ES2261870T3

ES2261870T3 - Procedimiento para la preparacion de un sistema de liberacion controlada.

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Publication number: ES2261870T3
Application number: ES03077121T
Authority: ES
Inventors: Wilhelmus Everhardus Hennink; Okke Franssen
Original assignee: Octoplus BV
Current assignee: Octoplus BV
Priority date: 1996-11-19
Filing date: 1997-11-17
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2017-11-17
Also published as: EP0941068B1; DE69729312T2; ES2222507T3; ATE322890T1; SI0941068T1; EP1371364A1; DE69735688T2; ATE267588T1; WO1998022093A1; EP1371364B1; AU5069798A; DE69729312D1; DK0941068T3; EP0941068A1; DE69735688D1

Abstract

Procedimiento para la preparación de un sistema de liberación controlada, que comprende: (a) disponer: (aa) un primer polímero soluble en agua, comprendiendo dicho primer polímero grupos reticulables e incorporando enlaces que son hidrolizables en condiciones fisiológicas; (bb) un segundo polímero soluble en agua que es incompatible con el primer polímero, en solución acuosa; y (cc) un material de proteínas liberable; (b) formar un sistema acuoso de dos fases que comprende una fase dispersa que comprende el primer polímero, y una fase continua que comprende un segundo polímero; (c) permitir que el material de proteínas liberable se disuelva en la fase dispersa o se difunda en la misma; (d) reticular el primer polímero para obtener microesferas, teniendo como mínimo 80% en peso del mismo un tamaño de partículas comprendido entre 100 nanómetros y 100 m, de manera que la etapa (c) puede ser llevada a cabo antes o después de la etapa (d), a condición de que cuando se lleva a cabo la etapa (c) después de la etapa (d) el primer polímero es un polímero sensible a la temperatura.

Description

Procedimiento para la preparación de un sistema de liberación controlada.

La presente es una solicitud divisional de la EP-A-0 941 068.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un sistema que tiene un buen comportamiento de liberación controlada.

Los rápidos avances en el campo biotecnológico conducen a un gran número de productos farmacéuticamente interesantes, especialmente proteínas, péptidos y genes. Tales productos se pueden utilizar adecuadamente en el tratamiento de enfermedades mortales, por ejemplo, cáncer, y varios tipos de enfermedades víricas, bacterianas y parasitarias.

Debido a su naturaleza, las proteínas y los productos proteináceos, por ejemplo, péptidos, a cuyo grupo de productos se hace referencia en esta patente a partir de ahora como fármacos de proteína, no se pueden administrar oralmente de forma eficiente. Se tienen que administrar parenteralmente en el sistema, es decir, mediante inyección. El perfil farmacocinético de estos productos es tal, que la inyección del producto por sí misma requiere una administración frecuente. En otras palabras, dado que los fármacos de proteína son química y físicamente inestables en el tracto gastrointestinal y generalmente tienen un tiempo de residencia activo corto en el cuerpo humano o animal, se requieren múltiples inyecciones en un periodo de tiempo corto para conseguir un efecto terapéutico. Será evidente que esto es un inconveniente para pacientes que requieren estos fármacos de proteínas.

Por esta razón, existe una necesidad de sistemas de suministro que tengan capacidad de liberación sostenida. Se han propuesto una serie de opciones en esta técnica, a la vez que se utilizan polímeros bastante bien definidos, sintéticos biodegradables, para controlar la liberación de los fármacos encapsulados.

Una de las opciones descritas anteriormente en la técnica es el uso de microesferas y nanoesferas hechas de polímeros. Estas microesferas o nanoesferas son partículas esféricas, cápsulas esféricas, nanocápsulas o nanopartículas que tienen un diámetro de partícula entre 0,1 \mum y 100 \mum. En esta descripción y en las reivindicaciones, la referencia a microesferas también abarca micropartículas, microcápsulas, nanoesferas, nanopartículas y nanocápsulas. Los polímeros ampliamente usados para preparar estas microesferas son ácido poliláctico y copolímeros de ácido láctico con ácido glicólico. Los polímeros deberían ser biodegradables para evitar la eliminación del transportador de polímeros después de su uso.

Los métodos de preparación hasta ahora conocidos para fármacos que contienen sistemas de liberación sostenida o controlada generalmente implican el uso de disolventes orgánicos. Los disolventes orgánicos pueden conducir a cambios estructurales en la estructura de la proteína, especialmente en la estructura secundaria y terciaria. Dichos cambios pueden llevar a una desnaturalización del fármaco de proteína. Dado que estos cambios estructurales normalmente conducen a una pérdida en la actividad farmacológica y a la aparición de efectos secundarios indeseados, tal como es evidente, dichos cambios son indeseables. Además, el uso de disolventes orgánicos tampoco es deseable desde un punto de vista medioambiental.

Además, es casi imposible evitar que las trazas de disolventes orgánicos permanezcan en el interior o sobre las microesferas producidas. Especialmente, esto es un problema cuando se utilizan disolventes tóxicos, tales como los disolventes ampliamente usados, cloroformo y diclorometano.

