ES2260760T3

ES2260760T3 - Acidos nucleicos que codifican un alergeno contenido en los acaros del polvo domestico (der p iii), y sus usos.

Info

Publication number: ES2260760T3
Application number: ES95904273T
Authority: ES
Inventors: Wayne R. Thomas; Kaw-Yan Graduate Institute of Immunology CHUA; Bruce L. Rogers; Mei-Chang Kuo
Original assignee: Telethon Kids Institute TVW; Heska Corp
Current assignee: Telethon Kids Institute TVW; Heska Corp
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2014-12-07
Also published as: NO962407L; US20050123569A1; JPH09510083A; US9447154B2; EP0733064A1; ATE320445T1; NO962407D0; KR20040004481A; US6180771B1; US20110117116A1; NZ277698A; AU697491B2; US20110059522A1; AU1302795A; US7666429B2; US8287875B2; US6752991B1; NO317850B1; CA2177612C; EP0733064B1

Abstract

SE DESCRIBEN ACIDOS NUCLEICOS AISLADOS QUE CODIFICAN UN ALERGENO DE DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS, DER P III. TAMBIEN SE DESCRIBE UN CADN QUE CODIFICA UN PEPTIDO QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DE DER P III Y UN PESO MOLECULAR ESTIMADO DE ALREDEDOR DE 24.985 DALTONS. LOS ACIDOS NUCLEICOS PUEDEN SER UTILIZADOS COMO SONDAS PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE ACIDO NUCLEICO DER P III EN UNA MUESTRA O PARA LA PRODUCCION RECOMBINANTE DE PEPTIDOS CON UNA ACTIVIDAD DE DER P III. LOS PEPTIDOS CON UNA ACTIVIDAD DE DER P III PUEDEN UTILIZARSE EN COMPOSICIONES ADECUADAS PARA ADMINISTRACION FARMACEUTICA O METODOS DE DIAGNOSTICO DE SENSIBILIDAD A ACAROS DE POLVO CASERO.

Description

Ácidos nucleicos que codifican un alérgeno contenido en los ácaros del polvo doméstico (Der p III), y sus usos.

Antecedentes de la invención

Aproximadamente un 10% de la población se vuelve hipersensibilizada (alérgica) tras exposición a antígenos de una variedad de fuentes ambientales. Aquellos antígenos que inducen los tipos inmediato y/o retardado de hipersensibilidad son conocidos como alérgenos (King, T.P., (1976), Adv. Immunol., 23: 77-105). Los alérgenos pueden incluir productos de hierbas, árboles, malezas, caspa animal, insectos, alimentos, fármacos y productos químicos. Se cree que la predisposición genética de un individuo desempeña un papel en el desarrollo de respuestas alérgicas inmediatas (Young, R.P., et al., (1990), Clin Sci., 79: 19) tales como atopia y anafilaxia, cuyos síntomas incluyen fiebre del heno, asma y urticaria.

Los anticuerpos implicados en la alergia atópica pertenecen principalmente a la clase IgE de inmunoglobulinas. La IgE se une a basófilos, mastocitos y células dendríticas mediante un receptor Fc\varepsilonRI específico de alta afinidad (Kinet, J.P., (1990), Curr. Opin. Immunol., 2: 499-505). Tras la combinación de un alérgeno que actúa como ligando con su receptor de IgE asociado, el Fc\varepsilonRI unido a la IgE puede reticularse sobre la superficie celular, dando como resultado manifestaciones fisiológicas de la interacción IgE-alérgeno. Estos efectos fisiológicos incluyen la liberación de, entre otras sustancias, histamina, serotonina, heparina, factor(es) quimiotáctico(s) para leucocitos eosinófilos y/o leucotrienos C4, D4 y E4, que causan una constricción prolongada de las células de músculo liso bronquial (Hood, L.E., et al., "Immunology" (2ª ed.), The Benjamin/Cumming Publishing Co., Inc. (1984)). Por tanto, la consecuencia última de la interacción de un alérgeno con IgE son síntomas alérgicos desencadenados por la liberación de los mediadores anteriormente citados. Dichos síntomas pueden ser de naturaleza sistémica o local, dependiendo de la vía de entrada del antígeno y del patrón de deposición de la IgE sobre mastocitos o basófilos. Las manifestaciones locales aparecen generalmente sobre superficies epiteliales en el sitio de entrada del alérgeno. Los efectos sistémicos pueden inducir anafilaxia (choque anafiláctico), que es el resultado de la respuesta de IgE-basófilo al antígeno en circulación (intravascular).

Los estudios con alérgenos purificados han mostrado que aproximadamente un 80% de los pacientes alérgicos al ácaro Dermatophagoides pteronyssinus producen IgE reactiva con Der p I y Der p II (Chapman M.D. et al., J. Immunol. (1980), 125: 587-592; Lind P., J. Allergy Clin. Immunol. (1985) 26: 753-761; Van der Zee, J.S. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1988) 81: 884-895). Para aproximadamente la mitad de los pacientes, estas especificidades constituyen un 50% del anticuerpo anti-ácaro de IgE. El alérgeno Der p III, recientemente identificado como tripsina (Stewart, G.A. et al., Immunology (1992) 75: 29-35), reacciona con una frecuencia similar o superior (Stewart G.A. et al., supra; Ford S.A. et al., Clin. Exp. Allergy (1989) 20: 27-31. Sin embargo, en el único estudio cuantitativo reseñado hasta la fecha, los investigadores determinaron que el nivel de unión de IgE a Der p III era considerablemente menor que para Der p I. Las técnicas electroforéticas (Ford S.A. et al., supra; Bengtsson A. et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. (1986) 80: 383-390; Lind P., et al., Scand. J. Immunol. (1983) 17: 263-273; Tovey E.R. et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1987) 79: 102) han mostrado que la mayoría de los sueros contienen IgE que reconocen otros alérgenos.

La trascendencia de la reactividad de IgE con Der p III continúa incierta. La reactividad de este grupo de alérgenos se ha reseñado que es tan baja como un 16% utilizando un ensayo en fase fluida (Heymann et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1989) 83: 1055-1067) y tan alta como un 100% utilizando un ensayo RAST (Stewart et al., Immunology, (1992) 75: 29-35). Algunos otros han reseñado una reactividad de IgE entre 60-83% (Tovey et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1987) 79: 93-102; Thomas et al., Exp. Appl. Acarol. (1992) 16: 153-164; Yasueda et al., Clin. Exp. Allergy (1993) 23: 384-390). Las discrepancias en la frecuencia de reactividad de IgE con los alérgenos del grupo III pueden ser atribuibles a las diferencias en la pureza de la preparación de alérgeno o a las diferencias en la sensibilidad de las técnicas de ensayo utilizadas. Para determinar la importancia de las especificidades particulares en las reacciones alérgicas, existe la necesidad de cantidades de alérgeno puro, que posibilitarían ensayos de unión de IgE cuantitativos y estudios de la frecuencia y el perfil de linfocina de las respuestas de células T ante el alérgeno.

Muchos pacientes con sensibilidad a alérgenos de ácaro del polvo doméstico se tratan actualmente mediante la administración de dosis pequeñas gradualmente crecientes de extractos de ácaro del polvo doméstico. El uso de estos extractos tiene múltiples inconvenientes, incluyendo anafilaxia potencial durante el tratamiento y la necesidad de terapia continua, a menudo durante un periodo de varios años, para crear suficiente tolerancia y una reducción significativa de los síntomas clínicos. La capacidad de sustituir composiciones de alérgeno de ácaro del polvo doméstico por
Der p III superaría algunos de estos inconvenientes. Por tanto, son altamente deseables una fuente de alérgeno puro que podría proporcionarse en cantidad para uso como reactivo de diagnóstico o terapéutico y métodos terapéuticos que superarían los inconvenientes asociados a los extractos de ácaro del polvo doméstico.

Sumario de la invención

Esta invención proporciona un ácido nucleico recombinante o sintético que codifica un alérgeno proteico Der p III según la reivindicación 1. En otro aspecto, la invención se refiere a un vector de expresión recombinante de la reivindicación 2. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula huésped según la reivindicación 3, los rasgos preferidos de la célula huésped son todos según la reivindicación 4. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método de detección de la sensibilidad en un sujeto a un alérgeno de ácaro del polvo doméstico según la reivindicación 5. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un proceso para producir una composición farmacéutica según la reivindicación 6. Se definen aspectos preferidos del proceso en las reivindicaciones 7 a 9. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un proceso de síntesis química según la reivindicación 10. Se describen también ácidos nucleicos aislados que codifican péptidos que tienen al menos una actividad biológica de Der p III, un alérgeno de la especie Dermatophagoides pteronyssinus (ácaro del polvo doméstico). Un ácido nucleico preferido es un ADNc que tiene una secuencia nucleotídica mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1). Se describen también péptidos codificados por todo o una porción de dicho ADNc (SEQ ID NO:1) y que tienen al menos una actividad biológica de Der p III. Se contemplan también ácidos nucleicos aislados que hibridan en condiciones de alto rigor (por ejemplo, equivalentes a 20-27ºC por debajo de la Tm y NaCl 1 M) con un ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1) o que codifica un péptido que comprende toda o una porción de una secuencia aminoacídica de las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2). Se describen también ácidos nucleicos que codifican péptidos que tienen una actividad de Der p III y que tienen al menos un 50% de homología con una secuencia mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2). Se presentan también por esta invención péptidos que tienen una actividad de Der p III producidos mediante expresión recombinante de un ácido nucleico de la invención, y péptidos que tienen una actividad de Der p III preparados mediante síntesis química. Los péptidos preferidos tienen la capacidad de inducir una respuesta de células T que puede incluir estimulación de células T (medida, por ejemplo, mediante la proliferación de células T o secreción de citocina) o insensibilidad de células T (concretamente, el contacto con el péptido o un complejo del péptido con una molécula de MHC de una célula presentadora de antígeno induce a la célula T a volverse insensible a señales estimulatorias o incapaz de proliferación). Otros péptidos preferidos, aparte o además de la capacidad de inducir una respuesta de células T, tienen la capacidad de unirse a IgE específica de sujetos alérgicos a ácaro del polvo doméstico. Dichos péptidos son útiles en el diagnóstico de la sensibilidad a ácaros del polvo doméstico en un sujeto. Aún otros péptidos, aparte de o además de la capacidad de inducir una respuesta de células T, tienen una capacidad reducida o despreciable de unirse a IgE de alérgicos a ácaro del polvo doméstico. Dichos péptidos son particularmente útiles como agentes terapéuticos.

Otros péptidos preferidos comprenden una secuencia aminoacídica mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2). Se dan a conocer también péptidos que tienen una actividad de Der p III y que comprenden una porción de la secuencia aminoacídica de las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2) y son de al menos 8-30 aminoácidos de longitud, preferiblemente aproximadamente 10-20 aminoácidos de longitud, y lo más preferiblemente aproximadamente 10-16 aminoácidos de longitud.

Se describen también anticuerpos específicamente reactivos con péptidos que tienen una actividad de Der p III. Los péptidos que tienen una actividad de Der p III pueden utilizarse en composiciones adecuadas para administración farmacéutica. Por ejemplo, dichas composiciones pueden utilizarse de manera similar a extractos de ácaro del polvo doméstico para tratar o prevenir reacciones alérgicas a ácaros del polvo doméstico en un sujeto. Los ácidos nucleicos de la invención y los péptidos que tienen una actividad de Der p III pueden utilizarse también para diagnosticar sensibilidad en un sujeto a ácaros del polvo doméstico.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B muestran las secuencias nucleotídica completa (SEQ ID NO:1) y aminoacídica deducida (SEC ID Nº 2) del clon de Der p III.

Las Figuras 2A y 2B muestran las secuencias aminoacídicas de Der p III (SEQ ID NO:2) y una proteína tripsina de cangrejo de río (SEQ ID NO:3).

La Figura 3 muestra los resultados de análisis PAGE-SDS de diversas concentraciones de Der p III recombinante (carril 1, 4,3 \mug; carril 2, 8,7 \mug; carril 3, 13,8 \mug; carril 4, 17,4 \mug; los marcadores están indicados por M).

