ES2260219T3

ES2260219T3 - Derivados de peptidos apo-ai/aii.

Info

Publication number: ES2260219T3
Application number: ES01930664T
Authority: ES
Inventors: Tadahiko Kohno
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-04-21
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2021-04-23
Also published as: WO2001081376A3; DE60117781T2; EP1290013A2; ATE319737T1; EP1290013B1; PT1290013E; DE60117781D1; DK1290013T3; JP2003530870A; US6743778B2; WO2001081376A2; CA2407083A1; MXPA02010324A; AU5717301A; US20030040470A1; AU2001257173B2

Abstract

¿ Una composición de materia de la fórmula (A1)a¿F1¿(A2)b y multímeros de la misma, en donde: F1 es un dominio Fc; A1 y A2 se seleccionan cada uno independientemente de ¿(L1)c¿P1, ¿(L1)c¿P1¿(L2)d¿P2, ¿(L1)c¿P1¿(L2)d¿P2¿(L3)e¿P3, y ¿(L1)c¿P1¿(L2)d¿P2¿(L3)e¿P3¿(L4)f¿P4 P1, P2, P3, y P4 son cada uno independientemente secuencias del péptido de la hélice anfipática de la apolipoproteína AI (Apo¿AI) o dominios mimetizadores del péptido de la hélice anfipática Apo¿AI; L1, L2, L3, y L4 son cada uno independientemente enlazadores; y a, b, c, d, e, y f, son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que al menos uno de a y b es 1.

Description

Derivados de péptidos Apo-AI/AII.

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional U.S. No. 60/198.920, presentada el 21 de Abril de 2000.

Antecedentes de la invención

Existe necesidad de agentes terapéuticos recombinantes o modificados que tengan la actividad del péptido de la hélice anfipática Apo-AI.

Las proteínas recombinantes y modificadas son una clase emergente de agentes terapéuticos. Modificaciones útiles de agentes terapéuticos proteínicos incluyen combinación con el dominio "Fc" de un anticuerpo y enlace a polímeros tales como polietilenglicol (PEG) y dextrano. Tales modificaciones se exponen en detalle en una solicitud de patente titulada, "Péptidos Modificados como Agentes Terapéuticos", U.S. Ser. No. 09/428.082, solicitud PCT No. WO 99/25044, y se exponen también en WO 9734631.

Un enfoque muy diferente para el desarrollo de agentes terapéuticos es el escrutinio de genotecas de péptidos. La interacción de un ligando proteínico con su receptor tiene lugar a menudo en una interfase relativamente grande. Sin embargo, como se demuestra para la hormona del crecimiento humano y su receptor, sólo un pequeño número de residuos clave en la interfase contribuyen a la mayor parte de la energía de enlace. Clackson et al. (1995), Science 267:383-6. El grueso del ligando proteínico presenta simplemente los epítopes de enlace en la topología correcta o atiende a funciones no relacionadas con el enlace. Así, moléculas de longitud sólo de "péptido" (2 a 40 aminoácidos) pueden unirse a la proteína receptora de un gran ligando proteínico dado. Tales péptidos pueden mimetizar la bioactividad del ligando proteínico grande ("agonistas peptídicos") o, por enlace competitivo, inhibir la bioactividad del ligando proteínico grande ("antagonistas peptídicos").

Las genotecas de péptidos de presentación de fago han surgido como un método poderoso en la identificación de tales agonistas y antagonistas peptídicos. Véase, por ejemplo, Scott et al. (1990), Science 249:386; Devlin et al. (1990), Science 249:404; y los documentos U.S. Pat. No. 5.223.409, expedido el 29 de junio de 1993; U.S. Pat. No. 5.733.631, expedido el 31 de marzo de 1998; U.S. Pat. No. 5.498.530, expedido el 12 de marzo de 1996; U.S. Pat. No. 5.432.018, expedido el 11 de julio de 1995; U.S. Pat. No. 5.338.665, expedido el 16 de agosto de 1994; U.S. Pat. No. 5.922.545, expedido el 13 de julio de 1999; WO 96/40987, publicado el 19 de diciembre de 1996; y WO 98/15833, publicado el 16 de abril de 1998. En tales genotecas, se presentan secuencias peptídicas aleatorias por fusión con proteínas de recubrimiento de fago filamentoso. Típicamente, los péptidos presentados se eluyen por afinidad contra un dominio extracelular inmunizado con anticuerpos de un receptor. Los fagos retenidos pueden enriquecerse por tandas sucesivas de purificación por afinidad y repropagación. Los péptidos de fijación óptimos pueden secuenciarse para identificar residuos clave dentro de una o más familias de péptidos estructuralmente afines. Véase, v.g., Cwirla et al. (1997), Science 276; 1696-9, en cuyo trabajo se identificaron dos familias distintas. Las secuencias peptídicas pueden sugerir también qué residuos pueden reemplazarse en condiciones de seguridad por escaneo de alanina o por mutagénesis al nivel del DNA. Pueden crearse genotecas de mutagénesis y escrutarse para optimizar ulteriormente la secuencia de los fijadores óptimos. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24.

El análisis estructural de la interacción proteína-proteína puede utilizarse también para sugerir péptidos que mimetizan la actividad de fijación de los ligandos proteínicos grandes. En un análisis de este tipo, la estructura cristalina puede sugerir la identidad y orientación relativa de residuos críticos del ligando proteínico grande, a partir de los cuales puede diseñarse un péptido. Véase, v.g., Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15:1266-70. Estos métodos analíticos pueden utilizarse también para investigar la interacción entre una proteína receptora y péptidos seleccionados por presentación de fago, lo cual puede sugerir una modificación ulterior de los péptidos para aumentar la afinidad de fijación.

Otros métodos compiten con la presentación de fago en la investigación de péptidos. Una genoteca de péptidos puede fusionarse al término carboxilo del represor lac y expresarse en E. coli. Otro método basado en E. coli permite la presentación en la membrana exterior de la célula por fusión con una lipoproteína asociada a peptidoglicano (PAL). En lo sucesivo, se hace referencia colectivamente a estos métodos y métodos afines como "presentación de E. coli". En otro método, la traducción de RNA aleatorio se detiene antes de la liberación del ribosoma, dando como resultado una genoteca de polipéptidos con su RNA asociado todavía unido. En lo sucesivo, se hace referencia colectivamente a este método y métodos afines como "presentación de ribosoma". Otros métodos emplean péptidos enlazados a RNA; por ejemplo, la tecnología PROfusion, de Phylos, Inc. Véase, por ejemplo, Robert & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12297-303. En lo sucesivo, se hace referencia colectivamente a este método y métodos afines como "escrutinio RNA-péptido". Se han desarrollado genotecas de péptidos derivadas químicamente en las cuales los péptidos están inmovilizados sobre materiales estables, no biológicos, tales como varillas de polietileno o resinas permeables a disolventes. Otra genoteca de péptidos derivada químicamente utiliza fotolitografía para escanear péptidos inmovilizados sobre portaobjetos de vidrio. En lo sucesivo, se hace referencia colectivamente a estos métodos y métodos afines como "escrutinio químico-peptídico". El escrutinio químico-peptídico puede ser ventajoso por el hecho de que permite el uso de D-aminoácidos y otros análogos no naturales, así como elementos no peptídicos. Tanto los métodos biológicos como los químicos se revisan en Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3:355-62. Conceptualmente, pueden descubrirse péptidos mimetizadores de cualquier proteína utilizando presentación de fago, escrutinio RNA-péptido, y los otros métodos mencionados anteriormente.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a agentes terapéuticos que tienen actividad similar al péptido de la hélice anfipática Apo-AI pero con características farmacéuticas (v.g., semi-vida)mejores. De acuerdo con la presente invención, tales compuestos comprenden:

a): un péptido de la hélice anfipática Apo-AI o dominio mimetizador del péptido de la hélice anfipática Apo-AI, que tiene preferiblemente la secuencia de péptido de la hélice anfipática Apo-AI, o secuencias derivadas del mismo por presentación de fago, escrutinio RNA-péptido, o las otras técnicas arriba mencionadas; y

b): un vehículo, de acuerdo con la reivindicación 1, es decir un dominio Fc;

en donde el vehículo de acuerdo con la reivindicación 1 está unido covalentemente al péptido de la hélice anfipática Apo-AI o dominio mimetizador del péptido de la hélice anfipática Apo-AI. El vehículo de acuerdo con la reivindicación 1 y el péptido de la hélice anfipática Apo-AI o el dominio mimetizador del péptido de la hélice anfipática Apo-AI pueden estar unidos por el término N o C del péptido de la hélice anfipática Apo-AI o del dominio mimetizador del péptido de la hélice anfipática Apo-AI, como se describe con mayor detalle más adelante. El vehículo es un dominio Fc, y el dominio Fc preferido es un dominio Fc de IgG. Los dominios mimetizadores del péptido de la hélice anfipática Apo-AI pueden generarse por presentación de fago, escrutinio RNA-péptido y las otras técnicas mencionadas en esta memoria.

