ES2259194T3 - Composicion enzimatica para disociar tejidos. - Google Patents
Composicion enzimatica para disociar tejidos.Info
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Abstract
SE EXPONEN UNA COMPOSICION ENZIMATICA Y SU USO PARA AISLAR CELULAS O GRUPOS DE CELULAS DE UN TEJIDO. LA COMPOSICION INCLUYE DOS ENZIMAS DE COLAGENASA Y UNA ENDOPROTEASA. LA RELACION ENTRE LA ACTIVIDAD TOTAL DE TIPO CASEINA, MARCADA POR FITC Y LAS UNIDADES WUNSCH DE ACTIVIDAD DE LAS MASAS DE COLAGENASA I Y COLAGENASA II ES DE APROXIMADAMENTE 85:1 Y 3.900:1.
Description
Composición enzimática para disociar
tejidos.
La presente invención se refiere a composiciones
para la disociación enzimática de matrices de tejido extracelular,
a fin de permitir la remodelación hística y el aislamiento eficiente
de células viables y de agregados celulares del
tejido.
tejido.
La disociación enzimática de tejidos en células
individuales y agregados celulares es útil en una gran variedad de
aplicaciones de laboratorio, diagnósticas y terapéuticas. Estas
aplicaciones implican el aislamiento de muchos tipos de células
para usos variados, incluyendo células endoteliales microvasculares
destinadas a la siembra para el injerto vascular de pequeño
diámetro, hepatocitos para terapia genética, dispositivos de
cribado toxicológico de fármacos y dispositivos extracorporales de
ayuda al hígado, condrocitos para la regeneración de los cartílagos
e islotes de Langerhans para el tratamiento de la diabetes mellitus
insulino-dependiente. El tratamiento enzimático
funciona fragmentando proteínas de la matriz extracelular y
proteínas que mantienen el contacto célula con célula. Como que el
colágeno es el principal componente proteico de la ultraestructura
del tejido, el enzima colagenasa se ha usado frecuentemente para
lograr la deseada desintegración del tejido.
Hay distintas formas de colagenasa bacteriana
bruta procedente de Clostidrium histolyticum, que pueden
adquirirse comercialmente y se emplean para separar células y
agregados celulares del tejido. Estas colagenasas brutas,
procedentes de sobrenadantes de cultivos celulares, suelen contener
una mezcla de enzimas proteásicos (con actividad colagenolítica y
proteolítica inespecífica) y componentes no proteásicos (p.ej.
productos secundarios de fermentación, componentes de los medios,
pigmentos, otros enzimas tales como fosfolipasas, y
endotoxinas).
El análisis de las colagenasas brutas
disponibles comercialmente ha revelado grandes variaciones en la
concentración y en las proporciones de los componentes proteásicos y
no proteásicos. Esta variedad en la composición también se refleja
en la variación entre los lotes y, por tanto, el rendimiento de la
colagenasa en los protocolos de disociación de tejidos es
impredecible. Aparte de esta variación inherente de actividad, cada
lote de colagenasa comercial pierde características de actividad y
rendimiento al cabo del tiempo. Por último, además de estos
problemas relativos a la variabilidad de la composición, el uso de
colagenasas brutas en los protocolos de recolección
celular/disociación de tejidos suele dar resultados inferiores a los
deseados, en cuanto a la recuperación de la viabilidad celular,
número de células y función celular. Dichos problemas son de
especial importancia cuando las células están destinadas a
trasplantes o a controlar el impacto de moléculas efectoras sobre
la función celular. Por ejemplo, se ha demostrado que la eficacia
del trasplante de islotes depende parcialmente de la masa de los
islotes y de su viabilidad. Además, la función desintoxicadora de
fármacos de los hepatocitos recuperados queda significativamente
reducida por el daño causado a las células durante la disociación
del tejido hepático y el aislamiento de las células. Para la mayoría
de aplicaciones de las células recuperadas es fundamental minimizar
el daño a las células y agregados celulares recuperados, a fin de
que el rendimiento celular sea óptimo.
Los profesionales experimentados han reconocido
la importancia de la actividad estable/predecible de los enzimas
proteásicos que se usan en los protocolos de disociación de tejidos
para aislar eficazmente las células (es decir, manteniendo la
integridad celular, recuperando agregados celulares más grandes y
mayor cantidad de células o de agregados celulares). En concreto,
se ha visto que la pureza de las composiciones de colagenasa y la
presencia deseable de cantidades definidas de enzima colagenasa de
las clases I (colagenasa I) y II (colagenasa II) de C.
histolyticum con al menos dos proteasas neutrales influyen en la
eficacia del aislamiento de islotes pancreáticos. No obstante, aún
hay necesidad de identificar composiciones enzimáticas que
faciliten la disociación rápida del tejido y un mayor número de
células viables.
La presente invención proporciona una
composición enzimática, que se prepara combinando masas definidas
de proteasas purificadas, incluyendo colagenasa I y colagenasa II
procedente de C. histolyticum y una cantidad tal de una
endoproteasa, que la relación de unidades totales de actividad en
caseína-FITC de la composición enzimática respecto
a las unidades de actividad Wunsch de las masas de colagenasa I y de
colagenasa II esté comprendida, aproximadamente, entre 85:1 y
3.900:1. Cuando se usa en los protocolos de disociación de tejidos
para aislar células, la composición enzimática resultante actúa
mejorando y acelerando la disociación de matrices extracelulares y
permite recuperar una mayor cantidad de las células deseadas, con
mejor viabilidad, en comparación con la cantidad y la viabilidad de
las células recolectadas con el empleo de las composiciones
enzimáticas del estado técnico anterior, incluyendo las
composiciones de colagenasa bruta.
En otra forma de ejecución de la presente
invención se proporciona una composición enzimática que consta
básicamente de colagenasa I y colagenasa II de C.
histolyticum y una endoproteasa, siendo la relación de la masa
de colagenasa II respecto a la masa de colagenasa I más colagenasa
II en la composición enzimática de aproximadamente 0,3 a 0,6. La
composición enzimática resultante también es una mejora respecto a
composiciones previamente conocidas, debido a su capacidad de
disociar las matrices de tejido extracelular de manera más rápida,
permitiendo la recuperación de una mayor cantidad de células
viables.
Esta invención también proporciona un método
para preparar una composición enzimática adaptada al aislamiento de
células vivas procedentes de tejido, incluyendo la etapa de combinar
masas conocidas de colagenasa I y colagenasa II de C.
histolyticum con una cantidad de endoproteasa suficiente para
aumentar la actividad total en caseína-FITC de la
composición enzimática a un nivel, en que la relación de la
actividad total en caseína-FITC de la composición
enzimática respecto a la actividad total en unidades Wunsch de las
masas de colagenasa I y de colagenasa II en la composición
enzimática está comprendida, aproximadamente, entre 85:1 y
3.900:1.
