ES2259196T3 - Procedimiento para la preparacion de productos de plasma sanguineo mediante la exclusion de donaciones con elevadas concentraciones de parvovirus b19. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de productos de plasma sanguineo mediante la exclusion de donaciones con elevadas concentraciones de parvovirus b19.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCION DE ELEVADAS CONCENTRACIONES DE VIRUS EN EL PLASMA SANGUINEO Y/O SUERO SANGUINEO MEDIANTE LA REACCION EN CADENA DE POLIMERASA (PCR), MEDIANTE EL CUAL LA SENSIBILIDAD DEL PCR SE HACE MAS ESPECIFICA MEDIANTE LA UTILIZACION DE CONDICIONES DE DETECCION, AMPLIFICACION Y EXTRACCION DE ACIDO NUCLEICO. ESTE PROCEDIMIENTO ES P. E. PARA DETECTAR EL DNA DE PARVOVIRUS EN EL PLASMA O EN EL SUERO, PUDIENDO AJUSTARSE LA SENSIBILIDAD DE LA PCR DE TAL MANERA QUE EL DNA DEL PARVOVIRUS SE DETECTA SOLO EN MUESTRAS, CUYO CONTENIDO EN DNA ES MAYOR QUE 10 6 HASTA 10 7 EQUIVALENTES DE GENOMA/ML. LA DETECCION DE LA AMPLIFICACION CONSEGUIDA DEL DNA DE PARVOVIRUS SE REALIZA EN LA MUESTRA MEDIANTE MEDIDAS DE FLUORESCENCIA.
Description
Procedimiento para la preparación de productos
de plasma sanguíneo mediante la exclusión de donaciones con elevadas
concentraciones de parvovirus B19.
Objeto de la invención es un procedimiento para
la preparación de productos de plasma sanguíneo, que se distingue
porque se seleccionan todas las donaciones en las que se demuestra,
por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la presencia de
más de 10^{6} hasta 10^{7} equivalentes genómicos/ml de
parvovirus B19, en donde la sensibilidad de la PCR se ajusta de tal
forma que el ADN de parvovirus B19 sólo se detecta en aquellas
donaciones cuyo contenido en ADN es mayor que 10^{6} hasta
10^{7} equivalentes genómicos/ml.
Se sabe que las impurezas virales contenidas en
soluciones de proteínas plasmáticas pasan también a los productos
plasmáticos preparados a partir de las mismas, y que pueden dar
lugar a infecciones de pacientes a los que se administra este tipo
de productos plasmáticos. Para prevenir este riesgo, se han
desarrollado múltiples medidas de seguridad. Entre éstas han
alcanzado especial significado la investigación del donante acerca
de determinadas infecciones virales, así como la inactivación y
eliminación de virus antes, durante y después de la obtención del
producto plasmático a partir de la sangre del donante.
Con frecuencia, la sangre de donantes está
contaminada con parvovirus B19. Los parvovirus provocan enfermedades
graves, sólo en casos excepcionales, si bien por motivos de
seguridad no se debería utilizar sangre de donantes que exhiba
títulos elevados de parvovirus para la obtención de productos
plasmáticos. Por el contrario, títulos bajos de parvovirus en la
sangre de donantes son tolerables, porque se dispone de métodos
físicos y químicos mediante los cuales se pueden separar cantidades
residuales de virus del plasma procesado en la obtención de
proteínas plasmáticas.
Por lo tanto, resulta deseable poder reconocer a
tiempo la sangre de donantes con concentraciones superiores al
promedio de parvovirus B19 (B19V), y excluirla del procesamiento
para productos plasmáticos.
Se planteó, por consiguiente, la misión de
desarrollar un procedimiento de detección para soluciones de
proteínas plasmáticas de título alto, que indique sólo la presencia
de cantidades superiores al promedio de B19V, pero que no reaccione
de manera alguna, por el contrario, en presencia de cantidades
menores de B19V.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es,
reconocidamente, un método muy eficaz para detectar cantidades
reducidas de una secuencia de ácidos nucleicos conocida en una
muestra (Erlich, H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. (1991),
Science, 252, págs. 1643-1651; PCR
Protocols. Current methods and applications (1993), compilado
por B.A. White, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, ISBN
0-89603-244-2).
