ES2261420T3 - Metodo para tratar y prevenir enfermedades infecciosas. - Google Patents

Metodo para tratar y prevenir enfermedades infecciosas.

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ES2261420T3 ES01940894T ES01940894T ES2261420T3 ES 2261420 T3 ES2261420 T3 ES 2261420T3 ES 01940894 T ES01940894 T ES 01940894T ES 01940894 T ES01940894 T ES 01940894T ES 2261420 T3 ES2261420 T3 ES 2261420T3
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Abstract

Método para reducir los niveles de un microorganismo infeccioso que contiene lípidos en un fluido acuoso que comprende: poner en contacto el fluido acuoso que contiene el microorganismo infeccioso que contiene lípidos con un primer disolvente orgánico, seleccionado del grupo de alcohol que tiene = 5 átomos de C, éter, amina, hidrocarburos o combinación de los mismos o una combinación de un alcohol que tiene de 1 a 8 átomos de C con éter, amina, hidrocarburos o una combinación de los mismos en una razón en la que el primer disolvente está presente en una cantidad eficaz para solubilizar sustancialmente el lípido en el microorganismo infeccioso; mezclar el fluido acuoso con dicho primer disolvente; permitir que se separen las fases orgánica y acuosa; y recoger la fase acuosa que contiene el microorganismo infeccioso con un contenido en lípidos reducido.

Description

Método para tratar y prevenir enfermedades infecciosas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para reducir la aparición y gravedad de enfermedades infecciosas, especialmente enfermedades infecciosas en las que se encuentran microorganismos infecciosos en fluidos biológicos, tales como la sangre. El método de la presente invención emplea un sistema para tratar microorganismos infecciosos que contienen lípidos. La presente invención emplea un sistema de disolventes útil para extraer lípidos del microorganismo infeccioso, reduciendo así la infectividad del microorganismo infeccioso. La presente invención también reduce la propagación de la enfermedad infecciosa proporcionando una composición que comprende una vacuna, que comprende un microorganismo infeccioso, tratado con el método de la presente invención para reducir el contenido en lípidos del microorganismo infeccioso, combinado con un excipiente farmacéuticamente aceptable, y administrado a un animal o un ser humano.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades infecciosas son una principal causa de sufrimiento y muerte en todo el mundo. Las enfermedades infecciosas de etiología variada afectan a miles de millones de animales y seres humanos cada año y ocasionan una enorme carga económica a la sociedad. Muchos microorganismos infecciosos contienen lípidos como principal componente de la membrana que los rodea. Los microorganismos que producen enfermedades infecciosas y contienen lípidos en su envoltura o pared celular incluyen, pero no se limitan a, bacterias, virus, protozoos, mohos y hongos. Numerosas bacterias y virus que afectan a animales y seres humanos provocan un sufrimiento extremo, y morbimortalidad. Muchas bacterias y virus viajan por todo el cuerpo en fluidos biológicos, tales como la sangre. Éstos y otros microorganismos infecciosos pueden encontrarse en otros fluidos biológicos tales como líquido peritoneal, líquido linfático, líquido pleural, líquido pericárdico, líquido cefalorraquídeo y en diversos fluidos del sistema reproductor. La enfermedad puede estar provocada en cualquier zona bañada por estos fluidos. Otras bacterias y virus residen principalmente en diferentes sistemas de órganos y en tejidos específicos, proliferan, y entonces entran en el sistema circulatorio para conseguir acceso a otros tejidos y órganos en zonas alejadas.
Los microorganismos infecciosos, tales como virus, afectan a miles de millones de personas anualmente. Epidemias recientes incluyen la enfermedad conocida como síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), que se cree que está provocado por el virus de inmunodeficiencia humano (VIH). Virus relacionados afectan a otros animales tales como primates y gatos. Este virus se propaga rápidamente en todo el mundo y es prevalerte en diversas subpoblaciones de individuos, incluyendo individuos que reciben transfusiones de sangre, individuos que usan agujas contaminadas, e individuos que tienen contacto con fluidos biológicos infectados. Esta enfermedad también está muy extendida en ciertos países y afecta a más de un tercio de la población. No existe ninguna cura conocida. Lo que se necesita es un método simple, fiable y económico para reducir la infectividad del virus VIH de modo que disminuya la transmisión. Lo que también se necesita es un método para tratar los fluidos biológicos de individuos infectados con el fin de disminuir la transmisión del virus a otras personas en contacto con esos fluidos biológicos. Lo que también se necesita es un método para tratar la sangre que se encuentra en bancos de sangre con el fin de disminuir la transmisión del virus a través de individuos que reciben transfusiones. Adicionalmente, lo que se necesita para el VIH así como para otros virus es un mecanismo para disminuir la carga viral de un ser humano o un animal tratando el plasma de ese individuo y devolviendo el plasma tratado al individuo de tal manera que la carga viral en el plasma está disminuida.
Otras infecciones virales principales que afectan a animales y seres humanos incluyen, pero no se limitan a, meningitis, citomegalovirus, y hepatitis en sus diversas formas. Aunque algunas formas de hepatitis pueden tratarse con fármacos, otras formas no se tratan satisfactoriamente y resultan letales. En la actualidad, la mayoría de las terapias antivirales se dirigen a la prevención o inhibición de la replicación viral y parecen centrarse en la unión inicial del virus al macrófago o linfocito T4, la trascripción de ARN viral en ADN viral y el ensamblaje de nuevos virus durante la reproducción. Sin embargo, una dificultad principal con los tratamientos existentes, especialmente con respecto al VIH, es la elevada tasa de mutación del virus. Muchas cepas diferentes de VIH son resistentes o se vuelven resistentes a la terapia con fármacos antivirales. Además, durante el tratamiento con terapia antiviral, pueden desarrollarse cepas resistentes del virus. Finalmente, muchas terapias comunes para la infección por VIH implican numerosos efectos secundarios no deseados y requieren el cumplimiento por parte del paciente con una ingestión de numerosas pastillas todos los días o varias veces al día. Desafortunadamente, muchos individuos están afectados por múltiples infecciones provocadas por más de un microorganismo infeccioso, tales como VIH y hepatitis. Tales individuos requieren farmacoterapias incluso más agresivas y caras para contrarrestar la progresión de la enfermedad. Tales regímenes pueden provocar numerosos efectos secundarios así como multirresistencia.
Los métodos de la técnica anterior de virus inactivados usando agentes químicos se basan en disolventes orgánicos tales como cloroformo. Sin embargo, el cloroformo desnaturaliza muchas proteínas plasmáticas y es inadecuado par su uso con fluidos que se administrarán posteriormente de nuevo al animal o ser humano. Muchas de las proteínas plasmáticas que resultan afectadas perjudicialmente por el cloroformo sirven para importantes funciones biológicas tales como la coagulación, respuestas hormonales y respuestas inmunitarias. Muchas de estas funciones son esenciales para la vida, y por tanto dañar a las proteínas relacionadas con esas funciones puede tener un efecto adverso sobre la salud de un paciente, conduciendo posiblemente a la muerte. Se han usado otros disolventes tales como B-propiolactona, detergentes tales como TWEEN-80, y fosfatos de di o trialquilo, solos o en combinación. Muchos de estos métodos, especialmente los que implican detergentes, requieren procedimientos tediosos para garantizar la eliminación del detergente antes de la reintroducción de la muestra de plasma tratado en el animal o el ser humano. Además, muchos de los métodos descritos en la técnica anterior implican una exposición extensa a temperatura elevada con el fin de destruir células infectadas y virus libres. Numerosas proteínas contenidas en fluidos biológicos tales como plasma resultan perjudicialmente afectadas por las temperaturas elevadas.
Uno de tales métodos se describe en el documento EP 0 222 974 A. El documento EP 0 222 974 A se refiere a un procedimiento para la producción de una vacuna frente a la rabia, en el que la inactivación del virus se realiza usando una beta-propiolactona (BPL) o fosfato de tri-(n-butilo). El método global comprende obtener el virus de la rabia a partir de tejido disgregado adecuado y extraer la suspensión de virus bruta con un disolvente orgánico inmiscible en agua para su purificación para eliminar lípidos extraños, en particular, mielina. Tras la purificación y enriquecimiento, se inactivan los virus intactos por medio de beta-propiolactona o fosfato de tri-(n-butilo). En consecuencia, lo que se necesita es un método que sea simple, eficaz, que no requiera el uso de temperaturas elevadas, y que no desnaturalice apreciablemente las proteínas plasmáticas ni extractos de las mismas de la muestra biológica que está tratándose.
La prevención de las enfermedades y mejora de la gravedad de las enfermedades provocadas por microorganismos infecciosos es un objetivo principal de la medicina moderna. Los programas de vacunación han reducido la aparición y gravedad de muchas enfermedades aunque numerosas enfermedades provocadas por microorganismos infecciosos siguen sin tener vacunas eficaces. En consecuencia, lo que se necesita son nuevas composiciones de vacunas para proporcionar protección frente a microorganismos infecciosos.
Sumario de la invención
La presente invención resuelve los problemas descritos anteriormente proporcionando un método simple, eficaz y eficiente para tratar fluidos acuosos que contienen microorganismos infecciosos que contienen lípidos. El método de la presente invención es eficaz en reducir la concentración de un microorganismo infeccioso que contiene lípidos en un fluido biológico. La presente invención también es eficaz en producir una vacuna frente al microorganismo infeccioso que contiene lípidos tratando un fluido biológico que contiene el microorganismo infeccioso de tal manera que el microorganismo todavía está presente pero ya no es infeccioso. Un microorganismo infeccioso que contiene lípidos, tratado de esta manera con el fin de reducir su infectividad, se administra a un receptor, tal como un animal o un ser humano, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un inmunoestimulante, con el fin de provocar una respuesta inmunitaria en el animal o ser humano frente a los antígenos del microorganismo infeccioso sin lípidos.
La presente invención contempla el tratamiento de microorganismos infecciosos que contienen un componente lipídico en su envoltura o pared celular. En consecuencia, numerosos virus y bacterias se incluyen dentro de los microorganismos infecciosos que pueden tratarse con el método de la presente invención. El método de la presente invención para el tratamiento de un fluido acuoso que contiene un microorganismo infeccioso que contiene lípidos comprende: obtener un fluido que contiene el microorganismo infeccioso; poner en contacto el fluido con un primer disolvente orgánico que puede solubilizar los lípidos en el microorganismo infeccioso; y separar una primera fase que contiene los lípidos del microorganismo infeccioso de una segunda fase en la que la segunda fase está sustancialmente libre de lípidos y contiene niveles reducidos del microorganismo infeccioso. Los fluidos tratados de esta manera pueden opcionalmente reintroducirse dentro del animal o ser humano.
