JP4745577B2 - アミノアシル化活性を有した触媒ＲＮＡｓ - Google Patents
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Description
【０００１】
本出願は、１９９９年１１月２４日提出の米国特許仮出願番号６０／１６７，３３１および２０００年６月２８日提出の米国特許仮出願番号６０／２１４，３８２（その開示が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般に、触媒ＲＮＡ分子の分野に関し、より詳細には、ｔＲＮＡ様分子のシスまたはトランスでのアミノアシル化能力を有する触媒ＲＮＡ分子に関するものである。
【０００３】
（背景技術）
非天然アミノ酸を含むタンパク質は、生物医学用および治療目的効果が期待されている。このようなアミノ酸は、特に、たんぱく質の構造および機能の探索、コンビナトリアルケミストリー用のペプチドライブラリーの構築、およびプロテオミクスに有用であり得る。しかし、このようなタンパク質の合成は、これまでのところ容易ではなかった。現在自然に起こることが公知の翻訳系では、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）によって遺伝子暗号化が行われている。これは２０の異なる形態で存在し、それぞれ１つのアミノ酸のその同族ｔＲＮＡイソ受容体へのエステル化を特異的に触媒し、それによりアミノ酸をその対応するアンチコドントリプレットに直接接触する。非同族アミノ酸のｔＲＮＡへの誤アシル化によりその細胞内活性に重要であり得る細胞タンパク質へのアミノ酸の誤組み込みが生じるので、ＡＲＳによるアミノアシル化反応の忠実度が非常に高くなければならない。この重要な課題を達成するために、ＡＲＳは同族アミノ酸およびｔＲＮＡを選択的に認識する非常に精巧な機構を使用する。ｔＲＮＡの認識決定要因は、アンチコドンループから受容体−Ｔｉ〜Ｃステムおよびリン酸−リボース骨格まで多種多様な範囲に及ぶ。これらの複雑さのために、非天然ｔＲＮＡおよびアミノ酸に対して所望の特異性を有するＡＲＳの操作は行われていなかった。結果として、核酸が注目されている。
【０００４】
長年、核酸は情報分子のみであると考えられていた。しかし、Ｃｅｃｈおよび共働者（Ｃｅｃｈ、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３６、１５３２〜１５３９；ＭｃＣｏｒｋｌｅら、１９８７、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４、２２１〜２２６）の先駆的研究により、触媒として作用することができる天然に存在するＲＮＡ（リボザイム）の存在が示された。しかし、これらの天然のＲＮＡ触媒が切断およびスプライシングのためのリボ核酸基質に対して作用することのみが示されているにもかかわらず、最近のリボザイムの人工的な進化の発展により種々の化学反応に対する触媒のレパートリーが広がっている。例えば、ＲＮＡは、ＤＮＡのリン酸ジエステル切断（Ｂｅａｕｄｒｙら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７、６３５）、アミノアシルエステルの加水分解（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、１４２０〜１４２４）、自己分解（Ｐａｎら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、３８８７）、３’ＯＨを有するオリゴヌクレオチドと触媒の５’三リン酸塩末端とのライゲーション（Ｂａｒｔｅｌら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１、１４１１〜１４１８）、ビフェニルイソメラーゼ活性（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４、１９２４〜１９２７）、およびポリヌクレオチドキナーゼ活性（Ｌｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７１、３１〜３６）を触媒することが報告されている。
【０００５】
新規の触媒を同定するために、Ｂｒｅｎｎｅｎら（１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、５３８１〜５３８３）は高分子の異種遺伝子プールを構築し、所望の反応を触媒する分子を単離するためにインビトロ選択処理過程を使用した。このアプローチの変形形態がＧｏｌｄ．ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，４７５，０９６号）によって使用されている。指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）として公知のこの方法により、種々の標的分子との特異的非共有結合相互作用を形成する能力を有する核酸を同定する。関連特許（米国特許第５，９９０，１４２号）は、ＳＥＬＥＸ法に基づいているが、標的との共有結合の形成を触媒することができる改変および非改変ＲＮＡ分子を潜在的に同定することができる。最近、ホスホジエステラーゼ、アミダーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子を同定することができる類似のアプローチが使用された（Ｊｏｙｃｅに付与された米国特許第６，０６３，５６６号）。
【０００６】
さらに、アミノアシル−ＲＮＡ結合の触媒がその（２’）３’末端において可能であるＲＮＡ分子（Ｉｌｌａｎｇａｋｅｋａｒｅら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７、６４３〜６４７）もしくは、ＲＮＡ分子があるＲＮＡ分子から別のＲＮＡ分子にアミノ酸を転移することができる（Ｌｏｈｓｅら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８１、４４２〜４４４）ことが研究により同定されている。
【０００７】
しかし、現在のタンパク質翻訳処理過程において生理学的に有意なＲＮＡ分子をアミノアシル化することができる触媒ｔＲＮＡ様分子はこれまでのところ証明されていない。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、シスアミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡを提供する。この触媒ＲＮＡは、ｔＲＮＡ様ドメインおよびリボザイムドメインを含む。リボザイムドメインは触媒活性を有するが、アミノアシル化のためのアミノ酸特異性も付与する。したがって、この触媒ＲＮＡは、特定のアミノ酸を有する３’末端を選択的にアミノアシル化する能力を有する（以後、シスアミノアシル化ＲＮＡ分子と呼ぶ）。これらの触媒ＲＮＡを使用して、天然にアミノアシル化されないｔＲＮＡ様配列をアミノアシル化することができる。
【０００９】
本発明はまた、ｔＲＮＡ様分子をトランスでアミノアシル化できる触媒ＲＮＡ分子を提供する（以後、トランスアミノアシル化ＲＮＡ分子と呼ぶ）。トランスアミノアシル化ＲＮＡは、シスアミノアシル化ＲＮＡのリボザイムドメインに対応する。これらの触媒ＲＮＡ分子を使用して所望の天然または非天然アミノ酸を有するｔＲＮＡ様分子をトランスでアミノアシル化することができる。
【００１０】
本発明はまた、自己アミノアシル化ＲＮＡ分子の構築法を提供する。この方法は、配列をｔＲＮＡ様分子の５’末端に結合させる工程を包含し、この配列はリボザイム配列を含む。この方法を使用して、その３’末端のアミノアシル化を触媒することができる触媒ＲＮＡを作成することができる。これらの触媒分子をＲＮアーゼＰで切断して、ｔＲＮＡ様分子をトランスでアミノアシル化する能力を有する異なる種の触媒ＲＮＡ分子を生成することができる。
【００１１】
本発明はまた、アミノアシル化活性を有するＲＮＡ配列の同定法を提供する。この方法は、ｔＲＮＡ様ドメインおよびリボザイムドメインを有するＲＮＡ配列のプールを提供する工程と、前記プールのＲＮＡ配列と所望の天然または非天然アミノ酸とを接触させる工程と、非アミノアシル化分子からアミノアシル化ＲＮＡ分子を分離する工程と、前記アミノアシル化ＲＮＡ分子を増幅して配列決定する工程とを包含する。
【００１２】
本発明はまた、本明細書中に記載の自己アミノアシル化触媒分子のアミノアシル化法を提供する。この方法は、自己アミノアシル化触媒活性を有するＲＮＡ分子を提供する工程と、ＲＮＡ分子と所望の天然または非天然アミノ酸とを接触させる工程と、アミノアシル化ＲＮＡ分子を単離する工程とを包含する。
【００１３】
本発明はまた、ｔＲＮＡ様分子のアミノアシル化法を提供する。この方法は、トランスアミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子を提供する工程と、ＲＮＡ分子とｔＲＮＡ様分子および所望のアミノ酸とを接触させる工程と、アミノアシル化ＲＮＡ分子を単離する工程とを包含する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
明細書および特許請求の範囲の目的のため、本明細書中に記載の語「ｔＲＮＡ様分子」または「ｔＲＮＡ様ドメイン」または「ｔＲＮＡ様配列」は、ｔＲＮＡに典型的に関連するクローバー型構造の形成に一致する配列を有するＲＮＡ分子を意味する。ｔＲＮＡ様分子の具体例は、ｏｔＲＮＡ（配列番号１８）である。他のｔＲＮＡ様分子は、配列番号５〜１５のｔＲＮＡドメイン（すなわち、配列番号５のヌクレオチド８６〜１４６、配列番号６のヌクレオチド９０〜１５１、配列番号７のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号８のヌクレオチド８９〜１５０、配列番号９のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号１０のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１１のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１２のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１３のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１４のヌクレオチド９０〜１５０、および配列番号１５のヌクレオチド８９〜１４８）である。さらに他のｔＲＮＡ様分子は、配列番号２０〜２２である。
【００１５】
明細書および特許請求の範囲のために本明細書中で使用される語「リボザイム」は、化学反応を触媒することができるＲＮＡ分子を意味する。
【００１６】
語「天然のアミノ酸」は、生細胞中でｔＲＮＡを正常にアミノアシル化する２０アミノ酸のうちの任意のアミノ酸をいう。このようなアミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸である。したがって、語「非天然のアミノ酸」は、天然のアミノ酸または天然のアミノ酸の改変以外の任意のアミノ酸を意味する。
【００１７】
用語「シス」は、同一分子内を意味する。用語「トランス」は、異なる分子上またはそれに対することを意味する。
【００１８】
用語「５’リーダードメイン」または「触媒ドメイン」または「５’リーダーリボザイム」は、シスアミノアシル化活性を有する触媒分子の５’領域を意味する。このような５’リーダードメインの例は、配列番号５のヌクレオチド１〜８５、配列番号６のヌクレオチド１〜８９、配列番号７のヌクレオチド１〜８９、配列番号８のヌクレオチド１〜８８、配列番号９のヌクレオチド８９、配列番号１０のヌクレオチド１〜８８、配列番号１１のヌクレオチド１〜８８、配列番号１２のヌクレオチド１〜８８、配列番号１３のヌクレオチド１〜８８、配列番号１４のヌクレオチド１〜８９、および配列番号１５のヌクレオチド１〜８８である。
【００１９】
