ES2259609T3 - Anexinas y autoanticuerpos usados como marcadores para cancer de pulmon y de esofago. - Google Patents
Anexinas y autoanticuerpos usados como marcadores para cancer de pulmon y de esofago.Info
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Abstract
Método para diagnosticar el cáncer de pulmón en un sujeto que comprende: (i) poner en contacto una muestra de suero derivada del sujeto con uno o más antígenos de proteína en condiciones tales que pueda producirse una reacción de unión antígeno-anticuerpo inmunoespecífica, en donde dichos antígenos de proteína son los antígenos de proteína de Anexina I y Anexina II; y (ii) detectar la unión inmunoespecífica de los autoanticuerpos frente a Anexina I o Anexina II en la muestra de suero; en el que un aumento en el nivel de unión inmunoespecífica detectado en la etapa (ii) al compararlo con una muestra de suero control es un indicador de cáncer de pulmón.
Description
Anexinas y autoanticuerpos usados como
marcadores para cáncer de pulmón y de esófago.
La presente invención se refiere a métodos de
detección para el diagnóstico, pronóstico o la predisposición a
cáncer de pulmón y de esófago en un sujeto mediante la detección de
la presencia de autoanticuerpos séricos para antígenos de proteína
anexina específicos en sueros de sujetos.
La presente invención también proporciona
métodos de detección para el diagnóstico y el pronóstico de cáncer
de pulmón y de esófago en un sujeto mediante la detección de niveles
de expresión aumentados de proteínas anexinas en muestras
biológicas del sujeto. El método de la invención puede usarse
también para identificar sujetos con riesgo de desarrollar cáncer
de pulmón y de esófago. El método de la invención implica el uso de
muestras biológicas derivadas del sujeto para determinar la
incidencia y el nivel de expresión de proteínas anexinas o la
expresión de péptidos o antígenos derivados de anexina, y/o la
incidencia y el nivel de autoanticuerpos circulantes frente a
antígenos de proteína anexina específicos. La invención se demuestra
mediante ejemplos en los que se han observado niveles elevados de
proteínas anexinas, y niveles elevados de autoanticuerpos
circulantes reactivos contra proteínas anexinas en los sueros de
sujetos con cáncer.
Se ha demostrado que varias proteínas celulares
aparecen con niveles aumentados en los fluidos corporales de
sujetos con diferentes tipos de cáncer. Los niveles aumentados de
tales proteínas en sujetos con cáncer proporcionan ensayos
diagnósticos y pronósticos para determinar la presencia de cáncer.
Por ejemplo, los niveles en suero elevados del antígeno específico
de la próstata (PSA) se usan con frecuencia como un indicador de la
presencia de cáncer de próstata en hombres.
Se conoce que los autoanticuerpos para proteínas
celulares normales o modificadas se producen por pacientes en
ciertas enfermedades tales como las enfermedades autoinmunitarias y
los trastornos relacionados con el sistema cardiovascular, en
algunos casos incluso antes de que la enfermedad haya producido
síntomas manifiestos. También existe una evidencia creciente de una
respuesta inmunitaria humoral al cáncer en seres humanos, tal como
se demuestra por la identificación de anticuerpos contra varios
antígenos intracelulares y de superficie en pacientes con diversos
tumores (Gourevitch et al., 1995, Br. J. Cancer
72:934-938; Yamamoto et al., 1996, Int. J.
Cancer, 69:283-289; Stockert et al., 1998, J.
Exp Med. 187:1349-1354; Gure et al., 1998,
Cancer Res. 58:1034-1041). Por ejemplo, las
alteraciones somáticas en el gen p53 obtienen una respuesta humoral
en el 30-40% de los pacientes afectados (Soussi,
1996, Immunol. Today 17:354-356). En algunos casos,
la detección de anticuerpos anti-p53 puede ser
anterior al diagnóstico del cáncer (Lubin et al., 1995, Nat.
Med. 7:701-702; Cawley et al., 1998,
Gastroenterology 115:19-27). La patente de los
EE.UU. nº 5.405.749 da a conocer un método para detectar un
autoantígeno de la retinopatía asociada al cáncer y para someter a
ensayo el suero del paciente para identificar un autoanticuerpo
para el autoantígeno. Además, se han observado aumentos en las tasas
relativas de la síntesis de las proteínas citoesqueléticas
principales en la superficie de las células leucémicas y de los
linfocitos transformados por mitógenos y los virus de
Epstein-Barr (Bachvaroff, R.J. et al., 1980,
Proc. Natl Acad. Sci. 77:4979-4983).
La mayoría de los antígenos derivados de tumores
que se han identificado y que obtienen una respuesta humoral no son
los productos de genes mutados. Incluyen antígenos de diferenciación
y otros productos génicos que se sobreexpresan en tumores (Old y
Chen, 1998, J. Exp. Med. 187:1163-1167). No está
claro por qué sólo un subconjunto de pacientes con un tipo de tumor
desarrollan una respuesta humoral para un antígeno en particular.
Los factores que influyen en la respuesta inmunitaria pueden incluir
la variabilidad entre individuos en las moléculas del complejo de
histocompatibilidad principales. También es posible que las
proteínas puedan volverse inmunogénicas tras sufrir una
modificación posterior a la traducción, un proceso que puede ser
variable entre tumores de un tipo similar.
El cáncer de pulmón es el cáncer más común en
los Estados Unidos y asciende a más de un cuarto (28%) de los
fallecimientos por cáncer en los EE.UU. (Travis et al., 1996,
Cancer 77:2464-2470). Se han identificado varias
alteraciones moleculares que incluyen la amplificación de
c-myc, mutaciones de Ki-ras o p53
que pueden afectar al comportamiento del tumor (Mao et al.,
1994, Cancer Res 54:1634-1637, Mills et al.,
1995, J. Natl. Cancer Inst. 87:1056-1060, Gao et
al., 1997, Carcinogenesis 18:473-478). Se ha
informado acerca de autoanticuerpos séricos contra los oncogenes
del producto y los genes supresores del tumor, tales como
c-myc (Ben-Mahrez et al.,
1990, Int. J. Cancer 46:35-38),
c-myb (Sorokine et al., 1991, Int. J. Cancer
47:665-669),
c-erbB-2 (Pupa et al., 1993,
Cancer Res 53:5864-5866), ras (Takahashi et
al., 1995, Clin. Cancer 1:107) y p53 (Peyrat et al.,
1995, Lancet 345:621-622; Iizasa et al.,
1998, Cancer Immunol. Immunother. 46:345-349) en
pacientes con diversas enfermedades malignas. Se ha informado
acerca de autoanticuerpos contra los productos del oncogén
L-myc en un 10% de los sueros de pacientes con
cáncer de pulmón (Yamamoto et al., 1996, Int. J. Cancer
69:283-289). También se han detectado
autoanticuerpos séricos contra p53 en sueros de pacientes con cáncer
de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (Iizasa et al.,
1998, Cancer Immunol. Immunother. 46:345-349). Los
títulos de suero elevados de los autoanticuerpos
anti-p53 estaban presentes en aproximadamente el 20%
de los casos de (NSCLC), y la incidencia de estos autoanticuerpos
refleja la presencia de mutaciones de p53 y una sobreexpresión de
p53 (Yamamoto et al., 1996, Int. J. Cancer
69:283-289).