Los fluidos que pueden tratarse con el método de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: plasma; suero; líquido linfático; líquido cefalorraquídeo; líquido peritoneal; líquido pleural; líquido pericárdico; diversos líquidos del sistema reproductor incluyendo, pero sin limitarse a, semen, líquidos de la eyaculación, líquido folicular y líquido amniótico; reactivos de cultivo celular tales como sueros normales, tales como suero bovino fetal o suero derivado de cualquier otro animal o ser humano; y reactivos inmunológicos tales como diversas preparaciones de anticuerpos y citocinas.
Microorganismos infecciosos tratados con la presente invención
Los microorganismos infecciosos que pueden tratarse con el método de la presente invención incluyen microorganismos infecciosos que contienen lípidos. Tales microorganismos infecciosos incluyen, pero no se limitan a, virus y bacterias, siempre que el virus o bacteria contenga lípidos en la envoltura viral o la pared celular bacteriana, respectivamente. Los métodos de la presente invención reducen la infectividad de microorganismos infecciosos y también proporcionan vacunas frente a estos microorganismos.
Los microorganismos infecciosos virales que pueden inactivarse mediante el sistema anterior incluyen, pero no se limitan a, los virus que contienen lípidos de los siguientes géneros: Alphavirus (alfavirus), Rubivurus (virus de la rubeola), Flavivirus (flavivirus), Pestivirus (virus de la enfermedad de la mucosa), (virus de la hepatitis C sin nombrar), Coronavirus (virus corona), Torovirus (torovirus), Arteivirus (arterivirus), Paramyxovirus (paramixovirus), Rubulavirus (rubulavirus), Morbillivirus (morbillivirus), Pneumovirinae (los pneumovirus), Pneumovirus (pneumovirus), Vesiculovirus (vesiculovirus), Lyssavirus (lyssavirus), Ephemerovirus (ephemerovirus), Cytorhabdovirus (rabdovirus vegetal del grupo A), Nucleorhabdovirus (rabdovirus vegetal del grupo B), Filovirus (filovirus), Influenzavirus A, B (virus influenza A y B), Influenza virus C (virus influenza C), (virus de tipo Thogoto, sin nombrar), Bunyavirus (bunyavirus), Phlebovirus (flebovirus), Nairovirus (nairovirus), Hantavirus (hantavirus), Tospovirus (tospovirus), Arenavirus (arenavirus), retrovirus de tipo B de mamífero sin nombrar, retrovirus de tipo C de mamífero y reptil sin nombrar, retrovirus de tipo D sin nombrar, Lentivirus (lentivirus), Spumavirus (espumavirus), Orthohepadnavirus (hepadnavirus de mamíferos), Avihepadnavirus (hepadnavirus de pájaros), Simplexvirus (virus simplex), Varicellovirus (varicellovirus), Betaherpesvirinae (los citomegalovirus), Cytomegalovirus (citomegalovirus), Muromegalovirus (citomegalovirus murino), Roseolovirus (virus 6 del herpes humano), Gammaherpesvirinae (los virus del herpes asociados a linfocitos), Lymphocryptovirus (virus de tipo Epstein-Barr), Rhadinovirus (virus del herpes de tipo saimiri-ateles), Orthopoxvirus (ortopoxvirus), Parapoxvirus (parapoxvirus), Avipoxvirus (virus de la viruela aviar), Capripoxvirus (virus de tipo viruela ovina), Leporipoxvirus (mixomavirus), Suipoxvirus (virus de la viruela porcina), Molluscipoxvirus (virus del molusco contagioso), Yatapoxvirus (yabapoxvirus y tanapoxvirus), virus de tipo fiebre porcina africana sin nombrar, Iridovirus (virus de insecto iridiscente pequeño), Ranavirus (iridovirus frontal), Lymphocystivirus (virus de la linfocistis del pescado) Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Enabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Retroviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, y cualquier otro virus que contiene lípidos.
Estos virus incluyen los siguientes patógenos de animales y seres humanos: virus de río Ross, virus de la fiebre, virus del dengue, virus de la encefalitis del valle Murray, virus de la encefalitis de las garrapatas (incluyendo virus de la encefalitis de las garrapatas europea y del extremo oriente), virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus corona humano 229-E y OC43 y otros (que provocan el resfriado común, infección de las vías respiratorias altas, probablemente neumonía y posiblemente gastroenteritis), virus de la parainfluenza humano 1 y 3, virus de la parotiditis infecciosa, virus de la parainfluenza humano 2, 4a y 4b, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial humano, virus de la rabia, virus de Marburg, virus del Ébola, virus influenza A y virus influenza B, arenavirus: virus de la coriomeningitis linfocítica (LCM); virus Lassa, virus de inmunodeficiencia humano 1 y 2, virus de la hepatitis B, Vaccinia, subfamilia: virus del herpes humano 1 y 2, virus del herpes B, virus Epstein-Barr), virus de la viruela, virus de la fiebre amarilla, virus de la viruela vacuna, poliovirus, virus Norwalk, virus del molusco contagioso, y cualquier otro virus que contiene lípidos.
Los virus preferidos para tratarse con el método de la presente invención incluyen los diversos virus de inmunodeficiencia incluyendo, pero sin limitarse al, humano (VIH), de simio (VIS), felino (VIF), así como cualquier otro tipo de virus de inmunodeficiencia. Otros virus preferidos para tratarse con el método de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, la hepatitis en sus diversas formas, especialmente hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C. Otros virus preferidos para tratarse con el método de la presente invención implican el virus de la diarrea bovina. Debe entenderse que la presente invención no se limita a los virus facilitados en la lista anterior. Todos los virus que contienen lípidos, especialmente en su envoltura viral, están incluidos dentro del alcance de la presente invención.
Las bacterias constituyen otra clase preferida de microorganismos infecciosos que pueden tratarse con el método de la presente invención siempre que la bacteria contenga lípidos, preferiblemente en su pared celular bacteriana. Bacterias preferidas para tratarse con el método de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: estafilococos; estreptococos, incluyendo S. pyogenes; enterococos; bacilos, incluyendo Bacillus anthracis, y lactobacilos; listeria; Corynebacterium diphtheriae; gardnerella incluyendo G. vaginalis; nocardia; estreptomices; Thermoactinomyces vulgaris; treponema; campylobacter; pseudomonas incluyendo P. aeruginosa; Legionella; Neisseria incluyendo N. gonorrhoeae y N. meningitides; flavobacteria incluyendo F. meningosepticum y F. odoratum; brucela; Bordetella incluyendo B. pertussis y B. bronchiseptica; Escherichia incluyendo E. coli; klebsiella; enterobacteria; Serratia incluyendo S. marcescens y S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus incluyendo P. mirabilis y P. vulgaris; estreptobacilo; Rickettsiaceae incluyendo R. rickettsii; clamidia incluyendo C. psittaci y C. trachomatis; micobacteria incluyendo M. tuberculosis, M. intracellulare, M. fortuitum, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracellulare, y M. lepraemurium; y Nocardia, y cualquier otra bacteria que contiene lípidos en sus membranas.
Otros microorganismos infecciosos que contienen lípidos que pueden tratarse con el método de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, protozoos, mohos y hongos.
En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para tratar un fluido con el fin de reducir o eliminar la infectividad de los microorganismos infecciosos contenidos en el mismo.
Es otro objeto de la presente invención disminuir la concentración del microorganismo infeccioso dentro del fluido.
Aún otro objeto de la presente invención es disminuir la infectividad del microorganismo infeccioso contenido dentro del fluido.
Todavía otro de la presente invención es usar el presente método para disminuir la concentración e infectividad de microorganismos infecciosos contenidos dentro de un fluido.
Es un objeto específico de la presente invención disminuir la infectividad de microorganismos infecciosos contenidos dentro de un fluido en el que el fluido es plasma.
Es otro objeto específico de la presente invención proporcionar un método para reducir la infectividad y carga viral de un virus que se encuentra dentro de fluidos tales como plasma.
Aún otro objeto de la presente invención es inactivar completa o parcialmente y reducir la carga viral de virus contenidos dentro de una muestra tal como plasma, en la que los virus son el virus de inmunodeficiencia humano, la hepatitis en sus diversas formas, u otro virus.
Aún otro objeto de la presente invención es reducir la infectividad y concentración de bacterias contenidas dentro de un fluido, tal como el plasma.
Es un objeto adicional de la presente invención tratar microorganismos infecciosos con el método de la presente invención con el fin de reducir su infectividad y proporcionar una vacuna que comprende un microorganismo infeccioso sin lípidos que puede administrarse a un animal o ser humano junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un compuesto inmunoestimulante, para evitar o minimizar la manifestación clínica de la enfermedad tras la exposición al microorganismo infeccioso.
Es otro objeto específico de la presente invención proporcional una vacuna antiviral.
Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna antibacteriana.
Es un objeto específico adicional de la presente invención conferir inmunidad frente a un microorganismo infeccioso que contiene lípidos en un animal o ser humano que recibe una vacuna que comprende una composición que comprende un microorganismo infeccioso tratado con el método de la presente invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método útil para el desarrollo de vacunas frente a microorganismos infecciosos, incluyendo, pero sin limitarse a, virus y bacterias.
Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar una solución que contiene partículas virales inactivadas de un virus que contiene lípidos tratado que puede liofilizarse y reconstituirse cuando se desee para su administración a un animal o ser humano.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para el tratamiento de microorganismos infecciosos que contienen lípidos dentro de un fluido que minimiza los efectos perjudiciales sobre las proteínas contenidas dentro del fluido.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para reducir la infectividad de microorganismos infecciosos que contienen lípidos, en el que el método no emplea temperaturas elevadas, cloroformo, detergentes ni fosfatos de trialquilo.
Éstos y otros objetos, ventajas y usos de la presente invención se revelarán por sí mismos a un experto en la técnica tras la lectura de la descripción detallada de las realizaciones preferidas y las reivindicaciones adjuntas.
Descripción detallada de la invención Definiciones
Por el término "fluido" se quiere decir cualquier fluido que contiene un microorganismo infeccioso, incluyendo, pero sin limitarse a, un fluido biológico obtenido de un organismo tal como un animal o ser humano. Tales fluidos biológicos obtenidos de un organismo incluyen, pero no se limitan a, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, líquido peritoneal, líquido folicular, líquido amniótico, líquido pleural, líquido pericárdico, líquidos reproductores y cualquier otro fluido contenido dentro del organismo. Otros fluidos pueden incluir muestras clínicas que contienen microorganismos infecciosos suspendidos en cualquier fluido seleccionado. Otros fluidos incluyen reactivos de cultivo celular, muchos de los cuales incluyen compuestos biológicos tales como fluidos obtenidos de organismos vivos, incluyendo, pero sin limitarse a, "suero normal" obtenido de diversos animales y usado como medio de crecimiento en aplicaciones de cultivo celular y tisular.
Por el término "primer disolvente" o "primer disolvente orgánico" se quiere decir un disolvente, que comprende uno o más disolventes, que facilita la extracción de lípidos.
Por el término "agente desemulsionante" se quiere decir un agente que facilita la eliminación del primer disolvente que puede estar presente en una emulsión en una fase acuosa.