本発明は、アミノアシル化反応を触媒することができる触媒ＲＮＡ分子に関する。自己アミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子は２つのドメイン、触媒ドメインおよびアミノアシル受容体ドメインを有する。触媒ドメインは、リボザイム活性を有する配列を含む。このドメインはまた、アミノ酸特性を付与する。
【００２０】
自己アミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子を構築するために、無作為に合成されたＲＮＡプールを選択する。このプールのＲＮＡ分子をｔＲＮＡ様分子の５’末端へ付着させ、複合体を基質分子（天然または非天然アミノ酸）を接触させることにより、自己アミノアシル化ＲＮＡ分子を同定する。次いで、これらの分子を選択的に増幅することができる。これらの分子の自己アミノアシル化の性質を、移動度ゲルシフトアッセイなどの標準的なアッセイによって確認することができる。活性アミノアシル化ＲＮＡ種の単離を容易にするために、ビオチンタグを標的分子に付着させることができる。あるいは、水溶性形態のビオチンを使用してアミノアシル化ＲＮＡを標識し、アミノアシル化ＲＮＡ種を作成することができる。これらのビオチン標識種を、ストレプトアビジン被覆アガロースを使用して単離することができる。選択的増幅ラウンドの反復により、自己アミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡの純粋な種が得られる。選択ラウンドは、ｃＤＮＡを作成するために反応のＳＡｖ結合部分から回収された逆転写ＲＮＡを一部含む。ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、次いでＰＣＲ産物を転写して、次の選択ラウンドで使用されるＲＮＡを作成する。最終選択ラウンドから得たＲＮＡを移動度ゲルシフトアッセイに供して自己アミノアシル化およびトランスアミノアシル化活性を証明する。
【００２１】
本発明の触媒分子はまた、ＲＮＡ種をトランスでアミノアシル化することができる。このような触媒分子を作成するために、アミノアシル受容体ドメイン（ｔＲＮＡ様ドメイン）を細菌ＲＮアーゼＰ消化によって触媒ドメインから切断することができる。触媒ドメインは、アミノアシル受容体ドメインまたはｔＲＮＡ様分子をトランスでアミノアシル化することができる。また、当業者に周知の方法によって、対応するＤＮＡテンプレートから適切なＲＮＡポリメラーゼで触媒化したインビトロ流出転写により触媒分子を合成することもできる。
【００２２】
アミノアシル受容体ドメインは、ｔＲＮＡ様分子である。ｔＲＮＡ様分子の適切な例は、人工オーソゴナルサプレッサーｔＲＮＡ（ｏｔＲＮＡ、図ＩＢを参照のこと）である。あるいは、異なる種（ヒトなど）に由来するか単離されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡをこの目的で使用することができる。このｔＲＮＡ配列は、アンバーサプレッサーｔＲＮＡGln2に由来するが、細菌ＡＲＳによって認識されない。ｏｔＲＮＡを、アミノアシル化活性およびアミノ酸特異性を付与する固有の触媒ドメインに結合させることができる。
【００２３】
一旦アミノアシル化活性を有することが公知の配列が単離されると、この配列をさらなるアミノアシル化配列の単離に対する足場ベースのアプローチに使用することができる。各塩基が非野生型となる一定の割合を有するように、ＤＮＡ形態のｐｒｅ−２４phe 配列領域（５’プライマー配列を除く）を無作為に変異誘発させる。次いで、このＤＮＡプールをｏｔＲＮＡのアンチセンスＤＮＡにアニーリングし、アニーリングプールを全長二重鎖ＤＮＡに伸長する。ＰＣＲによって新規のテンプレートのコピーを作成し、これを転写して先に記載した選択に供する。
【００２４】
ｐｒｅ−２４phe の触媒足場を利用して、ほとんどの配列がｐｒｅ−２４phe の二次またはさらに三次構造を維持することができる集中した配列空間のスクリーニングが可能である。この狭い焦点にかかわらず、足場プールは基質のアミノ酸成分であるように選択したアミノ酸に依存するアミノ酸特異性の望ましい変化に十分な無作為変異を有する。したがって、活性配列に出会う可能性は、完全に無作為なプールを使用した選択よりも高くなり得る。少数のヌクレオチドが無作為化されるので、足場プールのために非常に複雑なプールを扱う必要はない（変異速度に依存し、その複雑さは２から３桁低い）。したがって、選択はあまり骨が折れず、より迅速に結果を得ることができる。
【００２５】
これらおよび他の実施形態は、下記の実施形態からより明白になるが、これは例示であり限定と解釈すべきでない。
【００２６】
（実施例１）
この実施形態は、アミノアシル化活性のスクリーニング用のＲＮＡ分子のプールの構築を記載する。この実施形態の例示では、無作為化配列を作成し、ｔＲＮＡ様分子に結合した。したがって、７０ヌクレオチドのランダムプールを、以下のｔＲＮＡ様分子（ｏｔＲＮＡ）の５’末端に結合した。
【００２７】
プール構築：４つの合成オリゴヌクレオチドを、プール構築に使用した：ランダムプールＤＮＡテンプレート（５’−ＧＧＡＴＣＧＴＣＡＧＴＧＣＡＴＴＧＡＧＡ−Ｎ７０−ＧＧＴＧＧＴＡＴＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＡ−３’）（配列番号１）、オーソゴナルｔＲＮＡに相補的なＤＮＡテンプレート（ｏｔＲＮＡ）（配列番号２）、Ｔ７プロモーター配列を含む５’プライマー（配列番号３）、および３’プライマー（配列番号４）。熱サイクル条件下（９５℃で１０分、５５℃で１０分、および７２℃で１０分）で、ＤＮＡテンプレートの大規模Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ伸長を行った。次いで、全長産物を５’および３’プライマーの存在下での７サイクルの大規模ＰＣＲによって増幅した。約１０15の複雑度のプールＤＮＡの４つの等価物をａ−［32Ｐ］−ＵＴＰの存在下でのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製した。
【００２８】
（実施例２）
この実施形態は、実施例１で構築したＲＮＡ分子由来の活性配列の選択を記載する。例として、以下の基質を使用してＲＮＡのアミノ鎖アクリル化種を選択した。
【００２９】
（基質）
ＣＭＥ基は活性化と加水分解安定性との釣り合いが取れているので、Ｎ−ビオチニル−Ｌ−アミノアシル−シアノメチルエステル（Ｂｉｏｔｉｎ−ａａ−ＣＭＥ）をアミノアシルドナー基質として選択した。さらに、ＣＭＥは水素結合官能基を有していないので、基質のアミノ酸側鎖によるＲＮＡとの一次相互作用の確認の助けとなる。
【００３０】
他の基質には、フェニルアラニルアデニレート（Ｐｈｅ−ＡＭＰ）およびフェニルアラニルチオエステル（Ｐｈｅ−ＴＥ）を含んでいた。また、これらの基質を、上記の理由のためおよび他の基質成分よりもむしろアミノ酸への特異性を示すために選択した。ビオチンタグにより、固定ストレプトアビジン（ＳＡｖ）アガロース上のビオチン部分とＳＡｖとの間の相互作用を介した活性（すなわち、アミノアシル化）配列の単離を容易にする。Ｎ−ビオチニル−Ｌ−フェニルアラニル−シアノメチルエステル（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｐｈｅ−ＣＭＥ）およびＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＣＭＥ（Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）を以前に記載の方法によって本質的に合成した（Ｓｕｇａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０、１１５１〜１１５６、１９９８）。Ｐｈｅ−ＣＭＥの合成を以下のように行った：９：１ ＴＦＡ／アニソール溶液（５００ｍＬ）をアルゴン雰囲気下でＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＣＭＥ（３８５ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、約４Ｍの塩酸のジオキサン溶液（４ｍＬ）を残渣に添加した。溶液を真空濃縮し、残渣への無水エーテルの添加によって沈殿を得た。沈殿を最少量のＭｅＯＨに溶解し、この溶液（無水エーテル）を添加して生成物を再沈殿させた。生成物の純度を、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して測定した。
【００３１】
以前に記載のように（Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２５３、６０８〜６１１、１９５８）フェニルアラニルアデニレート（Ｐｈｅ−ＡＭＰ）の合成を行った。生成物の32Ｐ ＮＭＲ分析により、Ｐｈｅ−ＡＭＰの純度は約５０％であり、残りの副産物は未反応のＡＭＰであることが示された。生成物を水中に溶解し、さらに精製することなくアミノアシル化に使用した。
【００３２】
フェニルアラニルチオエステル（Ｐｈｅ−ＴＥ）の合成を以下に示す：Ｎ，Ｎ−ビス［２−オキソ−３−オキソゾリジイルホスホロジアミンクロリド］（２３８ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（３０７ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１７５ｍＬ、２．２６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に添加した。この混合物に、エチル２−メルカプトアセテート（１００ｍＬ、０．９１ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応混合物を室温で５時間激しく撹拌した。２０％ＮａＨＣＯ3 水溶液の添加によって反応を停止させた。標準的な水溶液の操作後、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＴＥをカラムクロマトグラフィーで単離した。９：１ ＴＦＡ／アニソール溶液（５００ｍＬ）をアルゴン雰囲気下でＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＴＥ（２００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、約４Ｍ塩酸のジオキサン溶液（４ｍＬ）を添加して、塩酸塩を形成した。溶液を真空濃縮し、残渣をエーテルに溶解した。この溶液に石油エーテルを添加することにより沈殿物が形成され、これをエーテルでリンスし、濾過してＰｈｅ−ＴＥを得た。
【００３３】
（活性配列の選択）
以下の条件で選択反応を行った：１０μＭ（第１ラウンドのみ）または１μＭＲＮＡプール、１ｍＭビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥのＥＫ緩衝液（５０ｍＭ ＥＰＰＳ、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５）、１００ＭＭ ＭｇＣｌ2 、およびエタノール（全体積の２５％）の混合物。プールＲＮＡをＥＫ緩衝液中でプレインキュベートし、９５℃で５分間加熱し、２５℃で５分間冷却した。次いで、ＭｇＣｌ2 を添加後、５分間平衡化した。基質のエタノール溶液の添加によって反応を開始し、２５℃で３時間インキュベートした（１５〜１７ラウンドは３０分間）。２体積の冷エタノールの添加によって反応を停止させ、ＲＮＡを２回エタノール沈殿した。ＲＮＡペレットをＥＫＥ緩衝液（５０ｍＭ ＥＰＰＳ、５００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解し、２００μＬ（第１ラウンドは１ｍＬ）のストレプトアビジンアガロースと室温で３０分間インキュベートした。未結合のＲＮＡを２０樹脂体積のＥＫＥ緩衝液、４０樹脂体積の４Ｍ尿素、その後１０樹脂体積の水で溶出した。樹脂結合ＲＮＡを１０ｍＭビオチン（ｐＨ７）の存在下での９５℃で１０分間の加熱によって溶出した。回収したＲＮＡを１μＭ ３’プライマー（配列番号４）、１２５μＭ ｄＮＴＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ＭＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ８．３）の存在下、４２℃で１時間（１〜１４ラウンド）または１０分間（１５〜１７ラウンド）１００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｇａ（商標））を使用して逆転写した。ｃＤＮＡをＰＣＲに供し、その後標準的な条件下で転写した。
