ES2259249T3 - Variantes de alfa-amilasa. - Google Patents
Variantes de alfa-amilasa.Info
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Abstract
Variante de una alfa-amilasa híbrida madre de la alfa-amilasa de B. licheniformis mostrada en la SEC ID NO: 4 y alfa-amilasa de B. amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5, dicha alfa-amilasa híbrida de Bacillus siendo idéntica a la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en la SEC ID No: 4, a excepción de que los 35 residuos de aminoácidos N-terminales (de la proteína madura) son sustituidos con los 33 residuos de aminoácidos N-terminales de la proteína madura de la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID No: 5, que además tiene las mutaciones siguientes: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración de la SEC ID No: 4).
Description
Variantes de
\alpha-amilasa.
La presente invención se refiere a variantes
nuevas de \alpha-amilasas madres con propiedades
alteradas relativas de la alfa-amilasa madre. Dichas
propiedades incluyen mayor estabilidad, p. ej., a pH ácido, p. ej.,
a concentraciones de calcio bajas y/o a altas temperaturas. Tales
variantes son adecuadas para varias aplicaciones, en particular,
para el tratamiento del almidón industrial (p. ej., licuefacción de
almidón o sacarificación).
Las \alpha-amilasas
(\alpha-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas,
EC 3.2.1.1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la
hidrólisis del almidón y otros oligo- y polisacáridos
1,4-glucosídicos lineales y ramificados.
Hay un cuerpo muy extenso de patentes y
bibliografía científica acerca de esta clase tan importante
industrialmente de enzimas. Varias \alpha-amilasas
tales como las variantes de \alpha-amilasas del
tipo Termamyl son conocidas a partir de, p. ej., WO 90/11352, WO
95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873 y WO 96/23874.
WO 96/23874 proporciona los datos estructurales
por un cristal de rayos X tridimensional para una
\alpha-amilasa del tipo Termamyl que consiste en
los 300 residuos de aminoácidos N-terminales de la
\alpha-amilasa de B. amylolíquefaciens y
los aminoácidos 301-483 del extremo
C-terminal de la \alpha-amilasa de
B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos
(esta última estando disponible comercialmente bajo el nombre
comercial Termamyl^{TM}), y que está por lo tanto bastante
relacionada con las \alpha-amilasas de
Bacillus industrialmente importantes (las cuales en el
presente contexto están comprendidas dentro del significado de los
términos "\alpha-amilasas del tipo Termamyl",
y las cuales incluyen, entre otras, las
\alpha-amilasas de B. licheniformis, B.
amyloliquefaciens y B. stearothermophilus). WO 96/23874
además describe la metodología para diseñar, en base a un análisis
de la estructura de una \alpha-amilasa del tipo
Termamyl, variantes de la \alpha-amilasa del tipo
Termamyl las cuales muestran propiedades alteradas relativas a
la
madre.
madre.
La presente invención se refiere a una variante
de una \alpha-amilasa híbrida madre de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis mostrada
en SEC ID No: 4 y \alpha-amilasa de B.
amyloliquefaciens mostrada en SEC ID No: 5, en particular
variantes que exponen mayor estabilidad al pH ácido a altas
temperaturas (relativas a la madre) que son ventajosas en relación
con, p. ej., el tratamiento industrial del almidón (licuefacción
del almidón, sacarificación y similares) como se describe en la
patente estadounidense Nº. 3.912.590 y en las publicaciones de
patentes EP Nos. 252.730 y 63.909.
Un proceso "tradicional" de conversión del
almidón que degrada el almidón a componentes de carbohidratos de
peso molecular más bajo tales como azúcares o sustitutos de grasa
incluye una fase desramificante.
En el caso de convertir el almidón en un azúcar
el almidón es despolimerizado. Este proceso de despolimerización
consiste en una fase de pretratamiento y dos o tres fases del
proceso consecutivas, es decir, un proceso de licuefacción, un
proceso de sacarificación y dependiendo del producto final deseado
opcionalmente un proceso de isomerización.
El almidón natural consiste en gránulos
microscópicos que son insolubles en agua a la temperatura ambiente.
Cuando se calienta una pasta de almidón acuosa, los gránulos se
hinchan y finalmente estallan, dispersando las moléculas de almidón
en la solución. Durante este proceso de "gelatinización" hay un
aumento espectacular de la viscosidad. Como el nivel de sólidos es
del 30-40% en un proceso normalmente industrial, el
almidón tiene que ser diluido o "licuado" de modo que pueda
ser manipulado. Esta reducción de la viscosidad es hoy
principalmente obtenida por degradación enzimática.
Durante la la fase de licuefacción, el almidón
de cadena larga es degradado en unidades más cortas ramificadas y
lineales (maltodextrinas) por una \alpha-amilasa
(p. ej., Termamyl^{TM} SEC ID NO: 4 de la presente). El proceso
de licuefacción se realiza a 105-110ºC durante 5 a
10 minutos seguido de 1-2 horas a 95ºC. El pH se
encuentra entre 5.5 y 6.2. Para asegurar una estabilidad enzimática
óptima bajo estas condiciones, se añade 1 mM de calcio (40 ppm de
iones calcio libres). Después de este tratamiento el almidón licuado
tendrá un "equivalente de dextrosa" (DE) de
10-15.
10-15.
Después del proceso de licuefacción las
maltodextrinas son convertidas en dextrosa por adición de una
glucoamilasa (p. ej., AMG^{TM}) y una enzima desramificante, tal
como una isoamilasa (patente estadounidense 4.335.208) o una
pululanasa (p. ej., Promozyme^{TM}) (patente estadounidense
4.560.651). Antes de esta fase el pH es reducido a un valor por
debajo de 4.5, manteniendo la temperatura alta (por encima de 95ºC)
para inactivar la \alpha-amilasa licuefactante
para reducir la formación de oligosacáridos cortos llamados
"precursores de panosa" los cuales no pueden ser hidrolizados
adecuadamente por la enzima desramificante.
La temperatura es reducida por debajo de 60ºC, y
la glucoamilasa y la enzima desramificante son agregadas. El
proceso de sacarificación se efectúa durante 24-72
horas.
Normalmente, cuando se desnaturaliza la
\alpha-amilasa después de la fase de licuefacción
aproximadamente el 0.2-0.5% del producto de la
sacarificación es el trisacárido ramificado
6^{2}-\alpha-glucosil maltosa
(panosa) el cual no puede ser degradado por una pululanasa. Si la
amilasa activa de la fase de licuefacción está presente durante la
sacarificación (es decir, sin desnaturalización), este nivel puede
ser tan elevado como 1-2%, que es muy indeseable
puesto que reduce el rendimiento de la sacarificación
significativamente.
Cuando el producto de azúcar final deseado es p.
ej. jarabe con alto contenido en fructosa, el jarabe de dextrosa
puede ser convertido en fructosa. Después del proceso de
sacarificación el pH es aumentado hasta un valor en la gama de
6-8, preferiblemente pH 7.5, y el calcio es
eliminado por intercambio iónico. El jarabe de dextrosa es luego
convertido en jarabe con alto contenido en fructosa, p. ej., una
glucosaisomerasa inmovilizada (tal como Sweetzyme^{TM})
En el contexto de la invención el término "pH
acídico" significa un pH inferior a 7.0, especialmente por
debajo de la gama de pH en la que los procesos de licuefacción del
almidón industriales son generalmente realizados, según el modo
descrito anteriormente, el cual está entre pH 5.5 y 6.2.
En el contexto de la presente invención los
términos "baja concentración de calcio" se refiere a
concentraciones por debajo del nivel normal usado en los procesos
de licuefacción del almidón industriales tradicionales, como entre
0-40 ppm, preferiblemente entre
10-30 ppm, como entre 15-25 ppm de
Calcio. Las concentraciones normales varían dependiendo de la
concentración de Ca^{2+} libre en el maíz. Normalmente se añade
una dosificación correspondiente a 1 mM (40 ppm) que junto con el
nivel de maíz da entre 40 y 60 ppm de Ca^{2+} libre.
En el contexto de la invención los términos
"temperatura elevada" se refieren a temperaturas entre 95 y
160ºC, especialmente a la gama de temperatura en la que los
procesos de licuefacción del almidón industriales son normalmente
realizados, es decir entre 95 y 105ºC.
La invención también se refiere a constructos de
ADN que codifican variantes de la invención, a métodos para
preparar las variantes de la invención, y al uso de las variantes
de la invención, solas o en combinación con otras enzimas
\alpha-amilolíticas, en varios procesos
industriales, en particular para la licuefacción del almidón.
En la presente descripción y reivindicaciones,
se usan los códigos una sola letra y de tres letras convencionales
para residuos de aminoácidos.
Para una referencia más fácil, las variantes de
\alpha-amilasa de la invención se describen
usando la nomenclatura siguiente:
- Aminoácido(s) original(es):posición(es):aminoácido(s) sustituido(s)
Según esta nomenclatura, por ejemplo la
sustitución de alanina por asparraguina en la posición 30 se indica
como:
- Ala30Asn o A30N
una supresión de alanina en la misma posición se
indica como:
- Ala30* o A30*
y la inserción de un residuo de aminoácido
adicional, tal como la lisina, se indica como:
- Ala30AlaLys o A30AK
Una supresión de una extensión consecutiva de
residuos de aminoácidos, como los residuos de los aminoácidos
30-33, se indica como (30-33)* o
\Delta(A30-N33).
