JPH09510083A

JPH09510083A - 家庭のちりのダニ・アレルゲン、ＤｅｒｐＩＩＩをコードしている核酸、およびそれらの使用

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Publication number: JPH09510083A
Application number: JP7516316A
Authority: JP
Inventors: ウエイン・アールトーマス，; カウ−ヤンチユア，; ブルース・エルロジヤース，; メイ−チヤングクオ，
Original assignee: イミユロジク・フアーマシユーチカル・コーポレーシヨン; インステイテユート・フオー・チヤイルド・ヘルス・リサーチ
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 1997-10-14
Also published as: NO962407L; US20050123569A1; US9447154B2; EP0733064A1; ATE320445T1; NO962407D0; KR20040004481A; US6180771B1; US20110117116A1; NZ277698A; AU697491B2; US20110059522A1; AU1302795A; ES2260760T3; US7666429B2; US8287875B2; US6752991B1; NO317850B1; CA2177612C; EP0733064B1

Abstract

(57)【要約】デルマトファゴイデス・プテロニッシナス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）のアレルゲン、ＤｅｒｐＩＩＩをコードしている単離された核酸が、開示される。また、ＤｅｒｐＩＩＩ活性および推定分子量２４，９８５ダルトンをもつペプチドをコードしているｃＤＮＡが、開示される。その核酸は、サンプル中にＤｅｒｐＩＩＩ核酸の存在を検出するためのプローブとして使用できるか、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの組み換え体作製のために使用できる。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、薬物学的投与に適切な組成物、または家庭のちりのダニに対する感受性を診断する方法に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】家庭のちりのダニ・アレルゲン、Der pＩＩＩをコードしている核酸、およびそれらの使用発明の背景人口のほぼ１０％は、種々の環境起源からの抗原に対する被曝により、過敏性（アレルギー性）になる。即時型および／または遅延型過敏症を誘起するこれらの抗原は、アレルゲンとして知られている（King，T.P.,（1976）Adv．Immunol. ，23: 77-105）。アレルゲンは、草、木、雑草、動物の毛の鱗屑、昆虫、食物、薬物、および化学薬品の生産物を含むことができる。個人の遺伝的素質が、アトピーやアナフィラキシー（その兆候は、枯草熱、ぜんそく、および蕁麻疹を含む）のような即時的アレルギー応答（Young，R.P．et al.,（1990）Clin．Sci.，7 9 :19）の発現においてある種の役割を演じていると信じられている。アトピー性アレルギーに随伴する抗体は、主として、免疫グロブリンのクラスＩｇＥに属する。ＩｇＥは、特異的な高親和性レセプターＦｃεＲＩを介して好塩基球、肥満細胞および樹状突起細胞に結合する（Kinet,J.P.,（1990）Curr．O pin．Immunol. ，2:499-505）。同族のレセプターＩｇＥと、リガンドとして働くアレルゲンとの組み合わせにおいて、ＩｇＥに結合されたＦｃεＲＩは、細胞表面に架橋され、ＩｇＥ−アレルゲン相互作用の生理的徴候をもたらす。これらの生理的作用は、数ある物質の中でも、ヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、好酸球に対する走化性因子および／またはロイコトリエンＣ４、Ｄ４およびＥ４の放出を含み、それらは、気管支の平滑筋細胞の長引く収縮を引き起こす（Hood,L.E．et al .，Immunology(2nd ed.)，The Benjamin/Cumming Publishing Co.，Inc．( 1984)）。それ故、アレルゲンとＩｇＥとの相互作用の最終結果は、前記仲介物質の放出によって引き起こされるアレルギー症状である。そのような症状は、抗原の侵入経路および肥満細胞や好塩基球へのＩｇＥの沈着パターンに応じて、現実には全身的でも局所的でもあり得る。局所症状は、一般には、アレルゲンの侵入部位における上皮表面で起きる。全身症状は、循環する（血管内の）抗原に対するＩｇＥ−好塩基球応答に起因するアナフィラキシー（アナフィラキシーショック）を誘起する。精製アレルゲンを用いる研究では、ダニ、デルマトファゴイデス・プテロニッシナス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）にアレルギー性の患者の約８０％が、Der pＩおよびDer pＩＩに反応するＩｇＥを産生することを示した（Chapman M.D．et al.，J．Immunol.（1980）125:587-92 ; Lind P.，J．Allergy Clin．Immunol.（1985）76:753-61); Van der Zee J.S ．et al.，J．Allergy Clin. Immunol.（1988）81:884-95）。約半数の患者について、これらの特異性は、ＩｇＥ抗ダニ抗体の５０％を構成する。アレルゲンDe r pＩＩＩは、近年トリプシンと同定されたが（Stewart G.A．et al.，Immunolo gy （1992）75:29-35）、これは同じかより高い頻度で反応する（Stewart G.A．e t al .,前出；Ford S.A．et al.，Clin．Exp．Allergy（1989）20:27-31）。しかしながら、今日まで報告された唯一の定量的研究では、研究者らは、Der pＩＩＩに結合するＩｇＥレベルが、Der pＩについてよりもかなり低いことを決定した。電気泳動技術（Ford et al.，前出；Bengtsson et al.，Int．Arch．Allergy Appl．Immunol．（1986）80:383-90; Lind et al.，Scand．J．Immunol.（1989）17:263-73; Tovey E.R．et al.，J ．Allergy Clin．Immunol ．（1987）79:93-102）では、ほとんどの血清が、他のアレルゲンを認識するＩｇＥを含むことを示した。 Der pＩＩＩに対するＩｇＥ反応性の意義は、不確かなままである。このグループのアレルゲンの反応性は、流体相アッセイ（Heymann et al.，J．Allergy C lin．Immunol ．（1989）83:1055-1067）を用いて１６％の低さであり、そしてＲＡＳＴアッセイ（Stewart et al.，Immunology（1992）75:29-35）を用いて１００％の高さであると報告されてきた。数人の他の研究者らは、６０〜８３％の間のＩｇＥ反応性を報告した（Tovey et al.，J．Allergy Clin．Immunol．（1987 ）79:93-102；Thomas et al.，Exp Appl Acarol（1992）16:153-164; Yasueda e t al .，Clin Exp Allergy（1993）23:384-390）。グループＩＩＩアレルゲンへのＩｇＥ反応性の頻度における相違は、研究されたアレルゲン標品の純度の違いか、使用されたアッセイ技術の感度の違いかに因るのであろう。アレルギー反応における特定の特異性の重要性を決定するためには、定量的ＩｇＥ結合試験、およびアレルゲンへのＴ細胞応答の頻度とリンホカイン・プロフィルの研究を可能にする、多量の純粋なアレルゲンが必要である。家庭のちりのダニ・アレルゲンに感受性をもつ多くの患者は、現在では、家庭のちりのダニ抽出物の少量づつを徐々に増加する用量の投与によって治療される。これらの抽出物の使用は、治療中の潜在的アナフィラキシー、ならびに十分な寛容性と臨床症状の有意な減退を築くためのしばしば数年間にわたる継続治療の必要性、を含む多数の欠点をもつ。家庭のちりのダニ・アレルゲン、Der pＩＩＩの組成物の代替能は、いくらかのこれらの欠点を克服するであろう。かくして、家庭のちりのダニ抽出物に伴う欠点を克服するであろう診断用もしくは治療用薬剤、および治療法としての使用のために、多量に供給できる純粋なアレルゲンの給源が、高く期待される。発明の概要本発明は、Der pＩＩＩ、種デルマトファゴイデス・プテロニッシナス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）（家庭のちりダニ）のアレルゲンの少なくとも１つの生物学的活性をもつペプチドをコードしている単離された核酸を提供する。好適な核酸は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に示されたヌクレオチド配列をもつｃＤＮＡである。また、本発明は、そのようなｃＤＮＡ（配列番号：１）の全部または一部分によってコードされ、そしてDer pＩＩＩの少なくとも１つの生物学的活性をもつペプチドにも関する。また、高い緊縮条件（例えば、Ｔｍ以下２０−２７℃および１ＭＮａＣｌに相当する）下で、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に示されたヌクレオチド配列をもつ核酸にハイブリダイズするか、あるいは図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）のアミノ酸配列の全部または一部分を含むペプチドをコードしている、単離された核酸も意図される。Der pＩＩＩの活性をもち、そして図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示された配列と少なくとも５０％の相同性をもつペプチドをコードしている核酸も、また特徴付けられる。本発明の核酸の組み換え発現によって産生されるDer pＩＩＩ活性をもつペプチド、および化学合成によって調製されるD er pＩＩＩ活性をもつペプチドも、また本発明において主要な役割を担っている。好適なペプチドは、Ｔ細胞刺激（例えば、Ｔ細胞増殖もしくはサイトカイン分泌によって測定される）、あるいはＴ細胞非応答性（すなわち、そのペプチドまたは抗原提示細胞のＭＨＣ分子とペプチド複合体との接触が、刺激シグナルに対して非応答になるか、または増殖不能になるようにＴ細胞を誘導する）を含むことができるＴ細胞応答の誘導能をもつ。Ｔ細胞応答の誘導能とは別でも、またそれに加えてもよいその他の好適なペプチドは、家庭のちりダニにアレルギー性の患者の特異的ＩｇＥに対する結合能力をもつ。そのようなペプチドは、患者において家庭のちりダニに対する感受性を診断するのに有用である。Ｔ細胞応答の誘導能とは別でも、またそれに加えてもよいなおその他のペプチドは、有意に低下されたか不能にされた、家庭のちりダニのアレルギー性ＩｇＥとの結合能力をもつ。そのようなペプチドは、治療剤として特に有用である。その他の適切なペプチドは、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されたアミノ酸配列を含む。一つの実施態様では、Der pＩＩＩ活性をもち、そして図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）のアミノ酸配列の一部分を含むペプチドは、少なくとも長さがアミノ酸約８−３０個、好ましくは長さがアミノ酸約１０−２０個、もっとも好ましくは長さがアミノ酸約１０−１６個である。本発明のその他の態様は、Der pＩＩＩ活性をもつペプチドと特異的に反応する抗体に特徴がある。Der pＩＩＩの活性をもつペプチドは、薬学的投与に適切な組成物中で使用できる。例えば、そのような組成物は、患者の家庭のちりダニに対するアレルギー反応を治療または予防するために、家庭のちりダニ抽出物と同様な方法で使用できる。また、本発明の核酸およびDer pＩＩＩの活性をもつペプチドは、家庭のちりダニに対する患者の感受性を診断するためにも使用できる。図の簡単な説明図１Ａおよび１Ｂは、Der pＩＩＩクローンの完全なヌクレオチド（配列番号：１）および推定アミノ酸（配列番号：２）配列を示す。図２Ａおよび２Ｂは、Der pＩＩＩ（配列番号：２）およびザリガニからのトリプシンタンパク質（配列番号：３）のアミノ酸配列を示す。図３は、種々の濃度の組み換えDer pＩＩＩ（列１，４．３μｇ；列２，８．７μｇ；列３，１３．８μｇ；列４，１７．４μｇ；マーカーは、Ｍで指示される）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。発明の詳細な記述本発明は、Der pＩＩＩ、デルマトファゴイデス・プテロニッシナス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）種のグループＩＩＩアレルゲンの少なくとも１つの生物学的活性をもつペプチドをコードしている単離された核酸に関する。好ましくは、核酸は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に示されたヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡである。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に示されたｃＤＮＡは、６３から１４９までのヌクレオチドによってコードされた予測アミノ酸残基２９個のプレプロ領域を含むDer pＩＩＩペプチドをコードしている。このリーダー配列は、１５０から８４５までのヌクレオチドによってコードされる成熟Der pＩＩＩには見いだされない。また、このｃＤＮＡに基づく推定アミノ酸配列は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示される。ｃＤＮＡは、７個のシステイン残基を含む推定分子量２４，９８５ダルトンをもつ２３２残基の成熟ペプチドをコードしている。最終塩基の後のポリアデニル化シグナル配列のヌクレオチド１７９個が、ｃＤＮＡ中に存在する（図１Ａおよび１Ｂ、参照）。Der pＩＩＩをコードしているｃＤＮＡを含む発現ベクターによりトランスフェクションされたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養株は、ブダペスト条約下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に、１９９３年１０月１５日に寄託され、受託番号６９４７２が推定された。したがって、本発明の一つの態様は、Der pＩＩＩをコードしているヌクレオチド配列を含む単離された核酸、Der pＩＩＩの少なくとも１つの生物学的活性をもつペプチドをコードしているその断片および／またはそのような核酸の等価物に関する。本明細書に使用される用語、「核酸」は、そのような断片および等価物を含むことを意図する。用語、「等価物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、De r pＩＩＩの活性をもつ機能的に等価のDer pＩＩＩペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むことを意図する。ここに定義されたように、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドは、Der pＩＩＩアレルゲンの少なくとも１つの生物学的活性をもつ。