【００３４】
プール中の自己アミノアシル化ＲＮＡ分子の１５ラウンドの選択的増幅により、ＳＡｖ依存性移動度ゲルシフトアッセイ（図２、レーン１〜３）で確認したところ、活性配列が富化した。ラウンド１５由来の全投入ＲＮＡ分子の約１０％で３時間後にアミノアシル化が認められた（レーン３）。より短いインキュベーション時間での２ラウンドの選択を使用して、プール中の活性をさらに増加させた（レーン４〜６）。ＳＡｖまたは基質の欠損により遅延するバンドが消失することから、これはビオチン−Ｐｈｅ基を有する活性ＲＮＡの自己アシル化が起こっていることが示される。３’末端ジオールの過ヨウ素酸酸化または３’アデノシンの欠失により、アミノアシル化がほぼ完全に阻害され（レーン９、１０）、これは、３’末端ヒドロキシル基がアミノアシル化部位であることが強く示唆される。
【００３５】
ラウンド１７のプール由来の３６個の各クローンを自己アミノアシル化（実施例Ｂに記載の自己アミノアシル化アッセイ）についてスクリーニングし、１１個のクローン（配列番号５〜１５）が明らかな活性を示した。これらの配列のアラインメントにより、５’リーダードメイン中約９５％が同一であることが明らかとなった（図３の上）。ｐｒｅ−２４またはｒｔＲＮＡ（配列番号９）と呼ばれるクローンの代表を自己アミノアシル化活性の確認のために選択した。
【００３６】
（実施例３）
ビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥの存在下でのｐｒｅ−２４の自己アミノアシル化活性を、１２．５ｍＭ ＫＣｌおよび５％エタノールを使用する以外は選択に使用したものと類似の条件下でアッセイした。各測定点で、反応アリコートを２回エタノール沈殿させ、ペレットを７μＬのＭＥＵＳ緩衝液（２５ｍＭ ＭＯＰＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、８Ｍ尿素、１０μＭストレプトアビジン、ｐＨ６．５）に溶解した。１μＭ ＲＮＡおよび１ｍＭビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥ（図４、レーン１、２、４、および５）または１ｍＭビオチン−ａａ−ＣＭＥ（レーン６〜１０）の存在下または基質の非存在下で反応を行った（レーン３）。過ヨウ素酸酸化のため（レーン４）に、ｐｒｅ−２４を１０ｍＭ ＮａＯＨで０℃で１時間処理し、アミノアシル化反応前にエタノール沈殿した。反応物を３０分間（レーン１〜４）または２時間（レーン５〜１０）インキュベートした。得られた溶液を、ゲルの温度を２０℃未満に維持するために低温室で１０％ＰＡＧＥによって分析した。基質濃度に対する初期速度のプロットにより、ｋcat ＝０．１０＋０．０１／ｍｉｎ-1およびＫｍ＝６．３±１．２ｍＭの速度パラメータのミカエリス−メンテン挙動が明らかとなる一方で、基質の溶解限度により５ｍＭ未満までに実際の作用濃度が制限される。バックグラウンド速度を、上記と同一の反応緩衝液中で１ｍＭビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥとｏｔＲＮＡを３時間インキュベーションすることによって測定し、０．０１％のアミノアシル−ｏｔＲＮＡが得られた（レーン１１）。したがって、バックグラウンド速度は、約５．５×１０-7／ｍｉｎ-1と評価される。認められたリボザイムの加速は、バックグラウンドよりも約１０5 倍高い。
【００３７】
自己アミノアシル化活性を、ＳＡｖ依存性移動度ゲルシフトアッセイによって確認された（図４Ａ、レーン１〜３）。過ヨウ素酸酸化により活性が完全に消失し、これにより、アミノアシル化部位が３’末端であることが強く示唆される（レーン４）。炭酸カリウムでのアミノアシル−ｐｒｅ−２４の穏やかな塩基の加水分解により、遅延するバンドが消失した（すなわち、ｐｒｅ−２４からビオチン−Ｐｈｅが加水分解された）。アミノアシル基質に再暴露した場合、この脱アシル化ｐｒｅ−２４は依然として自己アミノアシル化活性を示した（図６を参照のこと）。これにより、３’または２’エステル結合はアミノアシル−ｐｒｅ−２４の唯一可能性のある結合であることが示唆される。
【００３８】
触媒ＲＮＡのアミノ酸特異性を、５つの異なるビオチン−アミノアシル−ＣＭＥを使用して調査した（図４、レーン６〜１０）。Ｐｈｅ−ＣＭＥ、Ｐｈｅ−ＡＭＰ、およびＰｈｅ−ＴＥの基質について、アミノアシル−ＲＮＡペレットを酸性ＥＰＰＳ緩衝液（０．３Ｍ、ｐＨ５．５）に再懸濁する以外は上記と同一の手順を使用して自己アミノアシル化反応を行った。次いで、０．３Ｍ ＥＰＰＳ−ＫＯＨをこの溶液に添加してｐＨ８．０とした。これらのアミノ酸の反応速度はフェニルアラニンと比較すると劇的に減少し、これは、リボザイムドメインがビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥに対して顕著な特異性を有することを示す。
【００３９】
基質中の主な認識エレメントをさらに明らかにするために、３つの合成フェニルアラニンエステル（図１Ｃ）を活性について試験した（図４Ｂ）（１６）。０．５μＭ ｐｒｅ２４触媒ＲＮＡおよび５ｍＭ Ｐｈｅ−ＣＭＥ（レーン１）、５ｍＭ Ｐｈｅ−ＡＭＰ（レーン２）、または１０ｍＭ Ｐｈｅ−ＴＥ（レーン３）の存在下、２５℃（レーン１及び３）または０℃（レーン２）で３０分間反応を行った。ビオチン化（レーン４）またはＰｈｅ−ＣＭＥの基質（レーン５）の非存在により遅延バンドが消失し、これは、アミノアシル化は遅延バンドに必要であることを示す。バックグラウンドアミノアシル化を、５ｍＭ Ｐｈｅ−ＣＭＥの存在下でｏｔＲＮＡを使用してモニターした（レーン６）。Ｐｈｅ−ＡＭＰおよびＰｈｅ−ＴＥについて同一対照実験も行った（図７を参照のこと）。ａ−アミノ基からのビオチンの省略（すなわち、Ｐｈｅ−ＣＭＥ）により、Ｐｈｅ−ＣＭＥ濃度が５倍に増加した場合にビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥ（図４Ｂ、レーン１）で認められたものとほとんど同一の触媒速度が得られた。これは、ビオチニル基（おそらく、ａ−アミノ基に対するアミド官能基）はリボザイムと相互作用するが、必須の基質認識エレメントではないことを例示している。リボザイムはまた、ＣＭＥ遊離基の代わりにアデニレート（Ｐｈｅ−ＡＭＰ）およびチオエステル（Ｐｈｅ−ＴＥ）に適応した（レーン２および３）。これは、基質の重要な認識エレメントはフェニルアラニル側鎖であり、遊離基ではないことを示していた。
【００４０】
（実施例４）
この実施形態は、触媒ＲＮＡ分子の調製およびトランスアミノアセチル化活性を示す。実施例１および２由来のｐｒｅ−２４触媒ＲＮＡを本実施例で使用した。最初に、ｐｒｅ−２４ｏｔＲＮＡをＲＮアーゼＰ切断（図５Ａ）に供し、３’ｔＲＮＡドメインから５’触媒ドメインを遊離させた。［32Ｐ］−ボディ標識ｐｒｅ−２４otRNA をＲＮアーゼＰ ＲＮＡで２時間処理して約２３％のｐｒｅ−２４otRNA を切断した（レーン１）。ＲＮアーゼＰが存在しないと切断生成物は得られなかった（レーン２）。マーカーＲＮＡ（レーン３の５’リーダーセグメント及びレーン４のｏｔＲＮＡ）を、対応するＤＮＡセグメントを使用したインビトロ転写によって調製した。以前に記載のようにｐＤＷ２７プラスミドのＭ１遺伝子由来のＰＣＲ増幅ＤＮＡテンプレートを使用して大腸菌ＲＮアーゼＰ ＲＮＡをインビトロで転写し（Ｚｉｅｈｌｅｒら、１９９６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０、６２２〜６２４）、６％ＰＡＧＥで精製した。３７℃の１Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および０．１％ＳＤＳ中でＲＮアーゼＰ ＲＮＡ（１μＭ）によるｐｒｅ−２４otRNA （１μＭ）の切断を行った。反応後、溶液を２回エタノール沈殿し、得られた溶液を１０％ＰＡＧＥで分析した。
【００４１】
大腸菌ＲＮアーゼＰ ＲＮＡでのｐｒｅ−２４otRNA の処理により、５’リーダーセグメントおよびｏｔＲＮＡに対応する長さの２つのフラグメントが作成された（図５Ａ、レーン３および４の各フラグメントのインビトロ転写と比較したレーン１および２）。これは、ｐｒｅ−２４otRNA がＲＮアーゼＰ ＲＮＡ加水分解に影響されやすいことを示す。従って、触媒活性ｐｒｅ−ｔＲＮＡをｔＲＮＡ様分子および５’リーダーセグメントに断片化することができる。
【００４２】
次に、５’リーダーフラグメントがｏｔＲＮＡフラグメントをトランスでアミノアシル化することができるかどうかを試験した（図１Ａ右）。トランスアミノアシル化活性の分析のために（図５Ｂ）、非標識ｐｒｅ−２４otRNA を切断し、ｏｔＲＮＡおよび５’リーダードメインの各セグメントを１０％ＰＡＧＥで精製した。ｔＲＮＡセグメントをウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、［32Ｐ］−ａ−ＡＴＰの存在下でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化した。ｐｒｅ−２４otRNA に対するＲＮアーゼＰ ＲＮＡ作用によって作成した５’リーダーおよびｏｔＲＮＡフラグメントを、ビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥで処理した（図５Ｂ）。５’リーダーフラグメントは、ｐｒｅ−２４otRNA のシス反応と類似の速度でｏｔＲＮＡをトランスアミノアシル化した。インビトロ転写５’リーダーフラグメントはまた、上記と類似のトランス活性を示した。したがって、ＲＮアーゼＰ ＲＮＡ消化５’リーダーフラグメントを、その機能的構造に独立して折りたたんで、トランス活性化アミノアシル化酵素として作用することができる。
【００４３】
ｏｔＲＮＡの受容体Ｔステム−ループ領域からなるミニヘリックスＲＮＡ（図５Ｃ）の基質特性も試験した。５’リーダーリボザイムおよびミニヘリックスＲＮＡをインビトロ転写し、その後ＰＡＧＥで精製した。反応前に、各ＲＮＡ（４μＭの５’リーダーリボザイムおよび３μＭのミニヘリックスＲＮＡ）を、それぞれ折りたたんだ。残りの手順は、方法の節に記載のものと同一であった。ミニヘリックスＲＮＡは依然として５’リーダーリボザイムによってアミノアシル化されることから、アンチコドンループは活性に必須ではないことが示される。しかし、ｏｔＲＮＡと比較して認められた速度の約４倍が減少していることにより、５’リーダーリボザイムが全長ｏｔＲＮＡ中に存在するさらなるエレメントと相互作用することが示唆される。
【００４４】
さらに、５’リーダーフラグメントは、ｐｒｅ−２４otRNA のシス反応と同様の速度でｏｔＲＮＡをアミノアシル化した。インビトロ転写５’リーダーフラグメントはまた、上記と類似のトランス活性を示した。さらに、このフラグメントは、それぞれのシス反応に類似の速度でｒｔＲＮＡおよびその変異型に対する活性を示した（図８）。
【００４５】
結論として、本発明は、その３’末端のアミノアシル化を触媒する能力を有する改変ｔＲＮＡを提供する。５’リーダー配列は、独立して３’ｔＲＮＡドメインに存在し、その触媒特性を依然として保持することができる。
【００４６】
（実施例５）