Descripción detallada de la invención

Se dan a conocer ácidos nucleicos aislados que codifican péptidos que tienen al menos una actividad biológica de Der p III, un alérgeno del grupo III de la especie Dermatophagoides pteronyssinus. Preferiblemente, el ácido nucleico es un ADNc que comprende una secuencia nucleotídica mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1).

El ADNc mostrado en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1) codifica un péptido Der p III que incluye una región prepro de 29 restos aminoacídicos predicha codificada por los nucleótidos 63 a 149. Esta secuencia líder no se encuentra en la Der p III madura, que está codificada por los nucleótidos 150 a 845. La secuencia aminoacídica deducida basada en este ADNc se muestra también en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2). El ADNc codifica un péptido maduro de 232 restos que tiene un peso molecular predicho de 24.985 Da, incluyendo siete restos de cisteína. Está presente en el ADNc una secuencia señal de poliadenilación 179 nucleótidos después de la última base (véanse las Figuras 1A y 1B). Se depositó un cultivo de E. coli transfectado con un vector de expresión que contenía el ADNc que codifica Der p III según el Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection el 15 de Octubre de 1993, y se le asignó el número de acceso 69472.

Se describen también ácidos nucleicos aislados que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica
Der p III, fragmentos de los mismos que codifican péptidos que tienen al menos una actividad biológica de Der p III y/o equivalentes de dichos ácidos nucleicos. El término ácido nucleico como se utiliza en la presente memoria se pretende que incluya dichos fragmentos y equivalentes. El término equivalente se pretende que incluya secuencias nucleotídicas que codifican péptidos funcionalmente equivalentes a Der p III que tienen una actividad de Der p III. Como se define en la presente memoria, un péptido que tiene una actividad de Der p III tiene al menos una actividad biológica del alérgeno Der p III. Las secuencias nucleotídicas equivalentes incluyen secuencias que difieren en una o más sustituciones, adiciones o deleciones nucleotídicas, tales como variantes alélicas, e incluyen secuencias que difieren de la secuencia nucleotídica que codifica Der p III mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1) debido a la degeneración del código genético. Los equivalentes incluyen secuencias nucleotídicas que hibridan en condiciones rigurosas (concretamente, equivalentes a aproximadamente 20-27ºC por debajo de la temperatura de fusión (Tm) y aproxima-
damente NaCl 1 M) con la secuencia nucleotídica de Der p III mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1).

Los péptidos designados en la presente memoria por tener una actividad de Der p III se definen en la presente memoria como péptidos que tienen una secuencia aminoacídica correspondiente a toda o una porción de la secuencia aminoacídica de Der p III mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2). Por ejemplo, un péptido que tiene una actividad de Der p III puede tener la capacidad de inducir una respuesta en células T limitadas a Der p III tal como estimulación (por ejemplo, proliferación de células T o secreción de citocina) o inducción de insensibilidad de células T. Como alternativa, o adicionalmente, un péptido que tiene una actividad de Der p III puede tener la capacidad de unirse a (y ser reconocido por) anticuerpos de inmunoglobulina E de sujetos alérgicos a ácaro del polvo doméstico. Los péptidos que se unen a IgE son útiles en métodos de detección de sensibilidad alérgica a Der p III en un sujeto. Los péptidos que no se unen a IgE, o que se unen a IgE en un menor grado que una proteína Der p III nativa purificada, son particularmente útiles como agentes terapéuticos.

El ácido nucleico puede ser un ADNc que codifica un péptido que tiene una actividad de Der p III. Preferiblemente, el ácido nucleico es una molécula de ADNc que comprende al menos una porción de la secuencia nucleotídica que codifica Der p III mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1). Una porción preferida de la molécula de ADNc de las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1) incluye la región de codificación de la molécula.

El ácido nucleico puede codificar un péptido que tiene una actividad de Der p III y que comprende una secuencia aminoacídica mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2). Los ácidos nucleicos preferidos codifican un péptido que tiene una actividad de Der p III y que tiene al menos aproximadamente un 50% de homología, más preferiblemente al menos aproximadamente un 60% de homología, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 70% de homología con la secuencia mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2). Se dan a conocer también ácidos nucleicos que codifican péptidos que tienen una actividad de Der p III y que tienen al menos aproximadamente un 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 95%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 98-99% de homología con la secuencia indicada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2). Homología designa la similitud de secuencia entre dos péptidos que tienen una actividad de Der p III o entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología puede determinarse comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El grado de homología entre secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las secuencias.

Se da a conocer también un ácido nucleico que hibrida en condiciones de alto o bajo rigor con un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene toda o una porción de la secuencia aminoacídica mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2). Las condiciones de rigor apropiadas que promueven la hibridación de ADN, por ejemplo, 6,0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) aproximadamente a 45ºC, seguido de un lavado de 2,0 x SSC a 50ºC, son conocidas por los expertos en la técnica o pueden encontrarse en "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede seleccionarse desde un bajo rigor de aproximadamente 2,0 x SSC a 50ºC a un alto rigor de aproximadamente 0,2 x SSC a 50ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse desde condiciones de bajo rigor a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, a condiciones de alto rigor aproximadamente a 65ºC.

Se describen también ácidos nucleicos aislados que codifican un péptido que tiene una actividad de Der p III, como se describe en la presente memoria, y que tienen una secuencia que difiere de la secuencia nucleotídica mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1) debido a la degeneración del código genético.

Dichos ácidos nucleicos difieren en su secuencia de la secuencia de las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1) que codifica péptidos funcionalmente equivalentes (concretamente, péptidos que tienen una actividad de Der p III), pero debido a la degeneración del código genético. Por ejemplo, una serie de aminoácidos se designan por más de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoácido o sinónimos (por ejemplo CAU y CAC son sinónimos para histidina) pueden dar como resultado mutaciones "silenciosas" que no afectan a la secuencia aminoacídica de la proteína Der p III. Sin embargo, se espera que existan polimorfismos de secuencia de ADN que conduzcan a cambios en la secuencia aminoacídica de Der p III en la población de ácaros del polvo doméstico. Un experto en la técnica apreciará que estas variaciones en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente un 3-4% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican péptidos que tienen una actividad de Der p III pueden existir entre ácaros del polvo doméstico individuales debido a la variación alélica natural. Se dan a conocer también en la presente memoria cualquiera y todas dichas variaciones nucleotídicas y polimorfismos aminoacídicos resultantes. Además, puede haber una o más isoformas o miembros de la familia de Der p III reactivos de forma cruzada relacionados. Dichas isoformas o miembros de la familia se definen como proteínas relacionadas en función y secuencia aminoacídica con Der p III, pero que están codificadas por genes en diferentes loci.

Se describen también fragmentos de un ácido nucleico que codifica Der p III. Como se utiliza en la presente memoria, un fragmento de un ácido nucleico que codifica Der p III designa una secuencia nucleotídica que tiene menos nucleótidos que la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia aminoacídica entera de la proteína Der p III y que codifica un péptido que tiene una actividad de Der p III (concretamente, un péptido que tiene al menos una actividad biológica del alérgeno Der p III) como se define en la presente memoria.

Los fragmentos de ácido nucleico preferidos codifican péptidos de al menos 10 restos aminoacídicos de longitud, preferiblemente aproximadamente 10-20 restos aminoacídicos de longitud, y más preferiblemente aproximadamente 10-16 restos aminoacídicos de longitud. Se describen también en la presente memoria fragmentos de ácido nucleico que codifican péptidos que tienen una actividad de Der p III de al menos 30 restos aminoacídicos de longitud, al menos aproximadamente 40 restos aminoacídicos de longitud, al menos aproximadamente 60 restos aminoacídicos de longitud, al menos aproximadamente 80 restos aminoacídicos de longitud, al menos aproximadamente 100 restos aminoacídicos de longitud y al menos aproximadamente 200 restos aminoacídicos de longitud o más.

Los fragmentos de ácido nucleico incluyen aquellos capaces de hibridar con rigor alto o bajo con ácidos nucleicos de otras especies animales para uso en protocolos de examen para detectar Der p III o alérgenos que sean reactivos cruzados con Der p III. Generalmente, el ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una actividad de Der p III se seleccionará de las bases que codifican la proteína madura, sin embargo, en algunos casos, puede ser deseable seleccionar todo o parte de un péptido de la porción de secuencia líder del ácido nucleico. Los ácidos nucleicos pueden contener también secuencias engarce, sitios de endonucleasa de restricción modificados y otras secuencias útiles para clonación molecular, expresión o purificación de péptidos recombinantes que tienen una actividad de Der p III.

Puede obtenerse un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una actividad de Der p III a partir de ARNm presente en ácaros del polvo doméstico de la especie Dermatophagoides pteronyssinus. Debería ser posible también obtener ácidos nucleicos que codifican Der p III a partir de ADN genómico de Dermatophagoides pteronyssinus. Por ejemplo, el gen que codifica Der p III puede clonarse a partir de un ADNc o una biblioteca genómica según protocolos descritos en la presente memoria. Puede obtenerse un ADNc que codifica Der p III aislando el ARNm total de Dermatophagoides pteronyssinus. Los ADNc bicatenarios pueden prepararse entonces a partir del ARNm total. Posteriormente, los ADNc pueden insertarse en un vector plásmido o bacteriófago adecuado utilizando una cualquiera de una serie de técnicas conocidas. Los genes que codifican Der p III pueden clonarse también utilizando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa establecidas según la información de secuencia nucleotídica proporcionada por la invención. Los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN. Es un ácido nucleico preferido un ADNc que codifica Der p III
que tiene la secuencia descrita en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1).

Se describen también vectores de expresión que contienen un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una actividad de Der p III ligado operativamente al menos a una secuencia regulatoria. Ligado operativamente se pretende que signifique que la secuencia nucleotídica está ligada a una señal regulatoria de manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica. Las secuencias regulatorias están reconocidas en la técnica y se seleccionan para la expresión directa del péptido que tiene una actividad de Der p III mediante una célula huésped transfectada. En consecuencia, el término secuencia regulatoria incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Dichas secuencias regulatorias se describen en Goeddel, "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology", 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se va a transformar y/o el tipo de proteína que se desee expresar. El vector de expresión puede incluir un ADN que codifica un péptido que tiene una actividad de Der p III. Dichos vectores de expresión pueden utilizarse para transfectar células, produciendo así proteínas o péptidos, incluyendo proteínas de fusión o péptidos codificados por ácidos nucleicos como se describen en la presente memoria.

Se da a conocer también una célula huésped transfectada para expresar un péptido que tiene una actividad de
Der p III. La célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un péptido que tiene una actividad de Der p III puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (baculovirus), levadura o células de mamífero tales como célula de ovario de hámster chino (CHO). Otras células huésped adecuadas se designan en Goeddel (1990) supra, o son conocidas por los expertos en la técnica.

La expresión en células eucarióticas tales como células de mamífero, levadura o insecto puede conducir a una glicosilación parcial o completa y/o formación de enlaces disulfuro inter- o intracatenarios relevantes de un producto peptídico recombinante. Los ejemplos de vectores para expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et al., (1987), EMBO J., 6: 229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982), Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987), Gene 54: 113-123) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Los vectores baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (células SF9) incluyen la serie pAc (Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) y la serie pVL (Lucklow, V.A. y Summers, M.D., (1989) Virology 170: 31-39). Generalmente, las células COS (Gluzman, Y. (1981) Cell 23: 175-182) se utilizan junto con vectores tales como pCDM 8 (Aruffo. A. y Seed. B. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577) para amplificación/expresión transitoria en células de mamífero, mientras que las células CHO (dhfr-, ovario de hámster chino) se utilizan con vectores tales como pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6: 187-195) para amplificación/expresión estable en células de mamífero. El ADN de vector puede introducirse en células de mamífero mediante técnicas convencionales tales como coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano o electroporación. Pueden encontrarse métodos adecuados para transformar células huésped en Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) y en otros libros de texto de laboratorio.