Otro problema es que es difícil encapsular proteínas en matrices poliméricas de una forma reproducible. Es de suma importancia que se liberen cantidades predecibles y reproducibles de proteínas u otros productos encapsulados para ser utilizados como fármacos.

También se han utilizado hidrogeles en la preparación de sistemas de suministro para fármacos de proteína. Uno de estos sistemas comprende dextranos reticulados obtenidos mediante la polimerización radical de dextrano derivado de glicidil metacrilato (dex-GMA). A este respecto, se hace referencia a Van Dijk-Wolthuis y otros en Macromolecules 28, (1995), 6317-6322 y a De Smedt y otros en Macromolecules 28, (1995) 5082-5088.

Se observó que la liberación de las proteínas a partir de estos hidrogeles depende del grado de reticulación y del contenido inicial de agua en el gel y se puede controlar por los mismos (Hermink y otros, J. of. Contr. Rel. 39 (1996), 47-57).

Durante la biodegradación del material polimérico y/o por difusión se liberan los fármacos comprendidos en estos hidrogeles o microesferas poliméricas.

Normalmente, los fármacos se cargan en los hidrogeles o microesferas derivadas de éstos mediante equilibrado en una solución que contiene el fármaco, seguido de secado (ver, por ejemplo, Kim y otros en Pharm. Res. 9(3) (1992) 283-290), o mediante la incorporación del fármaco durante la preparación del hidrogel o las microesferas (ver, por ejemplo, Heller y otros en Biomaterials 4 (1983) 262-266). Ambas técnicas tienen una serie de inconvenientes aparte de los que surgen por cualquier disolvente orgánico utilizado.

La carga por equilibrado normalmente conduce a un contenido bastante bajo de fármaco en el sistema de suministro. Éste es especialmente el caso cuando el fármaco es un compuesto macromolecular. A menos que el tamaño del poro del hidrogel o la microesfera sea bastante grande, las macromoléculas sólo se adsorberán sobre la superficie exterior, la cual puede, después de la aplicación, conducir a una liberación súbita en el sistema animal o humano. Además, la fase del disolvente que contiene el fármaco, la cual está en contacto con el sistema de suministro para cargar el sistema de suministro, se tiene que eliminar del hidrogel o las microesferas. Esto puede producir la migración del fármaco a la superficie del sistema de suministro, y por lo tanto a una distribución no homogénea del fármaco. Esto tiende a dar lugar a una liberación súbita significativa del fármaco, que generalmente tampoco se desea.

Está dirigida a un proceso de carga adecuado para la incorporación de fármacos macromoleculares.

En un artículo en Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 22 (1995), 145-146, Gehrke y otros han descrito una técnica en la que cargando niveles mayores que los obtenibles por absorción de solución, por tanto mayor de 0,1% en peso, se pueden conseguir en hidrogeles preformados, purificados. La técnica de carga se basa en el hecho de que ciertas mezclas de polímeros se dividen en fases separadas al disolverse en agua. Las proteínas disueltas en tal sistema se distribuyen de forma no uniforme entre las fases. Este principio también se mantiene cuando una de las fases del polímero es un gel reticulado.

En particular, Gehrke y otros describen un sistema de gel de dextrano reticulado/poli (etilén glicol), y un sistema de gel hidroxipropilcelulosa reticulado/poli (vinil alcohol). Las proteínas presentes en una solución acuosa que contiene perlas de gel, tras la adición del segundo polímero no reticulado, se adsorben sobre las perlas y parcialmente se absorben a través de las mallas o poros en las superficies de las perlas.

Un inconveniente de esta técnica es que el material proteináceo, en una mayor extensión, sólo se adsorbe en las perlas, lo cual significa que si la fase que contiene el segundo polímero se reemplaza por otro sistema acuoso, se observa una rápida eliminación de las proteínas de las perlas. Sólo cuando en las superficies de las perlas están presentes amplias cantidades de poros con un diámetro mayor que el tamaño del material proteináceo a cargar, puede tener lugar algo de absorción. Este comportamiento de adsorción y absorción limitada tiene un efecto indeseable en la liberación del material proteináceo de las perlas.

Para mostrar adicionalmente el comportamiento de liberación indeseado, se observa que los perfiles mostrados en el artículo son -desde un punto de vista farmacológico- completamente inadecuados para usar en sistemas de liberación controlada. Además, las perlas de gel son demasiado grandes (cilindros con un diámetro de 1,5 mm) para usarse adecuadamente en la administración en el cuerpo humano o animal.

En la patente EP-A-0 213 303 se describe un método para producir partículas esféricas de polímero en sistemas que contienen dos fases acuosas líquidas. Una de las dos fases se dispersa en la otra fase en forma de gotitas para formar una emulsión. Posteriormente, las gotitas provocan la solidificación. En la fase a dispersar, se puede disolver una sustancia macromolecular. Además, sustancias de bajo peso molecular, tales como medicamentos, vacunas e insecticidas, se pueden unir químicamente a la partícula que forma la sustancia en la fase dispersada. No se comenta nada sobre el comportamiento de la liberación de la sustancia disuelta, ni sobre la aplicación de las partículas esféricas de polímero formadas o del tamaño de éstas.

