ES2260353T3 - Metodo para la deteccion cuantitativa de celulas tumorales epiteliales en un fluido corporal. - Google Patents
Metodo para la deteccion cuantitativa de celulas tumorales epiteliales en un fluido corporal.Info
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Abstract
Método para la detección cuantitativa de células tumorales epiteliales vitales en una cantidad definida de un fluido corporal, que comprende los siguientes pasos: a) marcar las células tumorales epiteliales vitales añadiendo al fluido corporal anticuerpos dirigidos contra antígeno epitelial humano los cuales están ligados a partículas magnéticas, en donde dicho antígeno epitelial humano es un antígeno que se reconoce por el anticuerpo monoclonal HEA 125. b) marcar las células tumorales epiteliales humanas añadiendo al fluido corporal anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno epitelial humano los cuales están ligados a un fluorocromo. c) enriquecer magnéticamente las células tumorales epiteliales vitales. d) inmovilizar la suspensión obtenida así sobre un material de soporte mediante adhesión autónoma de las células tumorales vitales. e) registrar las células tumorales epiteliales por medio de citometría de barrido de láser y calcular la cantidad de estas células con referencia a la cantidad de fluido corporal.
Description
Método para la detección cuantitativa de
células tumorales epiteliales en un fluido corporal.
La invención se refiere a un método para la
detección cuantitativa de células tumorales epiteliales vitales en
un fluido del cuerpo.
La invención se refiere en general al campo de
la indicación de tumores sólidos. Se conoce a la metástasis de
tumores sólidos como la causa fundamental de una alta mortalidad por
cáncer. Esta se provoca por las células que se diseminan en los
nudos linfáticos y/o que circulan en la sangre periférica. De las
células tumorales circulantes una parte puede, bajo ciertas
circunstancias, alcanzar compartimientos alejados donde pueden
comenzar de nuevo a crecer. Tales compartimientos se conocen en
algunos tumores. En el cáncer de pecho y de colon uno de tales
compartimientos es la médula de los huesos. La incidencia de las
células tumorales en relación con las células normales de médula de
hueso es de cuando mucho 10^{-3} hasta 10^{-7} células
tumorales/células normales de médula de hueso. Para obtener muestras
para un diagnóstico de médula de huesos se requiere una intervención
quirúrgica especial en combinación con o según una operación. Un
control regular de monitoreo requeriría una repetición de tal
intervención. Debido a las inconveniencias para los pacientes
relacionadas con esto, así como los costes y el gasto de tiempo, se
trató de mantener un número de intervenciones operativas lo más
pequeño posible.
Otra posibilidad es examinar la sangre
periférica, a la cual se accede substancialmente más fácil. En
efecto, el problema surgido allí es que las células tumorales
detectables están disponibles sólo en un número extremadamente
pequeño.
Sobreviene el agravante de que las células
tumorales circulantes en la sangre periférica pueden contaminar el
transplante ante una alta dosis de quimioterapia o en un transplante
periférico autólogo de células madre de la sangre. Por eso son
necesarios sistemas de alta sensibilidad para poder detectar tales
cantidades diminutas de células tumorales residuales.
El método más sensible en la actualidad es la
reacción en cadena de polimerasa (PCR). En el caso de crecimientos
hematológicos malignos la PCR de secuencias de genes que están
asociadas con el tumor muestra una alta sensibilidad en la detección
de un número pequeño de células tumorales. Sin embargo, en tumores
sólidos la PCR está vinculada con problemas respecto de la
aplicabilidad, la especificidad y la influencia clínica. Como método
adicional para distinguir inmunológicamente células aberrantes de
tejidos normales, se puede utilizar también la expresión,
dependiente de tejido y de maduración, de los antígenos
superficiales o intracelulares. La incidencia de 10^{-3} hasta
10^{-8} con la que se debe esperar células tumorales de tumores
sólidos normalmente en sangre periférica, exige no obstante el
ensayo de un alto número de células negativas para encontrar células
positivas o células tumorales.
