ES2436066T3 - Mutantes de alfa-amilasa - Google Patents
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Abstract
Variante de una α-amilasa tipo Termamyl progenitora, donde la α-amilasa tipo Termamyl progenitora se selecciona de: (i) SEC ID n.º: 1, SEC ID n.º: 2, SEC ID n.º: 3, SEC ID n.º: 4, SEC ID n.º: 5, SEC ID n.º: 6, SEC ID n.º: 7 o SEC ID n.º: 8o (ii) una α-amilasa progenitora de tipo Termamyl con al menos un 80% de homología a una de las secuencias en (i); y donde la variante tiene actividad de α-amilasa y comprende las mutaciones R181* y G182* y una sustitución seleccionadade N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V (con respecto a SEC ID n.º: 6) o en posicionescorrespondientes en otras α-amilasas de tipo Termamyl progenitoras, y donde la variante muestra una termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a una concentración de Ca2+ inferior a 40 ppm,en comparación con una variante correspondiente que comprende las mutaciones R181* y G182* sin la sustitución a N195.
Description
Mutantes de alfa-amilasa
[0001] La presente invención se refiere, entre otras cosas, a variantes nuevas (mutantes) de α-amilasas progenitoras de tipo Termamyl, sobre todo variantes que presentan termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a bajas concentraciones de Ca2+ (con respecto a la progenitora) que son ventajosas respecto a las aplicaciones de las variantes en el tratamiento de almidón
10 industrial particularmente (p. ej. licuefacción o sacarificación del almidón).
[0002] Las α-amilasas (α-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC 3,2,1,1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la 15 hidrólisis del almidón y otros oligo- y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados.
[0003] Hay un cuerpo muy extenso de patentes y de bibliografía científica acerca de esta clase de enzimas muy importante industrialmente. Varias α-amilasas tales como variantes de α-amilasas tipo Termamyl son conocidas a partir de p. ej. WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873 y WO 96/23874.
20 [0004] Entre las descripciones más recientes referentes a las α-amilasas, WO 96/23874 proporciona datos estructurales tridimensionales de cristales de rayos X para una α-amilasa tipo Termamyl que consiste en los 300 residuos N-terminales de aminoácidos de la α-amilasa de B. amyloliquefaciens y los aminoácidos 301-483 del extremo C-terminal de la α-amilasa de
B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos (estando disponible comercialmente bajo el nombre comercial
25 Termamyl™), y que está así cercanamente relacionada con las α-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (que en el contexto presente están incluidas dentro del significado del término "α-amilasas tipo Termamyl", y que incluyen, entre otras cosas, las α-amilasas de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophilus). WO 96/23874 también describe la metodología para diseñar, basándose en un análisis de la estructura de una α-amilasa progenitora tipo Termamyl, variantes de la α-amilasa progenitora tipo Termamyl que presentan propiedades alteradas con respecto a la
30 progenitora.
[0005] El documento WO 95/35382 (Gist Brocades B.V.) se refiere a enzimas amilolíticas derivadas de B. licheniformis con propiedades mejoradas que permiten la reducción de la concentración de Ca2+ bajo la aplicación sin una pérdida de rendimiento de la enzima. La enzima amilolítica comprende uno o más cambios de aminoácidos en las posiciones
35 seleccionadas del grupo de 104, 128, 187, 188 de la secuencia de α-amilasa de B. licheniformis.
[0006] El documento WO 96/23873 (Novo Nordisk) expone variantes de α-amilasa tipo Termamyl que tienen termoestabilidad aumentada obtenida por la deleción de pares en la región R181*, G182*, T183* y G184* de la secuencia mostrada en SEC ID N.º: 1 de la misma.
[0007] La presente invención se refiere a nuevas variantes α-amilolíticas (mutantes) de una α-amilasa tipo Termamyl, en particular variantes que exhiben termoestabilidad aumentada (en relación al progenitor) que son ventajosas en relación al
45 procesado industrial de almidón (licuefacción de almidón, sacarificación y similares).
[0008] Más específicamente, la presente invención proporciona una variante de una α-amilasa progenitora de tipo Termamyl tal y como se define por la reivindicación 1.
50 [0009] La presente invención sigue al hallazgo sorprendente de los inventores de que en caso de combinar dos mutaciones (se describirá a continuación), la termoestabilidad de las α-amilasas de tipo Termamyl se aumenta a pH ácido y/o a bajas concentraciones de Ca2+ en comparación con mutaciones únicas, como la mutación descrita en WO 96/23873 (Novo Nordisk), es decir deleción de pares en la región R181*, G182*, T183* y G184* de la secuencia mostrada en SEC ID n.º: 1 de la presente.
55 [0010] La invención se refiere adicionalmente a constructos de ADN que codifican variantes de la invención, a la composición que comprende variantes de la invención, a métodos para preparar variantes de la invención, y al uso de las variantes y composiciones de la invención, solas o en combinación con otras enzimas α-amilolíticas, en varios procesos industriales, p. ej., licuefacción de almidón.
[0011]
Figura 1 es un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de seis α-amilasas progenitoras de tipo Termamyl en el contexto de la invención. Los números en el extremo izquierdo designan las secuencias de aminoácidos respectivas de la siguiente manera:
1: SEC ID n.º: 2,
2: Kaoamyl,
3: SEC ID n.º: 1,
4: SEC ID n.º: 5,
5: SEC ID n.º: 4,
6: SEC ID n.º: 3.
La α-amilasa tipo Termamyl
[0012] Es bien sabido que varias α-amilasas producidas por Bacillus spp. son altamente homólogas a nivel aminoácido. Por ejemplo, la α-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 4 (comercialmente disponible como Termamyl™) se ha descubierto que es aproximadamente un 89% homóloga a la αamilasa de B. amiloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 5 y aproximadamente un 79% homóloga a la α-amilasa de B. stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 3. α-amilasas homólogas adicionales incluyen una α-amilasa derivada de una cepa de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, todas las cuales se describen en detalle en WO 95/26397, y la αamilasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31.
[0013] Otras α-amilasas homólogas adicionales incluyen la α-amilasa producida por la cepa de B. licheniformis descrita en el documento EP 0252666 (ATCC 27811), y las α-amilasas identificadas en los docuementos WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras α-amilasas de tipo Termamyl de B.licheniformis comerciales son Optitherm™ y Takatherm™ (disponibles de Solvay), Maxamyl™ (disponible de Gist-Brocades/Genencor), Spezym AA™ y Spezyme AA™ de Delta (disponible de Genencor), y Keistase™ (disponible de Daiwa).
[0014] Debido a la homología sustancial encontrada entre estas α-amilasas, se considera que pertenecen a la misma clase de α-amilasas, específicamente la clase de "α-amilasas tipo Termamyl".
[0015] Por consiguiente, en el presente contexto, el término "α-amilasa tipo Termamyl" se destina a indicar una α-amilasa que, a nivel de aminoácidos, muestra una homología sustancial con Termamyl™, es decir la α-amilasa de B. licheniformis con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.º: 4 de la presente. Más específicamente, una α-amilasa tipo Termamyl es una α-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n.º: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 de la presente, y la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.º: 1 del documento WO 95/26397 (la misma que la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID n.º: 7 aquí) o en SEC ID n.º: 2 del documento WO 95/26397 (la misma que la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID n.º: 8 aquí) o en el Tsukamoto et al., 1988, (que la secuencia de aminoácidos está mostrada en la SEC ID N.º: 6 aquí) o que muestra al menos un 80%, especialmente al menos un 85%, especialmente preferido al menos un 90%, más preferido incluso especialmente al menos un 95% de homología con al menos una de dichas secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID n.º 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 o 8.
[0016] Opcionalmente, la α-amilasa tipo Termamyl puede adicionalmente i) mostrar reactividad inmunológica cruzada con un anticuerpo dirigido contra al menos una de dichas α-amilasas, y/o ii) ser codificado por una secuencia de ADN que se hibridiza con las secuencias de ADN que codifican las α-amilasas especificadas anteriormente que son evidentes de SEC ID n.º: 9, 10, 11, o 12 de la presente solicitud (las cuales secuencias de codificación codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID n.º: 1, 2, 3,4 y 5 de la presente, respectivamente), de SEC ID n.º: 4 del documento WO 95/26397 (la
cual secuencia de ADN, junto con el codón de terminación TAA, se muestra en SEC ID n.º: 13 de la presente y codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.º: 8 de la presente) y de SEC ID n.º: 5 del documento WO 95/26397 (mostrada en SEC ID n.º: 14 de la presente), respectivamente.
[0017] La "homología" se puede determinar usando cualquier algoritmo convencional, preferiblemente usando el progama GAP del paquete GCG versión 7.3 (Junio 1993) usando valores por defecto para penalizaciones GAP, que es una penalización por creación de GAP de 3.0 y penalización por extensión de GAP de 0.1, (Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, version 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. 53711).
[0018] Un alineamiento estructural entre Termamyl y una α-amilasa tipo Termamyl se puede utilizar para identificar posiciones equivalentes/correspondientes en otras α-amilasas tipo Termamyl. Un método de obtención de dicho alineamiento estructural es utilizar programa Pile Up de los paquetes GCG utilizando los valores por defecto de penalizaciones GAP, es decir, una penalización por creación de GAP de 3.0 y penalización por extensión de GAP de 0.1. Otros métodos de alineamiento estructural incluyen el análisis de agrupamientos hidrofóbicos (Gaboriaud et al., (1987), letras FEBS 224, págs. 149-155) y enhebrado inverso (Huber, T; Torda, AE, PROTEIN SCIENCE Vol. 7, n.º 1 págs. 142149 (1998).
[0019] Propiedad i) de la α-amilasa, es decir la reactividad cruzada inmunológica, se puede evaluar utilizando un anticuerpo dirigido contra, o reactivo con, al menos un epítopo de la α-amilasa tipo Termamyl pertinente. El anticuerpo, que puede ser bien monoclonal o policlonal, se puede producir por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe por Hudson et al., Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publications . La reactividad cruzada inmunológica se puede determinar utilizando ensayos conocidos en la técnica, ejemplos de los cuales son el análisis Western Blotting o el ensayo de inmunodifusión radial, por ejemplo como se describe en Hudson et al., 1989. En este aspecto, se ha encontrado reactividad cruzada inmunológica entre las α-amilasas que tienen las secuencias de aminoácidos SEC ID n.º: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, o 8 respectivamente.