Adicionalmente de acuerdo con la presente invención se trata de un proceso para la fabricación de agentes terapéuticos que tienen la actividad del péptido de la hélice anfipática Apo-AI, que comprende:

a.: seleccionar al menos un péptido que tiene actividad del péptido de la hélice anfipática Apo-AI; y

b.: enlazar covalentemente dicho péptido a un vehículo.

El vehículo es un dominio Fc. El paso (a) se lleva a cabo preferiblemente por selección de SEQ ID NO: 7 o una secuencia aleatorizada de la misma por presentación de fago, escrutinio RNA-péptido, o las otras técnicas mencionadas en esta memoria.

Los compuestos de esta invención se pueden preparar por métodos de síntesis estándar, técnicas de DNA recombinante, y cualesquiera otros métodos de preparación de péptidos y proteínas de fusión. Los compuestos de esta invención que abarcan porciones no peptídicas pueden sintetizarse por reacciones estándar de química orgánica, además de las reacciones estándar de química de péptidos en caso aplicable.

El uso primario contemplado para los compuestos de esta invención es como agentes terapéuticos o profilácticos. El péptido enlazado a un vehículo puede tener actividad comparable a - o incluso mayor que - el ligando natural mimetizado por el péptido.

Los compuestos de esta invención pueden utilizarse para propósitos terapéuticos o profilácticos por formulación de los mismos con materiales vehículo farmacéuticos apropiados y administración de una cantidad eficaz a un paciente, tal como un humano (u otro mamífero) que se encuentre en necesidad de ello. Otros aspectos afines se incluyen también en la presente invención.

Numerosos aspectos y ventajas adicionales de la presente invención resultarán evidentes después de la consideración de las figuras y descripción detallada de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra dímeros Fc ilustrativos que pueden derivarse de un anticuerpo IgG1. "Fc" en la figura representa cualquiera de las variantes de Fc dentro del significado de "dominio Fc" en esta memoria. "X^{1}" y "X^{2}" representan péptidos o combinaciones enlazador-péptido como se definen más adelante en esta memoria. Los dímeros específicos son como sigue:

A, D: dímeros unidos por un solo disulfuro. Los anticuerpos IgG1 tienen típicamente dos enlaces disulfuro en la región bisagra entre los dominios constante y variable. El dominio Fc en las Figuras 2A y 2D puede estar formado por truncación entre los dos sitios de enlace disulfuro o por sustitución de un residuo cisteinilo con un residuo no reactivo (v.g., alanilo). En la Figura 2A, el dominio Fc está enlazado al termino amino de los péptidos; en 2D, al término carboxilo.

B, E: dímeros unidos por dos enlaces disulfuro. Este dominio Fc puede estar formado por truncación del anticuerpo parental de modo que retenga ambos residuos cisteinilo en las cadenas del dominio Fc o por expresión a partir de una construcción que incluye una secuencia que codifica un dominio Fc de este tipo. En la Figura 2B, el dominio Fc está enlazado al término amino de los péptidos; en 2E, al término carboxilo.

C, F: dímeros no covalentes. Este dominio Fc puede estar formado por eliminación de los residuos cisteinilo por truncación o sustitución. Puede ser deseable eliminar los residuos cisteinilo a fin de evitar las impurezas formadas por la reacción del residuo cisteinilo con residuos cisteinilo de otras proteínas presentes en la célula hospedadora. La unión no covalente de los dominios Fc es suficiente para mantener unido el dímero.

Otros dímeros pueden formarse utilizando dominios Fc derivados de tipos de anticuerpos diferentes (v.g., IgG2, IgM).

La Figura 2 muestra la estructura de compuestos preferidos de la invención que se caracterizan por repeticiones en tándem del péptido farmacológicamente activo. La Figura 2A muestra una molécula de una sola cadena y puede representar también la construcción de DNA para la molécula. La Figura 2B muestra un dímero en el cual la porción enlazador-péptido está presente solamente en una cadena del dímero. La Figura 2C muestra un dímero que tiene la porción peptídica en ambas cadenas. El dímero de la Figura 2C se formará espontáneamente en ciertas células hospedadoras después de la expresión de una construcción de DNA que codifica la cadena simple que se muestra en la Figura 3A. En otras células hospedadoras, las células podrían encontrarse en condiciones que favorezcan la formación de dímeros, o los dímeros pueden formarse in vitro.

La Figura 3 muestra secuencias ilustrativas de ácido nucleico y de aminoácidos (SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente) de Fc humano de IgG1 que pueden utilizarse en esta invención.

Descripción detallada de la invención Definición de Términos

Los términos utilizados a lo largo de esta memoria descriptiva se definen como sigue, a no ser que estén limitados de otro modo en casos específicos.

El término "que comprende" significa que un compuesto puede incluir aminoácidos adicionales en uno cualquiera o ambos términos N o C de la secuencia dada. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deben interferir significativamente con la actividad del compuesto.

El término "residuo ácido" hace referencia a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos ácidos. Residuos ácidos ilustrativos incluyen D y E.

El término "residuo aromático" hace referencia a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos aromáticos. Residuos aromáticos ilustrativos incluyen F, Y, y W.

El término "residuo básico" hace referencia a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos básicos. Residuos básicos ilustrativos incluyen H, K y R.

El término "residuo hidrófilo" hace referencia a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que comprenden grupos polares. Residuos hidrófilos ilustrativos incluyen C, S, T, N, y Q.

El término "residuo no funcional" hace referencia a residuos de aminoácidos en forma D o L que tienen cadenas laterales que carecen de grupos ácidos, básicos, o aromáticos. Residuos de aminoácidos neutros ilustrativos incluyen M, G, A, V, I, L y norleucina (Nle).

El término "vehículo" hace referencia a un dominio Fc.

El término "Fc nativo" hace referencia una molécula o secuencia que comprende la secuencia de un fragmento de fijación no antigénico resultante de la digestión de un anticuerpo entero, sea en forma monómera o en forma multímera. La fuente original de inmunoglobulina del Fc nativo es preferiblemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque se prefieren IgG1 e IgG2. Fc's nativos están constituidos por polipéptidos monómeros que pueden estar enlazados en formas dímeras o multímeras por asociación covalente (a saber, enlaces disulfuro) y asociación no covalente. El número de uniones intermoleculares disulfuro entre las subunidades monómeras de las moléculas de Fc nativo está comprendido entre 1 y 4 dependiendo de la clase (v.g., IgG, IgA, IgE) o subclase (v.g., IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgA2). Un ejemplo de un Fc nativo es un dímero unido por disulfuro resultante de la digestión con papaína de una IgG (véase Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). El término "Fc nativo" tal como se utiliza en esta memoria es genérico para las formas monómeras, dímeras, y multímeras.

El término "variante de Fc" hace referencia a una molécula o secuencia que está modificada a partir de un Fc nativo pero comprende todavía un sitio de unión para el receptor de salvamento, FcRn. Las solicitudes internacionales WO 97/34631 (publicada el 25 de septiembre de 1997) y WO 96/32478 describen variantes ilustrativas de Fc, así como la interacción con receptor de salvamento, y se incorporan en esta memoria por referencia en su totalidad. Así pues, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que está humanizada a partir de un
Fc nativo no humano. Adicionalmente, un Fc nativo comprende sitios que pueden eliminarse debido a que proporcionan características estructurales o actividad biológica que no se requieren para las moléculas de fusión de la presente invención. Así, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos Fc nativos que afectan o están implicados en (1) formación de enlaces disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula hospedadora seleccionada, (3) heterogeneidad N-terminal por expresión en una célula hospedadora seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con el complemento, (6) fijación a un receptor Fc distinto de un receptor de salvamento, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Variantes de Fc se describen con mayor detalle más adelante en esta memoria.