La presente invención se basa en el hallazgo de
que la colagenasa I y la colagenasa II de C. histolyticum
pueden combinarse con cantidades determinadas de una endoproteasa,
para proporcionar una nueva composición enzimática que posee unos
niveles de actividad óptimos para aislar células procedentes de
tejido del órgano donante. De manera más concreta, se ha
descubierto que la degradación enzimática óptima de las matrices de
tejido extracelular y la consiguiente liberación eficiente de
células y agregados celulares viables del tejido orgánico se puede
lograr empleando una composición enzimática de colagenasa, que se
prepara ajustando los componentes de la composición, de tal manera,
que la relación de la actividad total en
caseína-FITC de la composición enzimática respecto
a las unidades Wunsch de actividad de las masas de colagenasa I y de
colagenasa II en la composición enzimática esté comprendida,
aproximadamente, entre 85:1 y 3.900:1, con preferencia entre
aproximadamente 130:1 y 1.400:1. En una forma de ejecución de la
presente invención se ofrece una composición enzimática útil para
la disociación eficiente de tejido hepático de rata, que proporciona
un gran rendimiento de hepatocitos. Esta composición enzimática
lleva cantidades de colagenasa I y de colagenasa II procedentes de
C. histolyticum y una endoproteasa, de manera que la relación
de la actividad total en caseína-FITC de la
composición enzimática respecto a las unidades Wunsch de actividad
de las masas de colagenasa I y de colagenasa II en la composición
enzimática está comprendida, aproximadamente, entre 250:1 y 600:1,
con una relación media aproximada de 400:1.
Otro aspecto de la presente invención es la
optimización de las proporciones másicas de ambos componentes
enzimáticos de colagenasa en las composiciones enzimáticas de la
presente invención, formadas esencialmente por colagenasa I,
colagenasa II y una endoproteasa. La proporción másica óptima de
colagenasa II respecto al total de colagenasa en la composición,
colagenasa II/(colagenasa I + colagenasa II), es de aproximadamente
0,3 a 0,6. Cuando la colagenasa I y la colagenasa II de C.
histolyticum se combinan en esta proporción másica con una
endoproteasa, la composición enzimática resultante es
particularmente útil para recuperar células y agregados celulares
de muestras de tejido en gran cantidad, con elevada viabilidad y
mejor reproducibilidad, en comparación con los protocolos de
disociación de tejidos mediante composiciones enzimáticas de
colagenasa conocidas. En una composición enzimática de la presente
invención, útil para disociar hígado de rata, la proporción másica
de colagenasa II sobre el total de colagenasa en la composición está
aproximadamente comprendida entre 0,35 y 0,45.
Las composiciones enzimáticas de la presente
invención incluyen la colagenasa I y la colagenasa II de C.
histolyticum. La colagenasa I y la colagenasa II se purifican
partiendo de colagenasa bruta de C. histolyticum mediante
varios métodos conocidos del especialista, incluyendo cromatografía
de afinidad a un colorante ligando, cromatografía de afinidad a
heparina, precipitación con sulfato amónico, cromatografía de
absorción en hidroxilapatito, cromatografía de exclusión de tamaños,
cromatografía de intercambio iónico y cromatografía por quelación
metálica. La colagenasa bruta está comercialmente disponible de
varias fuentes (p.ej. Colagenasa P de Boehringer Mannheim
Corporation).
El componente endoproteásico de la presente
composición enzimática puede ser cualquier endoproteasa, incluyendo
una serina proteasa (p.ej. tripsina, quimotripsina, elastasa), una
cisteína proteasa (p.ej. papaína, quimopapaína), y es
preferiblemente una proteasa neutra (p.ej. proteasa neutra de C.
histolyticum, dispasa o termolisina (todas EC 3.4.24.4) (EC
significa clasificación según la Comisión de Enzimas). La EC
3.4.24.4 es la clasificación para las metaloproteinasas
microbianas).
Para la disociación de 6 a 12 gramos de hígado
de rata, recuperando los hepatocitos, la actividad de las masas de
colagenasa I y de colagenasa II en la composición enzimática es
aproximadamente de 7,7 a 62,7 unidades Wunsch, preferiblemente de
15,1 a 52,6 unidades Wunsch y con mayor preferencia de unas 24 a 33
unidades Wunsch, y una actividad media de aproximadamente 30
unidades Wunsch. La actividad total en caseína-FITC
para esta composición enzimática es aproximadamente de 5.500 a
29.700 unidades de caseína-FITC, preferiblemente de
7.000 a 22.000 unidades de caseína-FITC y con mayor
preferencia de unas 8.500 a 14.500 unidades de
caseína-FITC, y una actividad media de
aproximadamente 12.000 unidades de caseína-FITC. Por
lo tanto el margen de relación de unidades de
caseína-FITC en la composición respecto a unidades
Wunsch en la composición es de 5.500/62,7 hasta 29.000/7,7 o
aproximadamente de 85:1 hasta 3.900:1, preferiblemente 7.000/52,6
hasta 22.000/15,1 o aproximadamente de 130:1 hasta 1.400:1, y con
mayor preferencia 8.500/33 hasta 14.540/24 o aproximadamente de
250:1 hasta 600:1, y una relación media de actividad de 12.000/30 o
aproximadamente 400:1.
Además de la disociación del hígado para aislar
los hepatocitos, la composición anterior es útil para disociar la
grasa epidérmica y aislar células endoteliales microvasculares.
También es de esperar que la composición anterior sirva para
disociar tejido pancreático, para el tratamiento tópico de
quemaduras y úlceras y para curar heridas, para tratar la
enfermedad de Peyronie y para reformar los discos anormales o
herniados. En general la composición de la presente invención es
útil para cualquier aplicación en que se desee eliminar o modificar
células de una matriz extracelular.
Para ciertas aplicaciones puede ser preferible
que la composición enzimática esté sustancialmente libre de
endotoxinas. También puede ser deseable que la composición
enzimática esté básicamente exenta del enzima clostripaína, pero,
en general, la clostripaína no parece afectar al rendimiento de la
composición enzimática. Estos componentes no deseados, que se
encuentran en la colagenasa bruta obtenida a partir de C.
histolyticum, pueden separarse de los componentes de colagenasa
I y II purificados según uno o varios de los métodos anteriormente
descritos. "Sustancialmente libre", tal como se usa aquí para
describir la presente invención, significa que se hace o se ha
hecho un esfuerzo para excluir dicha impureza de la composición y
que la impureza, en caso de existir, solo se halla en trazas, con un
contenido típicamente inferior al 2% en peso, con mayor frecuencia
inferior al 1% en peso, y en cualquier caso en una cantidad menor de
la que puede afectar a la funcionalidad total de la
composición.
