ES2261192T3 - Antigeno de estafilococo y vacuna. - Google Patents

Abstract

Antígeno de estafilococo aislado que comprende (a) aminoácidos y hexosamina N-acetilada en una configuracióna, (b) no contiene ningún grupo O-acetilo detectable por espectroscopia de resonancia magnética nuclear y (3) enlaza específicamente con anticuerpos de una cepa de estafilococos depositada con el número ATCC 202176.

Description

Antígeno de estafilococo y vacuna.

La presente invención se refiere a un nuevo antígeno de estafilococo y a un método para obtener y utilizar el antígeno.

El estafilococo es el causante de diversas patologías debidas a varios mecanismos patógenos. La más frecuente y grave de estas patologías es la bacteriemia y sus complicaciones en los pacientes hospitalizados. En particular, el estafilococo puede causar infecciones en heridas e infecciones asociadas con catéteres y dispositivos protésicos. Como infecciones graves asociadas con bacteriemia por estafilococo se puede citar la osteomielitis, la endocarditis invasiva y la septicemia. El problema consiste en la resistencia múltiple a antibióticos en cepas de hospital, que limita gravemente la elección de una terapia. En la mayoría de los casos, el organismo causante es una cepa de S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus o S. hominis, o una combinación de los mismos. El problema con el estafilococo queda agravado por la resistencia múltiple a antibióticos en cepas de hospital, lo cual limita gravemente la elección de una terapia.

Una vacuna para el S. aureus proporcionaría una solución al problema de la resistencia antibiótica. Un antígeno común a múltiples especies de estafilococo permitiría la producción de una vacuna que contuviese un solo antígeno eficaz contra una amplia variedad de infecciones por estafilococo.

Por lo tanto, uno de los objetos de la presente invención es proporcionar un antígeno común a la mayoría de las cepas clínicamente importantes de múltiples especies de estafilococo.

Otro de los objetos es ofrecer una vacuna que contenga un antígeno común a la mayoría de cepas clínicamente importantes de especies múltiples de estafilococos.

Otro de los objetos consiste en ofrecer una composición de globulina hiperinmune que contenga anticuerpos dirigidos contra un antígeno común a una mayoría de cepas clínicamente importantes de especies múltiples de estafilococos.

Otro de los objetos de la presente invención es ofrecer una vacuna de células completas que lleve un antígeno común a una mayoría de cepas clínicamente importantes de múltiples cepas de estafilococo, particularmente uno que sea común a las especies coagulasa-negativa de S. epidermidis, S. haemolyticus y S. hominis.

Otro de los objetos consiste en proporcionar un kit y un ensayo para diagnosticar la infección por estafilococo.

De acuerdo con estos y otros objetos de la invención, se presenta un antígeno de estafilococo aislado que (a) comprende aminoácidos y una hexosamina N-acetilada en una configuración \alpha, (b) no contiene ningún grupo O-acetilo detectable por espectroscopia de resonancia magnética nuclear, y (3) enlaza específicamente con anticuerpos de una cepa de estafilococo depositada con el número ATCC 202176.

También se presenta una composición que comprende el antígeno de estafilococo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable y estéril para el mismo. Un método de inmunoterapia comprende una etapa de administración al individuo de una cantidad inmunoestimulante de dicha composición.

También se presenta una vacuna de célula completa que comprende células de una cepa de estafilococo que lleva el antígeno.

También se presenta una composición que comprende la vacuna de célula completa, y un vehículo farmacéuticamente aceptable y estéril para la misma.

La vacuna se puede administrar a un individuo para proporcionar protección contra infección por estafilococo.

Un agente inmunoterapéutico contra la infección por estafilococo se puede preparar inmunizando individuos con una composición según la invención, recogiendo plasma de los individuos inmunizados, y cosechando una globulina hiperinmune que contiene anticuerpos dirigidos contra estafilococos del plasma recogido. La globulina hiperinmune contiene anticuerpos dirigidos contra el antígeno. Un método de inmunoterapia comprende una etapa de administración de esta globulina hiperinmune a un individuo.

La presente invención también presenta un catéter revestido con un antígeno según la invención, y un método para evitar la adherencia de bacteria de estafilococo a un catéter, que comprende el tratamiento de un catéter con antígeno según la invención. En una realización preferida, el catéter es un catéter intravenoso.

En la siguiente descripción detallada se podrán apreciar otros objetos, características y ventajas de la presente invención. Queda sin embargo entendido que la descripción detallada y los ejemplos específicos, si bien presentan realizaciones preferidas de la invención, se dan únicamente a modo de ilustración.

La figura 1 es un perfil cromatográfico en Superose 6HR para el antígeno de estafilococo según la invención.

Las figuras 2a y 2b son espectros NMR para el antígeno de estafilococo según la invención.

Se ha descubierto que muchos aislados, clínicamente importantes, de S. epidermidis, S. haemolyticus, y S. hominis tienen en común un antígeno, que recibe aquí el nombre de "el antígeno". El antígeno representa la base para una vacuna, que ofrece protección contra la infección por un gran número de aislados de estafilococo clínicamente importantes. En este sentido, un aislado "clínicamente importante" es un aislado patógeno.

En particular, los presentes inventores observaron que la mayoría de los aislados clínicos de estafilococo reaccionaban muy fuertemente con suero de anticuerpo conjugado/antígeno, por lo que eran tipificables como cepas que contienen el antígeno. Más particularmente, la tipificación de aislados clínicos obtenidos de diversas fuentes ha mostrado que aprox. el 60% de los aislados de S. epidermidis, el 50% de los S. haemolyticus y el 40% de los S. hominis expresan el antígeno, según se determina por aglutinación en placa. Cuando se sometieron los digestos enzimáticos de los aislados de S. haemolyticus y S. homini a un ensayo de inmunodifusión, todos los aislados dieron un resultado positivo en cuanto a la presencia del antígeno.

Los anticuerpos del antígeno no tienen reacción cruzada con polisacáridos aislados de S. aureus tipo 5, tipo 8, tipo 4 o K73 (una cepa variante de tipo 5). El antígeno es por lo tanto específico, es decir que produce una sola banda únicamente con antisuero de cepas homólogas.

El antígeno se puede obtener en cantidad recuperable, de ciertos aislados de estafilococo cultivados según los protocolos aquí descritos, de forma prácticamente pura. En particular, el antígeno purificado contiene menos del 1% de ácidos nucléicos. Una cantidad "recuperable" en este sentido significa que la cantidad aislada del antígeno se puede detectar con una metodología menos sensible que el radio marcaje, como el inmunoensayo, y se puede someter a manipulaciones ulteriores que pueden suponer el paso a solución del antígeno per se.

Para obtener el antígeno, se fermenta primero un aislado según la invención en un Caldo Columbia modificado, suplementado con 4% NaCl. Tras la fermentación, se desactivan células y luego se centrifugan para separar las células del sobrenadante.

Se extrae el antígeno de la pasta celular. Algo del antígeno se encuentra presente en el sobrenadante, pero la cantidad es insignificante comparada con la cantidad encontrada en la pasta celular. Debido al bajo rendimiento y al riesgo de contaminación por hexosa del medio, no se considera preferible la extracción del sobrenadante.

Una suspensión de la pasta celular se trata con pronasa, lisostafina, DNasa y RNasa. La suspensión se hace de 10% en ácido tricloroacético (TCA) y se incuba a 60ºC. Tras la centrifugación, el sobrenadante se neutraliza con un NaOH a pH 7,0 seguido de precipitación secuencial con 25-75% etanol frío/CaCl_{2} para eliminar los ácidos nucléicos y proteínas de elevado peso molecular y luego se precipita el material que contiene antígeno.