La detección de autoanticuerpos para antígenos
celulares y la identificación de proteínas que han obtenido
autoanticuerpos se han llevado a cabo usando una diversidad de
enfoques. Por ejemplo, el antígeno nuclear de proliferación celular
(PCNA) se describió primeramente como un antígeno nuclear que unía
anticuerpos de algunos pacientes con lupus eritematoso (Miyachi,
K., Fritzler, M.J., y Tan, E.M., 1978, J. Immunol
121:2228-2234). Posteriormente se observó que los
linfocitos restantes no reaccionaron con el anticuerpo, al contrario
que los linfocitos estimulados por mitógeno que mostraron tinción
nuclear. Esto último condujo a la identificación de la proteína,
denominada PCNA que se reconoce por este autoanticuerpo en el lupus
(Tan, E.M., Ogata, K., y Takasaki, Y., 1987, J. Rheumatol.,
13:89-96). En algunos otros casos, las proteínas
candidatas se seleccionan e investigan con respecto a su capacidad
para inducir anticuerpos en pacientes, tal como se investigó para
p53 (Crawford, L.V., Firm, D.C., Bulbrook, R.D., 1984, Int J Cancer
30:403-408). Además, una técnica denominada SEREX
se basa en análisis serológicos de genotecas de expresión de ADNc
recombinante para identificar antígenos tumorales (Old, L., et
al. 1998, J. Exp. Med. 187:1163-1167). De este
modo, se han seguido muchos enfoques para buscar proteínas contra
las que puedan producirse anticuerpos.
Las anexinas son una familia de proteínas que se
unen fosfolípidos dependientes de calcio que se expresan de forma
ubicua en diferentes tipos de tejidos y células de eucariotas
superiores e inferiores (Benz, J. y Hofmann, A, 1997, Biol. Chem
378:177-183). Se han identificado al menos doce
proteínas anexinas. Entre las múltiples funciones sugeridas para la
familia de proteínas anexinas, las que implican a las proteínas en
la regulación de la exocitosis siguen siendo las más convincentes
(Donnelly, SR y Moss SE, Cell, 1997, Mol. Life Sci
53:533-538). Una proteína anexina típica se
caracteriza por dos rasgos definidos, (i) unión a fosfolípidos
dependiente de Ca^{2+}; y (ii) en presencia de un elemento de
secuencia conservada de aproximadamente 70 aminoácidos que se
repite cuatro u ocho veces en un miembro dado de la familia.
Estudios inmunocitoquímicos de anexinas han demostrado que residen
subadyacentes a las membranas plasmáticas, cerca de los orgánulos
intracelulares que secuestran calcio (Gerke, V y Moss, SE, 1997,
Biochimica et Biophysica Acta 1357:129-154). Las
propiedades físicas asociadas a las anexinas incluyen inhibición de
la fosfolipasa A_{2}, actividad anticoagulante, unión a proteínas
citoesqueléticas, agregación de membranas y vesículas y actividad de
canal selectiva de calcio. Se ha encontrado que los niveles
aumentados de anexina se asocian a varias enfermedades que incluyen
la esclerosis múltiple y la neuritis experimental.
Davis, R.G et al en J Immunol methods,
188, (1995) 91-95 describen la detección de anexina
II extracelular en diversas células cancerígenas usando un
radioinmunoensayo.
Pencil, S.D et al en Clin Exp Metastasis,
16 (1998) 113-120 observaron la inmunorreactividad
de la anexina I en una subpoblación de tumores primarios en cáncer
de mama humano.
Bastian, B.C et al en J Dermatol Science,
8 (1994) 194-202 observaron que los autoanticuerpos
dirigidos contra diversas anexinas podían detectarse tanto en los
grupos control como en los grupos enfermos, sin manifestar ninguna
correlación significativa con ninguno de los estados de enfermedad,
que incluían enfermedades autoinmunitarias, psoriasis, úlcera de
pierna, melanoma maligno y enfermedades diversas.
La patente de los EE.UU. nº 5 316 915 describe
un método para determinar anticuerpos contra lipocortinas
(anexinas), que emplea una mezcla de Lipocortina I y Lipocortina II
(anexina I y anexina II). Sin embargo, no se hace mención a ninguna
conexión con un estado de enfermedad específico.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar métodos de detección para la valoración diagnóstica y
pronóstica de cáncer de pulmón y de esófago, para la identificación
de sujetos con predisposición a cáncer de pulmón y de esófago, y la
monitorización de pacientes sometidos a tratamiento de cáncer de
pulmón y de esófago, basándose en la detección de niveles elevados
de autoanticuerpos frente a anexina en muestras biológicas de
sujetos. La invención también proporciona métodos para detectar una
sobreproducción de proteínas anexinas y/o una sobreproducción de
grupos de proteínas anexinas como un indicador diagnóstico o
pronóstico de cáncer de pulmón y de esófago.
La invención se refiere a un método para
diagnosticar el cáncer de pulmón en un sujeto que comprende: (i)
poner en contacto una muestra de suero derivada del sujeto con uno o
más antígenos de proteína en condiciones tales que pueda producirse
una reacción de unión antígeno-anticuerpo
inmunoespecífica, en la que dichos antígenos de proteína son los
antígenos de proteína de Anexina I y Anexina II; y (ii) detectar la
unión inmunoespecífica de los autoanticuerpos frente a Anexina I o
Anexina II en la muestra de suero; en el que un aumento en el nivel
de unión inmunoespecífica detectado en la etapa (ii) al compararlo
con una muestra de suero control es un indicador de cáncer de
pulmón.