Las composiciones enzimáticas de la presente
invención también se pueden preparar mezclando un número concreto
de unidades de actividad (o sea de unidades Wunsch de colagenasa I y
de colagenasa II) o masas específicas de los enzimas
preferiblemente purificados. Lo que sigue son ensayos enzimáticos de
colagenasa, proteasa neutra y clostripaína, que se llevaron a cabo
para definir las actividades específicas de los componentes de
colagenasa purificados, así como la actividad total (FITC) de la
composición enzimática completa. Los expertos en la materia
reconocerán que también pueden efectuarse otros ensayos enzimáticos
distintos de los revelados a continuación, para definir y preparar
composiciones enzimáticas funcionalmente equivalentes.
La actividad de la colagenasa se midió mediante
un substrato peptídico sintético, conforme al método de Wunsch y
Heidrich (Z. Physiol Chem. 1963; 333:149). Es un método
normalizado bien conocido de los expertos en la purificación de
colagenasa. La medición de la actividad de la colagenasa I, con el
péptido de Wunsch como substrato, dio valores típicos comprendidos
entre 0,2 y 0,6 unidades (U)/miligramo (mg) y de manera más
característica entre 0,3 y 0,5 U/mg. La medición de la actividad de
la colagenasa II, con el péptido de Wunsch como substrato, dio
valores típicos comprendidos entre 9,5 y 13,5 unidades U/mg y de
manera más característica entre 11 y 13 U/mg. Una unidad Wunsch (U)
de actividad se define como la hidrólisis de 1 micromol (\mumol)
de péptido por minuto a 25ºC y pH 7,1. Seguidamente se describe el
procedimiento de ensayo para determinar la actividad de la
colagenasa.
Tampón de dilución de la muestra (100
milimoles (mM)/litro (l) de
tris-(hidroximetil)-aminometano (Tris), pH
7,1): se disolvieron 1,21 gramos (g) de Tris en agua desionizada
(DI). El pH se ajustó a 7,1 con ácido clorhídrico (HCl) 1,0 Normal
(N) y el volumen se ajustó a 100 mililitros (ml) con agua (DI).
Substrato
PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg:
cada blanco o muestra se ensayó por duplicado. Cantidad total de
substrato necesario para el ensayo = 2 mg de substrato para cada
ensayo realizado, más 2 mg adicionales de substrato. (Por ejemplo,
2 muestras ensayadas por duplicado + tubos de blanco duplicados = 6
tubos de ensayo. La cantidad de substrato requerida es de 14 mg).
La cantidad total de substrato pesada se dividió por 50, a fin de
determinar los mililitros de metanol necesarios para disolver el
substrato. La cantidad de metanol calculada se añadió al substrato.
El substrato se mezcló a fondo, vortexando hasta su total
disolución. El tampón de dilución de la muestra se añadió al
substrato disuelto, hasta un volumen final en que la concentración
del substrato fue de 1 mg/ml.
100 mM/l de cloruro cálcico (CaCl_{2}):
se disolvieron 1,47 g de CaCl_{2} de peso fórmula (FW) 147 en
agua DI. El volumen se ajustó a 100 ml con agua DI.
25 mM/l de ácido cítrico: se disolvieron
0,525 g de ácido cítrico de FW 210,1 en agua DI. El volumen se
ajustó a 100 ml con agua DI.
Mezcla de ensayo: se introdujeron 2,0 ml
de substrato
PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg
y 0,4 ml de CaCl_{2} 100 mM en tubos de ensayo de 12 x 75
milímetros (mm) y se taparon. La mezclas de ensayo se dejaron en un
baño de agua a 25ºC para que se equilibraran antes de empezar el
ensayo. Se preparó un tubo para cada duplicado en blanco o muestra
ensayada.
Mezcla de extracción: se introdujeron 5,0
ml de acetato de etilo y 1,0 ml de ácido cítrico 25 mM en tubos de
ensayo de 16 x 125 mm. Se tapó cada tubo. Se preparó un tubo para
cada duplicado en blanco o muestra ensayada.
Tubos de secado: se introdujeron de 0,35
a 0,4 g de sulfato sódico anhidro en tubos de ensayo de 16 x 125
mm. Se tapó cada tubo. Se preparó un tubo para cada duplicado en
blanco o muestra ensayada.
Procedimiento de ensayo: todas las
muestras de enzimas concentradas y diluidas se guardaron entre 2ºC
y 8ºC, antes de añadirlas al substrato. Una muestra de la
composición enzimática completa o de uno de sus componentes (p.ej.
colagenasa I, colagenasa II o proteasa neutra) se diluyó con tampón
de dilución de muestras a un margen de concentración de 0,05 hasta
0,8 mg/ml, según la actividad estimada de la muestra. El tiempo de
incubación del ensayo se inició después de añadir 100 microlitros
(\mul) de blanco de control (se usó tampón de dilución de
muestras como blanco) al primer tubo de mezcla de ensayo. Después se
tapó la mezcla de ensayo, se agitó a fondo y se puso en un baño de
agua a 25ºC. A intervalos de 60 segundos se añadieron del mismo
modo a un tubo de mezcla de ensayo 100 \mul del siguiente blanco o
muestra ensayada. Cada mezcla de ensayo se incubó a 25ºC durante 15
minutos (min.) a partir del momento de la adición del blanco o de la
muestra ensayada. Tras 15 min. de incubación se pasaron 0,5 ml de
la primera mezcla de ensayo en blanco a un tubo con mezcla de
extracción. El tubo de mezcla de extracción se tapó y agitó a fondo
vortexando durante 20 segundos. A intervalos de 60 segundos, los
blancos y las muestras restantes se pasaron a tubos con mezcla de
extracción y se agitaron del mismo modo, siendo de 15 min. el
tiempo total de incubación de cada muestra. De la fase orgánica
(parte superior) de cada mezcla de extracción se pipetearon 3 ml en
un tubo de secado. Los tubos de secado se taparon, se agitaron y se
incubaron a temperatura ambiente en una campana durante 30 a 60
minutos. Los tubos se agitaron otra vez durante este tiempo. La
fase orgánica se pipeteó en cubetas de cuarzo y, con un
espectrofotómetro de temperatura controlada a 25ºC, se leyó la
absorbancia a 320 nanómetros (nm) para cada blanco y cada
muestra.