Este tipo de detección inmunológica de las
células tumorales debe ser llevado a cabo con ayuda de un
microscopio y es muy dispendioso. Las células tumorales presentes
pueden pasar inadvertidas debido a su cantidad tan pequeña. La
exactitud de este tipo de métodos de detección es comparativamente
baja. También la aplicación de métodos de análisis de imágenes
mejora la sensibilidad y la velocidad sólo de manera poco
considerable.
De WO 99/41613 se conoce un método para la
detección cuantitativa de células epiteliales en sangre periférica
de pacientes con cáncer. En el mismo las células, que llevan los
antígenos epiteliales, de sangre periférica se enriquecen con
partículas magnéticas y se tinturan con anticuerpos marcados
fluorescentemente dispuestos contra antígenos epiteliales para, acto
seguido, registrarlos cuantitativamente por medio de citometría de
paso. La cantidad de células epiteliales registradas se normaliza a
10 ml de sangre.
De Rinas, N. et al., Breast Cancer
Research and Treatment, NIJHOFF, Boston, US, Band 64, Nr. 1,
Noviembre 2000 (2000-11), página 97 se conoce que
las células de cáncer de mama circulantes en la sangre se enriquecen
por medio de partículas magnéticas y se cuantifican por medio de
citometría de barrido de láser. Para esto se emplearon anticuerpos
epiteliales antihumanos acoplados a partículas magnéticas y
conjugados con FITC.
De Pachmann K. et al., Breast Cancer
Research and Treatment, NIJHOFF, Boston, US, Band 64, Nr. 1,
Noviembre 2000 (2000-11), página 96, se conoce que
las células de sangre periférica de pacientes con cáncer de seno se
enriquecen por medio de partículas magnéticas; dichas células tienen
antígenos epiteliales y se tinturan por medio de un anticuerpo
marcado con fluorocromo para antígenos epiteliales. Las células se
midieron luego en un citómetro de barrido de
láser.
láser.
En los métodos conocidos la cantidad de las
células tumorales se determina con referencia a la cantidad de todas
las células, por ejemplo de los leucocitos. La cantidad de los
leucocitos puede, sin embargo, oscilar tan fuertemente que la
cantidad de células tumorales con referencia a la cantidad de
leucocitos solo se puede declarar de manera condicionada.
Un objetivo de la invención es eliminar las
desventajas del estado de la técnica. Debe suministrarse
especialmente un método mejorado para la detección cuantitativa de
células tumorales epiteliales vitales en un fluido corporal con una
exactitud y una velocidad que supere los métodos conocidos hasta
ahora.
Esta tarea se ha resuelto por medio de las
características de la reivindicación 1. Las realizaciones
convenientes de la invención se derivan de las características de
las reivindicaciones 2 hasta 10.
De acuerdo con la invención se suministra un
método para la detección cuantitativa de células tumorales
epiteliales vitales en una cantidad determinada de un fluido
corporal con los siguientes pasos:
- a)
- marcación de las células tumorales epiteliales vitales adicionando al fluido corporal anticuerpos dirigidos contra antígenos epiteliales humanos, enlazados con partículas magnéticas, siendo el antígeno epitelial humano un antígeno que se reconoce a través de anticuerpos monoclonales HEA 125.
- b)
- Marcación de las células tumorales epiteliales vitales adicionando al fluido corporal anticuerpos dirigidos contra antígenos epiteliales humanos, enlazados con un fluorocromo,
- c)
- Enriquecimiento magnético de las células tumorales epiteliales vitales,
- d)
- Inmovilización de la suspensión obtenida así sobre un material soporte, adhiriéndose por sí solas las células vitales.
- e)
- Registro de las células epiteliales vitales por medio de citometría de barrido de láser y cálculo de la cantidad de estas células con referencia a la cantidad de fluido corporal preparado.
El método propuesto ofrece la posibilidad de
determinar la cantidad de células epiteliales vitales directamente
en un fluido corporal, como por ejemplo la sangre, la médula de
hueso, aspirado de médula, transudado, exudado, linfa, aféresis,
ascitis, orina, saliva y fluidos drenados de secreciones de heridas.