Los términos "excipiente farmacéuticamente aceptable o vehículo farmacéuticamente aceptable" se usan en el presente documento para significar cualquier líquido incluyendo, pero sin limitarse a, agua o solución salina, un gel, pomada, diluyente, base de ungüento fluido, liposoma, micela, micela gigante, y similares, que es adecuado para su uso en contacto con tejido humano o de animal vivo sin provocar respuestas fisiológicas adversas, y que no interacciona con los otros componentes de la composición de una manera perjudicial.
Por el término "microorganismo infeccioso" se quiere decir cualquier microorganismo infeccioso que contiene lípidos que puede provocar una infección. Algunos microorganismos infecciosos incluyen bacterias, virus, protozoos, parásitos, hongos y mohos. Algunas bacterias que pueden tratarse con el método de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: estafilococos; estreptococos, incluyendo S. pyogenes; enterococos; bacilos, incluyendo Bacillus anthracis, y lactobacilos; listeria; Corynebacterium diphtheriae; gardnerella incluyendo G. vaginalis; nocardia; estreptomices; Thermoactinomyces vulgaris; treponema; campylobacter; pseudomonas incluyendo P. aeruginosa; Legionella; Neisseria incluyendo N. gonorrhoeae y N.meningitides; flavobacteria incluyendo F. meningosepticum y F. odoratum; brucela; Bordetella incluyendo B. pertussis y B. bronchiseptica; Escherichia incluyendo E. coli; klebsiella; enterobacteria; Serratia incluyendo S. marcescens y S. liquefaciens; Edwardsiella; Proteus incluyendo P. mirabilis y P. vulgaris; estreptobacilo; Rickettsiaceae incluyendo R. rickettsii; clamidia incluyendo C. psittaci y C. trachomatis; micobacteria incluyendo M. tuberculosis, M. intracellulare, M. fortuitum, M. laprae, M. avium, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. intracellulare, y M. lepraemurium; y Nocardia, y cualquier otra bacteria que contiene lípidos en su membrana.
Microorganismos infecciosos virales que pueden inactivarse mediante el sistema anterior incluyen, pero no se limitan a, virus que contienen lípidos de los siguientes géneros: Alphavirus (alfavirus), Rubivurus (virus de la rubeola), Flavivirus (flavivirus), Pestivirus (virus de la enfermedad de la mucosa), (virus de la hepatitis C sin nombrar), Coronavirus (virus corona), Torovirus (torovirus), Arteivirus (arterivirus), Paramyxovirus (paramixovirus), Rubulavirus (rubulavirus), Morbillivirus (morbillivirus), Pneumovirinae (los pneumovirus), Pneumovirus (pneumovirus), Vesiculovirus (vesiculovirus), Lyssavirus (lyssavirus), Ephemerovirus (ephemerovirus), Cytorhabdovirus (rabdovirus vegetal del grupo A), Nucleorhabdovirus (rabdovirus vegetal del grupo B), Filovirus (filovirus), Influenzavirus A, B (virus influenza A y B), Influenza virus C (virus influenza C), (virus de tipo Thogoto, sin nombrar), Bunyavirus (bunyavirus), Phlebovirus (flebovirus), Nairovirus (nairovirus), Hantavirus (hantavirus), Tospovirus (tospovirus), Arenavirus (arenavirus), retrovirus de tipo B de mamífero sin nombrar, retrovirus de tipo C de mamífero y reptil sin nombrar, retrovirus de tipo D sin nombrar, Lentivirus (lentivirus), Spumavirus (espumavirus), Orthohepadnavirus (hepadnavirus de mamíferos), Avihepadnavirus (hepadnavirus de pájaros), Simplexvirus (virus simplex), Varicellovirus (varicellovirus), Betaherpesvirinae (los citomegalovirus), Cytomegalovirus (citomegalovirus), Muromegalovirus (citomegalovirus murino), Roseolovirus (virus 6 del herpes humano), Gammaherpesvirinae (los virus del herpes asociados a linfocitos), Lymphocryptovirus (virus de tipo Epstein-Barr), Rhadinovirus (virus del herpes de tipo saimiriteles), Orthopoxvirus (ortopoxvirus), Parapoxvirus (parapoxvirus), Avipoxvirus (virus de la viruela aviar), Capripoxvirus (virus de tipo viruela ovina), Leporipoxvirus (mixomavirus), Suipoxvirus (virus de la viruela porcina), Molluscipoxvirus (virus del molusco contagioso), Yatapoxvirus (yabapoxvirus y tanapoxvirus), virus de tipo fiebre porcina africana sin nombrar, Iridovirus (virus de insecto iridiscente pequeño), Ranavirus (iridovirus frontal), Lymphocystivirus (virus de la linfocistis del pescado) Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Enabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Retroviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, y cualquier otro virus que contiene lípidos.
Estos virus incluyen los siguientes patógenos humanos y de animales: virus del río Ross, virus de la fiebre, virus del dengue, virus de la encefalitis del valle Murray, virus de la encefalitis de las garrapatas (incluyendo virus de la encefalitis de las garrapatas europea y del extremo oriente, virus de la hepatitis C, virus corona humano 229-E y OC43 y otros (que provocan el resfriado común, infección de las vías respiratorias altas, probablemente neumonía y posiblemente gastroenteritis), virus de la parainfluenza humano 1 y 3, virus de la parotiditis infecciosa, virus de la parainfluenza humano 2, 4a y 4b, virus del sarampión, virus respiratorio sincitial humano, virus de la rabia, virus de Marburg, virus del Ébola, virus influenza A y virus influenza B, arenavirus: virus de la coriomeningitis linfocítica (LCM); virus Lassa, virus de inmunodeficiencia humano 1 y 2, o cualquier otro virus de inmunodeficiencia, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, subfamilia: virus del herpes humano 1 y 2, virus del herpes B, virus Epstein-Barr), virus de la viruela, virus de la viruela vacuna, virus del molusco contagioso.
Disolventes para su uso en la eliminación de lípidos de microorganismos que contienen lípidos, especialmente microorganismos infecciosos
Pueden usarse numerosos disolventes orgánicos en el método de la presente invención para la eliminación de lípidos de microorganismos que contienen lípidos, especialmente microorganismos infecciosos, siempre que los disolventes o combinaciones de los mismos sean eficaces para solubilizar lípidos. Disolventes adecuados comprenden mezclas de hidrocarburos, éteres, alcoholes y aminas. Otros disolventes que pueden usarse con la presente invención incluyen aminas y mezclas de aminas. Los disolventes preferidos son combinaciones de alcoholes y éteres. Otro disolvente preferido comprende un éter o combinaciones de éteres. Se prefiere que el disolvente o combinación de disolventes tenga un punto de ebullición relativamente bajo para facilitar la eliminación mediante una combinación de vacío y posiblemente calor.
Ejemplos de aminas adecuadas para su uso en la eliminación de lípidos de microorganismos que contienen lípidos en la presente invención son aquellas que son sustancialmente inmiscibles en agua. Aminas típicas son aminas alifáticas que tienen una cadena carbonada de al menos 6 átomos de carbono. Un ejemplo no limitativo de una amina de este tipo es C_{6}H_{13}NH_{2}.
Los alcoholes que se prefieren para su uso en la presente invención, cuando se usan solos, incluyen aquellos alcoholes que no son miscibles de manera apreciable con plasma ni otros fluidos biológicos. Tales alcoholes incluyen, pero no se limitan a, alcoholes de cadena lineal y de cadena ramificada, incluyendo pentanoles, hexanoles, heptanoles, octanoles y alcoholes que contienen un número superior de carbonos.
Cuando se usan alcoholes en combinación con otro disolvente, por ejemplo, un éter, un hidrocarburo, una amina o una combinación de los mismos, pueden usarse alcoholes que contienen C_{1}-C_{8}. Alcoholes preferidos para su uso en combinación con otro disolvente incluyen alcoholes que contienen C_{4}-C_{8}. En consecuencia, los alcoholes preferidos que caen dentro del alcance de la presente invención son preferiblemente butanotes, pentanoles, hexanoles, heptanoles y octanoles, y las formas iso de los mismos. Se prefieren particularmente los butanotes (1-butanol y 2-butanol). Tal como se mencionó anteriormente, el alcohol más preferido es el alcohol C_{4}, butanol. La selección específica del alcohol dependerá del segundo disolvente empleado. En una realización preferida, se combinan alcoholes inferiores con éteres inferiores.
Los éteres, usados solos, o en combinación con otros disolventes, preferiblemente alcoholes, son otro disolvente preferido para su uso en el método de la presente invención. Se prefieren particularmente los éteres que contienen C_{4}-C_{8}, incluyendo, pero sin limitarse a, etil éter, dietil éter, y propil éteres, incluyendo, pero sin limitarse a, diisopropil éter. También son útiles en la presente invención combinaciones de éteres, tales como diisopropil éter y dietil éter. Cuando se usan éteres y alcoholes en combinación como primer disolvente para poner en contacto el fluido que contiene los microorganismos infecciosos que contienen lípidos, puede usarse cualquier combinación de alcohol y éter siempre que la combinación sea eficaz para eliminar parcial o completamente los lípidos del microorganismo infeccioso. En una realización, los lípidos se eliminan de la envoltura viral o la pared celular bacteriana del microorganismo infeccioso. Cuando se combinan alcoholes y éter como primer disolvente para tratar el microorganismo infeccioso contenido en un fluido, las razones preferidas de alcohol con respecto a éter en este disolvente son de aproximadamente el 0,01%-60% de alcohol con respecto a aproximadamente el 40%-99,99% de éter, con una razón preferida de aproximadamente el 10%-50% de alcohol con respecto a aproximadamente el 50%-90% de éter, con la razón más preferida de aproximadamente el 20%-45% de alcohol con respecto a aproximadamente el 55%-80% de éter. Una combinación especialmente preferida de alcohol y éter es la combinación de butanol y diisopropil éter. Otra combinación especialmente preferida de alcohol y éter es la combinación de butanol con dietil éter. Cuando se combinan butanol y diisopropil éter como primer disolvente para tratar el microorganismo infeccioso contenido en un fluido, las razones preferidas de butanol con respecto a diisopropil éter en este disolvente son de aproximadamente el 0,01%-60% de butanol con respecto a aproximadamente el 40%-99,99% de diisopropil éter, con una razón preferida de aproximadamente el 10%-50% de butanol con respecto a aproximadamente el 50%-90% de diisopropil éter, con la razón más preferida de aproximadamente el 20%-45% de butanol y aproximadamente el 55%-80% de diisopropil éter. La razón más preferida de butanol y diisopropil éter es de aproximadamente el 40% de butanol y aproximadamente el 60% de diisopropil éter.