[0020] La sonda de oligonucleótidos usada en la caracterización de la α-amilasa tipo Termamyl conforme a propiedad ii) anteriormente mencionada se puede preparar adecuadamente basándose en la secuencia total o parcial de nucleótidos o aminoácidos de la α-amilasa en cuestión.
[0021] Condiciones adecuadas para estudiar la hibridación implican el empapado previo en 5xSSC y la prehibridación durante 1 hora a ~40°C en una solución de formamida al 20%, solución del Denhardt 5x, fosfato sódico 50mM, pH 6,8, y 50mg de ADN de timo de ternero ultrasonicado desnaturalizado, seguido de hibridación en la misma solución suplementado con ATP 100mM durante 18 horas a ~40°C, seguido un lavado en tres veces del filtro en 2xSSC, SDS al 0,2% a 40°C durante 30 minutos (baja astringencia), preferido a 50°C (astringencia media), más preferiblemente a 65°C (astringencia alta), incluso más preferiblemente a ~75°C (astringencia altísima). Más detalles acerca del método de hibridación se pueden encontrar en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989 .
[0022] En el presente contexto, "derivado de" está destinado no sólo a indicar una α-amilasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una α-amilasa codificada por una secuencia de ADN aislada de tal cepa y producida en un organismo huésped transformado con dicha secuencia de ADN. Finalmente, el término se destina a indicar una α-amilasa que se codifica una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc y que tiene las características de identificación de la α-amilasa en cuestión. El término está también destinado a indicar que la α-amilasa progenitora puede ser una variante de una α-amilasa de origen natural, es decir una variante que es el resultado de una modificación (inserción, sustitución, eliminación) de uno o más residuos de aminoácidos de la α-amilasa de origen natural.
α-amilasas híbridas progenitoras
[0023] La α-amilasa progenitora puede ser una α-amilasa híbrida, es decir una α-amilasa que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivada de al menos dos α-amilasas.
[0024] La α-amilasa híbrida progenitora puede ser una que, basándose en la homología de aminoácidos y/o reactividad cruzada inmunológica y/o hibridación de ADN (como se define anteriormente), se puede determinar que pertenece a la familia de α-amilasa tipo Termamyl. En este caso, la α-amilasa híbrida está normalmente compuesta de al menos una parte de una α-amilasa tipo Termamyl y parte(s) de unas o varias otras α-amilasas seleccionadas de α-amilasas de tipo Termamyl
o α-amilasas de tipo no Termamyl de origen microbiano (fúngico o bacteriano) y/o mamífero.
[0025] Así, la α-amilasa híbrida progenitora puede comprender una combinación de secuencias parciales de aminoácidos que derivan de al menos dos α-amilasas tipo Termamyl, o de al menos una tipo Termamyl y al menos una α-amilasa
bacteriana tipo no Termamyl, o de al menos una tipo Termamyl y al menos una α-amilasa fúngica. La α-amilasa tipo Termamyl de la que deriva una secuencia parcial de aminoácidos puede, por ejemplo, ser cualquiera de aquellas α-amilasas tipo Termamyl específicas a las que se hace referencia en este caso.
[0026] Por ejemplo, la α-amilasa progenitora puede comprender una parte C-terminal de una α-amilasa derivada de una cepa de B. licheniformis, y una parte N-terminal de una α-amilasa derivada de una cepa de B. amyloliquefaciens o de una cepa de B. stearothermophilus. Por ejemplo, la α-amilasa progenitora puede comprender al menos 430 residuos de aminoácidos de la parte C-terminal de la α-amilasa de B. licheniformis, y puede, por ejemplo comprender a) un segmento de aminoácidos comprendiendo los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la α-amilasa de B. amyloliquefaciens que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.º: 5 y un segmento de aminoácidos correspondiente a los 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la α-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n.º 4, o b) un segmento de aminoácidos correspondiente a los 68 residuos de aminoácidos N-terminales de la α-amilasa de B. stearother-mophilus que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.º: 3 y un segmento de aminoácidos correspondiente a los 415 residuos de aminoácidos C-terminales de la α-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.º: 4.
[0027] La α-amilasa tipo no Termamyl puede, por ejemplo, ser una α-amilasa fúngica, una α-amilasa de mamífero o vegetal
o una α-amilasa bacteriana (diferente de una α-amilasa tipo Termamyl). Entre los ejemplos específicos de tales α-amilasas se incluyen la TAKA α-amilasa de Aspergillus oryzae, la α-amilasa ácida de A. niger, la α-amilasa de Bacillus subtilis, la αamilasa pancreática porcina y una α-amilasa de cebada. Todas estas α-amilasas tienen estructuras dilucidadas que son marcadamente diferentes de la estructura de una α-amilasa tipo Termamyl típica como se ha hecho referencia en este caso.
[0028] Las α-amilasas fúngicas mencionadas arriba, es decir derivadas de A. niger y A. oryzae, son altamente homólogas a nivel de aminoácidos y se considera generalmente que pertenecen a la misma familia de α-amilasas. La α-amilasa fúngica derivada de Aspergillus oryzae está comercialmente disponible bajo el nombre comercial de Fungamyl™.
[0029] Además, cuando una variante particular de una α-amilasa tipo Termamyl (variante de la invención) se refiere a - de manera convencional - por referencia a la modificación (p. ej. eliminación o sustitución) de residuos de aminoácidos específicos en la secuencia de aminoácidos de una α-amilasa específica de tipo Termamyl, debe entenderse que variantes de otra α-amilasa tipo Termamyl modificada en la(s) posición(es) equivalente(s) (como se determina a partir del mejor alineamiento posible de la secuencia de aminoácidos entre las respectivas secuencias de aminoácidos) están incluidas de este modo.
[0030] Una forma de realización preferida de una variante de la invención es una derivada de una α-amilasa de B. licheniformis (como progenitor α-amilasa tipo Termamyl), por ejemplo una de aquellas a las que se hace referencia anteriormente, tal como la α-amilasa de B. licheniformis con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.º: 4.
Construcción de variantes de la invención
[0031] La construcción de la variante de interés se puede realizar por cultivo de un microorganismo que comprende una secuencia de ADN que codifica la variante bajo condiciones que son propicias para producir la variante. La variante puede ser recuperada posteriormente del caldo de cultivo resultante. Esto se describe con detalle a continuación.
Propiedades alteradas de variantes de la invención
[0032] A continuación se discute la relación entre mutaciones que pueden estar presentes en variantes de la invención, y alteraciones deseables en las propiedades (con respecto a aquellas de una α-amilasa progenitora de tipo Termamyl) que pueden resultar de las mismas.
Termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a bajas concentraciones de Ca2+
[0033] Entre las mutaciones de relevancia particular en relación con la obtención de variantes según la invención teniendo termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a bajas concentraciones de Ca2+ incluyen mutaciones en la posición N190 (con respecto a la α-amilasa de B. licheniformis, SEC ID n.º: 4).
[0034] En el contexto de la invención, el término "pH ácido" significa un pH por debajo de 7,0, especialmente por debajo del rango de pH en el que se realizan normalmente los procesos de licuefacción de almidón industrial, que está entre pH 5,5 y 6,2.
[0035] En el contexto de la presente invención, el término "concentraciones bajas de Calcio" significa menos de 40ppm ya que esta es una concentración que está por debajo del nivel normal usado en la licuefacción de almidón industrial. Las concentraciones normales varían dependiendo de la concentración del Ca2+ libre en el maíz. Normalmente se añade una dosis correspondiente a 1mM (40ppm) que, junto con el nivel en el maíz, da entre 40 y 60ppm de Ca2+ libre.
[0036] En el contexto de la invención el término "temperaturas elevadas" significa temperaturas entre 95°C y 160°C, especialmente el rango de temperatura en el que se realizan normalmente los procesos de licuefacción del almidón industrial, que es entre 95°C y 105°C.
[0037] Los inventores han descubierto ahora que la termoestabilidad a pH ácido y/o a bajas concentraciones de Ca2+ se puede aumentar incluso más combinando la mutación anteriormente mencionada y/o I201 entre sí.
[0038] Dicha mutación "anteriormente mencionada" es la siguiente (con respecto a la α-amilasa de B. licheniformis, SEC ID n.º: 4):
N190.
[0039] Conforme a la presente invención, dicha mutación en N190 es posteriormente combinada con deleciones en dos posiciones como se describe en el documento WO 96/23873 (es decir, en las posiciones R181 y G182 en SEC ID n.º: 1 aquí). Por lo tanto, según la invención las variantes de una α-amilasa tipo Termamyl progenitora con actividad de α-amilasa que comprende mutaciones R181* y G182* y una sustitución seleccionada de N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V son contempladas.
[0040] Debe ser enfatizado que no sólo las α-amilasas tipo Termamyl mencionadas específicamente abajo están contempladas. También otras α-amilasas tipo Termamyl comerciales son contempladas. Una lista no exhaustiva de tales αamilasas es la siguiente:
α-amilasas producidas por la cepa B. licheniformis descrita en el documento EP 0252666 (ATCC 27811), y las α-amilasas identificadas en los documentos WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras α-amilasas tipo Termamyl comerciales de B. licheniformis son Optitherm™ y Takatherm™ (disponibles de Solvay), Maxamyl™ (disponible de Gistbrocades/Genencor), Spezim AA™ Spezime Delta AA™ (disponible de Genencor), y Keistase™ (disponible de Daiwa).
[0041] Se puede mencionar aquí que los residuos de aminoácidos, respectivamente, en posiciones correspondientes a N190, I201, D207 y E211, respectivamente, en la SEC ID NO: 4 constituyen residuos de aminoácidos que se conservan en numerosas α-amilasas tipo Termamyl. Así, por ejemplo, las posiciones correspondientes de estos residuos en las secuencias de aminoácidos de varias α-amilasas tipo Termamyl que han sido ya mencionadas (véase arriba) son las siguientes:
Tabla 1.