Los anticuerpos empleados se enlazan específicamente en las células
sospechosas de ser tumorales. Las células tumorales vitales pueden
ser separadas de las células tumorales muertas. La cantidad de
células tumorales vitales puede declararse con relación al volumen
de fluido corporal empleado. El método de acuerdo con la invención
arroja valores normados. Adicionalmente, el material de soporte
sobre el cual se ha aplicado el fluido corporal después de la
marcación, enriquecimiento y separación se puede guardar con
propósitos de documentación para su disponibilidad para una
evaluación más tarde u otra caracterización. En los métodos
anteriores se podía conservar, por contraste, sólo un protocolo
de
medición.
medición.
Con el método de la presente invención se pueden
detectar cantidades muy pequeñas de células tumorales en un fluido
corporal. Para propósitos de ensayo se añadieron, a manera de
ejemplo, diez células tumorales a 20 ml de sangre entera. Estas diez
células tumorales pudieron ser detectadas completamente con el
método de acuerdo con la invención. Este resultado es comparable con
aquel que se puede obtener por medio de PCR, pudiéndose evitar, no
obstante, las desventajas ligadas con ese método. El método de
acuerdo con la invención permite la determinación cuantitativa de
células tumorales epiteliales vitales en un fluido corporal.
De manera ventajosa, antes de la marcación de
las células epiteliales vitales, se lisa con anticuerpos el fluido
corporal, especialmente sangre periférica, para separar eritrocitos,
a manera de ejemplo. Acto seguido, la suspensión obtenida se
centrifuga y se separa y se desecha el sobrante. No se exige que se
retiren todos los eritrocitos puesto que éstos no influyen en el
método.
En una variante de la invención se marcan las
células tumorales antes del enriquecimiento magnético tanto con los
anticuerpos dirigidos contra el antígeno humano epitelial
(anticuerpos epiteliales antihumanos), los cuales están enlazados
con las partículas magnéticas ("cuentas magnéticas" o
"microperlas"), como también con anticuerpos dispuestos frente
el antígeno epitelial humano, los cuales están enlazados a un
fluorocromo. Las partículas magnéticas tienen de manera preferente
un diámetro que es menor de 70 nm. Las células tumorales llevan en
el enlace anticuerpo-antígeno tanto partículas
magnéticas como también tintura fluorescente. Las células tumorales
se enriquecen posteriormente por medio de separación celular
magnética, poniéndolas por ejemplo en una columna que se encuentra
en un fuerte campo magnético que se forma, por ejemplo por un
magneto permanente. Las células del fluido corporal, en las que
ninguna partícula magnética se ha enlazado, se sacan lavándolas de
la columna. Las células marcadas se quedan debido a la acción del
campo magnético en la columna. Después de retirar el campo magnético
las células que quedaron en la columna se pueden sacar
lavándolas.
En forma alternativa, se puede proceder a la
separación celular magnética antes de que se marquen las células
tumorales epiteliales vitales adicionándoles anticuerpos dirigidos
contra antígenos epiteliales humanos (anticuerpos epiteliales
antihumanos), que estén enlazados con un fluorocromo. Para esto es
suficiente si las células tumorales se marcan con las partículas
magnéticas.
De manera ventajosa, antes de marcar las células
tumorales epiteliales vitales se emplea un reactivo de bloqueo FcR
al fluido corporal.
Como anticuerpos se utilizan preferentemente
anticuerpos dirigidos contra el antígeno epitelial humano (HEA) o
anticuerpos epiteliales antihumanos que provienen de ratones. Como
fluorocromo se emplea preferentemente fluoresceinisotiocianato
(FITC).
Después del enriquecimiento y tinturado de las
células tumorales epiteliales vitales se coloca la suspensión de
células en un soporte. Éste se trata convenientemente de un
portaobjetos de vidrio, que está recubierto preferentemente de
poli-L-lisina.
La cantidad de células tumorales sobre el
soporte o material de soporte se determina por medio de citometría
de barrido con láser. Para contornear las células que se encuentran
sobre el material de soporte se utiliza de manera conveniente la
dispersión hacia delante (forward scatter) como parámetro de valor
de umbral con una magnificación pequeña. La fluorescencia de fondo
puede ser determinada dinámicamente para determinar la intensidad de
fluorescencia máxima y/o la fluorescencia total a través de la
integración por cada célula. Esto permite corregir modificaciones de
la fluorescencia de fondo de tal manera que se pueda calcularla
fluorescencia para cada célula bajo las mismas condiciones y se
obtengan resultados equivalentes para cada célula. La fluorescencia
verde de las células marcadas con FITC -HEA se registran
preferentemente usando un filtro pasabanda de 530/30 nm.