同等のヌクレオチド配列は、対立遺伝子の改変体のように１つ以上のヌクレオチド置換、付加もしくは欠失によって異なっている配列を含み、そして遺伝コードの縮重により、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に示されたDer p ＩＩＩをコードしているヌクレオチド配列とは異なる配列を含む。等価物は、緊縮条件（すなわち、融解温度（Ｔｍ）以下約２０−２７℃および約１ＭＮａＣｌに相当する）下で、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に示されたDer pＩＩＩのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。 Der pＩＩＩの活性をもつか、Der pＩＩＩ活性をもつような本明細書で言及されるペプチドは、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されたDer pＩＩＩのアミノ酸配列の全部または一部分に対応するアミノ酸配列をもつペプチドとして本明細書では定義される。例えば、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドは、刺激（例えば、Ｔ細胞増殖もしくはサイトカイン分泌）のようなDer pＩＩＩ限定Ｔ細胞における応答を誘導するか、またはＴ細胞非応答を誘導する能力をもってもよい。また、それに加えて、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドは、家庭のちりダニにアレルギー性の患者の免疫グロブリンＥ抗体に結合する（によって認識される）能力をもってもよい。ＩｇＥを結合するペプチドは、患者のDer pＩＩＩに対するアレルギー感受性を検出する方法において有用である。ＩｇＥに結合しないか、ＩｇＥを結合する精製された生来のDer pＩＩＩタンパク質よりも弱い程度で結合するペプチドは、治療剤として特に有用である。１つの実施態様では、核酸は、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドをコードしているｃＤＮＡである。好ましくは、核酸は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に示されたDer pＩＩＩをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含むｃＤＮＡ分子である。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）のｃＤＮＡ分子の好適な一部分は、その分子のコーディング領域を含む。その他の実施態様では、本発明の核酸は、Der pＩＩＩの活性をもち、そして図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されたアミノ酸配列を含むペプチドをコードしている。好適な核酸は、Der pＩＩＩ活性をもち、そして図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示された配列と、少なくとも約５０％の相同性、より好ましくは、少なくとも約６０％の相同性、もっとも好ましくは、少なくとも約７０％の相同性をもつペプチドをコードしている。De r pＩＩＩ活性をもち、そして図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示された配列と、少なくとも約９０％、より好ましくは、少なくとも約９５％、もっとも好ましくは、少なくとも約９８−９９％の相同性をもつペプチドをコードしている核酸もまた、本発明の範囲内にある。相同性は、Der pＩＩＩの活性をもつ２種のペプチド間、または２種の核酸分子間の配列類似性を言う。相同性は、比較するために一列に並べられてもよい各配列の位置を比較することによって決定できる。比較される配列の位置が、同じ塩基もしくはアミノ酸で占められている場合には、その分子は、その位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列によって分担される合致する位置または相同な位置の数の関数である。本発明のその他の態様は、高もしくは低緊縮条件下で、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されるアミノ酸配列の全部または一部分をもつペプチドをコードしている核酸にハイブリダイズする核酸を提供する。例えば、約４５℃における６．０ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）と、それに続く５０ ℃での２．０ｘＳＳＣの洗浄によって、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当な緊縮条件は、当業者には既知であるか、またはCurrent Protocols in M olecular Biology ，John Wiley &Sons，N.Y．(1989),6.3.1-6.3.6に見いだせる。例えば、洗浄段階の塩濃度は、５０℃で約２．０ｘＳＳＣの低い緊縮度から５０℃で約０．２ｘＳＳＣの高い緊縮度まで選ぶことができる。その上、洗浄段階の温度は、室温、約２２℃での低い緊縮条件から、約６５℃での高い緊縮条件まで増大することができる。本明細書に記載されるように、Der pＩＩＩの活性をもち、遺伝コードの縮重により、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に示されたヌクレオチド配列とは異なる配列をもつペプチドをコードしている単離された核酸は、また本発明の範囲内である。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）の配列とは配列において異なるそのような核酸は、機能的に等価のペプチド（すなわち、Der pＩＩＩの活性をもつペプチド）をコードしているが、遺伝コードの縮重に因っている。例えば、数種のアミノ酸は、１種を超えるトリプレットで指定示される。同じアミノ酸を特定するコドン、または同義コドン（例えば、ＣＡＵとＣＡＣはヒスチジンについて同義コドンである）は、Der pＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列に影響しない「サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）」変異をもたらすであろう。しかしながら、Der p ＩＩＩのアミノ酸配列における変化へと導くＤＮＡ配列の多型性が、家庭のちりダニ集団内に存在するであろうと考えられる。当業者は、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドをコードしている核酸の１個以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３−４％まで）におけるこれらの変異が、自然の対立遺伝子変異により、個々の家庭のちりダニに存在するであろうということは認識するであろう。いずれかおよびすべてのそのようなヌクレオチド変異、そして得られるアミノ酸の多型性は、本発明の範囲内である。さらに、Der pＩＩＩの１種以上のイソ型または関連する交差反応性ファミリーのメンバーも存在するであろう。そのようなイソ型またはファミリーメンバーは、機能においてDer pＩＩＩに関連するタンパク質およびアミノ酸として定義されるが、しかし異なる座の遺伝子によってコードされている。また、Der pＩＩＩをコードしている核酸の断片も、本発明の範囲内である。ここで使用されるように、Der pＩＩＩをコードしている核酸の断片は、Der pＩＩＩタンパク質の全アミノ酸配列をコードしている核酸配列よりも少ないヌクレオチドをもち、そして本明細書記載のDer pＩＩＩの活性をもつペプチド（すなわち、Der pＩＩＩアレルゲンの少なくとも１つの生物学的活性をもつペプチド）をコードしている核酸配列を指す。好適な核酸断片は、少なくとも長さがアミノ酸残基１０個、好ましくは長さがアミノ酸残基約１０−２０個、もっとも好ましくは長さがアミノ酸残基約１０− １６個のペプチドをコードしている。また、少なくとも長さが約アミノ酸残基３０個、少なくとも長さがアミノ酸残基約４０個、少なくとも長さが約アミノ酸残基約６０個、少なくとも長さが約アミノ酸残基８０個、少なくとも長さがアミノ酸残基約１００個、少なくとも長さが約アミノ酸残基約２００個もしくはそれ以上、のDer pIII活性をもつペプチドをコードしている核酸断片も本発明の範囲内である。本発明の範囲内の核酸断片は、Der pＩＩＩと交差反応性であるDer pＩＩＩまたはアレルゲンを検出するスクリーニング法に使用するため、他の動物種からの核酸と、高もしくは低緊縮下でハイブリダイズできるものを含む。一般に、Der p ＩＩＩの活性をもつペプチドをコードしている核酸は、成熟タンパク質をコードしている塩基から選ばれるであろうが、ある場合には、本発明の核酸のリーダー配列部分からのペプチドの全部または一部分を選ぶことが望ましいこともある。また、本発明の範囲内の核酸は、制限エンドヌクレアーゼ部位が改変されたリンカー配列、およびDer pＩＩＩの活性をもつ組み換えペプチドの分子クローニング、発現または精製のために有用な他の配列を含んでもよい。 Der pＩＩＩの活性をもつペプチドをコードしている核酸は、デルマトファゴイデス・プテロニッシナス種の家庭のちりダニに存在するｍＲＮＡから得ることもできる。また、デルマトファゴイデス・プテロニッシナスのゲノムＤＮＡから、Der pＩＩＩをコードしている核酸を得ることもできる。例えば、Der pＩＩＩをコードしている遺伝子は、本明細書に記載の方法にしたがって、ｃＤＮＡかゲノムライブラリーのいずれからもクローン化できる。Der pＩＩＩをコードしているｃＤＮＡは、デルマトファゴイデス・プテロニッシナスから全てのｍＲＮＡを単離することによって得ることができる。二本鎖ｃＤＮＡは、次いで、全ｍＲＮＡから調製できる。続いて、ｃＤＮＡは、多くの既知技術のどれか１つを用いて、適切なプラスミドか、バクテリオファージベクター中に挿入できる。また、Der pＩＩＩをコードしている遺伝子は、本発明によって提供されるヌクレオチド配列情報にしたがって、確立されているポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて、クローン化できる。本発明の核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。好適な核酸は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に描かれた配列をもつDer p ＩＩＩをコードしているｃＤＮＡである。また、本発明は、少なくとも１個の調節配列に操作可能に連結されたDer pＩＩＩの活性をもつペプチドをコードしている核酸を含む発現ベクターを提供する。「操作可能」とは、核酸配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能とする態様で、調節配列に連結されていることを意味するように意図されている。調節配列は、技術上認識されており、トランスフェクションされた宿主細胞によって、Der p ＩＩＩの活性をもつペプチドの発現を命令するように選ばれる。したがって、用語、「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節因子を含む。そのような調節配列は、Goeddel，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185，Acad emic Press，San Diego，CA(1990)に記載されている。発現ベクターのデザインは、形質転換されるべき宿主細胞および／または発現が望まれるタンパク質の種類の選択のようなファクターに依存する。１つの実施態様では、発現ベクターは、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドをコードしているＤＮＡを含む。そのような発現ベクターは、細胞をトランスフェクションするために使用され、それによって本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質もしくはペプチドを含む、タンパク質もしくはペプチドを産生することができる。さらに、本発明は、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドを発現するように、トランスフェクションされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、どんな原核生物もしくは真核生物細胞でもよい。例えば、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドは、Ｅ．コリのような細菌細胞、昆虫細胞（バクロウイルス）、酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞中で発現されてもよい。他の適切な宿主細胞は、Goeddel(1990)，前出、に言及されており、または当業者には既知である。哺乳動物、酵母もしくは昆虫細胞のような真核生物細胞での発現は、組み換えペプチド産物の部分的か完全なグリコシル化および／または適切な鎖内または鎖間のジスルフィド結合の形成に導くことができる。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃＩ（Baldari et al.,（1987）Embo J. 6:229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan and H erskowitz,（1982）Cell 30:933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al.,（1987 ）Gene 54:113-123）およびｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation，San Diego， CA）を含む。培養昆虫細胞（ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用できるバクロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Smith et al.,（1983）Mol．Ce ll Biol．3 :2156-2165）およびｐＶＬシリーズ（Lucklow，V.A.，and Summers， M.D.,（1989）Viology 170:31-39）を含む。一般に、ＣＯＳ細胞（Gluzman，Y., （1981）Cell 23:175-182）は、哺乳動物細胞における一過性増殖および／または発現のためのｐＣＤＭ８（Aruffo，A．and Seed，B.,（1987）Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 84:8573-8577）のようなベクターとの連結において使用されるが、一方、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ ^-ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙ）細胞は、哺乳動物細胞における安定な増殖／発現のためのｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al .，(1987)，EMBO J. 6:187-195）のようなベクターとともに使用される。ベクターＤＮＡは、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム同時沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションのような慣用の技術により、哺乳動物細胞中に導入できる。