Cuando se usa butanol en una combinación con dietil éter en un primer disolvente, las razones preferidas de butanol con respecto a dietil éter en esta combinación son de aproximadamente el 0,01%-60% de butanol con respecto a aproximadamente el 40%-99.99% de dietil éter, con una razón preferida de aproximadamente el 10%-50% de butanol con respecto a aproximadamente el 50%-90% de dietil éter, con la razón más preferida de aproximadamente el 20%-45% de butanol y aproximadamente el 55%-80% de dietil éter. La razón más preferida de butanol y dietil éter en un primer disolvente es de aproximadamente el 40% de butanol y aproximadamente el 60% de dietil éter. Se ha mostrado que esta combinación de aproximadamente el 40% de butanol y aproximadamente el 60% de dietil éter (vol:vol) no tiene ningún efecto significativo sobre una diversidad de parámetros sanguíneos bioquímicos y hematológicos, tal como se muestra por ejemplo en la patente de los EE.UU. 4.895.558. Se realizaron comparaciones adicionales en las actividades de enzimas, proteínas y pH del suero en suero humano cuando se trató con butanol-DIPE (40%-60% V/V). Los resultados se ilustran en la siguiente tabla.
TABLA 1
Control Sin lípidos
IgA mg/100 ml 168 167
IgM mg/100 ml 144 144
Ceruloplasmina mg/100 ml 1402 1395
Transferrina mg/100 ml 30 31
Albúmina g/100 ml 5,12 5,12
Proteína total g/100 ml 7,35 7,42
pH 7,37 7,37
GOT UI 25 23
Fosfatasa alcalina UI 81 80
a-amilasa UI 293 293
Este sistema de disolventes de butanol-DIPE (40%-60% V/V) no afecta de manera adversa a los constituyentes de la sangre mostrados en la tabla anterior. Además, parece haber poca o ninguna desnaturalización de las proteínas plasmáticas o cambios en la actividad enzimática, incluyendo la actividad de enzimas asociadas a lípidos tales como lecitina-colesterol acetiltransferasa y proteína de transferencia de éster de colesterol.
Disolventes para su uso en la producción de vacunas
Pueden usarse diferentes disolventes y combinaciones de disolventes para tratar un microorganismo que contiene lípidos, tal como un microorganismo infeccioso, para producir una vacuna usando el microorganismo tratado. Esta sección describe estos disolventes y combinaciones de los mismos. Los disolventes adecuados comprenden hidrocarburos, éteres, alcoholes, aminas, tensioactivos, ésteres y combinaciones de los mismos.
Los hidrocarburos en su forma líquida disuelven compuestos de baja polaridad tales como los lípidos que se encuentran en las membranas de microorganismos infecciosos. Los hidrocarburos que son líquidos a aproximadamente 37ºC son eficaces para romper una membrana lipídica de un microorganismo infeccioso. En consecuencia, los hidrocarburos comprenden cualquier hidrocarburo sustancialmente inmiscible en agua que es líquido a aproximadamente 37ºC. Hidrocarburos adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: hidrocarburos alifáticos de C_{5} a C_{20} tales como éter de petróleo, hexano, heptano, octano; hidrocarburos haloalifáticos tales como cloroformo, 1,1,2-tricloro-1,2,2-trifluoroetano, 1,1,1-tricloroetano, tricloroetileno, tetracloroetileno diclorometano y tetracloruro de carbono, e hidrocarburos tioalifáticos cada uno de los cuales puede ser lineal, ramificado o cíclico, saturado o insaturado; hidrocarburos aromáticos tales como benceno; alquilarenos tales como tolueno, haloarenos, haloalquilarenos y tioarenos. Otros disolventes adecuados también pueden incluir compuestos heterocíclicos saturados o insaturados tales como piridina y derivados tio o halogenados alifáticos de los mismos.
Ésteres adecuados que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de butilo, y propionato de etilo.
Tensioactivos adecuados que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: sulfatos, sulfonatos, fosfatos (incluyendo fosfolípidos), carboxilatos y sulfosuccinatos. Algunos materiales anfífilos aniónicos útiles con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: dodecilsulfato de sodio (SDS), decilsulfato de sodio, bis-(2-etilhexil)sulfosuccinato de sodio (AOT), sulfato de colesterol y laurato de sodio.
Los alcoholes que se prefieren para su uso en la presente invención, cuando se usan solos, incluyen aquellos alcoholes que no son miscibles de manera apreciable en el plasma ni otros fluidos biológicos. Cuando se usan alcoholes en combinación con otro disolvente, por ejemplo, éter, un hidrocarburo, una amina o una combinación de los mismos, pueden usarse alcoholes que contienen C_{1}-C_{8}. Los alcoholes preferidos para su uso en combinación con otro disolvente incluyen alcoholes inferiores tales como alcoholes que contienen C_{4}-C_{8}. En consecuencia, los alcoholes preferidos que caen dentro del alcance de la presente invención son preferiblemente butanoles, pentanoles, hexanoles, heptanoles y octanoles, y las formas iso de los mismos. Se prefieren particularmente los butanoles (1-butanol y 2-butanol). Tal como se mencionó anteriormente, el alcohol más preferido es el alcohol C_{4}, butanol. La selección específica del alcohol dependerá del segundo disolvente empleado. En una realización preferida, se combinan alcoholes inferiores con éteres inferiores.
Los éteres, usados solos, o en combinación con otros disolventes, preferiblemente alcoholes, son otro disolvente preferido para su uso en el método de la presente invención. Se prefieren particularmente los éteres C_{4}-C_{8}, incluyendo, pero sin limitarse a, etil éter, dietil éter, y propil éteres, incluyendo, pero sin limitarse a, diisopropil éter. También son útiles en la presente invención las combinaciones de éteres, tales como diisopropil éter y dietil éter.
Cuando se usan éteres y alcoholes en combinación como primer disolvente para eliminar lípidos del microorganismo infeccioso con el fin de preparar una vacuna, puede usarse cualquier combinación de alcohol y éter siempre que la combinación sea eficaz para eliminar parcial o completamente los lípidos del microorganismo infeccioso. En una realización, se eliminan los lípidos de la envoltura viral o la pared celular bacteriana del microorganismo infeccioso. Cuando se combinan alcoholes y éteres como primer disolvente para tratar el microorganismo infeccioso contenido en un fluido, las razones preferidas de alcohol con respecto a éter en este disolvente son de aproximadamente el 0,01%-60% de alcohol con respecto a aproximadamente el 40%-99,99% de éter, con una razón preferida de aproximadamente el 10%-50% de alcohol con respecto a aproximadamente el 50%-90% de éter, con la razón más preferida de aproximadamente el 20%-45% de alcohol y aproximadamente el 55%-80% de éter. Una combinación especialmente preferida de alcohol y éter es la combinación de butanol y diisopropil éter. Otra combinación especialmente preferida de alcohol y éter es la combinación de butanol con dietil éter. Cuando se combinan butanol y diisopropil éter como primer disolvente para tratar el microorganismo infeccioso contenido en un fluido, las razones preferidas de butanol con respecto a diisopropil éter en este disolvente son de aproximadamente el 0,01%-60% de butanol con respecto a aproximadamente el 40%-99,99% de diisopropil éter, con una razón preferida de aproximadamente el 10%-50% de butanol con respecto a aproximadamente el 50%-90% de diisopropil éter, con la razón más preferida de aproximadamente el 20%-45% de butanol y aproximadamente el 55%-80% de diisopropil éter. La razón más preferida de butanol y diisopropil éter es de aproximadamente el 40% de butanol y aproximadamente el 60% de diisopropil éter.
Cuando se usa butanol en combinación con dietil éter en un primer disolvente, las razones preferidas de butanol con respecto a dietil éter en esta combinación son de aproximadamente el 0,01%-60% de butanol con respecto a aproximadamente el 40%-99,99% de dietil éter, con una razón preferida de aproximadamente el 10%-50% de butanol con respecto a aproximadamente el 50%-90% de dietil éter, con la razón más preferida de aproximadamente el 20%-45% de butanol y aproximadamente el 55%-80% de dietil éter. La razón más preferida de butanol y dietil éter en un primer disolvente es de aproximadamente el 40% de butanol y aproximadamente el 60% de dietil éter.
Fluidos biológicos y tratamiento de los mismos para reducir la infectividad de microorganismos infecciosos que contienen lípidos
Tal como se mencionó anteriormente, pueden emplearse diversos fluidos biológicos con el método de la presente invención con el fin de reducir los niveles o infectividad de microorganismos que contienen lípidos en el fluido. En una realización preferida de la presente invención, el plasma obtenido de un animal o ser humano se trata con el método de la presente invención con el fin de reducir la concentración y/o infectividad de microorganismos infecciosos que contienen lípidos dentro del plasma. En esta realización, puede obtenerse plasma de un animal o ser humano extrayendo sangre del animal o ser humano usando métodos conocidos y tratando la sangre con métodos convencionales con el fin de separar los componentes celulares de la sangre (glóbulos rojos y blancos) del plasma. Tales métodos se conocen por un experto en la técnica e incluyen la centrifugación y la filtración.
Normalmente, los virus se retienen en el plasma y se ven afectados por el tratamiento del plasma con el método de la presente invención. Cuando el microorganismo que contiene lípidos que va a tratarse es sustancialmente mayor que un virus, y puede sedimentar con los glóbulos rojos y blancos de la sangre en condiciones de centrifugación normales para separar las células del plasma, el microorganismo que contiene lípidos puede separarse de los glóbulos rojos y blancos usando técnicas conocidas por un experto en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, la centrifugación y la filtración. Un experto en la técnica entiende las condiciones de centrifugación apropiadas para separar tales microorganismos que contienen lípidos de los glóbulos rojos y blancos. La filtración puede incluir la diafiltración o la filtración a través de membranas con tamaños de poro que separan al microorganismo que contiene lípidos, tal como bacterias, de los glóbulos rojos y los glóbulos blancos. El uso de la presente invención permite el tratamiento de microorganismos que contienen lípidos, tales como a bacterias, que se encuentran en el plasma, sin efectos perjudiciales sobre otras proteínas plasmáticas.
El tratamiento de microorganismos que contienen lípidos en fluidos biológicos distintos de la sangre y el plasma generalmente no implica la separación de las células del fluido antes de iniciar el procedimiento de eliminación de lípidos. Por ejemplo, pueden tratarse líquido folicular y líquido peritoneal con la presente invención para afectar los niveles e infectividad de microorganismos que contienen lípidos sin efectos perjudiciales sobre los componentes proteicos. Entonces puede devolverse el fluido tratado a un animal o ser humano. El tratamiento de estos tipos de fluidos diferentes de la sangre afecta a los microorganismos que contienen lípidos en el fluido, incluyendo las bacterias y virus.