La expresión en procariotas se lleva a cabo a menudo en E. coli con vectores de expresión inducibles de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión añaden habitualmente una serie de aminoácidos NH_{2}-terminales al gen diana expresado. Estos aminoácidos NH_{2}-terminales se designan a menudo como un grupo informador. Dichos grupos informadores sirven habitualmente para dos fines: 1) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante diana; y 2) ayudar a la purificación de la proteína recombinante diana actuando como un ligando en purificación por afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la intersección del grupo informador y la proteína recombinante diana para posibilitar la separación de la proteína recombinante diana del grupo informador posteriormente a la purificación de la proteína de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento asociadas, incluyen factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutation-S-transferasa, proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, con la proteína recombinante diana. Es un grupo informador preferido poli(His), que vuelve la proteína de fusión recombinante fácilmente purificable mediante cromatografía de quelato metálico.

Los vectores de expresión inducibles no de fusión incluyen pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69: 301-315) y pET11d (Studier et al., "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology", 185, Academic Press, San Diego, California (1990), 60-89). Aunque la expresión de gen diana se basa en la transcripción por ARN polimerasa de huésped a partir del promotor de fusión híbrido trp-lac en pTrc, la expresión de genes diana insertados en pET11d se basa en la transcripción a partir del promotor de fusión T7 gn10-lac 0 mediada por ARN polimerasa viral coexpresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral se suministra por las cepas huésped BL21(DE3) o HMS174(DE3) a partir de un profago \lambda residente que alberga T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de Der p III recombinante en E. coli es expresar la proteína en una bacteria huésped con una capacidad dañada de escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology", 185, Academic Press, San Diego, California (1990), 119-128). Otra estrategia sería alterar el ácido nucleico que codifica Der p III para insertar en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido fueran aquellos utilizados preferiblemente en proteínas de E. coli altamente expresadas (Wada et al., (1992) Nuc. Acids. Res. 20: 2111-2118). Dicha alteración de ácidos nucleicos de la invención puede llevarse a cabo mediante técnicas de síntesis de ADN estándar.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden sintetizarse químicamente también utilizando técnicas estándar. Son conocidos diversos métodos para sintetizar químicamente polidesoxinucleótidos, incluyendo síntesis en fase sólida que, como la síntesis peptídica, se ha automatizado totalmente en sintetizadores de ADN disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, Itakura et al., Patente de EE.UU. nº 4.598.049; Caruthers et al., Patente de EE.UU. nº 4.458.066 e Itakura, Patentes de EE.UU. nº 4.401.796 y 4.373.071, incorporadas como referencia a la presente memoria).

Se describen también métodos de producción de péptidos que tienen una actividad de Der p III. Por ejemplo, puede cultivarse una célula huésped transfectada con un vector ácido nucleico que dirige la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica un péptido que tiene una actividad de Der p III en condiciones apropiadas para permitir que ocurra la expresión del péptido. El péptido puede secretarse y aislarse a partir de una mezcla de células y medio que contiene el péptido. Como alternativa, el péptido puede retenerse citoplasmáticamente y recogerse las células, lisarse y aislarse la proteína. Un cultivo celular incluye células huésped, medios y otros subproductos. Los medios adecuados para cultivo celular son bien conocidos en la técnica. Los péptidos pueden aislarse a partir de medio de cultivo celular, células huésped o ambos utilizando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis y purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos de dichos péptidos.

Se describen también péptidos aislados que tienen una actividad de Der p III. Un péptido que tiene una actividad de Der p III tiene al menos una actividad biológica del alérgeno Der p III. Por ejemplo, un péptido que tiene una actividad de Der p III puede tener la capacidad de inducir una respuesta en células T específicas de Der p III tal como estimulación (proliferación de células T o secreción de citocina) o de inducir insensibilidad de células T. Un péptido que tiene una actividad de Der p III estimula células T como se evidencia, por ejemplo, mediante proliferación de células T o secreción de citocina. Los péptidos que tienen una actividad de Der p III inducen insensibilidad de células T, en la que las células T son insensibles a una exposición posterior a un péptido Der p III o proteína Der p III nativa después de exposición al péptido. Se describe también que un péptido que tiene una actividad de Der p III tiene una actividad de unión a IgE reducida comparado con proteína Der p III nativa purificada. Un péptido que tiene una actividad de Der p III puede diferir en la secuencia aminoacídica de la secuencia de Der p III descrita en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2), pero dichas diferencias dan como resultado una proteína modificada que funciona de la misma o similar manera que una proteína Der p III nativa o que tiene las mismas o similares características que la proteína Der p III. Se describen con detalle en la presente memoria diversas modificaciones de la proteína Der p In para producir estos y otros péptidos funcionalmente equivalentes. El término péptido, como se utiliza en la presente memoria, designa péptidos, proteínas y polipéptidos.

Puede producirse un péptido mediante modificación de la secuencia aminoacídica de la proteína Der p III mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:2), tal como mediante una sustitución, adición o deleción de uno o más restos aminoacídicos. Dichas modificaciones pueden dirigirse a restos aminoacídicos no implicados en una actividad biológica del péptido, o las modificaciones pueden dirigirse a dichos restos aminoacídicos para potenciar, o eliminar, una actividad biológica particular. Los péptidos descritos en la presente memoria son de al menos aproximadamente 8 restos aminoacídicos de longitud, preferiblemente de aproximadamente 10-20 restos aminoacídicos de longitud, y más preferiblemente de aproximadamente 10-16 restos aminoacídicos de longitud. Los péptidos que tienen una actividad de Der p III de al menos aproximadamente 30 restos aminoacídicos de longitud, al menos aproximadamente 40 restos aminoacídicos de longitud, al menos aproximadamente 60 restos aminoacídicos de longitud, al menos aproximadamente 80 restos aminoacídicos de longitud, al menos aproximadamente 100 restos aminoacídicos de longitud, y al menos aproximadamente 200 restos aminoacídicos o más de longitud están también incluidos en el alcance de esta invención.

Se describen también péptidos de un alérgeno del grupo III relacionado de la especie Dermatophagoides farinae, Der f III. Dichos péptidos se han aislado de una proteína Der f III nativa purificada y comprenden las secuencias: IVGGVKAKAGDSPYQISLQSSSHFXGGSILD (SEQ ID NO:15), una secuencia N-terminal; MICGGDVANGGVD
SEQGD (SEQ ID NO:10), un péptido interno, y MTLDQTNAKPVPLPTS (SEQ ID NO:12), un péptido inter-
no.

Se describe también una preparación sustancialmente pura de un péptido que tiene una actividad de Der p III. Dicha preparación está sustancialmente libre de las proteínas y péptidos con los que aparece naturalmente el péptido (concretamente, otros péptidos de ácaro del polvo doméstico) en una célula o cuando se secreta por una célula.

El término aislado como se utiliza en la presente memoria designa un ácido nucleico o péptido que está sustancialmente libre de material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinantes, o de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Dichos péptidos se caracterizan también por estar libres de cualquier otra proteína de ácaro del polvo doméstico. En consecuencia, un péptido aislado que tiene una actividad de Der p III se produce recombinante o sintéticamente y está sustancialmente libre de material celular y medio de cultivo o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, y está libre de cualquier otra proteína de ácaro del polvo doméstico. Un ácido nucleico aislado está también libre de las secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (concretamente, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el organismo del que deriva el ácido nucleico.

Los péptidos que tienen una actividad de Der p III pueden obtenerse, por ejemplo, examinando péptidos producidos recombinantemente a partir del correspondiente fragmento del ácido nucleico de Der p III que codifica dichos péptidos. Además, los fragmentos pueden sintetizarse químicamente utilizando técnicas conocidas en la técnica tales como química f-Moc o t-Boc en fase sólida de Merrifield convencional. Por ejemplo, la proteína Der p III puede dividirse arbitrariamente en fragmentos de la longitud deseada sin superposición de los fragmentos, o dividirse preferiblemente en fragmentos superpuestos de una longitud deseada. Pueden producirse los fragmentos (recombinantemente o mediante síntesis química) y ensayarse para identificar aquellos péptidos que tienen una actividad de
Der p III, concretamente, la capacidad de inducir una respuesta de células T tal como estimulación de células T (proliferación de células T, secreción de citocina) o insensibilidad de células T, y/o que tienen una actividad de unión a IgE
reducida.

Los péptidos que tienen una actividad de Der p III pueden identificarse mediante la capacidad del péptido de estimular células T o de inducir la insensibilidad de células T. Los péptidos que estimulan células T, como se determina, por ejemplo, mediante proliferación de células T o secreción de citocina, se definen en la presente memoria por comprender al menos un epítopo de células T. Los epítopos de células T se cree que están implicados en la iniciación y perpetuación de la respuesta inmune al alérgeno proteico que es responsable de los síntomas clínicos de alergia. Estos epítopos de células T se cree que desencadenan eventos tempranos al nivel de la célula auxiliar de T al unirse a una molécula HLA apropiada sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno, estimulando así la subpoblación de células T con el receptor de células T relevante para el epítopo. Estos eventos conducen a una proliferación de células T, secreción de linfocina, reacciones inflamatorias locales, reclutamiento de células inmunes adicionales en el sitio de interacción antígeno/célula T y activación de la cascada de células B, conduciendo a la producción de anticuerpos. Un isotipo de estos anticuerpos, IgE, es fundamentalmente importante para el desarrollo de síntomas alérgicos, y su producción está influida tempranamente en la cascada de eventos al nivel de la célula auxiliar de T por la naturaleza de las linfocinas secretadas. Un epítopo de célula T es el elemento básico, o la menor unidad de reconocimiento por un receptor de células T, en el que el epítopo comprende aminoácidos esenciales para el reconocimiento del receptor. Se describen también secuencias aminoacídicas que imitan aquellas de los epítopos de células T y que modifican la respuesta alérgica a alérgenos proteicos.

El examen en péptidos de aquellos que retienen una actividad de Der p III como se describe en la presente memoria puede realizarse utilizando uno o más ensayos diferentes. Por ejemplo, in vitro, la actividad estimulatoria de células T de Der p III se ensaya poniendo en contacto un péptido conocido por o sospechoso de tener una actividad de Der p III con una célula presentadora de antígeno que presenta moléculas de MHC apropiadas en un cultivo de células T. La presentación de un péptido que tiene una actividad de Der p III en asociación con moléculas de MHC apropiadas ante células T junto con la coestimulación necesaria, tiene el efecto de transmitir una señal a la célula T que induce la producción de niveles aumentados de citocinas, particularmente de interleucina-2 e interleucina-4. Puede obtenerse el sobrenadante de cultivo y ensayarse la interleucina-2 u otras citocinas conocidas. Por ejemplo, puede emplearse cualquiera de los diversos ensayos convencionales para interleucina-2, tales como el ensayo descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1333 (1989). Está también disponible un kit para ensayo de la producción de interferón en Genzyme Corporation (Cambridge, MA).

Como alternativa, un ensayo común para proliferación de células T conlleva medir la incorporación de timidina tritiada. La proliferación de células T puede medirse in vitro determinando la cantidad de timidina marcada con ^{3}H incorporada al ADN en replicación de células cultivadas. Por lo tanto, puede cuantificarse la velocidad de síntesis de ADN y, a su vez, la velocidad de división celular.

Se da a conocer también un péptido que tiene una actividad de Der p III en el que se examina la capacidad de inducir insensibilidad de células T. La capacidad de un péptido conocido por estimular células T (determinada mediante uno o más de los ensayos anteriormente descritos) de inhibir o bloquear completamente la actividad de Der p II nativa purificada o porción de la misma e inducir un estado de insensibilidad puede determinarse utilizando intentos posteriores de estimulación de las células T con células presentadoras de antígeno que presentan Der p III nativa o un péptido que tiene una actividad de Der p III, después de la exposición al péptido que tiene una actividad de Der p III. Si las células T son insensibles a los intentos de activación posteriores, como se determina mediante síntesis de interleucina-2 y/o proliferación de células T, se ha inducido un estado de insensibilidad. Véanse, por ejemplo, Gimmi et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6586-6590; y Schwartz (1990), Science 248: 1349-1356, para sistemas de ensayo que pueden utilizarse como base para un ensayo según la presente invención.