El precipitado crudo se disuelve en agua y el etanol residual se elimina por diálisis. El ácido teicóico residual se elimina por cromatografía de intercambio de anión. Se testan las precipitaciones por precipitación capilar con anticuerpos específicos del antígeno para determinar las fracciones que contienen antígeno, que se agrupan, dializan, liofilizan y tratan con lisozima para digerir el péptido glucano residual. La fracción que contiene antígeno crudo tratado con enzima se vuelve a suspender y se vuelve a cromatografiar en una columna de intercambio de aniones en un gradiente lineal 0,1-0,25 M NaCl en tampón de tris-HCl, pH 7,0. Las fracciones positivas de antígeno y negativas de fósforo, según se determina en el ensayo colorimétrico de la precipitación capilar con antisuero monoespecífico respectivamente, se agrupan, se dializan con agua y se liofilizan. La mayoría del antígeno eluye a 0,2 M NaCl. El antígeno crudo se sigue purificando por cromatografía en columna y las fracciones que contienen antígeno se agrupan para producir antígeno prácticamente puro.

El antígeno purificado produce una sola banda de precipitina cuando reacciona con antisuero de célula completa en un ensayo de doble inmunodifusión. La inmunoelectrofóresis de antígeno purificado y el modelo de elución en la columna de intercambio fónico durante el proceso de purificación indican una molécula cargada negativamen-
te.

El antígeno prácticamente puro y el antígeno repurificado por cromatografía de fase inversa en una columna C18 muestran un perfil polidisperso en una columna Superose 6HR (figura 1). Ambos contienen menos de 1% de ácidos nucléicos. En los ensayos colorimétricos no se detecta ninguna hexosa, ni fósforo ni grupos O-acetilo. El antígeno purificado no tiñe en SDS-PAGE Coomasie azul.

El análisis de antígeno purificado por espectrografía de masas-cromatografía líquido gas (GLC-MS) muestra la presencia de GlcNAc como componente glicósilo principal. Es sensible a ácido suave, lo cual indica que los residuos de GlcNAc no están ligados por enlaces glucosídicos. El antígeno es resistente a la acción de enzimas proteolíticas.

La presencia de GlcNAc se confirma por espectrografía 1H-NMR y 13C-NMR, que indica una señal anomérica a \delta 4,88 y \delta 100,48 ppm, respectivamente (ver fig. 2a y 2b). La espectrografía NMR confirma también la ausencia de grupos O-acetilo. Esta ausencia de acetilación O se encuentra en claro contraste con otros antígenos de estafilococo, como el tipo 5 y el tipo 8 que contienen de 20 a 80% de acetilación O.

Un pequeño valor de JH1, H2 (<1,0 Hz) indica una configuración \alpha para la glucosamina que se confirma con la medida de c=173 Hz para la constante de acoplamiento JC,H. Las señales en \delta 24,860 ppm (NAac-CH_{3}) y \delta 176,814 ppm (Nac-CO) en el espectro 13 NMR sugieren que la glucosamina está N-acetilada, por lo que se postula que la porción de carbohidrato del antígeno es 2-acetamido-2-desoí-\alpha-D-glucopiranosida.

El análisis de aminoácidos del antígeno muestra la presencia de serina, alanina, ácido aspártico/asparagina, valina y treonina en proporciones molares de aproximadamente 39:25:16:10:7. Los aminoácidos constituyen aproximadamente el 32% en peso de la molécula de antígeno.

Una comparación de los espectros NMR para el antígeno con los espectros NMR para cada uno de los antígenos de S. aureus tipo 5 y tipo 8 y con los espectros NMR para los antígenos 336 descritos en el documento US 5,770,208 muestra que es químicamente diferente de estos antígenos. Las estructuras de los antígenos de polisacárido de tipo 5 y 8 han sido puestas de manifiesto por Moreau et al., Carbohydr. Res. 201:285 (1990); y Fournier et al., Infect. Imm. 45:87 (1984). Ambos tienen FucNAcp en su unidad repetidora así como ManNAcA que se puede utilizar para introducir un grupo sulfidrilo. Las estructuras son las siguientes:

Tipo 5:

1

Tipo 8:

2

Por el contrario, el antígeno según la presente invención tiene glucosamina como componente de carbohidrato principal. A diferencia de los antígenos de S. aureus tipo 5 y tipo 8, contiene aminoácidos.

La inducción de bacteriemia en mamíferos requiere un número extremadamente elevados de organismos o alguna maniobra previa para reducir la resistencia del anfitrión. No obstante, la fagocitosis in vitro se puede estudiar como correlato de inmunidad protectora in vivo. En este modelo, se mide por fagocitosis, según el método descrito en Kojima et al., Infect. Dis. Immun. 58: 2367-2374 (1990). La aptitud de los anticuerpos policlonales y monoclonales específicos del antígeno, de los aislados de estafilococo opsonize in vitro. Los ensayos in vitro de opsonofagocitosis son reconocidos en el sector como pronóstico de eficacia como vacuna. Por ejemplo, Fischer et al. describe una correlación entre el anticuerpo funcional determinado con un ensayo opsónico y la actividad in vivo. J. Inf. Dis. 169: 324-9 (1994).

Los anticuerpos inducidos por una vacuna que contiene el antígeno facilitan la fagocitosis específica de tipo. Los ensayos de fagocitosis in vitro indican por lo tanto que los anticuerpos del antígeno protegen contra infección por cepas de estafilococos que llevan el antígeno. Una vacuna basada en el antígeno se puede utilizar para proteger contra infección procedente de una mayoría de cepas de estafilococos clínicos. Los resultados obtenidos in vivo con el modelo de letalidad del ratón y el modelo de bacteriemia del ratón se corresponden con los resultados de los ensayos de opsonofagocitosis in vitro y muestran que los anticuerpos de conjugados de antígenos reducen la mortalidad y la bacteriemia en ratones expuestos a cepas de estafilococos que llevan el antígeno.

De preferencia, una composición del antígeno o de células completas que contienen el antígeno según la presente invención, "consta esencialmente de" antígeno o células que contienen el antígeno. Dentro de este contexto, la expresión "consta esencialmente de" significa que la composición no contiene ningún material que interfiere con la provocación de una respuesta inmune al antígeno (y a otros antígenos, si se hallan presentes) si la composición se administra a un individuo como vacuna o con la característica de acoplamiento antígeno-anticuerpo de un ensayo diagnóstico si el antígeno se utiliza en diagnóstico.

El antígeno según la invención resulta útil en la producción de ensayos diagnósticos para detectar la presencia de antígeno de estafilococo y/o anticuerpo anti-estafilococo en una muestra. El antígeno o el antígeno específico del antígeno, solo o en combinación con otros antígenos de estafilococo o anticuerpos, se mezcla con una muestra que se sospecha contiene antígeno de estafilococo o anticuerpo y se controla y se sigue la unión antígeno-anticuerpo. El antígeno o anticuerpo se marca con una marca radioactiva o enzima. En una realización preferida, el antígeno o anticuerpo se inmoviliza en una matriz sólida de modo que el antígeno o anticuerpo tiene acceso al anticuerpo o antígeno complementario que entra en contacto con una superficie de la matriz. Se pone entonces en contacto la muestra con la superficie de la matriz y se controla y se sigue la unión antígeno-anticuerpo en la superficie.