- α-amilasa tipo Termamyl
- N I D E Q
- B. licheniformis (SEC ID N.º: 4)
- N190 I201 D207 E211 Q264
- B. amyloliquefaciens (SEC ID N.º: 5)
- N190 V201 D207 E211 Q264
- B. stearothermophilus (SEC ID N.º: 3)
- N193 L204 E210 E214 - --
- Bacillus WO 95/26397 (SEC ID N.º: 2)
- N195 V206 E212 E216 - --
- Bacillus WO 95/26397 (SEC ID N.º: 1)
- N195 V206 E212 E216 - --
- "Bacillus sp. #707" (SEC ID N.º: 6)
- N195 I206 E212 E216 - --
[0042] La mutación del residuo de aminoácido conservado en N190 es muy importante en relación con la termoestabilidad mejorada a pH ácido y/o a concentraciones bajas de calcio, y las siguientes mutaciones son de interés particular a este respecto (con referencia a la numeración de la secuencia de aminoácidos de B. licheniformis mostrada en SEC ID n.º: 4). Deleciones de pares de aminoácidos en posiciones correspondientes a R179-G182 en SEC ID n.º: 3 correspondientes a un espacio en SEC ID n.º: 4. cuando se alinea con numerosas α-amilasas tipo Termamyl. Así, por ejemplo, las posiciones correspondientes de estos residuos en las secuencias de aminoácidos de varias α-amilasas tipo Termamyl que han sido ya mencionadas (véase arriba) son de las siguientes:
Tabla 2.
α-amilasa tipo Termamyl Deleciones de aminoácidos emparejados entre
B. amiloliquefaciens (SEC ID n.º5) R176, G177, E178, G179
B. stearothermophilus (SEC ID n.º3) R179, G180, I181, G182 Bacillus WO 95/26397 (SEC ID n.º2) R181, G182, T183, G184 Bacillus WO 95/26397 (SEC ID n.º1) R181, G182, D183, G184
"Bacillus sp. #707" (SEC ID n.º6) R181, G182, H183, G184
[0043] Cuando se usa SEC ID n.º: 1 a SEC ID n.º: 6 como esqueleto (es decir, como α-amilasa tipo Termamyl progenitora) 5 se pueden realizar dos mutaciones según la invención en las regiones/posiciones siguientes para aumentar la termoestabilidad a pH ácido y/o a bajas concentraciones de Ca2+ (con respecto a la progenitora):
(con respecto a la SEC ID n.º: 1 aquí):
- 10 1: ana eliminación de pareja de R181*, G182*; y
2: N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V
(con respecto a SEC ID n.º: 2 aquí):
1: una eliminación de pareja de R181*,G182*; y
2: N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V;
- 20 3. (con respecto a SEC ID n.º: 3 aquí):
1: una eliminación de pareja de R179*,G180 y
2: N193A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V;
3. (con respecto a SEC ID n.º: 5 aquí):
1: una eliminación de pareja de R176*,G177*; y
- 30 2: N190A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V;
3. (con respecto a SEC ID n.º: 6 aquí):
1: una eliminación de pareja de R181*,G182*; y
2: N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.
[0044] Mutaciones dobles específicas para el esqueleto SEC ID n.º: 1 a SEC ID n.º: 6 están catalogadas a continuación.
40 [0045] Usando la SEC ID NO: 1 como esqueleto, las siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están contempladas según la invención: -R181*/G182*/N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.
45 [0046] Usando la SEC ID NO: 2 como esqueleto, las siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están contempladas según la invención: -R181*/G182*/N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V. 50 [0047] Usando la SEC ID n°. 3 como esqueleto, las siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están contempladas según la invención:
- -
- R179*/G180*/N193A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.
[0048] Usando la SEC ID NO: 5 como esqueleto, las siguientes mutaciones dobles resultando en el efecto deseado están contempladas según la invención:
- -
- R176*/G177*/N190A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.
[0049] Usando la SEC ID NO: 6 como esqueleto, las mutaciones siguientes dobles resultando en el efecto deseado están contempladas según la invención:
- -
- R181*/G182*/N195A,R,D,C,E,Q,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.
[0050] Todas las α-amilasa tipo Termamyl definidas anteriormente pueden ser utilizadas adecuadamente como esqueleto para preparar variantes de la invención.
Mutaciones generales en variantes de la invención
[0051] Se puede preferir que una variante de la invención comprenda una o más modificaciones además de aquellas perfiladas anterioremente. Así, puede ser ventajoso que uno o más residuos de prolina presentes en la parte de la variante de α-amilasa que es modificada sea/sean sustituidos con un residuo diferente de prolina que puede ser cualquiera de los residuos posibles de origen natural diferentes de prolina, y que son preferiblemente una alanina, glicina, serina, treonina, valina o leucina.
[0052] Análogamente, se puede preferir que uno o más residuos de cisteína presentes entre los residuos de aminoácidos con los cuales la α-amilasa progenitora es modificada sea/sean sustituidos con un residuo diferente de cisteína tal como serina, alanina, treonina, glicina, valina o leucina.
[0053] Además, una variante de la invención puede - bien como única modificación o en combinación con cualquiera de las anteriores modificaciones perfiladas - ser modificada de modo que uno o más Asp y/o Glu presentes en un fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácido 185-209 de SEC ID n.º: 4 se sustituye por un Asn y/o Gln, respectivamente. La sustitución, en la α-amilasa tipo Termamyl, de uno o más de los residuos de Lys presentes en un fragmento de aminoácido correspondiente al fragmento de aminoácido 185-209 de SEC ID n.º: 4 por un Arg también resulta de interés.
[0054] Se entenderá que la presente invención abarca variantes que incorporan dos o más de las modificaciones perfiladas anteriormente.
[0055] Además, puede ser ventajoso introducir mutaciones puntuales en cualquiera de las variantes descritas aquí.
Métodos para preparar variantes de α-amilasa
[0056] Diferentes métodos para introducir mutaciones en genes se conocen en la técnica. Después de una breve discusión de la clonación de secuencias de ADN que codifican α-amilasa, se discutirán métodos para generar mutaciones en sitios específicos en la secuencia codificante de α-amilasa.
Clonación de una secuencia de ADN que codifica una α-amilasa
[0057] La secuencia de ADN que codifica una α-amilasa progenitora puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que produce la α-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la técnica. Primero, una librería de ADN genómico y/o de ADNc debería ser construida usando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la α-amilasa que debe ser estudiada. Luego, si la secuencia de aminoácidos de la α-amilasa es conocida, homólogos, sondas de oligonucleótidos marcadas se pueden sintetizar y usar para identificar clones de codificación de α-amilasa de una genoteca obtenida a partir del organismo en cuestión. Alternativamente, una sonda de oligonucleótidos marcada que contiene secuencias homólogas a un gen conocido de α-amilasa podrían ser usadas como sonda para identificar clones que codifican α-amilasa, utilizando hibridación y condiciones de lavado de menor astringencia.
[0058] Otro método para identificar clones que codifican α-amilasa implicaría la inserción de fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, transformación de bacterias α-amilasa negativas con la biblioteca de ADN genómico resultante, y luego disponer en placas las bacterias transformadas sobre agar con un sustrato para α-amilasa, de
ese modo permitiendo que los clones que expresan la α-amilasa sean identificados.
[0059] Aternativamente, la secuencia de ADN que codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente por métodos estándares establecidos, p. ej. el método de fosforamidita descrito por S.L. Beaucage and M.H. Caruthers (1981) o el método descrito por Matthes et al. (1984). En el método de fosforamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, p. ej. en un sintetizador de ADN automático, se purifican, se anillan, se ligan y se clonan en vectores apropiados.
[0060] Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de origen mixto genómico y sintético, de origen mixto sintético y de ADNc o de origen mixto genómico y de ADNc, preparada para ligar fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado, los fragmentos correspondientes a varias partes de la secuencia de ADN entera), conforme a las técnicas estándares. La secuencia de ADN también se puede preparar por reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en el documento US 4,683,202 o R.K. Saiki et al. (1988).
Mutagénesis dirigida al sitio
[0061] Una vez que se ha aislado una secuencia de ADN que codifica a-amilasa, y se han identificado los sitios deseables para la mutación, las mutaciones se pueden introducir usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados; los nucleótidos mutantes se insertan durante la síntesis de oligonucleótidos. En un método específico, un espacio monocatenario de ADN, que enlaza la secuencia de codificación de a-amilasa, está creado en un vector que lleva el gen de a-amilasa. Luego el nucleótido sintético, que lleva la mutación deseada, se anilla a una parte homóloga del ADN monocatenario. El espacio restante se rellena luego con ADN polimerasa I (fragmento de Klenow) y el constructo se liga usando T4 ligasa. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al. (1984). El documento US 4,760,025 expone la introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples mediante la realización de alteraciones menores del casete. No obstante, una variedad incluso superior de mutaciones puede ser introducida en cualquier momento por el método de Morinaga, porque una multitud de oligonucleótidos, de varias longitudes, pueden ser introducidas.
[0062] Otro método para introducir mutaciones en secuencias de ADN que codifican a-amilasa se describe en Nelson y Long (1989). Implica la generación en 3 pasos de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada introducida usando una cadena de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. Del fragmento generado por PCR, un fragmento de ADN portador de la mutación puede ser aislado por seccionamiento con endonucleasas de restricción y reinsertado en un plásmido de expresión.
Mutagénesis aleatoria
[0063] La mutagénesis aleatoria se realiza de manera adecuada bien como mutagénesis aleatoria localizada o específica en al menos tres partes del gen que traduce para la secuencia de aminoácidos mostrada en cuestión, o dentro del gen entero.
[0064] La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica una α-amilasa progenitora se puede realizar convenientemente usando cualquier método conocido en la técnica.