宿主細胞を形質転換するための適切な方法は、Sambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory M anual ，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)）およびその他の実験書に見いだされる。原核生物における発現は、融合か非融合かいずれかの誘導発現ベクターを用いて、Ｅ．コリでもっともしばしば実施される。融合ベクターは、通常、発現される標的遺伝子に、若干のＮＨ₂末端アミノ酸を加える。これらのＮＨ₂末端アミノ酸類は、しばしばレポーター基と言われる。そのようなレポーター基は、普通には、２つの目的：１）標的の組み換えタンパク質の溶解度を増加するため；そして２）アフィニティー精製においてリガンドとして働くことによって標的の組み換えタンパク質の精製を助けるために役立つ。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク分解的切断部位が、レポーター基と標的の組み換えタンパク質の結合点に導入されて、融合タンパク質の精製に続いて、レポーター基からの標的組み換えタンパク質の分割を可能にする。そのような酵素、およびそれらの同族の認識配列は、ファクターＸａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、標的の組み換えタンパク質に、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロティンＡを融合するｐＧＥＸ（Amrad Corp.，Melbourne，Aust ralia）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs，Beverly，MA）およびｐＲＩＴ５（P harmacia，Piscataway，NJ）を含む。好適なレポーター基は、組み換え融合タンパク質を、金属キレートクロマトグラフィーによって容易に精製できるようにするポリ（Ｈｉｓ）である。誘導非融合発現ベクターは、ｐＴｒｃ（Amann et al.,（1988）Gene 69:301-3 15）およびｐＥＴ１１ｄ（Studier et al.，Gene Expression Technology; Meth ods in Enzymology 185 ，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89 ）を含む。標的遺伝子発現は、ｐＴｒｃのハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写によるのに対して、ｐＥＴ１１ｄ中に挿入された標的遺伝子の発現は、同時発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）によって仲介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ０融合プロモーターからの転写による。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５の転写調節下で、Ｔ７ｇｎ１を担持する常在性λプロファージから、宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）もしくはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。Ｅ．コリにおいて組み換えDer pＩＩＩ発現を最大にする１つの戦略は、組み換えタンパク質のタンパク分解的切断能を弱められた宿主細菌中で、タンパク質を発現することである（Gottesman,S.，Gene Expression Technology; Methods in Enzymology 185 ，Academic Press，San Diego，California（1990）119-128 ）。その他の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが、高度に発現されるＥ．コリ・タンパク質において優先的に利用されるコドンであるように、発現ベクター中に挿入されるべきDer pＩＩＩをコードしている核酸を改変することである（Wad a et al.,（1992）Nuc．Acids Res，20:2111-2118）。本発明の核酸のそのような改変は、標準ＤＮＡ合成技術によって実施できる。また、本発明の核酸は、標準技術を用いて、化学的に合成できる。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する種々の方法は、既知であり、ペプチド合成のように、市販のＤＮＡシンセサイザーにおける完全に自動化された固相合成を含む（例えば、引用によって本明細書に組み入れられるItakura et al.，米国特許第4,598,049号、Caruthers et al.，同第4,458,066号;およびItakura 同第4,40 1,796号および同第4,373,071号、参照）。さらに、本発明は、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドを生産する方法に関する。例えば、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドをコードしている核酸配列の発現を支配する核酸ベクターによってトランスフェクションされた宿主細胞は、ペプチドを生産させる適当な条件下で培養できる。ペプチドは、分泌され、そしてペプチドを含む細胞と培地の混合液から単離されてもよい。あるいはまた、ペプチドは、細胞質に保持され、そしてその細胞が、回収され、溶菌され、そしてタンパク質が単離されてもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副生物を含む。細胞培養用の適切な培地は、技術的に既知である。本発明のペプチドは、細胞培養液、宿主細胞、または両方から、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびそのようなペプチドに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティー精製を含む、タンパク質精製のための既知技術を用いて単離される。本発明のその他の態様は、Der pＩＩＩの活性をもつ単離されたペプチドに関する。Der pＩＩＩの活性をもつペプチドは、Der pＩＩＩアレルゲンの少なくとも１つの生物学的活性をもつ。例えば、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドは、刺激（Ｔ細胞増殖もしくはサイトカイン分泌）のようにDer pＩＩＩ特異的Ｔ細胞における応答を誘導しても、Ｔ細胞非応答性を誘導する能力をもっていてもよい。１つの実施態様では、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドは、例えば、Ｔ細胞増殖もしくはサイトカイン分泌によって例証されるように、Ｔ細胞を刺激する。その他の実施態様では、Der pＩＩＩ活性をもつペプチドは、Ｔ細胞非応答性を誘導し、その場合には、Ｔ細胞は、ペプチドへの被曝に続いてのDer pＩＩＩペプチドもしくは生来のDer pＩＩＩタンパク質によるその後のチャレンジにも応答しない。なおその他の実施態様では、Der pＩＩＩ活性をもつペプチドは、精製された生来のDer pＩＩＩタンパク質に較べて、減少されたＩｇＥ結合活性をもつ。Der pＩＩＩの活性をもつペプチドは、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に描かれたDer pＩＩＩ配列とは、アミノ酸配列で異なってもよいが、そのような相違は、生来のDer pＩＩＩタンパク質と同じか類似の方法で機能するか、またはDer pＩＩＩタンパク質の同じか類似の特徴をもつ、改変されなタンパク質を生じる。これらのものや、他の機能的に等価のペプチドを生産するためのDer pＩＩＩタンパク質の種々の改変は、本明細書に詳細に記述される。ここに使用される用語、「ペプチド」は、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドを言う。ペプチドは、例えば、１種以上のアミノ酸残基の置換、付加または欠失による、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されたDer pＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列の改変によって生産できる。そのような改変は、ペプチドの生物学的活性に関与しないアミノ酸残基に向けられるか、あるいは改変が、特定の生物学的活性を増進するか、除去するために、そのようなアミノ酸残基に向けられてもよい。本発明のペプチドは、少なくとも長さがアミノ酸残基約８個、好ましくは長さがアミノ酸残基約１０−２０個、もっとも好ましくは長さがアミノ酸残基約１０−１６個である。少なくとも長さが約アミノ酸残基３０個、少なくとも長さがアミノ酸残基約４０個、少なくとも長さが約アミノ酸残基約６０個、少なくとも長さが約アミノ酸残基８０個、少なくとも長さがアミノ酸残基約１００個、および少なくとも長さが約アミノ酸残基約２００個もしくは長さそれ以上のDer pＩＩＩの活性をもつペプチドも、また本発明の範囲内である。本発明のその他の実施態様では、デルマトファゴイデス・プテロニッシナス種の関連するグループＩＩＩアレルゲン、ＤｅｒｆＩＩＩからのペプチドが提供される。そのようなペプチドは、精製された生来のＤｅｒｆＩＩＩタンパク質から単離され、そして配列： IVGGVKAKAGDSPYQISLQSSSHFXGGSILD （配列番号：１５）、Ｎ末端配列；MICGGDVANGGVDSEQGD（配列番号：１０）、中間部ペプチド；そして MTLDQTNAKPVPLPTS（配列番号：１２）、中間部ペプチドを含む。本発明のなおその他の実施態様は、Der pＩＩＩの活性をもつペプチドの実質的に純粋な調製物を提供する。そのような調製物は、本ペプチドが、細胞中でも、細胞によって分泌されても、ともに自然に生じるタンパク質とペプチド（すなわち、他の家庭のちりダニペプチド）を実質的に含有しない。ここに使用される用語、「単離された」は、実質的に、組み換えＤＮＡ技術によって生産された場合には、細胞材料もしくは培養培地を含有しないか、または化学的に合成された場合には、他の化学前駆物質もしくは他の化学薬剤を含有しない核酸もしくはペプチドを称する。また、そのようなペプチドは、すべての他の家庭のちりダニタンパク質を含有しないのが特徴である。したがって、Der p ＩＩＩの活性をもつ単離されたペプチドは、組み換え的にも、合成的にも生成され、そして実質的に、細胞材料および培養培地を含有しないか、または実質的に、化学前駆物質もしくは他の化学薬剤を含有せず、さらに他の家庭のちりダニタンパク質を含有しない。また、単離された核酸は、その核酸が得られた生物において、自然にはその核酸に隣接する配列(すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列)も含有しない。 Der pＩＩＩの活性をもつペプチドは、例えば、そのようなペプチドをコードしているDer pＩＩＩの核酸の対応する断片から、組み換えによって作製されたペプチドをスクリーニングすることによって得られる。さらに、断片は、慣用のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃもしくはｔ−Ｂｏｃのような技術上既知の技術を用いて、化学的に合成できる。例えば、Der pＩＩＩタンパク質は、重複断片のない目的の長さの断片中に任意に分配されても、または好ましくは、目的の長さの重複する断片中に分配されてもよい。その断片を、作製し（組み換え的もしくは化学合成によって）、そして試験して、Der pＩＩＩ活性をもつそれらのペプチドを同定することができる。すなわち、Ｔ細胞刺激（Ｔ細胞増殖、サイトカイン分泌）のようなＴ細胞応答性か、またはＴ細胞非応答性の誘導能、そして／または低下されたＩｇＥ結合活性をもつかについて試験される。１つの実施態様では、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、Ｔ細胞を刺激するか、Ｔ細胞非応答性を誘導するペプチドの能力によって同定できる。例えば、Ｔ細胞増殖もしくはサイトカイン分泌によって決定されるように、Ｔ細胞を刺激するペプチドは、少なくとも１種のＴ細胞エピトープを含むものとして、本明細書では定義されている。Ｔ細胞エピトープは、アレルギーの臨床症状に関わるタンパク質アレルゲンに対する免疫応答の開始および持続に必要であると信じられる。これらのＴ細胞エピトープは、抗原提示細胞の表面の適当なＨＬＡ分子に結合することによって、Ｔヘルパー細胞のレベルにおける初期の現象を引き起こすと考えられ、それによって、そのエピトープに関連するＴ細胞レセプターをもつＴ細胞サブ集団を刺激する。これらの出来事は、Ｔ細胞増殖、リンホカイン分泌、局所炎症反応、抗原／Ｔ細胞相互作用の部位への付加的な免疫細胞の補充、およびＢ細胞カスケードの活性化をもたらし、そして抗体産生にいたる。これらの抗体、ＩｇＥの１種のイソ型は、アレルギー症状の亢進に基本的に重要であり、そしてその産生は、分泌されたリンホカインの性質によって、Ｔヘルパー細胞レベルでの現象のカスケードにおいて、初期に影響される。Ｔ細胞エピトープは、Ｔ細胞レセプターによる認識の基礎因子または最小単位であり、そのエピトープは、レセプター認識に必須のアミノ酸を含有する。Ｔ細胞エピトープの配列を模し、タンパク質アレルゲンへのアレルギー反応を改変するアミノ酸配列は、本発明の範囲内である。本明細書に記載されるようなＤｅｒｐＩＩＩ活性を保持するものについて、ペプチドをスクリーニングすることは、数種の異なるアッセイ法の１種以上を用いて達成できる。例えば、イン・ビトロで、ＤｅｒｐＩＩＩのＴ細胞刺激活性は、ＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつことが既に知られているかまたは予測されるペプチドを、Ｔ細胞培養において適当なＭＨＣ分子を提示する抗原提示細胞と接触させることによってアッセイされる。必要な同時刺激に関連して、Ｔ細胞に対する好適なＭＨＣ分子と共同でのＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつペプチドの提示は、増大したレベルのサイトカイン、特にインターロイキン−２およびインターロイキン−４の産生を誘導するＴ細胞へのシグナルの伝達という効果をもつ。培養上澄液が得られ、インターロイキン−２もしくは他の既知のサイトカインについてアッセイすることができる。例えば、適切な部分が、引用によって本明細書に組み入れられるProc．Natl．Acad．Sci．USA，86:1333(1989)に記載のアッセイ法のようなインターロイキン−２についての数種の慣用アッセイ法のどれか１つが用いられる。また、インターフェロンの産生に関するアッセイ用キットは、Genz yme Corporation(Ca mbridge，MA)から入手される。あるいはまた、Ｔ細胞増殖の普通のアッセイ法は、トリチウム化チミジン取り込みの測定を伴う。Ｔ細胞の増殖は、培養細胞の複製するＤＮＡ中に取り込まれた³Ｈ−標識チミジンの量を測定することによって、イン・ビトロで測定できる。それ故、ＤＮＡ合成の速度、そして順に、細胞分裂の速度が定量できる。その他の実施態様では、ＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつペプチドが、Ｔ細胞非応答性を誘導する能力についてスクリーニングされる。