Cuando una \alpha-amilasa
específica contiene una "supresión" en comparación con otras
\alpha-amilasas y se hace una inserción en esta
posición esto se indica como:
- *36Asp o *36D
para la inserción de un ácido aspártico en la
posición 36. Las mutaciones múltiples son separadas por el signo
más, es decir:
- Ala30Asp + Glu34Ser o A30N+E34S
representando mutaciones en las posiciones 30 y
34 sustituyendo la alanina y el ácido glutámico por asparraguina y
serina, respectivamente. Una mutación múltiple puede también ser
separada como sigue, es decir, significando lo mismo que el signo
más:
- Ala30Asp/Glu34Ser o A30N/E34S
Cuando uno o más residuos de aminoácidos
alternativos pueden ser insertados en una posición dada se indica
como
- A30N,E o
- A30N o A30E
Además, cuando una posición adecuada para la
modificación es identificada en la presente sin que se sugiera una
modificación específica, debe entenderse que cualquier residuo de
aminoácido puede ser sustituido por el residuo de aminoácido
presente en la posición. Así, por ejemplo, cuando una modificación
de una alanina en la posición 30 está mencionada, pero no
especificada, debe entenderse que la alanina puede ser suprimida o
sustituida por cualquier otro aminoácido, es decir, cualquiera
de:
- R,N,D,A,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.
Figura 1 es un alineamiento de las secuencias de
aminoácidos de seis \alpha-amilasas madres del
tipo Termamyl en el contexto de la invención. Los números en el
Extremo izquierdo designan las secuencias de aminoácidos respectivas
como sigue:
- 1:
- SEC ID NO: 2,
- 2:
- Amilasa
- 3:
- SEC ID NO: 1,
- 4:
- SEC ID NO: 5,
- 5:
- SEC ID NO: 4,
- 6:
- SEC ID NO: 3.
Figura 2 muestra la estrategia de la PCR usada
en el ejemplo 1.
Es bien sabido que varias
\alpha-amilasas producidas por Bacillus
spp. son muy homólogas en el nivel aminoácido. Por ejemplo, la
\alpha-amilasa de B. licheniformis que
comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 4
(comercialmente disponible como Termamyl^{TM}) se ha encontrado
que tiene sobre el 89% de homología con la
\alpha-amilasa de B. amyloliquefaciens que
comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 5
y sobre el 79% de homología con la \alpha-amilasa
de B. stearothermophilus que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID NO: 3. Además las
\alpha-amilasas homólogas incluyen una
\alpha-amilasa derivada de una cepa del
Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375,
todas estando descritas con detalle en WO 95/26397, y la
\alpha-ami-
lasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophvsical Research Communications, 151 (1988), págs. 25-31.
lasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophvsical Research Communications, 151 (1988), págs. 25-31.
Otras \alpha-amilasas
homólogas adicionales incluyen la \alpha-amilasa
producida por la cepa de B. licheniformis descrita en EP
0252666 (ATCC 27811), y las \alpha-amilasas
identificadas en WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras
\alpha-amilasas de B. licheniformis del
tipo Termamyl comerciales son Optitherm^{TM} y Takatherm^{TM}
(disponibles por Solvay), Maxamyl^{TM} (disponible por
Gist-brocades/Genencor), Spezym AA^{TM} y Spezyme
Delta AA^{TM} (disponible por Genencor), y Keistase^{TM}
(disponible por Daiwa).
Dada la homología sustancial encontrada entre
estas \alpha-amilasas, se considera que
pertenecen a la misma clase que las
\alpha-amilasas, es decir a la clase de
"\alpha-amilasas del tipo Termamyl".
En consecuencia, en este contexto, los términos
"\alpha-amilasa del tipo Termamyl" se
destina a indicar una \alpha-amilasa que, a nivel
del aminoácido, muestra una homología sustancial al
Termamyl^{TM}, es decir, la \alpha-amilasa de
B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID NO: 4 de la presente. En otras palabras, una
\alpha-amilasa del tipo Termamyl es una
\alpha-amilasa que tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en las SEC ID Nos: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7 o 8 de
la presente, y la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID NO:
1 de WO 95/26397 (la misma que la secuencia de aminoácidos mostrada
como SEC ID NO: 7 en la presente) o en la SEC ID NO: 2 de WO
95/26397 (la misma que en la secuencia de aminoácidos mostrada como
SEC ID NO: 8 en la presente) o en Tsukamoto et al., 1988,
(cuya secuencia de aminoácidos está mostrada en la SEC ID NO: 6 en
la presente) o i) que muestra al menos el 60% de homología
(identidad), prefiriéndose al menos el 70%, más preferido al menos
el 75%, más preferido incluso al menos el 80%, especialmente al
menos el 85%, especialmente preferido al menos el 90%,
especialmente al menos el 95%, incluso especialmente más preferido
al menos el 97%, especialmente al menos el 99% de homología con al
menos una de dichas secuencias de aminoácidos mostradas en SEC ID
Nos 1: ó 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6 ó 7 ó 8 y/o ii) muestra reacción cruzada
inmunológica con un anticuerpo mejorado contra una o más de dichas
\alpha-amilasas, y/o iii) que está codificada por
una secuencia de ADN que se hibridiza, bajo condiciones de baja a
muy alta astringencia (dichas condiciones descritas abajo) hasta
las secuencias de ADN que codifican las
\alpha-amilasas especificadas anteriormente que
son aparentes de las SEC ID Nos: 9, 10, 11, 12, y 32,
respectivamente, de la presente solicitud (que codifica las
secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nos: 1; 2; 3; 4,
y 5 en la presente, respectivamente), de la SEC ID No: 4 de WO
95/26397 (cuya secuencia de ADN, con el codón de detención TAA,
está mostrada en la SEC ID No: 13 de la presente y codifica la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID No: 8 de la
presente) y de la SEC ID Nº: 5 de WO 95/26397 (mostrada en la SEC ID
No: 14 de la presente), respectivamente.
En relación con la propiedad i), la
"homología" (identidad) puede ser determinada usando cualquier
algoritmo convencional, preferiblemente usando el progama gap del
paquete GCG versión 8 (Agosto 1994) que utiliza valores por defecto
para las penalizaciones de los huecos, es decir, una penalización
por creación de huecos de 3.0 y penalización por extensión de los
huecos de 0.1 (Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for
the GCG Package, version 8, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,
EEUU 53711).
Un alineamiento estructural entre Termamyl® (SEC
ID NO: 4) y una \alpha-amilasa del tipo Termamyl
puede ser usado para identificar posiciones
equivalentes/correspondientes en otras
\alpha-amilasas del tipo Termamyl. Un método para
obtener dicho alineamiento estructural es usando el programa Pile Up
del paquete GCG usando valores por defecto de penalizaciones por
huecos, es decir, una penalización por creación de huecos de 3.0 y
una penalización por extensión de los huecos de 0.1. Otros métodos
de alineamiento estructural incluyen el análisis del cluster
hidrofóbico (Gaboriaud et al., (1987), FEBS LETTERS 224,
págs. 149-155) y enhebrado inverso (Huber, T; Torda,
AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, No. 1 págs. 142-149
(1998).
Por ejemplo, las posiciones correspondientes, de
residuos diana encontrados en el C-dominio de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis, en las
secuencias de aminoácidos de varias
\alpha-amilasas del tipo Termamyl que han sido ya
mencionadas son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
| \alpha-amilasa del tipo Termamyl | |||||
| B. lich. (SEC ID No: 4) | S356 | Y358 | E376 | S417 | A420 |
| B. amylo. (SEC ID No: 5) | S356 | Y358 | E376 | S417 | A420 |
| B. stearo.(SEQ ID No: 3) | - - - - | Y361 | - - - - | - - - - | - - - - |
| Bac.WO 95/26397 (SEC ID No: 2) | - - - - | Y363 | - - - - | S419 | - - - - |
| Bac.WO 95/26397 (SEC ID No: 1) | - - - - | Y363 | - - - - | - - - - | - - - - |
\vskip1.000000\baselineskip
Como se describirá adicionalmente más abajo las
mutaciones de estos residuos de aminoácidos conservados están muy
relacionadas con el aumento de la estabilidad a pH ácido y/o a una
concentración de calcio baja a altas temperaturas.
Propiedad ii) (ver arriba) de la
\alpha-amilasa, es decir, la reactividad cruzada
inmunológica, puede ser evaluada usando un anticuerpo preparado
contra, o reactivo con, al menos un epítopo de la
\alpha-amilasa del tipo Termamyl relevante. El
anticuerpo, que puede bien ser monoclonal o policlonal, puede ser
producido por métodos conocidos en la técnica, p. ej., como se
describe por Hudson et al., Practical Immunology, Third
edition (1989), Blackwell Scientific Publications. La reacción
cruzada inmunológica puede ser determinada usando ensayos conocidos
en la técnica, ejemplos de ellos son el de Western Blotting o el
ensayo de inmunodifusión radial, p. ej., como se describe por
Hudson et al., 1989. En este aspecto, se ha encontrado la
reacción cruzada inmunológica entre las
\alpha-amilasas que tienen las secuencias de
aminoácidos SEC ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8
respectivamente.
La sonda de oligonucleótidos usada en la
caracterización de la \alpha-amilasa del tipo
Termamyl conforme a la propiedad iii) arriba puede de manera
adecuada ser preparada basándose en la secuencia completa o parcial
de nucleótidos o de aminoácidos de la
\alpha-amilasa en cuestión.
Condiciones adecuadas para evaluar la
hibridación implican el preremojo en 5xSSC y la prehibridación
durante 1 hora a \sim40ºC en una solución del 20% de formamida,
solución de 5xDenhardt, 50 mM de fosfato sódico, pH 6.8, y 50 mg de
ADN de timo de ternero ultrasónico desnaturalizado, seguido de la
hibridación en la misma solución suplementada con 100 mM de ATP
durante 18 horas a \sim40ºC, seguido de tres lavados del filtro
en 2xSSC, 0.2% de SDS a 40ºC durante 30 minutos (astringencia
baja), preferido a 50ºC (astringencia media), más preferiblemente a
65ºC (astringencia alta), incluso más preferiblemente a \sim75ºC
(astringencia muy alta). Más detalles sobre el método de hibridación
pueden ser encontrados en Sambrook et al., Molecular
Cloninq: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor,
1989.