１５％変異誘発足場プールを使用したＬｅｕ特異性リボザイムの選択に足場ストラテジーを使用した。１５％変異誘発足場ＲＮＡプールを以下のように合成した：ｔＲＮＡの５’プライマー領域および５’重複領域以外のリボザイムの各ヌクレオチドの位置を、自動化ＤＮＡ合成機の使用によって対応するＤＮＡテンプレートを変異誘発する。合成前に、各ホスホラミダイトを他の３つの塩基と８５：５：５：５の反応比で混合した。リボザイム配列にしたがってＤＮＡテンプレートを合成した。標準的な方法としてオリゴヌクレチドの脱保護および精製を使用した。２００μＬスケールでＰＣＲを行う以外は実施例１と同一の方法によってＤＮＡを増幅した。このＤＮＡテンプレートのインビトロ転写およびその後のＰＡＧＥによる精製によって、足場ＲＮＡプールが１５％変異誘発された。５ラウンドのみの選択後にプール中に活性配列が認められた（一方、完全に無作為のプール由来のｐｒｅ−２４Phe の選択には１５ラウンドを必要とする）。なお、オーソゴナルｔＲＮＡ（ｏｔＲＮＡ）に対して認められた活性は、本来のｐｒｅ−２４Phe のものよりも高く、このストラテジーは特異性を切り換えるだけでなく、ｏｔＲＮＡに対する活性を最適にする。
【００４７】
このアプローチの使用によって、ロイシン特異性シスアミノアシル化ＲＮＡが得られた。２つの具体例は、配列番号１７と配列番号１８として示される。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態を本明細書中に記載および例示したが、本発明はこのような好ましい実施形態に制限されない。本発明の精神を逸脱することなく、種々の変更形態を得ることができることが当業者に認識される。
【００４９】
【配列表フリーテキスト】
<210> １
<213> 人工配列
<223> ７０ヌクレオチドのランダムプールを含む合成オリゴヌクレオチド
<210> ２
<213> 人工配列
<223> ｏｔＲＮＡGln に対して相補的な完全に合成されたプライマー
<210> ３
<213> 人工配列
<223> Ｔ７プロモーター配列を含む５’プライマー
<210> ４
<213> 人工配列
<223> ３’完全に合成されたプライマー
<210> ５
<213> 人工配列
<223> プレ‐１２触媒ＲＮＡ
<210> ６
<213> 人工配列
<223> プレ‐３８触媒ＲＮＡ
<210> ７
<213> 人工配列
<223> プレ‐２９触媒ＲＮＡ
<210> ８
<213> 人工配列
<223> プレ‐３６触媒ＲＮＡ
<210> ９
<213> 人工配列
<223> プレ‐２４触媒ＲＮＡ
<210> １０
<213> 人工配列
<223> プレ‐２５触媒ＲＮＡ
<210> １１
<213> 人工配列
<223> プレ‐２２触媒ＲＮＡ
<210> １２
<213> 人工配列
<223> プレ‐５触媒ＲＮＡ
<210> １３
<213> 人工配列
<223> プレ‐１９触媒ＲＮＡ
<210> １４
<213> 人工配列
<223> プレ‐８触媒ＲＮＡ
<210> １５
<213> 人工配列
<223> プレ‐２３触媒ＲＮＡ
<210> １６
<213> 大腸菌
<223> ｏｔＲＮＡ
<210> １７
<213> 人工配列
<223> Ｈ２ Ｌｅｕ 触媒ＲＮＡ
<210> １８
<213> 人工配列
<223> Ｄ１‐Ｌｅｕ 触媒ＲＮＡ
<210> １９
<213> 人工配列
<223> ミニヘリックスを形成するＲＮＡ
<210> ２０
<213> 人工配列
<223> ｏｔＲＮＡのＶ１突然変異体
<210> ２１
<213> 人工配列
<223> ｏｔＲＮＡのＶ２突然変異体
<210> ２２
<213> 人工配列
<223> ｏｔＲＮＡのＶ３突然変異体
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】自己アミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ（左）およびトランスアミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ（右）を示す略図である。アミノ酸基質（アミノ酸側鎖および遊離基をそれぞれａａおよびＸで示す）は、５’リーダーリボザイムドメインに結合し、ｔＲＮＡ３’−ヒドロキシルの求核攻撃（曲がった矢印で示す）を促進する。ＲＮアーゼＰ ＲＮＡの切断部位をまっすぐな矢印で示す。
【図１Ｂ】ｏｔＲＮＡの二次構造を示す図である。
【図１Ｃ】基質シアノメチルエステル（ＣＭＥ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）（アデニレート）、およびチオエステル（ＴＥ）のそれぞれの化学構造を示す図である。
【図２】選択サイクル機能としての自己アミノアシル化活性を示すオートラジオグラムを示す図である。ａ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ＲＮＡ、ｂ．ＲＮＡプール。
【図３】ラウンド１７のＲＮＡから単離した活性クローンの配列アラインメントを示す図である。ｔＲＮＡドメインのアラインメントのために、野生型ｏｔＲＮＡを、選択したｒｔＲＮＡ配列と共に示す。ｔＲＮＡドメインに認められるコンセンサス欠失および変異をボックスで強調している。ｔＲＮＡループの略称を以下に示す：ＡＣ、アンチコドン；Ｖ、可変；Ｔ、ＴＣ。
【図４】図４Ａは、ｐｒｅ−２４の自己アミノアシル化活性およびアミノ酸特異性を示す図である。ａ．ＳＡｖと複合化したビオチン−アミノアシル−ｐｒｅ−２４；ｂ．ｐｒｅ−２４；ｃ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ｏｔＲＮＡ；ｄ．ｏｔＲＮＡ。
図４Ｂは、３つの異なるエステルを使用したｐｒｅ−２４の自己アミノアシル化活性の比較を示す図である。ａ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ｐｒｅ−２４；ｂ．ｐｒｅ−２４；ｃ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ｏｔＲＮＡ；ｄ．ｏｔＲＮＡ。０．５μＭ ｐｒｅ２４および５ｍＭ Ｐｈｅ−ＣＭＥ（レーン１）、５ｍＭ Ｐｈｅ−ＡＭＰ（レーン２）、または１０ｍＭＰｈｅ−ＴＥ（レーン３）の存在下、２５℃（レーン１および３）または０℃（レーン２）で３０分間反応を行った。
図４Ｃは、ｐｒｅ−２４およびｔＲＮＡドメインに異なる程度の変異および欠失を有するその変異体の自己アミノアシル化活性の比較を示す図である。野生型ｐｒｅ−２４（レーン１）およびｐｒｅ−２４otRNA （レーン５）は、それぞれｔＲＮＡドメインのｒｔＲＮＡおよびｏｔＲＮＡを含む。
【図５】図５Ａは、５’リーダーリボザイムのトランスアミノアシル化活性を示す図である。ＲＮアーゼＰ ＲＮＡによるｐｒｅ−２４ ｏｔＲＮＡの切断。ａ．ｐｒｅ−２４ ｏｔＲＮＡ；ｂ．５’リーダーセグメント；ｃ．ｏｔＲＮＡ。
図５Ｂは、ｏｔＲＮＡの５’リーダーリボザイム触媒アミノアシル化の経過時間を示すオートラジオグラムを示す図である。ａ．ＳＡｖで複合化されたビオチン−Ｐｈｅ−ｏｔＲＮＡ；ｂ．ｏｔＲＮＡ、ｐｒｅ−２４otRNA のＲＮアーゼＰ消化ＲＮＡフラグメントをアミノアシル化に使用した（ｋ．ｂ．＝１．０×１０-3ｍｉｎ-1）。
図５Ｃは、ミニヘリックスＲＮＡの５’リーダーリボザイム触媒アミノアシル化の経過時間を示す図である。ａ．ＳＡｖで複合化されたビオチン−Ｐｈｅ−ミニヘリックスＲＮＡ；ｂ．ミニヘリックスＲＮＡ（配列番号１９）（ｏｔＲＮＡの受容体−Ｔステム−ループ領域からなる）。
【図６】炭酸カリウムでのアミノアシル−ｐｒｅ−２４の穏やかな塩基の加水分解前後のアミノアシル化状態を示す図である。レーン１〜３：図４Ａのレーン１〜３と同じ、レーン４：ビオチン−Ｐｈｅ−ｐｒｅ−２４ ＲＮＡ（レーン１のＲＮＡと同じ）を５０ｍＭ Ｋ2 ＣＯ3 と３７℃で１５分間処理した。レーン５：レーン４から回収したＲＮＡをレーン１と同一の条件下でのアミノアシル化に使用した。
【図７】Ｐｈｅ−ＡＭＰおよびＰｈｅ−ＴＥの存在下でのｐｒｅ−２４およびｏｔＲＮＡのアミノアシル化を示す図である。レーン１：５ｍＭ Ｐｈｅ−ＡＭＰの存在下でのｐｒｅ−２４のアミノアシル化およびその後のビオチン処理。レーン２：アミノアシル化のみ。レーン３：５ｍＭ Ｐｈｅ−ＡＭＰでのｏｔＲＮＡのアミノアシル化およびその後のビオチン処理。レーン４：１０ｍＭ Ｐｈｅ−ＴＥの存在下でのｐｒｅ−２４のアミノアシル化およびその後のビオチン処理。レーン５：アミノアシル化のみ。レーン６：ビオチン処理のみ。レーン７：１０ｍＭ Ｏｈｅ−ＴＥでのｏｔＲＮＡのアミノアシル化およびその後のビオチン処理。
【図８】ｔＲＮＡ変異型に対するトランスでのリボザイム触媒アミノアシル化を示す図である。３時間反応を行った。ｖ１およびｖ３（レーン２および３）は、図４Ｃに記載のｔＲＮＡドメインのフラグメントである。
【配列表】
本出願は、１９９９年１１月２４日提出の米国特許仮出願番号６０／１６７，３３１および２０００年６月２８日提出の米国特許仮出願番号６０／２１４，３８２（その開示が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般に、触媒ＲＮＡ分子の分野に関し、より詳細には、ｔＲＮＡ様分子のシスまたはトランスでのアミノアシル化能力を有する触媒ＲＮＡ分子に関するものである。
【０００３】
（背景技術）
非天然アミノ酸を含むタンパク質は、生物医学用および治療目的効果が期待されている。このようなアミノ酸は、特に、たんぱく質の構造および機能の探索、コンビナトリアルケミストリー用のペプチドライブラリーの構築、およびプロテオミクスに有用であり得る。しかし、このようなタンパク質の合成は、これまでのところ容易ではなかった。現在自然に起こることが公知の翻訳系では、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）によって遺伝子暗号化が行われている。これは２０の異なる形態で存在し、それぞれ１つのアミノ酸のその同族ｔＲＮＡイソ受容体へのエステル化を特異的に触媒し、それによりアミノ酸をその対応するアンチコドントリプレットに直接接触する。非同族アミノ酸のｔＲＮＡへの誤アシル化によりその細胞内活性に重要であり得る細胞タンパク質へのアミノ酸の誤組み込みが生じるので、ＡＲＳによるアミノアシル化反応の忠実度が非常に高くなければならない。この重要な課題を達成するために、ＡＲＳは同族アミノ酸およびｔＲＮＡを選択的に認識する非常に精巧な機構を使用する。ｔＲＮＡの認識決定要因は、アンチコドンループから受容体−Ｔｉ〜Ｃステムおよびリン酸−リボース骨格まで多種多様な範囲に及ぶ。これらの複雑さのために、非天然ｔＲＮＡおよびアミノ酸に対して所望の特異性を有するＡＲＳの操作は行われていなかった。結果として、核酸が注目されている。
【０００４】
長年、核酸は情報分子のみであると考えられていた。しかし、Ｃｅｃｈおよび共働者（Ｃｅｃｈ、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３６、１５３２〜１５３９；ＭｃＣｏｒｋｌｅら、１９８７、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６４、２２１〜２２６）の先駆的研究により、触媒として作用することができる天然に存在するＲＮＡ（リボザイム）の存在が示された。しかし、これらの天然のＲＮＡ触媒が切断およびスプライシングのためのリボ核酸基質に対して作用することのみが示されているにもかかわらず、最近のリボザイムの人工的な進化の発展により種々の化学反応に対する触媒のレパートリーが広がっている。例えば、ＲＮＡは、ＤＮＡのリン酸ジエステル切断（Ｂｅａｕｄｒｙら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７、６３５）、アミノアシルエステルの加水分解（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、１４２０〜１４２４）、自己分解（Ｐａｎら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、３８８７）、３’ＯＨを有するオリゴヌクレオチドと触媒の５’三リン酸塩末端とのライゲーション（Ｂａｒｔｅｌら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１、１４１１〜１４１８）、ビフェニルイソメラーゼ活性（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４、１９２４〜１９２７）、およびポリヌクレオチドキナーゼ活性（Ｌｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７１、３１〜３６）を触媒することが報告されている。