El término "dominio Fc" abarca moléculas de Fc nativo y variantes de Fc y secuencias como se definen anteriormente. Como en el caso de las variantes de Fc y Fc's nativas, el término "dominio Fc" incluye moléculas en forma monómera o multímera, tanto si están digeridas a partir del anticuerpo entero como si se producen por otros medios.

El término "multímero" tal como se aplica a los dominios Fc o moléculas que comprende dominios Fc hace referencia a moléculas que tienen dos o más cadenas de polipéptido asociadas covalentemente, no covalentemente, o a la vez por interacciones covalentes y no covalentes. Las moléculas IgG forman típicamente dímeros; IgM, pentámeros; IgD, dímeros; e IgA, monómeros, dímeros, trímeros, o tetrámeros. Los multímeros pueden formarse por aprovechamiento de la secuencia y actividad resultante de la fuente nativa de Ig del Fc o por derivatización (como se define más adelante) de un Fc nativo de este tipo.

El término "dímero", tal como se aplica a los dominios Fc o moléculas que comprenden dominios Fc hace referencia a moléculas que tienen dos cadenas de polipéptido asociadas covalentemente o no covalentemente. Así, dímeros ilustrativos dentro del alcance de esta invención son como se muestra en la Figura 2.

Los términos "derivatización" y "derivado" o "derivatizado" comprenden procesos y compuestos resultantes efectivamente en los cuales (1) el compuesto tiene una porción cíclica; por ejemplo, reticulación entre residuos cisteinilo dentro del compuesto; (2) el compuesto está reticulado o tiene un sitio de reticulación; por ejemplo, el compuesto tiene un residuo cisteinilo y forma por tanto dímeros reticulados en cultivo o in vivo; (3) uno o más enlaces peptídicos está(n) reemplazado(s) por un enlace no peptídico; (4) el término N está reemplazado por -NRR^{1}, NRC(O)R^{1}, -NRC(O)OR^{1}, -NRS(O)_{2}R^{1}, -NHC(O)NHR, un grupo succinimida, o benciloxicarbonil-NH- sustituido o no sustituido, en donde R y R^{1} y los sustituyentes del anillo son como se define más adelante en esta memoria; (5) el término C está reemplazado por -C(O)R^{2} o -NR^{3}R^{4}, en donde R^{2}, R^{3} y R^{4} son como se define más adelante en esta memoria; y (6) compuestos en los cuales restos individuales de aminoácido están modificados por tratamiento con agentes capaces de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales. Los derivados se describen con mayor detalle más adelante en esta memoria.

El término "péptido" hace referencia a moléculas de 3 a 40 aminoácidos, siendo preferidas las moléculas de 5 a 60 aminoácidos. Péptidos ilustrativos pueden comprender el péptido de la hélice anfipática Apo-AI, péptidos que tienen uno o más residuos del péptido de la hélice anfipática Apo-AI aleatorizados, o péptidos que comprenden secuencias aleatorizadas.

El término "aleatorizado" tal como se utiliza para hacer referencia a secuencias peptídicas se refiere a secuencias totalmente aleatorias (v.g., seleccionadas por métodos de presentación de fago o escrutinio RNA-péptido) y secuencias en las cuales uno o más residuos de una molécula existente naturalmente se ha(n) reemplazado por un residuo de aminoácido que no aparece en dicha posición en la molécula existente naturalmente. Métodos ilustrativos para identificación de secuencias peptídicas incluyen presentación de fago, presentación de E. coli, presentación de ribosoma, escrutinio RNA-péptido, escrutinio químico, y análogos.

La expresión "mimetizador del péptido de la hélice anfipática Apo-AI" hace referencia a una molécula que aumenta o disminuye uno o más parámetros del ensayo de actividad del péptido de la hélice anfipática Apo-AI como lo hace el péptido de la hélice anfipática Apo-AI.

La expresión "antagonista del péptido de la hélice anfipática Apo-AI" hace referencia a una molécula que aumenta o disminuye uno o más parámetros de ensayo en sentido contrario al efecto sobre dichos parámetros causado por el péptido de la hélice anfipática Apo-AI.

Adicionalmente, están abarcadas en esta memoria las sales fisiológicamente aceptables de los compuestos de esta invención. El término "sales fisiológicamente aceptables" hace referencia a cualesquiera sales que son conocidas o que se descubran más adelante como farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos específicos son: acetato, trifluoroacetato, hidrohaluros, tales como hidrocloruro e hidrobromuro; sulfato; citrato; tartrato; glicolato; y oxalato.

Estructura de los compuestos

En general. Secuencias de aminoácidos que se unen al péptido de la hélice anfipática Apo-AI se describen en Spinivas et al., 1990, Virology 176: 48-57; Owens et al. (1990), J. Clin. Invest. 86: 1142-1150; Méndez et al. (1994), J. Clin. Invest. 94 (4): 1698-1705; Sprinivas et al. (1991), J. Cell. Biochem. 45 (2): 224-237, y en el documento US-A-6046166.

Los autores de la presente invención han identificado secuencias particulares preferidas conocidas o existentes naturalmente. Estas secuencias pueden aleatorizarse por las técnicas mencionadas anteriormente por las cuales pueden cambiarse uno o más aminoácidos manteniendo o incluso mejorando la afinidad de fijación del péptido.

En las composiciones de materia preparadas de acuerdo con esta invención, el péptido puede estar unido al vehículo por el término N o el término C del péptido. Así, las moléculas vehículo-péptido de esta invención pueden describirse por la fórmula I siguiente:

I(A^{1})_{a}-F^{1}-(A^{2})_{b}

en la cual:

F^{1} es un dominio Fc;

A^{1} y A^{2} se seleccionan cada uno independientemente de -(L^{1})_{c}-P^{1}, -(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}, -(L^{3})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}-(L^{3})_{e}-P^{3}, y -(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}-(L^{3})_{e}-P^{3}-(L^{4})_{f}-P^{4};

P^{1}, P^{2}, P^{3} y P^{4} son cada uno independientemente secuencias del péptido de la hélice anfipática Apo-AI o dominios mimetizadores del péptido de la hélice anfipática Apo-AI;

L^{1}, L^{2}, L^{3} y L^{4} son cada uno independientemente iniciadores; y

a, b, c, d, e, y f son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que al menos uno de a y b es 1.

Así, el compuesto I comprende compuesto preferidos de la fórmula II

IIA^{1}-F^{1}

y multímeros de las mismas en los cuales F^{1} es dominio Fc y está unido al término C de A^{1};

IIIF^{1}-A^{2}

y multímeros de la misma en los cuales F^{1} es un dominio Fc y está unido al término N de A^{2};

IVF^{1}-(L^{1})_{c}-P^{1}

y multímeros de la misma en los cuales F^{1} es un dominio Fc y está unido al término N de -(L^{1})_{c}-P^{1}; y

VF^{1}-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}

y multímeros de la misma en los cuales F^{1} es un dominio Fc y está unido al término N de -L^{1}-P^{1}-L^{2}-P^{2}.

Péptidos. Puede utilizarse cualquier número de péptidos en asociación con la presente invención. Los péptidos pueden comprender parte de la secuencia de proteínas existentes naturalmente, pueden ser secuencias aleatorizadas derivadas de la secuencia de las proteínas existentes naturalmente, o pueden ser secuencias totalmente aleatorizadas. La presentación de fago y el escrutinio RNA-péptido, en particular, son útiles en la generación de péptidos para uso en la presente invención.

Una secuencia de péptido particularmente interesante tiene la fórmula

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu Ala Phe

(SEQ ID NO:7)

Moléculas de esta invención que incorporan estas secuencias peptídicas pueden prepararse por métodos conocidos en la técnica. Cualesquiera de estos péptidos pueden estar enlazados en tándem (es decir, secuencialmente), con o sin enlazadores, proporcionándose varios ejemplos enlazados en tándem en la Tabla 2. Cualquier péptido que contenga un residuo cisteinilo puede reticularse con otro péptido que contenga Cys, pudiendo estar enlazados uno cualquiera de ellos o ambos a un vehículo. Asimismo, cualquier péptido que tenga más de un residuo Cys puede formar un enlace disulfuro intrapeptídico, Cualquiera de estos péptidos puede derivatizarse como se describe más adelante en esta memoria.

