ES2261977T3 - Fraccion de albumina derivada de plasma empobrecido en precalicreina. - Google Patents
Fraccion de albumina derivada de plasma empobrecido en precalicreina.Info
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Abstract
Un procedimiento de fabricación de una fracción enriquecida en albúmina que tiene un contenido reducido de activador de precalicreína (PKA) que comprende las etapas de: (a) reconstituir la pasta V, (fraccionamiento de Cohn) (b) realizar una etapa de concentración de la fracción obtenida en la etapa (a), (c) calendar la fracción obtenida en la etapa (b) en un intervalo de 50ºC a 70ºC durante un tiempo suficiente para pasteurizar la fracción, (d) opcionalmente rellenar la fracción obtenida para su uso y (e) realizar una etapa de incubación en las siguientes condiciones durante 10 días a 30-32ºC o 4 semanas a 20-25ºC.
Description
Fracción de albúmina derivada de plasma
empobrecido en precalicreína.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de fabricación una fracción enriquecida en albúmina
que tiene un activador de precalicreína (PKA) reducido y una
fracción que contiene albúmina que tiene un activador de
precalicreína (PKA) reducido que puede obtenerse de acuerdo con el
procedimiento de la invención.
Las preparaciones que contienen albúmina se usan
como soluciones de infusión para pacientes que tienen necesidad de
las mismas. Para tener un entorno más fisiológico, la sustitución
líquida se infunde a los pacientes conteniendo no solo sales en
concentración fisiológica sino albúmina como carga. Las
preparaciones de albúmina pueden contener un activador de
precalicreína, que puede conducir a efectos secundarios no deseados,
que pueden deberse a la interferencia del activador de precalicreína
en el sistema renina-angiotensina.
Vieron et al., Biotechnology of Blood
Proteins, 1993, Vol. 227, pág. 183-188 describe un
procedimiento de purificación combinado Cohn/cromatografía para la
fabricación de albúmina humana de alta pureza a partir de plasma
El documento
US-A-4.440.679 describe
composiciones que contienen proteínas térmicamente sensibles,
terapéuticamente activas que se pasteurizan sin pérdida sustancial
de su actividad terapéutica mezclando la composición de proteína con
una cantidad estabilizadora de pasteurización de un poliol antes de
la pasteurización.
Tanaka et al., describe en Brazilian
Journal of Medical and Biological Research, noviembre de 1998, una
purificación de albúmina humana por la combinación del procedimiento
de Cohn con cromatografía líquida. Las fracciones cromatográficas se
someten a una etapa de pasteurización.
El objeto de la presente invención era reducir
el contenido de PKA en fracciones derivadas de plasma que contienen
albúmina. Otro objeto era proporcionar una fracción que contiene
albúmina que tiene un valor de PKA reducido.
El objeto se resolvió mediante un procedimiento
de fabricación de una fracción enriquecida en albúmina que tiene un
activador de precalicreína (PKA) reducido que comprende las etapas
de:
(a) reconstituir la pasta V, (fraccionamiento de
Cohn)
(b) realizar una etapa de concentración de la
fracción obtenida en la etapa (a),
(c) calendar la fracción obtenida en la etapa
(b) en un intervalo de 50ºC a 70ºC durante un tiempo suficiente para
pasteurizar la fracción,
(d) opcionalmente rellenar la fracción obtenida
para su uso y
(e) realizar una etapa de incubación en las
siguientes condiciones durante 10 días a 30-32ºC o 4
semanas a 20-25ºC.
En una realización de la presente invención se
realiza una segunda etapa de pasteurización después del
rellenado.
En particular, la etapa de incubación se realiza
a 50 - 70ºC con una duración de al menos 5 horas, en particular 10
horas.
Empezando con la reconstitución de la pasta V y
opcionalmente la adición de adyuvantes de filtrado se realiza una
filtración preferiblemente con un filtro que tiene un tamaño de poro
de aproximadamente 0,2 \mum. Si fuera necesario, se realiza un
ajuste del pH. El pH debería estar en el intervalo de
7,2-7,6. Típicamente, se realiza una ultrafiltración
hasta el 8% (p/v) de contenido de proteína seguido de diafiltración
y otra ultrafiltración para concentrar la proteína. Esto conduce a
concentraciones de proteína de al menos el 20%. Puede realizarse
después otra filtración preferiblemente con una membrana que tiene a
tamaño de poro de aproximadamente 0,2 \mum.