El principio de división por afinidad en sistemas de dos fases que contienen PEG también es conocido de Göte Johansson, Affinity Partitioning in PEG-containing Two-Phase Systems In: Topics in Applied Chemistry; Poly (ethylene glycol) chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications, Ed. J.M. Harris, Plenum Press (1992). En este artículo, se describe un sistema de dos fases, el cual se crea cuando se mezclan una solución acuosa de dextrano y polietilén glicol (PEG). Se forman una fase enriquecida en PEG y una fase enriquecida en dextrano. Las proteínas se dividen de forma desigual en dichos sistemas. Estos conocidos sistemas se utilizan para la purificación de
proteínas.

En la patente WO-A-95/34328 se describe un sistema de suministro bioerosionable para la liberación controlada de productos medicinales. Comprende, como mínimo, una proteína seleccionada entre gelatina y albúmina; un estabilizador polimérico, tal como un polisacárido o un polinucleótido, y/o un reticulante externo, tal como un diimidato; y opcionalmente, una enzima capaz de degradar la proteína o el polisacárido.

La patente WO-A-96/02239, a nombre de Gehrke y otros, muestra un método para cargar un fármaco en una red de polímeros reticulados. Dicho método comprende poner en contacto un soluto biológicamente activo con una red de gel, un polímero protector que es parcialmente inmiscible en el gel, y una sal protectora. De esta manera, el soluto biológico se divide selectivamente en el gel.

En la patente WO-A-96/03147 se describe un método para sintetizar hidrogeles o geles químicos a partir de polisacáridos polielectrolitos. El polisacárido polielectrolito se funcionaliza para introducir dobles enlaces que tras someterlos a irradiación \gamma forman reticulaciones.

La solicitud de patente internacional 96/40071 muestra un método para fabricar cápsulas de volumen mínimo que contienen material biológico mediante la utilización de un sistema acuoso de emulsión de dos fases. La composición de la emulsión se ajusta para provocar la absorción de partículas dirigidas termodinámicamente, siendo estas partículas, células viables o agregados celulares.

Además, Moriyama & Yui describen en J. Control. Release 42 (1996) 237-248, hidrogeles de dextrano biodegradables que contienen polietilén glicol. No se describen micropartículas.

La presente invención está dirigida a dar a conocer un nuevo sistema inyectable de suministro de fármacos de proteínas, fácilmente tolerable por el paciente, en el que el sistema es seguro y biodegradable, y en el que el sistema posee una cinética de suministro perfectamente controlable. El periodo durante el que el suministro del fármaco se debería garantizar depende del fármaco de proteína utilizado, y varía entre unos días hasta más de un año. Adicionalmente, se deberían obtener grados elevados de carga en el sistema de suministro. Además, el sistema de la presente invención se debería producir sin necesidad de utilizar disolventes orgánicos.

Los problemas mencionados anteriormente se solucionan mediante microesferas específicas obtenibles a partir de un método de preparación específico de sistemas de liberación controlada, en el que se utiliza agua como disolvente. La utilización de agua como sistema de disolvente único es ventajosa desde un punto de vista medioambiental, a causa de consideraciones toxicológicas y, especialmente, a causa de razones de estabilidad de la proteína.

En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un sistema de liberación controlada que comprende:

(a): disponer:

(aa): un primer polímero soluble en agua, comprendiendo dicho primer polímero grupos reticulables e incorporando enlaces hidrolizables en condiciones fisiológicas;

(bb): un segundo polímero soluble en agua que es incompatible con el primer polímero en una solución acuosa; y

(cc): un material de proteínas liberable;

(b): formar un sistema acuoso de dos fases que comprende una fase dispersa que comprende a su vez el primer polímero y una fase continua que comprende el segundo polímero;

(c): permitir que el material liberable de proteínas se disuelva en la fase dispersa o se difunda en la misma;

(d): reticular el primer polímero para obtener microesferas, teniendo, como mínimo el 80% en peso de las mismas unas dimensiones de partículas comprendidas entre 100 nanómetros y 100 \mum, de manera que la etapa (c) puede ser llevada a cabo antes o después de la etapa (d), a condición de que cuando se lleva a cabo la etapa (c) después de la etapa (b) el primer polímero es un polímero sensible a la temperatura.

En una realización preferente, la reticulación se lleva a cabo hasta tal grado, que los poros (mallas) en la estructura reticulada finalmente formada son sustancialmente más pequeños que el tamaño del compuesto liberable. Mediante la emulsificación de un polímero acuoso reticulable en una fase continua comprendida de agua y un polímero que no es compatible con el polímero reticulable, y la reticulación de la fase discontinua, se puede ajustar el tamaño de partícula de las partículas de polímero reticulado, a la vez que la distribución del tamaño de partícula puede ser más estrecha, tal como se describe a continuación con más detalle.