Cuando se conoce ya la secuencia del ADN del virus, se puede
sintetizar un par de cebadores que sea complementario con respecto a
las regiones de las cadenas individuales opuestas entre sí, y
flanquee la secuencia de ADN buscada. Entre las condiciones en sí
conocidas de una PCR, es posible entonces amplificar in vitro
mediante la realización de, por lo general, más de 30 ciclos de
reacción grandes cantidades de un ADN específico. A través de los
ciclos de PCR, sólo resulta posible amplificar un fragmento de ADN
de un tamaño específico, que está compuesto por las longitudes de
ambos cebadores más la longitud del ADN viral situado entre ellos,
cuando el ADN viral buscado está presente en la muestra.
La técnica de PCR es tan sensible que es posible
detectar de manera segura cantidades extraordinariamente reducidas
de un ADN. La elevada sensibilidad de la PCR conduce también a
resultados positivos cuando, en una muestra de plasma, el ADN viral
se halla presente en cantidades tan pequeñas que el aprovechamiento
de la donación de sangre, de la que procede la muestra, no se ve
afectado para la preparación de productos del plasma sanguíneo. Por
ejemplo, para la detección de ADN de parvovirus B19, la técnica de
PCR cualitativa habitual no resulta apropiada, porque no se
diferencia entre concentraciones de parvovirus B19 altas y bajas, y
las muestras de plasma con un título bajo de parvovirus B19
aparecen como con una fuerte sobrecarga viral.
Carriere, C. et al. (1993), J.
Virol. Methods, 44, págs. 221-234,
describen un procedimiento para la detección de cantidades
reducidas de B19V mediante PCR.
Se ha encontrado ahora que es posible
transformar, de manera conveniente para su aplicación práctica, el
procedimiento de detección de altas concentraciones de B19V en
plasma sanguíneo y/o suero sanguíneo por medio de la reacción de
cadena de la polimerasa, reduciendo la sensibilidad de la reacción
en cadena de la polimerasa mediante el uso de condiciones
sub-óptimas de extracción, amplificación o detección de ácidos
nucleicos.
Este procedimiento es apropiado para la
detección de concentraciones elevadas de ácidos nucleicos de B19V.
De acuerdo con la invención, la sensibilidad de la PCR para la
detección de ácidos nucleicos de B19V se reduce tan fuertemente,
que los ácidos nucleicos de B19V sólo se pueden detectar en muestras
cuyo contenido en ADN es mayor que 10^{6} hasta 10^{7}
equivalentes genómicos/ml. Las muestras con un contenido en ADN de
B19V menor ya no se reconocen como positivas, y se pueden utilizar
en el procesamiento ulterior para la obtención de productos
plasmáticos, separando las cantidades reducidas de B19V, todavía
presentes, durante el procedimiento de producción.
Para reducir la sensibilidad de la PCR hay
disponibles múltiples procedimientos. De esta forma, por ejemplo,
la extracción de ácidos nucleicos puede llevarse a cabo bajo
condiciones en las que sólo se aíslan cantidades reducidas de
ácidos nucleicos, o se puede trabajar con soluciones altamente
diluidas, que contienen tan sólo cantidades reducidas de ácidos
nucleicos. Es posible, por ejemplo, el ajuste de condiciones
sub-óptimas de amplificación mediante la adición del cebador a la
cadena única de ADN (hibridación) y la amplificación a temperaturas
inusualmente bajas, y limitando el número de ciclos de PCR, o
"frenando" la amplificación a través de la reducción de la
concentración de cebadores por debajo del nivel óptimo. Por último,
también es posible seleccionar las condiciones de selección de tal
forma que sólo se reconozcan concentraciones especialmente altas de
ADN de B19V.