Los péptidos que tienen una actividad de Der p III se identifican mediante la actividad de unión a IgE. Por razones terapéuticas, los péptidos descritos en la presente memoria preferiblemente no se unen a IgE específica de un alérgeno de ácaro del polvo doméstico, o se unen a dicha IgE en un grado sustancialmente menor que el alérgeno de ácaro del polvo doméstico nativo se une a dicha IgE. La actividad de unión a IgE reducida designa la actividad de unión a IgE que es menor que la de la proteína Der p III nativa purificada. Si un péptido que tiene una actividad de Der p III ha de utilizarse como reactivo de diagnóstico, no es necesario que el péptido tenga una actividad de unión a IgE reducida comparado con el alérgeno de Der p III nativo. La actividad de unión a IgE de péptidos puede determinarse, por ejemplo, mediante un ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA) utilizando, por ejemplo, sueros obtenidos a partir de un sujeto (concretamente un sujeto alérgico) que se ha expuesto anteriormente al alérgeno Der p III nativo. Brevemente, el péptido sospechoso de tener una actividad de Der p III se recubre sobre pocillos de una placa de microvaloración. Después de lavar y bloquear los pocillos, se incuba en los pocillos la solución de anticuerpo constituida por el plasma de un sujeto alérgico que se ha expuesto a un péptido sospechoso de tener una actividad de Der p III. El plasma está generalmente libre de IgG antes de la incubación. Se añade un anticuerpo secundario marcado a los pocillos y se incuba. La cantidad de unión a IgE se cuantifica después y se compara con la cantidad de IgE unida por una proteína Der p IIII nativa purificada. Como alternativa, la actividad de unión a IgE de un péptido puede determinarse mediante análisis de transferencia Western. Por ejemplo, un péptido sospechoso de tener una actividad de Der p III se corre en un gel de poliacrilamida utilizado PAGE-SDS. Se transfiere después el péptido a nitrocelulosa y posteriormente se incuba con sueros de un sujeto alérgico. Después de incubar con un anticuerpo secundario marcado, se determina entonces la cantidad de IgE unida y se cuantifica.

Otro ensayo que puede utilizarse para determinar la actividad de unión a IgE de un péptido es un ensayo ELISA competitivo. Brevemente, se genera un conjunto de anticuerpos de IgE combinando plasma de sujetos alérgicos de ácaro del polvo doméstico que se ha mostrado mediante ELISA directa que tienen IgE reactivas con Der p III nativa. Este conjunto se utiliza en ensayos ELISA competitivos para comparar la unión a IgE de Der p III nativa y de un péptido sospechoso de tener una actividad de Der p III. Se determina y cuantifica la unión a IgE de la Der p III nativa y de un péptido sospechoso de tener una actividad de Der p III.

Si un péptido que tiene una actividad de Der p III se une a IgE y ha de utilizarse como agente terapéutico, es preferible que dicha unión no dé como resultado la liberación de mediadores (por ejemplo, histaminas) a partir de mastocitos o basófilos. Para determinar si un péptido que se une a IgE da como resultado la liberación de mediadores, puede realizarse un ensayo de liberación de histamina utilizando reactivos y protocolos estándar obtenidos en Amac, Inc. (Westbrook, ME). Brevemente, se combina una solución tamponada de un péptido sospechoso de tener una actividad de Der p III con un volumen igual de sangre entera heparinizada a partir de un sujeto alérgico. Después de mezclar e incubar, se sedimentan las células, se procesan los sobrenadantes y se analizan utilizando un radioimunoensayo para determinar la cantidad de histamina liberada.

Los péptidos que tienen una actividad de Der p III que se van a utilizar como agentes terapéuticos se ensayan preferiblemente en modelos de mamífero de atopia de ácaro del polvo doméstico, tales como el modelo de ratón dado a conocer en Tamura et al. (1986) Microbiol. Immunol. 30: 883-896 o en la patente de EE.UU. 4.939.239, o el modelo de primate dado a conocer en Chiba et al. (1990) Int. Arch. Allergy Immunol. 93: 83-88. El examen inicial de unión de IgE a un péptido que tiene una actividad de Der p III puede realizarse mediante ensayos de rascado o ensayos cutáneos intradérmicos en animales de laboratorio o voluntarios humanos, o en sistemas in vitro tales como RAST, inhibición RAST, ensayo ELISA, RIA (radioinmunoensayo) o un ensayo de liberación de histamina, como se describe anteriormente.

Es posible modificar la estructura de un péptido que tiene una actividad de Der p III para fines tales como aumentar la solubilidad, potenciar la eficacia terapéutica o profiláctica o la estabilidad (por ejemplo, la vida de almacenamiento ex vivo y la resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Dichos péptidos modificados se consideran equivalentes funcionales de péptidos que tienen una actividad de Der p III como se define en la presente memoria. Puede producirse un péptido modificado en el que la secuencia aminoacídica se haya alterado, tal como mediante sustitución, deleción o adición aminoacídica, para modificar la inmunogenicidad y/o reducir la alergenicidad o al que se haya añadido un componente con el mismo fin.

Por ejemplo, un péptido que tiene una actividad de Der p III puede modificarse de modo que mantenga la capacidad de inducir insensibilidad de células T y de unirse a proteínas MHC sin la capacidad de inducir una respuesta proliferativa fuerte o, posiblemente, cualquier respuesta proliferativa, cuando se administra en forma inmunogénica. En este caso, los restos de unión críticos para la función receptora de células T pueden determinarse utilizando técnicas conocidas (por ejemplo, sustitución de cada resto y determinación de la presencia o ausencia de reactividad de células T). Aquellos restos que se han mostrado esenciales para interacción con el receptor de células T pueden modificarse reemplazando el aminoácido esencial por otro, preferiblemente un resto aminoacídico similar (una sustitución conservativa) cuya presencia se muestra que potencia, reduce pero no elimina, o no afecta la reactividad de células T. Además, aquellos restos aminoacídicos que no son esenciales para la interacción de receptor de células T pueden modificarse reemplazándose por otro aminoácido cuya incorporación puede potenciar, reducir, pero no eliminar, o no afectar la reactividad de células T, pero cuya incorporación no elimina la unión a MHC relevante.

Adicionalmente, un péptido que tiene una actividad de Der p III puede modificarse reemplazando un aminoácido que se ha mostrado esencial para interacción con el complejo MHC-proteína por otro resto aminoacídico, preferiblemente similar (sustitución conservativa) cuya presencia se ha mostrado que potencia, reduce, pero no elimina, o no afecta la actividad de células T. Además, los restos aminoacídicos que no son esenciales para interacción con el complejo MHC-proteína, pero que siguen uniéndose al complejo MHC-proteína, pueden modificarse reemplazándose por otro aminoácido cuya incorporación puede potenciar, no afectar o reducir pero no eliminar, la reactividad de células T. Las sustituciones aminoacídicas preferidas para aminoácidos no esenciales incluyen, pero sin limitación, sustituciones por alanina, ácido glutámico o un metilaminoácido.

Otro ejemplo de modificación de un péptido que tiene una actividad de Der p III es la sustitución de restos de cisteína preferiblemente por restos de alanina, serina, treonina, leucina o ácido glutámico para minimizar la dimerización mediante enlaces disulfuro. Además, las cadenas laterales aminoacídicas de péptidos de la invención pueden modificarse químicamente. Otra modificación es la ciclación del péptido.

Para potenciar la estabilidad y/o reactividad, un péptido que tiene una actividad de Der p III puede modificarse para incorporar uno o más polimorfismos a la secuencia aminoacídica del alérgeno proteico resultante de cualquier variación alélica natural. Adicionalmente, pueden sustituirse o añadirse D-aminoácidos, aminoácidos no naturales o análogos no aminoacídicos para producir una proteína modificada dentro del alcance de esta invención. Además, un péptido que tiene una actividad de Der p III puede modificarse utilizando polietilenglicol (PEG) según el método de A. Sehon y colaboradores (Wie et al., supra), produciendo una proteína conjugada con PEG. Además, puede añadirse PEG durante la síntesis química de la proteína. Otras modificaciones de un péptido que tiene una actividad de Der p III incluyen reducción/alquilación (Tarr, "Methods of Protein Microcharacterization", J.E. Silver ed., Humana Press, Clifton, N.J., 155-194 (1986)); acilación (Tarr, supra); acoplamiento químico a un vehículo apropiado (Mishell y Shiigi, eds., "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman, San Francisco, CA (1980), Patente de EE.UU. 4.939.239;
o tratamiento moderado con formalina (Marsh (1971), Int. Arch. of Allergy and Appl. Immunol. 41: 199-215).

Para facilitar la purificación y aumentar potencialmente la solubilidad de un péptido que tiene una actividad de Der p III, es posible añadir un resto de fusión aminoacídica a la cadena principal peptídica. Por ejemplo, puede añadirse hexahistidina a la proteína para purificación mediante cromatografía de afinidad de ión metálico inmovilizado (Hochuli, E. et al., (1988), Bio/Technology 6: 1321-325). Además, para facilitar el aislamiento de péptidos libres de secuencias irrelevantes, pueden introducirse sitios de escisión de endoproteasas específicos entre las secuencias del resto de fusión y el péptido. Para desensibilizar exitosamente un sujeto ante la proteína Der p III o alérgeno relacionado, puede ser necesario aumentar la solubilidad de la proteína añadiendo grupos funcionales a la proteína u omitiendo regiones hidrofóbicas de la proteína.

Para ayudar potencialmente a un procesamiento de antígeno apropiado de epítopos de células T en Der p III, pueden introducirse por ingeniería genética sitios sensibles a proteasa canónicos entre regiones, comprendiendo cada una al menos un epítopo de células T, mediante métodos recombinantes o sintéticos. Por ejemplo, pueden introducirse pares de aminoácidos cargados, tales como KK o RR, entre regiones en una proteína o fragmento durante la construcción recombinante del mismo. El péptido resultante puede volverse sensible a la escisión mediante catepsina y/u otras enzimas similares a tripsina que generarían porciones de proteína que contienen uno o más epítopos de células T. Además, dichos restos aminoacídicos cargados pueden dar como resultado un aumento de la solubilidad del péptido.

La mutagénesis dirigida a sitio de un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una actividad de Der p III puede utilizarse para modificar la estructura del péptido mediante métodos conocidos en la técnica. Dichos métodos pueden incluir, entre otros, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores oligonucleotídicos que portan una o más mutaciones (Ho et al., (1989) Gene 77: 51-59) o la síntesis total de genes mutados (Hostomsky, Z. et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 161: 1056-1063). Para potenciar la expresión de proteína recombinante, pueden aplicarse los métodos anteriormente citados para cambiar los codones presentes en la secuencia de ADNc de la invención por aquellos utilizados preferiblemente por la célula huésped en la que se está expresando la proteína recombinante (Wada et al., supra).

Un anticuerpo específicamente reactivo con un péptido que tiene una actividad de Der p III. Los anticuerpos de esta invención pueden utilizarse para estandarizar extractos alergénicos o para aislar la forma de origen natural o nativa de Der p III. Por ejemplo, utilizando péptidos que tienen una actividad de Der p III basados en la secuencia de ADNc de Der p III, pueden prepararse antisueros o anticuerpos monoclonales anti-proteína/anti-péptido utilizando métodos estándar. Un mamífero tal como un ratón, un hámster o un conejo pueden inmunizarse con una forma inmunogénica del péptido (por ejemplo, la proteína Der p III o un fragmento antigénico que es capaz de desencadenar una respuesta de anticuerpo). Las técnicas para conferir inmunogenicidad a una proteína o péptido incluyen conjugación a vehículos u otras técnicas que son bien conocidas en la técnica. Puede administrarse un péptido que tiene una actividad de Der p III en presencia de coadyuvante. El progreso de la inmunización puede monitorizarse mediante la detección de titulaciones de anticuerpo en plasma o suero. Puede utilizarse ELISA estándar u otros inmunoensayos con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos.

Después de la inmunización, pueden obtenerse antisueros anti-Der p III y, si se desea, anticuerpos policlonales anti-Der p III aislados a partir del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, pueden recogerse células productoras de anticuerpo (linfocitos) a partir de un animal inmunizado y fusionarse mediante procedimientos de fusión celular somática estándar con células inmortalizadas tales como células de mieloma, proporcionando células de hibridoma. Dichas técnicas son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, la técnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (Nature (1975) 256: 495-497), así como otras técnicas tales como la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbar et al., Immunology Today (1983) 4: 72) y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., "Monoclonal antibodies and Cancer Therapy" (1985) Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96). En las células de hibridoma puede examinarse inmunoquímicamente la producción de anticuerpos específicamente reactivos con un péptido que tiene una actividad de Der p III y los anticuerpos monoclonales aislados.