En este contexto, "derivado de" está
destinado no sólo a indicar una \alpha-amilasa
producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino
también una \alpha-amilasa codificada por una
secuencia de ADN aislada de esta cepa y producida en un organismo
huésped transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el
término se destina a indicar una \alpha-amilasa
que está codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o
de ADNc y que tiene las características de identificación de la
\alpha-amilasa en cuestión. El término está
también destinado a indicar que la \alpha-amilasa
madre puede ser una variante de una
\alpha-amilasa de origen natural, es decir, una
variante que es el resultado de una modificación (inserción,
sustitución, supresión) de uno o más residuos de aminoácidos de la
\alpha-amilasa de origen natural.
La \alpha-amilasa madre (el
esqueleto) es una \alpha-amilasa híbrida, es
decir, una \alpha-amilasa que comprende una
combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivadas de dos
\alpha-amilasas.
La \alpha-amilasa madre
comprende una parte C-terminal de una
\alpha-amilasa derivada de una cepa de B.
licheniformis, y una parte N-terminal de una
\alpha-amilasa derivada de una cepa de B.
amyloliquefaciens. La \alpha-amilasa madre
comprende al menos 430 residuos de aminoácidos de la parte
C-terminal de la \alpha-amilasa de
B. licheniformis. Esta \alpha-amilasa
híbrida del tipo Termamyl es idéntica a la
\alpha-amilasa de Bacillus licheniformis
mostrada en la SEC ID NO: 4, a excepción de que los 35 residuos de
aminoácidos N-terminales (de la proteína madura)
está sustituida con los 33 residuos de aminoácidos
N-terminales de la proteína madura de la
\alpha-amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens (BAN) mostrada en SEC ID NO: 5.
A continuación se discute la relación entre
alteraciones/mutaciones que pueden estar presentes en las variantes
de la invención, y las alteraciones deseables en las propiedades
(respecto a las de una \alpha-amilasa del tipo
Termamyl madre) que pueden resultar de éstas.
La presente invención se refiere a una variante
de una \alpha-amilasa madre híbrida de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis mostrada
en la SEC ID NO: 4 y de \alpha-amilasa de B.
amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5, dicha
alfa-amilasa de Bacillus híbrida siendo idéntica a
la \alpha-amilasa de Bacillus licheniformis
mostrada en la SEC ID NO: 4, a excepción de que los 35 residuos de
aminoácidos N-terminales (de la proteína madura)
son sustituidos con los 33 residuos de aminoácidos
N-terminales de la proteína madura de la
\alpha-amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5, que además tiene
las mutaciones siguientes: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la
numeración de la SEC ID NO: 4).
La presente invención se refiere a una variante
de \alpha-amilasa de una
\alpha-amilasa híbrida madre, que comprende una
alteración en una o más posiciones seleccionadas del grupo de:
E376, S417, A420, S356, Y358.
En una forma de realización, la alteración es
una de las sustituciones siguientes:
- E376A,R,D,C,Q,G,H,I,K,L,M,N,F,P,S,T,W,Y,V.
En una forma de realización preferida, la
sustitución es: E376K.
En una forma de realización la alteración es una
de las sustituciones siguientes:
S417A,R,D,C,E,Q,G,H,I,K,L,M,N,
F,P,T,W,Y,V; En una forma de realización preferida la sustitución es S417T.
F,P,T,W,Y,V; En una forma de realización preferida la sustitución es S417T.
En una forma de realización la alteración es una
de las sustituciones siguientes
A420R,D,C,E,Q,G,H,I,K,L,M,N,F,
P,S,T,W,Y,V; En una forma de realización preferida la sustitución es: A420Q,R.
P,S,T,W,Y,V; En una forma de realización preferida la sustitución es: A420Q,R.
En una forma de realización la alteración es una
de las sustituciones siguientes:
S356A,R,D,C,E,Q,G,H,I,K,L,M,N,
F,P,T,W,Y,V.
F,P,T,W,Y,V.
En una forma de realización la alteración es una
de las sustituciones siguientes
Y358A,R,D,C,E,Q,G,H,I,K,L,M,N,
F,P,S,T,W,V. En una forma de realización preferida la sustitución es Y358F.
F,P,S,T,W,V. En una forma de realización preferida la sustitución es Y358F.
En una forma de realización de la invención una
variante comprende una o más de las sustituciones siguientes:
E376K, S417T, A420Q,R, S356A, Y358F.
El aumento de estabilidad a pH ácido y/o a una
concentración de calcio baja a altas temperaturas puede ser
determinado usando el método descrito abajo en el ejemplo 2 que
ilustra la invención.
La \alpha-amilasa madre puede
ventajosamente también tener una mutación en una o más de las
posiciones siguientes: K176, I201 y H205 (usando la numeración de
la SEC ID No: 4), especialmente una o más las sustituciones
siguientes: K176R, I201F, y H205N (usando la numeración de la SEC ID
No: 4), así como específicamente las sustituciones siguientes:
K176R+I201F+H205N (usando la numeración de la SEC ID No: 4).
Los inventores han encontrado que las variantes
anteriormente mencionadas tienen estabilidad aumentada a pHs
inferiores a 7.0 (es decir, pH acídico) y/o a una concentración de
calcio inferior a 1 mM (40 ppm) (es decir, concentraciones de
calcio bajas) a temperaturas en la gama de 95 a 160ºC (es decir,
temperaturas altas) con respecto a la
\alpha-amilasa del tipo Termamyl madre.
Las alteraciones (p. ej., por sustitución) de
uno o más residuos de aminoácidos expuestos a solventes que 1)
aumentan la hidrofobicidad global de la enzima, o 2) aumentan el
número de grupos metilo en las cadenas laterales de los residuos de
aminoácidos expuestos a solventes mejoran la estabilidad de la
temperatura. Se prefiere alterar (p. ej., por sustitución) a más
residuos hidrofóbicos en una superficie cóncava con un pliegue
hacia adentro. En una superficie convexa las alteraciones (p. ej.,
por sustitución) a residuos de aminoácidos con un número aumentado
de grupos metilo en la cadena lateral son preferidas.
Usando el programa CAST encontrado en Internet
en http://sunrise.cbs.umn.edu/cast/versión 1.0 (de Feb.
1998).
(referencia: Jie Liang, Herbert Edeisbrunner, and Ciare Woodward. 1998. Anatomy of protein Pockets and Cavities: Measurements of binding site geometry and implications for ligand design. Protein Science, 7, págs. 1884-1897), un área cóncava que accede a la superficie puede ser identificada. El acceso a la superficie está definido en el programa como una sonda con un diámetro de 1.4 \ring{A} que puede pasar dentro y fuera. Usando los parámetros por defecto del programa CAST, se pueden encontrar cavidades cóncavas usando la estructura de alfa-amilasa baja en calcio de B. licheniformis como se encuentra en la base de datos de Brookhaven (1BPL):
(referencia: Jie Liang, Herbert Edeisbrunner, and Ciare Woodward. 1998. Anatomy of protein Pockets and Cavities: Measurements of binding site geometry and implications for ligand design. Protein Science, 7, págs. 1884-1897), un área cóncava que accede a la superficie puede ser identificada. El acceso a la superficie está definido en el programa como una sonda con un diámetro de 1.4 \ring{A} que puede pasar dentro y fuera. Usando los parámetros por defecto del programa CAST, se pueden encontrar cavidades cóncavas usando la estructura de alfa-amilasa baja en calcio de B. licheniformis como se encuentra en la base de datos de Brookhaven (1BPL):
Tres tipos de interacción pueden ser
racionalizados:
- A.
- Interacción entre la cadena lateral del residuo y la proteína,
- B.
- Interacción entre la cadena lateral del residuo y el agua circundante,
- C.
- Interacción entre el agua y la proteína.
Usando la \alpha-amilasa del
tipo Termamyl madre mostrada en SEC ID NO: 4 como esqueleto, las
posiciones siguientes están consideradas a estar expuestas a
solventes y pueden ser alteradas de manera adecuada: E376, S417,
A420, S356, Y358.
Las posiciones expuestas a solventes
correspondientes y otras posiciones en la superficie de otra
\alpha-amilasa del tipo Termamyl pueden ser
identificadas usando el programa dssp de W. Kabsch y C. Sander,
Biopolymers 22 (1983) págs. 2577-2637. Las
superficies convexas pueden ser identificadas usando el programa
AACAVI parte del paquete WHATIF (G. Vriend, Whatif and drug design
program. J. Mol. Graph. 8, pp. 52-56. (1990) versión
19980317).
En una forma de realización de la invención una
variante comprende una o más de las sustituciones siguientes:
E376K, S417T, A420Q.R, S356A, Y358F.
Los inventores han encontrado que la estabilidad
a pH ácido y/o a una concentración de calcio baja a altas
temperaturas puede ser aumentada todavía más combinando las
mutaciónes en las posiciones anteriormente mencionadas, es decir,
E376, S417, A420, S356, Y358, (usando la numeración de la SEC ID No:
4) con mutaciones en una o más de las posiciones K176, I201, y
H205.
Las sustituciones adicionales siguientes son
preferidas:
- K176A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,M,N,F,P,S,T,W,Y,V;
- I201A,R,D,C,E,Q,G,H,L,K,M,N,F,P,S,T,W,Y,V;
- H205A,R,D,C,E,Q,G,I,L,K,M,N,F,P,S,T,W,Y,V;
\newpage
Como también se muestra en el ejemplo 2 que
ilustra la invención, la combinación de las mutaciónes siguientes
dan una estabilidad aumentada:
K176+I201F+H205N+E376K+A420R o
K176+I201F+H205N+S417T+A420Q o
K176+I201F+H205N+S356A+Y358F usando la
\alpha-amilasa híbrida a la que se hace
referencia como LE174 como la \alpha-amilasa del
tipo Termamyl madre.