Cálculos: A_{320} = absorbancia media
de la muestra - absorbancia media del blanco tampón. Actividad
(U/ml) = (A_{320} x 2,5 x 5 x factor de dilución)/(21 x 0,10 x 0,5
x 15). Simplificando, U/ml = A_{320} x 0,79 x factor de dilución.
La actividad específica U/mg de cada mezcla se calculó por la
relación siguiente: actividad específica (U/mg) =
(U/ml)/(mg/ml).
La actividad de la proteasa neutra se midió por
la liberación de péptidos fluorescentes del substrato
caseína-FITC, solubles en ácido tricloroacético
(TCA), según una versión modificada del método de Twining (Anal.
Biochem. 1984; 143:30). Los péptidos fluorescentes se
cuantificaron mediante una longitud de onda de excitación de 491 nm
y una longitud de onda de emisión de 525 nm. El intervalo de
actividad específica medida en caseína-FITC para la
proteasa neutra dispasa fue típicamente de 600 a 1.400 U/mg y de
modo más característico 1.100 a 1.400 U/mg. El intervalo de
actividad específica medida en caseína-FITC para la
proteasa neutra termolisina fue típicamente de 3.000 a 6.500 U/mg y
de modo más característico 3.500 a 6.000 U/mg. Una unidad de
actividad genera 100.000 unidades de fluorescencia (recuentos por
segundo), corregida para el ruido de fondo por minuto a 37ºC y pH
7,5. A continuación se describe el procedimiento de ensayo para
determinar la actividad de la proteasa neutra.
Tampón de dilución de la muestra (100 mM/l de
Tris, 10 mM/l de CaCl_{2}, pH 7,5): se disolvieron 6,06 g de
Tris y 0,74 g de CaCl_{2} en agua DI. El pH se ajustó a 7,5 con
ácido HCl 1,0 N y el volumen se ajustó a 500 ml con agua DI.
Solución de substrato
caseína-FITC (0,25% p/v): se disolvieron 50,0 mg
de caseína-FITC en el tampón de dilución de
muestras. El volumen se ajustó a 20,0 ml con tampón de dilución de
muestras.
Solución de extinción (5,0% p/v): se
disolvieron 5,0 g de ácido tricloroacético en agua DI. El volumen
se ajustó a 100 ml con agua DI.
Solución neutralizadora (500 mM/l de Tris, pH
8,5): se disolvieron 30,3 g de Tris en agua DI. El pH se ajustó
a 8,5 con HCl 1,0 N y el volumen a 500 ml con agua DI.
Procedimiento de ensayo: todas las
muestras concentradas y diluidas de enzimas se guardaron entre 2ºC
y 8ºC, antes de incorporarlas al substrato. Cada blanco o muestra se
probó por duplicado. Una muestra de la composición enzimática
entera o de uno de sus componentes (p.ej. colagenasa I, colagenasa
II o proteasa neutra) se diluyó con tampón de dilución de muestras
a un margen de concentración de 1 hasta 50 microgramos (\mug)/ml,
según la actividad estimada de la muestra. Se añadieron 10 \mul de
las muestras diluidas a 40 \mul de solución del substrato
caseína-FITC en tubos Eppendorf de 1,5 ml (el tampón
de dilución de muestras se usó como blanco) y se incubaron durante
45 min., agitando en un baño de agua a 37ºC. Se quitaron los tubos
del baño de agua y se añadieron 120 \mul de la solución de
extinción. Los tubos se vortexaron y se dejaron a temperatura
ambiente durante al menos 60 min. Los tubos se centrifugaron después
en una microcentrífuga a 14.000 rpm durante 2 min. Se retiraron 50
\mul del sobrenadante y se añadieron a 2 ml de tampón
neutralizador en una cubeta. Se tapó la cubeta y se invirtió para
mezclar la solución. Luego se midió la fluorescencia (longitud de
onda de excitación 491 nm y longitud de onda de emisión de 525 nm,
anchura de rendija 0,2 nm).
Cálculos: CPS = fluorescencia media de la
muestra enzimática - fluorescencia media del blanco tampón.
Actividad (U/ml) = (CPS x 0,17 x factor de dilución)/(0,05 ml x 0,01
ml x 45 min. x 100.000). Simplificando, U/ml = CPS x 0,0000755 x
factor de dilución. El intervalo lineal para el fluorímetro SPEX va
de 4.000 hasta 100.000 CPS.
El substrato de caseína, utilizado en el ensayo
de proteasas neutras arriba descrito, también puede servir como
substrato general para una gran variedad de actividades proteásicas,
incluyendo tripsina, clostripaína, dispasa, termolisina y muchas
otras. Los intervalos preferidos de actividad para la composición
enzimática completa en caseína-FITC aquí descritos
se midieron y definieron como unidades de actividad de la
composición enzimática final y no como unidades reales de los
componentes proteásicos neutros medidas separadamente antes del
mezclado.
La actividad de la clostripaína se midió
mediante la esterolisis de la
N-benzoíl-L-arginina
etil éster (BAEE), de acuerdo con una modificación del método de
Whitaker y Bender (J. Am. Chem. Soc. 1965; 87:2728). La
clostripaína es una cisteína proteasa activada por agentes
reductores tales como el ditiotreitol (DTT). La actividad medida de
la clostripaína es la diferencia entre el enzima activado con DTT y
el enzima no tratado con DTT. Dichas actividades se generaron
empleando 1,8 mM de BAEE. Una unidad se define como la hidrólisis
de 1 \mumol de BAEE por min. a 25ºC, pH 7,6. A continuación se
describe el procedimiento de ensayo para determinar la actividad de
la clostripaína.
Tampón de fosfato (75 mM/l): se
disolvieron 1,17 g de fosfato sódico monobásico (NaH_{2}PO_{4})
en agua DI. El volumen se ajustó a 100 ml con agua DI y se marcó
como "solución A". Se disolvieron 1,07 g de fosfato sódico
dibásico (Na_{2}HPO_{4}) en agua DI. El volumen se ajustó a 100
ml con agua DI y se etiquetó como "solución B". El pH de la
solución B se ajustó a 7,6 con solución A.
Solución de DTT (7,5 mM/l): se
disolvieron 28,9 mg de ditiotreitol (DTT) en agua DI y el volumen
se ajustó hasta 25 ml con agua DI.
Solución de BAEE (1,8 mM/l): se
disolvieron 15,4 mg de BAEE en agua DI y el volumen se ajustó hasta
25 ml con agua DI.