El término anticuerpo como se utiliza en la presente memoria se pretende que incluya fragmentos del mismo que sean también específicamente reactivos con un péptido que tiene una actividad de Der p III. Los anticuerpos pueden fragmentarse utilizando técnicas convencionales, y examinarse en los fragmentos la utilidad de la misma manera que se describe anteriormente para anticuerpos enteros. Por ejemplo, pueden generarse fragmentos F(Ab')_{2} tratando anticuerpo con pepsina. El fragmento F(Ab')_{2} resultante puede tratarse para reducir puentes disulfuro, produciendo fragmentos Fab'. El anticuerpo se pretende adicionalmente que incluya moléculas biespecíficas y quiméricas que tengan una porción anti-Der p III.

Se describen también clones de células T y receptores de células T solubles específicamente reactivos con un péptido que tiene una actividad de Der p III. Las poblaciones de células T monoclonales (concretamente, células T genéticamente idénticas entre sí y que expresan receptores de células T idénticos) pueden derivar de un sujeto sensible a Der p III, seguido de estimulación in vitro repetitiva con una proteína o péptido Der p III que tiene una actividad de Der p II en presencia de células presentadoras de antígeno de MHC coincidente. Las células sensibles a Der p III-MHC individuales pueden clonarse después mediante dilución limitante y expandirse y mantenerse estirpes permanentes mediante reestimulación periódica in vitro. Como alternativa, pueden producirse hibridomas T-T específicos de Der p III mediante una técnica similar a la producción de hibridoma de células B. Por ejemplo: se inmuniza un mamífero tal como un ratón con un péptido que tiene una actividad de Der p III; las células T del mamífero pueden purificarse y fusionarse con una estirpe tumoral de células T de crecimiento autónomo. A partir de los hibridomas resultantes, se seleccionan células sensibles a un péptido que tiene una actividad de Der p III y se clonan. Se describen procedimientos para propagar poblaciones de células T monoclonales en "Cellular and Molecular Immunology" (Abul K. Abbas et al., ed.), W.B. Saunders Company, Filadelfia, PA (1991), página 139. Los receptores solubles de células T específicamente reactivos con un péptido que tiene una actividad de Der p III pueden obtenerse mediante inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo contra el receptor de células T como se describe en "Immunology: A Synthesis"
(2ª Edición), Edward S. Golub et al., ed., Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1991), páginas 366-369.

Los clones de células T específicamente reactivos con un péptido que tiene una actividad de Der p III pueden utilizarse para aislar y clonar molecularmente el gen que codifica el receptor de células T relevante. Además, puede utilizarse un receptor soluble de células T específicamente reactivo con un péptido que tiene una actividad de
Der p III para interferir con o inhibir la activación dependiente de antígeno de la subpoblación de células T relevante, por ejemplo, mediante administración a un sujeto sensible a Der p III. Los anticuerpos específicamente reactivos con dicho receptor de células T pueden producirse según las técnicas descritas en la presente memoria. Dichos anticuerpos pueden utilizarse para bloquear o interferir la interacción de células T con péptidos presentados por MHC.

La exposición de sujetos alérgicos a péptidos que tienen una actividad de Der p III y que tienen actividad estimulatoria de células T puede causar que las subpoblaciones de células T apropiadas se vuelvan insensibles al alérgeno proteico respectivo (por ejemplo, no consigan estimular una respuesta inmune tras dicha exposición). Además, dicha administración puede modificar el perfil de secreción de linfocina comparado con la exposición al alérgeno proteico de origen natural o porción del mismo (por ejemplo, dando como resultado una reducción de IL-4 y/o un aumento de IL-2). Además, la exposición a péptidos que tienen una actividad de Der p III que tienen actividad estimulatoria de células T puede influir en subpoblaciones de células T que participan normalmente en la respuesta al alérgeno de tal modo que estas células T se retiran de(de los) sitio(s) de exposición normal al alérgeno (por ejemplo, mucosa nasal, piel y pulmón) hacia el(los) sitio(s) de administración terapéutica de la proteína o fragmento derivado de la misma. Esta redistribución de subpoblaciones de células T puede mejorar o reducir la capacidad del sistema inmune de un sujeto de estimular la respuesta inmune habitual en el sitio de exposición normal al alérgeno, dando como resultado una reducción de los síntomas alérgicos.

Un péptido que tiene una actividad de Der p III, cuando se administra a un sujeto sensible a ácaros del polvo doméstico, es capaz de modificar la respuesta de células B, la respuesta de células T o tanto la respuesta de células B como de células T del sujeto ante el alérgeno. Como se utiliza en la presente memoria, la modificación de la respuesta alérgica de un sujeto a un alérgeno de ácaro del polvo doméstico puede definirse como insensibilidad o reducción de los síntomas al alérgeno, determinado mediante procedimientos clínicos estándar (véase, por ejemplo, Varney et al. (1990) British Medical Journal 302: 265-269), incluyendo reducción de los síntomas asmáticos inducidos por ácaro del polvo doméstico. Como se designa en la presente memoria, una reducción de los síntomas incluye cualquier reducción de la respuesta alérgica de un sujeto al alérgeno después de un régimen de tratamiento con un péptido de la invención. Esta reducción de los síntomas puede determinarse subjetivamente (por ejemplo, el sujeto se siente más cómodo tras exposición al alérgeno) o clínicamente, tal como con un ensayo cutáneo estándar.

Pueden utilizarse también péptidos o anticuerpos para detectar y diagnosticar sensibilidad a Der p III. Por ejemplo, esto podría hacerse combinando sangre o productos sanguíneos obtenidos a partir de un sujeto en el que se ha de evaluar su sensibilidad con un péptido que tiene una actividad de Der p III, en condiciones apropiadas para la unión de componentes de la sangre (por ejemplo, anticuerpos, células T, células B) con el(los) péptido(s) y la determinación del grado en que aparece dicha unión. Otros métodos diagnósticos para enfermedades alérgicas con los que pueden utilizarse los péptidos o anticuerpos de la presente invención incluyen ensayo radioalergosorbente (RAST), ensayo radioimunosorbente de papel (PRIST), ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA), radioimunoensayos (RIA), ensayos inmunoradiométricos (IRMA), inmunoensayos de luminiscencia (LIA), ensayos de liberación de histamina e inmunotransferencias de IgE.

En otro ensayo, puede determinarse la presencia en un sujeto de IgE específica de Der p III y la capacidad de células T del sujeto de responder a epítopos de células T de Der p III administrando al sujeto un ensayo de hipersensibilidad de tipo inmediata y/o un ensayo de hipersensibilidad de tipo retardado (véanse, por ejemplo, "Immunology" (1985) Roitt, I.M. Brostoff, J., Male, D.K. (eds), C.V. Mosby Co., Gower Medical Publishing, Londres, N.Y., pág. 19.2-19.18; pág. 22.1-22.10) utilizando un péptido que tiene una actividad de Der p III, o una forma modificada de un péptido que tiene una actividad de Der p III, cada uno de los cuales se une a IgE específica del alérgeno. Se administra a los mismos sujetos un ensayo de hipersensibilidad de tipo retardado antes, simultáneamente o posteriormente a la administración del ensayo de hipersensibilidad de tipo inmediato. Por supuesto, si el ensayo de hipersensibilidad de tipo inmediato se administra antes del ensayo de hipersensibilidad de tipo retardado, el ensayo de hipersensibilidad de tipo retardado se administrará a aquellos sujetos que exhiban una reacción de hipersensibilidad específica de tipo inmediato. El ensayo de hipersensibilidad de tipo retardado utiliza un péptido que tiene una actividad de Der p III que tiene actividad estimulatoria de células T humanas y que no se une a IgE específica del alérgeno en un porcentaje sustancial de la población de sujetos sensibles al alérgeno (por ejemplo, al menos aproximadamente un 75%). A aquellos sujetos que se encuentra que tienen tanto reacción de hipersensibilidad específica de tipo inmediato como reacción de hipersensibilidad específica de tipo retardado, se les administra una cantidad de una composición adecuada para administración farmacéutica. La composición comprende el péptido que tiene una actividad de Der p III como se utiliza en el ensayo de hipersensibilidad de tipo retardado y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Un péptido que tiene una actividad de Der p III puede utilizarse en métodos de tratamiento y prevención de reacciones alérgicas a un alérgeno de ácaro del polvo doméstico o alérgeno proteico reactivo cruzado. Por tanto, se describen composiciones adecuadas para administración farmacéutica que comprenden una cantidad de al menos un péptido que tiene una actividad de Der p III y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La administración de las composiciones a un sujeto que se va a desensibilizar puede llevarse a cabo utilizando procedimientos conocidos, a dosificaciones y durante periodos de tiempo eficaces para reducir la sensibilidad (concretamente, reducir la respuesta alérgica) del sujeto a ácaro del polvo doméstico. El término sujeto se pretende que incluya organismos vivos en los que puede desencadenarse una respuesta inmune, por ejemplo, mamíferos. Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos. La cantidad de al menos un péptido que tiene una actividad de Der p III necesaria para conseguir un efecto terapéutico puede variar según factores tales como el grado de sensibilidad del sujeto al ácaro del polvo doméstico, la edad, el sexo y el peso del sujeto, y la capacidad del péptido que tiene una actividad de Der p III de desencadenar una respuesta antigénica en el sujeto. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar una respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis
divididas al día o la dosis puede reducirse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica.

El compuesto activo (concretamente, al menos un péptido que tiene una actividad de Der p III) puede administrarse de manera conveniente tal como mediante inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, administración transdérmica o administración rectal. Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo puede recubrirse con un material para proteger al compuesto de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Para administrar un péptido que tiene una actividad de Der p III mediante una administración distinta de la parenteral, puede ser necesario recubrir el péptido, o coadministrar el péptido, con un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, un péptido que tiene una actividad de Der p III puede administrarse a un sujeto en un vehículo, diluyente o coadyuvante apropiado, coadministrarse con inhibidores enzimáticos o en un vehículo apropiado tal como liposomas. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones tampón acuosas. Se utiliza coadyuvante en su sentido más amplio, e incluye cualquier compuesto inmunoestimulante tal como interferón. Los coadyuvantes contemplados en la presente memoria incluyen resorcinoles, tensioactivos no iónicos tales como polioxietilenoleiléter y n-hexadecilpolietilenéter. Los inhibidores enzimáticos incluyen inhibidor de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DEP) y trasilol. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua, así como liposomas convencionales (Strejan et al. (1984), J. Neuroimmunol. 7: 27). Con fines de inducción de insensibilidad de células T, la
composición se administra preferiblemente en forma no inmunogénica, por ejemplo, una que no

\hbox{contenga
coadyuvante.}

El compuesto activo puede administrarse también por vía parenteral o intraperitoneal. Pueden prepararse también dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio o polialcoholes tales como manitol y sorbitol, en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando compuesto activo (concretamente, al menos un péptido que tiene una actividad de Der p III) en la cantidad necesaria a un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización, que proporcionan un polvo del ingrediente activo (concretamente, al menos un péptido que tiene una actividad de Der p III) más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución esterilizada anteriormente por filtración del mismo.

Cuando el péptido que tiene una actividad de Der p III está adecuadamente protegido, como se describe anteriormente, el péptido puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o en un vehículo comestible asimilable. El péptido y los otros ingredientes pueden incluirse también en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos o incorporarse directamente a la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse a excipientes y utilizarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. El porcentaje de ingrediente activo en las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variar y puede estar convenientemente entre aproximadamente 5 a aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtenga una dosificación adecuada.

Como se utiliza en la presente memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en composiciones adecuadas para administración farmacéutica. Pueden incorporarse también compuestos activos suplementarios a las composiciones.

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación por la facilidad de administración y la uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación como se utiliza en la presente memoria designa unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se han de tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación de las formas de unidad de dosificación de la invención está dictada por y es directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se ha de conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de combinación de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en sujetos.