Los estabilizadores se añaden por ejemplo a 0,08
mmol/g de albúmina cada uno de
N-acetil-DL-triptófano
y caprilato sódico, seguido de otro ajuste del pH en un intervalo de
6,7 a 7,3. Se consigue ajustar el contenido de proteína y sodio y se
realiza una pasteurización a granel preferiblemente en un intervalo
de 58ºC a 65ºC durante al menos 9 horas. Esta etapa va seguida de
una filtración estéril. La muestra se almacena menos de 2 semanas de
2ºC a 25ºC. La albúmina estéril a granel se somete a una filtración
estéril terminal adicional y se rellena. Después del rellenado puede
realizarse una segunda etapa de pasteurización en condiciones
similares a las descritas anteriormente. Puede añadirse una etapa
adicional de incubación. Después de inspeccionar visualmente la
preparación está lista para almacenamiento y administración.
El procedimiento de la invención proporciona
también una fracción que contiene albúmina que tiene un activador de
precalicreína (PKA) reducido.
\newpage
El contenido de PKA de la albúmina de la
invención es menor de 12 UI/ml, preferiblemente 10 UI/ml,
determinándose el PKA de acuerdo con European Pharmacopea, Cuarta
Edición, 2.6.15, pág. 147-148.
La invención se describe adicionalmente mediante
los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo
1
La pasta V se suspende en 1,6 veces su peso de
agua para inyecciones durante > 6 horas a -2 \pm 2ºC. Se añaden
los adyuvantes de filtrado al producto y la preparación se agita
durante 30 min. El filtro de profundidad se lava previamente con
agua para inyecciones y posteriormente con etanol al 10% (v/v). La
solución se aclara haciéndola pasar a través del filtro de
profundidad y un filtro de membrana posterior de 0,2 \mum. El
filtro se lava posteriormente con etanol al 10% en agua para
inyecciones. El pH se ajusta a 7,4 \pm 0,2 con solución 3 M de
hidróxido sódico.
Se obtiene una concentración de proteína del 8%
por ultrafiltración a través de membranas con un límite de exclusión
de 10 kDalton. El concentrado se diafiltra contra una cantidad
\geq 3 veces de solución 0,5 M de cloruro sódico, seguido de una
cantidad \leq 3 veces de agua para inyecciones. Después de la
diafiltración, la solución de albúmina se concentra a una
concentración de proteína de aproximadamente el 22% por
ultrafiltración a \leq +15 C. La solución se aclara haciéndola
pasar a través del filtro de profundidad y un filtro de membrana
posterior de 0,2 \mum. El filtro de profundidad se lava
previamente con agua para inyecciones.
Posteriormente, se disuelven 0,0106 g de ácido
caprílico/g de proteína y 0,0182 g de
N-acetil-DL-triptófano/g
de proteína en hidróxido sódico al 10% (p/v) y se añaden a la
solución de albúmina con agitación lenta. El pH se ajusta a 7,0
\pm 0,3. La solución de albúmina se ajusta a una concentración de
proteína de 200 \pm 10 g/l añadiendo agua para inyecciones. El
contenido de sodio se ajusta a 150 \pm 7,5 mmol/I añadiendo
cloruro sódico. La solución se agita durante al menos 9 horas a
58-65ºC. La solución de albúmina se filtra estéril a
través de un filtro membrana de calidad para esterilización con un
tamaño de poro nominal típicamente de 0,2 \mum. El filtro estéril
se ensaya para comprobar su integridad antes y después de usar un
procedimiento de ensayo apropiado según recomiendas las
especificaciones del fabricante. La albúmina filtrada estéril se
almacena a +2ºC-+25ºC no más de 2 semanas. La solución estéril se
rellena usando un filtro estéril terminal de 0,2 \mum en
condiciones asépticas en viales de infusión despirogenados, que se
cierran con tapones de butilo esterilizados y sellan con precintos
de aluminio. El filtro estéril se ensaya para comprobar su
integridad antes y después de usarlo mediante un procedimiento de
ensayo apropiado según recomiendan las especificaciones del
fabricante. El volumen de llenado se controla durante todo el
procedimiento de llenado. Las pasteurización se realiza de acuerdo
con la European Pharmacopea. Los recipientes finales se incuban de
acuerdo con la European Pharmacopea. Después del periodo de
incubación, se inspeccionan visualmente todos los viales para
comprobar si hay contaminación con partículas, turbidez, defectos de
los viales y de los cierres. Las preparaciones defectuosas se
rechazan. Todos los viales se almacenan de +2ºC a +25ºC.