Ｔ細胞を刺激して、精製された生来のＤｅｒｐＩＩＩもしくはその一部分の活性を阻害するか完全に妨げ、そして非応答性の状態を誘導する既知ペプチドの能力（１種以上の上記アッセイ法によって決定される）は、ＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつペプチドに被曝された後、生来のＤｅｒｐＩＩＩ、またはＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつペプチドを提示する抗原提示細胞による、その後のＴ細胞刺激における試験を用いて決定できる。もし、Ｔ細胞が、インターロイキン−２合成および／またはＴ細胞増殖によって決定されるように、その後の活性化試験に応答しないならば、非応答性の状態が誘導されている。本発明によるアッセイ法の基礎として使用できるアッセイ系については、Gimmi，et al.,（1993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:6856- 6590; およびSchwartz（1990）Science，248:1349-1356参照。なおその他の実施態様では、ＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつペプチドは、ＩｇＥ結合活性によって同定される。治療目的のためには、本発明のペプチドは、好ましくは、家庭のちりダニ・アレルゲンに特異的なＩｇＥと結合しないか、あるいは精製された生来の家庭のちりダニ・アレルゲンが、そのようなＩｇＥと結合するよりも実質的に低い程度にそのようなＩｇＥと結合する。低下されたＩｇＥ結合活性は、精製された生来のＤｅｒｐＩＩＩタンパク質の活性よりも低いＩｇＥ結合活性をいう。もし、ＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつペプチドが、診断試薬として使用されようとする場合には、そのペプチドが、生来のＤｅｒｐＩＩＩアレルゲンに比較して低下されたＩｇＥ結合活性をもつことは必要ではない。ペプチドのＩｇＥ結合活性は、例えば、生来のＤｅｒｐＩＩＩアレルゲンに予め被曝された患者（すなわち、アレルギー性患者）から得られる血清を用いて、例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＩＬＩＳＡ）によって決定できる。簡単には、ＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつと予測されるペプチドが、ミクロタイタープレートのウェル上に塗布される。そのウェルを洗浄し、ブロックした後、ＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつと思われるペプチドに被曝されたアレルギー患者の血漿からなる抗体溶液が、ウェル中でインキュベートされる。血漿は、インキュベート前に、一般にＩｇＧを枯渇される。標識された第２の抗体が、ウェルに添加され、インキュベートされる。次いで、ＩｇＥ結合量が、定量され、精製された生来のＤｅｒｐＩＩＩタンパク質により結合されたＩｇＥ量と比較される。あるいはまた、ペプチドのＩｇＥ結合活性は、ウエスタンブロット分析によって決定できる。例えば、ＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつと予測されるペプチドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いるポリアクリルアミドゲル上で泳動される。次いで、ペプチドは、ニトロセルロースに転写され、続いて、アレルギー患者からの血清とともにインキュベートされる。標識された第２の抗体とインキュベート後、ＩｇＥ結合量が測定され、定量される。ペプチドのＩｇＥ結合活性を決定するために使用されるその他のアッセイ法は、競合ＥＬＩＳＡアッセイ法である。簡単に言えば、ＩｇＥ抗体プールが、直接ＥＬＩＳＡによって発見されている家庭のちりダニアレルギー患者からの血漿と合わせることによって、生来のＤｅｒｐＩＩＩと反応性のＩｇＥをもつように作製される。このプールが、生来のＤｅｒｐＩＩＩと、ＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつと予測されるペプチドのＩｇＥ結合を比較するために、ＥＬＩＳＡ競合アッセイに使用される。生来のＤｅｒｐＩＩＩと、ＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつと予測されるペプチドについてのＩｇＥ結合が決定され、定量される。もし、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドが、ＩｇＥを結合し、そして治療剤として使用されるならば、そのような結合は、肥満細胞もしくは好塩基球からのメディエーター（例えば、ヒスタミン）の放出をもたらさないことが好ましい。ＩｇＥを結合するペプチドが、メディエーターの放出をもたらすかどうかを決定するために、ヒスタミン放出アッセイが、Amac，Inc．(Westbrook，ME)から得られる標準試薬とプロトコールを用いて実施される。簡単に言えば、ＤｅｒｐＩＩＩ活性をもつと思われるペプチドのバッファー溶液が、アレルギー患者からのヘパリン処理全血の等量と一緒にされる。混合し、インキュベート後、細胞が沈殿され、そして上澄液が処理され、放出されたヒスタミン量を決定するために、ラジオイムノアッセイを用いて分析される。治療剤として使用されるべきＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、好ましくは、家庭のちりダニアトピーの哺乳動物モデル、例えば、Tamura et al.,（ 1989）Microbiol．Immunol．30:883-896 又は米国特許第4,939,239号に開示されたマウスモデル、あるいはChiba et al.，（1 990）Int．Arch．Allergy Immunol．93:83-88に開示された霊長類モデルにおいて試験される。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドに結合するＩｇＥについての最初のスクリーニングは、実験動物もしくはヒトのボランティアにおける掻爬試験もしくは皮内皮膚試験によるか、またはＲＡＳＴ、ＲＡＳＴ阻害、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）もしくは前記ヒスタミン放出アッセイのようなイン・ビトロ系で行われてもよい。溶解度の増加、治療もしくは予防効果、または安定性（例えば、エックス・ビボでの貯蔵寿命およびイン・ビボでのタンパク分解に対する抵抗性）の向上のような目的のために、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの構造を改変することが可能である。そのような改変されたペプチドは、本明細書に記載のＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの機能的等価物と考えられる。アミノ酸配列が、例えば、アミノ酸置換、欠失もしくは付加によって、免疫原性を改変し、そして／またはアレルギー原性を低下するように変えられたか、あるいはある成分が同じ目的のために加えられた改変ペプチドが、作製できる。例えば、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、それが、強い増殖応答や、または可能ならば、免疫原性型で投与された時でもどんな増殖応答も誘導する能力なくＴ細胞非応答性を誘導し、そしてＭＨＣタンパク質を結合する能力を維持するように改変することができる。この場合は、Ｔ細胞レセプター機能に対する臨界結合残基が、既知の技術を用いて決定される（例えば、各残基の置換およびＴ細胞反応性の存在または不在の決定）。Ｔ細胞レセプターとの相互作用に必須であることが示されたそれらの残基は、必須のアミノ酸を、その存在が、Ｔ細胞反応性を増進したり、減少するが除去しない、またはそれに影響しないことが分かっているその他のアミノ酸、好ましくは類似のアミノ酸残基により置換することによって改変できる。その上、Ｔ細胞レセプター相互作用に必須ではないそれらのアミノ酸残基は、その組み入れが、Ｔ細胞反応性を増進したり、減少するが除去しない、またはそれに影響しないであろうが、しかしその組み込みが、関連したＭＨＣへの結合を排除しないその他のアミノ酸により置換されることによって改変できる。さらに、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、ＭＨＣタンパク質複合体との相互作用に必須であることが示されたアミノ酸を、その存在が、Ｔ細胞反応性を増進したり、減少するが除去しない、またはそれに影響することが分かっているその他のアミノ酸、好ましくは類似のアミノ酸残基（保存的置換）により置換することによって改変できる。その上、ＭＨＣタンパク質複合体との相互作用に必須ではないが、なおＭＨＣタンパク質複合体を結合するアミノ酸残基は、その組み込みが、Ｔ細胞反応性を増進したり、それに影響しない、または減少するが除去しないであろうその他のアミノ酸により置換されることによって改変できる。必須でないアミノ酸についての好適なアミノ酸置換は、アラニン、グルタミン酸もしくはメチルアミノ酸による置換を含むが、それに限定されない。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの改変のその他の例は、ジスルフィド結合を通しての二量体化を最小にするための、好ましくは、アラニン、セリン、スレオニン、ロイシンもしくはグルタミン酸残基によるシステイン残基の置換である。さらに、本発明のペプチドのアミノ酸側鎖は、化学的にも改変できる。その他の改変は、ペプチドの環化である。安定性および／または反応性を増進するために、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、すべての自然の対立遺伝子変異から得られるタンパク質アレルゲンのアミノ酸配列に、１種以上の多型性を組み入れるように改変できる。さらに、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、非アミノ酸同族体が、本発明の範囲内の改変タンパク質を作製するために、置換されるか付加されてもよい。さらにまた、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、A．Sehon および共同研究者（Wie et a l .，前出）の方法にしたがって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて改変し、ＰＥＧに結合されたタンパク質を作製できる。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドのその他の改変は、還元／アルキル化（Tarr，Methods of Protein Microcharacterization ，J.E．Silvered.，Humana Press，Clifton NJ 155-194 (1986)）；アシル化（Tarr，前出）；適当な担体への化学的結合（Mishell and Shiigi，eds.，Selected Methods in Cellular Immunology，WH Freeman，San F rancisco，CA(1980)，米国特許第4,939,239号）；または弱いホルマリン処理（M arsh(1971)，Int．Arch．of Allergy and Appl．Immunol，41:199-215）を含む。精製を容易にし、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの溶解度を潜在的に増大するために、ペプチド骨格へアミノ酸融合部分を付加することが可能である。例えば、ヘキサ−ヒスチジンが、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（Hochuli，E．et al.,（1988）Bio/Technology 6:1321-1325）による精製のために、タンパク質に付加される。さらに、不適切な配列を含まないペプチドの単離を容易にするために、特異的エンドプロテアーゼ切断部位が、融合部分とペプチドの配列の間に導入される。ＤｅｒｐＩＩＩタンパク質または関連するアレルゲンに対して、成功裏に患者を脱感作するためには、そのタンパク質に官能基を付加するか、またはタンパク質の疎水性領域を除くことによって、タンパク質の溶解度を増大することが必要である。ＤｅｒｐＩＩＩ内のＴ細胞エピトープの適当な抗原プロセッシングを潜在的に助けるために、正規のプロテアーゼ感受性部位が、組み換えまたは合成法を通して少なくとも１個のＴ細胞エピトープに含まれる各領域間で加工されてもよい。例えば、ＫＫもしくはＲＲのような荷電アミノ酸対が、その組み換え体構築の間に、タンパク質または断片内の領域間に導入される。得られるペプチドは、１個以上のＴ細胞エピトープを含むタンパク質の部分を作るであろうカテプシンおよび／またはトリプシン様酵素による切断に対して、感受性にされる。さらに、そのような荷電アミノ酸残基は、ペプチドの溶解度を増大させることにもなる。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドをコードしている核酸の部位特異的変異誘発は、技術上既知の方法によってペプチドの構造を改変するために使用できる。そのような方法は、その他の中でも、１つ以上の変異を担持するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ho et al.,（19 89）Gene 77:51-59）または変異遺伝子の全合成（Hostomsky，Z．et al.,（1989 ）Biochem．Biophs．Res．Comm 161:1056-1063）を含む。組み換えタンパク質発現を増進するために、前記方法が、本発明のｃＤＮＡ配列に存在するコドンを、組み換えタンパク質が発現される宿主細胞によって優先的に利用されるコドンに変えるために応用できる（Wada et al.，前出）。本発明のその他の態様は、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドと特異的に反応する抗体に関する。本発明の抗体は、アレルゲン抽出物を標準化するためか、あるいは天然に存在するか生来の形のＤｅｒｐＩＩＩを単離するために使用できる。例えば、ＤｅｒｐＩＩＩのｃＤＮＡ配列に基づくＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドを用いることによって、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清もしくはモノクローナル抗体が、標準的方法を用いて作成できる。マウス、ハムスターもしくはウサギのような哺乳動物は、ペプチドの免疫原性形（例えば、ＤｅｒｐＩＩＩタンパク質もしくは抗体応答を引き出すことができる抗原断片）を用いて免疫される。タンパク質もしくはペプチドに免疫原性を与える技術は、担体への共役を含むか、または他の技術は、技術上周知である。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、アジュバントの存在下で投与される。免疫化の進展は、血漿もしくは血清における抗体価の検出によって追跡できる。標準ＥＬＩＳＡもしくは他のイムノアッセイは、抗体レベルを評価するために、抗原としての免疫原を用いて使用できる。免疫化に続いて、抗ＤｅｒｐＩＩＩ抗血清が得られ、そしてもし望まれるならば、ポリクローナル抗ＤｅｒｐＩＩＩ抗体が、血清から単離されてもよい。モノクローナル抗体を作製するために、抗体産生細胞（リンパ球）が、免疫動物から採取され、骨髄腫細胞のような不死化細胞を用いる標準の体細胞融合操作によって融合させて、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような技術は、技術上既知であり、例えば、ハイブリドーマ技術は、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbar et al.