De manera conocida, la PCR habitual se inicia
con una desnaturalización de los ácidos nucleicos extraídos de la
muestra a analizar, que se lleva a cabo a 90ºC o a una temperatura
mayor durante, por ejemplo, 20 seg hasta 1 min.
De este modo, los ácidos nucleicos se separan en
cadenas individuales, a las que se adiciona normalmente el cebador
a una temperatura de 45 hasta 65ºC. A continuación, se lleva a cabo
la amplificación a 72ºC.
Por el contrario, de acuerdo con la invención,
la hibridación y/o la amplificación se llevan a cabo aproximadamente
a 52ºC. Adicionalmente, se limita el número de ciclos de PCR a 30.
De esta forma se consigue que la velocidad de reacción de la PCR
disminuya de modo considerable y, debido a la disminución de los
ciclos, se reduzca considerablemente la cantidad de ADN de
B19V.
Como cebadores se utilizan, por ejemplo, los
siguientes oligonucleótidos:
- SEQ ID NO. 1: 5’ ATG GGC CGC CAA GTA CAG GAA A 3’
- SEQ ID NO. 2: 5’ CAG GCA CAG CTA CAC TTC CAG GC 3’
En el procedimiento según la invención ha
demostrado ser especialmente conveniente llevar a cabo la detección
de la sección amplificada de ADN de B19V por medio de una sonda
portadora de dos pigmentos fluorescentes. Esta sonda marcada, que
se fija al ADN, entre los dos cebadores cuyas secuencias se han
descrito anteriormente, tiene, entonces, por ejemplo, la siguiente
secuencia:
- SEQ ID NO. 3: 5’ FAM-TGG TGG TCT GGG ATG AAG GTA TTA TT-TAMRA 3’
Esta secuencia se puede adquirir en el comercio
bajo la marca TaqMan®, y está determinada para usar en el ensayo de
5’-nucleasa, el ensayo TaqMan. Este método aparece detalladamente
descrito por Livak K.J., Flood S.J.A., Marmaro J., Giusti W., Deetz
K., Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends
provide a quenched probe system useful for detecting PCR product
and nucleic acid hybridization. PCR Method and Appl.
1995; 4:357-362.
La propiedad particular de esta sonda radica en
que se reduce la fluorescencia del pigmento fijado en el extremo 5’
de la sonda (FAM), es decir, del informador, por la proximidad del
pigmento fluorescente dispuesto en el extremo 3’ del cebador
(TAMRA), el extintor.
En el transcurso de la amplificación, y bajo la
influencia de una ADN-polimerasa térmicamente
estable, preferentemente la polimerasa TaqMan, se forma la nueva
cadena de ADN. En este caso, la ADN-polimerasa no
sólo suprime de la sonda la cadena única, sino que la descompone
mediante su actividad endonucleolítica, liberando, de esta forma,
los dos pigmentos fluorescentes. La fluorescencia del pigmento
informador deja de estar inhibida por el pigmento extintor, y
aumenta. Si ahora se mide la fluorescencia con un espectrómetro de
fluorescencia a la longitud de onda del informador y del extintor
(518 nm para FAM y 582 nm para TAMRA), se puede determinar el
cociente entre el valor del informador y del extintor (RQ). Se resta
el valor medio de los cocientes de múltiples controles negativos
(RQ^{-}), y el valor calculado se expresa como \DeltaRQ. El
método para reconocer la formación de ADN en la PCR mediante el
empleo de un cebador marcado con dos pigmentos fluorescentes se
describe en la solicitud de patente internacional WO 92/02638.
Si se utiliza este procedimiento para la
detección del ADN de parvovirus B19 en el procedimiento de PCR según
la invención con sensibilidad reducida, las muestras con un valor
de \DeltaRQ igual o mayor que 0,7 se evalúan y clasifican como
positivas. Las muestras con un valor menor de \DeltaRQ contienen
cantidades menores de ADN de parvovirus B19 (<10^{6} hasta
10^{7} equivalentes genómicos/ml).