Por ejemplo, el antígeno o anticuerpo se puede utilizar en un ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA), en el cual el antígeno o anticuerpo se fija a una fase sólida y se utiliza un conjugado enzima-anticuerpo o enzima-antígeno para detectar y/o cuantificar el anticuerpo o antígeno presente en una muestra. Alternativamente, se puede utilizar un ensayo de transferencia western en el que el o los antígenos solubilizados y separados están unidos a papel de nitrocelulosa. El anticuerpo se detecta entonces mediante una anti-inmunoglobulina (Ig), marca-conjugada o enzima como conjugado Ig-peroxidasa rábano picante incubando el papel de filtro en presencia de un sustrato precipitable o detectable. Los ensayos de transferencia western tienen la ventaja de no requerir una pureza superior al 50% para el o los antígenos deseados. Se pueden encontrar descripciones de ELISA y técnicas de transferencia western en los Cap. 10 y 11 de Ausubel, et al. (eds), Current PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons (1988), incorporándose aquí, como referencia, el contenido completo de los mismos.

Para utilizarlo en una vacuna, es preferible conjugar el antígeno con un inmunoportador, por lo general un polipéptido o proteína, para mejorar la interacción entre células T y B para inducir una respuesta inmune contra el antígeno. Esto resulta particularmente importante para vacunas que se pretenden utilizar en pacientes con existencia reducida. Un inmunoportador potencia la inmunogenecidad tanto para la inmunización activa como para la preparación de antisueros de valor elevado en voluntarios para inmunización pasiva. Como inmunoportadores adecuados según la presente invención se pueden citar el tetanus toxoide, difteria toxoide, Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A o sus derivados, cepas mutantes no tóxicas producidas de modo recombinante, de exotoxin A, según se describe por ejemplo en Fattom et al., Inf. Imm. 61:1023-1032 (1993), así como otras proteínas habitualmente utilizadas como inmunoportadores.

Con el objeto de conjugar el antígeno a una proteína portadora, el antígeno se tiene que derivar primero. Se pueden utilizar diversos métodos para derivar antígeno y enlazarlo de modo covalente a un inmunoportador. Los grupos carboxilato activados del antígeno se pueden derivar con ADH, cistamina o PDP y entonces el antígeno se puede acoplar a una proteína portadora mediante una reacción en la que interviene carbodiimida del antígeno parcialmente amidato a un grupo carboxilato en la proteína portadora o por intercambio de disulfuro antígeno tiolatado con una proteína portadora SPDP-derivada.

Se pueden activar grupos hidroxilo en el antígeno utilizando bromuro de cianógeno o 1-ciano-4-dimetilamino-piridinio-tetrafluorborato, y luego el antígeno se puede derivar con la hidridazida de ácido adípico espaciadora bifuncional de 6 carbonos (ADH) según técnicas conocidas en el estado de la técnica, siguiendo el método de Kohn et al. FEBS Lett. 154:209:210 (1993). Este material se liga entonces a difteria toxoide (Dtd), exoproteína recombinante A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA), toxoide de tétanos (TTd) u otra proteína portadora adecuada por medio de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC). Los conjugados resultantes se pueden separar del antígeno que no ha reaccionado por cromatografía de exclusión por tamaño. Independientemente del método utilizado para conjugar el antígeno a la proteína portadora, el enlace covalente del antígeno a la proteína portadora potencia notablemente la inmunogenecidad del antígeno y se obtienen por lo tanto niveles más elevados de anticuerpos para el antígeno después de haber realizado el primer y segundo refuerzo en ratones.

De preferencia, el antígeno o conjugado de antígeno se administra sin adyuvante con el fin de evitar la toxicidad inducida por el adyuvante. Si se utiliza un adyuvante, se preferirá utilizar uno que promueva los anticuerpos protectores IgG subtipo 2. Entre los adyuvantes habituales se puede citar el hidróxido de aluminio, adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA). El sulfato de dextrano ha resultado ser un potente estimulador de anticuerpo IgG_{2} contra antígenos de superficie celular de estafilococos y resulta también adecuado como adyuvante.

La presente invención también se refiere a la utilización del antígeno para producir anticuerpos policlonales o monoclonales (ratón o humano) que interaccionan con o neutralizan las cepas de estafilococo que llevan el antígeno. En Ausubel, et al., (eds), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, NY., Capitulo 11; en Methods OF HYBRIDOMA FORMATION 257-271, Bartal & Hirshaut (eds.) Humana Press, Clifton, NJ (1998); en Vitetta et al., Immunol. Rev. 62: 159-83 (1982) y en Raso, Immunol. Rev. 62:93-117 (1982). Se describen protocolos para producir estos anticuerpos.

El inóculo para la producción de anticuerpo policlonal se suele preparar dispersando el inmunoportador de antígeno en un diluyente fisiológicamente tolerable como un salino, par formar una composición acuosa. Se administra una cantidad inmunoestimulante de inóculo, con o sin adyuvante a un mamífero y el mamífero inoculado se mantiene entonces durante un período de tiempo suficiente para que el antígeno proceda a la inducción de anticuerpos protectores anti-antígeno. Se pueden utilizar dosis de refuerzo del inmunoportador de antígeno en individuos que no han sido todavía sensibilizados para responder al antígeno.

Se pueden citar como anticuerpos las preparaciones de anticuerpos de una variedad de animales habitualmente utilizados como por ejemplo cabras, primates, asnos, cerdos, conejos, caballos, gallinas, conejillos de indias, ratas y ratones e incluso anticuerpos humanos tras una selección adecuada, fraccionamiento y purificación. Los antisueros animales también se pueden producir inoculando los animales con cepas inactivadas con formalina de estafilococos que llevan el antígeno, utilizando métodos convencionales, sangrando los animales y recuperando suero o plasma para su procesamiento ulterior.

Los anticuerpos inducidos de este modo se pueden cosechar y aislar en la forma de deseada utilizando técnicas bien conocidas como fraccionamiento de alcohol y cromatografía en columna o cromatografía por inmunoafinidad, es decir, ligando antígeno a un "packing" de columna cromatográfica como Sephadex^{TM}, haciendo pasar el antisuero a través de la columna, reteniendo de este modo anticuerpos específicos y separando otras inmunoglobulina (IgGs) y contaminantes, y luego recuperando anticuerpos purificados por elución con un agente caotrópico, seguido opcionalmente de purificación ulterior, por ejemplo haciendo pasar a través de una columna de antígenos de grupo sanguíneo "bound" u otras especies no patógenas. Este procedimiento puede ser el preferido cuando se aislan los anticuerpos deseados del suero o del plasma de humanos que han desarrollado un valor de anticuerpo contra el patógeno en cuestión, garantizando por lo tanto la retención de anticuerpos capaces de interactuar con el antígeno. Se pueden utilizar entonces en preparaciones para inmunización pasiva contra cepas de estafilococo que llevan el antígeno.

Una composición de anticuerpo monoclonal contiene, dentro de límites detectables, únicamente una especie de zona de combinación de anticuerpo capaz de interactuar efectivamente con el antígeno. Los anticuerpos adecuados en forma monoclonal se pueden preparar utilizando tecnología convencional de hibridoma. Para formar hibridomas a partir de los cuales se produce una composición de anticuerpo monoclonal de la presente invención, se condensa un mieloma u otra línea celular auto-perpetuante con linfocitos obtenidos de sangre periférica, nodos linfáticos o el bazo de un mamífero hiperinmunizado con el antígeno. Se prefiere que la línea celular del mieloma sea de la misma especie que los linfocitos. Los esplenocitos se suelen condensar con células de mieloma utilizando polietilenglicol 1500. Se eligen híbridos condensados por su sensibilidad a HAT. Los hibridomas que se secretan las moléculas de anticuerpo de esta invención se pueden identificar utilizando una ELISA.