，Immunology Today（1983）4:72）およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al.，Monoc lonal Antibodies and Cancer Therapy （1985）Alan R．Liss，Inc．pp. 77-96）のような他の技術と同様に、Kohler and Milstein,（Nature（1975）25 6 :495-497）によって初めて開発された。ハイブリドーマ細胞は、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドと特異的に反応する抗体の生産のために、免疫化学的に選択でき、そしてモノクローナル抗体が単離される。ここに使用される用語、「抗体」は、また、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドと特異的に反応するそれらの断片を含むことを意図する。抗体は、慣用の技術を用いて断片化でき、その断片が、全抗体について先に記した同じ方法での利用のためにスクリーニングされる。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂断片は、抗体をペプシンにより処理することによって作製できる。得られるＦ（ａｂ’）₂断片は、ジスルフィド架橋を還元して、Ｆａｂ’断片を生産できる。本発明の抗体は、さらに、抗ＤｅｒｐＩＩＩ部分をもつ二重特異性キメラ分子を含むことを意図する。本発明のその他の態様では、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドと特異的に反応するＴ細胞クローンおよび可溶性Ｔ細胞レセプターを提供する。モノクローナルＴ細胞集団（すなわち、互いに遺伝的に同一なＴ細胞および発現する同一なＴ細胞レセプター）は、ＤｅｒｐＩＩＩに感受性の患者から得られ、その後、ＭＨＣ適合抗原提示細胞の存在下で、ＤｅｒｐＩＩＩタンパク質またはＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドによるイン・ビトロの反復した刺激を受ける。次いで、単一のＤｅｒｐＩＩＩＭＨＣ反応性細胞が、限界希釈によってクローン化され、永久細胞系が、拡大され、そして周期的なイン・ビトロの再刺激によって維持される。あるはまた、ＤｅｒｐＩＩＩ特異性Ｔ−Ｔハイブリドーマは、Ｂ細胞ハイブリドーマ作製に類似する技術によって作製できる。例えば、マウスのような哺乳動物が、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドにより免疫化され、その哺乳動物からのＴ細胞が精製され、そして自律的に成長するＴ細胞腫瘍細胞系と融合される。得られるハイブリドーマから、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドに応答する細胞が選択され、クローン化される。モノクローナルＴ細胞集団を増殖させる操作は、Cellular and Molecular Immunolog y (Abul K．Abbas et al.，ed.)，W.B．Saunders Company，Philadelphia，PA（1 991）page 139に記載されている。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドと特異的に反応する可溶性Ｔ細胞レセプターは、Immunology; A Synthesis(Second Edi tion)，Edward S．Golub et al.，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA （1991）page 366-369に記載のように、Ｔ細胞レセプターに対する抗体を用いる免疫沈降によって得ることができる。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドと特異的に反応するＴ細胞クローンは、適切なＴ細胞レセプターをコードしている遺伝子を単離し、分子的にクローン化するために使用できる。その上、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドと特異的に反応する可溶性Ｔ細胞レセプターは、例えば、ＤｅｒｐＩＩＩに感受性の患者への投与によって、適切なＴ細胞サブ集団の抗原依存性活性化を妨げたり、または阻害するために使用できる。そのようなＴ細胞レセプターに特異的に反応する抗体は、本明細書に記載の技術により生産できる。そのような抗体は、ＭＨＣによって提示されたペプチドとＴ細胞の相互作用を、阻止するか妨害するために使用できる。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもち、またＴ細胞刺激活性をもつペプチドに対するアレルギー患者の被曝が、適当なＴ細胞サブ集団を、それぞれのタンパク質アレルゲンに対して非応答性にさせる（例えば、そのような被曝による免疫応答を刺激できなくする）。その上、そのような投与は、自然に存在するタンパク質アレルゲンもしくはその部分への被曝と比較して、リンホカイン分泌のプロフィルを改変するであろう（例えば、ＩＬ−４の減少とＩＬ−２の増加になる）。さらにまた、Ｔ細胞刺激活性をもっているＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドへの被曝は、これらのＴ細胞が、アレルゲンへの通常の被曝部位（例えば、鼻粘膜、皮膚および肺）から、タンパク質もしくはそれに由来する断片の治療的投与部位へそらされるように、アレルゲンへの応答に正常に関与するＴ細胞サブ集団に影響する。Ｔ細胞サブ集団のこの再分布は、アレルゲンへの通常の被曝部位における普通の免疫応答を刺激する患者の免疫系の能力を改良したり低下させて、アレルギー症状の緩和にいたるであろう。家庭のちりダニに感受性の患者に投与された場合、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、アレルゲンに対する患者のＢ細胞応答、Ｔ細胞応答、またはＢ細胞とＴ細胞の両応答を改変することができる。ここに使用されるように、家庭のちりダニ・アレルゲンに対する患者のアレルギー性応答の改変は、標準の臨床方法（例えば、Varney et al.，（1990）British Medical Jounal 302:265-269 、参照）によって決定されるように、家庭のちりダニに誘起される喘息症状を含むアレルゲンに対する症状における非応答性もしくは緩和として定義できる。ここに言及されるように、症状の緩和は、本発明のペプチドを用いる治療計画の後、アレルゲンに対する患者のアレルギー性応答におけるすべての低下を含む。この症状にける緩和は、標準の皮膚テストを用いるように、患者においても臨床的にも決定されるであろう。また、本発明のペプチドもしくは抗体は、ＤｅｒｐＩＩＩに対する感受性を検出および診断するために使用できる。例えば、これは、感受性を評価すべき患者から得られた血液もしくは血液産物を、ペプチドと血液中の成分（例えば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）の結合に好適な条件下で、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドと一緒にし、そしてそのような結合が生じる程度を測定することによって行われる。本発明のペプチドもしくは抗体が使用できるアレルギー疾患のその他の診断方法は、ラジオ−アレルゴソルベント試験（ＲＡＳＴ）、ペーパー・ラジオイムノソルベント試験（ＰＲＩＳＴ）、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ），蛍光免疫検定法（ＬＩＡ）ヒスタミン放出検定法およびＩｇＥイムノブロットを含む。その他のアッセイでは、ＤｅｒｐＩＩＩに特異的なＩｇＥの患者における存在、およびＤｅｒｐＩＩＩのＴ細胞エピトープに対する患者のＴ細胞の応答能力が、各々アレルゲンに特異的なＩｇＥを結合するＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドを利用するか、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの改変形を利用して、即時型過敏症試験および／または遅延型過敏症試験（例えば、Immunolo gy （1985）Roitt，I.M.，Brostoff，J.，Male，D.K．(eds.)，C.V.Mosby Co.，G ower Medical Publishing，London，NY，pp.19.2-19.18; pp.22.1-22.10、参照）を患者に適用することによって決定できる。同じ患者が、即時型過敏症試験の適用前か、それと同時か、またはその後に、遅延型過敏症試験を適用される。勿論、もし、即時型過敏症試験が、遅延型過敏症試験の前に適用される場合には、遅延型過敏症試験は、特異的な即時型過敏症反応を示す患者に対して行われるであろう。遅延型過敏症試験は、実質的なパーセンテージ（例えば、少なくとも約７５％）のアレルゲン感受性の患者集団において、ヒトＴ細胞刺激活性をもち、アレルゲンに特異的なＩｇＥを結合しないＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドを利用する。特異的な即時型過敏症反応と特異的な遅延型過敏症反応の両方をもつことが分かったそれらの患者は、薬物学的投与に適切な組成物の一定量を投与される。その組成物は、遅延型過敏症試験に使用されるＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチド、および薬物学的に許容できるキャリヤーもしくは賦形剤を含む。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、家庭のちりダニ・アレルゲンまたは交差反応性タンパク質アレルゲンに対するアレルギー反応を、治療および予防する方法に使用できる。したがって、本発明は、少なくとも１種のＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの一定量および薬物学的に許容できるキャリヤーを含む薬物学的投与に適する組成物を提供する。脱感作されるべき患者への本発明の組成物の投与は、家庭のちりダニに対する患者の感受性を低下（すなわち、アレルギー応答の減少）させるのに効果的な用量および期間において、既知の方法を用いて実施される。用語、「患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、免疫応答が誘起できる生きている生物、例えば、哺乳動物を含むことを意図する。患者の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種を含む。治療効果を達成するために必要な少なくとも１種のＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの一定量は、家庭のちりダニに対する患者の感受性の程度、年令、性別および患者の体重、そして患者において抗原反応を引き出すＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの能力のようなファクターに応じて変化してもよい。投与方法は、最適な治療上の応答を提供するように調節される。例えば、数回に分割された用量が、１日に投与されてもよく、またはその用量が、治療状況の危急性によって示されるように、比例して減少されてもよい。活性化合物（すなわち、少なくとも１種のＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチド）は、注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮適用または肛門内投与によるような慣用法で投与されてもよい。投与経路により、活性化合物は、その化合物を不活化するかもしれない酵素、酸および他の自然条件の作用から化合物を保護するために、材料中にコーティングされてもよい。非経口投与以外によってＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドを投与するために、その不活化を防ぐ材料でペプチドをコーティングするか、その材料とペプチドを同時に投与することが必要である。例えば、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、好適なキャリヤー、希釈剤もしくはアジュバントとともに、酵素阻害剤と同時投与で、またはリポソームのような好適なキャリヤーに入れて、患者に投与されてもよい。薬物学的に許容できる希釈剤は、生理食塩水およびバッファー水溶液を含む。アジュバントは、もっとも広義に使用され、インターフェロンのようなすべての免疫刺激化合物を含む。ここで考えられるアジュバントは、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン界面活性剤を含む。酵素阻害剤は、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＰ）およびトラシロールを含む。リポソームは。水中油中水のＣＧＦ乳液、ならびに慣用のリポソーム（Strejan et al.,（1984）J．Neuroi mmunol．7 :27）を含む。Ｔ細胞非応答性を誘導するために、本組成物は、好ましくは、非免疫原性形、例えば、アジュバントを含まない形態で投与される。また、活性化合物は、非経口的にも、腹腔内にも投与されてもよい。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合液中、およびオイル中で調製されてもよい。貯蔵および使用の普通条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有する。注射使用に適切な医薬組成物は、無菌水溶液剤（水溶性の場合）または分散剤、および無菌注射用液剤および分散剤の即席調合ための無菌散剤を含む。すべての場合に、組成物は、滅菌されねばならず、容易に注射器で扱える程度に流動しなければならない。それは、製造および貯蔵条件下で安定であらねばならず、細菌および真菌類のような微生物の汚染作用に対して防御されねばならない。キャリヤーは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合液、および植物油を含む溶媒もしくは分散媒体である。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散剤の場合に要求される粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって保つことができる。微生物の働きを防御することは、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成される。多くの場合、組成物中に、等張化剤、例えば、糖類、塩化ナトリウム、またはマニトールおよびソルビトールのようなポリアルコールを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の吸収持続性は、吸収を長引かせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムもしくはゼラチンを組成物中に含ませることによってもたらされる。無菌の注射液剤は、必要ならば先に列挙された成分の１種もしくは組み合わせとともに、好適な溶媒中必要な量において活性化合物（すなわち、少なくとも１種のＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチド）を組み入れ、続いて、無菌濾過によって調製されてもよい。