Secuencias peptídicas adicionales útiles pueden resultar de modificaciones conservadoras y/o no conservadoras de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

\newpage

Las modificaciones conservadoras producirán péptidos que tienen características funcionales y químicas similares a las del péptido en el que se han hecho tales modificaciones. En contraste, modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de los péptidos pueden realizarse seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoácidos que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura de la cadena molecular principal en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación en hoja o helicoidal, (b) la carga o carácter hidrófobo de la molécula en el sitio diana, o (c) el tamaño de la molécula.

Por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácido" puede implicar una sustitución de un residuo nativo de aminoácido con un residuo no nativo de tal modo que se produzca poco o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del residuo de aminoácido en dicha posición. Adicionalmente, cualquier residuo nativo en el polipéptido puede sustituirse también con alanina, como se ha descrito previamente para la "mutagénesis por barrido de alanina" (véase, por ejemplo, MacLennan et al., (1998), Acta Physiol. Scand. Suppl. 643: 55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24, que exponen la mutagénesis por barrido de alanina).

Sustituciones de aminoácidos deseadas (sean conservadoras o no conservadoras) pueden ser determinadas por los expertos en la técnica en el momento en que se deseen dichas sustituciones. Por ejemplo, pueden utilizarse sustituciones de aminoácidos para identificar residuos importantes de la secuencia peptídica, o para aumentar o disminuir la afinidad del péptido o de las moléculas vehículo-péptido (véanse las fórmulas precedentes) descritas en esta memoria. Sustituciones ilustrativas de aminoácidos se exponen en la Tabla 1.

TABLA 1 Sustituciones de aminoácidos

Residuos Originales	Sustituciones Ilustrativas	Sustituciones Preferidas
Ala(A)	Val, Leu, Ile	Val
Arg(R)	Lys, Gln, Asn	Lys
Asn(N)	Gln	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
Cys(C)	Ser, Ala	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro, Ala	Ala
His(H)	Asn, Gln, Lys, Arg	Arg
Ile(I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina	Leu
Leu(L)	Norleucina, Ile, Val Met, Ala, Phe	Ile
Lys(K)	Arg, Ácido 1,4-diamino-butírico, Gln, Asn	Arg
Met(M)	Leu, Phe, Ile	Leu
Phe(F)	Leu, Val, Ile, Ala, Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Gly
Ser(S)	Thr, Ala Cys	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr, Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val(V)	Ile, Met, Leu, Phe Ala, Norleucina	Leu

En ciertas realizaciones, las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden abarcar también residuos de aminoácidos no existentes naturalmente que se incorporan típicamente por síntesis química de péptidos en lugar de hacerlo por síntesis en sistemas biológicos.

Como se ha indicado en la sección precedente "Definición de Términos", los residuos existentes naturalmente pueden dividirse en clases basándose en propiedades comunes de las cadenas laterales que pueden ser útiles para modificaciones de la secuencia. Por ejemplo, sustituciones no conservadoras pueden implicar el cambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse en regiones de péptido que son homólogas con ortólogos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula. Adicionalmente, pueden hacerse también modificaciones utilizando P o G para el propósito de influir en la orientación de la cadena.

Al hacer tales modificaciones, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. Se ha asignado a cada aminoácido un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga siendo éstos: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5).

La importancia del índice hidropático de los aminoácidos en lo que respecta a conferir una función biológica interactiva en una proteína es conocida en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Es sabido que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tengan un índice o registro hidropático similar, reteniendo todavía una actividad biológica similar. En la realización de cambios basados en el índice hidropático, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de \pm 2, siendo particularmente preferidos aquéllos que están dentro de \pm 1, y siendo aún más particularmente preferidos aquéllos que están dentro de \pm 0,5.

Se conoce también en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse eficazmente sobre la base del carácter hidrófilo. El carácter hidrófilo medio local máximo de una proteína, tal como viene determinado por el carácter hidrófilo de sus aminoácidos adyacentes, está en correlación con su inmunogenicidad y su antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.

Se han asignado a los residuos de aminoácidos los valores de carácter hidrófilo siguientes: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm 1); glutamato (+ 3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2) glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3), valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). En la realización de cambios basados en valores de carácter hidrófilo similares, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de carácter hidrófilo están dentro de \pm2, siendo particularmente preferidos aquéllos que están dentro de \pm1, y siendo aún más particularmente preferidos aquéllos que están dentro de \pm0,5. Es posible también identificar epítopes a partir de secuencias primarias de aminoácidos basándose en el carácter hidrófilo. Se hace referencia también a estas regiones como "regiones epitópicas centrales ".

Un profesional experto será capaz de determinar variantes adecuadas del polipéptido como se exponen en las secuencias que anteceden utilizando técnicas bien conocidas. Para identificación de áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destrucción de la actividad, un experto en la técnica puede direccionar áreas que no se consideran importantes para la actividad. Por ejemplo, cuando se conocen polipéptidos similares con actividades similares de la misma especie o de otras especies, un experto en la técnica puede comparar la secuencia de aminoácidos de un péptido con péptidos similares. Con una comparación de este tipo, es posible identificar residuos y porciones de las moléculas que están conservadas entre polipéptidos similares. Se comprenderá que los cambios en áreas de un péptido que no están conservadas con relación a péptidos similares de este tipo tendrían menos probabilidad de afectar desfavorablemente a la actividad biológica y/o la estructura del péptido. Un experto en la técnica conocería también que, incluso en regiones relativamente conservadas, es posible emplear aminoácidos químicamente similares en sustitución de los residuos existentes naturalmente con mantenimiento de la actividad (sustituciones por residuos de aminoácidos conservadores). Por esta razón, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones conservadoras de aminoácidos sin destruir la actividad biológica o sin afectar desfavorablemente a la estructura del péptido.

Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar estudios estructura-función que identifican residuos en péptidos similares que son importantes para la actividad o la estructura. Teniendo presente una comparación de este tipo, es posible predecir la importancia de los residuos de aminoácidos en un péptido que corresponden a residuos de aminoácidos que son importantes para la actividad o la estructura en péptidos similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácidos de los péptidos predichos como importantes.

Un experto en la técnica puede analizar también la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con dicha estructura en polipéptidos similares. A la vista de dicha información, un experto en la técnica puede predecir la alineación de los residuos de aminoácidos de un péptido con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la técnica puede elegir no hacer cambios radicales en residuos de aminoácidos que se predice se encuentran en la superficie de la proteína, dado que tales residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de ensayos que contengan una sustitución de un solo aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes pueden escrutarse luego utilizando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la técnica. Tales datos podrían utilizarse para recoger información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un residuo de aminoácido particular da como resultado una actividad destruida, reducida indeseablemente, o inadecuada, deberían evitarse las variantes que contengan dicho cambio. Dicho de otro modo, basándose en la información recopilada a partir de tales experimentos de rutina, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos en los que deberían evitarse sustituciones ulteriores, sea solas o en combinación con otras mutaciones.

Varias publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. In Biotech., 7 (4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13 (2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113 (2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26: 367-384 (1979). Además, están disponibles actualmente programas de ordenador para ayudar a la predicción de la estructura secundaria. Un método de predicción de la estructura secundaria está basado en modelización de homologías. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor que 30%, o semejanza mayor que 40% tienen a menudo topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructurales de proteínas (PDB) ha proporcionado una predictibilidad mejorada de la estructura secundaria, con inclusión del número potencial de pliegues dentro de la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27 (1): 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 7 (3): 369-376 (1997)) que existen un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado(a) y que, una vez que se han resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural ganará espectacularmente en exactitud.

Métodos adicionales de predicción de la estructura secundaria incluyen el "ensartado" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol. 7 (3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4 (1): 15-9 (1996)), "análisis de perfiles" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Met. Enzym. 183: 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (13): 4355-8 (1987)), y "enlace evolutivo" (véase Home, supra, y Brenner supra.

Vehículos. Esta invención requiere la presencia de al menos un vehículo (F^{1}) unido a un péptido a través del término N, el término C o una cadena lateral de uno de los residuos de aminoácidos.

Un dominio Fc es el vehículo. El domino Fc puede estar fusionado a los términos N o C de los péptidos o a ambos términos N y C. Se prefiere la fusión al término N.