Solución activadora 10X (10 mM/l de acetato
cálcico 25 mM/l de DTT): se disolvieron 17,6 mg de acetato
cálcico y 38,6 mg de DTT en agua DI y el volumen se ajustó a 10,0 ml
con agua DI.
Solución blanco 10X (10 mM/l de acetato
cálcico): se disolvieron 17,6 mg de acetato cálcico en agua
RO/DI y el volumen se ajustó a 10,0 ml con agua DI.
Preparación de la muestra: todas las
muestras concentradas y diluidas de enzimas se guardaron entre 2ºC
y 8ºC antes de agregarlas al substrato. La colagenasa I se diluyó
con una combinación de solución activadora 10X y agua DI, de tal
manera, que la concentración final de la muestra fue de 0,15 mg/ml
en solución activadora 1X. (Así por ejemplo, para diluir una
muestra de colagenasa I desde 26,7 mg/ml hasta los 0,15 mg/ml del
ensayo, mezclar 10 \mul de la muestra de colagenasa I de 26,7
mg/ml con 178 \mul de la solución activadora 10X más 1.592 \mul
de agua DI). La colagenasa II se diluyó con una combinación de
solución activadora 10X y agua DI, de manera, que la concentración
final de la muestra fue de 0,4 mg/ml en solución activadora 1X. (Así
por ejemplo, para diluir una muestra de colagenasa II desde 31,2
mg/ml hasta los 0,4 mg/ml del ensayo, mezclar 10 \mul de la
muestra de colagenasa II de 31,2 mg/ml con 78 \mul de la solución
activadora 10X más 692 \mul de agua DI). Después las muestras se
incubaron a temperatura ambiente durante 4,5 horas.
Preparación de blancos de tripsina: los
blancos de tripsina se prepararon repitiendo las diluciones de las
muestras con la solución blanco 10X en lugar de la solución
activadora 10X y con la solución blanco 1X en lugar de la solución
activadora 1X.
Ensayo espectrofotométrico (longitud de onda
253 nm volumen final 0,93 ml, temperatura 25ºC): se preparó una
mezcla de blanco de tripsina y una mezcla de muestra activada, según
las siguientes composiciones:
\vskip1.000000\baselineskip
| mezcla de blanco de tripsina | mezcla de muestra activada | |
| Substrato BAEE | 5,0 ml | 5,0 ml |
| Tampón de fosfato 75 mM/l pH 7,6 | 5,0 ml | 5,0 ml |
| Agua DI | 5,0 ml | - - - |
| Solución de DTT 7,5 mM/l | - - - | 5,0 ml |
\vskip1.000000\baselineskip
Se colocaron cuatro cubetas de cuarzo en el
espectrofotómetro. Se pipetearon 0,9 ml de la mezcla de blanco de
tripsina en cada una de las dos primeras cubetas y 0,9 ml de la
mezcla de muestra activada en cada una de las dos cubetas
restantes. Se leyó la absorbancia durante 1,5 min. para establecer
un nivel del blanco (que no debería superar 0,01 delta
(\Delta)A_{253}/min.). Luego se inició la reacción,
pipeteando 0,03 ml de la preparación diluida del blanco de tripsina
en las dos cubetas con muestra activada y mezclando a fondo. Cada
cubeta se leyó durante 1,5 min. para determinar el grado de reacción
(el \DeltaA_{253}/min. debería oscilar entre 0,007 y
0,040).
Cálculo: para cada muestra, la actividad
U/ml se determinó como sigue: U/ml = [(\DeltaA/minuto) x (factor
de dilución) x (0,93) x (1.000)]/[(1.150) x (0,03)], donde
\DeltaA/minuto = \DeltaA_{253}/min. de la muestra -
\DeltaA_{253}/min. del blanco. Simplificando, U/ml =
(\DeltaA/minuto) x (factor de dilución) x (26,96). La actividad
específica U/mg de cada muestra se calculó según la siguiente
relación: (U/mg) = (U/ml)/(mg/ml).
Como material de partida se usó colagenasa
bacteriana bruta del comercio (colagenasa P de Boehringer Mannheim
Corporation). Para la cromatografía de afinidad a colorante ligando
se encontraron tres soportes aceptables de Amicon. Estos soportes
fueron: MATREX (marca comercial registrada de W.R. Grace & Co.)
Gel Blue A, MATREX Gel Red A y MATREX Gel Green A. También hubo
productos comparables de otros proveedores que funcionaron de
manera semejante. Para recuperar el máximo de actividad, todas las
etapas de purificación se realizaron entre 2ºC y 8ºC.
La colagenasa bacteriana bruta y el soporte
elegido se equilibraron contra un tampón, con contenido de calcio y
poca fuerza iónica, a un pH comprendido entre 6,0 y 7,5. Para la
mejor combinación de eficiencia purificadora, estabilidad
enzimática y capacidad de la resina es preferible un margen de pH
comprendido entre 6,5 y 7,0. En estas cromatografías se utilizaron
tampones de ácido
4-[2-hidroxietil]-1-piperazina
etanosulfónico (HEPES) 20 mM o
[bis-(2-hidroxietil)-imino]-tris-(hidroximetil)-metano
(BIS-Tris) 20 mM, cloruro cálcico 1 mM, pH 7,0,
para equilibrar la resina y el enzima. La colagenasa bacteriana
bruta se disolvió suspendiendo el material de partida liofilizado
en el tampón de equilibración elegido, a una concentración de
muestra de aproximadamente 40 mg/ml. Se han usado concentraciones
de 1 hasta 100 mg/ml, dando las concentraciones alrededor de 40
mg/ml la mejor combinación de estabilidad enzimática y brevedad de
carga de la muestra. El material insoluble se puede eliminar por
centrifugación y/o filtración a través de celulosa, acetato de
celulosa, poli-(étersulfona) u otras membranas de baja fijación de
proteína.
La muestra clarificada se aplicó a la resina con
un caudal de 0,1 hasta 2,0 centímetros (cm)/min. La purificación es
insensible al caudal, por tanto se emplea el caudal que se adapta
mejor al programa de producción. Dependiendo del lote de resina se
pueden fijar de 10 a 15 mg de enzima a las resinas Red A y Green A,
lo cual se traduce en una capacidad de fijación de 20 a 40 mg de
colagenasa P por milímetro de estos soportes. La resina Blue A
tiene aproximadamente 1/2 de esta capacidad. Una vez cargada la
muestra en la columna, el material no retenido se extrae lavando
con el tampón de equilibración. Para ello suele bastar una cantidad
de tampón equivalente a dos o tres volúmenes de columna.