【０００５】
新規の触媒を同定するために、Ｂｒｅｎｎｅｎら（１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、５３８１〜５３８３）は高分子の異種遺伝子プールを構築し、所望の反応を触媒する分子を単離するためにインビトロ選択処理過程を使用した。このアプローチの変形形態がＧｏｌｄ．ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，４７５，０９６号）によって使用されている。指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）として公知のこの方法により、種々の標的分子との特異的非共有結合相互作用を形成する能力を有する核酸を同定する。関連特許（米国特許第５，９９０，１４２号）は、ＳＥＬＥＸ法に基づいているが、標的との共有結合の形成を触媒することができる改変および非改変ＲＮＡ分子を潜在的に同定することができる。最近、ホスホジエステラーゼ、アミダーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子を同定することができる類似のアプローチが使用された（Ｊｏｙｃｅに付与された米国特許第６，０６３，５６６号）。
【０００６】
さらに、アミノアシル−ＲＮＡ結合の触媒がその（２’）３’末端において可能であるＲＮＡ分子（Ｉｌｌａｎｇａｋｅｋａｒｅら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７、６４３〜６４７）もしくは、ＲＮＡ分子があるＲＮＡ分子から別のＲＮＡ分子にアミノ酸を転移することができる（Ｌｏｈｓｅら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８１、４４２〜４４４）ことが研究により同定されている。
【０００７】
しかし、現在のタンパク質翻訳処理過程において生理学的に有意なＲＮＡ分子をアミノアシル化することができる触媒ｔＲＮＡ様分子はこれまでのところ証明されていない。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、シスアミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡを提供する。この触媒ＲＮＡは、ｔＲＮＡ様ドメインおよびリボザイムドメインを含む。リボザイムドメインは触媒活性を有するが、アミノアシル化のためのアミノ酸特異性も付与する。したがって、この触媒ＲＮＡは、特定のアミノ酸を有する３’末端を選択的にアミノアシル化する能力を有する（以後、シスアミノアシル化ＲＮＡ分子と呼ぶ）。これらの触媒ＲＮＡを使用して、天然にアミノアシル化されないｔＲＮＡ様配列をアミノアシル化することができる。
【０００９】
本発明はまた、ｔＲＮＡ様分子をトランスでアミノアシル化できる触媒ＲＮＡ分子を提供する（以後、トランスアミノアシル化ＲＮＡ分子と呼ぶ）。トランスアミノアシル化ＲＮＡは、シスアミノアシル化ＲＮＡのリボザイムドメインに対応する。これらの触媒ＲＮＡ分子を使用して所望の天然または非天然アミノ酸を有するｔＲＮＡ様分子をトランスでアミノアシル化することができる。
【００１０】
本発明はまた、自己アミノアシル化ＲＮＡ分子の構築法を提供する。この方法は、配列をｔＲＮＡ様分子の５’末端に結合させる工程を包含し、この配列はリボザイム配列を含む。この方法を使用して、その３’末端のアミノアシル化を触媒することができる触媒ＲＮＡを作成することができる。これらの触媒分子をＲＮアーゼＰで切断して、ｔＲＮＡ様分子をトランスでアミノアシル化する能力を有する異なる種の触媒ＲＮＡ分子を生成することができる。
【００１１】
本発明はまた、アミノアシル化活性を有するＲＮＡ配列の同定法を提供する。この方法は、ｔＲＮＡ様ドメインおよびリボザイムドメインを有するＲＮＡ配列のプールを提供する工程と、前記プールのＲＮＡ配列と所望の天然または非天然アミノ酸とを接触させる工程と、非アミノアシル化分子からアミノアシル化ＲＮＡ分子を分離する工程と、前記アミノアシル化ＲＮＡ分子を増幅して配列決定する工程とを包含する。
【００１２】
本発明はまた、本明細書中に記載の自己アミノアシル化触媒分子のアミノアシル化法を提供する。この方法は、自己アミノアシル化触媒活性を有するＲＮＡ分子を提供する工程と、ＲＮＡ分子と所望の天然または非天然アミノ酸とを接触させる工程と、アミノアシル化ＲＮＡ分子を単離する工程とを包含する。
【００１３】
本発明はまた、ｔＲＮＡ様分子のアミノアシル化法を提供する。この方法は、トランスアミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子を提供する工程と、ＲＮＡ分子とｔＲＮＡ様分子および所望のアミノ酸とを接触させる工程と、アミノアシル化ＲＮＡ分子を単離する工程とを包含する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
明細書および特許請求の範囲の目的のため、本明細書中に記載の語「ｔＲＮＡ様分子」または「ｔＲＮＡ様ドメイン」または「ｔＲＮＡ様配列」は、ｔＲＮＡに典型的に関連するクローバー型構造の形成に一致する配列を有するＲＮＡ分子を意味する。ｔＲＮＡ様分子の具体例は、ｏｔＲＮＡ（配列番号１８）である。他のｔＲＮＡ様分子は、配列番号５〜１５のｔＲＮＡドメイン（すなわち、配列番号５のヌクレオチド８６〜１４６、配列番号６のヌクレオチド９０〜１５１、配列番号７のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号８のヌクレオチド８９〜１５０、配列番号９のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号１０のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１１のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１２のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１３のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１４のヌクレオチド９０〜１５０、および配列番号１５のヌクレオチド８９〜１４８）である。さらに他のｔＲＮＡ様分子は、配列番号２０〜２２である。
【００１５】
明細書および特許請求の範囲のために本明細書中で使用される語「リボザイム」は、化学反応を触媒することができるＲＮＡ分子を意味する。
【００１６】
語「天然のアミノ酸」は、生細胞中でｔＲＮＡを正常にアミノアシル化する２０アミノ酸のうちの任意のアミノ酸をいう。このようなアミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸である。したがって、語「非天然のアミノ酸」は、天然のアミノ酸または天然のアミノ酸の改変以外の任意のアミノ酸を意味する。
【００１７】
用語「シス」は、同一分子内を意味する。用語「トランス」は、異なる分子上またはそれに対することを意味する。
【００１８】
用語「５’リーダードメイン」または「触媒ドメイン」または「５’リーダーリボザイム」は、シスアミノアシル化活性を有する触媒分子の５’領域を意味する。このような５’リーダードメインの例は、配列番号５のヌクレオチド１〜８５、配列番号６のヌクレオチド１〜８９、配列番号７のヌクレオチド１〜８９、配列番号８のヌクレオチド１〜８８、配列番号９のヌクレオチド８９、配列番号１０のヌクレオチド１〜８８、配列番号１１のヌクレオチド１〜８８、配列番号１２のヌクレオチド１〜８８、配列番号１３のヌクレオチド１〜８８、配列番号１４のヌクレオチド１〜８９、および配列番号１５のヌクレオチド１〜８８である。
【００１９】
本発明は、アミノアシル化反応を触媒することができる触媒ＲＮＡ分子に関する。自己アミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子は２つのドメイン、触媒ドメインおよびアミノアシル受容体ドメインを有する。触媒ドメインは、リボザイム活性を有する配列を含む。このドメインはまた、アミノ酸特性を付与する。
【００２０】
自己アミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子を構築するために、無作為に合成されたＲＮＡプールを選択する。このプールのＲＮＡ分子をｔＲＮＡ様分子の５’末端へ付着させ、複合体を基質分子（天然または非天然アミノ酸）を接触させることにより、自己アミノアシル化ＲＮＡ分子を同定する。次いで、これらの分子を選択的に増幅することができる。これらの分子の自己アミノアシル化の性質を、移動度ゲルシフトアッセイなどの標準的なアッセイによって確認することができる。活性アミノアシル化ＲＮＡ種の単離を容易にするために、ビオチンタグを標的分子に付着させることができる。あるいは、水溶性形態のビオチンを使用してアミノアシル化ＲＮＡを標識し、アミノアシル化ＲＮＡ種を作成することができる。これらのビオチン標識種を、ストレプトアビジン被覆アガロースを使用して単離することができる。選択的増幅ラウンドの反復により、自己アミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡの純粋な種が得られる。選択ラウンドは、ｃＤＮＡを作成するために反応のＳＡｖ結合部分から回収された逆転写ＲＮＡを一部含む。ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、次いでＰＣＲ産物を転写して、次の選択ラウンドで使用されるＲＮＡを作成する。最終選択ラウンドから得たＲＮＡを移動度ゲルシフトアッセイに供して自己アミノアシル化およびトランスアミノアシル化活性を証明する。
【００２１】
本発明の触媒分子はまた、ＲＮＡ種をトランスでアミノアシル化することができる。このような触媒分子を作成するために、アミノアシル受容体ドメイン（ｔＲＮＡ様ドメイン）を細菌ＲＮアーゼＰ消化によって触媒ドメインから切断することができる。触媒ドメインは、アミノアシル受容体ドメインまたはｔＲＮＡ様分子をトランスでアミノアシル化することができる。また、当業者に周知の方法によって、対応するＤＮＡテンプレートから適切なＲＮＡポリメラーゼで触媒化したインビトロ流出転写により触媒分子を合成することもできる。
【００２２】
アミノアシル受容体ドメインは、ｔＲＮＡ様分子である。ｔＲＮＡ様分子の適切な例は、人工オーソゴナルサプレッサーｔＲＮＡ（ｏｔＲＮＡ、図ＩＢを参照のこと）である。あるいは、異なる種（ヒトなど）に由来するか単離されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡをこの目的で使用することができる。このｔＲＮＡ配列は、アンバーサプレッサーｔＲＮＡGln2に由来するが、細菌ＡＲＳによって認識されない。ｏｔＲＮＡを、アミノアシル化活性およびアミノ酸特異性を付与する固有の触媒ドメインに結合させることができる。
【００２３】
一旦アミノアシル化活性を有することが公知の配列が単離されると、この配列をさらなるアミノアシル化配列の単離に対する足場ベースのアプローチに使用することができる。各塩基が非野生型となる一定の割合を有するように、ＤＮＡ形態のｐｒｅ−２４phe 配列領域（５’プライマー配列を除く）を無作為に変異誘発させる。次いで、このＤＮＡプールをｏｔＲＮＡのアンチセンスＤＮＡにアニーリングし、アニーリングプールを全長二重鎖ＤＮＡに伸長する。ＰＣＲによって新規のテンプレートのコピーを作成し、これを転写して先に記載した選択に供する。