Los materiales preferidos que se usan en la preparación de hibridomas humanos o de murino son el bazo de un ratón Balb/C, sangre periférica humana, nodos linfáticos o esplenocitos. Como mielomas de ratón adecuados que se usan la presente invención se pueden citar las líneas celulares sensible a hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), y un mieloma preferido es P3X63-Ag8.653. El partner de fusión preferido para la producción de anticuerpos monoclonales humanos es SHM-D33, un heteromieloma que se puede adquirir en ATCC, Rockville, Md y cuya denominación es CRL1668.

Se puede producir una composición de anticuerpos monoclonales de la presente invención iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio nutriente que contiene un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpo de la especificidad adecuada. El cultivo se mantiene en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo en el medio. El medio que contiene anticuerpo se recoge entonces y entonces las moléculas de,anticuerpo se pueden seguir aislando utilizando técnicas bien conocidas. Los medios útiles para la preparación de estas composiciones son bien conocidos en el estado de la técnica y se encuentran en el mercado; estos medios pueden ser medios de cultivo sintético, ratones endógamos y similares. Un medio sintético ejemplar es el medio esencial Mínimo de Dulbecco suplementado con 20% de suero de ternera fetal. Como ejemplo de cepa de ratón endógamo se puede citar el Balb/C.

Se contemplan también otros métodos de preparación de composiciones de anticuerpos monoclonales tales como fusiones Inter-especies, ya que es principalmente la especificidad antigénica de los anticuerpos lo que supone su utilidad en la presente invención. Se pueden condensar linfocitos humanos obtenidos de personas infectadas con una línea celular de mieloma humano para producir hibridomas que se criban entonces para observar la producción de anticuerpos que reconocen el antígeno. No obstante, resulta preferible en este sentido un proceso que no supone la utilización de una muestra biológica de un paciente humano infectado. Por ejemplo, un individuo inmunizado con una vacuna como la descrita aquí puede servir de fuente de anticuerpos que se pueden utilizar adecuadamente en una composición anticuerpo dentro de la presente invención.

En una realización particularmente preferida, se producen anticuerpos monoclonales del antígeno utilizando métodos similares a los descritos para anticuerpos específicos de S. aureus tipo 5 y tipo 8. Los anticuerpos monoclonales purificados se caracterizan por ensayos de aglutinación bacteriana usando una colección de aislados clínicos.

Las composiciones de anticuerpo monoclonal y policlonal producidas según la presente descripción se pueden utilizar mediante inmunización pasiva para inducir una respuesta inmune para la prevención o tratamiento de infección por cepas de estafilococos que llevan el antígeno. En este sentido, la preparación de anticuerpo puede ser una composición policlonal. Esta composición policlonal comprende anticuerpos que interactúan con el antígeno, y puede incluir además anticuerpos que interactúan con los antígenos que caracterizan otras cepas de estafilococo. El componente de anticuerpo policlonal puede ser un suero policlonal, de preferencia purificado por afinidad, de un animal que ha sido expuesto al antígeno, y posiblemente también a otros antígenos de estafilococo. Alternativamente, se puede utilizar una mezcla "oligoclonal diseñada" que es una mezcla de anticuerpos monoclonales del antígeno y anticuerpos monoclonales de otros antígenos de estafilococo.

En ambos tipos de mezclas, puede resultar ventajoso ligar juntos anticuerpos químicamente para formar una sola molécula poliespecífica capaz de interactuar con el antígeno y con antígenos característicos de otras cepas de estafilococos. Una forma de realizar dicho enlace consiste en hacer bivalente fragmentos híbridos F(ab')_{2} mezclando dos fragmentos F(ab')_{2} diferentes producidos, por ejemplo por digestión de pepsina de dos anticuerpos diferentes, división reductiva para formar una mezcla de fragmentos Fab', seguido de reformación oxidativa de los enlaces disulfuro para producir una mezcla de fragmentos F(ab')_{2} que comprende fragmentos híbridos que contienen una parte Fab' específica de cada uno de los antígenos originales. En Feteanu, LABELED ANTIBODIES IN BIOLOGY AND MEDICINE 321-23, McGraw-Hill Int'l Book Co. (1978); Nisonoff, et al., Arch Biochem. Biophys. 93: 470 (1961); and Hámmerling, et al., J. Exp. Med. 128: 1461 (1968); y en la patente US 4,331,47, se describen métodos para preparar estos fragmentos de anticuerpo híbridos.

En el estado de la técnica se conocen otros métodos para hacer bivalentes fragmentos enteramente heteroespecíficos, por ejemplo utilizando ligantes bifuncionales para unir fragmentos divididos. Se conocen moléculas recombinantes que incorporan la cadena ligera y pesada de un anticuerpo, por ejemplo según el método de Boss et al., patente US 4,816,397. En la presente invención se incluyen métodos análogos de producción de moléculas de fijación sintética o recombinante que tiene las características de anticuerpos. Utilizando diversos ligantes conocidos en el estado de la técnica se pueden unir más de dos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo monoespecíficos diferentes.

Un componente de anticuerpo producido de acuerdo con la presente invención puede incluir anticuerpos enteros, fragmentos de anticuerpos o subfragmentos. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulina completa de cualquier clase, por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, anticuerpos mixtos o híbridos con especificidades de epítopo o antígeno múltiple o dual, o fragmentos, por ejemplo F(ab')_{2}, Fab', Fab y similares, inclusive fragmentos híbridos y comprende además cualquier inmunoglobulina o cualquier proteína natural sintética o genéticamente diseñada que actúe como un anticuerpo interactuando con un antígeno específico para formar un complejo. En particular, las moléculas Fab se pueden expresar y ensamblar en un anfitrión transformado genéticamente como E. coli. Se dispone por lo tanto de un sistema de vector lambda para expresar una población de Fab's con una diversidad potencial igual a o superior a la del sujeto que genera el anticuerpo predecesor. Véase Huse, W.D. et al., Science 246: 1275-81 (1989).

El antígeno según la presente invención puede ser el ingrediente activo en una composición, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable para el ingrediente activo, que se puede utilizar como vacuna para inducir una respuesta inmune celular y/o la producción in vivo de anticuerpos que combaten la infección por estafilococos. En este sentido, un portador farmacéuticamente aceptable es un material que se puede utilizar como vehículo para la administración de un medicamento ya que el material es inerte o médicamente aceptable de alguna otra forma, así como compatible con el agente activo, en el contexto de la administración de vacuna. Además de un excipiente adecuado, un portador farmacéuticamente aceptable puede contener aditivos de vacuna convencionales como diluyentes, adyuvantes, antioxidantes, conservantes y agentes de solubilización.

En una realización alternativa, se utilizan células que llevan el antígeno en una vacuna de célula completa. Las células que llevan el antígeno se pueden identificar y seleccionar para utilizarlas en la vacuna de célula completa utilizando anticuerpos de una cepa conocida por llevar el antígeno, y todavía mejor utilizando anticuerpos monoclonales de antígeno aislado tal como se describe aquí. En este sentido, se puede utilizar un simple experimento de glutinación en placa en el que se mezclan con células anticuerpos del antígeno.