La invención también se refiere a un método para
diagnosticar el cáncer de esófago en un sujeto que comprende: (i)
poner en contacto una muestra de suero derivada del sujeto con uno o
más antígenos de proteína en condiciones tales que pueda producirse
una reacción de unión antígeno-anticuerpo
inmunoespecífica, en la que dichos antígenos de proteína son los
antígenos de Anexina I; y (ii) detectar la unión inmunoespecífica de
los autoanticuerpos frente a Anexina I en la muestra de suero, en
el que un aumento en el nivel de unión inmunoespecífica detectado
en la etapa (ii) al compararlo con una muestra de suero control es
un indicador de cáncer de esófago.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que los niveles de expresión de Anexina I y II
están aumentados en las muestras de tejido tumoral derivadas de
sujetos con adenocarcinoma pulmonar o cáncer de pulmón de células
escamosas. Adicionalmente, se detectaron niveles aumentados de
autoanticuerpos contra Anexina I y II en el suero de sujetos con
adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células escamosas. El hecho
de encontrar que los niveles de proteínas anexinas y
autoanticuerpos frente a anexina están aumentados en las muestras
derivadas de sujetos con cáncer proporciona una base para el
desarrollo de métodos diagnósticos y pronósticos así como de medios
para monitorizar la eficacia de diversos tratamientos terapéuticos
del cáncer.
Figura 1. Electroforesis en gel bidimensional de
lisados de células A549. Se tiñó el gel con plata para visualizar
las proteínas.
Figura 2. Inmunotransferencia (Western blot) de
una separación en gel bidimensional de un lisado de células A549
tratadas con suero de un paciente con cáncer de pulmón. Se observó
reactividad en un grupo de manchas de proteínas contiguas
denominado A1 con un pI de entre 6,3 y 6,8 y un peso molecular de 37
kDa.
Figura 3. Inmunorreactividad de IgM contra
proteínas de cáncer de pulmón. Inmunotransferencia de una separación
en gel bidimensional de lisados de A549 tratadas con suero de
pacientes con cáncer de pulmón. Posteriormente se incubaron las
membranas con un anticuerpo IgM antihumano de oveja conjugado con
peroxidasa de rábano
picante.
picante.
Figura 4. Inmunorreactividad del subtipo de IgG
contra sueros de pacientes con cáncer de pulmón. Inmunotransferencia
de una separación en gel bidimensional de lisados de A549 con suero
de pacientes con cáncer de pulmón. Posteriormente se hibridaron las
membranas con anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 antihumanos de
ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante.
Figura 5. Especificidad de anticuerpos IgG de A1
y A2 para sueros de pacientes con cáncer de pulmón. Se hibridaron
las membranas que contenían lisados de A549 con sueros de pacientes
con melanoma, cáncer de mama, cáncer de hígado o cáncer de esófago.
Ninguno de los sueros mostró inmunorreactividad basada en IgG contra
A2. Se observaron proteínas A1 con sueros de pacientes con cáncer
de esófago (5/8), cáncer de mama (1/11), pero estaban ausentes con
sueros de pacientes con melanoma (0/7) y cáncer de hígado
(0/11).
Figura 6. Los anticuerpos
anti-Anexina I y anti-Anexina II son
inmunorreactivos contra las proteínas en las manchas de A1 y A2,
respectivamente.
La presente invención consigue un objetivo
sumamente deseable, concretamente proporcionar métodos para la
evaluación diagnóstica y pronóstica de sujetos con cáncer de pulmón
y de esófago y la identificación de sujetos que muestran una
predisposición a desarrollar cáncer de pulmón y de esófago. Los
ensayos de la invención comprenden métodos diseñados para detectar
niveles aumentados en la producción de la proteína anexina, o la
presencia de autoanticuerpos frente a anexina, en muestras de suero
u otras muestras biológicas de un sujeto. Para los fines de la
presente invención, las proteínas anexinas se caracterizan por un
motivo canónico en el que un tramo de aproximadamente 70
aminoácidos se repite al menos cuatro veces (Wallner, B.P. et
al., 1986, Nature 320:77-80; Weber, K. y
Johnson, N., 1986, FEBS Lett. 203:95-98; Saris,
C.J.M. et al., 1986, Cell 46:201-212; Huang
K.S. et al., 1986, Cell 46:191-199).
Específicamente, la invención incluye un método
para el diagnóstico y pronóstico de cáncer de pulmón y de esófago
en un sujeto que comprende:
- (a)
- detectar cuantitativamente la proteína anexina en una muestra biológica derivada de un sujeto; y
- (b)
- comparar el nivel de proteína detectado en la muestra del sujeto con el nivel de proteína detectado en una muestra control,
en el que un aumento en el nivel de
proteína anexina detectado en la muestra del sujeto al compararlo
con las muestras control es un indicador de un sujeto con cáncer o
con un riesgo aumentado de cáncer de pulmón y de esófago. Además de
detectar la proteína anexina, pueden detectarse péptidos derivados
de anexina, antígenos o proteínas anexinas modificadas
diferencialmente para el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de
pulmón y de
esófago.
Puede prepararse una gran diversidad de mezclas
de proteínas que pueden contener proteínas anexinas o someterlas a
ensayo para el nivel de expresión de proteínas.
La presente invención incluye un método para el
diagnóstico y el pronóstico de un sujeto con cáncer de pulmón y de
esófago que comprende:
- (a)
- poner en contacto una muestra biológica que contiene anticuerpos derivada de un sujeto, con una muestra que contiene antígenos de proteína anexina en condiciones tales que pueda producirse una reacción de unión antígeno-anticuerpo inmunoespecífica; y
- (b)
- detectar la presencia de unión inmunoespecífica de los autoanticuerpos presentes en la muestra biológica del sujeto a la proteína anexina,
en el que la presencia de una unión
inmunoespecífica de autoanticuerpos indica la presencia de cáncer de
pulmón y de esófago en el
sujeto.
En una realización específica de la invención,
se purifican proteínas anexinas, incluyendo pero no limitándose a
Anexina I y II y péptidos derivados de las mismas, y se utilizan
para detectar en un suero de un sujeto la presencia de
autoanticuerpos circulantes para tales antígenos de proteína,
mediante ensayos inmunoabsorbentes sensibles y rápidos o mediante
otros procedimientos.