【００２４】
ｐｒｅ−２４phe の触媒足場を利用して、ほとんどの配列がｐｒｅ−２４phe の二次またはさらに三次構造を維持することができる集中した配列空間のスクリーニングが可能である。この狭い焦点にかかわらず、足場プールは基質のアミノ酸成分であるように選択したアミノ酸に依存するアミノ酸特異性の望ましい変化に十分な無作為変異を有する。したがって、活性配列に出会う可能性は、完全に無作為なプールを使用した選択よりも高くなり得る。少数のヌクレオチドが無作為化されるので、足場プールのために非常に複雑なプールを扱う必要はない（変異速度に依存し、その複雑さは２から３桁低い）。したがって、選択はあまり骨が折れず、より迅速に結果を得ることができる。
【００２５】
これらおよび他の実施形態は、下記の実施形態からより明白になるが、これは例示であり限定と解釈すべきでない。
【００２６】
（実施例１）
この実施形態は、アミノアシル化活性のスクリーニング用のＲＮＡ分子のプールの構築を記載する。この実施形態の例示では、無作為化配列を作成し、ｔＲＮＡ様分子に結合した。したがって、７０ヌクレオチドのランダムプールを、以下のｔＲＮＡ様分子（ｏｔＲＮＡ）の５’末端に結合した。
【００２７】
プール構築：４つの合成オリゴヌクレオチドを、プール構築に使用した：ランダムプールＤＮＡテンプレート（５’−ＧＧＡＴＣＧＴＣＡＧＴＧＣＡＴＴＧＡＧＡ−Ｎ７０−ＧＧＴＧＧＴＡＴＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＡ−３’）（配列番号１）、オーソゴナルｔＲＮＡに相補的なＤＮＡテンプレート（ｏｔＲＮＡ）（配列番号２）、Ｔ７プロモーター配列を含む５’プライマー（配列番号３）、および３’プライマー（配列番号４）。熱サイクル条件下（９５℃で１０分、５５℃で１０分、および７２℃で１０分）で、ＤＮＡテンプレートの大規模Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ伸長を行った。次いで、全長産物を５’および３’プライマーの存在下での７サイクルの大規模ＰＣＲによって増幅した。約１０15の複雑度のプールＤＮＡの４つの等価物をａ−［32Ｐ］−ＵＴＰの存在下でのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製した。
【００２８】
（実施例２）
この実施形態は、実施例１で構築したＲＮＡ分子由来の活性配列の選択を記載する。例として、以下の基質を使用してＲＮＡのアミノ鎖アクリル化種を選択した。
【００２９】
（基質）
ＣＭＥ基は活性化と加水分解安定性との釣り合いが取れているので、Ｎ−ビオチニル−Ｌ−アミノアシル−シアノメチルエステル（Ｂｉｏｔｉｎ−ａａ−ＣＭＥ）をアミノアシルドナー基質として選択した。さらに、ＣＭＥは水素結合官能基を有していないので、基質のアミノ酸側鎖によるＲＮＡとの一次相互作用の確認の助けとなる。
【００３０】
他の基質には、フェニルアラニルアデニレート（Ｐｈｅ−ＡＭＰ）およびフェニルアラニルチオエステル（Ｐｈｅ−ＴＥ）を含んでいた。また、これらの基質を、上記の理由のためおよび他の基質成分よりもむしろアミノ酸への特異性を示すために選択した。ビオチンタグにより、固定ストレプトアビジン（ＳＡｖ）アガロース上のビオチン部分とＳＡｖとの間の相互作用を介した活性（すなわち、アミノアシル化）配列の単離を容易にする。Ｎ−ビオチニル−Ｌ−フェニルアラニル−シアノメチルエステル（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｐｈｅ−ＣＭＥ）およびＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＣＭＥ（Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）を以前に記載の方法によって本質的に合成した（Ｓｕｇａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０、１１５１〜１１５６、１９９８）。Ｐｈｅ−ＣＭＥの合成を以下のように行った：９：１ ＴＦＡ／アニソール溶液（５００ｍＬ）をアルゴン雰囲気下でＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＣＭＥ（３８５ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、約４Ｍの塩酸のジオキサン溶液（４ｍＬ）を残渣に添加した。溶液を真空濃縮し、残渣への無水エーテルの添加によって沈殿を得た。沈殿を最少量のＭｅＯＨに溶解し、この溶液（無水エーテル）を添加して生成物を再沈殿させた。生成物の純度を、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を使用して測定した。
【００３１】
以前に記載のように（Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２５３、６０８〜６１１、１９５８）フェニルアラニルアデニレート（Ｐｈｅ−ＡＭＰ）の合成を行った。生成物の32Ｐ ＮＭＲ分析により、Ｐｈｅ−ＡＭＰの純度は約５０％であり、残りの副産物は未反応のＡＭＰであることが示された。生成物を水中に溶解し、さらに精製することなくアミノアシル化に使用した。
【００３２】
フェニルアラニルチオエステル（Ｐｈｅ−ＴＥ）の合成を以下に示す：Ｎ，Ｎ−ビス［２−オキソ−３−オキソゾリジイルホスホロジアミンクロリド］（２３８ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（３０７ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１７５ｍＬ、２．２６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に添加した。この混合物に、エチル２−メルカプトアセテート（１００ｍＬ、０．９１ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応混合物を室温で５時間激しく撹拌した。２０％ＮａＨＣＯ3 水溶液の添加によって反応を停止させた。標準的な水溶液の操作後、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＴＥをカラムクロマトグラフィーで単離した。９：１ ＴＦＡ／アニソール溶液（５００ｍＬ）をアルゴン雰囲気下でＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＴＥ（２００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、約４Ｍ塩酸のジオキサン溶液（４ｍＬ）を添加して、塩酸塩を形成した。溶液を真空濃縮し、残渣をエーテルに溶解した。この溶液に石油エーテルを添加することにより沈殿物が形成され、これをエーテルでリンスし、濾過してＰｈｅ−ＴＥを得た。
【００３３】
（活性配列の選択）
以下の条件で選択反応を行った：１０μＭ（第１ラウンドのみ）または１μＭＲＮＡプール、１ｍＭビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥのＥＫ緩衝液（５０ｍＭ ＥＰＰＳ、５００ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．５）、１００ＭＭ ＭｇＣｌ2 、およびエタノール（全体積の２５％）の混合物。プールＲＮＡをＥＫ緩衝液中でプレインキュベートし、９５℃で５分間加熱し、２５℃で５分間冷却した。次いで、ＭｇＣｌ2 を添加後、５分間平衡化した。基質のエタノール溶液の添加によって反応を開始し、２５℃で３時間インキュベートした（１５〜１７ラウンドは３０分間）。２体積の冷エタノールの添加によって反応を停止させ、ＲＮＡを２回エタノール沈殿した。ＲＮＡペレットをＥＫＥ緩衝液（５０ｍＭ ＥＰＰＳ、５００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解し、２００μＬ（第１ラウンドは１ｍＬ）のストレプトアビジンアガロースと室温で３０分間インキュベートした。未結合のＲＮＡを２０樹脂体積のＥＫＥ緩衝液、４０樹脂体積の４Ｍ尿素、その後１０樹脂体積の水で溶出した。樹脂結合ＲＮＡを１０ｍＭビオチン（ｐＨ７）の存在下での９５℃で１０分間の加熱によって溶出した。回収したＲＮＡを１μＭ ３’プライマー（配列番号４）、１２５μＭ ｄＮＴＰ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ＭＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ８．３）の存在下、４２℃で１時間（１〜１４ラウンド）または１０分間（１５〜１７ラウンド）１００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｇａ（商標））を使用して逆転写した。ｃＤＮＡをＰＣＲに供し、その後標準的な条件下で転写した。
【００３４】
プール中の自己アミノアシル化ＲＮＡ分子の１５ラウンドの選択的増幅により、ＳＡｖ依存性移動度ゲルシフトアッセイ（図２、レーン１〜３）で確認したところ、活性配列が富化した。ラウンド１５由来の全投入ＲＮＡ分子の約１０％で３時間後にアミノアシル化が認められた（レーン３）。より短いインキュベーション時間での２ラウンドの選択を使用して、プール中の活性をさらに増加させた（レーン４〜６）。ＳＡｖまたは基質の欠損により遅延するバンドが消失することから、これはビオチン−Ｐｈｅ基を有する活性ＲＮＡの自己アシル化が起こっていることが示される。３’末端ジオールの過ヨウ素酸酸化または３’アデノシンの欠失により、アミノアシル化がほぼ完全に阻害され（レーン９、１０）、これは、３’末端ヒドロキシル基がアミノアシル化部位であることが強く示唆される。
【００３５】
ラウンド１７のプール由来の３６個の各クローンを自己アミノアシル化（実施例Ｂに記載の自己アミノアシル化アッセイ）についてスクリーニングし、１１個のクローン（配列番号５〜１５）が明らかな活性を示した。これらの配列のアラインメントにより、５’リーダードメイン中約９５％が同一であることが明らかとなった（図３の上）。ｐｒｅ−２４またはｒｔＲＮＡ（配列番号９）と呼ばれるクローンの代表を自己アミノアシル化活性の確認のために選択した。
【００３６】
（実施例３）
ビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥの存在下でのｐｒｅ−２４の自己アミノアシル化活性を、１２．５ｍＭ ＫＣｌおよび５％エタノールを使用する以外は選択に使用したものと類似の条件下でアッセイした。各測定点で、反応アリコートを２回エタノール沈殿させ、ペレットを７μＬのＭＥＵＳ緩衝液（２５ｍＭ ＭＯＰＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、８Ｍ尿素、１０μＭストレプトアビジン、ｐＨ６．５）に溶解した。１μＭ ＲＮＡおよび１ｍＭビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥ（図４、レーン１、２、４、および５）または１ｍＭビオチン−ａａ−ＣＭＥ（レーン６〜１０）の存在下または基質の非存在下で反応を行った（レーン３）。過ヨウ素酸酸化のため（レーン４）に、ｐｒｅ−２４を１０ｍＭ ＮａＯＨで０℃で１時間処理し、アミノアシル化反応前にエタノール沈殿した。反応物を３０分間（レーン１〜４）または２時間（レーン５〜１０）インキュベートした。得られた溶液を、ゲルの温度を２０℃未満に維持するために低温室で１０％ＰＡＧＥによって分析した。基質濃度に対する初期速度のプロットにより、ｋcat ＝０．１０＋０．０１／ｍｉｎ-1およびＫｍ＝６．３±１．２ｍＭの速度パラメータのミカエリス−メンテン挙動が明らかとなる一方で、基質の溶解限度により５ｍＭ未満までに実際の作用濃度が制限される。バックグラウンド速度を、上記と同一の反応緩衝液中で１ｍＭビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥとｏｔＲＮＡを３時間インキュベーションすることによって測定し、０．０１％のアミノアシル−ｏｔＲＮＡが得られた（レーン１１）。したがって、バックグラウンド速度は、約５．５×１０-7／ｍｉｎ-1と評価される。認められたリボザイムの加速は、バックグラウンドよりも約１０5 倍高い。