Una vez que se obtiene un fluido biológico, tal como plasma, o bien de esta manera, o bien por ejemplo, a partir de una instalación de almacenamiento que aloja bolsas de plasma, se pone en contacto el plasma con un primer disolvente orgánico, tal como se describió anteriormente, que puede solubilizar los lípidos en el microorganismo infeccioso que contiene lípidos. El primer disolvente orgánico se combina con el plasma en una razón en la que el primer disolvente está presente en una cantidad eficaz para solubilizar sustancialmente los lípidos en el microorganismo infeccioso. Las razones preferidas de primer disolvente con respecto a plasma (expresadas como primer disolvente orgánico : plasma) se describen en los siguientes intervalos: 0,5-4,0:0,5-4,0; 0,8-3,0:0,8-3,0; y 1-2:0,8-1,5.
Debe entenderse que pueden emplearse otras razones diversas para diferentes fluidos tales como aquellos fluidos descritos anteriormente. Por ejemplo, en el caso de fluido de cultivo celular, pueden emplearse los siguientes intervalos de primer disolvente orgánico con respecto a fluido de cultivo celular: 0,5-4,0:0,5-4,0; 0,8-3,0:0,8-3,0; y 1-2:0,8-1,5.
Tras poner en contacto el fluido que contiene el microorganismo infeccioso con el primer disolvente tal como se describió anteriormente, se mezclan el primer disolvente y el fluido. Métodos de mezclado adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: agitación suave; agitación vigorosa; agitación en vórtex; agitación con remolino; homogeneización; y rotación continua.
La cantidad de tiempo requerida para obtener un mezclado adecuado del primer disolvente con el fluido está relacionada con el método de mezclado empleado. Los fluidos se mezclan durante un periodo de tiempo suficiente para permitir un contacto íntimo entre las fases orgánica y acuosa, y para que el primer disolvente solubilice algunos o todos los lípidos contenidos en el microorganismo infeccioso. Normalmente, el mezclado se producirá durante un periodo de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 24 horas, preferiblemente de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 2 horas, más preferiblemente de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 10 minutos, o de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 1 hora, dependiendo del método de mezclado empleado. Ejemplos no limitativos de duraciones de mezclado asociadas con diferentes métodos se presentan en las siguientes frases. La agitación suave y la rotación continua pueden producirse durante un periodo de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 24 horas. La agitación vigorosa y la agitación en vórtex pueden producirse durante un periodo de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 30 minutos. La agitación con remolino puede producirse durante un periodo de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 2 horas. La homogeneización puede producirse durante un periodo de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 10 minutos.
Tras el mezclado del primer disolvente con el fluido, se separa el disolvente del fluido que está tratándose. La separación puede producirse mediante cualquier manera conocida por un experto en la técnica de la separación de fases orgánicas y acuosas. Ya que el primer disolvente es normalmente inmiscible en el fluido acuoso, la separación se logra normalmente permitiendo que se separen las dos fases y retirando la fase no deseada. La fase no deseada es la fase del disolvente que contiene lípidos disueltos y depende de si el disolvente es más o menos denso que la fase acuosa. Una ventaja de la separación de esta manera es que pueden retirarse los lípidos disueltos en la fase del disolvente. La separación puede lograrse a través de medios, incluyendo, pero sin limitarse a, los siguientes: retirada de la fase mediante pipeteado; centrifugación seguida de la eliminación de la fase que va a separarse; creación de una trayectoria o agujero en el fondo del tubo que contiene las fases y permitir a la fase inferior pasar a su través; utilización de un recipiente con válvulas u orificios ubicados a longitudes específicas a lo largo del eje más largo del recipiente para facilitar el acceso a, y la eliminación de, fases específicas; y cualquier otro medio conocido por un experto en la técnica. Otro método de separación de las fases, especialmente cuando la fase del disolvente es volátil, es mediante la destilación a presión reducida o la evaporación a temperatura ambiente, opcionalmente combinada con calentamiento suave. En una realización que emplea la centrifugación, se emplean fuerzas g relativamente bajas, tales como 900 x g durante aproximadamente de 5 a 15 minutos para separar las fases.
Tras la separación del primer disolvente del fluido tratado, cierta cantidad del primer disolvente puede permanecer atrapada en la fase acuosa. Éste puede estar en forma de una emulsión. Opcionalmente, se emplea un agente desemulsionante para facilitar la eliminación del primer disolvente atrapado. El agente desemulsionante puede ser cualquier agente eficaz para facilitar la eliminación del primer disolvente. Un agente desemulsionante preferido es éter y un agente desemulsionante más preferido es dietil éter. El agente desemulsionante puede añadirse al fluido o, alternativamente, puede dispersarse el fluido en el agente desemulsionante. Cuando se prepara una vacuna, pueden emplearse alcanos en una razón de aproximadamente 0,5 a 4,0 con respecto a aproximadamente 1 parte de emulsión (vol:vol) como agente desemulsionante, seguido por un lavado para eliminar alcano residual del microorganismo sin lípidos usado para preparar la vacuna. Alcanos preferidos incluyen, pero no se limitan a, pentano, hexano y alcanos de cadena lineal y ramificada de orden superior.
El agente desemulsionante, tal como éter, puede eliminarse a través de medios conocidos por un experto en la técnica, incluyendo medios tales como los descritos en el párrafo anterior. Un método conveniente para eliminar el agente desemulsionante, tal como éter, del sistema es permitir que el éter se evapore del sistema en una campana extractora u otro dispositivo adecuado para recoger y eliminar el agente desemulsionante del entorno. Los agentes desemulsionantes pueden eliminarse mediante la aplicación de temperaturas elevadas, por ejemplo, de desde aproximadamente 24 hasta 37ºC con o sin presiones de aproximadamente 10 a 20 mbar. Otro método para eliminar el agente desemulsionante implica la separación mediante centrifugación, eliminación del disolvente orgánico mediante aspiración seguida de evaporación a presión reducida (por ejemplo de 50 mbar) o suministro adicional de un gas inerte, tal como nitrógeno, sobre el menisco.
Debe entenderse que el método de la presente invención puede emplearse de una manera continua o discontinua. Es decir, de una manera continua, puede alimentarse un fluido de una manera continua a un sistema que emplea un primer disolvente que entonces se mezcla con el fluido, se separa, y opcionalmente se elimina adicionalmente mediante la aplicación de un agente desemulsionante. El método continuo también facilita un retorno posterior del fluido que contiene el microorganismo infeccioso sin lípidos a una ubicación deseada. Tales ubicaciones pueden ser recipientes para la recepción y/o almacenamiento de tal fluido tratado, y también puede incluir el sistema vascular de un ser humano o animal o algún otro compartimiento del organismo de un ser humano o animal, tal como los espacios pleural, pericárdico, peritoneal, y abdominopélvico. Por ejemplo, en una realización de la presente invención, puede usarse el método de manera continua en la siguiente situación. Se extrae un fluido biológico, por ejemplo sangre, de un animal o ser humano a través de medios conocidos por un experto en la técnica, tales como un catéter. Se emplean factores anticoagulantes apropiados tales como los conocidos por un experto en la técnica, tales como heparina, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o citrato. Entonces se separa esta sangre en sus componentes celulares y plasmáticos mediante el uso de una centrífuga. Entonces se pone en contacto el plasma con el primer disolvente y se mezcla con el primer disolvente para realizar la eliminación de los lípidos del microorganismo infeccioso contenido dentro del plasma. Tras la separación del primer disolvente del plasma tratado, se emplea opcionalmente un agente desemulsionante para eliminar el primer disolvente atrapado. Tras garantizar que se encuentran niveles aceptables de primer disolvente o agente desemulsionante, si se emplea, dentro del plasma que contiene el microorganismo infeccioso sin lípidos, entonces se combina opcionalmente el plasma con las células previamente separadas de la sangre para formar una nueva muestra de sangre que contiene microorganismos infecciosos parcial o completamente sin lípidos. En cualquier caso, se ha eliminado o reducido enormemente la infectividad del microorganismo infeccioso a través del método de la presente invención. Tras la recombinación con las células originariamente separadas de la sangre, puede reintroducirse esta muestra dentro del sistema vascular o algún otro sistema del ser humano o animal. El efecto de un tratamiento de este tipo del plasma extraído del ser humano o animal y retorno de la muestra que contiene el microorganismo infeccioso parcial o completamente sin lípidos al ser humano o animal provoca una disminución neta de la concentración e infectividad del microorganismo infeccioso contenido dentro del sistema vascular del ser humano o animal. De esta manera, se reduce la carga o concentración del microorganismo infeccioso, ya sea un virus, una bacteria o algún otro microorganismo infeccioso, por ejemplo, un protozoo o un moho. En este modo continuo de funcionamiento, el método de la presente invención se emplea para tratar fluidos corporales de una manera continua, mientras que el ser humano o animal está conectado a un sistema para un tratamiento de este tipo.
Otro uso del método de la presente invención es en un modo discontinuo o intermitente. En esta realización, el ser humano o animal no está conectado a un dispositivo para tratar fluidos corporales con el método de la presente invención. En un modo discontinuo de funcionamiento, la presente invención emplea un fluido, por ejemplo una muestra de plasma o una muestra de líquido linfático o líquido folicular, que se ha obtenido previamente de un ser humano o animal. Una muestra puede estar contenida dentro de un banco de sangre, o puede haberse extraído simplemente de un ser humano o animal antes de la aplicación del método. Una muestra puede ser un líquido reproductor o cualquier fluido usado en el procedimiento de inseminación artificial o fertilización in vitro. Alternativamente, la muestra puede ser una que no se obtiene directamente de un ser humano o animal sino que puede ser un fluido de cultivo celular o algún otro fluido que contiene un microorganismo potencialmente infeccioso. En este modo de funcionamiento, se trata esta muestra con el método de la presente invención para producir una nueva muestra que contiene microorganismos infecciosos parcial o completamente sin lípidos. Una realización de este modo de la presente invención es tratar muestras de plasma previamente obtenidas de animales o seres humanos y almacenadas en un banco de sangre para su posterior transfusión. Estas muestras pueden tratarse con el método de la presente invención para minimizar o eliminar la transfusión de enfermedades infecciosas, tales como VIH, hepatitis, citomegalovirus, estafilococos, estreptococos, enterococos, o meningococos, de la muestra biológica.
La eliminación de lípidos de un microorganismo infeccioso puede lograrse mediante diversos medios. Puede usarse un método discontinuo para fluidos biológicos frescos o almacenados, por ejemplo, plasma fresco congelado. En este caso puede usarse una variedad de los disolventes orgánicos descritos o mezclas de los mismos para la inactivación viral. El tiempo de extracción depende del disolvente (o disolvente mixto) y del procedimiento de mezclado empleado.
También puede emplearse un método continuo para la eliminación de lípidos de un microorganismo infeccioso, usando por ejemplo, un dispositivo tal como se describe en las patentes de los EE. UU. 4.895.558 o 5.744.038.