Los métodos pueden llevarse a cabo, por ejemplo,
utilizando kits diagnósticos previamente empaquetados que
comprenden al menos un reactivo para detectar la proteína anexina
tal como un anticuerpo anti-anexina.
Alternativamente, los kits diagnósticos comprenden un fragmento de
proteína anexina o de proteína antigénica para la detección de
autoanticuerpos frente a anexina en una muestra derivada de un
sujeto.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que los niveles de proteínas anexinas I y II están
aumentados en el adenocarcinoma y los tumores de pulmón de células
escamosas derivados de sujetos con cáncer de pulmón y de esófago.
Adicionalmente, se han detectado niveles aumentados de
autoanticuerpos circulantes reactivos contra proteínas anexinas en
el suero de sujetos que tienen adenocarcinoma y tumores de pulmón de
células
escamosas.
escamosas.
Según la invención, pueden usarse mediciones de
los niveles de proteínas anexinas en muestras derivadas de un
sujeto para el diagnóstico temprano de enfermedades tales como el
cáncer de pulmón y de esófago. Por otra parte, pueden usarse la
monitorización y cuantificación de los niveles de proteína anexina
con un fin pronóstico para representar la progresión de la
enfermedad y para valorar la eficacia de los agentes usados para
tratar a un sujeto con cáncer de pulmón y de esófago.
La detección de proteínas anexinas en una
muestra de un sujeto puede llevarse a cabo mediante cualquiera de
varios métodos. Los métodos diagnósticos preferidos para la
detección de proteínas anexinas en la muestra biológica de un
sujeto pueden incluir, por ejemplo, inmunoensayos en los que las
proteínas anexinas se detectan por su interacción con un anticuerpo
específico de anexina. Los anticuerpos útiles en la presente
invención pueden usarse para detectar cuantitativa o
cualitativamente la presencia de anexinas o fragmentos antigénicos
de las mismas. Además, pueden usarse reactivos distintos a los
anticuerpos, tales como, por ejemplo, polipéptidos que se unen
específicamente a proteínas anexinas en ensayos para detectar el
nivel de expresión de proteína anexina. Alternativamente, la
detección de proteínas anexinas puede llevarse a cabo mediante la
detección y medición de los niveles de las propiedades biológicas
asociadas a las proteínas anexinas, tales como por ejemplo, la
fosfolipasa A, y la actividad anticoagulante.
Los inmunoensayos útiles en la práctica de la
invención incluyen pero no se limitan a sistemas de ensayo que usan
técnicas tales como inmunotransferencias, radioinmunoensayos, ELISA
(ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de
intercalación ("sandwich"), ensayos de inmunoprecipitación,
reacciones con precipitina, reacciones con precipitina por difusión
en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos
de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos,
inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A, para
nombrar solamente algunos.
Se obtiene una muestra biológica que puede
contener proteínas anexinas de un sujeto sospechoso de tener un
cáncer o riesgo de cáncer de pulmón y de esófago en particular. Se
solubilizan alícuotas de tejidos completos, o células, usando
cualquiera de una diversidad de combinaciones de solubilización
conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede
solubilizarse un tejido mediante la adición de un tampón de lisis
que comprende (por litro) urea 8 M, 20 ml de tensioactivo Nonidet
P-40, 20 ml de anfólitos (pH
3,5-10), 20 ml de 2-mercaptoetanol,
y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,2 mM en agua destilada
desionizada.
Los inmunoensayos para detectar la expresión de
la proteína anexina comprenden normalmente poner en contacto la
muestra biológica con un anticuerpo anti-anexina en
condiciones tales que pueda producirse una reacción de unión
antígeno-anticuerpo inmunoespecífica, y detectar o
medir la magnitud de cualquier unión inmunoespecífica por el
anticuerpo. En un aspecto específico, puede usarse una unión de
anticuerpo de este tipo, por ejemplo, para detectar la presencia y
la producción aumentada de proteínas anexinas en las que la
detección de la producción aumentada de proteínas anexinas es una
indicación de un estado de enfermedad. Los niveles de proteína
anexina en una muestra biológica se comparan con normas
establecidas para individuos normales que coinciden en edad y sexo
y para sujetos con una diversidad de estados de enfermedad no
cancerígenos o precancerígenos.
En una realización de la invención, la muestra
biológica se pone en contacto con un soporte o portador de fase
sólida, tal como nitrocelulosa, para inmovilizar cualquier proteína
presente en la muestra. Luego se lava el soporte con tampones
adecuados seguido de un tratamiento con un anticuerpo específico de
anexina marcado de manera detectable. Luego se lava el soporte de
fase sólida con el tampón una segunda vez para eliminar anticuerpos
no unidos. La cantidad de anticuerpos unidos en el soporte sólido se
determina entonces según métodos bien conocidos. Los expertos en la
técnica podrán determinar las condiciones de ensayo opcionales para
cada determinación empleando la experimentación habitual.
Una de las maneras en las que los anticuerpos
frente a anexina pueden marcarse de manera detectable es ligando el
anticuerpo a una enzima, como para el uso en un inmunoensayo
enzimático (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent
Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2:1-7,
Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD;
Voller, A., et al., 1978, J. Clin. Pathol.
31:507-520; Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol.
73:482-523). La enzima que se une al anticuerpo
reaccionará con un sustrato apropiado, preferiblemente un sustrato
cromogénico, de manera que produzca un resto químico que pueda
detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos,
fluorimétricos o visuales. Las enzimas que pueden usarse para marcar
el anticuerpo de manera detectable incluyen, pero no se limitan a,
peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. La detección
puede llevarse a cabo también mediante métodos colorimétricos que
emplean un sustrato cromogénico para la enzima.
La detección de anticuerpos frente a anexina
puede llevarse a cabo también usando una diversidad de otros
métodos. Por ejemplo, marcando los anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos de manera radioactiva, es posible detectar la expresión
de la proteína anexina a través del uso de un radioinmunoensayo
(RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of
Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay
Techniques, The Endocrine Society, marzo 1986). El isótopo
radioactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un
contador gamma o un contador de centelleo o mediante
autorradiografía.
El anticuerpo también puede marcarse con un
compuesto fluorescente. Entre los compuestos de marcado fluorescente
usados más comúnmente se encuentran el isocianato de fluoresceína,
la rodamina, ficoeritrina y fluorescamina. Asimismo, puede usarse
un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo frente a
anexina. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina
detectando la presencia de luminiscencia. Compuestos de
bioluminiscencia importantes para los fines de marcado son la
luciferina, luciferasa y aequorina.