【００３７】
自己アミノアシル化活性を、ＳＡｖ依存性移動度ゲルシフトアッセイによって確認された（図４Ａ、レーン１〜３）。過ヨウ素酸酸化により活性が完全に消失し、これにより、アミノアシル化部位が３’末端であることが強く示唆される（レーン４）。炭酸カリウムでのアミノアシル−ｐｒｅ−２４の穏やかな塩基の加水分解により、遅延するバンドが消失した（すなわち、ｐｒｅ−２４からビオチン−Ｐｈｅが加水分解された）。アミノアシル基質に再暴露した場合、この脱アシル化ｐｒｅ−２４は依然として自己アミノアシル化活性を示した（図６を参照のこと）。これにより、３’または２’エステル結合はアミノアシル−ｐｒｅ−２４の唯一可能性のある結合であることが示唆される。
【００３８】
触媒ＲＮＡのアミノ酸特異性を、５つの異なるビオチン−アミノアシル−ＣＭＥを使用して調査した（図４、レーン６〜１０）。Ｐｈｅ−ＣＭＥ、Ｐｈｅ−ＡＭＰ、およびＰｈｅ−ＴＥの基質について、アミノアシル−ＲＮＡペレットを酸性ＥＰＰＳ緩衝液（０．３Ｍ、ｐＨ５．５）に再懸濁する以外は上記と同一の手順を使用して自己アミノアシル化反応を行った。次いで、０．３Ｍ ＥＰＰＳ−ＫＯＨをこの溶液に添加してｐＨ８．０とした。これらのアミノ酸の反応速度はフェニルアラニンと比較すると劇的に減少し、これは、リボザイムドメインがビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥに対して顕著な特異性を有することを示す。
【００３９】
基質中の主な認識エレメントをさらに明らかにするために、３つの合成フェニルアラニンエステル（図１Ｃ）を活性について試験した（図４Ｂ）（１６）。０．５μＭ ｐｒｅ２４触媒ＲＮＡおよび５ｍＭ Ｐｈｅ−ＣＭＥ（レーン１）、５ｍＭ Ｐｈｅ−ＡＭＰ（レーン２）、または１０ｍＭ Ｐｈｅ−ＴＥ（レーン３）の存在下、２５℃（レーン１及び３）または０℃（レーン２）で３０分間反応を行った。ビオチン化（レーン４）またはＰｈｅ−ＣＭＥの基質（レーン５）の非存在により遅延バンドが消失し、これは、アミノアシル化は遅延バンドに必要であることを示す。バックグラウンドアミノアシル化を、５ｍＭ Ｐｈｅ−ＣＭＥの存在下でｏｔＲＮＡを使用してモニターした（レーン６）。Ｐｈｅ−ＡＭＰおよびＰｈｅ−ＴＥについて同一対照実験も行った（図７を参照のこと）。ａ−アミノ基からのビオチンの省略（すなわち、Ｐｈｅ−ＣＭＥ）により、Ｐｈｅ−ＣＭＥ濃度が５倍に増加した場合にビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥ（図４Ｂ、レーン１）で認められたものとほとんど同一の触媒速度が得られた。これは、ビオチニル基（おそらく、ａ−アミノ基に対するアミド官能基）はリボザイムと相互作用するが、必須の基質認識エレメントではないことを例示している。リボザイムはまた、ＣＭＥ遊離基の代わりにアデニレート（Ｐｈｅ−ＡＭＰ）およびチオエステル（Ｐｈｅ−ＴＥ）に適応した（レーン２および３）。これは、基質の重要な認識エレメントはフェニルアラニル側鎖であり、遊離基ではないことを示していた。
【００４０】
（実施例４）
この実施形態は、触媒ＲＮＡ分子の調製およびトランスアミノアセチル化活性を示す。実施例１および２由来のｐｒｅ−２４触媒ＲＮＡを本実施例で使用した。最初に、ｐｒｅ−２４ｏｔＲＮＡをＲＮアーゼＰ切断（図５Ａ）に供し、３’ｔＲＮＡドメインから５’触媒ドメインを遊離させた。［32Ｐ］−ボディ標識ｐｒｅ−２４otRNA をＲＮアーゼＰ ＲＮＡで２時間処理して約２３％のｐｒｅ−２４otRNA を切断した（レーン１）。ＲＮアーゼＰが存在しないと切断生成物は得られなかった（レーン２）。マーカーＲＮＡ（レーン３の５’リーダーセグメント及びレーン４のｏｔＲＮＡ）を、対応するＤＮＡセグメントを使用したインビトロ転写によって調製した。以前に記載のようにｐＤＷ２７プラスミドのＭ１遺伝子由来のＰＣＲ増幅ＤＮＡテンプレートを使用して大腸菌ＲＮアーゼＰ ＲＮＡをインビトロで転写し（Ｚｉｅｈｌｅｒら、１９９６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０、６２２〜６２４）、６％ＰＡＧＥで精製した。３７℃の１Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2 および０．１％ＳＤＳ中でＲＮアーゼＰ ＲＮＡ（１μＭ）によるｐｒｅ−２４otRNA （１μＭ）の切断を行った。反応後、溶液を２回エタノール沈殿し、得られた溶液を１０％ＰＡＧＥで分析した。
【００４１】
大腸菌ＲＮアーゼＰ ＲＮＡでのｐｒｅ−２４otRNA の処理により、５’リーダーセグメントおよびｏｔＲＮＡに対応する長さの２つのフラグメントが作成された（図５Ａ、レーン３および４の各フラグメントのインビトロ転写と比較したレーン１および２）。これは、ｐｒｅ−２４otRNA がＲＮアーゼＰ ＲＮＡ加水分解に影響されやすいことを示す。従って、触媒活性ｐｒｅ−ｔＲＮＡをｔＲＮＡ様分子および５’リーダーセグメントに断片化することができる。
【００４２】
次に、５’リーダーフラグメントがｏｔＲＮＡフラグメントをトランスでアミノアシル化することができるかどうかを試験した（図１Ａ右）。トランスアミノアシル化活性の分析のために（図５Ｂ）、非標識ｐｒｅ−２４otRNA を切断し、ｏｔＲＮＡおよび５’リーダードメインの各セグメントを１０％ＰＡＧＥで精製した。ｔＲＮＡセグメントをウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、［32Ｐ］−ａ−ＡＴＰの存在下でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化した。ｐｒｅ−２４otRNA に対するＲＮアーゼＰ ＲＮＡ作用によって作成した５’リーダーおよびｏｔＲＮＡフラグメントを、ビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥで処理した（図５Ｂ）。５’リーダーフラグメントは、ｐｒｅ−２４otRNA のシス反応と類似の速度でｏｔＲＮＡをトランスアミノアシル化した。インビトロ転写５’リーダーフラグメントはまた、上記と類似のトランス活性を示した。したがって、ＲＮアーゼＰ ＲＮＡ消化５’リーダーフラグメントを、その機能的構造に独立して折りたたんで、トランス活性化アミノアシル化酵素として作用することができる。
【００４３】
ｏｔＲＮＡの受容体Ｔステム−ループ領域からなるミニヘリックスＲＮＡ（図５Ｃ）の基質特性も試験した。５’リーダーリボザイムおよびミニヘリックスＲＮＡをインビトロ転写し、その後ＰＡＧＥで精製した。反応前に、各ＲＮＡ（４μＭの５’リーダーリボザイムおよび３μＭのミニヘリックスＲＮＡ）を、それぞれ折りたたんだ。残りの手順は、方法の節に記載のものと同一であった。ミニヘリックスＲＮＡは依然として５’リーダーリボザイムによってアミノアシル化されることから、アンチコドンループは活性に必須ではないことが示される。しかし、ｏｔＲＮＡと比較して認められた速度の約４倍が減少していることにより、５’リーダーリボザイムが全長ｏｔＲＮＡ中に存在するさらなるエレメントと相互作用することが示唆される。
【００４４】
さらに、５’リーダーフラグメントは、ｐｒｅ−２４otRNA のシス反応と同様の速度でｏｔＲＮＡをアミノアシル化した。インビトロ転写５’リーダーフラグメントはまた、上記と類似のトランス活性を示した。さらに、このフラグメントは、それぞれのシス反応に類似の速度でｒｔＲＮＡおよびその変異型に対する活性を示した（図８）。
【００４５】
結論として、本発明は、その３’末端のアミノアシル化を触媒する能力を有する改変ｔＲＮＡを提供する。５’リーダー配列は、独立して３’ｔＲＮＡドメインに存在し、その触媒特性を依然として保持することができる。
【００４６】
（実施例５）
１５％変異誘発足場プールを使用したＬｅｕ特異性リボザイムの選択に足場ストラテジーを使用した。１５％変異誘発足場ＲＮＡプールを以下のように合成した：ｔＲＮＡの５’プライマー領域および５’重複領域以外のリボザイムの各ヌクレオチドの位置を、自動化ＤＮＡ合成機の使用によって対応するＤＮＡテンプレートを変異誘発する。合成前に、各ホスホラミダイトを他の３つの塩基と８５：５：５：５の反応比で混合した。リボザイム配列にしたがってＤＮＡテンプレートを合成した。標準的な方法としてオリゴヌクレチドの脱保護および精製を使用した。２００μＬスケールでＰＣＲを行う以外は実施例１と同一の方法によってＤＮＡを増幅した。このＤＮＡテンプレートのインビトロ転写およびその後のＰＡＧＥによる精製によって、足場ＲＮＡプールが１５％変異誘発された。５ラウンドのみの選択後にプール中に活性配列が認められた（一方、完全に無作為のプール由来のｐｒｅ−２４Phe の選択には１５ラウンドを必要とする）。なお、オーソゴナルｔＲＮＡ（ｏｔＲＮＡ）に対して認められた活性は、本来のｐｒｅ−２４Phe のものよりも高く、このストラテジーは特異性を切り換えるだけでなく、ｏｔＲＮＡに対する活性を最適にする。
【００４７】
このアプローチの使用によって、ロイシン特異性シスアミノアシル化ＲＮＡが得られた。２つの具体例は、配列番号１７と配列番号１８として示される。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態を本明細書中に記載および例示したが、本発明はこのような好ましい実施形態に制限されない。本発明の精神を逸脱することなく、種々の変更形態を得ることができることが当業者に認識される。
【００４９】
【配列表フリーテキスト】
<210> １
<213> 人工配列
<223> ７０ヌクレオチドのランダムプールを含む合成オリゴヌクレオチド
<210> ２
<213> 人工配列
<223> ｏｔＲＮＡGln に対して相補的な完全に合成されたプライマー
<210> ３
<213> 人工配列
<223> Ｔ７プロモーター配列を含む５’プライマー
<210> ４
<213> 人工配列
<223> ３’完全に合成されたプライマー
<210> ５
<213> 人工配列
<223> プレ‐１２触媒ＲＮＡ
<210> ６
<213> 人工配列
<223> プレ‐３８触媒ＲＮＡ
<210> ７
<213> 人工配列
<223> プレ‐２９触媒ＲＮＡ
<210> ８
<213> 人工配列
<223> プレ‐３６触媒ＲＮＡ
<210> ９
<213> 人工配列
<223> プレ‐２４触媒ＲＮＡ
<210> １０
<213> 人工配列
<223> プレ‐２５触媒ＲＮＡ
<210> １１
<213> 人工配列
<223> プレ‐２２触媒ＲＮＡ
<210> １２
<213> 人工配列
<223> プレ‐５触媒ＲＮＡ
<210> １３
<213> 人工配列
<223> プレ‐１９触媒ＲＮＡ
<210> １４
<213> 人工配列
<223> プレ‐８触媒ＲＮＡ
<210> １５
<213> 人工配列
<223> プレ‐２３触媒ＲＮＡ
<210> １６
<213> 大腸菌
<223> ｏｔＲＮＡ
<210> １７
<213> 人工配列
<223> Ｈ２ Ｌｅｕ 触媒ＲＮＡ
<210> １８
<213> 人工配列
<223> Ｄ１‐Ｌｅｕ 触媒ＲＮＡ
<210> １９
<213> 人工配列
<223> ミニヘリックスを形成するＲＮＡ
<210> ２０
<213> 人工配列
<223> ｏｔＲＮＡのＶ１突然変異体
<210> ２１
<213> 人工配列
<223> ｏｔＲＮＡのＶ２突然変異体
<210> ２２
<213> 人工配列
<223> ｏｔＲＮＡのＶ３突然変異体