Las células enriquecidas y marcadas con FITC
(células positivas de FITC) pueden además tinturarse con otra
tintura de fluorescencia. A manera de ejemplo se puede tinturar el
DNA de los núcleos celulares con una tintura específica para DNA
como el yoduro de propidio. La fluorescencia roja de las células así
tinturadas se registran eventualmente por medio de citometría de
barrido con láser usando un filtro de pasabanda de 625/28 nm. La
dispersión hacia delante (forward scatter) sirve como parámetro de
valor de umbral para el contornado. Las fluorescencias medidas roja
y verde se comparan una con otra y se determina la cantidad de
sucesos positivos.
La cantidad de células marcadas positivas es
especialmente alta en comparación con los métodos conocidos en el
estado de la técnica debido al enriquecimiento por volumen, de tal
manera que la velocidad y la exactitud del método de acuerdo con la
invención son considerablemente más altas.
La cantidad de las células marcadas encontradas
se calcula con referencia al volumen de fluido corporal tomado
originalmente. Esto permite comparar los resultados de detección
obtenidos en diferentes puntos de tiempo. Se puede reconocer
rápidamente el éxito de, por ejemplo, una terapia tumoral.
La morfología de las células positivas
registradas pueden, a continuación, ser determinadas por medio de
métodos de tinturado hematológicos, como la coloración de
May-Grünwald.
El método de acuerdo con la invención permite de
una manera ventajosa llevar a cabo varias detecciones cuantitativas,
unas tras otras. Las células pueden ser estudiadas cuantitativamente
con respecto a diferentes parámetros. Para este propósito, después
de una primera evaluación cuantitativa, las células pueden ser
tratadas, por ejemplo, con una solución que contiene una segunda
substancia de detección, por ejemplo un colorante fluorescente que
sea específico para malignidad. Las coordenadas de las células ya
son conocidas de la realización de la primera detección
cuantitativa y almacenadas en una computadora u ordenador. Se puede
encontrar inmediatamente cada célula, registrar su reacción frente a
otras substancias de detección y evaluarlas cuantitativamente. Se
pueden realizar otros métodos de detección, especialmente FISH o
TUNEL, y evaluarse cuantitativamente.
En adelante la invención se explica con más
detalle por medio de ejemplos de realización.
En este ejemplo se describe un método para
detección de células tumorales epiteliales en sangre en el cual el
enriquecimiento magnético de las células tumorales epiteliales tiene
lugar después de la marcación de las células tumorales epiteliales
adicionando anticuerpos dirigidos contra el antígeno epitelial
humano, al cual está ligado un fluorocromo.
La sangre periférica fue mezclada con diferentes
porciones de células tumorales. Las células tumorales provenían de
una línea de cáncer de pecho (del tipo AK Br2). Los leucocitos de la
sangre periférica y las células tumorales fueron contados. En un
primer paso de dilución se mezclaron 6x10^{5} células tumorales
con 100 :l de sangre entera que contenían 6x10^{5} leucocitos. En
el siguiente paso de dilución, 6x10^{4} células tumorales y
6x10^{3} de células tumorales fueron añadidas respectivamente a
100 :l de sangre. En el siguiente paso de dilución fueron agregadas
6x10^{3} y 6x10^{2} células tumorales a 1 ml de sangre así como
2x10^{2} y 60 células tumorales a 10 ml o 20 ml de sangre,
obteniéndose en el último caso una dilución de 5 células tumorales a
107 células normales.