En una realización específica de la invención,
los niveles de proteínas anexinas en muestras biológicas pueden
analizarse mediante electroforesis bidimensional en gel. Los
expertos en la técnica conocen los métodos de electroforesis
bidimensional. Las muestras biológicas, tales como muestras de
tejidos, se cargan sobre geles electroforéticos para una separación
de isoelectroenfoque en la primera dimensión que separa proteínas
basándose en la carga. Pueden utilizarse varias preparaciones en
gel de primera dimensión que incluyen geles en tubo para
separaciones basadas en anfólitos portadores o tiras de gel para
separaciones basadas en gradientes inmovilizados. Tras la
separación de primera dimensión, las proteínas se transfieren al
segundo gel de dimensión, siguiendo un procedimiento de equilibrado
y se separan usando la SDS PAGE (electroforesis en geles de
poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio) que separa
las proteínas basándose en el peso molecular. Cuando se comparan
las muestras biológicas derivadas de diferentes sujetos, se preparan
múltiples geles a partir de muestras biológicas individuales
(incluyendo muestras de controles normales).
Tras la separación, se transfieren las proteínas
desde los geles bidimensionales a las membranas usadas comúnmente
para la realización de inmunotransferencias. Las técnicas para la
realización de inmunotransferencias y la visualización posterior de
proteínas también se conocen bien en la técnica (Sambrook et
al, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª edición,
volumen 3, 1989, Cold Spring Harbor). Pueden usarse los
procedimientos habituales, o pueden modificarse los procedimientos
tal como se conoce en la técnica para la identificación de proteínas
de un tipo en particular, tales como las muy básicas o ácidas, o
solubles en lípidos, etc. (Véase, por ejemplo, Ausubel, et
al., 1999, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley &
Sons, Inc., N.Y.). Los anticuerpos que se unen a las proteínas
anexinas se utilizan en una etapa de incubación, tal como en el
procedimiento de análisis de inmunotransferencia. Un segundo
anticuerpo específico para el primer anticuerpo se utiliza en el
procedimiento de análisis de inmunotransferencia para visualizar las
proteínas que reaccionaron con el primer anticuerpo.
La detección de niveles de proteína anexina en
muestras biológicas también puede usarse para monitorizar la
eficacia de los agentes anticancerígenos potenciales durante el
tratamiento. Por ejemplo, el nivel de producción de proteína
anexina puede determinarse antes y durante el tratamiento. La
eficacia del agente puede seguirse comparando la expresión de
anexina a lo largo del tratamiento. Los agentes que muestran
eficacia son los que reducen el nivel de producción de proteína
anexina a medida que progresa el tratamiento con el agente.
La presente invención se demuestra mediante
ejemplos en los que se han detectado niveles elevados de proteínas
anexinas en muestras de tejidos derivadas de pacientes con
adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de pulmón de células
escamosas. En particular, se detectaron niveles aumentados de
Anexina I y II en muestras derivadas de pacientes con cáncer de
pulmón. La detección y/o medición cuantitativa de proteínas anexinas
en muestras biológicas puede usarse para detectar sujetos que
presentan riesgo de desarrollar ciertos tipos de cáncer u otros
trastornos proliferativos en los que se sobreexpresan las proteínas
anexinas. Además, pueden usarse las diferencias cualitativas en el
patrón de incidencia en los diferentes fluidos séricos o biológicos
de diferentes miembros de la familia de anexina de proteínas como
un indicador de detección, diagnóstico o pronóstico de cáncer o
riesgo de cáncer de pulmón y de
esófago.
esófago.
La presente invención proporciona métodos
diagnósticos y pronósticos para enfermedades tales como cáncer de
pulmón y de esófago basados en la detección de autoanticuerpos
frente a anexina circulantes en un sujeto. El método obtiene
validez mediante el uso de una muestra biológica de un sujeto con
cáncer y de controles que coinciden en edad y sexo, sin cáncer. Una
muestra biológica que puede contener autoanticuerpos, tal como
suero, se obtiene de un sujeto sospechoso de tener cáncer de pulmón
y de esófago o sospechoso de tener predisposición a desarrollar
cáncer de pulmón y de esófago. Un fluido orgánico similar se obtiene
de un sujeto control que no tiene cáncer.
Según la invención, la medición de
autoanticuerpos reactivos contra los antígenos de proteína anexina
puede usarse para el diagnóstico temprano de enfermedades tales
como cáncer de pulmón y de esófago. Por otra parte, la
monitorización de los niveles de autoanticuerpos puede usarse de
manera pronóstica para representar la progresión de la enfermedad.
La detección de autoanticuerpos en una muestra de suero de un
paciente puede llevarse a cabo mediante varios métodos. Tales
métodos incluyen inmunoensayos que incluyen, pero no se limitan a,
sistemas de ensayo que usan técnicas tales como
inmunotransferencias, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de intercalación
("sandwich"), ensayos de inmunoprecipitación, reacciones con
precipitina, reacciones con precipitina por difusión en gel, ensayos
de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del
complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos
fluorescentes, inmunoensayos con proteína A, para nombrar solamente
algunos.
Un inmunoensayo de este tipo se lleva a cabo por
un método que comprende poner en contacto una muestra de suero
derivada de un sujeto con una muestra que contiene los antígenos de
proteína anexina en condiciones tales que pueda producirse una
reacción de unión antígeno-anticuerpo
inmunoespecífica, y detectar o medir la magnitud de cualquier unión
inmunoespecífica por el autoanticuerpo. En un aspecto específico,
una unión de este tipo de un autoanticuerpo por secciones
tisulares, por ejemplo, puede usarse para detectar la presencia de
un autoanticuerpo en el que la detección de un autoanticuerpo es una
indicación de un estado de enfermedad. Los niveles de
autoanticuerpos en una muestra de suero se comparan con los niveles
presentes en una muestra de suero análoga de un sujeto que no tiene
el trastorno.
Los inmunoensayos pueden llevarse a cabo de
diversas maneras. Por ejemplo, un método para llevar a cabo tales
ensayos implica anclar la proteína anexina a un soporte sólido y
detectar los anticuerpos anti-anexina unidos
específicamente a la misma. Las proteínas anexinas que deben
utilizarse en los ensayos de la invención pueden prepararse a
través de técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica.
Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica para una proteína
anexina o un fragmento antigénico de la misma pueden crearse
mediante ingeniería genética para dar un vector de expresión
apropiado para una preparación a gran escala de proteína anexina.