[0065] En relación con lo anterior, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para generar una variante de una α-amilasa progenitora, p. ej. donde la variante muestra termoestabilidad alterada o aumentada con respecto a la progenitora, el método comprendiendo:
- (a)
- someter una secuencia de ADN que codifica la α-amilasa progenitora a mutagénesis aleatoria,
- (b)
- expresar la secuencia de ADN mutada obtenida en el paso (a) en una célula huésped, y hacer un barrido para seleccionar células huésped que expresen una variante de α-amilasa que tenga una propiedad alterada (es decir, termoestabilidad) con relación a la α-amilasa progenitora.
[0066] El paso (a) del método anterior de la invención se realiza preferiblemente utilizando cebadores dopados. Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado, usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria puede ser realizada usando cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes. El agente mutagenizante puede, p. ej., ser uno que induce transiciones, transversiones, inversiones, aleatorización, deleciones, y/o inserciones.
[0067] Entre los ejemplos de un agente físico o químico mutagenizante adecuado para este fin se incluyen radiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metilo-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etilmetano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótido. Cuando se utilizan tales agentes, la mutagénesis se realiza normalmente incubando la secuencia de ADN que codifica la enzima progenitora para ser
mutagenizada en presencia del agente mutagenizante de elección bajo condiciones adecuadas para que la mutagénesis tenga lugar, y seleccionando el ADN mutado con las propiedades deseadas.
[0068] Cuando la mutagénesis se realiza utilizando un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado con los tres nucleótidos no progenitoras durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que deben ser cambiadas. El dopaje o adicionado se puede realizar de modo que los codones para los aminoácidos indeseados sean evitados. El oligonucleótido adicionado o dopado se puede incorporar en el ADN que codifica la enzima de α-amilasa por cualquier técnica publicada, utilizando por ejemplo PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa como se estime apropiado.
[0069] Preferiblemente, el dopaje se realiza usando el "dopaje aleatorio constante", donde el porcentaje de tipo salvaje y la mutación en cada posición está predefinido. Además, el dopaje puede ser dirigido hacia una preferencia para la introducción de nucleótidos determinados, y de ese modo una preferencia para la introducción de uno o más residuos de aminoácidos específicos. El dopaje se puede hacer, p. ej., para permitir la introducción del 90% de tipo salvaje y del 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección de un esquema de dopaje se basa en genética así como en restricciones estructurales de las proteínas. El esquema de dopaje se puede realizar usando el programa DOPE que, entre otras cosas, asegura que se evita la introducción de codones de parada.
[0070] Cuando se usa la mutagénesis generada por PCR, tanto un gen tratado químicamente como uno no tratado que codifica una α-amilasa progenitora se somete a PCR bajo condiciones que aumentan la desincorporación de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, pp. 11-15).
[0071] Una cepa mutágena de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191), S. cereviseae o cualquier otro organismo microbiano se puede utilizar para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la α-amilasa por, por ejemplo, transformación de un plásmido que contiene el progenitor de glicosilasa en la cepa mutágena, creciendo la cepa mutágena con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado puede ser posteriormente transformado en el organismo de expresión.
[0072] La secuencia de ADN que debe ser mutagenizada puede estar convenientemente presente en una biblioteca genómica o de ADNc obtenida a partir de un organimo que expresa la α-amilasa progenitora. Alternativamente, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, que como tal puede ser incubado con o expuesto de otra manera al agente mutagenizante. El ADN que debe ser mutagenizado también puede estar presente en una célula huésped tanto siendo integrado en el genoma de dicha célula como estando presente en un vector albergado en la célula. Finalmente, el ADN que debe ser mutagenizado puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN que debe ser sometida a mutagénesis aleatoria es preferiblemente una secuencia ADNc o de ADN genómico.
[0073] En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar el paso de expresión b) o el paso de selección c). Tal amplificación se puede realizar conforme a métodos conocidos en la técnica, siendo el método actualmente preferido la amplificación generada por PCR utilizando cebadores de oligonucleótidos preparados en base al ADN o secuencia de aminoácidos de la enzima progenitora.
[0074] Después de la incubación con o exposición al agente mutagenizante, el ADN mutado se expresa por cultivo de una célula huésped adecuada que lleva la secuencia de ADN bajo condiciones que permiten que la expresión tenga lugar. La célula huésped usada para este propósito puede ser una que ha sido transformada con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente en un vector, o una que lleve la secuencia de ADN que codifica la enzima progenitora durante el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de células huésped adecuadas son las siguientes: bacterias gram positivas tal como
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; y bacterias gram-negativas tales como E. Coli.
[0075] La secuencia de ADN mutada puede además comprender una secuencia de ADN que codifica funciones que permiten la expresión de la secuencia de ADN mutada.
Mutagénesis aleatoria localizada
[0076] La mutagénesis aleatoria puede estar ventajosamente localizada en una parte de la α-amilasa progenitora en cuestión. Esto puede, por ejemplo, ser ventajoso cuando se ha identificado que ciertas regiones de la enzima son de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando se modifican se espera que resulten en una variante con propiedades mejoradas. Tales regiones se pueden identificar normalmente cuando la estructura terciaria de la enzima progenitora ha sido dilucidada y relacionada con la función de la enzima.
[0077] La mutagénesis aleatoria, localizada o específica de una región, se realiza convenientemente usando técnicas de mutagénesis generada por PCR como se ha descrito anteriormente o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN a ser modificada puede ser aislada, por ejemplo, por inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser posteriormente sometida a mutagénesis usando cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionados anteriormente.
Métodos alternativos de suministro de variantes de α-amilasa
[0078] Entre los métodos alternativos para suministrar variantes de la invención se incluyen métodos de transposición de genes conocidos en la técnica incluyendo los métodos por ejemplo descritos en los documentos WO 95/22625 (de Affymax Technologies N.V.) y WO 96/00343 (de Novo Nordisk A/S).
Expresión de variantes de α-amilasa
[0079] Según la invención, una secuencia de ADN que codifica la variante producida por métodos anteriormente descritos, o por cualquier método alternativo conocido en la técnica, puede ser expresada, en forma enzimática, usando un vector de expresión que normalmente incluye las secuencias de control que codifican un promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes activadores.
[0080] El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de α-amilasa de la invención puede ser cualquier vector que pueda ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector frecuentemente dependerá de la célula huésped en la que debe ser introducido. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej. un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica con el(los) cromosoma(s) en el(los) que ha sido integrado.
[0081] En el vector, la secuencia de ADN debería estar operativamente conectada a una secuencia del promotor adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección y puede ser derivada de genes que codifican proteínas bien homólogas o heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de α-amilasa de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli, los promotores del gen dagA de agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen de α-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, los promotores del gen de amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, los promotores de la α-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis etc. Para la transcripción en un huésped fúngico, ejemplos de promotores útiles son estos derivados del gen que codifica la TAKA amilasa de A. oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la α-amilasa neutra de A. niger, la α-amilasa estable en ácido de A. niger, la glucoamilasa de A. niger, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o la acetamidasa de A. nidulans.
[0082] El vector de expresión de la invención puede también comprender un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotas, las secuencias de poliadenilación conectadas operativamente a la secuencia de ADN que codifica la variante de α-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden adecuadamente derivar de las mismas fuentes que el promotor.
[0083] El vector puede además comprender una secuencia de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de plásmidos pUC19; pACYC177; pUB110; pE194, pAMB1 y pIJ702.
[0084] El vector puede también comprender un marcador seleccionable, p. ej., un gen cuyo producto complementa un defecto en la célula huésped, tal como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiere resistencia antibiótica tal como resistencia a la ampicilina, la canamicina, el cloranfenicol o la tetraciclina. Además, el vector puede incluir marcardores Aspergillus de selección tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que da lugar a resistencia a higromicina, o la selección se puede realizar por co-transformación, por ejemplo como se describe en el documento WO 91/17243.
[0085] Mientras que la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos aspectos, por ejemplo cuando se usan bacterias determinadas como células huésped, es generalmente preferido que la expresión sea extracelular. En general, las α-amilasas de Bacillus mencionadas aquí comprenden una prerregión que permite la secreción de la proteasa expresada en
el medio de cultivo. Si se desea, esta prerregión puede ser sustituida por una prerregión diferente o secuencia señal, convenientemente realizada por sustitución de las secuencias de ADN que codifican las prerregiones respectivas.
[0086] Los procedimientos usados para enlazar el constructo de ADN de la invención que codifica una variante de αamilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados conteniendo la información necesaria para la replicación, son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989).
[0087] La célula de la invención, comprendiendo bien un constructo de ADN o bien un vector de expresión de la invención tal como se ha definido anteriormente, se ha utilizado ventajosamente como célula huésped en la producción recombinante de una variante de α-amilasa de la invención. La célula se puede transformar con el constructo de ADN de la invención que codifica la variante, convenientemente integrando el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración se considera generalmente una ventaja ya que la secuencia de ADN es más propensa a ser mantenida de forma estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped se puede realizar según métodos convencionales, p. ej. por recombinación homóloga o heteróloga. Alternativamente, la célula se puede transformar con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en relación con los diferentes tipos de células huésped.
[0088] La célula de la invención puede ser una célula de un organismo más alto tal como un mamífero o un insecto, pero es preferiblemente una célula microbiana, por ejemplo una célula bacteriana o fúngica (incluyendo levadura).
[0089] Ejemplos de bacterias adecuadas son las bacterias gram positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalo-philus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o Streptomyces lividans o Streptomices murinus, o bacterias gram negativas tal como E.coli. La transformación de las bacterias puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplastos o usando células competentes de una manera conocida per se.
[0090] El organismo de levadura puede ser seleccionado favorablemente de unas especies de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae. El hongo filamentoso puede ventajosamente pertenecer a unas especies de Aspergillus, por ejemplo Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Las células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida de la regeneración de la pared celular en cierto modo conocido per se. Un procedimiento adecuado para la transformación de células huésped de Aspergillus se describe en el documento EP 238 023.
[0091] En aún otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una variante de α-amilasa de la invención, este método comprende el cultivo de una célula huésped como se ha descrito anteriormente bajo condiciones propicias a la producción de la variante y a la recuperación de la variante de las células y/o medio de cultivo.