Puede ser preferido que una variante de la
invención comprenda una o más modificaciones además de las
subrayadas arriba. Así, puede ser ventajoso que uno o más residuos
de prolina presente(s) en la parte de la variante de
\alpha-amilasa que es modificada sea/sean
sustituido(s) con un residuo sin prolina que puede ser
cualquiera de los posibles residuos sin prolina de origen natural, y
que preferiblemente es una alanina, glicina, serina, treonina,
valina o leucina.
Análogamente, puede ser preferido que uno o más
residuos de cisteína presente(s) entre los residuos de
aminoácidos con los cuales la \alpha-amilasa madre
es modificada sea/sean sustituido(s) con un residuo sin
cisteína tal como serina, alanina, treonina, glicina, valina o
leucina.
Además, una variante de la invención puede -bien
como la única modificación o en combinación con cualquiera de las
modificaciones arriba subrayadas- ser modificada de modo que una o
más Asp y/o Glu presente en un fragmento de aminoácido
correspondiente a el fragmento de aminoácido 185-209
de la SEC ID No: 4 sea sustituido por una Asn y/o Gln,
respectivamente. También de interés es la sustitución, en la
\alpha-amilasa del tipo Termamyl, de uno o más de
los residuos de Lys presentes en un fragmento de aminoácido
correspondiente al fragmento de aminoácido 185-209
de la SEC ID No: 4 por una Arg.
Será entendido que la presente invención
comprende las variantes que incorporan dos o más de las
modificaciones arriba subrayadas.
Además, puede ser ventajoso introducir
mutaciones puntuales en cualquiera de las variantes descritas en la
presente.
La secuencia de ADN que codifica una
\alpha-amilasa madre puede ser aislada de
cualquier célula o microorganismo que produce la
\alpha-amilasa en cuestión, usando varios métodos
bien conocidos en la técnica. Primero, un ADN genómico y/o
biblioteca de ADNc debería ser construida usando ADN cromosómico o
ARN mensajero del organismo que produce la
\alpha-amilasa por estudiar. Después, si la
secuencia de aminoácidos de la \alpha-amilasa es
conocida, las sondas de oligonucleótidos homólogas, marcadas pueden
ser sintetizadas y usadas para identificar clones codificadores de
\alpha-amilasa de una biblioteca genómica obtenida
a partir del organismo en cuestión. De forma alternativa, una sonda
de oligonucleótidos marcada que contiene secuencias homólogas a un
gen de \alpha-amilasa conocido podría ser usada
como sonda para identificar clones codificadores de
\alpha-amilasa, usando unas condiciones de
hibridación y de lavado de menor astringencia.
Otro método para identificar clones
codificadores de \alpha-amilasa implica la
inserción de fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión,
tal como un plásmido, transfomación de bacterias
\alpha-amilasa-negativas con la
biblioteca de ADN genómico resultante, y luego colocación en placas
de las bacterias transformadas en agar conteniendo un sustrato para
\alpha-amilasa, permitiendo así que los clones
expresen la \alpha-amilasa para ser
identificada.
De forma alternativa, la secuencia de ADN que
codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos
estándar establecidos, p. ej. el método de fosforamidita descrito
por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers (1981) o el método descrito por
Matthes et al. (1984). En el método de fosforamidita, los
oligonucleótidos son sintetizados, p. ej., en un sintetizador de ADN
automático, purificados, fijados, ligados y clonados en los
vectores apropiados.
Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de
origen genómico y sintético mezclado, de origen sintético y de ADNc
mezclado o de origen genómico y de ADNc mezclado, preparado ligando
fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea
apropiado, los fragmentos correspondiendo a varias partes de la
secuencia de ADN entera), según las técnicas estándar. La secuencia
de ADN puede también ser preparada por reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se
describe en US 4.683.202 o R.K. Saiki et al. (1988).
Una vez que una secuencia de ADN codificadora de
\alpha-amilasa ha sido aislada, y los sitios
deseables para la mutación han sido identificados, las mutaciones
pueden ser introducidas usando oligonucleótidos sintéticos. Estos
oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean
los sitios de mutación deseados; los nucleótidos mutantes son
insertados durante la síntesis de los oligonucleótidos. En un
método específico, un hueco monocatenario de ADN, que conecta la
secuencia codificadora de \alpha-amilasa, es
creado en un vector portador del gen de
\alpha-amilasa. Luego el nucleótido sintético,
portador de la mutación deseada, es fijado a una parte homóloga del
ADN monocatenario. El hueco restante es luego rellenado con ADN
polimerasa I (Fragmento Klenow) y la construcción es ligada usando
T4 ligasa. Un ejemplo específico de este método está descrito en
Morinaga et al. (1984). US 4.760.025 expone la introducción
de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples mediante la
realización de menores alteraciones del casette. No obstante, una
variedad todavía superior de mutaciones puede ser introducida en un
momento cualquiera por el método de Morinaga, porque se puede
introducir una multitud de oligonucleótidos, de varias
longitudes.
longitudes.
Otro método para introducir mutaciones en
secuencias de ADN codificadoras de \alpha-amilasa
está descrito en Nelson y Long (1989). Esto implica la generación en
3 fases de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada
introducida usando una cadena de ADN sintetizada químicamente como
uno de los cebadores en las reacciones de la PCR. Del fragmento
generado por PCR, un fragmento de ADN portador de la mutación puede
ser aislado por seccionamiento con endonucleasas de restricción y
reinsertado en un plásmido de expresión.
La mutagénesis aleatoria se realiza de manera
adecuada bien como mutagénesis aleatoria localizada o específica de
la región en al menos tres partes del gen que traduce a la secuencia
de aminoácidos mostrada en cuestión, o dentro del gen entero.
La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN
que codifica una \alpha-amilasa madre puede ser
convenientemente realizada usando cualquier método conocido en la
técnica.
En relación con lo anterior, otro aspecto de la
presente invención se refiere a un método para generar una variante
de una \alpha-amilasa madre, p. ej., en el que la
variante muestra termoestabilidad alterada o aumentada con respecto
a la madre, el método comprendiendo:
(a) someter a una secuencia de ADN que codifica
la \alpha-amilasa madre a mutagénesis
aleatoria,
(b) expresar la secuencia de ADN mutada obtenida
en la fase (a) en una célula huésped, y
(c) selecionar células huéspedes que expresan
una variante de \alpha-amilasa que tiene una
propiedad alterada (es decir termoestabilidad) con respecto a la
\alpha-amilasa madre.
La fase (a) del método anterior de la invención
es preferiblemente realizada usando cebadores dopados.
Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede ser
realizada usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado,
usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo a la secuencia de
ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis
aleatoria puede ser realizada usando cualquier combinación de estos
agentes mutagenizantes. El agente mutagenizante puede, p. ej., ser
uno que induce transiciones, transversiones, inversiones,
aleatorización, eliminaciones, y/o inserciones.
Ejemplos de un agente mutagenizante físico o
químico adecuado para este objetivo incluyen la irradiación
ultravioleta (UV), hidroxilamina,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil
metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y
análogos de nucleótidos. Cuando estos agentes son usados, la
mutagénesis es normalmente realizada incubando la secuencia de ADN
que codifica la enzima madre por mutagenizar ante el agente
mutagenizante de elección bajo las condiciones adecuadas para que
la mutagénesis tenga lugar, y seleccionando el ADN mutado que tiene
las propiedades deseadas.
Cuando la mutagénesis es realizada usando un
oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado
con los tres nucleótidos no parentales durante la síntesis del
oligonucleótido en las posiciones que deben ser cambiadas. El dopaje
o adición puede hacerse de tal manera que los codones para los
aminoácidos indeseados sean evitados. El oligonucleótido dopado o
adicionado puede ser incorporado en el ADN que codifica la enzima
alfa-amilasa por cualquier técnica publicada,
usando p. ej. PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa como se
crea
apropiado.
apropiado.
Preferiblemente, el dopaje se realiza usando
"dopaje aleatorio constante", donde se predefina el porcentaje
de tipo salvaje y la mutación en cada posición. Además, el dopaje
puede ser dirigido a una preferencia para la introducción de los
nucleótidos determinados, y de ese modo una preferencia para la
introducción de uno o más residuos de aminoácidos específicos. El
dopaje puede hacerse, p. ej., para permitir la introducción del 90%
de tipo salvaje y del 10% de mutaciones en cada posición. Una
consideración adicional en la elección de un esquema de dopaje se
basa en limitaciones genéticas al igual que
proteínico-estructurales. El esquema de dopaje
puede ser hecho usando el programa DOPE que, entre otras cosas,
asegura que se evita la introducción de codones de deten-
ción.
ción.
\newpage
Cuando se usa la mutagénesis generada por PCR,
bien un gen tratado o no tratado químicamente que codifica una
\alpha-amilasa madre es sometido a PCR bajo
condiciones que aumentan la desincorporación de nucleótidos (Deshler
1992; Leung et al., Technique, Vol. 1, 1989, págs.
11-15).
Una cepa mutadora de E. coli (Fowler
et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, págs.
179-191), S. cereviseae o cualquier otro
organismo microbiano puede ser usada para la mutagénesis aleatoria
del ADN que codifica la \alpha-amilasa, p. ej.,
mediante la transformación de un plásmido conteniendo la glicosilasa
madre en la cepa mutadora, haciendo crecer la cepa mutadora con el
plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutadora. El
plásmido mutado puede ser posteriormente transformado en el
organismo de expresión.
La secuencia de ADN por mutagenizar puede estar
presente convenientemente en una biblioteca genómica o de ADNc
obtenida a partir de un organismo que expresa la
alfa-amilasa madre. De forma alternativa, la
secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal
como un plásmido o un bacteriófago, el cual como tal puede ser
incubado con o por el contrario expuesto al agente mutagenizante.