Como mínimo, 80% en peso de las microesferas tiene un tamaño de partículas comprendido entre 100 nanómetros y 100 \mum, cuyas microesferas están formadas por un polímero degradable reticulado que encapsula, como mínimo, un compuesto liberable, siendo el tamaño de los poros del polímero reticulado, igual o preferentemente menor que el tamaño de las partículas del compuesto liberable. Estas microesferas se pueden obtener utilizando el procedimiento de la invención, y se encuentran libres de disolventes orgánicos.

Dependiendo de la aplicación de las microesferas, el tamaño se puede ajustar, por ejemplo, entre 1 y 50 \mum, preferiblemente entre 2 \mum y 25 \mum, tal como entre 5 y 15 \mum.

A causa de que los tamaños de los poros o mallas del polímero reticulado son iguales o más pequeños que el tamaño del diámetro hidrodinámico del componente liberable, éste se libera esencialmente cuando el polímero es degradado. Más en particular, en esta realización la estructura reticulada debe ser degradable en el cuerpo humano o animal, de manera que el compuesto liberable encapsulado puede dejar la matriz reticulada. Si, por otra parte, los tamaños de poros o rejillas del polímero reticulado son mayores que las dimensiones del componente liberable, el componente liberado, por lo menos parcialmente por difusión. El tamaño de poro del producto reticulado obtenido por el proceso de la presente invención proporciona una herramienta perfecta para controlar la liberación. Además, la eficiencia de la incorporación de un compuesto liberable en tal estructura del polímero es muy elevada, mientras que el grado de carga se puede ajustar hasta la concentración de saturación del compuesto a liberar.

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La degradabilidad de la estructura reticulada se puede regular de varias maneras. Como un primer ejemplo, se observa que se pueden incorporar enlaces, los cuales son hidrolizables bajo condiciones fisiológicas. En este aspecto, se puede hacer referencia a la solicitud de patente europea EP-B-0910412 del grupo de los presentes inventores. Esta solicitud de patente muestra hidrogeles que comprenden separadores hidrolíticamente lábiles entre diferentes cadenas de polímero. Los separadores hidrolíticamente hábiles descritos en esa solicitud se pueden utilizar adecuadamente en la presente invención.

Otro ejemplo para controlar la degradabilidad es la coencapsulación de una enzima o sustancia química capaz de romper enlaces en el polímero reticulado. En una realización preferente de la presente invención, el polímero reticulable es un polímero de dextrano. En esta realización, en el proceso de preparación se puede añadir una dextranasa al sistema acuoso de dos fases antes de la etapa de reticulación o se puede añadir posteriormente.

El polímero de dextrano se puede utilizar adecuadamente en el proceso para preparar las microesferas de la presente invención junto con un polietilén glicol o Pluronic®, el cual es un polímero preferente a utilizar en el proceso de la invención.

El producto de la presente invención se puede separar de la otra fase del polímero en el proceso de preparación utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, centrifugación y decantación.

En una primera etapa del proceso de preparación de las microesferas de la presente invención, se forma un sistema acuoso de dos fases. Este sistema de dos fases comprende agua y, como mínimo, dos polímeros solubles en agua, los cuales son incompatibles en solución. Preferiblemente, también está presente un compuesto a liberar, a pesar de que es posible añadir el compuesto a liberar después de la etapa de reticulación. Como mínimo, uno de los polímeros presentes en la fase acuosa es reticulable, y la fase del polímero reticulable se emulsifica en la otra fase acuosa del polímero.

Los polímeros utilizados se pueden elegir dependiendo de la naturaleza del compuesto a liberar. Es preferible que el compuesto a liberar tenga una clara preferencia por la fase del polímero reticulable. En ese caso, en las microesferas a fabricar, se puede obtener el mayor grado posible de carga, teóricamente hasta la concentración de saturación.

No es crítico el polímero reticulable que se utiliza. Sin embargo, si el sistema de liberación controlada que comprende el polímero en la forma reticulada se desea introducir en el interior del cuerpo humano o animal, el polímero debería ser farmacéuticamente aceptable y preferiblemente debería ser degradable. Los polímeros reticulables solubles en agua adecuados son dextranos y dextranos derivatizados, almidones y derivados de almidón, derivados de celulosa, tales como hidroxietil e hidroxipropil celulosa, polivinilpirrolidona, proteínas y proteínas derivatizadas, etcétera. El peso molecular de los polímeros reticulables utilizados se encuentra normalmente entre 1.000 y 1.000.000 Da. Se observa que con un peso molecular más elevado del polímero, se obtiene generalmente una mejor separación de fase en la solución acuosa utilizada en el proceso de la invención.

Los técnicos en la materia tendrán el conocimiento para elegir el polímero reticulable y las condiciones de reticulación requeridas para la emulsión preparada. Por ejemplo, los dextranos se pueden reticular con metacrilato o grupos de metacrilato. Otro ejemplo es un sistema que comprende PVP como fase externa y dextrano como fase emulsificada, en el que el dextrano se reticula por la presencia de isocianatos.