Para separación en una columna magnética se
incubaron en frío durante 30 minutos 400 :l que contenían máximo
hasta 5x10^{7} células, obtenidas de la serie de dilución del
literal a, con 100 :l de reactivo antibloqueo. Las células se
trataron entonces con partículas magnéticas a las que se ligaron
anticuerpos dirigidos contra el antígeno epitelial humano, (100 PI
de microperlas de HEA), se incubaron 15 minutos y se lavaron 10
veces con el buffer o tampón de marcación. Las columnas en las que
se ha dispuesto un magneto o imán, fueron lavadas y las partículas
magnéticas recolectadas en las columnas. Las células negativas
fueron eluidas mediante lavado con buffer de 5 veces 500 Pl y se
separaron las columnas del magneto. Las células que quedaron en las
columnas se sacaron mediante lavado con buffer adicional y
tinturadas con 50 Pl de anticuerpos conjugados de ratón FITC
dirigidos contra el antígeno epitelial humano (anticuerpos
HEA-FITC, Miltenyi).
Las células se colocan sobre un portaobjetos.
Después de aplicar 100 :l de suspensión celular, las células vitales
se adhirieron a la superficie del portaobjetos después de 10 a 15
minutos. Para mediciones óptimas, se debe aplicar una suspensión
individual de células sobre el portaobjetos, estando las células
espaciadas una de otra por una distancia que es aproximadamente 2 o
3 veces el diámetro de una célula.
Las células adheridas se midieron usando un
citómetro de barrido con láser (LSC Compucyte Corp). El contorneado
de las células adheridas al portaobjetos se llevó a cabo usando la
dispersión adelante como parámetro de valor de umbral con una
magnificación de 20 veces. La fluorescencia de fondo fue determinada
dinámicamente para calcular tanto la intensidad de fluorescencia
máxima como también la fluorescencia total con base en una célula.
Esto hace posible corregir variaciones en la fluorescencia de fondo
para que el cálculo de la fluorescencia sea equivalente para todas
las células. La fluorescencia verde de las células
HEA-FITC positivas fue registrada con un filtro
pasabanda de 530/30 nm y reforzada con un fotomultiplicador.
Acto seguido se centrifugaron las células sobre
el portaobjetos y se sumergieron en una solución de PBS que contenía
1 mg/ml de yoduro de propidio. El valor de umbral para el
contorneado de las células se basó también en la dispersión hacia
adelante (forward scatter). La fluorescencia roja fue registrada con
un filtro pasabanda de 625/30 nm y reforzado con un segundo
fotomultiplicador. Las fluorescencias roja y verde fueron comparadas
usando un programa de computadora u ordenador (WinCyte, Compucyte
Corporation) y representadas como diagramas de dispersión,
histogramas, porcentajes y promedios de las células FITC positivas y
FITC negativas, basándose el cálculo sólo en la región que abarca
células individuales.
La correlación entre la cantidad calculada de
células tumorales en una muestra de la serie de dilución y de la
cantidad obtenida por medio del método fue muy alta (>0,99).
Incluso en una dilución de 10-8 veces se pudieron
detectar 50 a 60 células.
En este ejemplo se describe un método para
detección de células tumorales epiteliales en sangre, en el cual el
enriquecimiento magnético de las células tumorales epiteliales tiene
lugar antes de la marcación de las células tumorales epiteliales
mediante adición de anticuerpos dirigidos contra el antígeno
epitelial humano que están ligados a un fluorocromo.
20 ml de sangre periférica fueron combinados con
40 ml de buffer de erilisis (155 mM NH_{4}Cl, 10 mM KHCO_{3}, 1
mM Na_{2}-EDTA) y centrifugados en frío a 2000
rpm. El sobrante fue desechado y el sedimento fue llevado a una
solución de PBS-EDTA (50 ml de PBS con 200 Pl 0,5 M
de EDTA) de tal modo que el volumen total fuera 900 Pl.
A 300 Pl de esta mezcla se añadieron 100 Pl de
agente de bloqueo FcR (MiItenyi), 100 Pl de las partículas
magnéticas, a las que están ligados los anticuerpos dirigidos contra
el antígeno epitelial humano, (100 Pl de microperlas HEA, MIltenyi),
y se mezclaron. Acto seguido se añadieron a esta suspensión 50 Pl de
anticuerpos de ratón FITC conjugados dirigidos contra el antígeno
epitelial humano (anticuerpos HEA-FITC, Miltenyi) y
se incubaron 15 minutos en frío.