El ADN por mutagenizar puede también estar presente en una célula
huésped bien siendo integrado en el genoma de dicha célula o
estando presente en un vector comprendido en la célula. Finalmente,
el ADN por mutagenizar puede estar en forma aislada. Será entendido
que la secuencia de ADN que se deba someter a mutagénesis aleatoria
sea preferiblemente un ADNc o una secuencia de ADN genómico.
En algunos casos puede ser conveniente
amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar la fase de
expresión b) o la fase de selección c). Esta amplificación puede
ser realizada conforme a métodos conocidos en la técnica, el método
actualmente preferido siendo la amplificación generada por PCR
usando cebadores de oligonucleótidos preparada en base a la
secuencia de ADN de aminoácidos de la enzima madre.
Después de la incubación con o de la exposición
al agente mutagenizante, el ADN mutado es expresado cultivando una
célula huésped adecuada portadora de la secuencia de ADN bajo
condiciones que permiten que la expresión tenga lugar. La célula
huésped usada para este propósito puede ser una que haya sido
transformada con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente
en un vector, o una que fuera llevada por la secuencia de ADN que
codifica la enzima madre durante el tratamiento de mutagénesis.
Ejemplos de células huéspedes adecuadas son las siguientes:
Bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus
lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces
lividans o Streptomyces murinus; y bacterias
gram-negativas tales como E. coli.
La secuencia de ADN mutada puede además
comprender una secuencia de ADN que codifica las funciones que
permiten la expresión de la secuencia de ADN mutada.
La mutagénesis aleatoria puede estar
ventajosamente localizada en una parte de la
\alpha-amilasa madre en cuestión. Esto puede, p.
ej., ser ventajoso cuando algunas regiones de la enzima han sido
identificadas por ser de particular importancia para una propiedad
dada de la enzima, y que al modificarse está previsto que resulten
en una variante con propiedades mejoradas. Tales regiones pueden
normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la
enzima madre ha sido dilucidada y relacionada con la función de la
enzima.
La mutagénesis aleatoria localizada, o,
específica de la región es convenientemente realizada usando
técnicas de mutagénesis generada por PCR según el modo descrito
anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en la
técnica. De forma alternativa, la secuencia de ADN que codifica la
parte de la secuencia de ADN que se debe modificar puede ser
aislada, p. ej., mediante la inserción en un vector adecuado, y
dicha parte puede ser posteriormente sometida a mutagénesis usando
cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionados
anteriormente.
Los métodos alternativos para proporcionar
variantes de la invención incluyen el método de transposición de
genes conocido en la técnica incluyendo los métodos, p. ej.,
descritos en WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) y WO
96/00343 (de Novo Nordisk A/S).
De acuerdo con la invención, una secuencia de
ADN que codifica la variante producida por los métodos
anteriormente descritos, o por cualquier método alternativo
conocido en la técnica, puede ser expresada, en forma enzimática,
usando un vector de expresión que normalmente incluye secuencias de
control que codifican un promotor, operador, sitio de unión de
ribosomas, señal de iniciación de la traducción, y, opcionalmente,
un gen represor o varios genes activadores.
El vector de expresión recombinante que lleva la
secuencia de ADN que codifica una variante de
\alpha-amilasa de la invención puede ser cualquier
vector que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de
ADN recombinante, y la elección del vector a menudo dependerá de la
célula huésped en la que se deba introducir. Así, el vector puede
ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que
existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es
independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un
bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un
cromosoma artificial. De forma alternativa, el vector puede ser uno
que, al ser introducido en una célula huésped, se integra en el
genoma de la célula huésped y se replica con el(los)
cromosoma(s) donde se ha integrado.
En el vector, la secuencia de ADN debería estar
operativamente conectada a una secuencia de un promotor adecuado.
El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra
actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede
derivar de genes que codifican proteínas bien homólogas o
heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados
para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica
una variante de \alpha-amilasa de la invención,
especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón
lac de E. coli, los promotores del gen de agarasa dagA de
Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de
\alpha-amilasa (amyL) de Bacillus
licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica
(amyM) de Bacillus Stearothermophilus, los promotores de
\alpha-amilasa (amyQ) de Bacillus
Amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de
Bacillus subtilís etc. Para la transcripción en un huésped
fúngico, ejemplos de promotores útiles son los derivados del gen
que codifica la TAKA amilasa de A. oryzae, proteinasa
aspártica de Rhizomucor miehei,
\alpha-amilasa neutra de A. Niger,
\alpha-amilasa estable ácida de A. Níger,
glucoamilasa de A. Niger, lipasa de Rhizomucor miehei,
proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato isomerasa de
A. oryzae o acetamidasa de A. nidulans.
El vector de expresión de la invención puede
también comprender un terminador de la transcripción adecuado y, en
eucariotas, las secuencias de poliadenilación operativamente
conectadas a la secuencia de ADN que codifica la variante de
\alpha-amilasa de la invención. Las secuencias de
terminación y de poliadenilación pueden de manera adecuada derivar
de las mismas fuentes que el promotor.
El vector puede además comprender una secuencia
de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped
en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de
replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1
y plJ702.
El vector puede también comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complemente un defecto
en la célula huésped, tal como los genes dal de B.
subtilis o de B. licheniformis, o uno que confiera
resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina,
canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Además, el vector puede
comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como
amdS, argB, niaD y sC, un marcador que de lugar a la resistencia a
la higromicina, o bien la selección puede ser realizada por
cotransformación, p. ej. como se describe en WO 91/17243.
Mientras que la expresión intracelular puede ser
ventajosa en algunos aspectos, p. ej. cuando se usan bacterias
determinadas como células huéspedes, es generalmente preferido que
la expresión sea extracelular. En general, las
\alpha-amilasas de Bacillus mencionadas en
la presente comprenden una prerregión que permite la secreción de
la proteasa expresada en el medio de cultivo. Si se desea, esta
prerregión puede ser sustituida por una prerregión diferente o
secuencia señal, realizándose convenientemente por sustitución de
las secuencias de ADN que codifican las prerregiones
respectivas.
Los procedimientos usados para ligar el
constructo de ADN de la invención que codifica una variante de
\alpha-amilasa, el promotor, terminador y otros
elementos, respectivamente, y para insertarlos en los vectores
adecuados conteniendo la información necesaria para la replicación,
son bien conocidos por los expertos en la técnica (ver, por
ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor, 1989).
La célula de la invención, que comprende bien un
constructo de ADN o bien un vector de expresión de la invención tal
como se ha definido anteriormente, es ventajosamente usada como
célula huésped para la producción recombinante de una variante de
\alpha-amilasa de la invención. La célula puede
ser transformada con el constructo de ADN de la invención que
codifica la variante, convenientemente integrando el constructo de
ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración
está generalmente considerada como una ventaja puesto que la
secuencia de ADN es más propensa a ser mantenida de forma estable
en la célula. La integración de los constructos de ADN en el
cromosoma huésped puede ser realizada según los métodos
convencionales, p. ej. por recombinación homóloga o heteróloga. De
forma alternativa, la célula puede ser transformada con un vector
de expresión según el modo descrito anteriormente en relación con
los diferentes tipos de células huéspedes.
La célula de la invención puede ser una célula
de un organismo más grande tal como un mamífero o un insecto, pero
es preferiblemente una célula microbiana, p. ej., una célula
bacteriana o una micótica (incluyendo la leva-
dura).
dura).
Ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias
gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus
lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o
Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o
bacterias gramnegativas tales como E. coli. La
transformación de las bacterias puede, por ejemplo, ser efectuada
por transformación de protoplastos o usando células competentes de
una manera conocida per se.
El organismo de la levadura puede ser
seleccionado de forma favorable de una especie de
Saccharomyces o Schizosacaromices, p. ej.
Saccharomyces cerevisiae. El hongo filamentoso puede
ventajosamente pertenecer a una especie de Aspergillus, p.
ej. Aspergillus oryzae o Aspergillus Niger. Las
células micóticas pueden ser transformadas por un proceso que
implica la formación de protoplastos y la transformación de los
protoplastos seguido de la regeneración de la pared celular en
cierto modo conocido per se. Un procedimiento adecuado para
la transformación de células huésped de Aspergillus está
descrito en EP 238 023.
En otro aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un método para producir una variante de
\alpha-amilasa de la invención, este método
comprende el cultivo de una célula huésped según el modo descrito
anteriormente bajo condiciones propicias para la producción de la
variante y la recuperación de la variante de las células y/o del
medio de cultivo.
El medio usado para cultivar las células puede
ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la
célula huésped en cuestión y obtener la expresión de la variante de
\alpha-amilasa de la invención. Los medios
adecuados están disponibles por proveedores comerciales o pueden
ser preparados según recetas publicadas (p. ej., como se describe
en los catálogos de la American Type Culture Collection).
La variante de \alpha-amilasa
segregada a partir de las células huésped puede convenientemente
ser recuperada del medio de cultivo por procedimientos bien
conocidos, incluyendo la separación de las células del medio por
centrifugado o filtración, y precipitación de los componentes
proteináceos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio,
seguido del uso de procedimientos cromatográficos tales como la
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o
similar.
Las variantes de
\alpha-amilasa de esta invención poseen
propiedades valiosas que permiten una variedad de aplicaciones
industriales. Una variante enzimática de la invención es aplicable
como componente en composiciones detergentes para lavar la ropa,
para lavavajillas y para la limpieza de superficies duras. Muchas
variantes son particularmente útiles en la producción de
edulcorantes y etanol a partir de almidón, y/o para el desencolado
textil. Las condiciones para procesos de conversión del almidón
convencionales, incluyendo la licuefacción del almidón y/o procesos
de sacarificación, están descritos en, p. ej., US 3.912.590 y en
las publicaciones de patentes EP Nos. 252.730 y
63.909.