Producción de vacunas
El microorganismo infeccioso parcial o sustancialmente sin lípidos, o componentes del mismo, se combina con un excipiente farmacéuticamente aceptable para preparar una composición que comprende una vacuna. Esta composición de vacuna se combina opcionalmente con un inmunoestimulante y se administra a un animal o a ser humano. Debe entenderse que estas composiciones de vacuna pueden contener más de un microorganismo infeccioso parcial o sustancialmente sin lípidos o componentes de los mismos, con el fin de proporcionar protección frente a más de una enfermedad tras la vacunación. Tales combinaciones pueden seleccionarse según la inmunidad deseada. Por ejemplo, una combinación puede ser VIH y hepatitis, o influenza y hepatitis. Las partículas restantes del microorganismo se conservan en el fluido biológico sin lípidos, y cuando se reintroduce dentro del animal o ser humano son presumiblemente captadas por los fagocitos. El número de partículas aisladas y afectadas por el tratamiento de eliminación de lípidos se determina mediante el recuento de partículas antes y después del tratamiento.
Administración de una vacuna producida con el método de la presente invención
Cuando se administra un microorganismo sin lípidos a un animal o ser humano, se combina normalmente con un excipiente farmacéuticamente aceptable para producir una vacuna, y se combina opcionalmente con un inmunoestimulante tal como sabe un experto en la técnica.
Las formulaciones de vacuna pueden presentarse convenientemente en formas farmacéuticas unitarias y pueden prepararse mediante técnicas farmacéuticas convencionales. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación el principio activo y el (los) vehículo(s) o excipiente(s) farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación uniforme e íntimamente el principio activo con los excipientes líquidos. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, viales y ampollas selladas, y pueden almacenarse en estado secado por congelación (liofilizado) que sólo requiere la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse suspensiones y soluciones para inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles usados comúnmente por un experto en la técnica.
Formulaciones de dosis unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis o unidad, o una fracción apropiada de la misma, del principio administrado. Debe entenderse que además de los principios mencionados de manera particular anteriormente, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes comúnmente usados por un experto en la técnica.
La vacuna puede administrarse mediante diferentes vías, tales como oral, incluyendo bucal y sublingual, rectal, parenteral, mediante aerosol, por vía nasal, intramuscular, subcutánea, intradérmica y tópica. La vacuna de la presente invención puede administrarse de diferentes formas, incluyendo, pero sin limitarse a, soluciones, emulsiones y suspensiones, microesferas, partículas, micropartículas, nanopartículas y liposomas. Se espera que puedan necesitarse desde aproximadamente 1 hasta 5 dosis por régimen de inmunización. Las inyecciones iniciales pueden oscilar desde aproximadamente 1 mg hasta 1 gramo, con un intervalo preferido de aproximadamente 10 mg a 800 mg, y un intervalo más preferido de desde aproximadamente 25 mg hasta 500 mg. Las inyecciones de refuerzo pueden oscilar desde 1 mg hasta 1 gramo, con un intervalo preferido de aproximadamente 10 mg a 750 mg, y un intervalo más preferido de aproximadamente 50 mg a 500 mg.
El volumen de administración variará dependiendo de la vía de administración. Las inyecciones intramusculares pueden oscilar desde aproximadamente 0,1 ml hasta 1,0 ml.
Las vacunas de la presente invención pueden administrarse antes, durante o después de una infección. En una realización, la carga viral (uno o más virus) de un ser humano o un animal puede reducirse mediante el tratamiento de eliminación de lípidos del plasma y el mismo individuo puede recibir una vacuna dirigida al uno o más virus, estimulando así al sistema inmunitario para luchar contra el virus que permanece en el individuo.
La vacuna puede almacenarse a temperaturas de desde aproximadamente 4ºC hasta -100ºC. La vacuna también puede almacenarse en un estado liofilizado a diferentes temperaturas, incluyendo la temperatura ambiente. La vacuna puede esterilizarse a través de medios convencionales conocidos por un experto en la técnica. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, la filtración, radiación y calor. La vacuna de la presente invención también puede combinarse con agentes bacteriostáticos, tales como timerosal, para inhibir el crecimiento bacteriano.
Programa de vacunación
La vacuna de la presente invención puede administrarse a seres humanos o animales. El momento óptimo para la administración de la vacuna es aproximadamente de uno a tres meses antes de la infección inicial. Sin embargo, la vacuna también puede administrarse tras la infección inicial para mejorar la progresión de la enfermedad, o tras la infección inicial para tratar la enfermedad.
Adyuvantes
Puede administrarse una variedad de adyuvantes conocidos por un experto en la técnica junto con la proteína en la composición de vacuna. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: polímeros, copolímeros tales como copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, incluyendo copolímeros de bloque; polímero P1005; monotide ISA72; adyuvante completo de Freund (para animales); adyuvante incompleto de Freund; monooleato de sorbitano; escualeno; adyuvante CRL-8300; alumbre; QS 21, dipéptido de muramilo; trehalosa; extractos bacterianos, incluyendo extractos micobacterianos; endotoxinas detoxificadas; lípidos de membrana; o combinaciones de los
mismos.
Se apreciará que otras realizaciones y usos resultarán claros para aquellos expertos en la técnica y que la invención no se limita a esos ejemplos ilustrativos específicos.
Ejemplo 1 La eliminación de lípidos del suero produce la inactivación del virus de la hepatitis B del pato (DHBV)
Se usó una combinación de suero de pato habitual (Camden) que contenía 10^{6} DI_{50} dosis de DHBV. La DI_{50} se conoce por un experto en la técnica como la dosis infectiva (DI) eficaz para infectar al 50% de los animales tratados con esa dosis. Se obtuvieron veintiún patos jóvenes a partir de una bandada negativa para DHBV en el día de la eclosión. Se sometieron a prueba estos patos jóvenes al adquirirlos y se mostró eran negativos frente a ADN de DHBV mediante hibridación de transferencia puntual.
Se mezcló el sistema de disolventes orgánicos en la razón del 40% de butanol con respecto al 60% de diisopropil éter. Se mezclaron 4 ml del sistema de disolventes orgánicos mixtos con 2 ml de la combinación de suero habitual y se rotó suavemente durante 1 hora a temperatura ambiente. Se centrifugó la mezcla a 400 x g durante 10 minutos y se retiró la fase acuosa inferior a temperatura ambiente. Entonces se mezcló la fase inferior con un volumen igual de dietil éter y se centrifugó tal como anteriormente. Entonces se retiró la fase acuosa y se mezcló con un volumen igual de dietil éter y volvió a centrifugarse. Se retiró la fase acuosa y se eliminó el dietil éter residual mediante aireación en una campana extractora a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. Se almacenó el plasma sin lípidos, con o sin partículas virales, a -20ºC.
Se diluyeron los sueros de pato control positivo y negativo en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Controles positivos: se mezclaron 2 ml de suero de la combinación que contiene 10^{6} DI_{50} dosis de DHBV con 4 ml de PBS. Controles negativos: se mezclaron 2 ml de suero de la combinación negativo para DHBV con 4 ml de PBS. Se probó la infectividad residual mediante inoculación de 100 \mul o bien de muestra de prueba (n=7), control negativo (n=7) o positivo (n=7) en las cavidades peritoneales de patos de un día de edad. Se hicieron pasar los controles con suero negativo para DHBV tratado con disolventes orgánicos y luego se mezclaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se inyectaron en patos receptores.
Uno de los patos de control positivo murió entre los 4 y 6 días de edad y se excluyó de análisis posteriores. Otros 3 patos de control positivo murieron entre los 9 y 10 días de edad, y dos de tratamiento y uno de control negativo murieron el día 11. Se decidió terminar el experimento. Se sacrificaron los patos jóvenes restantes el día 12 con pentobarbital sódico, por vía intravenosa, y se extirparon sus hígados para el análisis de ADN de DHBV descrito por Deva et al (J Hospital Infection 33:119-130, 1996). Los siete patos de control negativo permanecieron negativos para DHBV. Los hígados de los seis patos de control positivo fueron positivos para DHBV. Los siete patos de prueba permanecieron negativos para ADN de DHBV en sus hígados.
La eliminación de lípidos del suero usando el sistema de disolventes anterior dio como resultado la inactivación del DHBV. Ninguno de los patos jóvenes que recibió el suero tratado quedó infectado. Aunque hubo de terminarse el experimento el día 12 en vez de el día 14, todos los patos de control positivo fueron positivos para DHBV (3/3 fueron positivos para DHBV en el día 10). Esto sugiere que había transcurrido suficiente tiempo para que los patos tratados se volviesen positivos para DHBV en su hígado y que la terminación prematura del experimento no tuvo ningún efecto sobre los resultados.
Ejemplo 2 Inactivación del pestivirus de ganado (virus de la diarrea bovina, BVDV), como modelo para la hepatitis C
Se usó un producto aislado del pestivirus de ganado habitual (BVDV) en estos experimentos. Este producto aislado, el virus BVD "Numerella", se aisló en 1987 a partir de una muestra de diagnóstico presentada a partir de un caso típico de "enfermedad de la mucosa" en una granja del distrito de Bega de New South Wales, Australia. Este virus no es citopatogénico, y reacciona con los 12 de un panel de anticuerpos monoclonales producidos en el Elizabeth Macarthur Agricultural Institute (EMAI) (Instituto de Agricultura Elizabeth Macarthur), NSW, Australia, como reactivos de tipificación. Por lo tanto, este virus representa una "cepa habitual" del virus BVD australiano.
Se hizo crecer el virus Numerella en células MDBK bovinas probadas que estaban libres de agentes virales adventicios, incluyendo BVDV. El medio usado para el crecimiento viral contenía suero bovino adulto al 10% derivado de ganado del EMAI, todos probados que estaban libres de virus BVDV y anticuerpos frente a BVDV. Se ha empleado este complemento de suero durante años para excluir la posibilidad de contaminación por BVDV adventicio de los sistemas de prueba, un fallo común en laboratorios en todo el mundo que no toman precauciones para garantizar que el virus de prueba es el único en el sistema de cultivo. El uso de estos sistemas de cultivo probados garantizó altos niveles de replicación del virus y altos rendimientos de virus infeccioso. La titulación del rendimiento viral final tras 5 días de crecimiento en células MDBK mostró un título de 10^{6,8} partículas virales infecciosas por ml de medio de cultivo aclarado (centrifugado).
1. Inactivación de BVDV infeccioso
Se cultivaron 100 ml de sobrenadante de cultivo tisular, que contenía 10^{6,8} partículas virales/ml a partir de un matraz de cultivo tisular de 150 cm^{2}. Se aclaró el sobrenadante mediante centrifugación (residuos celulares sedimentados a 3.000 rpm, 10 min., 4ºC) y se apartaron 10 ml como control positivo para la inoculación de animales (virus no inactivado). Se inactivaron los 90 ml restantes, que contenían 10^{7,75} virus infecciosos, usando el siguiente protocolo. Brevemente, se añadieron 180 ml de butanol : diisopropil éter (2:1) y se mezcló mediante agitación con remolino. Entonces se agitó la mezcla, en un matraz cónico de 500 ml, durante 60 min. a 30 rpm y temperatura ambiente en un agitador orbital. Entonces se centrifugó durante 10 min. a 400 x g a 4ºC y se eliminó la fase de disolvente orgánico y se desechó. En etapas posteriores, se retiró la fase inferior (fase acuosa) de debajo de la fase orgánica, mejorando los rendimientos considerablemente.