Además, se hace referencia a reticulación que utiliza radiación. Dex-GMA se puede, por ejemplo, polimerizar utilizando pequeñas dosis de radiación \gamma, tales como menores de 0,1 Mrad. Una ventaja de esta realización es que se pueden obtener micropartículas estériles en una etapa. Además, son posibles técnicas de reticulación mediante radiación UV y reticulación física utilizando, por ejemplo, colas hidrofóbicas acopladas a un polímero.

En una realización preferente, el polímero reticulable es un polímero sensible a la temperatura, tal como poli-N-isopropil-acrilamida, el cual puede estar presente, por ejemplo, como un injerto en otro polímero, tal como un dextrano. Los hidrogeles de estos polímeros muestran un comportamiento de hinchamiento creciente al disminuir las temperaturas. Esto hace posible que el material liberable pueda penetrar fácilmente en el hidrogel después de la reacción de reticulación. Mediante el posterior aumento de la temperatura, por ejemplo, hasta un valor de 37ºC, las mallas del hidrogel se encogen, capturando así el compuesto liberable.

El polímero que está presente en la fase continua acuosa puede ser cualquier polímero que sea incompatible con el polímero reticulable. A pesar de que este polímero puede ser también reticulable, pero, desde luego, no bajo las condiciones de reacción utilizadas para la reticulación de la fase discontinua del polímero, esto no es preferente. Algunos ejemplos de polímeros adecuados incompatibles con el polímero a reticular son poli(etilén glicol) (PEG) y poli(vinil alcohol) (PVA) (en combinación con, por ejemplo, dextranos y derivados de dextrano, almidones y derivados de almidón, PVP, y derivados de celulosa solubles en agua).

La liberación del compuesto liberable depende de un número de variables, las cuales se pueden utilizar para diseñar el suministro como se desee. Una de estas variables es el tamaño de las microesferas. El tamaño se puede ajustar mediante la modificación cuidadosa de las circunstancias del proceso y los parámetros de formulación en la etapa de emulsificación. Por ejemplo, el contenido de agua, la presencia de grupos hidrofóbicos en cualquiera de los polímeros o mezclas de polímeros utilizados, la viscosidad de la fase continua y discontinua, y la carga eléctrica en, como mínimo, dos polímeros utilizados, son ejemplos de herramientas para ajustar el tamaño de las microesferas o micropartículas a fabricar. Además, se pueden añadir emulsificadores. Algunos emulsificadores adecuados son copolímeros, preferiblemente copolímeros bloque, de unidades de los dos polímeros incompatibles, por ejemplo, un copolímero bloque de PEG y dextrano, utilizado para crear el sistema de dos fases.

Para garantizar adicionalmente una liberación controlada, el polímero reticulado debería ser preferiblemente degradable.

Como se dijo en esta patente anteriormente, es importante que los dos polímeros solubles en agua sean incompatibles entre sí, de manera que se obtiene un sistema de dos fases después de que los dos polímeros se hayan añadido uno a otro en una solución acuosa. El obtener o no un sistema de dos fases depende no sólo de la naturaleza de los dos polímeros implicados, sino también de las condiciones bajo las cuales se han añadido. Los factores que son importantes en este aspecto son el peso molecular de los polímeros, sus concentraciones en la solución acuosa, la temperatura a la que se añaden uno a otro, etcétera. Es parte de la experiencia normal del técnico determinar un diagrama de fases para cualquier combinación de polímeros que se puedan utilizar y, de este modo, elegir las condiciones adecuadas para obtener una separación de fases.

En la figura 9 adjunta se muestra como ejemplo un diagrama de fases de un sistema ternario agua/PEG/dextrano. Cuando una composición inicial está por debajo de la línea binodal (- - -), se produce un sistema de una fase, mientras que por encima de la línea binodal, se forman dos fases coexistentes: una enriquecida en el polímero 1 (composición x_{1}) y la otra enriquecida en el polímero 2 (composicición x_{2}). X_{1} y x_{2} se unen a través de una línea de conexión (___). Todos los sistemas preparados que utilizan composiciones iniciales en la misma línea de conexión se separan en fases de composición constante. Para una composición inicial dada, la proporción en volumen de las fases coexistentes x_{1}/x_{2} es igual a y_{2}/y_{1}.

Tal como se indicó anteriormente en esta patente, el compuesto liberable puede ser un fármaco de proteína. Sin embargo, también es posible encapsular medicamentos que contengan nanopartículas o micropartículas, por ejemplo, liposomas e iscoms. La encapsulación de este tipo de partículas tiene la ventaja de impedir la liberación demasiado rápida del compuesto encapsulado, o, dicho con otras palabras, se pueden evitar los efectos de la liberación súbita de una forma más segura.