63.909.
Un proceso "tradicional" para la conversión
del almidón en jarabes de fructosa normalmente consiste en tres
procesos enzimáticos consecutivos, es decir, un proceso de
licuefacción seguido de un proceso de sacarificación y un proceso
de isomerización. Durante el proceso de licuefacción, el almidón es
degradado a dextrinas por una \alpha-amilasa (p.
ej. Termamyl^{TM}) a valores de pH entre 5.5 y 6.2 y a
temperaturas de 95-160ºC durante un periodo de
aprox. 2 horas. Para asegurar una estabilidad enzimática óptima
bajo estas condiciones, se añade 1 mM de calcio (40 ppm de iones
de calcio libre).
Después del proceso de licuefacción las
dextrinas son convertidas en dextrosa por adición de una
glucoamilasa (p. ej. AMG^{TM}) y una enzima desramificante, tal
como una isoamilasa o una pululanasa (p. ej. Promozyme^{TM})
Antes de esta fase el pH es reducido a un valor por debajo de 4.5,
manteniendo la temperatura alta (por encima de 95ºC), y la
actividad \alpha-amilasa liquefactante es
desnaturalizada. La temperatura es reducida a 60ºC, y se añade la
glucoamilasa y la enzima desramificante. El proceso de
sacarificación se desarrolla durante 24-72
horas.
Después del proceso de sacarificación el pH es
aumentado a un valor en la gama de pH de 6-8,
preferiblemente de 7.5, y el calcio es quitado por intercambio
iónico. El jarabe de dextrosa es luego convertido en sirope rico en
fructosa usando, p. ej., una glucosaisomerasa inmovilizada (tal
como Sweetzyme^{TM}).
Al menos 1 mejora enzimática de este proceso
podría ser prevista. Reducción de la dependencia del calcio de la
\alpha-amilasa liquefactante. La adición de
calcio libre es requerida para asegurar adecuadamente una
estabilidad elevada de la \alpha-amilasa, pero el
calcio libre inhibe fuertemente la actividad de la glucosaisomerasa
y requiere ser retirado, mediante una operación unitaria costosa,
hasta un punto en el que reduce el nivel de calcio libre por debajo
de 3-5 ppm. Los ahorros en el coste podrían ser
obtenidos si esta operación pudiera ser evitada y el proceso de
licuefacción pudiera ser realizado sin adición de iones de calcio
libre.
Para conseguirlo, se requiere una
\alpha-amilasa del tipo Termamy menos
calcio-dependiente que sea estable y altamente
activa a concentraciones bajas de calcio libre (< 40 ppm). Esta
\alpha-amilasa del tipo Termamyl debería tener un
pH óptimo a un pH en la gama de 4.5-6.5,
preferiblemente en la gama de 4.5-5.5.
Como se ha mencionado anteriormente, las
variantes de la invención pueden ser incorporadas de manera adecuada
en composiciones de detergentes. Se hace referencia, por ejemplo, a
WO 96/23874 y WO 97/07202 para detalles adicionales referentes a
ingredientes pertinentes de composiciones de detergentes (tales
como detergentes para lavar la ropa o lavavajillas), métodos
apropiados de formulación de las variantes en tales composiciones de
detergentes, y para ejemplos de tipos relevantes de composiciones de
detergentes.
Las composiciones de detergentes que comprenden
una variante de la invención pueden también comprender una o más
enzimas distintas, tales como una lipasa, cutinasa, proteasa,
celulasa, peroxidasa o lacasa, y/u otra
\alpha-amilasa.
Las variantes de
\alpha-amilasa de la invención pueden ser
incorporadas en detergentes a concentraciones empleadas de forma
convencional. Está actualmente contemplado que una variante de la
invención pueda ser incorporada en una cantidad correspondiente a
0.00001-1 mg (calculado como proteína enzimática
activa pura) de \alpha-amilasa por litro de
solución para lavar la ropa/lavavajillas usando niveles de
dosificación convencionales del detergente.
Variante de alpha-amilasa
híbrida LE174: LE174 es una alfa-amilasa híbrida
del tipo Termamyl que es idéntica a la secuencia de Termamyl, es
decir, la \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis mostrada en la SEC ID No: 4, a excepción de que
los 35 residuos de aminoácidos N-terminales (de la
proteína madura) han sido sustituidos por los 33 residuos
N-terminales de BAN (proteína madura), es decir, la
Alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens
mostrada en la SEC ID No: 5, que además tiene las mutaciones
siguientes: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (usando la numeración de
la SEC ID NO: 4).
Este vector transportador de E.
coli/bacillus puede utilizarse para introducir mutaciones sin
la expresión de \alpha-amilasa en E. coli y
luego ser modificado de tal manera que la
\alpha-amilasa esté activa en Bacillus. El
vector fue construido como sigue: El gen de
\alpha-amilasa en el vector de pX (pDN1528 con las
alteraciones siguientes dentro de amyL:
BAN(1-33), H156Y, A181T, N190F, A209V, Q264S,
el plásmido pDN1528 está también descrito en el ejemplo 1) fue
inactivado por interrupción en el sitio PstI en la región de
codificación 5' del gen de alfa-amilasa por un
fragmento de 1.2 kb que contenía un fragmento de origen de E.
coli. Este fragmento fue amplificado a partir del pUC19
(GenBank Accession #:X02514) usando el cebador directo 1:
5'-gacctgcagtcaggcaacta-3' (SEC ID
No: 28) y el cebador inverso 1:
5'-tagagtcgacctgcaggcat-3' (SEC ID
No: 29). El amplicon de la PCR y el plásmido pX que contenía el
gen de \alpha-amilasa fueron digeridos con PstI a
37ºC durante 2 horas. El fragmento del vector de pX y el amplicon de
origen de E. coli fueron ligados a temperatura ambiente
durante 1 hora y transformados en E. coli por
electrotransformación. El vector resultante se denomina pSnK101.
Este vector transportador de E.
coli/bacillus puede utilizarse para introducir mutaciones sin
expresión de \alpha-amilasa en E. coli y
luego ser modificado de tal manera que la
\alpha-amilasa esté activa en Bacillus. El
vector fue construido como sigue: El gen de
\alpha-amilasa en el vector de pX (pDN 1528 con
las alteraciones siguientes dentro de amyL:
BAN(1-33), H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S, el
plásmido pDN1528 está posteriormente descrito en el ejemplo 1) fue
inactivado por interrupción en el sitio PstI en la región de
codificación 5' del gen de alfa-amilasa por un
fragmento de 1.2 kb conteniendo un fragmento de origen de E.
coli. Este fragmento fue amplificado del pUC19 (GenBank Accesion
#:X02514) usando el cebador directo 2:
5'-gacctgcagtcaggcaacta-3' (SEC ID
No: 30) y el cebador inverso 2:
5'-tagagtcgacctgcaggcat-3' (SEC ID
No: 31). El amplicon de la PCR y el plásmido pX conteniendo el gen
de \alpha-amilasa fueron digeridos con PstI a
37ºC durante 2 horas. El fragmento del vector de pX y el amplicon de
origen de E. coli fueron ligados a temperatura ambiente
durante 1 hora y transformados en E. coli por
electrotransformación. El vector resultante se denomina
pSnK101.
Se colocan bibliotecas de Bacillus en un
sándwich de acetato de celulosa (OE 67, Schleicher & Schuell,
Dassel, Alemania) - y filtros de nitrocelulosa
(Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel,
Alemania) en placas de TY agar con 10 (g/ml de cloranfenicol a 37ºC
durante al menos 21 hrs. La capa de acetato de celulosa está
localizada en la placa de TY agar.
Cada sándwich de filtro es específicamente
marcado con una aguja después de la colocación en placas, pero
antes de la incubación con el fin de poder localizar variantes
positivas en el filtro y el filtro de nitrocelulosa con las
variantes unidas es transferido a un contenedor con tampón citrato,
pH 4.5 e incubado a 90ºC durante 15 min. Los filtros de acetato de
celulosa con colonias son almacenados en las placas de TY a
temperatura ambiente hasta su uso. Tras la incubación, la actividad
residual es detectada en las placas de ensayo que contienen un 1%
de agarosa, 0.2% de almidón en tampón citrato, pH 6.0. Las placas
de ensayo con filtros de nitrocelulosa son marcados de la misma
manera que el sándwich de filtro e incubados durante 2 horas a
50ºC. Después de la eliminación de los filtros las placas de ensayo
son coloreadas con una solución de Lugol al 10%. Las variantes que
degradan el almidón son detectadas como manchas blancas en fondo
azul oscuro y luego identificadas en las placas de almacenamiento.
Las variantes positivas son reseleccionadas dos veces bajo las
mismas condiciones que la primera selección.
Los transformantes positivos después de la
reselección son elegidos de la placa de almacenamiento y evaluados
en un ensayo de placas secundario. Transformantes positivos son
hechos crecer durante 22 horas a 37ºC en 5 ml de LB +
cloranfenicol. El cultivo de Bacillus de cada transformante
positivo y una variante de LE174 de control fueron incubados en un
tampón citrato, pH 4.5 a 90ºC y se tomaron muestras a 0, 10, 20,
30, 40, 60 y 80 minutos. Una muestra de 3 microlitros fue esparcida
en una placa de ensayo. La placa de ensayo fue coloreada con una
solución de Lugol al 10%. Las variantes mejoradas fueron vistas
como variantes con actividad residual más alta detectada como halos
en la placa de ensayo que el esqueleto. Las variantes mejoradas son
determinadas por secuenciación nucleótida.
Una cepa de B. subtilis conteniendo el
plásmido de expresión pertinente es colocado en líneas en una placa
de LB-agar con 15 (g/ml de cloranfenicol de un
caldo a -80ºC, y hecho crecer durante toda la noche a 37ºC. Las
colonias son transferidas a 100 ml de medios de BPX suplementadas
con 15 (g/ml de cloranfenicol en un matraz de agitación de 500
ml.