Ejemplo
2
La pasta V se suspende en 1,6 veces su peso de
agua para inyecciones durante > 6 horas a -2 \pm 2ºC. Los
adyuvante de filtración se añaden al producto y la preparación se
agita durante 30 min. El filtro de profundidad se lava previamente
con agua para inyecciones y posteriormente con etanol al 10%. La
solución se aclara haciéndola pasar a través del filtro de
profundidad y un filtro de membrana posterior de 0,2 \mum. El
filtro se lava posteriormente con etanol al 10% en agua para
inyecciones. El pH se ajusta a 7,4 \pm 0, 2 con solución 3 M de
hidróxido sódico. Se obtiene una concentración de proteína del 8%
mediante ultrafiltración a través de las membranas con un límite de
exclusión de 10 kDalton. El concentrado se diafiltra contra una
cantidad \geq 3 veces la de la solución 0,5 M de cloruro sódico,
seguido de una cantidad \leq 3 veces la de agua para inyecciones.
Después de la diafiltración, la solución de albúmina se concentra a
una concentración de proteína de aproximadamente el 26% por
ultrafiltración a < +15ºC. La solución se aclara haciéndola pasar
a través del filtro de profundidad y un filtro de membrana posterior
de 0,2 \mum. El filtro de profundidad se lava previamente con agua
para inyecciones. Posteriormente se disuelven 0,0106 g de ácido
caprílico/g de proteína y 0,0182 g de
N-acetil-DL-triptófano/g
de proteína en hidróxido sódico al 10% y se añaden a la solución de
albúmina con agitación lenta. El pH se ajusta a 7,0 \pm 0,3. La
solución de albúmina se ajusta a una concentración de proteína de
250 \pm 12 g/l añadiendo agua para inyecciones. El contenido de
sodio se ajusta a 150 \pm 7,5 mmol/I añadiendo cloruro sódico. La
solución se agita durante al menos 9 horas a
58-65ºC. La solución de albúmina se filtra estéril a
través de un filtro membrana de calidad para esterilización de un
tamaño de poro nominal típicamente de 0,2 \mum. El filtro estéril
se ensaya para comprobar su integridad antes y después de usarlo
mediante un procedimiento de ensayo apropiado según recomiendan las
especificaciones del fabricante. La albúmina filtrada estéril se
almacena a +2ºC-+25ºC no más de 2 semanas. La solución estéril se
rellena usando un filtro estéril terminal de 0,2 \mum en
condiciones asépticas en viales de infusión despirogenados, que se
cierran con tapones de butilo esterilizados y se sellan con
precintos de aluminio. El filtro estéril se ensaya para comprobar su
integridad antes y después de usarlo mediante un procedimiento de
ensayo apropiado según recomiendan las especificaciones del
fabricante. El volumen de llenado se controla durante todo el
procedimiento de llenado. La pasteurización se realiza de acuerdo
con la European Pharmacopea. Los recipientes finales se incuban de
acuerdo con la European Pharmacopea. Después del periodo de
incubación, se inspeccionan visualmente todos los viales para
comprobar si hay contaminación con partículas, turbidez, defectos de
los viales y de los cierres. Las preparaciones defectuosas se
rechazan. Todos los viales se almacenan de +2ºC a +25ºC.
Ejemplo
3
La pasta V se suspende en 1,6 veces su peso de
agua para inyecciones durante 6 horas a -2 \pm 2 C. Los adyuvante
de filtración se añaden al producto y la preparación se agita
durante 30 min. El filtro de profundidad se lava previamente con
agua para inyecciones y posteriormente con etanol al 10%. La
solución se aclara haciéndola pasar a través del filtro de
profundidad y un filtro de membrana posterior de 0,2 \mum. El
filtro se lava posteriormente con 10% etanol en agua para
inyecciones. El pH se ajusta a 7,40, 2 con solución 3 M de hidróxido
sódico. Se obtiene una concentración de proteína del 8% mediante
ultrafiltración a través de las membranas con un límite de exclusión
de 10 kDalton. El concentrado se diafiltra contra una cantidad >
3 veces la de la solución 0,5 M de cloruro sódico, seguido de a una
cantidad < 3 veces la de agua para inyecciones. Después de la
diafiltración, la solución de albúmina se concentra a una
concentración de proteína de aproximadamente el 22% por
ultrafiltración a menos de +15ºC. La solución se aclara haciéndola
pasar a través del filtro de profundidad y un filtro de membrana
posterior de 0,2 \mum. El filtro de profundidad se lava
previamente con agua para inyecciones. Posteriormente se disuelven
0,0106 g de ácido caprílico/g de proteína y 0,0182 g de
N-acetil-DL-triptófano/g