La invención proporciona también una composición que comprende al menos dos péptidos que tienen una actividad de Der p III (por ejemplo, una mezcla física de al menos dos péptidos), teniendo cada uno actividad estimulatoria de células T. Como alternativa, puede administrarse a un sujeto alérgico un péptido que tiene al menos dos regiones, teniendo cada una actividad estimulatoria de células T (concretamente, comprendiendo cada región al menos un epítopo de células T). Puede administrarse una composición de dos péptidos que tienen una actividad de Der p III, o una composición de dos péptidos que tienen al menos dos regiones, teniendo cada una actividad estimulatoria de células T, a un sujeto en forma de una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable como se describe anteriormente en la presente memoria. Puede administrarse una cantidad de una o más de dichas composiciones simultánea o secuencialmente a un sujeto sensible a un alérgeno de ácaro del polvo doméstico para tratar dicha sensibilidad.

El ADNc (o el ARNm que sirvió como molde durante la transcripción inversa) que codifica un péptido que tiene una actividad de Der p III puede utilizarse para identificar ácidos nucleicos similares en cualquier variedad o tipo de animal y, por tanto, para clonar molecularmente genes que tienen suficiente homología de secuencia para hibridar con el ADNc que codifica un péptido que tiene una actividad de Der p III. Por tanto, la presente invención incluye no sólo péptidos que tienen una actividad de Der p III, sino también otras proteínas que pueden ser alérgenos codificados por ADN que hibridan con ADN de la presente invención.

Los péptidos aislados que están inmunológicamente relacionados con Der p III, tales como mediante reactividad cruzada de anticuerpo o reactividad cruzada de células T, distintos de los ya identificados, están dentro del alcance de la invención. Dichos péptidos se unen a anticuerpos específicos de la proteína y péptidos de la invención, o estimulan células T específicas de la proteína y péptidos de esta invención.

Un péptido que tiene una actividad de Der p III (concretamente, Der p III producida recombinantemente o mediante síntesis química) está libre de otras proteínas de ácaro del polvo doméstico y, por tanto, es útil en la estandarización de extractos de alérgeno, que son reactivos clave para el diagnóstico y el tratamiento de hipersensibilidad a ácaro del polvo doméstico. Además, dicho péptido es de una composición consistente bien definida y con actividad biológica para uso en preparaciones que se administrarán con fines terapéuticos (por ejemplo, para modificar la respuesta alérgica de un sujeto sensible a ácaro del polvo doméstico). Dichos péptidos pueden utilizarse también para estudiar el mecanismo de inmunoterapia de alergia a D. pteronyssinus y para diseñar derivados modificados o análogos útiles en inmunoterapia.

El trabajo de otros ha mostrado que altas dosis de extractos de alérgeno producen generalmente los mejores resultados durante la inmunoterapia (concretamente, mejor alivio de síntomas). Sin embargo, muchos sujetos son incapaces de tolerar grandes dosis de dichos extractos debido a las reacciones sistémicas desencadenadas por los alérgenos y otros componentes de estas preparaciones. Un péptido que tiene una actividad de Der p III tiene la ventaja de estar libre de todas las demás proteínas de ácaro. Por tanto, dicho péptido puede administrarse con fines terapéuticos con menos efectos secundarios previstos.

Es ahora posible también diseñar un agente o un fármaco capaz de bloquear o inhibir la capacidad de un alérgeno de ácaro del polvo doméstico de inducir una reacción alérgica en sujetos sensibles. Dichos agentes podrían diseñarse, por ejemplo, de tal manera que se unieran a moléculas de IgE anti-Derp III relevantes, previniendo así la unión IgE-alérgeno, y la posterior desgranulación de mastocitos/basófilos. Como alternativa, dichos agentes podrían unirse a componentes celulares del sistema inmune, dando como resultado la supresión o desensibilización de las respuestas alérgicas a alérgenos de ácaro del polvo doméstico. Un ejemplo no restrictivo de esto es el uso de péptidos que incluyen epítopos de células B o T de Der p III o modificaciones de los mismos, basados en la estructura proteica de ADNc de Der p III, para suprimir la respuesta alérgica a un alérgeno de ácaro del polvo doméstico. Esto podría llevarse a cabo definiendo las estructuras de los fragmentos que codifican epítopos de células B y T que afectan la función de células B y T en estudios in vitro con componentes sanguíneos de sujetos sensibles a ácaro del polvo doméstico.

Ejemplos Materiales y métodos Cultivos de D. pteronyssinus

Se adquirieron ácaros enteros en Commonwealth Serum Laboratories, Parkville, Australia y el medio agotado fue un obsequio de la misma fuente.

Purificación de Der p III nativa

Utilizando un método adaptado de Heymann et al. (Heymann et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1989) 83: 1055-1067), se aplicaron 15 ml de un medio de crecimiento agotado de D. pteronyssinus precipitado con sulfato de amonio saturado al 50-80% a una columna P-100 de poliacrilamida de 2 cm x 90 cm de flujo ascendente equilibrada con PBS (Pharmacia, LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia). El contenido de proteína de las fracciones de 5 ml eluídas se determinó mediante medición de la densidad óptica (A280 nm) y análisis por PAGE-SDS. Se agruparon aquellas fracciones que contenían predominantemente bandas en la región de 30 kDa, se concentraron mediante polietilenglicol 6000 (BDH Chemicals, Aust. PTY, Ltd. Kilsyth. Vic. Aus.) se dializaron frente a PBS y se pasaron por la columna de nuevo. Se repitió esto dos veces hasta que el análisis por PAGE-SDS determinó que las únicas bandas detectables eran un doblete de peso molecular de aproximadamente 30 kDa.

Análisis de secuencia de proteína

Se sometieron las proteínas Der p III y Der f III nativas purificadas por afinidad a HPEC utilizando un sistema de columna al 12% (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se sometieron después las proteínas purificadas por afinidad o las fracciones de HPEC de peso molecular apropiado a análisis de secuencia de proteína utilizando el secuenciador en fase gaseosa de Applied Biosystems modelo 477A con análisis de derivado de feniltiohidantoína en línea (modelo 120). Como alternativa, las proteínas purificadas por afinidad se separaron primero por PAGE-SDS (BioRad), se transfirieron a Problot (Applied Biosystems) y se secuenciaron utilizando un Beckman modelo LF3000. Después del análisis de secuencia inicial de las proteínas, se aplicó o-ftalaldehído para bloquear las terminaciones N excepto aquellas con prolinas (posición 13 para Der p III), para eliminar las secuencias peptídicas contaminantes y extender la secuencia N-terminal no ambiguamente. Se produjeron péptidos CNBr escindiendo las proteínas purificadas por afinidad con CNBr al 2% (p/v) en ácido fórmico al 70% (p/v) durante una noche a temperatura ambiente. Los péptidos digeridos se sometieron a HPEC para purificación y después se sometieron los fragmentos peptídicos a análisis de secuencia.

Uso de codón preferido

Se determinó el sesgo de uso de codón para las proteínas maduras Der f I (Dilworth et al., Clin. Exp. Allergy (1991) 21: 25-32), Der f II (Trudinger et al., Clin. Exp. Allergy (1991) 21: 33-37), Der p I (Chua et al., J. Exp. Med. (1988) 167: 175-182) y Der p II (Chua et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. (1990) 91: 118-123). Se determinó el uso porcentual medio de cada codón de triplete para cada aminoácido para cada una de estas cuatro proteínas de Dermatophagoides, y se tabularon los resultados en la Tabla 1.

TABLA 1 Tabla de uso de codón preferido para alérgenos de Dermatophagoides

Aminoácido	Codón	\hskip0.3cm %	Aminoácido	Codón	\hskip0.3cm %
Ala A	GCT	45,4	Pro P	CCA	87,2
	GCC	33,0		CCC	9,6
	GCA	21,6		CCG	3,2
	GCG	0,0		CCT	0,0

Cys C	TGT	55,2	Gln Q	CAA	94,4
	TGC	44,8		CAG	5,6

Asp D	GAT	92,3	Arg R	CGA	36,5
	GAC	7,7		CGT	41,6
				CGC	16,5
Glue E	GAA	100,0		AGA	5,4
	GAG	0,0		CGG	0,0
				AGG	0,0
Phe F	TTC	82,5
	TTT	17,5	Ser S	TCA	42,5
				TCT	18,4
Gly G	GGT	65,2		AGT	11,2
	GGA	24,5		TCG	11,2
	GGC	10,3		AGC	10,2
	GGG	0,0		TCC	6,5

His H	CAT	78,8	Thr T	ACT	39,2
	CAC	21,2		ACA	35,0
				ACC	18,9
Ile I	ATT	50,0		ACG	6,9
	ATC	48,5
	ATA	1,5	Val V	GTT	51,2
				GTC	33,8
Lys K	AAA	99,0		GTA	12,3
	AAG	1,0		GTG	2,7

Leu L	TTG	64,5	Trp W	TGG	100,0
	TTA	18,5
	CTC	8,0	Tyr Y	TAT	62,2
	CTT	6,5		TAC	38,0
	CTG	2,5
	CTA	0,0	Parp	TAA	75,0
				TGA	25,0
Met M	ATG	100,0		TAG	0,0

Asn N	AAT	52,0
	AAC	48,0

Construcción de biblioteca de ADNc de \lambda gt10 de D. pteronyssinus

Se utilizó ARNm poliadenilado (10 \mug) para sintetizar ADNc mediante el método de la ARNasa H (Gubler, et al., Gene (1983) 25: 263-269) utilizando un kit (Amersham International, Aylesbury, R.U.). Después de la adición de engarces de enzima de restricción EcoRI (New England Biolabs, Beverly, EE.UU.), se ligó el ADNc a brazos de lambda gt10 tratados con fosfatasa alcalina (Promega Biotec, Madison, Wisc). Se empaquetó el ADN de fago recombinante y se sembró en JP777 de E. coli, produciendo una biblioteca de 5 x 10^{5} recombinantes.

Marcaje terminal con quinasa de oligonucleótidos

Se sintetizaron oligonucleótidos utilizando un Applied Biosystems PCR mate (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se marcaron terminalmente 20 pmol de ADN oligonucleotídico con (\gamma-^{32}P)-ATP utilizando polinucleótido quinasa T4 (Promega Corp., Madison, Wisc.) (Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook, J. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). El oligonucleótido marcado se purificó mediante electroforesis en gel de poliacrilamina al 15% y se eluyó posteriormente con agua destilada estéril.

Aislamiento de clones de ADNc de Der p III a partir de la biblioteca de ADNc de \lambda gt10

Se realizó el examen de la biblioteca con dos sondas diseñadas utilizando tanto datos de secuencia de proteína N-terminales como internos obtenidos como se describe anteriormente para alérgenos del grupo III. La primera, P3forward3 (P3F3), era un polímero de 38 unidades de longitud con la siguiente secuencia nucleotídica: 5'-TCA
GAAAAAGCTTTGGCTGGTGAATCACCATATCAAAT 3' (SEQ ID NO:8). La segunda sonda, P3reverse4 (P3R4), un polímero de 41 unidades con la siguiente secuencia nucleotídica, 5'-GAATCAACACCACCATTAGCAACATCAC
CACCGCAAATCAT-3' (SEQ ID NO:9). Se sembró la biblioteca a 25.000 ufp por placa Petri de 150 mm y se transfirió el fago sobre nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Se desnaturalizaron las transferencias de filtro duplicadas de cada placa y se calentaron para hibridación con una diferente de las dos sondas (Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook, "J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Se realizaron las hibridaciones en mezcla de hibridación (6 x cloruro de sodio/citrato de sodio, pH 7,0 (SSC), 0,1% de Denhardts, ADN de esperma de arenque desnaturalizado 100 \mug/ml) a 42ºC con 10^{6} cpm/ml de sonda marcada durante una noche. Se lavaron los filtros tres veces a 42ºC durante 20 min y después a 50ºC durante 10 min en 400 ml de una solución de lavado que contenía 6 x SSC, 0,1% de Triton X-100.

Aislamiento de ADN a partir de clones de Der p III de \lambda gt10

Se preparó ADN de fago a partir de clones de Der p III utilizando un procedimiento de precipitación con polietilenglicol (Chua et al., J. Exp. Med. (1988) 167: 175-182).