Como se ha indicado arriba, las variantes de Fc son vehículos adecuados dentro del alcance de esta invención. Un Fc nativo puede modificarse extensamente para formar una variante de Fc de acuerdo con esta invención, con tal que se mantenga la unión al receptor de salvamento; véanse, por ejemplo, los documentos WO 97/34631 y WO 96/32478. En tales variantes de Fc, pueden eliminarse uno o más sitios de un Fc nativo que proporcionan características estructurales o actividad funcional no requeridas por las moléculas de fusión de esta invención. Es posible eliminar estos sitios, por ejemplo, por sustitución o deleción de residuos, inserción de residuos en el sitio, o truncación de porciones que contienen el sitio. Los residuos insertados o sustituidos pueden ser también aminoácidos alterados, tales como mimetizadores de péptidos o D-aminoácidos. Las variantes de Fc pueden ser deseables por diversas razones, varias de
las cuales se describen a continuación. Variantes de Fc ilustrativas incluyen moléculas y secuencias en las cuales:

1.: Se eliminan los sitios implicados en la formación de enlaces disulfuro. Dicha eliminación puede evitar la reacción con otras proteínas que contengan cisteína presentes en la célula hospedadora utilizada para producir las moléculas de la invención. Para este propósito, puede truncarse el segmento que contiene cisteína en el término N o los residuos cisteína pueden delecionarse o sustituirse con otros aminoácidos (v.g., alanilo, serilo). En particular, es posible truncar el segmento de 20 aminoácidos N-terminal de SEQ ID NO: 2 o delecionar o sustituir los residuos cisteína en las posiciones 7 y 10 de SEQ ID NO: 2. Incluso cuando se eliminan residuos cisteína, los dominios Fc de una sola cadena pueden formar todavía un dominio Fc dímero que se mantiene unido de modo no covalente.

2.: Se modifica un Fc nativo para hacerlo más compatible con una célula hospedadora seleccionada. Por ejemplo, es posible eliminar la secuencia PA cerca del término N de un Fc típico nativo, que puede ser reconocido por una enzima digestiva en E. coli tal como prolina-iminopeptidasa. También es posible añadir un residuo metionina N-terminal, especialmente cuando la molécula se expresa recombinantemente en una célula bacteriana tal como E. coli. El dominio Fc de SEQ ID NO: 2 es una variante Fc de este tipo.

3.: Se elimina una porción del término N de un Fc nativo para prevenir la heterogeneidad N-terminal cuando se expresa en una célula hospedadora seleccionada. Para este propósito, puede delecionarse cualquiera de los 20 primeros residuos de aminoácidos en el término N, particularmente los que se encuentran en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5.

4.: Se eliminan uno o más sitios de glicosilación. Los residuos que están glicosilados típicamente (v.g., asparagina) pueden conferir respuesta citolítica. Tales residuos pueden delecionarse o sustituirse por residuos no glicosilados (v.g. alanina).

5.: Se eliminan los sitios implicados en interacción con el complemento, tales como el sitio de fijación C1q. Por ejemplo, es posible seleccionar o sustituir la secuencia EKK de la IgG1 humana. El reclutamiento del complemento puede no ser ventajoso para las moléculas de esta invención, y por tanto puede evitarse con una variante de Fc de este tipo.

6.: Se eliminan los sitios que afectan a la fijación a receptores de Fc distintos de un receptor de salvamento. Un Fc nativo puede tener sitios para interacción con ciertas células blancas de la sangre que no son necesarias para las moléculas de fusión de la presente invención y por consiguiente pueden eliminarse.

7.: Se elimina el sitio ADCC. Los sitios ADCC son conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) con relación a los sitios ADCC en IgG1. Estos sitios tampoco son necesarios para las moléculas de fusión de la presente invención y por tanto pueden eliminarse.

8.: Cuando el Fc nativo se deriva de un anticuerpo no humano, el Fc nativo puede humanizarse. Típicamente, para humanizar un Fc nativo, se sustituirán residuos seleccionados en el Fc nativo no humano con residuos que se encuentran normalmente en el Fc nativo humano. Los métodos para humanización de anticuerpos son bien conocidos en la técnica.

Variantes de Fc preferidas incluyen las siguientes. En SEQ ID NO: 2 (Figuras 3A y 3B) la leucina de la posición 15 puede sustituirse con glutamato; el glutamato en la posición 99, con alanina; y las lisinas en las posiciones 101 y 103, con alaninas. Adicionalmente, uno o más residuos tirosina pueden reemplazarse por residuos fenilalanina.

Enlazadores. Cualquier grupo "enlazador" es opcional. Cuando está presente, su estructura química no es crítica, dado que sirve fundamentalmente como separador. El enlazador está constituido preferiblemente por aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. Así, en realizaciones preferidas, el enlazador está constituido por 1 a 20 aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, en los cuales los aminoácidos se seleccionan de los 20 aminoácidos existentes naturalmente. Algunos de estos aminoácidos pueden estar glicosilados, como es bien conocido por los expertos en la técnica. En una realización más preferida, los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina, y lisina. De modo todavía más preferible, un enlazador está constituido por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedimento estérico, tales como glicina y alanina. Así, enlazadores preferidos son poliglicinas (particularmente (Gly)_{4}, (Gly)_{5}), poli(Gly-Ala), y polialaninas. Otros ejemplos específicos de enlazadores son:

	(Gly)_{3}Lys(Gly)_{4}	(SEQ ID NO: 3);

	(Gly)_{3}AsnGlySer(Gly)_{2}	(SEQ ID NO: 4);

	(Gly)_{3}Cys(Gly)_{4}	(SEQ ID NO: 5);

y

GlyProAsnGlyGly

(SEQ ID NO: 6).

Para explicar la nomenclatura anterior, por ejemplo, (Gly)_{3}Lys(Gly)_{4} significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 3). Los enlazadores de un solo aminoácido (v.g., -Ala- o -Gly-) son enlazadores preferidos, y son también preferidas combinaciones de Gly y Ala. Los enlazadores que se muestran en esta memoria son ilustrativos; los enlazadores comprendidos dentro del alcance de esta invención pueden ser mucho más largos y pueden incluir otros residuos.

Son también posibles enlazadores no peptídicos. Por ejemplo, podrían utilizarse enlazadores alquílicos tales como -NH-(CH_{2})_{s}-C(O)-, donde s = 2-20. Estos enlazadores alquílicos pueden estar sustituidos ulteriormente con cualquier grupo que no presente impedimento estérico tal como alquilo inferior (v.g., C_{1}-C_{6}), acilo inferior, halógeno (v.g., Cl, Br), CN, NH_{2}, fenilo, etc. Un enlazador no peptídico ilustrativo es un enlazador PEG,

VI

1

en donde n es tal que el enlazador tiene un peso molecular de 100 a 5000 kD, preferiblemente 100 a 500 kD. Los enlazadores peptídicos pueden alterarse para formar derivados de la misma manera que se ha descrito arriba.

Derivados. Los inventores contemplan también la derivatización de la porción de péptido y/o vehículo de los compuestos. Tales derivados pueden aumentar la solubilidad, absorción, semi-vida biológica, etcétera, de los compuestos. Los restos pueden eliminar o atenuar alternativamente cualquier efecto secundario indeseable de los compuestos, etcétera. Derivados ilustrativos incluyen compuestos en los cuales:

1.: El compuesto o alguna porción del mismo es cíclico. Por ejemplo, la porción del péptido puede modificarse para contener dos o más residuos Cys (v.g., en el enlazador), que podrían ciclarse por formación de enlaces disulfuro.

2.: El compuesto está reticulado o se ha hecho susceptible de reticulación entre moléculas. Por ejemplo, la porción del péptido puede modificarse de modo que contenga un residuo Cys y con ello sea capaz de formar un enlace disulfuro intermolecular con una molécula semejante. El compuesto puede reticularse también a través de su término C, como en la molécula que se muestra a continuación.

: VII

2

3.: Uno o más eslabones (enlaces) peptídicos [-C(O)NR-] se reemplaza por un eslabón no peptídico. Eslabones ilustrativos no peptídicos son -CH_{2}- carbamato [-CH_{2}-OC(O)NR-], fosfonato, -CH_{2}-sulfonamida [-CH_{2}-S(O)_{2}NR-], urea [-NHC(O)NH-], -CH_{2}-amina secundaria, y péptido alquilado [-C(O)NR^{6}- en donde R^{6} es alquilo inferior].

4.: El término N está derivatizado. Típicamente, el término N puede acilarse o modificarse para dar una amina sustituida. Grupos derivados N-terminales ilustrativos incluyen -NRR^{1} (distinto de -NH_{2}), -NRC(O)R^{1}, -NRC(O)OR^{1}, -NRS(O)_{2}R^{1}, -NHC(O)NHR^{1}, succinimida, o benciloxicarbonil-NH- (CBZ-NH-), en donde R y R^{1} son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo inferior, y en donde el anillo fenilo puede estar sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo constituido por alquilo C_{1}-C_{4}, alcoxi C_{1}-C_{4}, cloro, y bromo.