La cepa depositada ATCC 202176 es una cepa representativa de estafilococos que llevan el antígeno y se pueden utilizar para producir anticuerpos útiles para identificar otras cepas que llevan el antígeno. No obstante, no es necesario utilizar la cepa depositada para producir el antígeno, la vacuna de célula completa o anticuerpos útiles para identificar otras células que llevan el antígeno. ATCC 202176 únicamente proporciona un medio inmunológico de identificar dichas células.

Tal como se ha descrito anteriormente para la vacuna de antígeno purificado, la vacuna de célula completa comprende también un portador farmacéuticamente aceptable. La vacuna de célula completa puede contener también opcionalmente aditivos de vacuna convencionales como diluyentes, adyuvantes, antioxidantes, conservantes y agentes de solubilización. En una realización preferida, la vacuna de célula completa contiene solamente células que llevan el antígeno y no incluye células de cepa de estafilococo que no llevan el antígeno.

Se pueden administrar vacunas según la invención a un sujeto no infectado todavía con estafilococo, para inducir de este modo una respuesta inmune protectora a los estafilococos (humoral o celular) en dicho sujeto. Alternativamente, se pueden administrar, vacunas, dentro de la presente invención, a un sujeto en el que ya se ha presentado la infección por estafilococo aunque se encuentra en un estadio suficientemente temprano para que la respuesta inmune producida a la vacuna siga inhibiendo de forma eficaz la extensión de la infección.

En otra aproximación, se puede administrar una vacuna de la presente invención a un sujeto que actúa entonces como fuente de globulina, producida en respuesta a la exposición a la vacuna específica ("globulina hiperinmune"), que contiene anticuerpos dirigidos contra estafilococos. Un sujeto así tratado donaría plasma del que se obtendría globulina hiperinmune, utilizando una metodología convencional de fraccionamiento-plasma y se administraría a otro sujeto para proporcionarle resistencia contra o tratar la infección por estafilococos. Las globulinas hiperinmunes según la invención resultan particularmente útiles para individuos inmunodeprimidos, para individuos sometidos a procedimientos invasivos o cuando el tiempo disponible no permite al individuo producir sus propios anticuerpos en respuesta a la vacunación.

De forma similar, se pueden conjugar con una inmunotoxina anticuerpos anti-estafilococos monoclonales o policlonales según la presente invención y administrarlos a un sujeto en el que la infección por estafilococos ya se ha producido pero que no se ha extendido todavía mucho. Para ello, se administrará el material de anticuerpo producido según la presente invención en un portador farmacéuticamente aceptable, según se define en el presente documento.

La presente invención se describe a continuación más ampliamente con referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos.

Ejemplo 1 Fermentación de estafilococos

Se fermentó ATCC 202176, una cepa de S. epidermidis que lleva el antígeno, en un fermentador de 50 litros en Caldo de Columbia, suplementado con 4% NaCl. La fermentación se inició con un litro de cultivo de semilla de 16 horas. Se fermentaron las células durante 24 horas con baja aireación (1 v.v.m.) y agitando suavemente (200 rpm) a 37ºC. Tras la fermentación, se inactivaron las células con 2% de concentración final de fenol a etanol (1:1) y luego se centrifugó para separar las células del sobrenadante.

Las células que se iban a utilizar como vacuna para preparar antisuero de célula completa se fijaron en formalina 3% durante la noche a temperatura ambiente. Se desactivaron células para la purificación de antígeno añadiendo fenol-etanol (1:1, vol/vol) al fermentador hasta una concentración final de 2% y mezclando lentamente durante 2 horas a 15-20ºC. Se detectaron las células no viables después de este tratamiento. Se cosecharon entonces las células por centrifugación a 14.500 x g y se almacenaron a -70ºC hasta su utilización.

Ejemplo 2 Preparación de antisuero de célula completa

Se ajustaron células fijadas por formalina del ejemplo 1 a OD_{540 \ nm} = 1 y se inyectaron por vía intravenosa a unos conejos. No se utilizó ningún adyuvante. Se sangraron los conejos semanalmente y se recogió y agrupó el suero de célula completa positivo. Se purificó IgG a partir del suero de célula completa mediante una columna de afinidad proteína G.

Ejemplo 3 Purificación de antígeno

Se extrajo antígeno de la pasta celular. Se trató durante 4 horas a 37ºC una suspensión de la pasta celular (0,5 g/ml) con pronasa (1 mg/g de célula) y luego con lisostafina (175 U/g de célula), DNase y RNase (0,1 mg/g de cada) y luego se almacenó durante la noche a 4ºC. Se hizo la suspensión 10% en ácido tricloroacético (TCA) y se incubó durante 4 horas a 60ºC. Tras la centrifugación, el sobrenadante se neutralizó con 1 M NaOH hasta un pH de 7,0 seguido de precipitación secuencial con 25-75% etanol frío en presencia de 10 mM CaCl_{2}. Se precipitaron ácidos nucléicos y proteínas de alto peso molecular del sobrenadante neutralizo ajustándolo a 25% de etanol e incubando a 4ºC durante 4 horas. Después de la centrifugación, se ajustó el sobrenadante a 75% de etanol y se incubó a 4ºC durante 4-12 horas para precipitar el material que contenía antígeno.

El precipitado que contenía el antígeno crudo se disolvió en agua y se eliminó por diálisis en etanol residual. El material dializado se ajustó a 0,01 M Tris-HCl pH 7,0, 0,3 M NaCl y se eliminó el ácido teicoide residual por cromatografía de cambio de aniones en una columna Q-Sepharose en modo de paso con 0,01 Tris-HCl pH 7,0, 0,3 M NaCl. Se testaron fracciones por precipitación capilar con anticuerpos específicos del antígeno para determinar las fracciones que contenían antígeno. Las fracciones que contenían antígeno se dializaron contra agua (3 x 5L), se liofilizaron y trataron con lisozima (0,5 mg/g pasta celular) durante 3 horas a 37ºC para digerir el péptido glucano residual. La fracción que contenía antígeno crudo, tratado con enzima se volvió a suspender en 0,01 M en Tris-HCl pH 7,0 y se recromatografió en una columna Q-Sepharose en gradiente lineal 0,1-0,25 M NaCl. Las fracciones positivas de antígeno y negativas de fósforo, determinadas mediante el ensayo colorimétrico y precipitación capilar con antisuero monoespecífico del ejemplo 2, respectivamente se agruparon, se dializaron contra agua y se liofilizaron. La mayoría de los antígenos eluyeron a 0,2 M NaCl. El antígeno crudo se siguió purificando en una columna CL6B Sepharose para obtener antígeno prácticamente puro. Se agruparon las fracciones que contenían antígeno, se dializaron contra agua y se secaron por congelación.

Ejemplo 4 Caracterización de antígeno

El análisis de antígeno purificado por GLC-MS mostró la presencia de GlcNAc como componente glucosilo principal. Esto se confirmó mediante espectroscopia 1H-NMR y 13C-NMR del antígeno, lo cual indicó una señal anomérica a \delta 4,88 y \delta 100,48 ppm, respectivamente. La presencia de una sola señal anomérica connota la presencia de monosacárido como componente principal. No se encontraron señales correspondientes a grupos O-acetilo.