Subclonación y secuenciación de ADN

Se digirió ADN de fago Der p III purificado con enzima de restricción EcoRI (Toyobo) y se ligó el fragmento liberado al vector de secuenciación M13mp19 digerido con la enzima de restricción EcoRI (Messing, Meth. Enzymol. (1983), 101: 20-78). Se transformó el ADN recombinante utilizando TG-1 de E. coli y se realizó la secuenciación utilizando el método de terminación de cadena didesoxinucleótido y Sequenase (U.S. Biochemicals) (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 5463-5467). Los cebadores oligonucleotídicos utilizados para secuenciar incluyeron los cebadores universales, un cebador de secuenciación de 17 unidades (-40) 5'-CAGCACTGACCCTTTTG-3' (SEQ ID NO:4) y un cebador de secuenciación inverso de 16 unidades (-24) 5'-AACAGCTATGACCATG-3' (SEC ID NO:5), los dos cebadores internos utilizados para examen de biblioteca (SEQ ID NOS: 8 y 9) y los dos cebadores internos P3forward5 (P3F5) 5'-AAAGCTGTTGGATTACCA-3' (SEQ ID NO:6) y P3reverse5 (P3R5) 5'-TACATCC
GATCCTTTTGC-3' (SEQ ID NO:7) y P3F4 5-GCGGATCCATTGTTGGTGGT-3' (SEQ ID NO:18). Las dos sondas internas se diseñaron para corresponder a los restos nucleotídicos 456-473 (P3F5) y 491-474 (P3R5) (Figuras 1A y 1B). Se utilizaron los cebadores para secuenciar el clon aislado en ambas orientaciones.

Análisis de secuencia de ADN y proteína

Se realizaron los análisis de secuencia utilizando el software MAC VECTOR (IBI, New Haven, EE.UU.). Se realizó el cálculo informático de la homología de secuencia con otras proteínas en el NCBI utilizando el servicio de red BLAST. La versión de BLAST utilizada fue BLAST 1.3.1OMP (7 de Julio de 1993).

Ejemplo 1 Secuencia de alérgenos del grupo III nativos

El procedimiento de aislamiento de proteína produjo una muestra de Der p III que corrió en forma de doblete con pesos moleculares de 30 y 28 kDa cuando se analizó por PAGE-SDS. Ambas bandas reaccionaron con anti-Der f III de ratón policlonal según la reactividad cruzada interespecie anteriormente reseñada (Thomas et al., Exp. Appl. Acarol. (1992) 16: 153-164). La Der f III aislada a partir de una columna de anticuerpo monoclonal 5A12 (Heymann et al., J. Allergy Clin. Immun. (1989): 1055-1067) exhibió características similares. Utilizando o-ftaldehído para eliminar las secuencias de proteína contaminantes, la secuenciación N-terminal tanto de Der p III como Der f III nativas corrigió y extendió la secuencia de Der p III conocida y extendió la secuencia de Der f III. La secuencia N-terminal de Der p III se extendió a IVGGEKALAGQSPYQISLQSSSHFSGGTIL (SEQ ID NO:16). La secuencia N-terminal de Der f III se extendió a IVGGVKAKAGDSPYQISLQSSSHFXGGSILD (SEQ ID NO:15). La comparación de los datos de secuencia publicados por Stewart et al. (Immunology (1992) 75: 29-35) y Heymann et al., (J. Allergy Clin. Immunol. (1989) 83: 1055-1067) para alérgenos del grupo III con los datos de la presente memoria indicó varios errores en la secuencia publicada. En particular, se encontró un cambio no conservativo en el residuo 8 desde una lisina cargada positivamente a una leucina hidrofóbica no polar (Der f III, Heymann et al., J. Allergy Clin. Immunol. (1989) 83: 1055-1067). Se aislaron dos péptidos internos de Der f III mediante HPEC después de digestión con CNBr de la proteína natural, MICGGDVANGGVDSEQGD (SEQ ID NO:10) y MTLDQTNAKPVPLPTS (SEQ ID NO:12).

Ejemplo 2 Secuencia de Der p III recombinante

Se utilizó la información de secuencia proteica obtenida como se describe en el Ejemplo 1 junto con los datos de uso de codón preferido (Tabla 1) para construir dos sondas oligonucleotídicas. Estos oligonucleótidos se diseñaron para hibridar con los restos nucleotídicos 159-196 y con los restos 688-648 del clon de Der p III (Figuras 2A y 2B). Sólo se aislaron los clones que hibridaron fuertemente con ambas sondas a partir de la biblioteca de ADNc de \lambda gt10. La secuencia nucleotídica resultante para el clon P3WS1 y la secuencia aminoacídica deducida se muestran en las Figuras 1A y 1B. La secuencia nucleotídica completa era de 1.059 pb de longitud. Esto incluye una región de no codificación 5' de 62 pb, una región no traducida 3' de 211 pb y un marco abierto de lectura de 786 pb con un codón de paro (TGA) en los restos nucleotídicos 846-848. No hay cola de poliA, pero parece haber una señal de poliadenilación (AATAAA). El marco abierto de lectura codifica una proteína que incluye una región prepro de 29 aminoácidos y, partiendo de la isoleucina N-terminal, una proteína madura de 232 restos aminoacídicos con un peso molecular calculado de 24.985 y pI de 8,5. El resto de metionina (ATG) en la posición aminoacídica -29 es el sitio de iniciación de la traducción más probable. La selección de este sitio de iniciación se basó en parte en la presencia de una secuencia después de la metionina que codifica un péptido señal clásico de 18 restos aminoacídicos, con restos hidrofóbicos presentes predominantemente. Además, la secuencia inmediata anterior a este codón ATG, 5'-GAAAGATG-3', se ajusta aproximadamente a la secuencia consenso de Kozak (CCACCATG) para el sitio de iniciación de la traducción eucariótica, con la purina crucial (lo más frecuentemente A) en la posición -3 (Kozak, Nucleic Acid Research (1984) 12: 857-872).

Los datos de secuenciación de proteína de Der p III descritos en el Ejemplo 1 difieren de la secuencia aminoacídica deducida a partir del ADNc del clon P3WS1 como resultado de las sustituciones Glu/Gln en el resto 11 y una posible sustitución Cys/Ser en el resto 17. Estas sustituciones pueden deberse a la existencia de Der p III en diferentes isoformas. El análisis de la secuencia proteica deducida para P3WS1 de Der p III confirmó que la posición del péptido CNBr 1 de Der f III (MI(C)GGDVANGGVDS(E)QGD) (SEQ ID NO:10) se predijo correctamente que estaba en los restos aminoacídicos 177-183, y tiene un 88% de identidad con la secuencia recombinante en esta región, MICGGD
VANGGKDSCQD (SEQ ID NO:11). De forma interesante, hay dos cambios no conservativos idénticos que existen cuando la secuencia del péptido Der f III nativo se alinea con la secuencia del clon P3WS1. Existe un cambio desde una valina hidrofóbica no polar en 178 (según la numeración en las Figuras 1A y 1B) en Der f III a un resto de lisina cargado positivamente en las secuencias del clon P3WS1. El otro cambio es un resto ácido glutámico en 181 en Der f III sustituido por un resto de cisteína en la secuencia del clon P3WS1. La cisteína forma uno de los puentes disulfuro tanto en éstas como en la mayoría de otras proteínas tripsina. La alineación predicha del segundo péptido Der f III, (M)TLDQTNA(K)PVPL(P)(T)(S) (SEQ ID NO:12) producido por la digestión con CNBr fue de los restos aminoacídicos 95-110 (MKLIVQKNAKAVGLPAK) (SEQ ID NO:13). Existe un 63% de homología con el clon P3WS1 en esta región. Estas diferencias entre las secuencias proteicas de Der p III y Der f III son consistentes con el 20% de variación de secuencia
encontrada entre otros alérgenos homólogos de esta especie tales como Der p I y Der f I; y Der p II y Der f II.

La secuencia completa del clon P3SW1 de Der p III codifica una proteína de 319 aminoácidos, Der p III que, como todas las tripsinas conocidas, se sintetiza en forma de un zimógeno prepro. El sitio de escisión del péptido señal se postula que está entre los restos aminoacídicos -12 y -11, ya que los restos alrededor de este sitio se ajustan a las limitaciones aminoacídicas descritas por von Heijne (von Heijne, Eur. J. Biochem. (1983) 133: 17-21). Von Heijne propuso que los aminoácidos neutros pequeños se prefieren fuertemente en las posiciones -1 y -3 del sitio de escisión, tales como la alanina y tirosina observadas en el gen Der p III. Los restos de prolina no se encuentran nunca en las posiciones +1 a -3, excluyendo así cualquier otro sitio. La mayoría de las proteínas tripsina de mamíferos se ha reseñado que tienen péptidos pre o señal de 15 ó 16 aminoácidos. El péptido Der p III es de 18 aminoácidos de longitud. Aunque la diferencia en longitud es relativamente pequeña, parece que la longitud del péptido señal puede ser atribuible a la diversidad filogenética de las especies a partir de las que se origina la tripsina. Esto es más evidente en Streptomyces griseus, con un péptido pre de 32 aminoácidos (Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991) 181: 707-713). Se ha reseñado también que, para tripsinas de mamíferos, el péptido señal contiene dos agrupaciones específicas de dos y después cuatro restos hidrofóbicos (MacDonald et al., J. Biol. Chem. (1982) 257: 9724-9732; Le Huerou et al., Eur. J. Biochem. (1990) 193: 767-773). Existe abundancia de restos hidrofóbicos en esta región del gen Der p III, pero no están dispuestos en agrupaciones altamente conservadas. Sucede lo mismo en los péptidos señal tanto de Drosophila melangastor (Davis et al., Nucleic Acids Research (1988) 13: 6605-6615) como de S. griseus (Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991) 181: 707-713). Por lo tanto, es posible que las agrupaciones altamente conservadas de restos hidrofóbicos no sean una característica de todas las proteínas tripsina, sino en lugar de ello de las tripsinas de mamíferos.

Cadena abajo del péptido señal está el péptido de preactivación de 11 restos, de los restos aminoacídicos -11 a -1. La comparación de esta región pro con otras regiones pro de tripsinas de diversas especies indica que el péptido pro
Der p III es inhabitual. Tanto las tripsinas de vertebrados como de invertebrados se ha mostrado que tienen un octapéptido y/o un hexapéptido de región pro, con cuatro restos contiguos de aspartilo seguidos por un resto de lisina en la posición -1 (Le Huerou et al., Eur. J. Biochem. (1990) 193: 767-773). Es la región carboxilo de este resto de lisina la que se escinde durante la activación del tripsinógeno a tripsina. La Der p III carece de esta secuencia de poliaspartil-lisina. Por lo tanto, el tripsinógeno no puede activarse mediante el mecanismo habitual. Existen unas pocas otras tripsinas que son similares a Der p III en este aspecto, D. melangastor (Davis et al., Nucleic Acid Research (1988) 13: 6605-6615), S. griseus (Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991) 181: 707-713) y, lo más interesantemente, una tripsina aniónica de 32 kDa de páncreas de rata (Gendry y Launay, Biochemica et Biophysica Acta (1988) 955: 243-249). Este grupo mostró que la enteroquinasa, una enzima que tiene una afinidad altamente específica por los restos de poliaspartil-lisina en proteínas tripsina, no tenía efecto sobre la tripsina que aislaron. Sugirieron, por lo tanto, que se estaba utilizando un mecanismo diferente para el proceso de activación. La ausencia de cualquier homología de la región de proenzima de Der p III con cualquiera de las secuencias conocidas puede implicar un mecanismo de activación único.