Los enzimas fijados se recuperaron por elución
de la resina con una sal y/o un gradiente de pH. Los tampones de
elución constituidos por HEPES 20 mM, cloruro cálcico 1 mM y cloruro
sódico 400 mM a pH 7,5 o bien Tris 20 mM, cloruro cálcico 1 mM y
cloruro sódico 150 mM a pH 9,0 fueron suficientes para recuperar la
mayor parte de la actividad proteolítica fijada.
La mezcla enzimática de colagenasa purificada
por afinidad al colorante ligando se siguió purificando mediante
cromatografía de intercambio catiónico fuerte sobre la resina SP
Sepharose Fast Flow (marca registrada de Pharmacia, Inc.). Antes de
usarla, la resina se convirtió de la forma sódica a la forma
cálcica, lavándola con exceso de solución de cloruro cálcico. Bastó
un volumen de 1/2 columna de solución de cloruro cálcico 500 mM
para convertir la resina cargada en la forma cálcica. La resina
cargada en forma cálcica y la solución del enzima purificado por
afinidad al colorante ligando se equilibraron contra un tampón de
baja fuerza iónica que contenía calcio, mantenido a un pH entre 6,5
y 7,5. En estas cromatografías se usó un tampón de HEPES 20 mM,
cloruro cálcico 5 mM, pH 7,0 para la equilibración. La mezcla
enzimática purificada por afinidad al colorante ligando, ya
equilibrada, se aplicó a la forma cálcica de la columna de SP
Sepharose FF con unos caudales de hasta 8 cm/min. Para la mayor
parte de purificaciones, un caudal de 2 cm/min. es el más
conveniente por la rapidez y la facilidad de control del proceso.
Después de aplicar la muestra, los enzimas de colagenasa se
eluyeron aplicando tampón de equilibración. Normalmente bastó una
cantidad de tampón equivalente a unos dos volúmenes de columna para
eluir todos los enzimas de colagenasa. Una vez eluidos fuera de la
columna los enzimas de colagenasa, las proteínas fijadas
(predominantemente clostripaína junto con varias proteínas no
proteásicas) se pueden eluir usando un gradiente de cloruro cálcico
5 hasta 100 mM. Esto se realizó utilizando un gradiente lineal de
10 a 15 volúmenes de columna, para recuperar la clostripaína
purificada, o un gradiente por etapas, a fin de limpiar la columna
para volverla a usar. En promedio se fijaron de uno a dos miligramos
de clostripaína por milímetro de resina. Es importante saturar esa
resina con calcio, porque de no hacerlo, la resina quitará calcio
de los enzimas en la preparación, aumentando su degradación y
disminuyendo las recuperaciones. Cabe esperar que otras resinas de
intercambio catiónico fuerte se comporten de manera similar a
esta
resina.
resina.
La fracción de flujo procedente de la columna de
SP Sepharose FF saturada de calcio, que contenía los enzimas de
colagenasa y la proteasa neutra clostridiana, se purificó por
cromatografía de intercambio aniónico sobre dietil aminoetil (DEAE)
o trimetil aminoetil (Q) Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Tanto el
soporte como la muestra de enzima se equilibraron contra un tampón
de baja fuerza iónica, que contiene calcio, a un pH comprendido
entre 6,5 y 9,0. En este margen de pH, ambas resinas proporcionaron
una eficiencia similar de purificación y recuperaciones. Sin
embargo, debido a sus protocolos más simples de regeneración y
equilibración se usó el soporte de Q Sepharose FF. En estas
cromatografías se empleó el tampón de HEPES 5 mM, cloruro cálcico 1
mM, a pH 7,5. La reserva enzimática de colagenasa equilibrada se
aplicó a la resina equilibrada a unos caudales de hasta 8 cm/min.
(usualmente de 1 a 2 cm/min.). En promedio se aplicaron de 20 hasta
50 mg de mezcla enzimática por ml de resina. Tras aplicar la mezcla
a la resina, los enzimas se eluyeron con un gradiente lineal de
cloruro cálcico 1 a 100 mM. Se usó un gradiente de 20 hasta 30
volúmenes de columna. El enzima colagenasa II se eluyó a unos 15
hasta 20 mM de calcio, la colagenasa I a unos 30 hasta 35 mM de
calcio y la proteasa neutra a unos 60 hasta 70 mM de calcio.
Los enzimas recuperados se equilibraron contra
el tampón de HEPES 5 mM, cloruro cálcico 1 mM, a pH 7,5 y se
conservaron congelados a -20ºC o menos. Purificados de dicha forma y
guardados en estas condiciones, los enzimas de colagenasa pueden
conservarse durante al menos dos años, sin pérdida manifiesta de
actividad.
Se ha visto que las colagenasas I y II
preparadas de este modo están básicamente exentas de clostripaína.
Según nuestra experiencia, el material preparado de este modo tiene
menos de 3 unidades BAEE de actividad de clostripaína,
habitualmente solo una o menos unidades de actividad, lo cual se
traduce en un alto grado de pureza (98 a 99%) de ambos componentes
de colagenasa. La siguiente tabla 1 muestra las actividades
enzimáticas típicas de los componentes enzimáticos purificados.
| Enzima | Actividad Wunsch | Actividad BAEE | Actividad caseína-FITC |
| colagenasa I | 0,2-0,6 U/mg | ||
| colagenasa II | 9,5-13,5 U/mg | ||
| clostripaína | 70-140 U/mg | ||
| termolisina | 3.000-6.500 U/mg | ||
| dispasa | 600-1.400 U/mg |
Las colagenasas I y II, que tienen solubilidades
muy elevadas, se prepararon y se guardaron como líquidos
congelados, tal como se ha descrito arriba en el ejemplo 1. Sin
embargo, la termolisina tiene una solubilidad mucho menor y resulta
mucho más difícil de obtener en solución, sobre todo a
concentraciones mayores que 2,0 mg/ml. Para conseguir una
solubilización reproducible de este enzima se usó una modificación
del método presentado por Matsubra (Methods in Enzymology, v. 19,
págs. 642-651). La masa deseada de termolisina seca
(Boehringer Mannheim Corporation, Biochemicals cat. # 161586) se
colocó en un recipiente de tamaño apropiado. Luego se añadió una
cantidad de agua pura, suficiente para preparar una suspensión de 8
mg/ml de termolisina. Después de mezclar en baño de hielo, para
hidratar los cristales de termolisina, se agregó suficiente solución
diluida de hidróxido sódico, a fin de ajustar el pH a
aproximadamente 10,5. Si es necesario, el pH se puede incrementar
hasta 11,5 para asegurar la solubilización total. Una vez completada
ésta, la solución presentó un ligero color entre amarillo y
tostado. El pH de esta solución se rebajó después a 8,5 con una
solución diluida de ácido acético. El ácido exento de HEPES también
funciona bien y es compatible con la solución tampón. Tras este
proceso de solubilización, una solución de termolisina con una
concentración de proteína de 5 a 6 mg/ml se puede mantener al menos
varias horas entre 0 y 8ºC.