La invención se explicará a través del ejemplo
siguiente:
La extracción de ácido nucleico se lleva a cabo
con una versión mejorada del método descrito por Ishizawa et
al. (Ishizawa M., Kobayashi Y., Miyamura T., Matsuma S.:
Simple procedure of DNA isolation from human serum.
Nucl. Acids Res. 1991; 19:5792). Para esto, se mezclan
100 \mul de plasma o suero con 300 \mul de tampón de extracción
(yoduro sódico 6M, EDTA 13 mM, 0,5% de sarcosilo,
Tris-HCl 26 mM, pH 8,0, 33 \mug/ml de glucógeno,
77 \mug/ml de ARNt de levadura), y se incuba durante 15 min a 60
\pm 2ºC. Mediante la adición de 400 \mul de isopropanol, los
ácidos nucleicos precipitan durante 20 min a temperatura ambiente. A
continuación, se realiza una centrifugación durante 10 min a 13.000
hasta 14.000 rpm en una centrifugadora de sobremesa para la
granulación de los ácidos nucleicos. Se retira el sobrenadante, el
granulado (precipitado) se lava con 1 ml de isopropanol al 40%, se
seca, y se resuspende en 20 \mul de H_{2}O.
La amplificación del ADN de B19V en el gen NS1
se ajusta mediante hibridación y temperaturas de prolongación
sub-óptimas, de manera que sólo sean positivas aquellas muestras
cuyo contenido en ADN sea mayor que 10^{6} hasta 10^{7}
equivalentes genómicos/ml. A 10 \mul del ADN extraído se agregan
mediante pipeta 40 \mul de Master Mix (5 \mul 10 x tampón de
PCR (Catálogo de Perkin-Elmer 1995/96, PCR Systems,
Reagents and Consumables), 3 \mul de MgCl_{2} 25 mM, 4 \mul
de trifosfato de desoxinucleósido, sendos 4 \mul de los
oligonucleótidos de la SEQ ID NO. 1 y de la SEQ ID NO. 2 (cada uno,
10 pmol/\mul), 0,3 \mul del oligonucleótido de la SEQ ID NO. 3
(10 pmol/\mul), 0,25 \mul de ADN-polimerasa Taq
(1,25 unidades, Catálogo de Perkin-Elmer 1995/96
PCR-Systems, Reagents and Consumables), 11,45 \mul
de H_{2}O), se mezcla y se someten a los siguientes ciclos
térmicos:
- 1.
- Desnaturalización inicial durante 1 min a 90ºC;
- 2.
- 30 ciclos, respectivamente desnaturalización durante 28 seg a 94ºC, e hibridación y prolongación durante 1 min a 52ºC;
- 3.
- Refrigeración a 4ºC hasta la evaluación.
La reacción de PCR se evalúa en un espectrómetro
de fluorescencia. Para esto, se mide la fluorescencia a las
longitudes de onda de informador y extintor (518 nm para FAM y 582
nm para TAMRA), y se determina el cociente correspondiente entre
informador y extintor (RQ). Se resta el valor medio de los cocientes
de tres controles negativos (RQ^{-}), y el valor calculado se
expresa como \DeltaRQ. Las muestras con un \DeltaRQ igual o
mayor que 10^{6} hasta 10^{7} se evalúan como positivas, las
muestras menores que 0,7, como negativas. De este modo, sólo se
evalúan como positivas aquellas muestras cuyo contenido en ADN es
mayor que 10^{6} hasta 10^{7} equivalentes genómicos/ml.
Protocolo de
secuencia:
Datos
generales
- Solicitante:
- Centeon Pharma GmbH
- \quad
- Calle Emil-von-Behring 76 35041 Marburgo
- \quad
- República Federal de Alemania
- \quad
- Tel.: (0 64 21) 39-20 69
- \quad
- Fax: (0 64 21) 39-45 58
- Título de la invención:
- Procedimiento para la detección de soluciones de proteínas plasmáticas de título alto mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
- Número de secuencias:
- 3
\vskip1.000000\baselineskip
- Dirección del remitente:
- Centeon Pharma GmbH
- \quad
- Apartado de Correos 12 30
- \quad
- 35002 Marburgo
- \quad
- República Federal de Alemania
\vskip1.000000\baselineskip
Datos
generales
Edición
informática:
- Soporte de datos:
- Diskette
- Ordenador:
- PC IBM-compatible
- Sistema Operativo:
- PC-DOS / MS-DOS
- Software:
- Microsoft Windows 6.0
\vskip1.000000\baselineskip
Datos de la SEQ ID NO.