5.: El término C libre está derivatizado. Típicamente, el término C está esterificado o amidado. Grupos derivados C-terminales ilustrativos incluyen, por ejemplo, -C(O)R^{2} en donde R^{2} es alcoxi inferior o -NR^{3}R^{4} en donde R^{3} y R^{4} son independientemente hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{8} (preferiblemente alquilo C_{1}-C_{4}).

6.: Un enlace disulfuro está reemplazado con otro resto reticulador, preferiblemente más estable (v.g., un alquileno). Véase, v.g., Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9.

7.: Uno o más residuos de aminoácidos individuales está(n) modificado(s). Se conocen diversos agentes de derivatización que reaccionan específicamente con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados, como se describe en detalle más adelante.

Los residuos lisinilo y residuos amino terminales pueden hacerse reaccionar con anhídrido succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos, que invierten la carga de los residuos lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatización de residuos que contienen grupos alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacción con glioxilato catalizada por transaminasas.

Los residuos arginilo pueden modificarse por reacción con uno cualquiera o una combinación de varios reactivos convencionales, que incluyen fenil-glioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivatización de los residuos arginilo requiere que la reacción se lleve a cabo en condiciones alcalinas, debido al alto pKa del grupo funcional guanidino. Adicionalmente, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como con el grupo epsilon-amino de la arginina.

La purificación específica de los residuos tirosilo ha sido estudiada extensamente, con interés particular en la introducción de marcadores espectrales en los residuos tirosilo por reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Más generalmente, se utilizan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil-tirosilo y 3-nitroderivados, respectivamente.

Los grupos de cadena lateral carboxilo (aspartilo o glutamilo) pueden modificarse selectivamente por reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R') tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)-carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)-carbodiimida. Adicionalmente, los residuos aspartilo y glutamilo pueden convertirse en residuos asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones amonio.

Los residuos glutaminilo y asparaginilo pueden desamidarse para dar los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones moderadamente ácidas. Cualquier forma de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención.

Los residuos cisteinilo pueden reemplazarse por residuos de aminoácidos u otros restos, sea para eliminar enlaces disulfuro o, inversamente, para estabilizar la reticulación. Véase, v.g., Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39:
3814-9.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticulación de los péptidos o sus derivados funcionales a una matriz soporte insoluble en agua o a otros vehículos macromoleculares. Agentes de reticulación utilizados comúnmente incluyen, v.g., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, aldehído glutárico, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, que incluyen ésteres de disuccinimidoílo tales como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Agentes de derivatización tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato producen compuestos intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de luz. Alternativamente, matrices reactivas insolubles en agua tales como carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las Patentes U.S. Núms. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 se emplean para inmovilización de proteínas.

Los grupos carbohidrato (oligosacáridos) pueden fijarse convenientemente a sitios que se sabe son sitios de glicosilación en las proteínas. Generalmente, los oligosacáridos enlazados en O se fijan a los residuos serina (Ser) o treonina (Thr), mientras que los oligosacáridos enlazados en N se fijan a los residuos asparagina (Asn) cuando los mismos forman parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferiblemente uno de los 19 aminoácidos existentes naturalmente distintos de la prolina. Las estructuras de los oligosacáridos enlazados en N o enlazados en O y los residuos azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es el ácido N-acetilneuramínico (al que se hace referencia como ácido siálico). El ácido siálico es usualmente el residuo terminal tanto de los oligosacáridos enlazados en N como de los enlazados en O y, en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas al compuesto glicosilado. Dicho o dichos sitios pueden incorporarse en el enlazador de los compuestos de esta invención y son glicosilados preferiblemente por una célula durante la producción recombinante de los compuestos polipéptidos (v.g., en células de mamífero tales como CHO, BHK, COS). Sin embargo, tales sitios pueden glicosilarse adicionalmente por procedimientos sintéticos o semi-sintéticos conocidos en la técnica.

Otras posibles modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, oxidación del átomo de azufre en Cys, metilación de los grupos alfa-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina. Creighton, Proteins:Structure and Molecule Properties (W.H. Freeman & Co,. San Francisco), pp. 79-86 (1983).

Los compuestos de la presente invención pueden cambiarse asimismo al nivel del DNA. La secuencia de DNA de cualquier porción del compuesto puede cambiarse a codones más compatibles con la célula hospedadora seleccionada. Para E. coli, que es la célula hospedadora preferida, los codones optimizados se conocen en la técnica. Los codones pueden estar sustituidos para eliminar sitios de restricción o para incluir sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar al procesamiento del DNA en la célula hospedadora seleccionada. Las secuencias de vehículo, enlazador y DNA peptídico pueden modificarse para incluir cualquiera de los cambios de secuencia que anteceden.

Métodos de Producción

Los compuestos de esta invención pueden producirse en gran parte en células hospedadoras transformadas utilizando técnicas de DNA recombinantes. Para hacer esto, se prepara una molécula de DNA recombinante que codifica el péptido. Métodos de preparación de tales moléculas de DNA son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias que codifican los péptidos podrían escindirse del DNA utilizando enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de DNA podría sintetizarse utilizando técnicas de síntesis química, tal como el método del fosforamidato. Asimismo, podría utilizarse una combinación de estas técnicas.

La invención incluye también un vector capaz de expresar los péptidos en un hospedador apropiado. El vector comprende la molécula de DNA que codifica los péptidos enlazados(as) operativamente a secuencias apropiadas de control de la expresión. Métodos de realización de este enlace operativo, sea antes o después de insertar la molécula de DNA en el vector, son bien conocidos. Secuencias de control de la expresión incluyen promotores, activadores, intensificadores, operadores, sitios de fijación de ribosoma, señales de iniciación, señales de parada, señales de formación de casquete, señales de poliadenilación, y otras señales implicadas con el control de la transcripción o la traducción.

El vector resultante que tiene la molécula de DNA en el mismo se utiliza para transformar un hospedador apropiado. Esta transformación puede realizarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

Cualquiera de un gran número de células hospedadoras disponibles y bien conocidas puede utilizarse en la práctica de esta invención. La selección de un hospedador particular depende de varios factores reconocidos por la técnica. Éstos incluyen, por ejemplo, compatibilidad con el vector de expresión seleccionado, toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de DNA, tasa de transformación, facilidad de recuperación de los péptidos, características de expresión, bio-seguridad y costes. puede Tiene que encontrarse un balance de estos factores, en el entendimiento de que no todos los hospedadores pueden ser igualmente eficaces para la expresión de una secuencia de DNA particular. Dentro de estas líneas orientativas generales, hospedadores microbianos útiles incluyen bacterias (tales como E. coli sp.), levaduras (tales como Sacharomyces sp.) y otros hongos, insectos, plantas, células de mamífero (con inclusión de células humanas), u otros hospedadores conocidos en la técnica.

A continuación, el hospedador transformado se cultiva y se purifica. Las células hospedadoras pueden cultivarse en condiciones convencionales de fermentación de tal modo que se expresen los compuestos deseados. Tales condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Finalmente, los péptidos se purifican del cultivo por métodos bien conocidos en la técnica.

Los compuestos pueden producirse también por métodos de síntesis. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas de síntesis en fase sólida. Métodos adecuados son bien conocidos en la técnica, e incluyen los descritos en Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis y Panayotis, compiladores); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 1149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart y Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis, Pat. U.S. No. 3.941.763; Finn et al. (1976), The Proteins (3ª edición) 2: 105-253; y Erickson et al. (1976), The Proteins (3ª edición) 2: 257-527. La síntesis en fase sólida es la técnica preferida de producción de péptidos individuales, dado que es el método de producción de péptidos pequeños más eficaz en costes.

Los compuestos que contienen péptidos derivatizados o que contienen grupos no peptídicos pueden sintetizarse por técnicas bien conocidas de química orgánica.

Usos de los Compuestos

Los compuestos de esta invención tienen actividad farmacológica resultante de su actividad mimética del péptido de la hélice anfipática Apo-AI.

Los agonistas o mimetizadores del péptido de la hélice anfipática Apo-AI son útiles en el tratamiento de:

\bullet: hipercolesterolemia

\bullet: infección vírica, particularmente infección por HSV y HIV;

etcétera.