Se prepararon composiciones enzimáticas
mezclando masas específicas de cada enzima. La masa de cada enzima
se determinó en base a su absorbancia a 280 nanómetros. Para las
colagenasas I y II, una solución de 1,0 mg/ml tendrá una
absorbancia de 1,4 unidades de absorbancia (AU) y una solución de
1,0 mg/ml de termolisina tendrá una absorbancia de 1,1 AU. Con
estos valores se prepararon soluciones de cada componente y el
número de unidades de absorbancia, calculado para cada componente,
se combinaron para preparar las mezclas deseadas.
Se derritieron las muestras de colagenasa I y II
procedentes del ejemplo 1 anterior. (Todas las operaciones se deben
realizar entre 0 y 8ºC para maximizar la estabilidad de los
enzimas). Se preparó una muestra del enzima colagenasa I que
contenía 3,48 mg de proteína (4,87 AU). A esta muestra se le añadió
una muestra del enzima colagenasa II que contenía 2,32 mg de
proteína (3,25 AU). A esta mezcla de colagenasa I y II se le agregó
un volumen de solución de termolisina, que aportó 1,82 mg de este
enzima (2,00 AU) y se mezcló bien.
Una vez mezclada, la composición enzimática
puede mantenerse durante varias horas en un baño de hielo, sin
pérdida de actividad. No obstante, para un almacenamiento a más
largo plazo, se recomienda conservar la composición a -20ºC o
menos, como líquido congelado o como liofilizado. Así preparadas,
estas mezclas son estables durante varios años. Para 6 a 12 gramos
de hígado, las masas enzimáticas indicadas en la siguiente tabla 2
proporcionaron una mezcla óptima para aislar hepatocitos.
| Enzima | Peso | Unidades de absorbancia/ | Unidades totales de |
| miligramo | absorbancia | ||
| colagenasa I | 3,48 mg | 1,4 AU/mg | 4,87 AU |
| colagenasa II | 2,32 mg | 1,4 AU/mg | 3,25 AU |
| termolisina | 1,82 mg | 1,1 AU/mg | 2,00 AU |
En la composición enzimática descrita arriba en
la tabla 2, la colagenasa I aportó aproximadamente 0,7 hasta 1,7
unidades Wunsch de actividad colagenasa, y la colagenasa II
aproximadamente 23,2 hasta 31 unidades Wunsch de actividad. Como
que la termolisina no aportaba ninguna actividad Wunsch importante,
la composición total dio aproximadamente 24 a 33 unidades Wunsch de
actividad y en promedio unas 30 unidades Wunsch. La composición
total tuvo aproximadamente de 8.500 a 14.500 unidades de actividad
caseína-FITC y en promedio unas 12.000 unidades
caseína-FITC. Por tanto el margen de relación de
unidades caseína-FITC respecto a las unidades Wunsch
de la composición es de 8.500/33 hasta 14.500/24 o aproximadamente
de 250:1 hasta 600:1, con una relación media de actividad de
12.000/30 o de aproximadamente 400:1.
Cabe esperar que la composición enzimática
descrita arriba para la disociación de hígado de rata también
funcione aceptablemente para otros tipos de tejido. Como es evidente
para los expertos en la materia, puede ser necesario efectuar
alguna modificación para optimizar la mezcla enzimática purificada,
con el fin de disociar tejidos específicos, p.ej. los tejidos que
contienen más colágeno pueden requerir una mayor actividad de
colagenasa y los tejidos que contienen más proteínas no colagénicas
pueden requerir una mayor actividad de proteasa. De manera análoga,
las muestras de tejido de mayor o menor tamaño pueden necesitar los
correspondientes ajustes de la actividad enzimática.
Se ensayaron combinaciones de composiciones
enzimáticas purificadas en cuanto a su capacidad de disociar hígado
de rata en hepatocitos libres. En las evaluaciones se utilizaron
ligeras modificaciones de los procedimientos de Seglen (Seglen,
Exp. Cell Res. 82, págs. 391-398 (1973)). Los
tampones abajo descritos se usaron en la disociación de órganos.
Todos los tampones se prepararon con agua de gran pureza y se
pasaron a través de un filtro de 0,2 micras, para asegurar la
esterilidad.
Tampón de perfusión: 8,3 g de cloruro
sódico, 0,5 g de cloruro potásico y 2,4 g de HEPES se añadieron a
800 ml de agua. Una vez completada la disolución, el pH se ajustó a
7,4 y el volumen se llevó hasta 1.000 ml.
Tampón de digestión: 3,9 g de cloruro
sódico, 0,5 g de cloruro potásico, 0,7 g de cloruro cálcico
dihidratado y 24 g de HEPES se añadieron a 800 ml de agua. Una vez
completada la disolución, el pH se ajustó a 7,6 y el volumen se
llevó hasta 1.000 ml.
Tampón de suspensión: 4,0 g de cloruro
sódico, 0,4 g de cloruro potásico, 7,2 g de HEPES, 0,18 g de
cloruro cálcico dihidrato, 0,15 g de fosfato potásico, 0,1 g de
sulfato sódico, 0,13 g de cloruro magnésico hexahidrato, 6,9 g de
(ácido
2-{[tris-(hidroximetil)-metil]-amino}-etanosulfónico)
(TES), 6,5 g de
{N[tris-(hidroximetil)-metil]-glicina}
(TRICINA) y 2,1 g de hidróxido sódico se añadieron a 800 ml de
agua. Una vez completada la disolución, el pH se ajustó a 7,6 y el
volumen se llevó hasta 1.000 ml.
Tampón de lavado: 8,3 g de cloruro
sódico, 0,5 g de cloruro potásico, 2,4 g de HEPES y 0,18 g de
cloruro cálcico dihidrato se añadieron a 800 ml de agua. Una vez
completada la disolución, el pH se ajustó a 7,4 y el volumen se
llevó hasta 1.000 ml.