1:
- \quad
- Longitud: 22 pares de bases
- \quad
- Tipo: Oligonucleótido
- \quad
- Forma de cadena: Cadena única
- \quad
- Topología: lineal
- \quad
- Origen: Síntesis química
- \quad
- Característica: Cebador para la PCR de una secuencia de parvovirus B19.
- \quad
- Nombre: Oligo 1
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción de la
secuencia:
- \quad
- 5’ ATG GGC CGC CAA CAG GAA A 3’
\vskip1.000000\baselineskip
Datos de la SEQ ID NO.
2:
- \quad
- Longitud: 23 pares de bases
- \quad
- Tipo: Oligonucleótido
- \quad
- Forma de cadena: Cadena única
- \quad
- Topología: lineal
- \quad
- Origen: Síntesis química
- \quad
- Característica: Cebador para la PCR de una secuencia de ADN de parvovirus B19.
- \quad
- Nombre: Oligo 2
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción de la
secuencia:
- \quad
- 5’ CAG GCA CAG CTA CAC TTC CAC GC 3’
\vskip1.000000\baselineskip
Datos de la SEQ ID NO.
3:
- \quad
- Longitud: 26 pares de bases, con dos pigmentos fluorescentes situados en los extremos
- \quad
- Tipo: Oligonucleótido
- \quad
- Forma de cadena: Cadena única
- \quad
- Topología: lineal
- \quad
- Origen: Síntesis química
- \quad
- Característica: Sonda TaqMan® para usar en el ensayo de 5’-nucleasa.
- \quad
- Nombre: Oligo 3
\vskip1.000000\baselineskip
Descripción de la
secuencia:
- \quad
- 5’ FAM-TGG-TGG-TCT-GGG-ATG-AAG-GTA-TTA-TT-TAMRA 3’
FAM y TAMRA son pigmentos fluorescentes.
Claims (5)
1. Procedimiento para la preparación de
productos plasmáticos, caracterizado porque se excluyen todas
las donaciones de sangre en las que se detectan, por medio de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), más de 10^{6} hasta
10^{7} equivalentes genómicos/ml de parvovirus B19, en donde el
ajuste de la sensibilidad de la PCR se realiza de tal forma que el
ADN de parvovirus B19 sólo se detecta en aquellas donaciones cuyo
contenido en ADN es mayor que 10^{6} hasta 10^{7} equivalentes
genómicos/ml.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el ajuste de sensibilidad de la PCR se
realiza efectuando la hibridación del cebador con la cadena única
de ADN, así como la amplificación a una temperatura de
aproximadamente 52ºC, y sin llevar a cabo más de 30 ciclos.
3. Procedimiento según al menos una de las
reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el ajuste de
sensibilidad de la PCR se realiza trabajando con muestras altamente
diluidas.
4. Procedimiento según al menos una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la sección
amplificada de ADN de parvovirus se detecta con una sonda
adicional, que porta dos pigmentos fluorescentes, en donde la
fluorescencia de un pigmento (informador) resulta reducida por la
proximidad del segundo pigmento (extintor), con la condición de que
el cebador adicional siga estando intacto, y la fluorescencia del
informador aumenta en cuanto se suprime el cebador adicional por
una ADN-polimerasa térmicamente estable y por su
actividad endonucleolítica.
5. Procedimiento según al menos una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque como
ADN-polimerasa térmicamente estable se utiliza,
preferentemente, la ADN-polimerasa Taq.
Applications Claiming Priority (2)
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