Puede ser ventajoso crear proteínas de fusión que puedan facilitar
el marcado, inmovilización o detección de proteína anexina. Véanse,
por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, N.Y. Alternativamente, la proteína anexina
puede purificarse a partir de fuentes naturales, por ejemplo,
purificarse a partir de células, usando las técnicas de separación
de proteínas bien conocidas en la técnica. Tales técnicas de
purificación pueden incluir, pero no se limitan a la cromatografía
con tamiz molecular y/o cromatografía de intercambio de iones. En la
práctica, se utilizan de manera conveniente placas de microtítulo
como soporte sólido para las proteínas anexinas. Las superficies
pueden prepararse de antemano y almacenarse.
La presente invención se demuestra mediante
ejemplos en los que se han detectado niveles elevados de
autoanticuerpos circulantes reactivos contra diversos antígenos de
proteína anexina en los sueros de pacientes con cáncer. Puede
usarse la detección y/o medición cuantitativa de autoanticuerpos
anti-anexina circulantes en suero para detectar
sujetos con riesgo de padecer cáncer de pulmón y de esófago en los
que los niveles de proteína anexina están aumentados.
6.
Ejemplo
Usando los métodos de la presente invención, se
detectó la reactividad contra las proteínas anexinas en sueros
obtenidos de sujetos con cáncer. Se encontró que las muestras de
suero de los sujetos con cáncer eran reactivas contra las proteínas
anexinas. Además, se observaron niveles aumentados en la producción
de proteínas anexinas en muestras tisulares derivadas de sujetos
con cáncer.
Todos los reactivos de cultivo celular,
incluyendo el medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, que
contiene L-glutamina, piruvato de sodio y
clorhidrato de piridoxina), la solución salina tamponada con fosfato
(PBS) de Dulbecco, suero bovino fetal y penicilina/estreptomicina
se obtuvieron de GIBCO-BRL (Grand Island, N.Y.). Se
obtuvieron anticuerpos monoclonales anti-Anexina I y
II de ratón de ICN (Costa Mesa, C.A). Se compraron anticuerpos
monoclonales IgM anti-humanos de ratón en la empresa
Sigma Chemical (St. Louis, MO). Se adquirieron anticuerpos IgG1,
IgG2, IgG3 e IgG4 anti-humanos de ratones conjugados
con peroxidasa de rábano picante en la empresa Zymed (San
Francisco, CA). Se obtuvieron anticuerpos IgG
anti-humanos de oveja conjugados con peroxidasa de
rábano picante y anticuerpos monoclonales IgG
anti-ratón, el kit ECL (de quimioluminiscencia
intensificada) y la película Hyperfilm MP de Amersham (Arlington
Heights, IL). Se compraron membranas Immobilon-P de
PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)) en Millipore Corp.
(Bedford, Mass.). La acrilamida usada en la primera electroforesis
dimensional, la urea, el persulfato de amonio y la PDA (piperazina
diacrilamida) se compraron todos en Bio-Rad
(Rockville Center, N.Y.). La acrilamida usada en la segunda
electroforesis dimensional se compró en Serva (Crescent Chemical,
Hauppauge, N.Y.) y los anfólitos portadores (pH de 4 a 8) y el
NP-40 se compraron ambos en Gallard/Schlessinger
(Carle Place, N.Y.). Todos los demás reactivos y productos químicos
se obtuvieron o bien de Fisher o bien de Sigma y eran de la mayor
pureza disponible.
Se cultivaron líneas celulares de adenocarcinoma
humano A549 a 37ºC en una incubadora humidificada con el 6% de
CO_{2} en DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal, 100
U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina. Se hicieron pases
semanales de las células hasta que habían alcanzado una confluencia
del 70-80%.
Se obtuvo tejido tumoral fresco en el momento
del diagnóstico (por ejemplo, tejido de biopsia) de pacientes con
cáncer de pulmón. El protocolo experimental fue aprobado por el
"Institutional Review Board for Approved Research Involving Human
Subjects" (Consejo de revisión institucional para la
investigación aprobada que implica sujetos humanos) de la
Universidad de Michigan. Antes del estudio se obtuvo el
consentimiento informado de los pacientes (o de sus familias). Tras
la escisión, se congeló inmediatamente el tejido tumoral a -80ºC,
tras lo cual se solubilizaron cantidades reducidas de tejido tumoral
en tampón de solubilización y se conservaron a -80ºC hasta su uso.
Se lisaron las células cultivadas por adición de 200 \mul de
tampón de solubilización que comprendía urea 8M,
NP-40 al 2%, anfólitos portadores al 2% (pH de 4 a
8), \beta-mercaptoetanol al 2% y PMSF 10 mM, y se
recogieron usando un rascador de células. Tras añadir 100 \mul
adicionales de tampón de solubilización, se transfirió la
disolución que contenía los extractos celulares a tubos de microfuga
y se conservaron a -80ºC hasta su uso.
Se separaron proteínas derivadas a partir de
extractos, tanto de células cultivadas como de tumores sólidos, en
dimensiones tal como se describió previamente (Strahler et
al., 1989, Two-dimensional polyacrylamide gel
electrophoresis of proteins. En "Protein Structure: A Practical
Approach" T.E. Creighton (ed.) IRL Press, Oxford, R.U., págs.