Se anestesiaron ratas Wistar macho (de 150 a 200
g) con inyecciones I.P. de pentabarbitol (10 mg/100 g de peso
corporal). Se abrió la cavidad abdominal y se canuló la vena cava
inferior entre el hígado y el riñón. La vena cava se ligó por
encima del hígado y la vena porta se cortó o se canuló para permitir
el reflujo desde el hígado. El hígado se perfundió durante al menos
cinco minutos con tampón de perfusión a un caudal de 30 ml/min. La
composición enzimática del ejemplo 2 anterior se disolvió en 300 ml
de solución digestiva y se incubó a 37ºC hasta calentarse. Luego se
disoció el hígado pasando la solución digestiva por el órgano a un
caudal de 30 ml/min. hasta ablandarlo. Se anotó el tiempo de
digestión.
Después se extrajo el órgano ablandado y se puso
cuidadosamente aparte en tampón de suspensión pregaseado con 95% de
oxígeno y 5% de dióxido de carbono. Cualquier resto de tejido se
cortó en pequeños fragmentos, eliminando todos los vasos sanguíneos
y las membranas. La suspensión de tejido se llevó hasta un volumen
final de 150 ml con tampón de suspensión y se incubó agitando
suavemente a 37ºC durante 25 min., para dispersar los hepatocitos.
Tras separar por filtración los fragmentos grandes de tejido, los
hepatocitos se peletizaron por centrifugación a 20 x G durante 5
minutos a 4ºC. Las células no hepatocíticas, los hepatocitos dañados
y los desechos celulares quedaron en el sobrenadante, y se quitaron
por aspiración y se descartaron. Los hepatocitos se lavaron y
centrifugaron al menos dos veces más con solución de lavado fría. Se
determinó el recuento final de las células y el % de viabilidad. Se
introdujeron cuatro millones de hepatocitos en placas de cultivo de
60 mm de diámetro cubiertas de colágeno y se incubó a 37ºC en 95% de
aire y 5% de dióxido de carbono, a 95% de humedad relativa. Los
ensayos funcionales se realizaron a intervalos de tiempo
apropiados.
Se utilizó una composición enzimática que
contenía 2,32 mg de colagenasa II, 3,48 mg de colagenasa I y 1,82
mg de termolisina, para disociar muestras de tejido adiposo de rata,
con el propósito de recuperar células microvasculares. El método
empleado fue una pequeña modificación del procedimiento de Rodbell
(J. Biol. Chem., v. 239, p. 375 (1964)). La composición preferida
de la mezcla se reconstituyó en 20 ml de solución fisiológica
salina, tamponada con fosfato (PBS), que contenía 1,0 mg/ml de
albúmina de suero bovino exenta de ácido graso (BSA), y se
esterilizó a través de un filtro de acetato de celulosa de 0,2
micras. Cuatro panículos adiposos epididímicos finamente picados
(con promedios volumétricos de grasa de 3 a 5 ml) de ratas de 8
hasta 10 semanas de edad se metieron en 10 ml de la solución
enzimática mixta. La digestión se efectuó a 37ºC en un baño de agua
agitado, durante 10 a 15 min. Las células se recuperaron
centrifugando cuatro minutos a 700 x G. La grasa flotante y las
soluciones mixtas de enzimas se aspiraron y se descartaron: el
paquete de células endoteliales se suspendió dos veces en tampón
PBS que llevaba 1,0 mg/ml de BSA y las células se recuperaron
centrifugando durante cuatro minutos a 700 x G con una
centrifugación final en tampón PBS corriente. Las células quedaron
luego a punto para el recuento, el ensayo de viabilidad, el cultivo
o el fraccionamiento adicional.
Claims (6)
1. Composición enzimática que contiene
colagenasa I y colagenasa II de Clostridium histolyticum y
una endoproteasa, que se prepara combinando colagenasa I con una
actividad Wunsch de aproximadamente 0,2 U/mg a 0,6 U/mg y
colagenasa II con una actividad Wunsch de aproximadamente 9,5 U/mg a
13,5 U/mg, de manera que la proporción de la masa de colagenasa II
respecto a la masa de colagenasa I más la masa de colagenasa II en
la composición enzimática es aproximadamente de 0,3 a 0,6, y
añadiendo una cantidad de la endoproteasa, suficiente para
incrementar la relación de las unidades totales de actividad en
caseína-FITC de la composición enzimática respecto
a las unidades totales Wunsch de actividad de las masas combinadas
de colagenasa I y colagenasa II, hasta aproximadamente 250:1 a
600:1.
2. La composición enzimática de la
reivindicación 1, en que la endoproteasa es una proteasa neutra.
3. La composición enzimática de la
reivindicación 1, en que la endoproteasa es termolisina y la
composición está sustancialmente libre de endotoxinas.
4. Una composición enzimática que contiene
colagenasa I y colagenasa II de Clostridium histolyticum y
termolisina, que se prepara combinando colagenasa I con una
actividad Wunsch de aproximadamente 0,2 U/mg a 0,6 U/mg y colagenasa
II con una actividad Wunsch de aproximadamente 9,5 U/mg a 13,5
U/mg, de manera que la proporción de la masa de colagenasa II
respecto a la masa de colagenasa I más la masa de colagenasa II en
la composición enzimática es aproximadamente de 0,3 a 0,6, y
añadiendo una cantidad de la termolisina, suficiente para
incrementar la relación de las unidades totales de actividad en
caseína-FITC de la composición enzimática respecto a
las unidades totales Wunsch de actividad de las masas combinadas de
colagenasa I y colagenasa II, hasta aproximadamente 400:1.
5. Un método de preparación de una composición
enzimática, adaptado para aislar células vivas de tejido, que
comprende las etapas de combinar colagenasa I de Clostridium
histolyticum con una actividad Wunsch de aproximadamente 0,2
U/mg a 0,6 U/mg y colagenasa II de Clostridium histolyticum
con una actividad Wunsch de aproximadamente 9,5 U/mg a 13,5 U/mg y
una cantidad de una endoproteasa, suficiente para aumentar la
actividad en caseína-FITC de la composición
enzimática hasta un nivel en que la relación de las unidades totales
de actividad en caseína-FITC de la composición
enzimática respecto a las unidades totales Wunsch de actividad de
las masas combinadas de colagenasa I y colagenasa II esté
aproximadamente comprendida entre 250:1 y 600:1.
6. El método de la reivindicación 5, en que la
endoproteasa es termolisina.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US760893 | 1996-12-06 | ||
| US08/760,893 US5830741A (en) | 1996-12-06 | 1996-12-06 | Composition for tissue dissociation containing collagenase I and II from clostridium histolyticum and a neutral protease |
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|---|---|---|---|
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