Un pequeño valor de JH1,H2 (<1,0 Hz) indicó una configuración \alpha para el carbohidrato, que fue confirmada por una medida de c=173 Hz para la constante de acoplamiento JC,H. Las señales en \alpha 24,860 ppm (NAc-CH_{3}) y \alpha 176,814 ppm (NAc-CO) en 13C NMR indicaron que la glucosamida estaba N-acetilada, constituyendo la porción carbohidrato del antígeno 2-acetamido-2-deoxi-\alpha-D-glucopiranosida. Otras señales de espectro C13-NMR aparecen en 6 75,122, 73,953, 73,865, 73,807, 72,939, 69,847, 69,638, 69,585, 63,515 y 56,321 respectivamen-
te.

El análisis de aminoácidos del antígeno mostró la presencia de serina, alanina, ácido aspártico/asparagina, valina y treonina en proporciones molares de aproximadamente 39:25:16:10:7. Los aminoácidos constituían aproximadamente el 32% en peso de la molécula de antígeno.

La movilidad del antígeno purificado tras la inmunoelectrofóresis (IEF) indicó la presencia de grupos cargados negativamente. El antígeno purificado no contenía azucares neutros como se detectó en el ensayo fenol sulfúri-
co.

Ejemplo 5 Preparación de conjugados de inmunoportador de antígeno

Se despolimerizó parcialmente antígeno purificado por hidrólisis en 50 mM ácido acético a 100ºC durante 30 minutos, o a 80ºC durante 90 minutos. La mezcla de reacción se liofilizó y se eliminó el ácido acético por liofilización.

Se disolvió un antígeno parcialmente hidrolizado en 0,5 M ADH hasta su concentración final de 5 mg/mL y el pH se ajustó a 5,6 con 0,1 M HCl. Se obtuvo una solución de antígeno 100 mM EDAC añadiendo EDAC (como polvo) y se mantuvo el pH a 5,6 con 0,1 M HCl durante 1 hora. La mezcla de reacción se dializó entonces contra 0,2 M NaCl (1X), luego se desaló sobre una columna Sephadex G25 (2,6 x 30 cm) y se liofilizó. La cantidad de ADH incorporada al antígeno se determinó colorimétricamente mediante un ensayo de ácido trinitrobenceno sulfónico (TNBS) usando ADH como standard.

Se disolvió antígeno derivado de ADH (10 mg) en 1795 \muL de 0,1 M MES tampón pH 5,6 y se añadió 205 \muL de solución rEPA (48 mg/mL) que representa 10 mg de rEPA. La mezcla de reacción pasó a ser de 100 mM EDAC añadiendo EDAC (en polvo) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se detuvo la reacción llevando el pH a 7,0 con sal sádica MES 1 M (pH 9,21). Se obtuvo conjugado puro por cromatografía de exclusión de tamaño en columna Sephacryl S-300 eluido con PBS. La cantidad de antígeno y proteína en el conjugado se determinó por ensayo competitivo ELISA y Coomasie Blue (Pierce) utilizando el antígeno correspondiente o BSA como standard. Se utilizó el procedimiento similar para preparar conjugado antígeno-Dtd.

Ejemplo 6 Preparación de antisueros de conjugados de antígeno-inmunoportador

Se inmunizaron conejos blancos hembras de Nueva Zelanda mediante inyección subcutánea con 50 \mug de conjugado inmunoportador-antígeno preparado según el ejemplo 5 los días 0, 14 y 28. La primera inyección se dio con un volumen igual de adyuvante completo de Freund (CFA) y se dieron unas inyecciones ulteriores con adyuvante incompleto de Freund (IFA). Las muestras de prueba tomadas de los conejos se analizaron para comprobar la presencia de precipitación de anticuerpos de conejo específicos del antígeno con el que fueron inmunizados. Se realizaron más inyecciones, en la medida de lo necesario, para reforzar el valor.

Se sangraron conejos para obtener antisueros de conejo de alto valor que contenía anticuerpos específicos del antígeno con el que fueron inmunizados. Los anticuerpos pudieron mediar en la desactivación de células que llevaban el antígeno mediante HL 60 en presencia de complemento. Los conejos inmunizados con conjugados de rEPA-antígeno o Dtd-antígeno también podían producir anticuerpos específicos del antígeno. Estos anticuerpos dieron precipitados con el antígeno en capilares.

Se vio que los sueros conjugados purificados IgG contenían 16,0 mg/ml de IgG total en ELISA y 1,54 mg/ml IgG específico-antígeno con ELISA. Se utilizó IgG conjugado en ensayos de opsonofagocitosis para evaluar la aptitud de los anticuerpos específicos para mediar en la opsonofagocitosis de bacterias estafilococos correspondientes mediante células HL-60 en ensayos in vitro y en modelos animales para evaluar la eficacia in vivo.

Ejemplo 7 Ensayos de opsonofagocitosis in vitro

Se transfirieron bacterias de ATCC 202176, una cepa de estafilococo que lleva el antígeno, desde perlas a una nueva placa agar soja tripsínica. Se incubó la placa durante 18-20 horas a 37ºC en 5% CO_{2}. Las bacterias se rasparon de la placa y se utilizaron para la inoculación de 200 mL de Caldo Columbia suplementado con 4% NaCl. Se incubaron las bacterias durante 18-20 horas a 27ºC, luego se centrifugaron a 200 rpm durante 10 minutos a 25-35ºC y se quitó el sobrenadante. La bacteria granulada se volvió a suspender en dos mililitros de salino estéril y se preparó para utilizar una suspensión de bacterias de una densidad óptica de 0,1 a 650 nm.

Se utilizó como material de trabajo de solución bacteriana una muestra diluida 1:200 preparada a partir de la suspensión bacteriana antes descrita en medio MEM suplementado con 0,1% de gelatina. Esta preparación bacteriana se probó con los antisueros correspondientes para aglutinación en placa positiva. El material de trabajo bacteriano se cargó en pocillos de placa de microvaloración con la dilución adecuada de medio MEM.

Se obtuvieron PMNs de células HL-60 ajustados a una concentración de 1,0 x 10^{6} células por ml en MEM suplementado con 0,1% de gelatina. Las células PMN se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos a 30-35ºC. Las células granuladas se volvieron a suspender en 5 ml de medio MEM suplementado con 0,1% de gelatina y se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos. Las células granuladas se volvieron a suspender en 1 ml de medio MEM suplementado con 0,1% gelatina para obtener concentración de trabajo de 1 x 10^{6}/ml.

Se diluyó hasta 1:80 en medio MEM suplementado con 0,1% gelatina un complemento humano preparado a partir de suero humano. La mezcla de reacción en los pocillos de la placa de microvaloración contenía 50 \mul de bacterias [10^{6} célula/ml], 50 \mul de suero diluido, 50 \mul de PMN [10 x 10^{6} células/ml] y 50 \mul de complemento [1:80], lo cual daba un volumen total de 200 \mul. En el momento cero, se diluyó en serie 1:5, 1:10, y 1:50 una muestra de 10 \mul de la placa de reacción. Se preparó en placas Petri una muestra de 10 \mul de cada disolución sobre una placa de agar soja tripsínica (TSA). Las placas TSA se incubaron durante la noche a 37ºC, 5% CO_{2}. Tras la dilución de la hora cero, la placa de reacción se incubó a 37ºC durante 90 minutos. Las muestras se volvieron a mezclar. Se diluyó en serie 1:5, 1:10 y 1:50 una muestra de 10 \mul de la placa de reacción. Se preparó en placas de Petri una muestra de 10 \mul de cada dilución sobre placas TSA que se incubaron luego durante la noche a 37ºC, 5% CO_{2}.