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】自己アミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ（左）およびトランスアミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ（右）を示す略図である。アミノ酸基質（アミノ酸側鎖および遊離基をそれぞれａａおよびＸで示す）は、５’リーダーリボザイムドメインに結合し、ｔＲＮＡ３’−ヒドロキシルの求核攻撃（曲がった矢印で示す）を促進する。ＲＮアーゼＰ ＲＮＡの切断部位をまっすぐな矢印で示す。
【図１Ｂ】ｏｔＲＮＡの二次構造を示す図である。
【図１Ｃ】基質シアノメチルエステル（ＣＭＥ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）（アデニレート）、およびチオエステル（ＴＥ）のそれぞれの化学構造を示す図である。
【図２】選択サイクル機能としての自己アミノアシル化活性を示すオートラジオグラムを示す図である。ａ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ＲＮＡ、ｂ．ＲＮＡプール。
【図３】ラウンド１７のＲＮＡから単離した活性クローンの配列アラインメントを示す図である。ｔＲＮＡドメインのアラインメントのために、野生型ｏｔＲＮＡを、選択したｒｔＲＮＡ配列と共に示す。ｔＲＮＡドメインに認められるコンセンサス欠失および変異をボックスで強調している。ｔＲＮＡループの略称を以下に示す：ＡＣ、アンチコドン；Ｖ、可変；Ｔ、ＴＣ。
【図４】図４Ａは、ｐｒｅ−２４の自己アミノアシル化活性およびアミノ酸特異性を示す図である。ａ．ＳＡｖと複合化したビオチン−アミノアシル−ｐｒｅ−２４；ｂ．ｐｒｅ−２４；ｃ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ｏｔＲＮＡ；ｄ．ｏｔＲＮＡ。
図４Ｂは、３つの異なるエステルを使用したｐｒｅ−２４の自己アミノアシル化活性の比較を示す図である。ａ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ｐｒｅ−２４；ｂ．ｐｒｅ−２４；ｃ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ｏｔＲＮＡ；ｄ．ｏｔＲＮＡ。０．５μＭ ｐｒｅ２４および５ｍＭ Ｐｈｅ−ＣＭＥ（レーン１）、５ｍＭ Ｐｈｅ−ＡＭＰ（レーン２）、または１０ｍＭＰｈｅ−ＴＥ（レーン３）の存在下、２５℃（レーン１および３）または０℃（レーン２）で３０分間反応を行った。
図４Ｃは、ｐｒｅ−２４およびｔＲＮＡドメインに異なる程度の変異および欠失を有するその変異体の自己アミノアシル化活性の比較を示す図である。野生型ｐｒｅ−２４（レーン１）およびｐｒｅ−２４otRNA （レーン５）は、それぞれｔＲＮＡドメインのｒｔＲＮＡおよびｏｔＲＮＡを含む。
【図５】図５Ａは、５’リーダーリボザイムのトランスアミノアシル化活性を示す図である。ＲＮアーゼＰ ＲＮＡによるｐｒｅ−２４ ｏｔＲＮＡの切断。ａ．ｐｒｅ−２４ ｏｔＲＮＡ；ｂ．５’リーダーセグメント；ｃ．ｏｔＲＮＡ。
図５Ｂは、ｏｔＲＮＡの５’リーダーリボザイム触媒アミノアシル化の経過時間を示すオートラジオグラムを示す図である。ａ．ＳＡｖで複合化されたビオチン−Ｐｈｅ−ｏｔＲＮＡ；ｂ．ｏｔＲＮＡ、ｐｒｅ−２４otRNA のＲＮアーゼＰ消化ＲＮＡフラグメントをアミノアシル化に使用した（ｋ．ｂ．＝１．０×１０-3ｍｉｎ-1）。
図５Ｃは、ミニヘリックスＲＮＡの５’リーダーリボザイム触媒アミノアシル化の経過時間を示す図である。ａ．ＳＡｖで複合化されたビオチン−Ｐｈｅ−ミニヘリックスＲＮＡ；ｂ．ミニヘリックスＲＮＡ（配列番号１９）（ｏｔＲＮＡの受容体−Ｔステム−ループ領域からなる）。
【図６】炭酸カリウムでのアミノアシル−ｐｒｅ−２４の穏やかな塩基の加水分解前後のアミノアシル化状態を示す図である。レーン１〜３：図４Ａのレーン１〜３と同じ、レーン４：ビオチン−Ｐｈｅ−ｐｒｅ−２４ ＲＮＡ（レーン１のＲＮＡと同じ）を５０ｍＭ Ｋ2 ＣＯ3 と３７℃で１５分間処理した。レーン５：レーン４から回収したＲＮＡをレーン１と同一の条件下でのアミノアシル化に使用した。
【図７】Ｐｈｅ−ＡＭＰおよびＰｈｅ−ＴＥの存在下でのｐｒｅ−２４およびｏｔＲＮＡのアミノアシル化を示す図である。レーン１：５ｍＭ Ｐｈｅ−ＡＭＰの存在下でのｐｒｅ−２４のアミノアシル化およびその後のビオチン処理。レーン２：アミノアシル化のみ。レーン３：５ｍＭ Ｐｈｅ−ＡＭＰでのｏｔＲＮＡのアミノアシル化およびその後のビオチン処理。レーン４：１０ｍＭ Ｐｈｅ−ＴＥの存在下でのｐｒｅ−２４のアミノアシル化およびその後のビオチン処理。レーン５：アミノアシル化のみ。レーン６：ビオチン処理のみ。レーン７：１０ｍＭ Ｏｈｅ−ＴＥでのｏｔＲＮＡのアミノアシル化およびその後のビオチン処理。
【図８】ｔＲＮＡ変異型に対するトランスでのリボザイム触媒アミノアシル化を示す図である。３時間反応を行った。ｖ１およびｖ３（レーン２および３）は、図４Ｃに記載のｔＲＮＡドメインのフラグメントである。
【配列表】
Claims (11)
- ａ．配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５の配列ならびにその相補配列を有するＲＮＡと、
ｂ．ｕがｔに置換されているａ）の配列を有するＤＮＡ
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸分子。 - 前記ＲＮＡ配列が配列番号９の配列を有することを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
- ａ）配列番号５のヌクレオチド１〜８５、配列番号６のヌクレオチド１〜８９、配列番号７のヌクレオチド１〜８９、配列番号８のヌクレオチド１〜８８、配列番号９のヌクレオチド１〜８９、配列番号１０のヌクレオチド１〜８８、配列番号１１のヌクレオチド１〜８８、配列番号１２のヌクレオチド１〜８８、配列番号１３のヌクレオチド１〜８８、配列番号１４のヌクレオチド１〜８９、および配列番号１５のヌクレオチド１〜８８の配列ならびにその相補配列を有するＲＮＡと、
ｂ）ｕがｔに置換されているａ）の配列を有するＤＮＡ
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸分子。 - ａ）配列番号５のヌクレオチド８６〜１４６、配列番号６のヌクレオチド９０〜１５１、配列番号７のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号８のヌクレオチド８９〜１５０、配列番号９のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号１０のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１１のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１２のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１３のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１４のヌクレオチド９０〜１５０、および配列番号１５のヌクレオチド８９〜１４８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２の配列およびその相補配列を有するＲＮＡと、
ｂ）ｕがｔに置換されているａ）の配列を有するＤＮＡ
からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸分子。 - 前記ＲＮＡ配列が配列番号９のヌクレオチド９０〜１５０の配列を有することを特徴とする請求項４に記載の核酸分子。
- ｔＲＮＡ様分子を提供する工程と、リボザイム配列を前記ｔＲＮＡ様分子の５’末端に結合させる工程を包含し、前記リボザイム配列が配列番号５のヌクレオチド１〜８５、配列番号６のヌクレオチド１〜８９、配列番号７のヌクレオチド１〜８９、配列番号８のヌクレオチド１〜８８、配列番号９のヌクレオチド１〜８９、配列番号１０のヌクレオチド１〜８８、配列番号１１のヌクレオチド１〜８８、配列番号１２のヌクレオチド１〜８８、配列番号１３のヌクレオチド１〜８８、配列番号１４のヌクレオチド１〜８９、および配列番号１５のヌクレオチド１〜８８からなる群から選択され、シス−アミノアシル化がｔＲＮＡ様分子の３’末端のアミノアシル化を引き起こすことを特徴とするシス−アミノアシル化触媒ＲＮＡ分子の構築方法。
- ａ．ｔＲＮＡ様分子を提供する工程と、
ｂ．配列番号５のヌクレオチド１〜８５、配列番号６のヌクレオチド１〜８９、配列番号７のヌクレオチド１〜８９、配列番号８のヌクレオチド１〜８８、配列番号９のヌクレオチド１〜８９、配列番号１０のヌクレオチド１〜８８、配列番号１１のヌクレオチド１〜８８、配列番号１２のヌクレオチド１〜８８、配列番号１３のヌクレオチド１〜８８、配列番号１４のヌクレオチド１〜８９、および配列番号１５のヌクレオチド１〜８８からなる群から選択される配列を有するリボザイムドメイン分子を提供する工程と、
ｃ．前記リボザイムドメイン分子を前記ｔＲＮＡ様分子の５’末端に結合してリボザイム−ｔＲＮＡ分子のプールを得る工程と、
ｄ．前記リボザイム−ｔＲＮＡ分子とアミノ酸基質とを接触させる工程と、
ｅ．前記リボザイム−ｔＲＮＡ分子の残存物からアミノアシル化リボザイム−ｔＲＮＡ分子を分離してシス−アミノアシル化触媒ＲＮＡ分子を得る工程とを包含することを特徴とするシス−アミノアシル化触媒ＲＮＡ分子の同定方法。 - 前記ｔＲＮＡ様分子が、配列番号５のヌクレオチド８６〜１４６、配列番号６のヌクレオチド９０〜１５１、配列番号７のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号８のヌクレオチド８９〜１５０、配列番号９のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号１０のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１１のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１２のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１３のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１４のヌクレオチド９０〜１５０、および配列番号１５のヌクレオチド８９〜１４８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２からなる群から選択される配列を有することを特徴とする請求項６に記載の方法。
- ａ．配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５からなる群から選択される配列を有するＲＮＡ分子を提供する工程と、
ｂ．前記ＲＮＡ分子をＲＮアーゼＰで切断して、トランス−アミノアシル化触媒ＲＮＡ分子およびアミノアシル受容体ドメインを得る工程とを包含することを特徴とするトランスアミノアシル化触媒ＲＮＡ分子の獲得方法。 - ａ．ｔＲＮＡ様分子の５’末端に結合したリボザイム配列を含み、請求項６に記載の方法によって構築されたシス−アミノアシル化触媒ＲＮＡ分子を提供する工程と、
ｂ．前記ＲＮＡ分子と所望の天然又は非天然アミノ酸とを接触させる工程と、
ｃ．アミノアシル化ＲＮＡ分子を単離する工程とを包含し、前記アミノアシル化がｔＲＮＡ様分子の３’末端の位置にて起こることを特徴とする触媒ＲＮＡ分子のシス−アミノアシル化方法。 - ａ．請求項９に記載の方法によって獲得されたトランスアミノアシル化触媒ＲＮＡ分子を提供する工程と、
ｂ．ｔＲＮＡ様分子を提供する工程と、
ｃ．前記触媒ＲＮＡ分子およびｔＲＮＡ様分子と所望の天然または非天然アミノ酸とを接触させる工程と、
ｄ．アミノアシル化ｔＲＮＡ様分子を単離する工程とを包含することを特徴とするｔＲＮＡ様分子のトランスアミノアシル化方法。
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