La división del compuesto a liberar está determinada principalmente por la naturaleza de los polímeros presentes en el sistema acuoso de dos fases. Se puede influir en esta división, por ejemplo, mediante la adición de sal al sistema acuoso, o mediante el ajuste del pH.

Si los compuestos liberables, tales como proteínas, están presentes durante la etapa de reticulación, se debe tener cuidado de que la integridad de los compuestos liberables sea segura. Se debería evitar, por ejemplo, que el material proteináceo se oxidara por sistemas iniciadores, etc. En vista de esto, se observa que los efectos adversos se pueden evitar o minimizar minimizando la cantidad de iniciador, reduciendo el tiempo de polimerización o añadiendo antioxidantes adecuados, tales como \alpha-tocoferol.

La separación de las estructuras reticuladas que recubren el compuesto liberable de la otra fase se puede llevar a cabo de cualquier modo convencional. Preferiblemente, la separación se efectúa mediante filtrado o centrifugación. Las estructuras reticuladas, posteriormente, se pueden lavar con agua y secar. La etapa de secado determina que se pueda obtener un producto farmacéuticamente aceptable, con un periodo de conservación de más de 2 años. Un método de secado muy preferente es el secado por pulverización, aunque el secado también se puede llevar a cabo adecuadamente utilizando liofilización.

La presente invención se mostrará ahora más en detalle mediante la preparación de microesferas de dextrano utilizando la técnica de emulsión de agua-en-agua, y por los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Se obtuvieron polietilén glicoles (PEG) con pesos moleculares diversos de Merck-Schuchardt, Alemania. Se sintetizaron dextranos derivatizados de glicidil metacrilato (dex-GMA) con diversos DS (grado de sustitución; el número de grupos metacrilato por cada 100 residuos de glucopiranosa) mediante una reacción de acoplamiento de dextrano T40 y glicidil metacrilato en DMSO (dimetilsulfóxido) utilizando DMAP (N,N-dimetilaminopiridina) como catalizador, esencialmente como se describió por Van Dijk-Wolthuis y otros en Macromolecules 28, (1995) 6317-6322.

El dex-PEG se sintetizó como se indica a continuación. Se disolvieron mPEG (monometoxipolietilén glicol, M 5000 g/mmol, 5 g, correspondientes con 1 mmol de grupos hidroxilo) y CDI (carbonildiimidazola, 162 mg, 1 mmol) en 100 ml de tetrahidrofurano anhidro. La solución se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente, seguido por la evaporación del disolvente bajo presión reducida. A continuación, el mPEG activado por la CI (carbonilimidazola) se añadió a una solución de dextrano T40 (1,7 g) y DMAP (0,35 g) en 50 ml de DMSO. Esta solución se agitó durante una semana a temperatura ambiente. Tras la neutralización de la DMAP con HCl, la solución se dializó extensamente frente a agua y posteriormente se secó por congelación. El producto se caracterizó mediante una cromatografía de permeación en gel y RMN. El grado de sustitución ascendió a 4. La Dex-lactato-HEMA (DS 3) se sintetizó como se describió en la solicitud de patente europea EP-B-0 910412.

Se disolvió polietilén glicol (PEG, peso molecular variable) en KCl 0,22M hasta una concentración del 12-40% (w/w) ("peso/peso"). El dex-GMA se disolvió en KCl 0,22M hasta una concentración del 10-40% (w/w). Ambas soluciones se lavaron con nitrógeno durante 10 minutos. A continuación, se mezclaron 4,75 ml de la solución de PEG y 0,25 ml de la solución de dex-GMA y se agitó con vortex (Winn Vortex-Genie, máxima velocidad) durante 1 minuto, dando lugar a una emulsión de agua-en-agua con dextrano como fase interna y PEG como fase externa. Después de 10 minutos, se añadieron TEMED ((N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina, 100 \mul, 20% (v/v) en KCl 0,22M, pH ajustado a 7,2 con HCl concentrado) y KPS (peroxodisulfato de potasio, 180 \mul, 50 mg/ml en agua). La emulsión se incubó durante 30 minutos a 37ºC para polimerizar el dex-GMA. Las microesferas se lavaron dos veces con agua y se secaron por congelación.

Se demostró utilizando cultivos de células in vitro que la citotoxicidad del dex-GMA es baja en comparación a la citotoxicidad del dextrano, cuyo compuesto ha sido utilizado durante años como agente sustituyente de plasma en seres humanos.

Se determinaron el tamaño de partícula (diámetro de peso en número (=\Sigmand/\Sigman) y el diámetro de peso en volumen (=\Sigmand^{4}/\Sigmand^{3})), I.C. Edmundson, Particle-size analysis, H.S. Bean, A.H. Beckett y J.E. Carles (eds) en: Advances in Pharmaceutical Sciences vol. 2, Academia Press, Londres 1967, 95-174) y la distribución del tamaño de partícula mediante una técnica de bloqueo por luz láser (Accusizer^{tm}, modelo 770, Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA, USA). Se establecieron la forma y las características de la superficie (porosidad) de las microesferas mediante un análisis por microscopía electrónica de barrido (SEM).