Las colonias bacterianas se recontaron para cada dilución/muestra/placa y se calculó el porcentaje de desactivación de bacterias mediante la fórmula:

% \ desactivación \ = \frac{n^{o} \ de \ colonias \ a \ T_{0} - n^{o} \ de \ colonias \ a \ T_{90} \ x \ 100}{número \ de \ colonias \ a \ T_{0}}

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Los dos antisueros de célula completa de conejos inmunizados con ATCC 202176 y anticuerpos de conejos producidos por conjugados antígeno-Dtd intervinieron en la opsonofagocitosis de estafilococo por HL-60 en presencia de complemento humano. La actividad opsónica tanto del antisuero de célula completa como de los anticuerpos de conejo de conjugado anti-antígeno-rEPA fue absorbida completamente por el antígeno.

Ejemplo 8 Protección in vivo de ratones contra la exposición letal a estafilococo por vacunación con conjugado antígeno-rEPA

Se dividieron en tres grupos un total de 24 ratones, con 8 ratones en cada grupo. Los ratones en el primer grupo se inmunizaron con una inyección intraperitoneal de 2,5 \mug de conjugado antígeno-rEPA purificado producido según el ejemplo 5 e IFA. Los ratones en el segundo grupo se inyectaron con PBS más IFA, mientras que los ratones del tercer grupo se inyectaron con PBS. Los ratones se revacunaron dos veces a dos semanas de intervalo con la misma vacuna o dosis de control.

Una semana después de la tercera inyección (segundo refuerzo), se expusieron los ratones a 1,15 x 10^{8} cfu de cepa #V01048, una cepa productora de limo de S. epidermidis que lleva el antígeno en 5% hog mucin. Se controló la morbidez y mortalidad de los ratones expuestos. Los resultados mostraron que el 75% (2/8) de los ratones del primer grupo sobrevivieron a la exposición letal y estaban todavía vivos y 216 después de la exposición mientras que todos los ratones de los grupos segundo y tercero murieron a los 41 días de la exposición.

Ejemplo 9 Protección in vivo de ratones contra la exposición letal a estafilococo con anticuerpo monoclonal antígeno-específico

Se evaluó el efecto profiláctico de anticuerpo monoclonal antígeno-específico en el mismo modelo de ratón utilizando cepa S. epidermidis productora de limo #977 que lleva el antígeno para la exposición. Se inmunizaron subcutáneamente grupos de ratones con 0,5 mg ó 1,0 mg de anticuerpo monoclonal antígeno-específico de S. epidermidis, 1 mg de anticuerpo monoclonal E. Coli-específico, o 1 mg de anticuerpo monoclonal específico de limo de S. epidermidis, respectivamente. Veinticuatro horas después de la inmunización, los ratones se expusieron intraperitonealmente a 1 x 10^{8} CFU de bacterias en 6% hog mucin y se controló la morbidez y mortalidad de los ratones. Los resultados mostraron protección en función de la dosis por anticuerpo monoclonal específico de antígeno según la invención. Ningún anticuerpo específico del limo ni específico de E. coli ofreció protección contra la exposición.

Ejemplo 10 Protección in vivo de ratones contra bacteriemia por vacunación con conjugado antígeno-Dtd

Se dividió un total de 80 ratones en dos grupos, con 40 ratones en cada grupo. Los ratones del primer grupo se inmunizaron con una inyección subcutánea de 2,5 \mug de conjugado antígeno-Dtd purificado según el ejemplo 5 e IFA. Los ratones del segundo grupo se inyectaron con conjugado MEP (un conjugado de exopolisacárido mucoide de Pseudomonas aeruginosa y Dtd) más IFA. Se revacunaron dos veces los ratones a dos semanas de intervalo, con la misma vacuna o dosis de control.

\newpage

Una semana después de la tercera inyección se expusieron intraperitonealmente los ratones a una dosis sub-letal (5,0 x 10^{7} cfu) de capa #V01048, una cepa productora de limo de S. epidermidis que lleva el antígeno en 5% hog mucin. Los ratones expuestos se exsanguinaron y se comprobó si había cultivos bacterianos positivos a las 6 horas, 24 horas, 30 horas y 48 horas (diez ratones en cada uno de estos periodos). Los resultados mostraron que la inmunización con conjugado antígeno-rEPA reducía notablemente la bacteriemia en los ratones expuestos, facilitando la depuración de bacterias de la sangre. El grupo de control inmunizado con el conjugado MEP no quedó protegido contra bacteriemia.

Ejemplo 11 Aptitud del antígeno para bloquear la adherencia de bacteria estafilococo a catéteres intravenosos in vivo

Se evaluó en un ensayo de adherencia in vitro la aptitud del antígeno para propiciar la adherencia de la cepa #977 de S. epidermidis productora de limo que lleva el antígeno y la cepa de S. haemolyticus 4162 que lleva el antígeno (determinado por doble inmunodifusión de extracto bacteriano crudo) a catéteres intravenosos. Se cultivaron las bacterias durante la noche a 37ºC en una placa agar Columbia suplementada con cloruro sódico 4%. A la mañana siguiente se inoculó una colonia aislada de esta placa en 5 ml de Caldo Columbia suplementado con cloruro sódico 4%. Este cultivo se dejó en cultivo durante 4 horas agitando a 37ºC y luego se ajustó a un OD de 0,12 a 650 nM.

Se incubó un solo catéter 1¼'' IV Insyte [Material de Radiopaque Vialon®, Becton Dickinson Vascular Access, Sandy, Utah] a 37ºC durante 30 minutos en un volumen de 1 ml de una solución de antígeno 0,5 mg/ml en PBS. Los catéteres se lavaron entonces con cuidado con PBS frío, se sumergieron en 1 ml de suspensión bacteriana y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC sin agitar. Los catéteres se lavaron entonces con cuidado nuevamente con una solución PBS fría y se cortaron en tres trozos iguales. Los catéteres cortados se sumergieron en 500 \mul de PBS y se expusieron a ultrasonidos durante 1 minuto sobre hielo para desprender mediante ultrasonidos las células bacterianas fijadas en el catéter. Esta suspensión se diluyó a 1:10, 1:100 y 1:1000 en PBS y se preparó sobre placas TSA y se incubó durante 18-20 horas a 37ºC. Se recontaron las colonias bacterianas y se determinaron las diferencias en cuanto a recuperación bacteriana de diferentes catéteres revestidos con antígeno.

Los resultados mostraron que la preincubación de los catéteres intravenosos con antígeno aislado de S. epidermidis 202176 reducía en 97,5% la adherencia de la cepa #977 de S. epidermidis productora de limo que lleva el antígeno y redujo en 92% la adherencia de S. haemolyticus. Se detectó el antígeno idéntico al antígeno purificado de S. epidermidis 202176 en extractos de pared celular cruda de S. haemolyticus y S. hominis, lo cual sugiere que el antígeno de S. epidermidis es responsable de la adherencia de estafilococos coagulasa-negativos a catéteres intravenosos.

Ejemplo 12 Aptitud de fragmentos Fab de anticuerpos antígeno-específicos para bloquear la adherencia de bacterias de estafilococo a catéteres intravenosos in vitro

Se evaluó en un ensayo de adherencia in vitro la aptitud de los fragmentos Fab preparados a partir de anticuerpos antígeno-específicos para bloquear la adherencia de la cepa RP62A de S. epidermidis productora de limo, una cepa que lleva el antígeno, al catéter intravenoso preincubado en plasma humano. Se cultivaron las bacterias durante la noche a 37ºC en una placa agar Columbia suplementada con cloruro sódico 4%. A la mañana siguiente, se inoculó una colonia aislada de esta placa en 5 ml de Caldo Columbia suplementado con cloruro sódico 4%. Este cultivo se dejó en cultivo durante 4 horas agitando a 37ºC y luego se ajustó a un OD de 0,12 a 650 nm. Se centrífugo la suspensión bacteriana (1 ml) a 300 rpm y el gránulo se volvió a suspender en 1 ml de solución Fab (1 mg/mi) y se incubó durante 30 minutos a 37ºC.