[0092] El medio utilizado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de la célula huésped en cuestión y la obtención de la expresión de la variante de α-amilasa de la invención. Medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según recetas publicadas (p. ej. como se describe en catálogos de the American Type Culture Collection).
[0093] La variante de α-amilasa segregada de las células huésped pueden convenientemente ser recuperadas del medio de cultivo por procedimientos bien conocidos, incluyendo separación de las células del medio por centrifugado o filtración, y la precipitación de los componentes proteináceos del medio mediante una sal tal como sulfato de amonio, seguido del uso de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad, o similar.
Aplicaciones industriales
[0094] Las variantes de α-amilasa de esta invención poseen propiedades valiosas que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En particular, las variantes enzimáticas de la invención son aplicables como componente en el lavado, lavado de la vajilla y composiciones de detergentes de limpieza de superficies rígidas. Numerosas variantes son particularmente útiles en la producción de edulcorantes y etanol a partir de almidón, y/o para el desencolado textil. Condiciones para los procesos de conversión de almidón convencional, incluyendo licuefacción de almidón y/o procesos de sacarificación, se describen en, por ejemplo, US 3,912,590 y en publicaciones de patentes EP n.º 252 730 y 63 909.
Producción de edulcorantes de almidón:
[0095] Un proceso "tradicional" para la conversión del almidón en jarabes de fructosa normalmente consiste en tres procesos enzimáticos consecutivos, es decir, un proceso de licuefacción seguido de un proceso de sacarificación y un
proceso de isomerización. Durante el proceso de licuefacción, el almidón se degrada a dextrinas mediante una α-amilasa
(p. ej. Termamyl™) a valores de pH entre 5,5 y 6,2 y a temperaturas de 95-160°C durante un periodo de aprox. 2 horas. Para asegurar una estabilidad de enzima óptima bajo estas condiciones, se añade calcio 1 mM (40 ppm de iones de calcio libres).
[0096] Después del proceso de licuefacción las dextrinas se convierten en dextrosa por adición de una glucoamilasa (p. ej. AMGT™) y una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa (p. ej. Promozyme™). Antes de este paso el pH se reduce a un valor inferior a 4,5, manteniendo la alta temperatura (por encima de 95°C), y la actividad de licuefacción de la α-amilasa se desnaturaliza. La temperatura se reduce a 60°C, y se añade la glucoamilasa y la enzima desramificante. El proceso de sacarificación se lleva a cabo durante 24-72 horas.
[0097] Después del proceso de sacarificación, el pH se aumenta a un valor en el rango de 6-8, preferiblemente pH 7,5, y el calcio se elimina por intercambio iónico. El jarabe de dextrosa se convierte luego en jarabe de fructosa utilizando, por ejemplo, una glucosaisomerasa inmovilizada (tal como Sweetzyme™).
[0098] Al menos 1 mejora enzimática de este proceso podría ser prevista. Reducción de la dependencia de calcio de la αamilasa de licuefacción. La adición de calcio libre es requerida para asegurar una estabilidad adecuadamente alta de la αamilasa, pero el calcio libre inhibe fuertemente la actividad de la glucosaisomerasa y necesita ser eliminado, mediante una unidad de operación costosa, hasta una extensión que reduce el nivel de calcio libre por debajo de 3-5 ppm. Se podrían obtener ahorros en el coste si tal operación pudiera ser evitada y el proceso de licuefacción pudiera ser realizado sin adición de iones de calcio libre.
[0099] Para conseguir esto, se requiere una α-amilasa tipo Termamyl menos dependiente de calcio que sea estable y altamente activa a concentraciones bajas de calcio libre (< 40 ppm). Tal α-amilasa tipo Termamyl debería tener un pH óptimo a un pH en el rango de 4,5-6,5, preferiblemente en el rango de 4,5-5,5.
Composiciones detergentes
[0100] Como se ha mencionado anteriormente, variantes de la invención pueden ser incorporadas adecuadamente en composiciones detergentes. La termoestabilidad aumentada a bajas concentraciones de calcio sería muy beneficiosa para el rendimiento de la amilasa en detergentes, es decir, la región alcalina. Se hace referencia, por ejemplo, a los documentos WO 96/23874 y WO 97/07202 para detalles adicionales en lo que se refiere a ingredientes pertinentes de composiciones de detergentes (tales como detergentes para lavar la ropa o la vajilla), métodos apropiados de formulación de las variantes en tales composiciones de detergentes, y a ejemplos de tipos pertinentes de composiciones de detergentes.
[0101] Composiciones de detergentes que comprenden una variante de la invención pueden adicionalmente comprender una o más enzimas adicionales, tales como una lipasa, cutinasa, proteasa, celulasa, peroxidasa o lacasa, y/u otra αamilasa.
[0102] Las variantes de α-amilasa de la invención pueden ser incorporadas en detergentes a las concentraciones empleadas de forma convencional. Es actualmente contemplado que una variante de la invención se puede incorporar en una cantidad correspondiente a 0,00001-1 mg (calculado como proteína enzimática pura activa) de α-amilasa por litro de solución de detergente para lavar la ropa/la vajilla usando niveles de dosificación convencionales de detergente.
[0103] La invención también se refiere a una composición comprendiendo una mezcla de una o más variantes de la invención derivadas de (como la α-amilasa progenitora tipo Termamyl) la α-amilasa de B. stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en SEC ID NO: 3 y una alfa-amilasa tipo Termamyl derivada de la α-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia mostrada en SEC ID NO: 4.
[0104] Además, la invención también se refiere a una composición comprendiendo una mezcla de una o más variantes según la invención derivada de (como la α-amilasa progenitora tipo Termamyl) la α-amilasa de B. stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 3 y una alfa-amilasa híbrida que comprende una parte de la α-amilasa de B. amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5 y una parte de la α-amilasa de B. licheniformis mostrada en la SEC ID NO:
4. Esta α-amilasa híbrida tipo Termamyl mencionada comprende los 445 residuos de aminoácidos C-terminales de B. licheniformis mostrados en la SEC ID NO: 4 y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la α-amilasa derivada de B. amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5. Esta última α-amilasa híbrida mencionada puede de manera adecuada comprender las mutaciones siguientes: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (utilizando la numeración en SEC ID n.º: 4). En los ejemplos siguientes de dicha α-amilasa tipo Termamyl progenitor híbrido, se usan en combinación con variantes de la invención, estas variantes se pueden utilizar en composiciones de la invención.
[0105] En una forma de realización específica de la invención la composición comprende una mezcla de TVB146 y LE174, por ejemplo, en una proporción de 2:1 a 1:2, tal como 1:1.
[0106] Una variante de α-amilasa de la invención o una composición de la invención puede en un aspecto de la invención 5 ser utilizada para el lavado y/o lavado de la vajilla; para el desencolado textil o para la licuefacción de almidón.
Enzimas: 10 [0107] BSG alfa-amilasa: alfa-amilasa de B. stearothermophilus representada en la SEC ID NO: 3.
[0108] Variante TVB146 de alfa-amilasa: una variante de alfa-amilasa de B. stearothermophilus representada en la SEC ID NO: 3 con las mutaciones siguientes: con la deleción en las posiciones I181-G182 + N193F. Variante LE174 de alfa-amilasa 15 híbrida:
LE174 es una alfa-amilasa híbrida tipo Termamyl que es idéntica a la secuencia de Termamyl, es decir, la α-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en SEC ID n.º: 4, a excepción de que los 35 residuos de aminoácidos N-terminales (de la proteína madura) han sido sustituidos por los 33 residuos N-terminales de BAN (proteína madura), es decir, la alfa-amilasa
20 de Bacillus amyloliquefaciens mostrada en la SEC ID NO: 5, que además tiene las siguientes mutaciones:
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (utilizando la numeración en SEC ID n.º: 4). LE174 fue construida por SOE- PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16:7351).
[0109] Una cepa de B. subtilis que alberga el plásmido de expresión pertinente se dispone en líneas en una placa de LBagar con 10 µg/mL de canamicina a partir de materia prima a -80°C, y crecida durante toda la noche a 37°C. Las colonias se transfieren a 100 mL de medios BPX suplementados con 10 µg/mL de canamicina en un matraz de
30 agitación de 500 mL.
Composición de medio BPX:
[0110]
Almidón de patata Harina de cebada BAN 5000 SKB Caseinato sódico Harina de soja Na2HPO4, 12 H2O Pluronic™
[0111] El cultivo se agita a 37°C a 270 r.p.m. durante 5 días.
100 g/l 50 g/l 0,1 g/l 10 g/l 20 g/l 9 g/l 0,1 g/l
[0112] Las células y el detrito celular se eliminan del caldo de fermentación por centrifugado a 4500 r.p.m. en 20-25 minutos.
40 Después el sobrenadante se filtra para obtener una solución completamente clara. El filtrado se concentra y se lava en un filtro UF (membrana de corte de 10000) y el tampón se cambia a acetato 20mM pH 5,5. El filtrado UF se aplica en una Ssefarosa F.F. y la elución se realiza por elución de fase con NaCl 0,2M en el mismo tampón. El eluato se dializa contra Tris 10mM, pH 9,0 y se aplica en un Q-sepharose F.F. y se eluye con un gradiente lineal de 0-0,3M NaCl sobre 6 volúmenes de columna. Las fracciones que contienen la actividad (medidas por el ensayo Phadebas) se agrupan, el pH se ajustó a pH 7,5
45 y color restante se eliminó mediante un tratamiento con carbón activo 0.5% p/v en 5 minutos.
[0113] Una unidad Kilo de alfa-amilasa (1 KNU) es la cantidad de enzima que degrada 5,26 g de almidón (Merck, Amylum 50 Solubile, Erg. B 6, lote 9947275) por hora en el método estándar de Novo Nordisk para la determinación de alfa-amilasa
basada en las condiciones siguientes:
Sustrato almidón soluble
Contenido de calcio en solvente 0,0043 M
Tiempo de reacción 7-20 minutos
Temperatura 37°C
pH 5,6
[0114] Una descripción detallada del método analítico de Novo Nordisk (AF 9) está disponible bajo solicitud.
5
Determinación de actividad de BS-amilasa KNU(S)
10 [0115] Este método se utiliza para determinar la actividad α-amilasa en fermentación y recuperación de muestras y productos formulados y granulados.