Se lavó la fase acuosa, tras tratamiento con butanol : diisopropil éter, 4 veces con un volumen igual de dietil éter nuevo para eliminar todas las trazas contaminantes de butanol. Cada vez, se agitó con remolino el matraz para garantizar un mezclado uniforme de las fases acuosa y de disolvente antes de la centrifugación tal como anteriormente (400 x g, 10 min., 4ºC). Tras 4 lavados, se colocó la fase acuosa en un vaso de precipitados estéril cubierto con un tejido estéril fijado al vaso de precipitados con una banda elástica para evitar la contaminación, y se colocó en una campana extractora que funcionaba continuamente durante la noche (16 horas). El cultivo posterior del material inactivado mostró que no había contaminación. Se dejó funcionar la campana extractora para eliminar todo el residuo de éter volátil restante de la preparación viral inactivada. Entonces se almacenó a 4ºC en condiciones estériles hasta que se inoculó en cultivo tisular o animales para probar si quedaba algo de virus infeccioso.
2. Pruebas de la preparación de BVDV inactivado 2.1 Inoculación de cultivo tisular
Se mezclaron 2 ml de la preparación de virus inactivado en disolvente, que contenía aproximadamente 10^{7,1} equivalentes virales esperados, con 8 ml de medio de cultivo tisular, medio mínimo de Eagle (MEM), que contenía suero bovino adulto al 10% libre probado y se adsorbieron durante 60 min. sobre una monocapa de células MDBK en un matraz de cultivo tisular de 25 cm^{2}. Como control positivo, se adsorbieron de manera similar 2 ml de virus no inactivado (que contenía la misma cantidad de virus vivo, infeccioso) sobre células MDBK en un matraz de cultivo tisular de 25 cm^{2}. Tras 60 min., se retiró el sobrenadante de ambos matraces y se sustituyó por medio de crecimiento normal (+ SBA al 10%) Entonces se dejaron crecer las células durante 5 días en condiciones habituales antes de fijar las células MDBK y teñirlas usando un protocolo de inmunoperoxidasa habitual con una mezcla de 6 anticuerpos monoclonales específicos frente a BVDV (panel de EMAI, reactivos con 2 proteínas virales de BVD diferentes).
No hubo células infectadas en la monocapa de células MDBK que se inoculó con el virus tratado con disolvente orgánico (inactivado). En cambio, aproximadamente el 90% de las células en el matraz de control (que estaba inoculado con virus BVD no inactivado) fueron positivas para el virus tal como se muestra por una tinción de inmunoperoxidasa específica, pesada. Estos resultados mostraron que, en condiciones de prueba in vitro, no permaneció virus infeccioso en la preparación de BVDV inactivado.
Inoculación de animales
Una prueba incluso más sensible in vivo es inocular ganado que no recibió tratamiento (negativo para el anticuerpo) con la preparación de virus inactivado. Tan sólo una partícula viral infecciosa inyectada por vía subcutánea en tales animales se considera una dosis infecciosa para vacas, dado que la entrada en las células y replicación del virus es extremadamente eficaz para BVDV.
Se asignó aleatoriamente un grupo de 10 novillos negativos para el anticuerpo (de 10-12 meses de edad) a 3 grupos. Se usó el primer grupo de 6 novillos para probar si se había inactivado completamente el virus BVD. Se usó la misma preparación inactivada de BVD descrita anteriormente en este ejemplo.
Se inocularon dos novillos con vacuna no inactivada para actuar como control positivo para el grupo de vacuna, mientras que los 2 novillos restantes actuaron como animales "centinela" negativos para garantizar que no había ninguna transmisión de pestivirus natural que se producía de manera natural dentro del grupo vacunado de animales. Los animales de control positivo (inoculados con virus vivo, infeccioso) recibieron cada uno 5 ml de la preparación viral no inactivada (la cosecha viral original tal como se describió anteriormente) y se hicieron pasar en condiciones de cuarentena, por separado, para evitar que infectaran a otros animales cuando desarrollaron una viremia transitoria tras la infección (normalmente a los 4-7 días tras recibir el virus BVDV vivo). Se midieron los niveles de anticuerpos en los 10 animales usando un ELISA validado, competitivo, desarrollada en el EMAI. Esta prueba ha sido validada independientemente por CSL Ltd. y se comercializa por IDEXX Scandinavia en Europa.
Los seis animales en el primer grupo recibieron cada uno una inyección subcutánea de 4,5 ml de la preparación de BVDV inactivado, incorporada en un adyuvante comercial. Ya que cada ml de la preparación inactivada contenía 10^{6,8} equivalentes virales, la carga viral total antes de la inactivación fue de 10^{7,4} dosis infecciosas de cultivo tisular (DICT)_{50}. Los animales de control positivo recibieron 5 ml cada uno de la preparación no inactivada, es decir, 10^{7,5} DICT_{50} inyectados por vía subcutánea del mismo modo que para el primer grupo. A los dos animales "centinela" restantes no se les administró ningún antígeno viral, haciéndolos pastar con el primer grupo de animales en todo el ensayo para garantizar que no se producía actividad de pestivirus natural en el grupo mientras tuvo lugar el ensayo.
No hubo desarrollo de anticuerpos en ninguno de los novillos vacunados que recibieron la preparación de virus BVD inactivado hasta que se administró una segunda dosis de vacuna. Por tanto, a las 2 y 4 semanas tras una dosis única, ninguno de los 6 novillos mostró seroconversión, lo que muestra que no quedaba virus infeccioso en un volumen total de 27 ml de la preparación de virus inactivado. Esto es el equivalente de una inactivación total de 10^{8,2} DICT_{50}. En cambio, hubo altos niveles tanto de anticuerpos anti-E2 (anticuerpos de neutralización) como de anticuerpos anti-NS3, tanto a las 2 como a las 4 semanas tras la inoculación en los 2 animales que recibieron 5 ml cada uno de la preparación viral antes de la inactivación. Esto confirmó la naturaleza infecciosa del virus antes de la inactivación. Estos resultados in vivo confirman los hallazgos de la prueba de cultivo tisular in vitro. Los 2 animales "centinela" permanecieron seronegativos en todo el ensayo mostrando que el rebaño permaneció libre de infecciones de pestivirus natural.
El panel de anticuerpos monoclonales usado detectó anticuerpos de huésped dirigidos contra la glucoproteína (E2) de envoltura principal que es una glucoproteína incorporada en la envoltura lipídica del virus intacto. Los sistemas de prueba también detectaron anticuerpos dirigidos contra la proteína no estructural, NS3, que se fabrica dentro de células infectadas por el virus. Esta proteína tiene papeles reguladores principales en la replicación viral y no está presente dentro del virus infeccioso. No hubo evidencia de proteínas virales intactas presentes. No hubo evidencia en el ganado vacunado de que hubiera virus infeccioso presente, lo que indica que se habían destruido todas las partículas virales infecciosas. Todos los pestivirus son virus de ARN. Por lo tanto, no hubo ADN viral presente en la preparación inactivada.
Ejemplo 3 Preparación de BVDV inactivada como vacuna en novillos
Se volvió a inyectar a los seis novillos que había recibido una dosis inicial de 4,5 ml de la preparación de BVDV inactivada descrita en el ejemplo 2, por vía subcutánea una dosis similar a las 4 semanas tras la primera dosis de sensibilización. En este momento no había ninguna respuesta de anticuerpos tras la dosis única. Normalmente los animales reaccionan tras la segunda dosis. Se observaron fuertes respuestas anamnésicas para los niveles de anticuerpos anti-E2 (equivalente a los anticuerpos de seroneutralización SNT) en 3 de los 6 novillos a las 2 semanas tras la segunda dosis del virus inactivado. Esta respuesta fue más del 70% de inhibición en un ELISA competitivo. Los 3 animales restantes mostraron respuestas de anticuerpos débiles (el 23-31% de inhibición).
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Al contrario que las respuestas de anticuerpos anti-E2, sólo un animal desarrolló una fuerte respuesta de anticuerpos anti-NS3 (el 93% de inhibición) a las 2 semanas tras la segunda dosis de BVDV inactivado. Un segundo animal tuvo una respuesta de anti-NS3 débil (el 29% de inhibición) y 4 animales no mostraron anticuerpos tras la administración de 2 dosis. Esto no era inesperado ya que se han observado previamente respuestas similares tras la administración de vacunas de BVDV inactivado. Los niveles de anticuerpos en novillos tras 2 dosis de la preparación de BVDV inactivada demuestran su potencial como vacuna ya que podían medirse niveles de anticuerpos anti-E2 en los 6 novillos vacunados a las 2 semanas tras la segunda dosis.
Ejemplo 4 Análisis ultraestructural de partículas de virus Flavivirus Kunjin antes y después de tratamiento de eliminación de lípidos
Se realizó la eliminación de lípidos con diisopropil éter (DIPE) / butanol y DIPE solo durante 60 min., 1 min. y 30 segundos. Se usaron técnicas inmunocitoquímicas ultraestructurales habituales. Se usó albúmina de suero bovino como solución de bloqueo a una concentración del 1% y se diluyeron los anticuerpos en esta solución y se incubaron con las muestras durante 15 min. a temperatura ambiente. Se adquirió la proteína A marcada con oro de Biocell, RU.
No se detectó infectividad ni partículas de virus visibles mediante ME, incluso tras el tratamiento durante 30 segundos. No se observaron partículas de virus para las muestras inactivadas. Se cree que la destrucción de la envoltura viral se produce demasiado rápido para su observación.
Sin embargo, cuando se usó una muestra tratada sin purificar (es decir, fluido de cultivo tisular infectado), aunque no había partículas de virus presentes, pudieron observarse algunas de las proteínas de manera ultraestructural junto con anticuerpos monoclonales marcados con oro específicos para la proteína E viral principal de la envoltura. El análisis ultraestructural para la visualización de partículas se basa realmente en que haya un título razonable de virus (aproximadamente 10^{6} partículas por ml). En un ensayo de infectividad, el tratamiento de eliminación de lípidos redujo la infectividad del virus y este procedimiento pareció ser dependiente del tiempo. Por lo tanto, el tratamiento redujo el título hasta un nivel que era inferior al necesario para la visualización por ME frecuente y por tanto sugiere que se disgregaron las partículas ya que no se observó ninguna. Aunque no se desea restringirse al siguiente enunciado, algunas partículas todavía estaban presentes tal como se muestra por la infectividad pero cuanto más largo era el tratamiento, más inactivación, y probablemente disgregación, se producía.
Ejemplo 5 Suero positivo para DHBV sin lípidos como vacuna para prevenir la infección por DHBV
Se examinó la eficacia del procedimiento de eliminación de lípidos para proporcionar una vacuna frente al virus de la hepatitis B del pato (DHBV).