Se incubó un solo catéter 1¼'' IV Insyte [Material de Radiopaque Vialon®, Becton Dickinson Vascular Access, Sandy, Utah] a 37ºC durante 30 minutos en un volumen de 1 ml de una solución de antígeno 0,5 mg/ml en PBS. Los catéteres se lavaron entonces con cuidado con PBS frío, se sumergieron en 1 ml de suspensión bacteriana y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC sin agitar. Los catéteres se lavaron entonces con cuidado nuevamente con una solución PBS fría y se cortaron en tres trozos iguales. Los catéteres cortados se sumergieron en 500 \mul de PBS y se expusieron a ultrasonidos durante 1 minuto sobre hielo para desprender mediante ultrasonidos las células bacterianas fijadas en el catéter. Esta suspensión se diluyó a 1:10, 1:100 y 1:1000 en PBS y se preparó sobre placas TSA y se incubó durante 18-20 horas a 37ºC. Se recontaron las colonias bacterianas y se determinaron las diferencias en cuanto a recuperación bacteriana de diferentes catéteres revestidos con antígeno.

Los resultados mostraron que la adherencia de la cepa RP62A de S. epidermidis productora de limo que lleva el antígeno no se veía afectada por el tratamiento previo de catéteres con fragmentos Fab preparados a partir de anticuerpos de conejo normales. El tratamiento previo de las mismas bacterias con fragmentos Fab preparados a partir de anticuerpos de conejo antígeno-específicos inhibió de modo eficaz la adherencia de las bacterias a los catéteres intravenosos. Estos datos y los datos del ejemplo 11 sugieren que el antígeno desempeña un papel importante en la adherencia de estafilococos coagulasa-negativos a biomateriales. La inhibición de la adherencia mediante antígenos y anticuerpos antígeno-específicos puede jugar un papel importante en la prevención de infecciones relacionadas con cuerpos extraños causadas por estafilococos coagulasa-negativos.

Claims (29)

1. Antígeno de estafilococo aislado que comprende (a) aminoácidos y hexosamina N-acetilada en una configuración \alpha, (b) no contiene ningún grupo O-acetilo detectable por espectroscopia de resonancia magnética nuclear y (3) enlaza específicamente con anticuerpos de una cepa de estafilococos depositada con el número ATCC 202176.

2. Antígeno según la reivindicación 1, donde la mencionada hexosamina N-acetilada es 2-acetamido-2-deoxi-\alpha-D-glucopiranosida.

3. Antígeno según la reivindicación 2, en el que los mencionados aminoácidos comprenden serina, alanina, ácido aspártico/asparagina, valina y treonina.

4. Antígeno según la reivindicación 3, en el que la mencionada serina, alanina, ácido aspártico/asparagina, valina y treonina se encuentran en relación molar 39:25:16:10:7.

5. Conjugado portador de antígeno que comprende un antígeno según la reivindicación 1 ligado a un inmunoportador.

6. Conjugado portador de antígeno según la reivindicación 5, en el que el mencionado inmunoportador es una cepa mutante no tóxica, producida de forma recombinante, de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa.

7. Composición que comprende un antígeno según la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable y estéril para el mismo.

8. Composición que comprende un conjugado inmunoportador de antígeno según la reivindicación 5, y un vehículo farmacéuticamente aceptable y estéril para el mismo.

9. Composición según la reivindicación 5, en la que el citado inmunoportador es un mutante no toxico producido de forma recombinante, de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa.

10. Composición según la reivindicación 9, que se utiliza en un método de inmunoterapia que comprende una etapa de administración a un individuo de una cantidad inmunoestimulante de la citada composición.

11. Método de preparación de un agente inmunoterapéutico contra infección por estafilococo, que comprende la cosecha de una globulina hiperinmune que contiene anticuerpos dirigidos contra estafilococo de plasma recogido de individuos inmunizados con una composición según la reivindicación 9.

12. Globulina hiperinmune que contiene anticuerpos dirigidos contra un antígeno como el de la reivindicación 1.

13. Anticuerpo monoclonal dirigido contra un antígeno según la reivindicación 1.

14. Globulina hiperinmune según la reivindicación 12, que se utiliza en un método de inmunoterapia que comprende una etapa de administración de dicha globulina a un individuo.

15. Vacuna que comprende células de estafilococo que llevan un antígeno que enlaza específicamente con anticuerpos de una cepa de estafilococos depositada con el número ATCC 202176 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Composición según la reivindicación 15, que se utiliza en un método de inmunoterapia que comprende la administración a un individuo de una cantidad inmunoestimulante de la citada composición.

17. Método de preparación de un agente inmunoterapéutico contra la infección por estafilococo, que comprende:

la cosecha de anticuerpos dirigidos contra estafilococos de plasma recogido de individuos inmunizados con una composición según la reivindicación 15.

18. Agente inmunoterapéutico contra infección por estafilococos que comprende anticuerpos preparados con el método de la reivindicación 15 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Ensayo diagnóstico para detectar la presencia de un anticuerpo anti-estafilococo en una muestra, que comprende:

la mezcla de un antígeno de estafilococo según la reivindicación, con una muestra sospechosa de contener anticuerpo específico de estafilococo; y

el control y seguimiento de dicha mezcla para observar el enlace entre dicho antígeno y el anticuerpo específico de estafilococo en la citada muestra.

20. Ensayo diagnóstico según la reivindicación 19, en el que el mencionado antígeno se inmoviliza sobre una matriz sólida.

21. Kit para detectar la presencia de un anticuerpo anti-estafilococo en una muestra, que comprende:

un antígeno de estafilococo según la reivindicación 1.

22. Kit según la reivindicación 21, en el que dicho antígeno se inmoviliza sobre una matriz sólida.

23. Ensayo diagnóstico para detectar la presencia de un antígeno anti-estafilococo en una muestra que comprende:

la mezcla de un anticuerpo monoclonal de un antígeno de estafilococo según la reivindicación 1, con una muestra sospechosa de contener antígeno de estafilococo; y

el control y seguimiento de dicha mezcla para comprobar el enlace entre dicho antígeno y el mencionado anticuerpo monoclonal de estafilococo.

24. Ensayo diagnóstico según la reivindicación 23, en el que el citado anticuerpo se inmoviliza sobre una matriz sólida.

25. Kit para detectar la presencia de un anticuerpo anti-estafilococo en una muestra que comprende:

un anticuerpo monoclonal de un antígeno de estafilococo según la reivindicación 1.

26. Kit según la reivindicación 25, en el que dicho anticuerpo monoclonal se inmoviliza sobre una matriz sólida.

27. Método para evitar la adherencia de bacterias de estafilococo a un catéter, que comprende el tratamiento de dicho catéter con antígeno según la reivindicación 1.

28. Catéter revestido con un antígeno según la reivindicación 1.

29. Vacuna según la reivindicación 15, que se utiliza en un método de inmunoterapia que comprende una etapa de administración a un individuo de una cantidad inmunoestimulante de la citada composición.