Una búsqueda de la base de datos de proteínas ha confirmado que P3WS1 de Der p III es homólogo tanto con tripsinas de vertebrados como de invertebrados. El alérgeno Der p III no es una quimotripsina de ácaro (Gendry y Launay, Biochemica et Biophysica Acta (1988) 955: 243-249), ya que la comparación con las secuencias proteicas N-terminales mostró que diferían en tanto como un 50%. Las Figuras 2A y 2B muestran una comparación de las secuencias aminoacídicas de tripsinas de P3WS1 de Der p III y cangrejo de río (SEQ ID NOS: 2 y 3). El cangrejo de río tiene un 44% de homología con Der p III. Hay siete restos de cisteína, seis de estos restos son conocidos por formar puentes disulfuro, 54-70, 181-198 y 210-236 (Figuras 2A y 2B) (Hartley, Phil. Trans. Roy Soc. Lond. B (1970) 257: 77-87). Lo más importantemente, la proteína Der p III contiene los restos altamente conservados implicados en la actividad catalítica y la especificidad de sustrato de las proteínas tripsina. Los His 40 y Ser 185 conservados (Figuras 1A y 1B) representan el sistema de relé de carga que comprende el sitio catalítico activo de la enzima tripsina. El resto de ácido aspártico cargado positivamente en 179 representa el sitio de especificidad de tripsina. La mayoría de las serinproteasas tienen un aminoácido neutro en este resto (Keil, "The Enzymes", Academic Press, Nueva York, 1971, páginas 249-279). Los restos de glicina en 206 y 211 en combinación con el ácido aspártico en 179 son responsables de la acomodación de las cadenas laterales cargadas positivamente voluminosas de lisina y arginina, los restos escindidos por tripsinas. Los restos aminoacídicos 179-185 y 202-206 (Figuras 1A y 1B) forman las cavidades de unión S1, que están implicadas en la unión del sustrato a la molécula de tripsina. Las zonas que rodean inmediatamente todos estos restos importantes son las regiones más conservadas de la proteína Der p III. Todos estos resultados son consistentes con el hecho de que entre las proteínas tripsina de diferentes especies aparecen variaciones estructurales en aquellas regiones de la molécula que no son importantes para la actividad catalítica (Vithayathil et al., Arch. Biochem. Biophys. (1961) 92: 532-540).

La mayoría de las proteínas tripsina tienen generalmente un apareamiento común de restos de cisteína formando seis puentes disulfuro, siendo dos de estos puentes, Cys 15-145 y Cys 117-218, únicos en este grupo de proteínas. En Der p III, como tanto en cangrejo de río (Titani et al., Biochemistry (1983) 22: 1459-1465) como en S. griseus, faltan estos dos enlaces únicos pero, lo más importantemente, Der p III es única porque contiene un resto de cisteína no apareado extra. Este resto puede ser el equivalente a la Cys 15 de la tripsina bovina que, al contrario que Cys 145, 117 y 218, no fue eliminada durante la divergencia evolutiva de la tripsina de ácaro.

El aislamiento del gen que codifica la secuencia nucleotídica del alérgeno del grupo III, Der p III, es la primera determinación de secuencia primaria para este grupo de alérgenos de Dermatophagoides. La comparación de la secuencia con otras serinproteasas de vertebrados e invertebrados a la vista de experimentos de unión de sustrato (Stewart et al., Immunology (1992) 75: 29-35; Ando et al., Arerugi (1992) 41: 704-707), indica que los alérgenos del grupo III son proteínas tripsina. Las proteínas tripsina se secretan en forma de zimógenos prepro por las células acinares pancreáticas de todos las especies de vertebrados e invertebrados. Se ha reseñado que las tripsinas de invertebrados tienen un peso molecular en el intervalo de 20 a 30 kDa (Graf et al., Insect Biochem. (1985) 15: 611-618). El tripsinógeno de P3WS1 de Der p III tiene un peso molecular calculado de 28 kDa, y la correspondiente proteína madura un peso molecular de 24.985 kDa, mientras que la proteína nativa purificada existía en forma de un duplicado de 28 y 30 kDa estimado por PAGE-SDS. Ha habido otros informes de aislamiento de bandas de proteína múltiples tanto para Der f III (Thomas et al., Exp. Appl. Acarol. (1992) 16: 153-164) como para Der p III (Stewart et al., Immunology (1992) 75: 29-35). Estos resultados no son inhabituales, ya que las proteínas tripsina son conocidas por existir en diversas isoformas. Gendry y Launay (1988) aislaron bandas de proteína duplicadas de una proteína de tipo tripsina aniónica a partir de páncreas de rata. Demostraron que la banda mayor de 32 kDa representaba la tripsina inactiva y que la banda menor de 30 kDa representaba la forma activa de la tripsina, que podía autocatalizar la escisión de la banda de 32 kDa. Por lo tanto, es posible que la banda de 30 kDa represente el tripsinógeno inactivo y la banda de 28 kDa la tripsina activa. El número de isozimas para tripsinas de invertebrado se ha reseñado que está en el intervalo de 1-12 (MacDonald et al., J. Biol. Chem. (1982) 212: 9724-9732). Stewart et al. (1992) propusieron que existían nueve isoformas principales de Der p III, con pI en el intervalo de 4 a >8.

Ejemplo 3 Expresión y purificación de Der p III recombinante

Se digirió un inserto de ADN complementario que codifica Der p III (Figuras 1A y 1B) con EcoRI y se insertó en pUC 19. Para retirar la secuencia 5' no traducida, así como parte del supuesto líder hidrofóbico, se escindió el ADNc con Mscl y se añadió un engarce EcoRI. Posteriormente, se digirió con EcoRI el fragmento de Der p III truncado y se subclonó en el vector de expresión pET11d (Studier et al., "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology", 185, Academic Press, San Diego, California (1990), 60-89). Se verificaron la secuencia y el marco de lectura mediante secuenciación de ADN. La secuencia de codificación de Der p III abarcaba el resto 13 hasta el codón de paro (véanse las Figuras 1A y 1B). Se transformó el vector de expresión pET11d Der p III en la cepa huésped BL21 (DE3) de E. coli y se seleccionó en placas que contenían ampicilina 150 \mug/ml (Studier et al., "Gene Expression Technology: Methods in Enzymology" 185, Academic Press, San Diego, California (1990), 60-89). Creció una sola colonia transformante en 2 ml de volumen de medio BHIB que contenía ampicilina 150 \mug/ml a 37ºC durante aproximadamente 6 horas. Se dispersaron 10 ml de este cultivo sobre una placa de selección y se dejo crecer durante una noche a 37ºC. Se recuperó el césped bacteriano en 2 ml de medio, se añadió a 500 ml de medio BHIB (ampicilina 150 \mug/ml) y creció a 37ºC hasta A600= 1,0. Se indujo la expresión recombinante mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM. Después de 2 h de crecimiento, se recogieron las células, se lisaron y se solubilizaron las proteínas en tampón HCl-guanidina 6 M que contenía 2-ME 100 mM como se ha descrito anteriormente para los alérgenos recombinantes de ambrosía, Amb a I.1 y Amb a II (Rogers et al. (1991) L. Immunol. 142: 2547-2552).

Se sometió el lisado de HCl-guanidina que contenía Der p III a cromatografía de afinidad de ión metálico Ni^{2+} en condiciones desnaturalizantes en urea 8 M (Hochuli, E. et al., (1988) Bio/Technology 6: 1321-1325). Después de la elución del soporte quelante de Ni^{2+}, QIAGEN NTA-agarosa (Diagen GmH, Dusseldorf, Alemania), se sometieron las preparaciones de proteína Der p III recombinante a análisis PAGE-SDS (Figura 3).

La Der p III recombinante tenía un peso molecular esperado de aproximadamente 27 kDa como predecían los 252 aminoácidos más los aminoácidos utilizados como cola de purificación (MGHHHHHHEF (SEQ ID NO:17)). El sistema de expresión pET11d y el método de cromatografía de afinidad de ión metálico Ni^{2+} generaron aproximadamente 12 mg de Der p III recombinante por litro de medio de crecimiento (evaluado mediante medida de la A280). Este esquema de expresión y purificación proporcionó una preparación de proteína con una pureza superior a 90%, evaluada por PAGE-SDS, visualizada por tinción con azul de Coomasie (Figura 3). El peso molecular aparente observado de aproximadamente 32 kDa es ligeramente mayor que el predicho a partir de la estructura primaria (Figuras 1A y 1B, y anteriormente). En la Figura 3, se examinaron concentraciones crecientes de preparación de Der p III para verificar la pureza (carril 1, 4,3 \mug; carril 2, 8,7 \mug; carril 3, 13,8 \mug; carril 4, 17,4 \mug; los marcadores se indican por M).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: IMMULOGIC PHARMACEUTICAL CORPORATION

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 610 LINCOLN STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: WALTHAM

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(D): ESTADO: MASSACHUSETTS

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02154

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: (617) 466-6000

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: (617) 466-6010

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UN ALERGENO DE ÁCARO DEL POLVO DOMÉSTICO, DER P III, Y USOS PARA LOS MISMOS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: LAHIVE & COCKFIELD

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 60 STATE STREET, SUITE 510

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: BOSTON

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: MA

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): ZIP: 02109

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(v): FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

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(A): TIPO DE MEDIO: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: compatible con PC-IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: TEXTO ASCII

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/163.919

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 8 DE DICIEMBRE DE 1993

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(viii): INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: MANDRAGOURAS, AMY E.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 36.207

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 072.OUS (IMI-041PC)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (617) 227-7400

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (617) 227-5941

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1059 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 63...848

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 150...848

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1

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1

2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 261 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 237 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

4

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCACTGAC GGTTTTG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACAGCTATG ACCATG

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGCTGTTG GATTACCA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACATCCGAT CCTTTTGC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGAAAAAG CTTTGGCTGG TGAATCACCA TATCAAAT

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATCAACAC CACCATTAGC AACATCACCA CCGCAAATCA T

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ile Cys Gly Gly Asp Val Ala Asn Gly Gly Val Asp Ser Glu Gln}

\sac{Gly Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ile Cys Gly Gly Asp Val Ala Asn Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln}

\sac{Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Thr Leu Asp Gln Thr Asn Ala Lys Pro Val Pro Leu Pro Thr Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Leu Asn Gln Lys Asn Ala Lys Ala Val Glu Leu Pro Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Asn Gln Val Val Gly Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Val Gly Gly Val Lys Ala Lys Ala Gly Asp Ser Pro Tyr Gln Ile}

\sac{Ser Leu Gln Ser Ser Ser His Phe Xaa Gly Gly Ser Ile Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Val Gly Gly Glu Lys Ala Leu Ala Gly Gln Ser Pro Tyr Gln Ile}

\sac{Ser Leu Gln Ser Ser Ser His Phe Ser Gly Gly Thr Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gly His His His His His His Glu Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CATENARIEDAD: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGATCCAT TGTTGGTGGT

\hfill

20

Claims

1. Un ácido nucleico recombinante o sintético que codifica un alérgeno proteico Der p III, en el que el ácido nucleico (a) comprende la secuencia nucleotídica mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1); o (b) comprende la región de codificación de la secuencia nucleotídica mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1); o (c) comprende una secuencia nucleotídica que es al menos un 90% idéntica a la secuencia nucleotídica mostrada en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO:1).

2. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Una célula huésped transfectada con el vector de expresión recombinante de la reivindicación 2 capaz de dirigir la expresión de un péptido que tiene una actividad de Der p III.

4. Una célula huésped según la reivindicación 3, en la que la célula huésped es una célula eucariótica.

5. Un método de detección de la sensibilidad en un sujeto a un alérgeno de ácaro del polvo doméstico, que comprende combinar una muestra de sangre obtenida a partir del sujeto con un alérgeno proteico codificado por el ácido nucleico, vector de expresión recombinante o célula huésped de las reivindicaciones 1 a 4 en condiciones apropiadas para la unión de los componentes sanguíneos con el alérgeno proteico, y determinar el grado en que dicha unión ocurre, opcionalmente, en el que el grado en que ocurre la unión se determina evaluando funciones de células T, proliferación de células T, función de células B, unión de la proteína a anticuerpos presentes en la sangre o una combinación de las mismas.

6. Un proceso para producir una composición farmacéutica o reactivo de diagnóstico que comprende un alérgeno proteico de ácaro del polvo doméstico recombinante, comprendiendo el proceso las etapas de: (a) cultivar una célula huésped que contiene un vector de expresión que comprende una molécula de ADN que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 1.

7. El proceso de la reivindicación 6, en el que el vector de expresión comprende una secuencia regulatoria ligada operativamente a la secuencia nucleotídica.

8. El proceso de la reivindicación 6 ó 7, en el que el alérgeno proteico está fusionado o coexpresado con un polipéptido adicional.

9. El proceso de la reivindicación 8, en el que el polipéptido adicional es glutation-S-transferasa.

10. Un proceso de síntesis química para producir una composición farmacéutica o reactivo de diagnóstico que comprende un alérgeno proteico de ácaro del polvo doméstico, estando codificado dicho alérgeno por el ácido nucleico según la reivindicación 1.