Composiciones Farmacéuticas

En general. La presente invención proporciona también métodos de utilización de composiciones farmacéuticas de los compuestos de la invención. Tales composiciones farmacéuticas pueden estar destinadas a administración por inyección, o para administración oral, pulmonar, nasal, transdérmica u otras formas de administración. En general, la invención abarca composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades eficaces de un compuesto de la invención junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes con contenido de tampón (v.g., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y concentración iónica diversos; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (v.g., Tween 80, Polysorbate 80), antioxidantes (v.g., ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), conservantes (v.g., Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias aumentadoras de volumen (v.g., lactosa, manitol); incorporación del material en preparaciones particuladas de compuestos polímeros tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc. o en liposomas. También puede utilizarse ácido hialurónico, y éste puede tener el efecto de promover una duración prolongada en la circulación. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo, y la tasa de aclaramiento in vivo de las/los presentes proteínas y derivados. Véase, v.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, Edición 18ª (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), páginas 1435-1712. Las composiciones se pueden preparar en forma líquida, o pueden encontrarse en forma de polvo seco, tal como la forma liofilizada. Se contemplan también formulaciones implantables de liberación prolongada, así como formulaciones transdérmicas.

Formas de dosificación oral. Se contemplan para uso en esta memoria formas de dosificación oral sólidas, que se describen generalmente en el Capítulo 89 de Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), Edición 18ª, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042). Las formas de dosificación sólidas incluyen tabletas, cápsulas, píldoras, trociscos o pastillas, sellos o pelets. Asimismo, puede utilizarse encapsulación liposómica o proteinoide para formular las presentes composiciones (como, por ejemplo, las microesferas proteinoides consignadas en la Patente U.S. No. 4.925.673). Puede utilizarse la encapsulación en liposomas, y los liposomas pueden derivatizarse con diversos polímeros (v.g., Patente U.S. No. 5.013.556). Una descripción de formas de dosificación sólidas posibles para la terapéutica se da en el Capítulo 10 de Marshall, K., Modern Pharmaceutics (1979), recopilado por G.F. Banker y C.T. Rhodes. En general, la formulación incluirá el compuesto de la invención, e ingredientes inertes que confieren protección contra el ambiente del estomago, y liberación del material biológicamente activo en el intestino.

Se contemplan también específicamente formas de dosificación oral de los compuestos de la invención indicados anteriormente. En caso necesario, los compuestos pueden estar modificados químicamente a fin de que el suministro oral sea eficaz. Generalmente, la modificación química contemplada es la fijación de al menos un resto a la molécula del compuesto propiamente dicha, donde dicho resto permite (a) inhibición de la proteólisis; y (b) absorción en el torrente sanguíneo desde el estómago o el intestino. Es deseable también el aumento en la estabilidad global del compuesto y el aumento del tiempo de circulación en el cuerpo. Restos útiles como vehículos unidos covalentemente en esta invención pueden utilizarse también para este propósito. Ejemplos de tales restos incluyen: PEG, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetil-celulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y poliprolina. Véase, por ejemplo, Abuchowski y Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg y Roberts, compiladores, Wiley-Interscience, Nueva York, NY, pp. 367-83; Newark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4: 185-9. Otros polímeros que podrían utilizarse son poli-1,3-dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Como se ha indicado anteriormente, para el uso farmacéutico se prefieren los restos PEG.

Para formas de dosificación de suministro oral, es también posible utilizar una sal de un aminoácido alifático modificado, tal como N-(8-[2-hidroxibenzoil]amino)-caprilato de sodio (SNAC), como vehículo para mejorar la absorción de los compuestos terapéuticos de esta invención. La eficacia clínica de una formulación de heparina que utiliza SNAC ha sido demostrada en una prueba de Fase II realizada por Emisphere Technologies. Véase la Patente US No. 5.792.451, "Oral drug delivery composition and methods".

Los compuestos de esta invención pueden incluirse en la formulación como multipartículas finas en forma de granos o pelets de tamaño de partícula aproximado 1 mm. La formulación de los materiales para la administración de cápsulas podría ser también en forma de polvo, bloques ligeramente comprimidos o incluso como tabletas. El agente terapéutico podría prepararse por compresión.

Pueden incluirse colorantes y agentes saborizantes. Por ejemplo, la proteína (o derivado) puede formularse (por ejemplo por encapsulación en liposomas o microesferas) e incluirse luego dentro de un producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contenga colorantes y agentes saborizantes.

Es posible diluir o aumentar el volumen del compuesto de la invención con un material inerte. Estos diluyentes podrían incluir carbohidratos, especialmente manitol, \alpha-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. Ciertas sales inorgánicas pueden utilizarse también como cargas, con inclusión de trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes disponibles comercialmente son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.

Pueden incluirse desintegrantes en la formulación del compuesto terapéutico en una forma de dosificación sólida. Materiales utilizados como desintegrantes incluyen, pero sin carácter limitante, almidón, con inclusión del desintegrante comercial basado en almidón, Explotab. Pueden utilizarse también almidón-glicolato de sodio, Amberlite, carboximetilcelulosa sódica, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, piel de naranja, carboximetil-celulosa ácida, esponja natural y bentonita. Otra forma de los desintegrantes son las resinas cambiadoras de catión insolubles. Pueden utilizarse gomas pulverizadas como desintegrantes y como aglomerantes, y éstas pueden incluir gomas pulverizadas tales como agar, Karaya o tragacanto. El ácido algínico y su sal de sodio son también útiles como desintegrantes.

Pueden utilizarse aglomerantes para mantener el agente terapéutico unido a fin de formar una tableta dura, e incluyen materiales procedentes de productos naturales tales como goma arábiga, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metil-celulosa (MC), etil-celulosa (EC) y carboximetil-celulosa (CMC). Podrían utilizarse polivinil-pirrolidona (PVP) e hidroxipropilmetil-celulosa (HPMC), ambas en soluciones alcohólicas para granular el producto terapéutico.

Puede incluirse un agente antifricción en la formulación del agente terapéutico para prevenir el pegado durante el proceso de formulación. Pueden utilizarse lubricantes como una capa entre el agente terapéutico y la pared de la matriz, y éstos pueden incluir, pero sin carácter limitante, ácido esteárico, con inclusión de sus sales de magnesio y calcio, politetrafluoretileno (PTFE), aceite de parafina, aceites vegetales y ceras. Pueden utilizarse también lubricantes solubles tales como lauril-sulfato de sodio, lauril-sulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.

Podrían añadirse deslizantes que puedan mejorar las propiedades de flujo del fármaco durante la formulación y para favorecer el reordenamiento durante la compresión. Los deslizantes pueden incluir almidón, talco, sílice pirógena y silicoaluminato hidratado.

Para favorecer la disolución del compuesto de esta invención en el ambiente acuoso podría añadirse un agente tensioactivo como agente humectante. Los agentes tensioactivos pueden incluir detergentes aniónicos tales como lauril-sulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctil-sodio y sulfonato de dioctil-sodio. Podrían utilizarse detergentes catiónicos, los cuales podrían incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que podrían incluirse en la formulación como agentes tensioactivos son lauromacrogol 400, polioxil-40-estearato, polioxietileno-aceite de ricino hidrogenado 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, sacarosa-éster de ácido graso, metil-celulosa y carboximetil-celulosa. Estos agentes tensioactivos podrían estar presentes en la formulación de la proteína o un derivado, sea solos o como una mezcla en relaciones diferentes.

También pueden incluirse aditivos en la formulación para mejorar la absorción del compuesto. Aditivos que tienen potencialmente esta propiedad son por ejemplo los ácidos grasos ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.

Puede ser deseable una formulación de liberación controlada. El compuesto de esta invención podría incorporarse en una matriz inerte que permite la liberación por mecanismos de difusión o lixiviación, v.g., gomas. También pueden incorporarse en la formulación matrices que se degeneran lentamente, v.g., alginatos y polisacáridos. Otra forma de una liberación controlada de los compuestos de esta invención es por un método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), a saber, en el que el fármaco está confinado en una membrana semipermeable que permite que el agua entre e impulse la salida del fármaco a través de una única abertura pequeña debido a efectos osmóticos. Algunos recubrimientos entéricos tienen también un efecto de liberación retardada.