15 [0116] La BS-amilasa degrada el sustrato (4,6-etiliden(G7)-p-nitrofenil(G1)-α,D-maltoheptaósido (escrito como etiliden-G7-PNP) en, entre otras cosas, G2-PNP y G3-PNP, donde G denota glucosa y PNP, P- nitrofenol.
[0117] G2-PNP y G3-PNP son degradados por la α-glucosidasa, que se añade en exceso, en glucosa y el p-nitrofenol de color amarillo.
20 [0118] La reacción de color se monitoriza in situ y el cambio en la absorbancia frente al tiempo se calcula como una expresión de la velocidad de la reacción y así de la actividad de la enzima. Véanse las pautas de Boehringer Mannheim
1442 309 para detalles adicionales.
25 2.1 Condiciones de reacción
[0119]
Reacción:
Temperatura
pH
Tiempo de preincubación:
Detección:
Longitud de onda
Tiempo de medición
: 37°C : 7,1 2 minutos
: 405 nm 3 minutos
[0120] La actividad de la alfa-amilasa de Bacillus stearotermofius (BS-amilasa) se determina respecto a un estándar de actividad declarada y establecida en unidades Kilo Novo (Stearothermophilus) o KNU(S)).
35 4. Especificidad y sensibilidad [0121] Límite de determinación: aprox. 0,4 KNU(s)/g
40 [0122]
Analizador de Cobas Fara
Diluido (p. ej. Hamilton Microlab 1000)
Equilibrio analítico (p. ej. Mettler AE 100)
5
Placas de agitación
10 [0123] Un equipo ya preparado se utiliza en este análisis para determinar la actividad de α-amilasa. Obsérvese que los reactivos específicos para el sustrato y la α-glucosidasa no se usan como se describe en las pautas de Boehringer Mannheim. No obstante, las designaciones "tampón", "cristal 1", cristal 1a" y cristal 2" son aquellas a las que se hace referencia en estas pautas.
- 15 6.1. Sustrato
[0124] 4,6-etiliden(G7)-p-nitrofenil(G1)-α,D-maltoheptaósido (escrito como etiliden-G7-PNP) por ejemplo Boehringer Mannheim 1442 309
- 20 6.2 Reactivo auxiliar de α-glucosidasa [0125] α-glucosidasa, por ejemplo Boehringen Mannheim 1442 309
6.3 Solución BRIJ 35 25
[0126]
BRIJ 35 (30% p/v de Sigma 430 AG-6) 1000 mL
Agua desmineralizada hasta 2 000 mL
6.4 Estabilizador
30 [0127] Solución Brij 35 33 mL CaCl2*2H2O (Merck 2382) 882 g Agua desmineralizada hasta 2 000 mL
35 7.1 Curva estándar
Ejemplo: preparación de la curva estándar de BS-amilasa
[0128] El estándar pertinente se diluye a 0,60 KNU(s)/mL de la siguiente manera. Una cantidad calculada de estándar se
40 pesa y se añade a un matraz aforado de 200 mL, que se rellena hasta aproximadamente la marca de 2/3 con agua desmineralizada. Se añade estabilizador correspondiente al 1% del volumen del matraz y el matraz se rellena hasta la marca con agua desmineralizada. Se utiliza un Hamilton Microlab 1000 para producir las diluciones mostradas abajo. Se usa agua desmineralizada con 1% de estabilizador como diluyente.
- Dilución n.º
- Solución de reserva enzimática 1% estabilizador KNU(s)/mL
- 1
- 20µL 580µL 0,02
- 2
- 30µL 570µL 0,03
- 3
- 40µL 560µL 0,04
- 4
- 50µL 550µL 0,05
- 5
- 60µL 540µL 0,06
7.2 Control de nivel
[0129] Un control del nivel de BS amilasa de Novo Nordisk A/S está incluido en todas las series usando el Cobas Fara. El control se diluye con estabilizador al 1% de modo que la dilución final está en el rango de la curva estándar. Todos los pesos y diluciones están anotados en la lista de trabajo.D
7.3 Soluciones de muestra Determinación única [0130] Muestras de fermentación (no muestras finales) a partir de la producción, todas las muestras de fermentación de
instalaciones experimentales y muestras de estabilidad de almacenamiento se pesan y analizan sólo una vez.
Determinación doble sobre 1 serie:
Se pesan muestras de proceso, muestras de fermentación final a partir de la producción, muestras de estudios de GLP y
muestras de R&D y se analizan dos veces.
Determinaciones dobles sobre 2 series:
Se pesan muestras de producto acabado y se analizan dos veces en dos series separadas.
Concentración máxima de muestras en polvo: 5%
[0131] Las muestras de prueba se diluyen con agua desmineralizada con estabilizador al 1% hasta aprox. 0,037 KNU(s)/mL basándose en su actividad prevista. La dilución final se realiza directamente en el recipiente de muestra.
8.1 Programa de menú de Cobas [0132]
- •
- el Programa de Menú de Cobas se utiliza para sugerir el peso/diluciones de muestras y el control de nivel que debe ser utilizado.
- •
- las muestras se introducen en el programa con un único código de identificación y se imprime una lista de trabajo.
- •
- las muestras y el control se pesan y se diluyen como se establece en la lista de trabajo con los datos del peso escritos a mano que se insertan en el cuaderno de trabajo para el análisis de BS-amilasa
- •
- los resultados se computerizan automáticamente por el Cobas Fara como se describe en el artículo 9 y se imprime junto con la curva estándar.
- •
- las listas de trabajos y los resultados impresos se insertan en el cuaderno de trabajo para el análisis de BS-amilasa.
8.2 Instalación de Cobas Fara [0133]
- •
- las muestras se colocan en el portamuestras
- •
- los cinco estándares se colocan en el bastidor de calibrado en las posiciones 1 a 5 (el estándar más fuerte en la posición 5), y el control se coloca en el mismo bastidor en la posición 10.
- •
- el sustrato se transfiere a un contenedor reactivo de 30 mL y se coloca en el bastidor de reactivo en la posición 2 (soporte 1).
- •
- el reactivo auxiliar de α-glucosidasa se transfiere a un contenedor reactivo de 50 mL y se coloca en el estante reactivo en la posición 2 (soporte C)
8.3 Análisis Cobas Fare
[0134] Los principios principales del análisis son los siguientes:
20µL de muestra y 10µL de agua de lavado se pipetean en la cubeta junto con 250µL de reactivo auxiliar de α-glucosidasa. La cubeta gira durante 10 segundos y los reactivos se expulsan en las cubetas horizontales. 25µL de sustrato y 20µL de agua de lavado se extraen con la pipeta. Después de un 1 segundo de espera para asegurar que la temperatura es de 37°C, la cubeta gira otra vez y el sustrato se mezcla en las cubetas horizontales. La absorbancia se mide por primera vez después 120 segundos y luego cada 5 segundos. La absorbancia se mide un total de 37 veces para cada muestra.
[0135] La actividad de las muestras se calcula con respecto al estándar Novo Nordisk A/S.
[0136] La curva estándar se traza por el analizador. La curva debe ser suavemente curvada, aumentando firmemente a una
absorbancia de alrededor de 0,25 para el estándar n.º 5.
[0137] La actividad de las muestras en KNU(S)/mL se lee fuera de la curva estándar por el analizador.
[0138] Los cálculos finales para permitir los pesos/diluciones han usado emplean la siguiente fórmula:
S= lectura del resultado del análisis (KNU(S)/mL V= volumen del matraz aforado usado en mL F= factor de dilución para la segunda dilución W= peso de muestra enzimática en g
9.2 Cálculo de valores medios
[0139] Los resultados se declaran con 3 dígitos significativos. No obstante, para la actividad de la muestra < 10 KNU(S)/g,
sólo se dan 2 dígitos significativos.
[0140] Las siguientes reglas se aplican en el cálculo de valores medios:
- 1.
- Los datos que se desvían más de 2 desviaciones estándar del valor medio no se incluyen en el cálculo.
- 2.
- Determinación única y doble sobre una serie: El valor medio se calcula en base a los resultados situados en la área de actividad de la curva estándar.
- 3.
- Determinaciones dobles sobre dos series: todos los valores se incluyen en el valor medio. Se omiten los valores atípicos.
[0141] El coeficiente de variación es 2,9% basado en la validación retrospectiva de los resultados del análisis para varios productos finales y el control de nivel.
Ensayo de actividad de α-amilasa
[0142] La actividad de α-amilasa se determina por un método utilizando comprimidos Phadebas® como sustrato. Los comprimidos de Phadebas (ensayo de amilasa de Phadebas®, suministrado por Pharmacia Diagnostic) contienen un polímero de almidón coloreado de azul insoluble entrecruzado que se ha mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia de tampón y se ha dispuesto en comprimidos.
[0143] Para cada medida se suspende un comprimido en un tubo que contiene 5 mL de tampón Britton-Robinson 50 mM (ácido acético 50 mM, ácido fosfórico 50 mM, ácido bórico 50 mM, CaCl2 0,1 mM, el pH se ajusta al valor de interés con NaOH). La prueba se realiza en un baño maría a la temperatura de interés. La α-amilasa que debe ser evaluada se diluye en x mL de tampón Britton-Robinson 50 mM. 1 mL de esta solución de α-amilasa se añade a 5 mL del tampón Britton-Robinson 50 mM. El almidón se hidroliza por la α-amilasa dando fragmentos azules solubles. La absorbancia de la solución
azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, está en función de la actividad de α-amilasa.
[0144] Es importante que la absorbancia medida a 620 nm después de 10 o 15 minutos de incubación (tiempo de prueba) esté en el rango de 0,2 a 2,0 unidades de absorbancia a 620 nm. En este rango de absorbancia hay linealidad entre la actividad y la absorbancia (ley de Lambert-Beer). La dilución de la enzima debe por lo tanto ajustarse en base a este criterio. Bajo un conjunto específico de condiciones (temp., pH, tiempo de reacción, condiciones de tampón) 1 mg de una α-amilasa dada hidrolizará una cantidad determinada de sustrato y se producirá un color azul. La intensidad del color se mide a 620 nm. La absorbancia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína de α-amilasa pura) de la α-amilasa en cuestión bajo el conjunto de condiciones dado .