一般に、分散剤は、基礎分散媒と、先に列挙した他の必要な成分を含む無菌媒体中に活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌注射液剤の調製のための無菌散剤の場合には、好適な調製方法は、活性化合物（すなわち、少なくとも１種のＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチド）と、添加が望まれるいずれかの成分との粉末を、それらの予め無菌濾過された溶液から得るための真空乾燥および凍結乾燥である。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドが、上記のように適切に保護される場合には、ペプチドは、例えば、不活性な希釈剤もしくは同化できる食用キャリヤーとともに、経口的に投与されてもよい。また、ペプチドおよび他の成分は、硬質もしくは軟質ゼラチンカプセル殻中に封入しても、錠剤中に圧縮しても、または患者の食物中に直接組み入れられてもよい。経口的治療用投与のためには、活性化合物は、添加物とともに組み入れられ、摂取できる錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエファー剤等の剤形で使用されてもよい。組成物および調製物中の活性成分のパーセンテージは、勿論変えることができ、単位重量の約５〜約８０％の間が好都合であろう。そのような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な用量が得られるように決められる。ここで使用されるように、「薬物学的に許容できるキャリヤー」は、どれか、すべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。薬物学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、技術的に既知である。慣用の媒体もしくは薬剤の内、活性化合物と不適合であるすべてのものを除いては、薬物学的投与に適切な組成物におけるその使用が考えられる。また、補充的な活性化合物が、組成物中に組み入れられてもよい。投与を容易にし用量を均一にするために、非経口組成物を、用量単位剤形に製剤化することが、特に有利である。ここに使用されるような単位用量剤形は、治療されるべき哺乳動物患者に対して、単位毎の用量に見合う物理的に区別された単位剤形を指す；各単位は、必要な医薬キャリヤーと連携して目的の治療効果を生むように、計算された予定量の活性化合物を含む。本発明の単位用量剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の性質と、達成されるべき特定の治療効果、および（ｂ）患者の感受性を治療するために、そのような活性化合物を調合する技術に固有の制約、によって指定され、そして直接的にはそれに依存する。また、本発明は、各々Ｔ細胞刺激活性をもつ、少なくとも２種のＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチド（例えば、少なくとも２種のペプチドの物理的混合物）を含む組成物を提供する。あるいは、各々Ｔ細胞刺激活性をもつ、少なくとも２種の領域をもつペプチド（すなわち、各々の領域が、少なくとも１種のＴ細胞抗原決定基を含む）が、アレルギー患者に投与できる。各々Ｔ細胞刺激活性をもつ、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつ２種のペプチドの組成物、または少なくとも２種の領域をもつ２種のペプチドの組成物は、前記の薬物学的に許容できるキャリヤーとの組成物の形で患者に投与できる。１種以上のそのような組成物の一定量が、家庭のちりダニ・アレルゲンに感受性の患者に対して、そのような感受性を治療するために、同時に、または連続して投与できる。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドをコードしているｃＤＮＡ（または逆転写の間、鋳型として役立つｍＲＮＡ）は、すべての変種または型の動物において類似の核酸を同定するために使用でき、したがって、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドをコードしているｃＤＮＡにハイブリダイズするのに十分な配列の相同性をもつ遺伝子を分子的にクローン化するために使用できる。かくして、本発明は、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドのみならず、また、本発明のＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるアレルゲンであってもよい他のタンパク質をも含む。既に同定されたもの以外に、例えば、抗体交差反応性またはＴ細胞交差反応性によって、免疫学的にＤｅｒｐＩＩＩに関連する単離されたペプチドは、本発明の範囲内である。そのようなペプチドは、本発明のタンパク質およびペプチドに特異的な抗体を結合するか、本発明のタンパク質およびペプチドに特異的なＴ細胞を刺激する。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチド（すなわち、組み換え的または化学合成によって作製されたＤｅｒｐＩＩＩ）は、すべて他の家庭のちりダニタンパク質を含有せず、したがって、家庭のちりダニ過敏症の診断および治療のためのキー試薬であるアレルゲン抽出物の標準化に有用である。その上、そのようなペプチドは、治療目的（例えば、家庭のちりダニに感受性の患者のアレルギー反応を改変するために）で投与されるであろう調製物における使用のためには、一貫した十分確定された組成と生物学的活性をもっている。また、そのようなペプチドは、Ｄ．プテロニッシナス・アレルギーの免疫治療のメカニズムを研究するため、そして免疫治療において有用な改変された誘導体もしくは同族体をデザインするためにも使用することができる。他の研究者による仕事は、高用量のアレルゲン抽出物が、一般に、免疫治療の間に最良の成績（すなわち、最良の症状軽減）を生むことを示した。しかしながら、多くの患者は、これらの調製物の中のアレルゲンおよび他の成分によって引き出される全身反応によって、そのような大用量の抽出物を許容することができない。ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドは、すべての他のダニタンパク質を含まないという利点をもつ。したがって、そのようなペプチドは、ほとんど心配される副作用もなく治療目的に投与できる。また、家庭のちりダニ・アレルゲンが、感受性患者におけるアレルギー反応を誘起する能力を阻止または阻害できる因子もしくは薬物をデザインすることが、ここに可能になる。そのような因子は、例えば、それらが、関連する抗ＤｅｒｐＩＩＩ・ＩｇＥ分子に結合し、それによりＩｇＥ−アレルゲン結合と、続いての肥満細胞／好塩基球脱顆粒を防ぐような仕組みでデザインできる。あるいはまた、そのような因子は、免疫系の細胞成分に結合して、家庭のちりダニ・アレルゲンに対するアレルギー応答の抑制または脱感作をもたらす。これの非限定の例は、ＤｅｒｐＩＩＩのＢもしくはＴ細胞エピトープを含むペプチド、またはＤｅｒｐＩＩＩのｃＤＮＡタンパク質構造に基づくその改変体を使用して、家庭のちりダニ・アレルゲンに対するアレルギー応答を抑えることである。これは、家庭のちりダニ・アレルゲンに対して感受性の患者からの血液成分を用いるイン・ビトロの研究において、ＢおよびＴ細胞の機能に影響するＢおよびＴ細胞エピトープをコードしている断片の構造を明らかにすることによって実施できるであろう。さらに、本発明は、次の実施例によって具体的に説明されるが、それは、本発明をさらに限定するものとして解釈されるべきでない。本明細書を通して引用されるすべての参考文献および公開された特許明細書の内容は、引用によって本明細書に組み入れられる。次の方法論は、実施例を通して使用された。実施例材料および方法Ｄ．プテロニッシナス培養株すべてのダニは、Commonwealth Serum Laboratories，Parkville，Australia から購入され、スペント（ｓｐｅｎｔ）培地は、同所から贈られた。 Heymann ら(Heymann et al.，J Allergy Clin Immunol（1989）83:1055-1067) からの改良された方法を用いて、Ｄ．プテロニッシナスのスペント増殖培地の５０〜８０％飽和硫酸アンモニウム沈殿物１５ｍｌを、ＰＢＳで平衡化された上方流動する２ｃｍｘ９０ｃｍのポリアクリルアミドＰ−１００カラム（Pharmacia ，LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden）に適用した。流出された５ｍｌの画分のタンパク質含量を、光学濃度（Ａ２８０ｎｍ）を測定することによって決定し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。３０ｋＤａ領域に顕著なバンドを含むそれらの画分をプールし、ポリエチレングリコール６０００（BDH Chemicals，Aust ．PTY．Ltd．Kilsyth，Vic．Aust）によって濃縮し、ＰＢＳに対して透析し、そして再びカラムを通過させた。これを２回繰り返した結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で、検出される唯一のバンドがほぼ分子量３０ｋＤａのダブレットであると決定された。タンパク質配列の分析アフィニティー精製された生来のＤｅｒｐＩＩＩおよびＤｅｒｆＩＩＩタンパク質を、１２％カラムシステムを用いるＨＰＥＣ（Applied Biosystem，Foste r City，CA）にかけた。次に、アフィニティー精製されたタンパク質もしくは好適な分子量のＨＰＥＣ画分を、オン・ラインのフェニルチオヒダントイン誘導体分析器（モデル１２０）を装着したＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍモデル４７７Ａ気相配列決定装置を用いるタンパク質配列分析にかけた。あるいはまた、アフィニティー精製されたタンパク質を、まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（BioRad）によって分別し、Ｐｒｏｂｌｏｔ（Applied Biosystem）に移し、そしてＢｅｃｋｍａｎモデルＬＦ３０００を用いて配列決定した。タンパク質の初期配列分析の後、ｏ−フタルアルデヒドを、プロリン（ＤｅｒｐＩＩＩの位置１３）をもつもの以外のＮ−末端をブロックするために適用して、混入しているペプチド配列を除去し、そしてＮ−末端配列を明白に伸長した。アフィニティー精製されたタンパク質を、７０％（ｗ／ｖ）ギ酸中２％（ｗ／ｖ）ＣＮＢｒで切断することによって、ＣＮＢｒペプチドを作製した。消化されたペプチドを、精製のためにＨＰＥＣにかけ、次いで、ペプチド断片を配列分析にかけた。好適なコドン使用成熟タンパク質ＤｅｒｆＩ（Dilworth et al．Clin Exp Allergy（1991）21: 25-32）、ＤｅｒｆＩＩ（Trudinger et al．Clin Exp Allergy（1991）21:33-3 7）、ＤｅｒｐＩ（Chua et al．J Exp Med（1988）167:175-182）およびＤｅｒｐＩＩ（Chua et al．Int Arch Allergy Appl Immunol（1990）91:118-123）のコドン使用の偏りを決定した。各アミノ酸についての各トリプレットコドンの平均使用パーセントを、これらの４種のデルマトファゴイデスのタンパク質の各々について決定し、結果を表１に記した。Ｄ．プテロニッシナスλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーの構築ポリアデニル化ｍＲＮＡ（１０μｇ）を、キット（Amersham International， Aylesburg，U.K.）を使用するＲＮＡｓｅＨ法（Gubler et al．Gene（1983）25: 263-269）によってｃＤＮＡを合成するために使用した。ＥｃｏＲＩ制限酵素リンカー（New England Biolabs，Beverly，U.S.A.）の付加の後、ｃＤＮＡを、アルカリホスファターゼ処理されたλｇｔ１０アーム（Promega Biotec，Madison ，Wisc.）に連結した。組み換えファージＤＮＡを、パッケージし、そしてＥ．コリＪＰ７７７に広げて、５ｘ１０⁵の組み換え体ライブラリーを作製した。オリゴヌクレオチドのキナーゼ末端標識オリゴヌクレオチドを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍＰＣＲメート（Applied Biosystem，Foster City，CA）を用いて合成した。オリゴヌクレオチドＤＮＡの２０ピコモルを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Promega Corp.，M adison，Wisc.）を用いて（γ−³²Ｐ）ＡＴＰにより末端標識した（Maniatis，T .，Fritsch，E.F．and Sambrook，J．Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，2nd Ed．Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）。標識されたオリゴヌクレオチドを、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、続いて、無菌蒸留水中に溶出した。ライブラリーのスクリーニングを、グループＩＩＩアレルゲンについて前記のように得られたＮ−末端および中間部タンパク質配列データの両方を用いてデザインされた２種のプローブによって実施した。第１のプローブ、Ｐ３フォワード３（Ｐ３Ｆ３）は、次のヌクレオチド配列5′TCAGAAA AAGCTTTGGCTGGTGAATCACCATATCAAAT3′（配列番号：８）をもつ長さ３８量体（３８ｍｅｒ）であった。第２のプローブ、Ｐ３リバース４（Ｐ３Ｒ４）は、次のヌクレオチド配列5′GAATCAACACCACCATTAGCAACATCACCACCGCAAATCAT3′（配列番号：９）をもつ長さ４１量体であった。ライブラリーを、１５０ｍｍペトリ皿当たり２５，０００ｐｆｕでプレーティングし、ファージを、ニトロセルロース（Sc hleider & Schnell，Dassel，Germany）上に釣取した。各プレートからの重複フィルターリフト（ｌｉｆｔ）を変性し、そして２種のプローブの異なる１種とのハイブリダイゼーションのためにベーク（ｂａｋｅ）した（Maniatis，T.，Frit sch，E.F．and Sambrook，J．Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd E d．Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション混合液（６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウムｐＨ７．０（ＳＳＣ）、０．１％デンハート液，変性ニシン精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ）中４２℃で、１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの標識プローブを用いて一夜行った。フィルターを、４２℃２０分間３回、次いで、５０℃１０分間、６ｘＳＳＣ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む洗浄液４００ｍｌ中で洗浄した。