Las columnas de separación se colocaron en el
magneto (ctaMACS, Miltenyi) y fueron lavadas dos veces con 500 Pl de
solución de PBS-EDTA. La suspensión obtenida en la
sección a. fue suspendida con 500 PI de solución de
PBS-EDTA y aplicada a la columna. La columna se lavó
tres veces con 500 PI de solución de PBS-EDTA y
retirada del magneto. A continuación, la columna fue lavada con 200
Pl de solución de PBS-EDTA para retirar las células
marcadas.
En un portaobjetos recubierto con poli- L -
lisina (Laboratorios Schubert) se aplicaron 100 Pl de la solución
obtenida en el literal b. y se repartieron de manera uniforme. La
cantidad de células tumorales se determinó como en el ejemplo 1,
sección c, y la cantidad fue calculada con referencia al volumen de
sangre periférica usado inicialmente.
Claims (10)
1. Método para la detección cuantitativa de
células tumorales epiteliales vitales en una cantidad definida de un
fluido corporal, que comprende los siguientes pasos:
- a)
- marcar las células tumorales epiteliales vitales añadiendo al fluido corporal anticuerpos dirigidos contra antígeno epitelial humano los cuales están ligados a partículas magnéticas, en donde dicho antígeno epitelial humano es un antígeno que se reconoce por el anticuerpo monoclonal HEA 125.
- b)
- marcar las células tumorales epiteliales humanas añadiendo al fluido corporal anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno epitelial humano los cuales están ligados a un fluorocromo.
- c)
- enriquecer magnéticamente las células tumorales epiteliales vitales.
- d)
- inmovilizar la suspensión obtenida así sobre un material de soporte mediante adhesión autónoma de las células tumorales vitales.
- e)
- registrar las células tumorales epiteliales por medio de citometría de barrido de láser y calcular la cantidad de estas células con referencia a la cantidad de fluido corporal.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en
el cual por medio de la citometría de barrido de láser se determina
la máxima intensidad de fluorescencia y/o la fluorescencia total por
célula.
3. Método de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes en el cual la fluorescencia de fondo se
determina dinámicamente de tal manera que se obtienen valores de
fluorescencia equivalente para cada célula.
4. Método según una de las reivindicaciones
precedentes en el cual el enriquecimiento magnético de las células
tumorales epiteliales vitales tiene lugar antes de la marcación de
las células epiteliales vitales por adición al fluido corporal de
anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno epitelial humano, los
cuales están ligados a un fluorocromo.
5. Método de acuerdo con una de las
reivindicaciones precedentes en el cual el enriquecimiento magnético
de las células tumorales epiteliales humanas tiene lugar después de
la marcación de las células tumorales epiteliales humanas por
adición al fluido corporal de anticuerpos dirigidos contra dicho
antígeno epitelial humano, los cuales están ligados a un
fluorocromo.
6. Método según una de las reivindicaciones
precedentes en el cual el fluido corporal es sangre periférica, la
cual se lisa y se centrifuga antes de que las células tumorales
epiteliales vitales se marquen con anticuerpos, separando el
sobrante y desechándolo.
7. Método según una de las reivindicaciones
precedentes en el cual un reactivo de bloqueo FcR se adiciona al
fluido corporal antes de la marcación de las células tumorales
epiteliales vitales.
8. Método según una de las reivindicaciones
precedentes en el cual para la marcación de células tumorales
epiteliales vitales con anticuerpos dirigidos contra el antígeno
epitelial humano se emplean anticuerpos dirigidos contra el antígeno
epitelial humano provenientes del ratón.
9. Método según una de las reivindicaciones
precedentes en el cual en calidad de fluorocromo se emplea
fluoresceinisotiocianato (FITC).
10. Método según una de las reivindicaciones
precedentes en el cual el fluido corporal se selecciona del
siguiente grupo: sangre, médula de hueso, aspirado de médula de
hueso, transudado, exudado, linfa, fluido de aféresis, ascitis,
orina, saliva y fluidos drenados de secreciones de heridas.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE10127079A DE10127079A1 (de) | 2001-06-02 | 2001-06-02 | Verfahren zum quantitativen Nachweis vitaler epithelialer Tumorzellen in einer Körperflüssigkeit |
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| ES2260353T3 true ES2260353T3 (es) | 2006-11-01 |
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