EJEMPLOS
Construcción de variantes de BSG α-amilasa (SEQ ID n.º: 3)
[0145] El gen que codifica BSG, amyS, se localiza en plásmido pPL1117. Este plásmido contiene también el gen que confiere resistencia frente a canamicina y un origen de replicación, ambos obtenidos del plásmido pUB110 (Griczan, T.J. et al (1978) J.Bact 134:318-329).
[0146] La secuencia de ADN de la parte madura de amyS se muestra como SEC ID n.º: 11 y la secuencia de aminoácidos de la proteína madura se muestra como SEC ID n.º: 3
[0147] La variante TVB145 de BSG, que contiene una deleción de 6 nucleótidos correspondientes a los aminoácidos I181-G182 en la proteína madura, se construye como sigue:
[0148] La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza para amplificar la parte del gen amyS (del plásmido pPL1117), localizada entre los cebadores de ADN BSG1 (SEC ID N.º: 15) y BSGM2 (SEC ID N.º: 18). BSG1 es idéntico a una parte del gen amyS mientras que BSGM2 contiene la deleción de 6 pb de nucleótidos. Se realiza una reacción PCR estándar: 94°C durante 5 minutos, 25 ciclos de (94°C durante 45 segundos, 50°C durante 45 segundos, 72°C durante 90 segundos), 72°C durante 7 minutos usando la polimerasa Pwo bajo condiciones recomendadas por el fabricante, Boehringer Mannheim Gmbh.
[0149] La banda amplificada de aproximadamente 550pb resultante se utilizó como megacebador (Barik, S and Galinski, MS (1991): Biotechniques 10: 489-490) junto con el cebador BSG3 en una segunda PCR con pPL1117 como molde dando como resultado un fragmento de ADN de aproximadamente 1080 pb.
[0150] Este fragmento de ADN se digere con endonucleasas de restricción Acc65I y SalI y el fragmento resultante de aproximadamente 550 pares de bases se liga en plásmido pPL1117 digerido con las mismas enzimas y transformado en la cepa SHA273 de Bacillus subtilis delecionada de proteasa y de amilasa (descrita en WO92/11357 y WO95/10603). Los transformantes resistentes a la canamicina y degradantes del almidón se analizaron para la presencia de las mutaciones deseadas (digestión de restricción para verificar la introducción de un sitio HindIII en el gen). La secuencia de ADN entre los sitios de restricción Acc65I y SalI fue verificada por la secuenciación del ADN para asegurar la presencia de sólo las mutaciones deseadas.
[0151] La variante TVB146 de BSG que contiene la misma deleción de 6 nucleótidos como TVB145 y una sustitución adicional de asparagina 193 para una fenilalanina, N193F, se construyó de manera similar a TVB145 utilizando el cebador BSGM3 (SEC ID n.º: 19) en la primera PCR.
[0152] La variante TVB161 de BSG, conteniendo la deleción de I181-G182. N193F, y L204F, se construye de manera similar a las dos variantes precedentes con la excepción de que el molde para las reacciones de la PCR es el plásmido pTVB146 (pPL1117 conteniendo las mutaciones de TVB146 dentro de amyS y el oligonucleótido mutagénico para la primera PCR sea BSGM3.
[0153] La variante TVB162 de BSG, conteniendo la deleción de I181-G182, N193F, y E210H, se construye de manera similar a TVB161 a excepción de que el oligonucleótido mutagénico es BSGM4 (SEC ID N.º: 20).
[0154] La variante TVB163 de BSG, conteniendo la deleción de I181-G182, N193F, y E214Q, se construye de manera similar a TVB161 a excepción de que el oligonucleótido mutagénico es BSGM5 (SEC ID N.º: 21).
[0155] Las variantes de BSG construidas anteriormente se fermentaron y purificaron como se ha descrito anteriormente en
la sección "Materiales y Métodos".
Ejemplo 2
[0156] Normalmente, el proceso de licuefacción industrial se realiza usando pH 6,0-6,2 como pH de licuefacción y una adición de 40 ppm de calcio libre para mejorar la estabilidad a 95°C-105°C. Algunas sustituciones aquí propuestas han sido hechas para mejorar la estabilidad a
- 1.
- pH inferior a pH 6,2 y/o
- 2.
- a niveles de calcio libre inferiores a 40 ppm de calcio libre.
15 [0157] Se han utilizado dos métodos diferentes para medir las mejoras en la estabilidad obtenida por las diferentes sustituciones en la α-amilasa de B.stearothermophilus:
Método 1. Un ensayo que mide la estabilidad a pH reducido, pH 5,0, en presencia de 5 ppm de calcio libre.
20 [0158] Se incubaron 10 µg de la variante bajo las siguientes condiciones: una solución de acetato 0,1 M, pH ajustado a pH 5,0, que contiene 5ppm de calcio y un 5% p/p de almidón de maíz común (libre de calcio). La incubación se realizó al baño maría a 95°C durante 30 minutos.
Método 2. Un ensayo que mide la estabilidad en ausencia de calcio libre y donde el pH se mantiene a pH 6,0.
25 [0159] Este ensayo mide la reducción en la sensibilidad de calcio: se incubaron 10 µg de la variante bajo las siguientes condiciones: una solución de acetato 0,1 M, pH ajustado a pH 6,0, que contiene un 5% p/p de almidón de maíz común (libre de calcio). La incubación se realizó al baño maría a 95°C durante 30 minutos.
30 Determinación de estabilidad
[0160] Todos los ensayos de estabilidad 1, 2 se han hecho utilizando la misma configuración. El método fue:
[0161] La enzima se incubó bajo las condiciones pertinentes (1-4). Las muestras se tomaron a 0, 5, 10, 15 y 30 minutos y se 35 diluyeron 25 veces (la misma dilución para todas las muestras tomadas) en el tampón de ensayo (0,1M 50mM Tampón de Britton pH 7,3) y la actividad se midió utilizando el ensayo Phadebas (Pharmacia) bajo condiciones estándar pH 7,3, 37°C.
[0162] La actividad medida antes de la incubación (0 minutos) se utilizó como referencia (100%). El descenso en el porcentaje se calculó como función del periodo de incubación. La tabla muestra la actividad residual después de 30 minutos 40 de incubación.
Método de estabilidad 1. / Mejora de estabilidad a pH bajo
[0163] 45
- MINUTOS DE INCUBACIÓN
- PESO AMILASA SEC. ID. N.º:3 (BSG) VARIANTE SEC. ID N.º: 3 CON DELECIÓN EN POS. I181-G182 (TVB145) VARIANTE SEC. ID N.º: 3 CON DELECIÓN EN POS. I181-G182 + N193F (TVB146) VARIANTE SEC. ID N.º: 3 CON DELECIÓN EN POS. I181-G182 + N193F + E214Q (TVB163)
- 0
- 100 100 100 100
- 5
- 29 71 83 77
- 10
- 9 62 77 70
- 15
- 3 50 72 67
- 30
- 1 33 62 60
[0164] Método de estabilidad 1. / Mejora de estabilidad a pH bajo La temperatura descrita en el método 1 se ha reducido de 95°C a 70°C ya que las amilasas mencionadas para SEC ID n.º: 1 y 2 tienen una termoestabilidad inferior que para SEC ID n.º: 3.
- MINUTOS DE INCUBACIÓN
- PESO AMILASA SEC. ID. N.º: 2 VARIANTE SEC. ID N.º: 2 CON DELECIÓN EN POS. D183-G184 AMILASA DE SEC. ID N.º: 1 VARIANTE DE SEC. ID N.º: 1 CON DELECIÓN EN POS. T183-G184
- 0
- 100 100 100 100
- 5
- 73 92 41 76
- 10
- 59 88 19 69
- 15
- 48 91 11 62
- 30
- 28 92 3 59
Método de estabilidad 2. / Sensibilidad de calcio bajo [0165]
- MINUTOS DE INCUBACIÓN
- PESO DE AMILASA DE SEC ID NO: 3 (BSG) VARIANTE DE SEC ID NO: 3 CON DELECIÓN EN POS. I181-G182 (TVB145) VARIANTE DE SEC ID NO: 3 CON DELECIÓN EN POS. I181-G182 + N193F (TVB146) VARIANTE DE SEC ID NO: 3 CON DELECIÓN EN POS. I181-G182 + N193F + E214Q (TVB163)
- 0
- 100 100 100 100
- 5
- 60 82 81 82
- 10
- 42 76 80 83
- 15
- 31 77 81 79
- 30
- 15 67 78 79
- 10
- Determinación de actividad específica.
- [0166] La actividad específica se determinó utilizando el ensayo Phadebas (Pharmacia) como actividad/mg de enzima. La
- actividad fue determinada usando el ensayo de α-amilasa descrito en la sección Materiales y Métodos de la presente.
- 15
- [0167] La actividad específica de la enzima progenitora y una mutación única y una doble se determinaron para:
- BSG: SEC ID NO:3 (enzima progenitora) 20000 NU/mg
- 20
- TVB145: SEC ID NO:3 con la deleción en posiciones
- I181-G182: (mutación única) 34600 NU/mg
- TVB146: SEC ID NO:3 con la deleción en posiciones
- 25
- I181-G182 + N193F: (mutación doble) 36600 NU/mg
- TVB163: SEC ID NO:3 con la deleción en posiciones
- 30
- I181-G182+N193F+E214Q: (mutación Triple) 36300 NU/mg
- 35
EJEMPLO 3
Cocción a presión y licuefacción en instalación experimental con variante de alfa-amilasa TVB146
[0168] Se realizaron experimentos de licuefacción en una instalación experimental en el sistema mini-jet usando una dosis
de 50 NU (S)/g DS a pH 5,5 con 5 ppm de Ca++ añadido, para comparar el rendimiento de la variante de BSG alfa-amilasa
TVB146 formulada (SEC ID N.º: 3 con deleción en posiciones
I181-G182 + N193F) con aquella de BSG alfa-amilasa progenitora (SEC ID N.º: 3). La reacción se monitorizó por medición
del aumento DE (método Neocuproine) como función del tiempo.