65-92), con algunas modificaciones. Brevemente, tras
la lisis celular en tampón de solubilización, se aplicaron 35
\mul de alícuotas de células cultivadas o de tejido tumoral
solubilizadas derivadas de aproximadamente 2,5 x 10^{6} células
sobre geles de isoenfoque. Se llevó a cabo un isoelectroenfoque
usando anfólitos portadores con un pH de 4 a 8 a 700 V durante 16
h, seguido de 1000 V durante 2 h adicionales. Se cargó el gel de
tubo de primera dimensión sobre un casete que contenía el gel de
segunda dimensión, tras equilibrado en un tampón de muestra de
segunda dimensión (Tris 125 mM (pH 6,8), que contenía glicerol al
10%, SDS al 2%, ditiotreitol al 1% y azul de bromofenol). Para la
separación de segunda dimensión, se usó un gradiente de acrilamida
de desde el 11% hasta el 14%, y las muestras se sometieron a
electroforesis hasta que la parte delantera del colorante había
alcanzado el extremo opuesto del gel. Se transfirieron las proteínas
separadas a una membrana de PVDF Immobilon-P. Se
visualizaron los patrones de proteína en algunos geles mediante
tinción con plata, y en algunas membranas
Immobilon-P mediante tinción de las membranas con
azul de Coomassie. Se incubaron las membranas no teñidas preparadas
para la hibridación con tampón de bloqueo (que comprendía solución
salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 1,8% de leche en polvo
desnatada y 0,1% de Tween 20) durante 2 h, luego se lavó y se
incubó con suero obtenido o bien de pacientes, o con suero control
normal (300 \mul de suero, a una dilución de 1:100) durante 1 h a
temperatura ambiente. Tras tres lavados con tampón de bloqueo, se
incubaron las membranas con un anticuerpo IgG
anti-humano de oveja conjugado con peroxidasa de
rábano picante (a una dilución de 1:1000) durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Se lavaron las membranas 5 veces con TBS que
contenía el 0,1% de Tween 20, una vez en TBS, se incubaron
brevemente en ECL y se expusieron a Hyperfilm^{TM} MP durante
10-30 min. Se compararon directamente los patrones
visualizados tras la hibridación con los sueros de pacientes, tanto
con las inmunotransferencias teñidas con azul de Commassie de la
misma muestra para determinar la correlación con proteínas, así
como con los patrones obtenidos de la hibridación de las
inmunotransferencias derivadas de la misma muestra con los sueros
de pacientes con otros tumores sólidos o sueros control para
determinar la especificidad de los autoantígenos. Alternativamente,
se incubaron membranas con un anticuerpo IgM
anti-humano de oveja conjugado con peroxidasa de
rábano picante y se procesaron para incubaciones con un anticuerpo
IgG anti-humano.
Adicionalmente, se caracterizaron las manchas de
proteína tanto en los tumores como en los lisados de las líneas
celulares de adenocarcinoma de pulmón que se visualizaron con los
sueros de paciente, pero no con los sueros control. Se sometieron
los lisados celulares de A549 a PAGE 2-D, tras lo
cual se transfirieron las proteínas separadas a membranas
Immobilon-P y posteriormente se tiñeron con azul de
Commassie. Se cortaron las manchas de proteína de interés de la
membrana y se sometieron a una secuenciación de aminoácidos
N-terminal y análisis espectrométrico de masa. Se
utilizaron las secuencias resultantes y masas peptídicas para
búsquedas en bases de datos para una identificación proteica.
Se utilizaron dos anticuerpos monoclonales de
anti-Anexina I y II. Se usaron estos anticuerpos
primarios a una dilución de 1:5000 en ensayos de
inmunotransferencia y se procesaron para incubaciones con sueros de
paciente.
Se separaron proteínas celulares de A549
mediante PAGE 2-D y se transfirieron a membranas de
PVDF Immobilon-P. Para el análisis de
inmunotransferencia, se trató cada membrana con una muestra de
suero. Las muestras incluían sueros obtenidos en el momento del
diagnóstico de 18 pacientes con adenocarcinoma de pulmón, 11
pacientes con carcinoma de pulmón de células escamosas, 4 con
carcinoma de pulmón de células pequeñas, 2 con carcinoma de pulmón
de células grandes, 19 con cáncer de pulmón sin clasificar; 37
pacientes con otros tipos de cáncer (11 con cáncer de mama, 7 con
melanoma, 11 con cáncer de hígado, y 8 con cáncer de esófago; y de
15 sujetos sanos sin historia previa de cáncer o enfermedad
autoinmunitaria.
En la figura 1 se muestra un ejemplo de un gel
de 2-D de células A549 teñidas con plata. La
hibridación de las membranas usando sueros de paciente como
anticuerpo primario e IgG anti-humano de oveja como
anticuerpo secundario revelaron patrones variables de reactividad
entre sueros de paciente con cáncer de pulmón. Las hibridaciones
duplicadas dieron como resultado patrones similares. En general, se
observaron diversas manchas reactivas con la mayoría de los sueros.
Se observaron algunos de las manchas reactivas con sueros control y
de este modo, se consideró que representaban una reactividad no
específica. Otros se restringieron a sueros de paciente con cáncer
de pulmón. Lo más destacable entre estos últimas fue su intensa
reactividad en un grupo de manchas de proteínas contiguas
denominado A1, con un pI de entre 6,3 y 6,8 y un PM de 37 kDa
(figura 2), que se observó con sueros de 8 de 18 pacientes con
adenocarcinoma de pulmón, 4 de 11 pacientes con carcinoma de pulmón
de células escamosas, 1 de 4 pacientes con carcinoma de pulmón de
células pequeñas, y 2 de 19 pacientes con cáncer de pulmón sin
clasificar y que estaba ausente en membranas de A549 hibridadas con
sueros de individuos normales. Un segundo grupo de manchas de
proteínas contiguas denominado A2 (figura 3), con un pI de entre
7,2 y 7,8 y un PM de aproximadamente 36 kDa se observó con sueros de
7 de 18 pacientes con adenocarcinoma de pulmón, 3 de 11 pacientes
con carcinoma de pulmón de células escamosas, 2 de 4 pacientes con
carcinoma de pulmón de células pequeñas, y 6 de 19 pacientes con
cáncer de pulmón sin clasificar pero estaban ausentes en sueros de
individuos normales. En total, 11 de 18 sueros de pacientes con
adenocarcinoma de pulmón y 6 de 11 sueros de pacientes con
carcinoma de pulmón de células escamosas y 3 de 4 con carcinoma de
pulmón de células pequeñas mostraron reactividad hacia A1 y/o
A2.
Para determinar si los sueros que mostraron
inmunorreactividad basada en IgG contra proteínas A1 y/o A2 también
mostraron inmunorreactividad basada en IgM, se incluyeron en este
análisis el suero de tres pacientes con adenocarcinoma de pulmón
que mostró inmunorreactividad basada en IgG contra A1 y/o A2 y de
dos controles negativos. Se hibridaron membranas que contenían
lisados de A549 con sueros de paciente y control y posteriormente se
incubaron con un anticuerpo IgM anti-humano de
oveja conjugado con peroxidasa de rábano picante. Sólo el suero de
paciente que mostró reactividad basada en IgG contra A1 y A2 mostró
reactividad basada en IgM contra estas dos proteínas de conjunto
contiguas (figura 3).