ＤｅｒｐＩＩＩクローンからのファージＤＮＡを、ポリエチレングリコール沈殿法（Chua et al．J Exp Med（1988）167:175-182）を用いて調製した。サブクローニングおよび配列決定精製ＤｅｒｐＩＩＩファージＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ制限酵素（Toyob o）を用いて消化し、遊離した断片を、ＥｃｏＲＩ制限酵素消化したＭ１３ｍｐ１９配列決定ベクター（Messing，Meth．Enzymol．（1983）101:20-78）に連結した。組み換えＤＮＡを、Ｅ．コリＴＧ−１を用いて形質転換し、そして配列決定を、ジオキシヌクレオチド連鎖終結法およびシークェナーゼ（U.S.Biochemica ls）を用いて行う（Sanger et al.，Proc Natl Acad Sci USA（1977）74:5463-5 467）。配列決定に使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは、ユニバーサルプライマー、１７量体シークェンシングプライマー(-40)5′CAGCACTGACCCTTTTG3 ′（配列番号：４）および１６量体リバースシークェンシングプライマー(-24)5 ′AACAGCTATGACCATG3′（配列番号：５）、ライブラリースクリーニングに使用された２種のインターナルプライマー（配列番号：８および９）、そして２種のインターナルプライマーＰ３フォワード５（Ｐ３Ｆ５）5′AAAGCTGTTGGATTACCA3 ′（配列番号：６）およびＰ３リバース５（Ｐ３Ｒ５）5′TACATCCGATCCTTTTGC3 ′（配列番号：７）、そしてＰ３Ｆ４5′GCGGATCCATTGTTGGTGGT3′（配列番号：１８）を含んだ。２種のインターナルプローブを、ヌクレオチド残基４５６〜４７３（Ｐ３Ｆ５）および４９１〜４７４（Ｐ３Ｒ５）（図１Ａおよび１Ｂ）に対応するためにデザインした。プライマーを、両方の向きに単離されたクローンを配列決定するために使用した。ＤＮＡおよびタンパク質配列解析配列解析は、ＭＡＣＶＥＣＴＯＲソフトウエアー（IBI，New Haven，U.S.A. ）を用いて行った。他のタンパク質との配列相同性の比較は、ＢＬＡＳＴネットワークサービスを用いてＮＣＢＩにおいて行った。使用されたＢＬＡＳＴのバージョンは、ＢＬＡＳＴ１．３．１ＯＭＰ（7- Jul-93）であった。実施例１：生来のグループＩＩＩアレルゲンの配列タンパク質単離法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分子量３０と２８ｋをもつダブレットとして泳動するＤｅｒｐＩＩＩサンプルを作製した。両バンドは、既報（Thomas et al.，Exp．Appl．Acadrol.（1992）16:153-164）の種間交差反応性にしたがって、ポリクローナルマウス抗ＤｅｒｆＩＩＩと反応した。５Ａ１２モノクローナル抗体（Heymann et al.，J Allergy Clin Immunol（1989）83 :1055-1067）カラムから単離されたＤｅｒｆＩＩＩは、類似の特徴を示した。混入しているタンパク質配列を除去するためにｏ−フタルアルデヒドを用いて、生来のＤｅｒｐＩＩＩおよびＤｅｒｆＩＩＩの両方のＮ−末端配列を修正し、既知ＤｅｒｐＩＩＩ配列に伸長し、そしてＤｅｒｆＩＩＩ配列に伸長した。ＤｅｒｐＩＩＩＮ−末端配列を、IVGGEKALAGQSPYQISLQSSSHFSGGTIL（配列番号：１６）に伸長した。ＤｅｒｆＩＩＩＮ−末端配列を、IVGGVKAKAGDSPYQISLQSSSH FXGGSILD（配列番号：１５）に伸長した。ここに示したデータとグループＩＩＩアレルゲンについてのStewartら（Immunology（1992）75:29-35）およびHeymann ら（J Allergy Clin Immunol（1989）83:1055-1067）により報告された配列データの比較では、公表された配列において若干の誤りを指摘した。特に、残基８における陽荷電のリジンから非極性疎水性ロイシンへの非同類変換が見られた（ＤｅｒｆＩＩＩ、Heymann et al.，J Allergy Clin Immunol（1989）83:1055-106 7）。ＤｅｒｆＩＩＩの２種の中間部ペプチドを、天然のタンパク質、MICGGDVA NGGVDSEQGD（配列番号：１０）およびMTLDQTNAKPVPLPTS（配列番号：１２）のＣＮＢｒ消化の後に、ＨＰＥＣによって単離した。実施例１に記載のようにして得られたタンパク質配列情報を、好適なコドン使用データ（表１）と一緒に使用して、２種のオリゴヌクレオチドプローブを構築した。これらのオリゴヌクレオチドを、ＤｅｒｐＩＩＩクローンのヌクレオチド残基１５９−１９６および残基６８８−６４８（図２Ａおよび２Ｂ）にハイブリダイズするようにデザインした。両プローブと強くハイブリダイズする唯一のクローンは、λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーから単離した。Ｐ３ＷＳ１クローンについて得られるヌクレオチド配列およびその演繹されるアミノ酸配列を、図１Ａおよび１Ｂに示した。完全なヌクレオチド配列は、長さ１０５９ｂｐであった。これは、６２ｂｐの５’非コーディング領域、２１１ｂｐの３’非翻訳領域およびヌクレオチド残基８４６−８４８において終止コドン（ＴＧＡ）をもつ７８６ｂｐのオープン読み枠を含む。ポリＡテールを含まないが、ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）であると考えられる。オープン読み枠は、アミノ酸２９個のプレプロ領域を含むタンパク質、およびＮ−末端イソロイシンで始まり、計算分子量２４，９８５と８．５のｐＩをもつ２３２個のアミノ酸残基の成熟タンパク質をコードしている。アミノ酸位置−２９のメチオニン残基（ＡＴＧ）は、もっとも可能性のある翻訳開始部位である。この開始部位の選択は、顕著に疎水的な残基の存在をもつアミノ酸残基１８個のクラシカルなシグナルペプチドをコードする、メチオニンに続く配列の存在に一部分基づいた。その上、このＡＴＧコドンの前の隣接配列、５’ＧＡＡＡＧＡＴＧ３’は、位置−３における決定的なプリン（ほとんどの場合Ａ）をもつ真核生物の翻訳開始部位のＫｏｚａｋ共通配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧ）に、弱く適合する（ Kozak，Nucleic Acid Research（1984）12:857-872）。実施例１記載のＤｅｒｐＩＩＩのタンパク質配列決定データは、残基１１におけるＧｌｕ／Ｇｌｎの置換および残基１７における可能なＣｙｓ／Ｓｅｒ置換の結果として、Ｐ３ＷＳ１クローンのｃＤＮＡから演繹されるアミノ酸配列とは異なる。これらの置換は、異なるイソ型におけるＤｅｒｐＩＩＩの存在によるかもしれない。ＤｅｒｐＩＩＩＰ３ＷＳ１について演繹されたタンパク質配列の解析により、ＤｅｒｆＩＩＩＣＮＢｒペプチド１(MI(C)GGDVANGGVDS(E)QGD) （配列番号：１０）の位置が、アミノ酸残基１７７−１８３に由来し、そしてこの領域における組み換え配列、MICGGDVANGGKDSCQD（配列番号：１１）と８８％の一致をもつと、正確に予測されたことを確認した。興味あることには、生来のＤｅｒｆＩＩＩペプチド配列が、Ｐ３ＷＳ１クローン配列と一列に並べられる場合存在する２つの同一な非同類変化がある。ＤｅｒｆＩＩＩにおける１７８（図１Ａおよび１Ｂの番号にしたがい）の非極性疎水性バリンから、Ｐ３ＷＳ１クローン配列における陽荷電のリジン残基への変化がある。その他の変化は、Ｐ３ＷＳ１クローン配列におけるシステイン残基について置換されたＤｅｒｆＩＩＩ中の１８１におけるグルタミン酸残基である。システインは、これらと、ほとんどの他のトリプシンタンパク質の両方においてジスルフィド架橋の１つを形成する。ＣＮＢｒ消化により作製された第二のＤｅｒｆＩＩＩペプチドの予測される列、(M)TLDQTNA(K)PVPL(P)(T)(S)（配列番号：１２）は、アミノ酸残基９５−１１０（MKLNQKNAKAVGLPAK）（配列番号：１３）から得られた。この領域ではＰ３ＷＳ１クローンと６３％の相同性がある。ＤｅｒｐＩＩＩとＤｅｒｆＩＩＩタンパク質配列の間のこれらの相違は、ＤｅｒｐＩとＤｅｒｆＩ、およびＤｅｒｐＩＩとＤｅｒｆＩＩのようなこの種からの他の同類のアレルゲン間に見られる２０％の配列変異と一致する。ＤｅｒｐＩＩＩＰ３ＷＳ１クローンの完全な配列は、アミノ酸３１９個のタンパク質をコードしている。ＤｅｒｐＩＩＩは、すべての既知トリプシンのように、プレプロチモーゲンとして合成される。シグナルペプチドの切断部位は、 Von Heijine（Von Heijine，Eur J Biochem（1983）133:17-21）によって概説されるアミノ酸拘束に適合するこの部位周辺の残基として、アミノ酸残基−１２と −１１の間にあると主張される。Von Heijineは、少量の中性アミノ酸が、ＤｅｒｐＩＩＩ遺伝子に見られるアラニンおよびチロシンのような切断部位より位置−１および−３において強く優先されることを提案した。プロリン残基は、位置＋１〜−３においては決して発見されず、したがってどんな他の部位も排除する。ほとんどの哺乳動物トリプシンタンパク質は、１５または１６個のプレもしくはシグナルペプチドをもつと報告されている。ＤｅｒｐＩＩＩペプチドは、長さアミノ酸１８個である。長さの相違が比較的小さいにもかかわらず、シグナルペプチドの長さは、トリプシンが由来する種の系統的多様性に寄与できるであろうと思われる。これは、３２個のアミノ酸のプレペプチドをもつストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）においてもっとも明白である（Kim et al.，Biochem Biophys Res Commun（1991）181:707-71 3）。また、哺乳動物トリプシンに関して、シグナルペプチドが、２種の特定のクラスター２個、次いで疎水性残基４個を含むことが報告されている（Mac Donald et al.，J Biol Chem（1982）257:9724-9732; Le Huerou et al. ，Eur J Biochem（1990）193:767-73）。ＤｅｒｐＩＩＩ遺伝子のこの領域内には疎水性残基が豊富であるが、それらは、高度に保存されたクラスター中には配置されない。同じことは、ドロソフィラ・メランガスター（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＭｅｌａｎｇａｓｔｏｒ）（Davis et al.，Nucleic Acid Research（1988 ）13:6605-6615）およびＳ．グリセウス（Kim et al.，Biochem Biophys Res Co mmun （1991）181:707-713）の両方のシグナルペプチドについても真実である。それ故、疎水性残基の高度に保存されたクラスターは、すべてのトリプシンの特徴ではなくて、むしろ哺乳動物のトリプシンの特徴である。シグナルペプチドからの下流は、アミノ酸残基−１１〜−１からの残基１１個のプレ活性化ペプチドである。このプロ領域と、種々の種のトリプシンからの他のプロ領域との比較では、ＤｅｒｐＩＩＩプロペプチドが異常であることを示す。脊椎動物および無脊椎動物トリプシンの両方とも、−１位置のリジン残基へ続く４個の隣接するアスパルチル残基をもつオクタペプチドおよびまたはヘキサペプチドプロ領域をもつことが分かっている（Le Huerou et al.，Eur J Bioche m （1990）193:767-73）。それは、トリプシノーゲンのトリプシンへの活性化の間に切断されるこのリジン残基のカルボキシル領域である。ＤｅｒｐＩＩＩは、このポリアスパルチル−リジン配列を欠く。それ故、トリプシノーゲンは、通常のメカニズムによっては活性化できない。これに関してＤｅｒｐＩＩＩに類似する若干の他のトリプシン、Ｄ．メランガスター（Davis et al.，Nucleic Ac id Research （1988）13:6605-6615）、Ｓ．グリセウス（Kim et al.，Biochem B iophys Res Commun （1991）181:707-71 3）、およびもっとも興味あることには、ラット膵臓からの３２ｋＤａの陰イオン性トリプシン（Gendry and Laenay，Biochemica et Biophysica Acta（1988）955 :243-249）がある。このグループは、エンテロキナーゼ、トリプシンタンパク質におけるポリアスパルチル−リジン残基への高い特異的親和力をもつ酵素が、それらが単離したトリプシンには作用しないことを示した。それ故、彼らは、異なるメカニズムが、活性化過程に使用されたことを示唆した。ＤｅｒｐＩＩＩプロ酵素領域と、すべての既知の配列とのいかなる相同性をも欠くことは、独特の活性化メカニズムを暗示するであろう。タンパク質データベースの検索は、ＤｅｒｐＩＩＩＰ３ＷＳ１が、脊椎動物および無脊椎動物両方のトリプシンに相同であることを明確にした。ＤｅｒｐＩＩＩアレルゲンは、Ｎ−末端タンパク質配列の比較により、それらが、５０％もの多さで異なることを示したので、ダニのキモトリプシン（Gendry and Laena y，Biochemica et Biophysica Acta（1988）955:243-249）ではない。図２Ａおよび２Ｂは、ＤｅｒｐＩＩＩＰ３ＷＳ１とザリガニトリプシン（配列番号：２および３）のアミノ酸配列の比較を示す。ザリガニは、ＤｅｒｐＩＩＩと４４％の相同性をもつ。７個のシステイン残基があり、これらの残基の６個が、ジスルフィド架橋、５４−７０、１８１−１９８および２１０−２３６（図２Ａおよび２Ｂ）を形成することは、既知である（Hartley，Phil Trans Roy Soc Lond B （1970）257:77-87）。もっとも重要なことには、ＤｅｒｐＩＩＩタンパク質は、トリプシンタンパク質の触媒活性と基質特異性に関与する高い保存性残基を含む。保存されたＨｉｓ４０およびＳｅｒ１８５（図１Ａおよび１Ｂ）は、トリプシン酵素の活性触媒部位を含む電荷リレー系を表す。１７９における陽荷電のアスパラギン酸残基は、トリプシン特異性部位を表す。ほとんどのセリンプロテーゼは、この部位に中性アミノ酸をもつ（Keil，The Enzymes．Academic Press，New York，1971，pages 249 -279）。１７９におけるアスパラギン酸との組み合わせにおける２０６および２１１のグリシン残基は、リジンとアルギニンの大きな陽荷電側鎖、トリプシンによって切断される基質残基を調節することに関与している。アミノ酸残基１７９ −１８５および２０２−２０６（図１Ａおよび１Ｂ）は、トリプシン分子への基質の結合に必要なＳ１結合ポケットを形成する。これらの重要な残基のすべてを隣接して取り囲む領域は、ＤｅｒｐＩＩＩタンパク質のもっとも保存性の高い領域である。これら全結果は、異なる種からのトリプシンタンパク質の中で、構造的変異が、触媒活性に重要ではない分子のそれらの領域に起きるという事実と一致している（Vithayathil et al.，Arch Biochem Biophys（1961）92:532-540 ）。ほとんどのトリプシンタンパク質は、一般に、システイン残基の通常の対をなして、このグループのタンパク質に独特であるこれらの２種の架橋、Ｃｙｓ１５ −１４５およびＣｙｓ１１７−２１８を含む６個のジスルフィド架橋を形成する。ザリガニ（Titani et al.，Biochemistry（1983）22:1459-1465）およびＳ．グリセウスの両方に似ているＤｅｒｐＩＩＩは、これら２種の独特な結合を失っているが、より重要なのは、ＤｅｒｐＩＩＩは、それが、対にならないシステイン残基を外に含むので独特である。この残基は、Ｃｙｓ１４５、１１７および２１８と違って、ダニ・トリプシンの進化の分岐の間に除去されなかったウシ・トリプシンにおけるＣｙｓ１５に相当するであろう。