[0169] Se prepararon suspensiones de almidón de maíz de 11,8 kg Cerestar C*farm GL 03406 (89 % de almidón) en agua
desionizada y se compensó hasta 30 kg. El pH se ajustó a 5,5 a temperatura ambiente, después de la adición de 0,55 g de
CaCl2 · 2H2O.
Se utilizaron las siguientes enzimas:
TVB146 108 KNU(S)/g, 146 KNU(SM9)/g
BSG amilasa 101 KNU(S)/g, 98 KNU(SM9)/g
[0170] Se añadió una cantidad de enzima correspondiente a 50 NU (SM9)/g DS, y la conductividad se ajustó a 300mS utilizando NaCl. Las condiciones estándar fueron las siguientes:
- Concentración de sustrato
- 35 % p/p (inicial)
- 31,6-31,9 % p/p (final)
- Temperatura
- 105°C, 5 min (licuefacción primaria)
- 95°C, 90 min (licuefacción secundaria)
- pH (inicial)
- 5,5
[0171] Después del sometimiento a presión, el almidón licuado se recogió y transportó en termo-matraces sellados de la instalación experimental al laboratorio, donde se continuó la licuefacción secundaria a 95 °C.
[0172] Se tomaron 10 mL de muestra a intervalos de 15 minutos de 15-90 minutos. 2 gotas de HCl 1 N se adicionaron para inactivar la enzima. De estas muestras, se pesaron 0,3-0,1 g (según el DE previsto) y se diluyeron a 100 mL. Se determinaron luego los azúcares reductores según el método Neocuproine (determinación de azúcar reductor con precisión mejorada. Dygert, Li, Florida and Thomas (1965). Anal. Biochem 13, 368) y se determinaron los valores DE El desarrollo de DE como función de tiempo se da en la siguiente tabla:
- TVB146
- BSG
- Tiempo (min.)
- DE (neocuproina)
- 15
- 2,80 2,32
- 30
- 4,88 3,56
- 45
- 6,58 4,98
- 60
- 8,17 6,00
- 75
- 9,91 7,40
- 90
- 11,23 8,03
[0173] Como se puede observar la variante de alfa-amilasa TVB146 dio un rendimiento significativamente mejor bajo
condiciones de aplicación industrialmente relevantes a niveles bajos de calcio que la BSG alfa-amilasa progenitora.
EJEMPLO 4
Cocción a presión y Licuefacción con una combinación de variantes de alfa-amilasa (TVB146 y LE174)
[0174] La cocción a presión y licuefacción usando una combinación de las variantes de alfa-amilasa, TVB146 y LE174
(proporción 1:1) se realizaron en las condiciones siguientes:
Almidón de maíz en polvo de grado alimentario Sustrato A.E. Staley (100lbs)
D.S. 35% usando agua DI
Ca2+
Libre 2,7ppm a pH 5,3 (ningún añadido, del almidón sólo) pH incial 5,3
5 La dosis unidad de AF9 (AF9 está disponible bajo pedido) para cada variante enzimática fue 28 NU/g de almidón db para una dosis total de 56 NU/g
Temperatura en la licuefacción primaria 105°C
10 Tiempo de mantenimiento en la licuefacción primaria 5 minutos
Temperatura en la licuefacción secundaria 95°C
[0175] A 15 minutos en licuefacción secundaria se añadieron 1,5 g de hidrolizado a un litro volumétrico pesado que contiene
15 500cc de agua DI y 1 mL de HCl uno normal y se registró el peso exacto añadido. Este se repitió a intervalos de 15 minutos hasta a 90 minutos con un punto adicional a 127 minutos. Estos se diluyeron hasta un litro y se determinó para equivalencia de dextrosa por medio del método de Neocuproina como se describe por Dygert,Li, Florida and Thomas. Determination of reducing sugar with improved precision (1965). Anal. Biochem 13: 368. Determinación de azúcar reductor con precisión mejorada (1965). Anal. Biochem 13, 368.
20 [0176] Los resultados fueron los siguientes:
- Tiempo
- DE
- 15
- 3,2
- 30
- 4,8
- 45
- 6,3
- 60
- 7,8
- 75
- 9,4
- 90
- 10,4
- 127
- 13,1
[0177]
Klein, C., et al., Biochemistry 1992, 31, 8740-8746 .
30 Mizuno, H., et al., J. Mol. Biol. (1993) 234, 1282-1283 . Chang, C., et al, J. Mol. Biol. (1993) 229, 235-238 . Larson, S.B., J. Mol. Biol. (1994) 235, 1560-1584 .
35 Lawson, C.L., J. Mol. Biol. (1994) 236, 590-600 . Qian, M., et al., J. Mol. Biol. (1993) 231, 785-799 . 40 Brady, R.L., et al., Acta Crystallogr. sect. B, 47, 527-535 . Swift, H.J., et al., Acta Crystallogr. sect. B, 47, 535-544 .
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- R.
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LISTADO DE SECUENCIAS
[0178]
<110> Novozymes A/S
<120> Mutantes de alfa-amilasa
<130> 5276.215- EP
<160> 21
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 485
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 1
<210> 2
<211> 485
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 2
<210> 3
<211> 514
<212> PRT
<213> Bacillus stearothermophilus
<400> 3
<210> 4
<211> 483
<212> PRT
<213> Bacillus licheniformis
<400> 4
<210> 5
<211> 480
<212> PRT
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 5
<210> 6
<211> 485
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 6
<210> 7
<211> 485
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 7
<210> 8
<211> 485
<212> PRT
<213> Bacillus sp.
<400> 8
<210> 9
<211> 1455
<212> ADN
<213> Bacillus sp.
<400> 9
<210> 10
<211> 1455
<212> ADN
<213> Bacillus sp.
<400> 10
<210> 11
<211> 1548
<212> ADN
<213> Bacillus sp.
<400> 11
<210> 12
<211> 2084
<212> ADN
<213> Bacillus sp.
<400> 12
<210> 13
<211> 1455
<212> ADN
<213> Bacillus sp.
<400> 13
<210> 14
<211> 1455
<212> ADN
<213> Bacillus sp.
<400> 14
<210> 15
<211> 23
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador BSG1 10
<400> 15
15 <210> 16
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Cebador BSG3
<400> 16
<210> 17
<211> 70
<212> ADN 30 <213> Artificial
<220>
<223> Cebador BSGM1
<400> 17
<210> 18
<211> 41 10 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador BSGM2 15
<400> 18
20 <210> 19
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
25 <220>
<223> Cebador BSGM3
<400> 19
<210> 20
<211> 25
<212> ADN 35 <213> Artificial
<220>
<223> Cebador BSGM4
40 <400> 20
<210> 21 45 <211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador BSGM5
<400> 21
Claims (13)
- REIVINDICACIONES1. Variante de una α-amilasa tipo Termamyl progenitora, donde la α-amilasa tipo Termamyl progenitora se selecciona de:
- (i)
- SEC ID n.º: 1, SEC ID n.º: 2, SEC ID n.º: 3, SEC ID n.º: 4, SEC ID n.º: 5, SEC ID n.º: 6, SEC ID n.º: 7 o SEC ID n.º: 8 o
- (ii)
- una α-amilasa progenitora de tipo Termamyl con al menos un 80% de homología a una de las secuencias en (i); y
donde la variante tiene actividad de α-amilasa y comprende las mutaciones R181* y G182* y una sustitución seleccionada de N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V (con respecto a SEC ID n.º: 6) o en posiciones correspondientes en otras α-amilasas de tipo Termamyl progenitoras, y donde la variante muestra una termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a una concentración de Ca2+ inferior a 40 ppm, en comparación con una variante correspondiente que comprende las mutaciones R181* y G182* sin la sustitución a N195. - 2. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de α-amilasa según la reivindicación1.
-
- 3.
- Vector de expresión recombinante que lleva un constructo de ADN según la reivindicación 2.
-
- 4.
- Célula que se transforma con un constructo de ADN según la reivindicación 2 o un vector según la reivindicación 3.
-
- 5.
- Célula según la reivindicación 4, que es un microorganismo.
-
- 6.
- Aditivo de detergente que incluye una variante de α-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1, opcionalmente en forma de granulado que no forma polvo, líquido estabilizado o enzima protegida.
-
- 7.
- Composición de detergente que incluye una variante de α-amilasa según la reivindicación 1.
-
- 8.
- Composición para detergente de lavado de vajilla manual o automático que incluye una variante de α-amilasa según la reivindicación 1.
-
- 9.
- Composición de lavado de ropa manual o automático que incluye una variante de α-amilasa según la reivindicación 1.
-
- 10.
- Composición comprendiendo:
- (i)
- una mezcla de la α-amilasa de B. licheniformis con la secuencia mostrada en SEC ID n.º: 4 con una o más variantes según la reivindicación 1 derivada de (como la α-amilasa progenitora de tipo Termamyl) la α-amilasa de B. stearothermophilus con la secuencia mostrada en SEC ID n.º: 3 o
- (ii)
- una mezcla de la α-amilasa de B. stearothermophilus con la secuencia mostrada en SEC ID n.º: 3 con una o más variantes según la reivindicación 1 derivadas de una o varias otras α-amilasas de tipo Termamyl progenitoras; o
(iii) una mezcla de una o más variantes según la reivindicación 1 derivada de (como la α-amilasa progenitora de tipo Termamyl) la α-amilasa de B. stearothermophilus con la secuencia mostrada en SEC ID n.º: 3 con una o más variantes según la invención derivadas de una o varias otras α-amilasas progenitoras de tipo Termamyl. -
- 11.
- Uso de una variante de α-amilasa según la reivindicación 1 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para lavado de ropa y/o vajilla.
-
- 12.
- Uso de una variante de α-amilasa según la reivindicación 1 o una composición según la reivindicación 9 para el desencolado textil.
-
- 13.
- Uso de una variante de α-amilasa según la reivindicación 1 o una composición según la reivindicación 9 para la licuefacción de almidón.
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