Composición del medio de BPX:
| Almidón de patata | 100 g/l |
| Harina de cebada | 50 g/l |
| BAN 5000 SKB | 0.1 g/l |
| Caseinato sódico | 10 g/l |
| Harina de soja | 20 g/l |
| Na_{2}HPO_{4}; 12 H_{2}O | 9 g/l |
| Pluronic^{TM} | 0.1 g/l |
El cultivo es agitado a 37ºC a 270 rpm durante 5
días.
Las células y fragmentos celulares son extraídos
del caldo de fermentación por centrifugado a 4500 rpm en
20-25 minutos. Después el sobrenadante es filtrado
para obtener una solución completamente clara. El producto filtrado
es concentrado y lavado en un filtro UF (membrana de 10000 cortes)
y el tampón es cambiado a 20 mM de Acetato, pH 5.5. El producto
filtrado por UF es aplicado en una S-sepharose F.F.
y se realiza la elución por una elución por fases con 0.2 M NaCl en
el mismo tampón. El eluato es dializado contra 10 mM de Tris, pH 9.0
y aplicado en una Q-sepharose F.F. y eluido con un
gradiente lineal de 0-0.3 M de NaCl sobre 6
volúmenes de columna. Las fracciones que contienen la actividad
(medidas por el ensayo Phadebas) son agrupadas, el pH fue ajustado a
pH 7.5 y el color restante fue extraido por un tratamiento con 0.5%
w/vol. de carbón activo en 5 minutos.
Todos los procesos de estabilidad han sido
realizados usando la misma preparación. El método es:
La enzima es incubada bajo las condiciones
pertinentes (1-4). Las muestras son tomadas a 0, 5,
10, 15 y 30 minutos y diluidas 25 veces (misma dilución para todas
las muestras tomadas) en un tampón de ensayo (0.1 M 50 mM tampón
Britton pH 7.3) y la actividad es medida usando el ensayo Phadebas
(Pharmacia) bajo condiciones estándar pH 7.3, 37ºC.
La actividad medida antes de la incubación (0
minutos) se usa como referencia (100%). El descenso del porcentaje
es calculado como función del período de incubación. La tabla
muestra la actividad residual después de 30 minutos de
incubación.
Una unidad de kilo de
alfa-amilasa (1 KNU) es la cantidad de enzimática
que rompe 5.26 g de almidón (Merck, Amylum Solubile, Erg. B 6, Batch
9947275) por hora en el método estándar de Novo Nordisk para la
determinación de alfa-amilasa en base a la
condición siguiente:
| Sustrato | almidón soluble |
| Contenido de calcio en solvente | 0.0043 M |
| Tiempo de reacción | 7-20 minutos |
| Temperatura | 37ºC |
| pH | 5.6 |
Una descripción detallada del método analítico
de Novo Nordisk (AF 9) está disponible bajo pedido.
La actividad \alpha-amilasa
está determinada por un método que utiliza comprimidos de Phadebas®
como sustrato. Los comprimidos de Phadebas (Phadebas® Amylase Test,
suministrada por Pharmacia Diagnostic) contienen un polímero de
almidón coloreado de azul insoluble entrecruzado que ha sido
mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia del tampón y
colocado en comprimidos.
Para cada medición individual una pastilla es
suspendida en un tubo conteniendo 5 ml de tampón
Britton-Robinson 50 mM (50 mM de ácido acético, 50
mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0.1 mM de CaCl_{2},
pH ajustado al valor de interés con NaOH). La prueba es realizada
al baño maría a la temperatura de interés. La
\alpha-amilasa que debe evaluarse es diluida en x
ml de 50 mM de tampón Britton-Robinson. 1 ml de
esta solución de \alpha-amilasa es añadido a 5 ml
de tampón Britton-Robinson 50 mM. El almidón es
hidrolizado por la \alpha-amilasa dando
fragmentos azules solubles. La absorbencia de la solución azul
resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función
de la actividad \alpha-amilasa.
Es importante que la absorbencia medida de 620
nm después de 10 ó 15 minutos de incubación (duración de la prueba)
esté en la gama de 0.2 a 2.0 unidades de absorbencia a 620 nm. En
esta gama de absorbencia hay un alineamiento entre actividad y
absorbencia (ley de Lambert-Beer). La dilución de
la enzima debe en consecuencia ser ajustada para cumplir este
criterio. Bajo un grupo especifico de condiciones (temp., pH,
tiempo de reacción, condiciones del tampón) 1 mg de una
\alpha-amilasa dada hidrolizará una cantidad
determinada de sustrato y se producirá un color azul. La intensidad
del color es medida a 620 nm. La absorbencia medida es directamente
proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína
pura de \alpha-amilasa) de la
\alpha-amilasa en cuestión bajo el grupo dado de
condiciones.
Para mejorar la estabilidad a bajo pH y la
concentración de calcio bajo la variante de
\alpha-amilasa LE174 madre, se realizó la
mutagénesis aleatoria en regiones preseleccionadas.
Las regiones fueron:
| Región: | Residuo: |
| SERI | A425-Y438 |
| SERII | W411-L424 |
| SERIII | G397-G410 |
| SERV | T369-H382 |
| SERVII | G310-F323 |
| SERIX | L346-P359 |
Por cada seis regiones, se sintetizan
oligonucleótidos aleatorios usando el mismo nivel de mutación (97%
del esqueleto y 1% de cada uno de los tres nucleótidos restantes
dando el 3% de mutaciones) en cada posición de nucleótidos en las
regiones anteriores, p. ej., 1. posición en el codón para A425:
97%C, 1%A, 1%T, 1%G. Los seis oligonucleótidos aleatorios y en caso
de usar cebadores auxiliares SOE complementarios se muestran en las
tablas 1-6: Con las cuatro distribuciones de
nucleótidos a continuación.
RSERI: 5'-GC GTT TTG CCG GCC GAC
ATA 312 234 322 243 333 133 444 233 423 242 212 211 243 343 CAA ACC
TGA ATT-3' (SEC ID No: 15)
\vskip1.000000\baselineskip
RSERII: 5'-GC GTT TTG CCG GCC
GAC ATA CAT TCG CTT TGC CCC ACC GGG TCC GTC TGT TAT TAA TGC CGC 311
133 241 122 243 113 341 432 423 433 223 332 242 331 GCC GAC AAT GTC
ATG GTG-3' (SEC ID No: 16)
RSERIII: 5'-GTC GCC TTC CCT TGT
CCA 433 413 112 423 124 424 423 411 121 123 124 324 243 233 GTA CGC
ATA CTG TTT TCT-3' (SEC ID No: 17)
Cebador auxiliar FSERIII: 5'-TGG
ACA AGG GAA GGC GAC AG-3' (SEC ID No: 18)
\vskip1.000000\baselineskip
RSERV: 5-TAA GAT CGG TTC AAT TTT
424 222 311 443 144 112 223 434 324 441 423 233 222 342 CCC GTA CAT
ATC CCC GTA GAA-3 (SEC ID No: 19)
Cebador auxiliar FSERV: 5-AAA
ATT GAA CCG ATC TTA-3 (SEC ID No: 20)
\vskip1.000000\baselineskip
FSERVII: 5'-TT CCA TGC TGC ATC
GAC ACA GGG AGG CGG CTA TGA TAT GAG GAA ATT GCT GAA 344 213 442 342
223 311 431 233 422 411 123 442 213 122 TGT CGA TAA
CCA-3' (SEC ID No: 21)
Cebador auxiliar RSERVII: 5'-TGT
CGA TGC AGC ATG GAA-3' (SEC ID No: 22)
\vskip1.000000\baselineskip
FSERIX: 5'-GT CCA AAC ATG GTT
TAA GCC 432 243 221 343 222 212 232 313 114 441 123 244 121 333 TCA
GGT TTT CTA CGG GGA-3' (SEC ID No: 23)
Cebador auxiliar RSERIX: 5'-GGC
TTA AAC CAT GTT TGG AC-3' (SEC ID No: 24)
Distribución de nucleótidos en cada posición de
nucleótidos mutados
- 1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
- 2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
- 3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
- 4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
Dos fragmentos de aproximadamente 1.4 kb fueron
amplificados por PCR usando el cebador 1B: 5'-CGA
TTG CTG ACG CTG TTA TTT GCG-3' y el oligonucleótido
aleatorio aparente de la tabla 1, respectivamente el
oligonucleótido aleatorio aparente de la tabla 2. El vector pSnK101
y los fragmentos de la PCR fueron digeridos con EcoRV y EagI
durante 2 horas. El fragmento de vector de aproximadamente 3.6 kb y
los fragmentos de la PCR de aproximadamente 1.3 kb fueron
purificados y ligados durante toda la noche y transformados en
E. coli y luego transformados adicionalmente en una estarina
huésped de Bacillus como se describe abajo. Los
oligonucleótidos aleatorios aparentes de las Tablas
3-6 (que por un término común se denomina aSER y
bSER en Fig. 2) para cada región y los cebadores 1B específicos de
B. licheniformis (SEC ID No: 26) y #63:
5'-CTA TCT TTG MC ATA AAT TGA AAC
C-3' (SEC ID No: 27) que cubren los sitios EcoRV y
EagI en la secuencia de LE174 se utilizan para generar fragmentos
de una biblioteca de PCR por el método de extensión de la
superposición (Horton et al., Gene, 77 (1989), págs.
61-68) La Figura 2 muestra la estrategia de la PCR.
Los fragmentos de la PCR son clonados en el vector transportador
pSNK101 de E. coli/bacillus (ver Materiales y Métodos)
permitiendo la mutagénesis en E. coli y la expresión
inmediata en Bacillus subtilis evitando la acumulación letal
de amilasas en E. coli. Después de establecer los fragmentos
de la PCR clonados en E. coli, un fragmento de pUC19
modificado es digerido fuera del plásmido y el promotor y el gen
Termamyl mutado es físicamente conectado y la expresión puede tener
lugar en el huésped de Bacillus.