La figura 1 muestra un ejemplo representativo de la distribución del tamaño de partícula de un lote de microesferas de dextrano preparadas a través de la técnica de emulsión de agua-en-agua, determinado utilizando el Accusizer. El análisis por SEM mostró que las partículas son perfectamente esféricas y no porosas (figura 2).

La figura 3 muestra el diámetro promedio de peso en volumen de las microesferas de dextrano como función del grado de sustitución de GMA y el peso molecular de PEG. La concentración de la solución de PEG fue del 24% (w/w); la concentración de la solución de dex-GMA fue del 20%. Se muestra que el tamaño de partícula se incrementa al disminuir el peso molecular del PEG. A un peso molecular fijo de PEG, el tamaño de partícula disminuye ligeramente al aumentar el DS.

La figura 4 muestra el diámetro promedio de peso en volumen de las microesferas de dextrano como función del grado de sustitución de GMA y la concentración de la solución acuosa de dex-GMA. El diámetro medio disminuye al disminuir la concentración de dex-GMA.

La figura 5 muestra el efecto de la concentración y el peso molecular de PEG en el diámetro promedio de peso en volumen de las microesferas de dextrano. Para esta evaluación, se utilizó dex-GMA con un DS de 8 en KCl 0,22 M (20%, w/w). Parece que para un PEG dado, las partículas más grandes se obtenían a una concentración de PEG alrededor del 24%.

Ejemplo 2

La emulsión de agua-en-agua también se puede preparar utilizando un agitador mecánico en lugar del vortex utilizado en el Ejemplo 1. Se añadió una solución de dex-GMA (DS 4, 7, 13 ó 30; 20% w/w) en KCl 0,22 M a una solución de PEG (peso molecular diverso; 24%) en KCl 0,22 M, y se agitó mecánicamente (aproximadamente a 600-1000 rpm, dependiendo de la viscosidad de la fase PEG) durante 5 minutos bajo una corriente de nitrógeno. A continuación, se añadieron TEMED ((N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina, 1,0 ml, 20% (v/v) en KCl 0,22M, pH ajustado a 7,2 con HCl concentrado) y KPS (peroxidisulfato de potasio, 1,8 ml, 50 mg/ml en agua) y la mezcla se incubó durante 30 minutos a 37ºC para polimerizar el dex-GMA. El tamaño de partícula es ligeramente mayor utilizando un agitador mecánico en lugar de un vortex (figura 5).

Ejemplo 3

Las microesferas se prepararon a partir de las siguientes sustancias utilizando el protocolo mostrado en el Ejemplo 1 y utilizando las siguientes disoluciones stock:

Soluciones stock (% en w/w) en KCl 0,22 M:

A. PEG 10.000, 24%

B. PEG 20.000, 24%

C. Dex-GMA (DS 13) 20%

D. Dex-lactHEMA (DS 3) 20%

E. Dex-lactHEMA (DS 3) 10%

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F. Dex-PEG 20%

La Tabla 1 resume los resultados:

PEG	dex	Emulsificador	diámetro de peso	diámetro de peso
			en número (\mum)	en volumen (\mum)
4,50 ml A	0,25 ml C	0,25 ml F	3,3	7,2
4,75 ml A	0,25 ml C	No	4,4	11,5
4,75 ml A	0,25 ml D	No	6,3	17,0
4,75 ml B	0,25 ml E	No	5,3	16,0

Como se puede observar, un emulsificador adecuado (copolímero bloque de dextrano y PEG) permite obtener partículas más pequeñas con una dispersidad menor (= diámetro en peso medio/diámetro en número medio).

Ejemplo 4

Se evaluó la liberación de una proteína modelo de microesferas de dextrano no degradables y microesferas degradables. Las microesferas se volvieron degradables mediante la incorporación de dextranasa en microesferas de dex-GMA.

El dex-GMA (DS 8) se disolvió en tampón fosfato 10 mM de pH 8,0. A 2 ml de esta solución se añadió una cantidad fija de IgG (Inmunoglobulina G, 25,6 mg) y una cantidad variable de dextranasa (Sigma D1508; 0, 0,1 y 1 U (1 U libera 1 \mumol de oligosacáridos reductores por minuto a 37ºC y pH 6,0)). Esta solución se emulsificó en una solución acuosa de PEG (M = 10000, concentración 24% (w/w)) en KCl 0,22 M. Después de esto, se añadieron TEMED ((N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina, 100 \mul, 20% (v/v) en KCl 0,22 M, pH ajustado a 7,2 con HCl concentrado) y KPS (peroxidisulfato de potasio, 180 \mul, 50 mg/ml en agua). Las microesferas se lavaron con agua y se secaron bajo una corriente de nitrógeno.

Se suspendió una cantidad exactamente pesada de microesferas (0,3-0,5 g) en 10 ml de tampón fosfato de pH 5,5 y se determinó la cantidad de proteína liberada en el tampón utilizando el ensayo de proteína biorad (M. Bradford. Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254). La figura 7 muestra los perfiles de liberación. A partir de esta figura, es obvio que la liberación de IgG a partir de microesferas de dextrano se puede modular mediante dextranasa.