グループＩＩＩアレルゲン、ＤｅｒｐＩＩＩに関するヌクレオチド配列をコードしている遺伝子の単離は、デルマトファゴイデス・アレルゲンのこのグループについて最初の一次配列の決定である。基質結合実験を考慮して、他の脊椎動物および無脊椎動物セリンプロテアーゼとの配列の比較（Stewart et al.，Immu nology （1992）75:29-35; Ando et al.，Arerugi（1992）41:704-707）は、グループＩＩＩアレルゲンが、トリプシンタンパク質であることを示す。トリプシンタンパク質は、すべての脊椎動物および無脊椎動物種の膵臓小胞細胞によってプレプロチモーゲンとして分泌される。無脊椎動物トリプシンは、分子量範囲２０〜３０ｋＤａをもつと報告された（Graf et al.，Insect Biochem（1985）15:61 1-618）。ＤｅｒｐＩＩＩＰ３ＷＳ１トリプシノーゲンは、計算された分子量２８ｋＤａをもち、そして対応する成熟タンパク質は、分子量２４，９８５ｋＤａであり、一方、生来の精製タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価されるように２８と３０ｋＤａの二重体(ｄｕｐｌｉｃａｔｅ)として存在した。ＤｅｒｆＩＩＩ（Thomas et al.，Exp Appl Acarol（1992）16:153-164）およびＤｅｒｐＩＩＩ（Stewart et al.，Immunology（1992）75:29-35）両方については、単離された多重タンパク質バンドという他の報告があった。トリプシンタンパク質が、数種のイソ型で存在することが知られているので、これらの結果は、異常ではない。GendryとLaaunay（1988）は、ラット膵臓から陰イオン性トリプシン様タンパク質の二重タンパク質バンドを単離した。彼らは、より高い３２ｋＤａバンドが不活性のトリプシンを表し、そしてより低い３０ｋＤａが、３２ｋＤａバンドの切断を自己触媒できるトリプシンの活性形を表すことを示唆した。それ故、３０ｋＤａバンドが、不活性なトリプシノーゲンを表し、そして２８ｋＤａバンドが活性トリプシンを表す可能性もある。無脊椎動物トリプシンに関するイソ酵素の数は、１〜１２の範囲と報告されている（MacDonald et al.，J Biol Chem（1982）257:9724-9732 ）。Stewartら（1992）は、ｐＩの範囲４〜＞８をもって存在するＤｅｒｐＩＩＩの９個の主要なイソ型を示した。ＤｅｒｐＩＩＩをコードしている相補的ＤＮＡ挿入断片（図１Ａおよび１Ｂ）を、ＥｃｏＲＩにより消化し、ｐＵ１９中に挿入した。非翻訳５’配列ならびに推定の疎水性リーダーの１部分を除去するために、ｃＤＮＡを、ＭｓｃＩで切断し、ＥｃｏＲＩリンカーを付加した。続いて、端を切り取ったＤｅｒｐＩＩＩ断片を、ＥｃｏＲＩ消化し、発現ベクターｐＥＴ１１ｄ（Studier et al.，Ge ne Expression Technology: Methods in Enzymology 185 ，Academic Press，San Diego，California（1990）60-89）中にサブクローン化した。配列と読み枠を、ＤＮＡ配列決定によって実証した。ＤｅｒｐＩＩＩをコードする配列は、終止コドンに残基１３を含んだ（図１Ａおよび１Ｂ、参照）。発現ベクターｐＥＴ１１ｄＤｅｒｐＩＩＩを、Ｅ．コリ宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換し、アンピシリン１５０μｇ／ｍｌを含むプレート上で選択した（Studier et al. ，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185，Academic Press ，San Diego，California（1990）60-89）。単一の形質転換株コロニーを、アンピシリン１５０μｇ／ｍｌを含むＢＨＩＢ培地２ｍｌ容中で、３７℃で約６時間増殖させた。この培養液１０ｍｌを、選択プレート上に塗布し、３７℃で一夜増殖させた。細菌叢を、培地２ｍｌに採取し、ＢＨＩＢ培地（アンピシリン１５０ μ ｇ／ｍｌ）５００ｍｌに添加し、３７℃でＡ₆₀₀＝１．０まで増殖させた。組み換え体発現を、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加して誘導した。２時間増殖後、細胞を回収し、溶菌し、そしてタンパク質を、ブタクサの組み換えアレルゲン、ＡｍｂａＩ．１およびＡｍｂａＩＩについて既に記載のように（Rogers，et a l .（1991）J．Immunol．147:2547-2552）、１００ｍＭ２−ＭＥを含む６ＭグアニジンＨＣｌバッファー中で可溶化した。ＤｅｒｐＩＩＩを含むグアニジンＨＣｌ溶菌液を、８Ｍ尿素中の変性条件下でＮｉ²⁺金属イオン・アフィニティークロマトグラフィーにかけた（Hochuli，E ．et al.,（1988）Bio/Technology 6:1321-1325）。Ｎｉ²⁺キレート支持体からの溶出後、組み換えＤｅｒｐＩＩＩタンパク質調製物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた（図３）。組み換えＤｅｒｐＩＩＩは、２５２個のアミノ酸に、精製ｔａｇ（ＭＧＨＨＨＨＨＨＥＦ（配列番号：１７））として使用されたアミノ酸を加えたものについて予測されたように、期待される分子量約２７ｋＤａをもった。ｐＥＴ１１ｄ発現系およびＮｉ²⁺メチルイオン・アフィニティークロマトグラフィー法により、増殖培地１リットル当たり約１２ｍｇの組み換えＤｅｒｐＩＩＩ（Ａ₂₈₀測定で推定）を生産した。この発現および精製スキムにより、クーマシーブルー染色によって可視化されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）により評価されるように、９０％を超える純度をもつタンパク質調製物を得た。観察された見かけの分子量約３２ｋＤａは、一次構造（図１Ａおよび１Ｂ、および上記）から予測されたものよりやや高い。図３において、ＤｅｒｐＩＩＩ調製物の濃度増加は、純度を実証するために試験された（列１，４．３μｇ；列２，８．７μｇ；列３，１３．８μｇ；列４，１７．４μｇ；マーカーをＭで示した）。等価物当業者は、明細書とともに記載の特定の態様に対する種々の等価物を認識するであろうし、また日常の実験以外のものを用いて確認することもできるであろう。そのような等価物は、本発明の範囲内にあると考えられ、そして次の請求の範囲によって包含される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/435 Ｃ０７Ｋ 14/435 9356−4Ｈ 16/18 16/18 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9637−4Ｂ 21/08 21/08 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＱＧ０１Ｎ 33/53 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チユア，カウ−ヤン台湾・タイペイ100・フアーストセクシヨン・ジエン−アイロード１・ナシヨナルタイワンユニバーシテイ・カレツジオブメデイシン・グラジユエイトインステイテユートオブイミユノロジー (72)発明者ロジヤース，ブルース・エルアメリカ合衆国マサチユセツツ州01890ベルモント・リチヤードソンロード54 (72)発明者クオ，メイ−チヤングアメリカ合衆国マサチユセツツ州01890ウインチエスター・コツクスロード５

Claims

【特許請求の範囲】１．家庭のちりのダニ・アレルゲン、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離された核酸。２．ｃＤＮＡ配列である、請求の範囲１の単離された核酸。３．ｃＤＮＡが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に示されたヌクレオチド配列を含む、請求の範囲２の単離された核酸。４．ｃＤＮＡが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に示されたヌクレオチド配列のコーディング領域を含む、請求の範囲２の単離された核酸。５．ペプチドが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されたアミノ酸配列を含む、請求の範囲１の単離された核酸。６．ペプチドが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示された配列のアミノ酸残基１−２３２を含む、請求の範囲５の単離された核酸。７．ペプチドが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されたアミノ酸配列を含む配列と少なくとも５０％相同である、請求の範囲１の単離された核酸。８．ペプチドが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されたアミノ酸配列を含むペプチドをコードしている核酸に、高くも低くも緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、請求の範囲１の単離された核酸。９．ペプチドが、長さ、アミノ酸残基少なくとも約１０−２０個である、請求の範囲１の単離された核酸。１０．ペプチドが、長さ、アミノ酸残基少なくとも約１０−１６個である、請求の範囲１の単離された核酸。１１．長さ、アミノ酸残基少なくとも約１０−１６個またはそれ以上のペプチドをコードし、そして図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されたアミノ酸配列と少なくとも約５０％の相同性をもつヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ。１２．請求の範囲１の核酸を含む組み換え発現ベクター。１３．核酸がｃＤＮＡである、請求の範囲１２の組み換え発現ベクター。１４．ｃＤＮＡが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：１）に示されたヌクレオチド配列を含む、請求の範囲１３の組み換え発現ベクター。１５．ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの発現を指令することができる請求の範囲１２の組み換え発現ベクターを用いて、トランスフェクションされた宿主細胞。１６．真核生物細胞である、請求の範囲１５の宿主細胞。１７．ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの発現を指令することができる請求の範囲１３の組み換え発現ベクターを用いて、トランスフェクションされた宿主細胞。１８．真核生物細胞である、請求の範囲１７の宿主細胞。１９．ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの発現を指令することができる請求の範囲１４の組み換え発現ベクターを用いて、トランスフェクションされた宿主細胞。２０．真核生物細胞である、請求の範囲１９の宿主細胞。２１．培地中で請求の範囲１５の宿主細胞を培養してペプチドを発現させ、そして培養物からペプチドを単離することを含むＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドを生産する方法。２２．請求の範囲１の核酸の組み換え発現によって生産される、家庭のちりのダニ・アレルゲン、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつ単離されたペプチド。２３．請求の範囲３の核酸の組み換え発現によって生産される、家庭のちりのダニ・アレルゲン、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつ単離されたペプチド。２４．請求の範囲４の核酸の組み換え発現によって生産される、家庭のちりのダニ・アレルゲン、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつ単離されたペプチド。２５．請求の範囲１１のＤＮＡの組み換え発現によって生産される、家庭のちりのダニ・アレルゲン、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつ単離されたペプチド。２６．化学合成によって生産される、家庭のちりのダニ・アレルゲン、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつ単離されたペプチド。２７．長さ、アミノ酸残基少なくとも約１０−２０個である、請求の範囲２６の単離されたペプチド。２８．長さ、アミノ酸残基少なくとも約１０−１６個である、請求の範囲２６の単離されたペプチド。２９．ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつ改変されたペプチド。３０．図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されたＤｅｒｐＩＩＩアミノ酸配列に存在する少なくとも１個のシステイン残基が、その他のアミノ酸によって置換されている、請求の範囲２９の改変されたペプチド。３１．図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されたＤｅｒｐＩＩＩアミノ酸配列に存在する少なくとも１個のシステイン残基が、セリン残基によって置換されている、請求の範囲３０の改変されたペプチド。３２．少なくとも１個のリジン残基が、ペプチドのアミノもしくはカルボキシ末端か、またはアミノおよびカルボキシ両末端かのいずれかに付加されている、請求の範囲２９の改変されたペプチド。３３．家庭のちりのダニ・アレルゲン、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつペプチドの実質的に純粋な調製物。３４．家庭のちりのダニ・アレルゲン、ＤｅｒｐＩＩＩの活性をもつ少なくとも１種のペプチドおよび薬物学的に許容できるキャリアーを含む、薬物学的投与に適切な組成物。３５．ペプチドが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）のアミノ酸配列を含む、請求の範囲３４の組成物。３６．ペプチドが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号：２）に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１−２３２を含む、請求の範囲３５の組成物。３７．請求の範囲３４の組成物を患者に投与することを含む、家庭のちりのダニ・アレルゲンに感受性の患者におけるそのアレルゲンに対する感受性を治療する方法。３８．ペプチドと血液成分との結合に適する条件下で、請求の範囲２２のペプチドと患者から得られた血液サンプルを合わせ、そしてそのような結合が生じる程度を測定することを含む、患者における家庭のちりのダニ・アレルゲンに対する感受性を検出する方法。３９．結合が生じる程度が、Ｔ細胞機能、Ｔ細胞増殖、Ｂ細胞機能、血液中に存在する抗体へのタンパク質の結合、またはそれらの組み合わせ現象を評価することによって測定される、請求の範囲３８の方法。４０．請求の範囲２２のペプチドと特異的に反応する抗体。４１．モノクローナル抗体である請求の範囲４０の抗体。４２．請求の範囲２５のペプチドと特異的に反応する抗体。４３．モノクローナル抗体である請求の範囲４２の抗体。４４．請求の範囲２２のペプチドと特異的に反応するＴ細胞クローン。４５．請求の範囲２２のペプチドと特異的に反応する可溶性Ｔ細胞レセプター。４６．請求の範囲４５のＴ細胞レセプターと特異的に反応する抗体。４７．抗体がモノクローナル抗体である、請求の範囲４６の抗体。