Pueden utilizarse otros recubrimientos para la formulación. Éstos incluyen una diversidad de azúcares que podrían aplicarse en una bandeja de recubrimiento. El agente terapéutico podría suministrarse también en una tableta recubierta con película, y los materiales utilizados en este caso se dividen en dos grupos. El primero son los materiales no entéricos e incluyen metil-celulosa, etil-celulosa, hidroxietil-celulosa, metilhidroxi-etil-celulosa, hidroxipropil-celulosa, hidroxipropil-metil-celulosa, carboxi-metil-celulosa sódica, providona y los polietilenglicoles. El segundo grupo está constituido por los materiales entéricos que son comúnmente ésteres de ácido ftálico.

Podría utilizarse una mezcla de materiales para proporcionar el recubrimiento de película óptimo. El recubrimiento de película puede llevarse a cabo en un recubridor de bandeja o en un lecho fluidizado, o mediante recubrimiento por compresión.

Formas de suministro pulmonar. Se contempla también en esta invención el suministro pulmonar de la presente proteína (o derivados de la misma). La proteína (o su derivado) se suministra a los pulmones de un mamífera mientras se inhala y pasa a través del revestimiento epitelial del pulmón al torrente sanguíneo. (Otros informes de este tipo incluyen Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7: 565-9; Adjei et al. (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63: 135-44 (acetato de leuprolida); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (suplemento 5): p. 143-146 (endotelina-1); Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3: 206-12 (\alpha1-antitripsina); Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84: 1145-6 (\alpha1-proteinasa); Oswein et al. (marzo de 1990), "Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (hormona recombinante del crecimiento humano); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140: 3482-8 (interferón-\gamma y factor de necrosis tumoral \alpha) y Platz et al., Patente U.S. No. 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos).

Se contemplan para uso en la práctica de esta invención una extensa gama de dispositivos mecánicos diseñados para suministro pulmonar de productos terapéuticos que incluyen, pero sin carácter limitante, nebulizadores, inhaladores de dosis medidas, e inhaladores de polvos, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica. Algunos ejemplos específicos de dispositivos disponibles comercialmente, adecuados para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medidas Ventolin, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; y el inhalador de polvos Spinhaler, fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

La totalidad de dichos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para la dispensación del compuesto de la invención. Típicamente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado y puede implicar el uso de un material propelente apropiado, además de diluyentes, adyuvantes y/o vehículos útiles en terapia.

El compuesto de la invención debería prepararse de modo muy ventajoso en forma particulada con un tamaño de partícula menor que 10 \mum (o micrómetros), muy preferiblemente 0,5 a 5 \mum, para el suministro más eficaz al pulmón distal.

Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen carbohidratos tales como trehalosa, manitol, xilitol, sacarosa, lactosa, y sorbitol. Otros ingredientes para uso en formulaciones pueden incluir DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Pueden utilizarse agentes tensioactivos naturales o sintéticos. Puede utilizarse PEG (incluso aparte de su uso en la derivatización de la proteína o análogo). Pueden utilizarse dextranos, tales como ciclodextrano. Se pueden utilizar sales biliares y otros mejoradores afines. Pueden utilizarse celulosa y derivados de celulosa. Se pueden utilizar aminoácidos, tales como el uso en una formulación tampón.

Se contempla también el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión, u otros tipos de vehículos.

Formulaciones adecuadas para uso con un nebulizador, sea de tipo chorro o ultrasónico, comprenderán típicamente el compuesto de la invención disuelto en agua en una concentración de aproximadamente 0,1 a 25 mg de proteína biológicamente activa por ml de solución. La formulación puede incluir también un tampón y un azúcar simple (v.g., para estabilización de la proteína y regulación de la presión osmótica). La formulación de nebulizador puede contener también un agente tensioactivo, a fin de reducir o prevenir la agregación superficial inducida de la proteína causada por la atomización de la solución en la formación del aerosol.

Las formulaciones para uso con un dispositivo inhalador de dosis medidas comprenderán generalmente un polvo finamente dividido que contiene el compuesto de la invención suspendido en un propelente con ayuda de un agente tensioactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono, o un hidrocarburo, con inclusión de triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetano, y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Agentes tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitán y lecitina de soja. También puede ser útil el ácido oleico como agente tensioactivo.

Las formulaciones para dispensación desde un dispositivo inhalador de polvos comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene el compuesto de la invención y pueden incluir también un agente aumentador de volumen, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa, manitol, trehalosa, o xilitol, en cantidades que faciliten la dispersión del polvo desde el dispositivo, v.g., 50 a 90% en peso de la formulación.

Formas de suministro nasal. Se contempla también el suministro nasal del compuesto de la invención. El suministro nasal permite el paso de la proteína al torrente sanguíneo inmediatamente después de la administración del producto terapéutico a la nariz, sin necesidad de deposición del producto en el pulmón. Las formulaciones para suministro nasal incluyen las que contienen dextrano o ciclodextrano. Se contempla también el suministro por transporte a través de otras membranas mucosas.

Dosificaciones. El régimen de dosificación implicado en un método para tratamiento de las afecciones arriba descritas será determinado por el médico encargado del tratamiento, considerando diversos factores que modifican la acción de los fármacos, v.g. la edad, el estado, el peso corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. Generalmente, el régimen diario debería estar comprendido en el intervalo de 0,1-1000 microgramos del compuesto de la invención por kilogramo de peso corporal, preferiblemente 0,1-150 microgramos por kilogramo.

Realizaciones específicas preferidas

Los inventores han determinados estructuras preferidas para los péptidos preferidos enumerados a continuación en la Tabla 2. El símbolo "\Lambda" puede ser cualquiera de los enlazadores descritos en esta memoria o puede representar simplemente un enlace peptídico normal (es decir, tal que no está presente enlazador alguno). Las repeticiones y enlazadores en tándem se representan separados por guiones para claridad.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Realizaciones preferidas

3

"F^{1}" es un dominio Fc como se define anteriormente en esta memoria. Además de los enumerados en la Tabla 2, los inventores contemplan también heterodímeros en los cuales cada cadena de un dímero Fc está enlazada a una secuencia peptídica diferente; por ejemplo, en donde cada Fc está enlazado a una secuencia diferente seleccionada de la Tabla 1.

La totalidad de los compuestos de esta invención se pueden preparar por métodos descritos en la solicitud PCT No. WO 99/25044.

Claims

1. Una composición de materia de la fórmula

(A^{1})_{a}-F^{1}-(A^{2})_{b}

y multímeros de la misma, en donde:

F^{1} es un dominio Fc;

A^{1} y A^{2} se seleccionan cada uno independientemente de -(L^{1})_{c}-P^{1}, -(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}, -(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}-(L^{3})_{e}-P^{3}, y -(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}-(L^{3})_{e}-P^{3}-(L^{4})_{f}-P^{4}

P^{1}, P^{2}, P^{3}, y P^{4} son cada uno independientemente secuencias del péptido de la hélice anfipática de la apolipoproteína AI (Apo-AI) o dominios mimetizadores del péptido de la hélice anfipática Apo-AI;

L^{1}, L^{2}, L^{3}, y L^{4} son cada uno independientemente enlazadores; y

a, b, c, d, e, y f, son cada uno independientemente 0 ó 1, con la condición de que al menos uno de a y b es 1.

2. La composición de materia de la reivindicación 1 de las fórmulas

A^{1}-F^{1}

o

F^{1}-A^{2}.

3. La composición de materia de la reivindicación 1 de la fórmula

F^{1}-(L^{1})_{c}-P^{1}.

4. La composición de materia de la reivindicación 1 de la fórmula

F^{1}-(L^{1})_{c}-P^{1}-(L^{2})_{d}-P^{2}.

5. La composición de materia de la reivindicación 1, en la cual F^{1} es un dominio Fc de IgG.

6. La composición de materia de la reivindicación 1, en la cual F^{1} es un dominio Fc de IgG1.

7. La composición de materia de la reivindicación 1, en la cual F^{1} comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2.

8. La composición de materia de la reivindicación 1, en la cual el péptido de la hélice anfipática de Apo-AI o la secuencia del dominio mimetizador del péptido de la hélice anfipática de Apo-AI es de la fórmula

Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu Ala Phe (SEQ ID NO:7).

9. La composición de materia de la reivindicación 8, en la cual F^{1} es un dominio Fc de IgG.

10. La composición de materia de la reivindicación 9, en la cual F^{1} es un dominio Fc de IgG1.

11. La composición de materia de la reivindicación 1, que tiene una secuencia seleccionada del grupo constituido por SEQ ID Nos: 8, 9, 10 y 11.