Ejemplo 5

Se evaluó la liberación de una proteína modelo (IgG) a partir de microesferas de dextrano degradables. La degradación se estableció mediante el co-atrapamiento de dextranasa en las micropartículas.

Se disolvió dextrano derivatizado de glicidil metacrilato (DS=8; 138 mg) en 612 \mul de tampón (fosfato 10 mM, KCl 220 mM, pH 8,0). Después de esto, se añadieron 250 \mul de una solución acuosa de IgG (50 mg/ml) y 250 \mul de una solución acuosa de dextranasa (concentración variable). La IgG y la Dextranasa se disolvieron en el mismo tampón (fosfato 10 mM, KCl 220 mM, pH 8,0). A continuación, se añadió 500 \mul de la solución de Dextranasa, dexMa, IgG, a 5 ml de una solución acuosa de PEG (peso molecular de 10000 g/mol, concentración de 17,5, 24 o 30% w/w) en el mismo tampón. Estos sistemas de fases separadas se agitaron con vortex durante 1 minuto, seguido de la adición de 180 \mul de peroxodisulfato de potasio (50 mg/ml; disueltos en tampón fosfato) y TEMED ((N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina, 20% v/v, pH ajustado a 8,0 con HCl). A continuación, se incubaron las muestras durante 30 minutos a 37ºC para polimerizar el DexMA. Se recogieron las partículas por centrifugación y se lavaron con agua. Las partículas se resuspendieron en tampón (NH_{4}Ac 5 mM, pH 5,5) y se incubaron a 37ºC. Periódicamente, se extrajeron muestras y se analizó su contenido en proteína (ensayo Biorad). La figura 8 muestra los perfiles de liberación. Se puede observar que en ausencia de dextranasa la liberación acumulativa fue menor del 10%, indicando que el diámetro hidrodinámico de la proteína era mayor que el tamaño de la malla de hidrogel. Además, la velocidad de liberación se incrementa al aumentar la cantidad de dextranasa en las partículas. Un aumento en la cantidad de dextranasa en las partículas da lugar a un aumento de la velocidad de degradación. Esto significa que la liberación de partículas de dextrano en forma de proteínas atrapadas se puede modular mediante la velocidad de degradación de la matriz de hidrogel. La degradación se puede realizar mediante la adición de una enzima (dextranasa) o mediante la introducción de separadores hidrolíticamente lábiles (por ejemplo, lactato ésters) en las reticulaciones.

Ejemplo Comparativo (EP-A-0 213 303)

Se disolvieron en 45 ml de agua, 5 gramos de dextrano, en el que las cadenas de dextrano son derivadas con grupos acrilo, con un M_{w} de 40.000. Se preparó, en 45 ml de agua, una segunda solución, la cual comprendía 7 g de polietilén glicol con un M_{w} de 6.000.

A temperatura ambiente, se añadió, con agitación, la primera solución a la segunda solución. El resultado fue un sistema de una fase del que no se pudieron formar microesferas. Este ejemplo muestra la necesidad de elegir los pesos moleculares y las concentraciones de los materiales de partida, de tal manera que se obtenga un sistema de dos fases.

Claims

1. Procedimiento para la preparación de un sistema de liberación controlada, que comprende:

(a): disponer:

(aa): un primer polímero soluble en agua, comprendiendo dicho primer polímero grupos reticulables e incorporando enlaces que son hidrolizables en condiciones fisiológicas;

(bb): un segundo polímero soluble en agua que es incompatible con el primer polímero, en solución acuosa; y

(cc): un material de proteínas liberable;

(b): formar un sistema acuoso de dos fases que comprende una fase dispersa que comprende el primer polímero, y una fase continua que comprende un segundo polímero;

(c): permitir que el material de proteínas liberable se disuelva en la fase dispersa o se difunda en la misma;

(d): reticular el primer polímero para obtener microesferas, teniendo como mínimo 80% en peso del mismo un tamaño de partículas comprendido entre 100 nanómetros y 100 \mum, de manera que la etapa (c) puede ser llevada a cabo antes o después de la etapa (d), a condición de que cuando se lleva a cabo la etapa (c) después de la etapa (d) el primer polímero es un polímero sensible a la temperatura.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la reticulación es llevada a cabo hasta un grado tal que los poros de la estructura reticulaza son sustancialmente más pequeños que el tamaño del compuesto de proteínas liberable.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, en el que antes o después de la etapa de reticulación, una enzima capaz de degradar la estructura reticulada formada o que se va a formar, es añadida al sistema acuoso de dos fases.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polímero reticulable es un polímero de dextrano.

5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que antes o después de la etapa de reticulación se añade dextranasa al sistema acuoso de dos fases.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que uno de los polímeros solubles en agua es polietilén glicol.

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las estructuras reticulazas son separadas de la otra fase de polímero.