Las seis bibliotecas fueron seleccionadas en los
ensayos de filtro a bajo pH descritos en la sección "Materiales y
Métodos" arriba.
Todas las variantes catalogadas en la tabla en
el ejemplo 2 a continuación fueron preparadas como se describe en
el Ejemplo 1.
Normalmente, los procesos de licuefacción
industriales son realizados a pH 6.0-6.2 con
adición de aproximadamente 40 ppm de calcio libre para mejorar la
estabilidad a 95ºC-105ºC. Las variantes de la
invención han sido hechas para mejorar la estabilidad a
1. pH inferior a pH 6.2 y/o
2. a niveles de calcio libre inferiores a 40
ppm de calcio libre.
Un ensayo que mide la estabilidad a pH ácido, pH
5.0, ante 5 ppm de calcio libre fue usado para medir el aumento de
la estabilidad.
10 \mug de la variante fueron incubados bajo
las condiciones siguientes: una solución de acetato 0.1 M, pH
ajustado a pH 5.0, que contiene 5 ppm de calcio y 5% p/p almidón
de maíz común (libre de calcio). La incubación fue realizada al
baño maría a 95ºC durante 30 minutos.
Estabilidad aumentada a pH 5.0, 5 ppm de calcio
incubado a 95ºC
| Minutos de | LE174 | LE174 | LE174 | LE174 |
| incubación | Con K176R+ | Con K176R+ | Con K176R+ | Con K176R+ |
| I201F+H205N | I201F+H205N+ | I201F+H205N+ | I201F+H205N+ | |
| E376K+A420R | S417T+A420Q | S356A+Y358F | ||
| 0 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 5 | 65 | 61 | 66 | 66 |
| 10 | 58 | 53 | 60 | 59 |
| 15 | 51 | 48 | 55 | 56 |
| 30 | 36 | 39 | 45 | 49 |
La actividad específica fue determinada usando
el ensayo Phadebas (Pharmacia) (anteriormente descrito) como
actividad/mg de enzima. La actividad fue determinada usando el
ensayo de \alpha-amilasa descrito en la sección
Materiales y Métodos de la presente.
\vskip1.000000\baselineskip
LE174 con las sustituciones siguientes:
- K176R+I201F+H205N
- Actividad específica determinada: 13400 NU/mg
\vskip1.000000\baselineskip
LE174 con las sustituciones siguientes:
- K176R+I201F+H205N+E376K+A420R:
- Actividad específica determinada: 14770 NU/mg
\vskip1.000000\baselineskip
LE174 con las sustituciones siguientes:
- K176R+I201F+H205N+S417T+A420Q:
- Actividad específica determinada:16670 NU/mg
\vskip1.000000\baselineskip
LE174 con las sustituciones siguientes:
- K176R+I201F+H205N+S356A+Y358F:
- Actividad específica determinada:15300 NU/mg
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stearothermophilus, FEMS Microbiol. letters: 56: págs.
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Hudson et al., Practical
Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific
Publications,
Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratorv Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor,
1989
S.L. Beaucage and M.H. Caruthers,
Tetrahedron Letters 22, 1981, pp.
1859-1869
Matthes et al., The EMBO J. 3, 984, págs. 801-805.
R.K. Saiki et al., Science
239, 1988, págs. 487-491.
Morinaga et al., (1984,
Biotechnology 2:646-639)
Nelson and Long, Analytical
Biochemistry 180, 1989, págs.
147-151
Hunkapiller et al., 1984,
Nature 310:105-111
R. Higuchi, B. Krummel, and R.K.
Saiki (1988). A general method of in vitro
preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of
protein and DNA interactions. Nucl. Acids Res.
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Dubnau et al., 1971, J.
Mol. Biol. 56, págs. 209-221.
Gryczan et al., 1978, J.
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Acad. Sci. 74, págs. 1680-1682.
Boel et al., 1990,
Biochemistry 29, págs. 6244-6249.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: NOVO NORDISK A/S
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: DK-2880 Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): DK-2880
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +45 44 44 88 88
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +45 44 49 32 56
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Variantes de \alpha-amilasa
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 32
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: Lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus sp.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus sp.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 514 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus stearothermophilus.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 483 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus licheniformis
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 480 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus amyloliquefaciens
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus sp.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus sp.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 485 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus sp.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus sp.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus sp.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1548 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus stearothermophilus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1920 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus licheniformis
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:421..1872
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus sp.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- SEQUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1455 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus sp.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 74 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "RSERI"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 21-62
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /Nota = 1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
\hskip8,7cm4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 122 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: single
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "RSERII"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 63-104
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /Nota = 1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
\hskip8,7cm4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LONGITUD DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "RSERIII"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19-60
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /Nota = 1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
\hskip8,7cm4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "FSERIII"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGACAAGGG AAGGCGACAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 81 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "RSERV"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 19-60
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /Nota = 1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
\hskip8,7cm4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "FSERV"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAATTGAAC CGATCTTA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 107 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "FSERVII"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 54-95
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /Nota = 1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
\hskip8,7cm4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN PARA LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "RSERVII"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCGATGCA GCATGGAA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 80 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "FSERIX"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 21-62
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /Nota = 1:97%A, 1%T, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm2:97%T, 1%A, 1%C, 1%G
\hskip8,7cm3:97%C, 1%A, 1%T, 1%G
\hskip8,7cm4:97%G, 1%A, 1%T, 1%C
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "RSERIX"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTTAAACC ATGTTTGGAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "Cebador 1B"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGATTGCTGA CGCTGTTATT TGCG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "Cebador #63"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTATCTTTGA ACATAAATTG AAACC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "Cebador directo 1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacctgcagt caggcaacta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "Cebador inverso 1"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagagtcgac ctgcaggcat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "Cebador directo 2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacctgcagt caggcaacta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: característica-misc:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /desc = "Cebador inverso 2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagagtcgac ctgcaggcat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2084 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Organismo: Bacillus amyloliquefaciens
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE:: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:343..1794
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Variante de una
\alpha-amilasa híbrida madre de la
\alpha-amilasa de B. licheniformis
mostrada en la SEC ID NO: 4 y \alpha-amilasa de
B. amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5, dicha
alfa-amilasa híbrida de Bacillus siendo
idéntica a la \alpha-amilasa de Bacillus
licheniformis mostrada en la SEC ID No: 4, a excepción de que
los 35 residuos de aminoácidos N-terminales (de la
proteína madura) son sustituidos con los 33 residuos de aminoácidos
N-terminales de la proteína madura de la
\alpha-amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID No: 5, que además
tiene las mutaciones siguientes: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S
(usando la numeración de la SEC ID No: 4).
2. Variante según la reivindicación 1, donde la
\alpha-amilasa madre además tiene una mutación en
una o más de las posiciones siguientes: K176, I201 y H205, en
particular comprendiendo una o más de las sustituciones siguientes:
K176R, I201F o H205N, o donde la \alpha-amilasa
madre tiene las sustituciones siguientes: K176R+I201F+H205N (usando
la numeración de la SEC ID NO: 4).
3. Variante según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, variante que tiene una o más
de las sustituciones siguientes: E376, S417, A420, S356 o Y358
(usando la numeración de la SEC ID NO: 4).
4. Variante según la reivindicación 3, variante
que tiene una o más de las sustituciones siguientes: S356A o
Y358F.
5. Variante según la reivindicación 3, variante
que tiene una o más de las sustituciones siguientes: E376K o
A420R.
6. Variante según la reivindicación 3, variante
que tiene una o más de las sustituciones siguientes: S417T o
A420Q.
7. Constructo de ADN que comprende una secuencia
de ADN que codifica una variante de
\alpha-amilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6.
8. Vector de expresión recombinante que lleva un
constructo de ADN según la reivindicación 7.
9. Célula que es transformada con un constructo
de ADN según la reivindicación 7 o vector según la reivindicación
8.
10. Célula según la reivindicación 9, que es un
microorganismo, en particular una bacteria o un hongo.
11. Célula según la reivindicación 10, que es
una bacteria gram positiva tal como Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus
stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus
amyloliquefaciens, Bacillus agulans, Bacillus circulans, Bacillus
lautus o Bacillus thuringiensis.
12. Aditivo de detergente que comprende una
variante de \alpha-amilasa según cualquiera de
las reivindicaciones 1-6, opcionalmente en forma de
un granulado no en polvo, líquido estabilizado o enzima
protegida.
13. Aditivo de detergente según la
reivindicación 12, que contiene 0.02-200 mg de
proteína enzimática/g del aditivo.
14. Aditivo de detergente según la
reivindicación 12 ó 13, que adicionalmente comprende otra enzima
tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima
amilolítica y/o una celulasa.
15. Composición de detergente que comprende una
variante de \alpha-amilasa según cualquiera de
las reivindicaciones 1-6.
16. Composición de detergente según la
reivindicación 15, que adicionalmente comprende otra enzima tal como
una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica
y/o una celulasa.
17. Una composición de detergente para
lavavajillas manual o automático que comprende una variante de
\alpha-amilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6.
18. Composición de detergente para lavavajillas
según la reivindicación 17, que adicionalmente comprende otra enzima
tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima
amilolítica y/o una celulasa.
19. Una composición para lavar la ropa de forma
manual o automática que comprende una variante de
\alpha-amilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6.
20. Una composición para lavar la ropa según la
reivindicación 19, que adicionalmente comprende otra enzima tal como
una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, una enzima amilolítica y/o
una celulasa.
21. Uso de una variante de
\alpha-amilasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 para lavar la ropa y/o para
lavavajillas o para desencolado textil o para licuefacción de
almidón.
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