Para determinar el subtipo de IgG de sueros que
mostraron inmunorreactividad basada en IgG contra proteínas A1 y/o
A2, se incluyeron en este análisis el suero de tres pacientes con
adenocarcinoma de pulmón que mostró inmunorreactividad de IgG
contra las proteínas A1 y/o A2 y de dos controles negativos. Se
hibridaron membranas que contenían lisados de A549 con sueros de
paciente y control y posteriormente se incubaron con un anticuerpo
IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 anti-humano de ratón
conjugado con peroxidasa de rábano picante. Sólo los sueros de
paciente que mostraron reactividad basada en IgG contra A1 y/o A2
mostraron reactividad basada en IgG1 contra estos dos conjuntos
contiguos de proteínas (figura 4).
Se hibridaron membranas que contenían lisados de
A549 con sueros de pacientes con melanoma, cáncer de mama, cáncer
de hígado o cáncer de esófago. Ninguno de los sueros mostró
inmunorreactividad basada en IgG contra las proteínas A2 y A1 con
sueros de pacientes con cáncer de esófago (5/8) (figura 5), con
sueros de pacientes con cáncer de mama (1/11), pero estaban
ausentes en sueros de pacientes con melanoma (0/7) y cáncer de
hígado (0/11).
Para determinar la identidad de las proteínas A1
y A2, se prepararon membranas adicionales de lisados celulares de
adenocarcinoma de pulmón de A549 y se visualizaron las proteínas
mediante tinción con azul de Commassie. Se cortaron las manchas de
A1 y A2 de las membranas, se eluyeron y se sometieron a digestión
con tripsina. Se analizaron fragmentos peptídicos mediante
espectrometría de masas. Para secciones contiguas, se cortaron las
denominadas A1a, A1b (justo a la izquierda de A1a, es decir, más
ácida), A1c (justo a la izquierda de A1b, es decir, más ácida) y
A1d (justo a la izquierda de A1c, es decir, más ácida) de las
inmunotransferencias. Estas cuatro áreas comprendieron, en total,
toda la región A1 que era inmunorreactiva. Los análisis
espectrométricos de masas de los péptidos derivados de estas
secciones revelaron que las variantes de Anexina I y Anexina II
eran las isoformas de Anexina I predominantes presentes excepto la
sección A1a que no produjo ningún resultado. Para las proteínas A2,
se cortaron dos secciones contiguas, denominadas A2a y A2b (justo a
la izquierda de A1b, es decir más ácida) de las
inmunotransferencias. Los análisis espectrométricos de masa de los
péptidos derivados de estas secciones revelaron que la variante de
Anexina II (A2a) y la variante de Anexina II (A2b) eran las
isoformas de Anexina II predominantes presentes. Adicionalmente, las
manchas de A1 y A2 se cortaron de las membranas y se sometieron a
secuenciación N-terminal directa. Dado que las
anexinas estaban bloqueadas de forma N-terminal por
acetilación, no se obtuvieron resultados.
Para confirmar que las manchas de A1 y A2
consistían en una mezcla de Anexina I y Anexina II respectivamente,
se hibridaron membranas preparadas a partir de ambas líneas
celulares de adenocarcinoma de A549 con o bien un anticuerpo
monoclonal de ratón comercialmente disponible que reacciona con
Anexina I, o bien con el anticuerpo monoclonal frente a Anexina II
de ratón. Se compararon los patrones de inmunorreactividad obtenidos
tanto con las inmunotransferencias teñidas con azul Commassie del
mismo tipo de lisado celular como con los patrones de
inmunorreactividad observados con sueros de pacientes con cáncer de
pulmón. Los anticuerpos anti-Anexina I, y
anti-Anexina II inmunorreaccionaron con las
proteínas en las manchas de A1 y A2 visualizadas respectivamente
con sueros de pacientes con cáncer de pulmón (figura 6).
Sorprendentemente, se observaron diversas manchas inmunorreactivas
de bajo peso molecular adicionales resultado de la hibridación de
ambos anticuerpos monoclonales anti-Anexina I y II
utilizados. Estas manchas no han mostrado inmunorreactividad con
ningún suero de paciente sometido a ensayo.
Claims (5)
1. Método para diagnosticar el cáncer de pulmón
en un sujeto que comprende:
(i) poner en contacto una muestra de suero
derivada del sujeto con uno o más antígenos de proteína en
condiciones tales que pueda producirse una reacción de unión
antígeno-anticuerpo inmunoespecífica, en donde
dichos antígenos de proteína son los antígenos de proteína de
Anexina I y Anexina II; y
(ii) detectar la unión inmunoespecífica de los
autoanticuerpos frente a Anexina I o Anexina II en la muestra de
suero;
en el que un aumento en el nivel de
unión inmunoespecífica detectado en la etapa (ii) al compararlo con
una muestra de suero control es un indicador de cáncer de
pulmón.
2. Método para diagnosticar el cáncer de esófago
en un sujeto que comprende:
(i) poner en contacto una muestra de suero
derivada del sujeto con uno o más antígenos de proteína en
condiciones tales que pueda producirse una reacción de unión
antígeno-anticuerpo inmunoespecífica, en donde
dichos antígenos de proteína son los antígenos de Anexina I; y
(ii) detectar la unión inmunoespecífica de los
autoanticuerpos frente a Anexina I en la muestra de suero,
en el que un aumento en el nivel de
unión inmunoespecífica detectado en la etapa (ii) al compararlo con
una muestra de suero control es un indicador de cáncer de
esófago.
3. Método según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que los autoanticuerpos frente a Anexina I
o Anexina II se detectan usando un inmunoensayo.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
los autoanticuerpos frente a Anexina I y la Anexina II se detectan
usando un inmunoensayo que comprende:
(a) inmovilizar una o más proteínas anexinas en
un sustrato o membrana en donde dichas proteínas anexinas son la
Anexina I y la Anexina II;
(b) poner en contacto el sustrato o la membrana
con la muestra de suero del sujeto; y
(c) detectar la presencia de autoanticuerpos
frente a Anexina I y Anexina II unidos al sustrato.
5. Método según la reivindicación 3, en el que
la presencia de autoanticuerpos frente a Anexina I y Anexina II se
detecta usando un reactivo marcado que se une a los
autoanticuerpos.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US370337 | 1999-08-06 | ||
| US09/370,337 US6645465B2 (en) | 1999-08-06 | 1999-08-06 | Annexin proteins and autoantibodies as serum markers for cancer |
Publications (1)
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| ES2259609T3 true ES2259609T3 (es) | 2006-10-16 |
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