Se obtuvieron aproximadamente 16 patos jóvenes Pekín cruzados obtenidos de una bandada negativa para DHBV de patos jóvenes de un día desde la eclosión. Se sometieron los patos jóvenes a prueba y se determinó que eran negativos para DHBV mediante análisis de ADN de DHBV usando hibridación de transferencia puntual. Se dividieron los patos en tres grupos: el grupo 1 contenía seis patos que recibieron la vacuna de prueba; el grupo 2 consistía en cuatro patos vacunados con DHBV inactivado con glutaraldehído, este grupo se denomina vacunación simulada; el grupo 3 consistía en seis patos que se vacunaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), estos se consideraron como patos con vacunación fingida usados como control para el procedimiento de vacunación. La inactivación con glutaraldehído se logró mediante fijación con una solución diluida de glutaraldehído a aproximadamente 1:250.
Procedimiento de eliminación de lípidos
Se empleó un sistema de disolventes orgánicos para realizar la eliminación de lípidos del suero. El sistema de disolventes consistía en una razón del 40% de butanol (calidad para reactivo analítico) y el 60% de diisopropil éter. Se mezcló este disolvente con suero con una razón de 2:1. En consecuencia, se mezclaron 4 ml del disolvente orgánico con 2 ml del suero y se hicieron rotar durante 1 hora. Se centrifugó esta mezcla a aproximadamente 400 x g durante 10 minutos y se retiró la fase acuosa. Entonces se mezcló la fase acuosa con un volumen igual de dietil éter y se centrifugó a 400 x g durante 10 minutos. A continuación, se retiró la fase acuosa y se mezcló con un volumen igual de dietil éter y se realizó una rotación continua a 30 rpm durante aproximadamente 1 hora, y se centrifugó a 400 x g durante 10 minutos. Se retiró la fase acuosa y se eliminó el dietil éter residual mediante evaporación en una campana extractora durante aproximadamente de 10 a 30 minutos. Lo que quedó tras la eliminación del dietil éter se consideró el suero tratado y se usó para producir la vacuna. Los controles para el procedimiento de eliminación de lípidos incluyeron someter el suero negativo para DHBV al mismo procedimiento de eliminación de lípidos que el suero positivo para DHBV.
\newpage
Producción de vacunas
Vacuna de prueba:
1ª dosis - Se mezcló una alícuota de 40 \mul del suero sin lípidos con 1960 \mul de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
2ª dosis - Se mezcló una alícuota de 40 \mul del suero sin lípidos con 1960 \mul de PBS y luego se emulsionó en 1000 \mul de adyuvante incompleto de Freund.
3ª dosis - Se mezcló una alícuota de 200 \mul del suero sin lípidos con 1800 \mul de PBS y luego se emulsionó en 1000 \mul de adyuvante incompleto de Freund.
Vacunación simulada o control de suero de DHBV:
1ª dosis - Se mezcló una alícuota de 200 \mul de combinación de suero positivo para DHBV nº 4 (20.4.99) con 300 \mul de PBS y 100 \mul de una solución de glutaraldehído al 2% (Aidal Plus de Whiteley Chemicals) y se incubó durante 10 minutos para inactivar el DHBV. Se añadió una alícuota de 40 \mul de la mezcla de suero inactivado / PBS a 1960 \mul de PBS.
2ª y 3ª dosis - Se mezcló una alícuota de 200 \mul de combinación de suero positivo para DHBV nº 4 (20.4.99) con 300 \mul de PBS y 100 \mul de Aidal Plus (Whiteley Chemicals) y se incubó durante 10 minutos para inactivar el DHBV. Se añadió una alícuota de 40 \mul de la mezcla de suero inactivado / PBS a 1960 \mul de PBS y se emulsionó en 1000 \mul de adyuvante incompleto de Freund.
Vacunación fingida o control negativo:
1ª dosis - PBS
2ª y 3ª dosis - Se emulsionó una alícuota de 200 \mul de PBS en 1000 \mul de adyuvante incompleto de Freund.
Procedimiento experimental
Fecha de eclosión: 23.10.00
Protocolo de vacunación: 1ª dosis - Se inyectaron a los patos 200 \mul de la vacuna respectiva en la cavidad peritoneal el día 8 tras la eclosión. 2ª dosis - Se vacunaron los patos con 300 \mul de la vacuna respectiva por vía intramuscular el día 16 tras la eclosión. 3ª dosis - Se vacunaron los patos con 300 \mul de la vacuna respectiva por vía intramuscular el día 22 tras la eclosión.
Se expusieron los patos a 10000 \mul de suero positivo para DHBH (combinación de suero 20.1.97) el día 29 tras la eclosión. Se mostró que la combinación de suero 20.1.97 tenía 1,8 x 10^{10} equivalentes genómicos (gev)/ml mediante hibridación de transferencia puntual. Un gev es aproximadamente una partícula viral.
Se extrajo sangre a los patos antes de la vacunación en los días 1 y 10, antes de la exposición en los días 17 y 23, y tras la exposición en los días 37, 43 y 52. Se sometió su suero a prueba para determinar el ADN de DHBV mediante hibridación de transferencia puntual tal como se describe por Deva et al. (1995). Se sacrificaron los patos el día 58 y se extirparon sus hígados, y se extrajo el ADN y se sometió a prueba para determinar la presencia de DHBV mediante hibridación de transferencia puntual tal como se describe por Deva et al. (1995).
Resultados
Patos de prueba Cinco de los 6 patos de prueba vacunados con la vacuna de prueba permanecieron negativos para ADN de DHBV en el suero y el hígado tras la exposición. Un pato de prueba se volvió positivo para DHBV tras la exposición.
Patos con vacunación simulada Los cuatro patos vacunados con suero inactivado con glutaraldehído se volvieron positivos para DHBV tras la exposición a DHBV.
Patos con vacunación fingida
Cinco de los 6 patos de control negativo con vacunación fingida se volvieron positivos para DHBV tras la exposición.
Se usó el análisis de chi-cuadrado para comparar las diferencias entre tratamientos. Significativamente más patos de control (con vacunación fingida) se volvieron positivos para DHBV tras la exposición que los patos vacunados con suero sin lípidos (p < 0,05).
La vacunación de los patos jóvenes con suero positivo para DHBV sin lípidos usando el protocolo anterior dio como resultado la prevención de la infección por DHBV tras la exposición a suero positivo para DHBV en 5 de 6 patos jóvenes. Esto sugiere que la vacuna de suero sin lípidos puede inducir inmunidad en patos vacunados. En comparación, 5 de los 6 patos con vacunación fingida y 4 de los 4 con vacunación simulada se volvieron positivos para DHBV tras la vacunación, lo que sugiere que no hubo inducción de inmunidad en esos patos.
Debe entenderse, por supuesto, que lo anterior se refiere sólo a realizaciones preferidas de la presente invención y que pueden hacerse numerosas modificaciones o alteraciones a las mismas sin apartarse del espíritu y alcance de la invención tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (17)

1. Método para reducir los niveles de un microorganismo infeccioso que contiene lípidos en un fluido acuoso que comprende:
poner en contacto el fluido acuoso que contiene el microorganismo infeccioso que contiene lípidos con un primer disolvente orgánico, seleccionado del grupo de alcohol que tiene \geq 5 átomos de C, éter, amina, hidrocarburos o combinación de los mismos o una combinación de un alcohol que tiene de 1 a 8 átomos de C con éter, amina, hidrocarburos o una combinación de los mismos en una razón en la que el primer disolvente está presente en una cantidad eficaz para solubilizar sustancialmente el lípido en el microorganismo infeccioso;
mezclar el fluido acuoso con dicho primer disolvente;
permitir que se separen las fases orgánica y acuosa; y
recoger la fase acuosa que contiene el microorganismo infeccioso con un contenido en lípidos reducido.
2. Método según la reivindicación 1, que comprende además
poner en contacto la fase acuosa con un agente desemulsionante que puede eliminar el primer disolvente orgánico; y
separar el agente desemulsionante que contiene el primer disolvente orgánico eliminado de la fase acuosa en contacto.
3. Método según la reivindicación 1 o 2, que comprende además añadir células a la fase acuosa que contiene el microorganismo infeccioso con un contenido en lípidos reducido.
4. Método según la reivindicación 3, en el cual el fluido es sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, líquido peritoneal, líquido folicular, líquido amniótico, líquido pleural, líquido pericárdico o líquidos reproductores.
5. Método para preparar una vacuna que comprende:
poner en contacto un microorganismo infeccioso que contiene lípidos en un fluido acuoso con un primer disolvente orgánico, seleccionado del grupo de alcohol que tiene \geq 5 átomos de C, éter, amina, hidrocarburos, tensioactivos y ésteres o una combinación de los mismos o una combinación de un alcohol que tiene de 1 a 8 átomos de C con éter, amina, hidrocarburos o una combinación de los mismos;
mezclar el fluido acuoso y el primer disolvente orgánico durante un tiempo suficiente como para extraer los lípidos del microorganismo infeccioso que contiene lípidos;
permitir que se separen las fases orgánica y acuosa; y recoger la fase acuosa que contiene el microorganismo infeccioso con un contenido en lípidos reducido.
6. Método según la reivindicación 5, que comprende además:
poner en contacto la fase acuosa con el agente desemulsionante que puede eliminar el primer disolvente orgánico; y
separar el agente desemulsionante y el primer disolvente orgánico eliminado de la fase acuosa en contacto.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el microorganismo infeccioso que contiene lípidos es un virus, bacteria, protozoo u hongo.
8. Método según la reivindicación 7, en el que el microorganismo infeccioso es un virus y el virus es el virus de inmunodeficiencia, hepatitis o pestivirus.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el primer disolvente orgánico es una combinación de un alcohol y un éter.
10. Método según la reivindicación 9, en el que el éter es un éter de C_{4} a C_{8} y el alcohol es un alcohol de C_{1} a C_{5}.
11. Método según la reivindicación 2 o 6, en el que el agente desemulsionante es un éter.
12. Composición de vacuna que puede obtenerse según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, que comprende un microorganismo infeccioso sustancialmente sin lípidos y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. Composición de vacuna según la reivindicación 12, que comprende además un inmunoestimulante.
14. Uso de una mezcla de disolventes orgánicos que comprende diisopropil éter y butanol para la eliminación de lípidos de un microorganismo infeccioso que contiene lípidos en un fluido.
15. Uso de una mezcla de disolventes orgánicos que comprende diisopropil éter y butanol para la preparación de un sistema de disolventes para tratar sangre infectada por un microorganismo infeccioso que contiene lípidos.
16. Uso de una mezcla de disolventes orgánicos que comprende diisopropil éter y butanol para la preparación de una composición de vacuna que comprende un fluido que contiene niveles reducidos de un microorganismo infeccioso que contiene lípidos.
17. Uso según la reivindicación 14 o 16, en el que el fluido es sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático o líquido peritoneal obtenido de un animal o un ser humano.
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