de proteína en hidróxido sódico al 10% y se añaden a la solución de
albúmina con agitación lenta. El pH se ajusta a 7,0 \pm 0,3. La
solución de albúmina se ajusta a una concentración de proteína de
200 \pm 10 g/l añadiendo agua para inyecciones. El contenido de
sodio se ajusta a 150 \pm 7,5 mmol/I añadiendo cloruro sódico. La
solución se agita durante al menos 10 horas a
58-65ºC. La solución de albúmina se filtra estéril a
través de un filtro membrana de calidad para esterilización de un
tamaño de poro nominal típicamente de 0,2 \mum. El filtro estéril
se ensaya para comprobar su integridad antes y después de usarlo
mediante un procedimiento de ensayo apropiado según recomiendan las
especificaciones del fabricante. La albúmina filtrada estéril se
almacena a +2ºC a +25ºC no más de 2 semanas. La solución de albúmina
se ajusta a una concentración de proteína de 50 \pm 2,5 g/I
añadiendo agua para inyecciones. El pH se ajusta a 7,0 \pm 0,3. El
contenido de sodio se ajusta a 150 \pm 7,5 mmol/I añadiendo
cloruro sódico. La solución de albúmina se almacena de +2ºC a +25 C
no más de 24 horas hasta el llenado. La solución estéril se rellena
usando un filtro estéril terminal de 0,2 \mum en condiciones
asépticas en viales de infusión despirogenados, que se cierran con
tapones de butilo esterilizados y se sellan con precintos de
aluminio. El filtro estéril se ensaya para comprobar su integridad
antes y después de usarlo mediante un procedimiento de ensayo
apropiado según recomiendan las especificaciones del fabricante. El
volumen de llenado se controla durante todo el procedimiento de
llenado. La pasteurización se realiza de acuerdo con la European
Pharmacopea. Los recipientes finales se incuban de acuerdo con la
European Pharmacopea. Después del periodo de incubación, se
inspeccionan visualmente todos los viales para comprobar si hay
contaminación con partículas, turbidez, defectos de los viales y de
los cierres. Las preparaciones defectuosas se rechazan. Todos los
viales se almacenan de +2ºC a +25ºC.
El activador de precalicreína (PKA) activa
precalicreína a calicreína y puede ensayarse por su capacidad para
escindir un cromóforo de un sustrato peptídico sintético de manera
que la velocidad de escisión puede medirse espectrofotométricamente
y la concentración de PKA se calcula por comparación con una
preparación de referencia calibrada en Unidades Internacionales.
La Unidad Internacional es la actividad de una
cantidad establecida del Patrón Internacional compuesto por un
activador de precalicreína liofilizado. La equivalencia en Unidades
Internacionales del Patrón Internacional la establece la
Organización Mundial de la Salud.
Para evitar la activación de la coagulación, la
sangre o el plasma usados para la preparación de precalicreína deben
estar en contacto sólo con superficies de plástico o de vidrio
tratado con silicona. Se extraen 9 volúmenes de sangre humana en 1
volumen de solución anticoagulante (ACD, CPD o 38 g/l de citrato
sódico) a la que se ha añadido 1 mg/ml de bromuro de hexadimetrina.
Se centrifuga la mezcla a 3600 g durante 5 min. Se separa el plasma
y se centrifuga de nuevo a 6000 g durante 20 min para que sedimenten
las plaquetas. Se separa el plasma pobre en plaquetas y se dializa
frente a 10 volúmenes de tampón A durante 20 h. Se aplica el plasma
dializado a una columna cromatográfica que contiene
agarosa-DEAE para cromatografía de intercambio de
iones que se ha equilibrado en tampón A y es igual a dos veces el
volumen del plasma. Se eluye de la columna con tampón A a 20
ml/cm^{2}/h. Se recoge el eluato en fracciones y se registra la
absorbancia a 280 nm (2.2.25). Se combinan las fracciones que
contienen el primer pico de proteína de manera que el volumen del
combinado es de aproximadamente 1,2 veces el volumen del plasma
pobre en plaquetas.
Se ensaya el combinado de sustrato para la
ausencia de actividad calicreína mezclando 1 parte con 20 partes de
la solución sustrato cromogénico calentado previamente para usarlo
en el ensayo y se incuba a 37ºC durante 2 min. El sustrato es
adecuado su el aumento de absorbancia es menor de 0,001 por minuto.
A la solución combinada se le añaden 7 g/l de cloruro sódico y se
filtra usando un filtro de membrana (porosidad 0,45 \mum). Se
congela el filtrado en porciones y se almacena a -25ºC; el sustrato
puede liofilizarse antes del almacenamiento.
Se realizan todos los procedimientos desde el
comienzo de la cromatografía hasta la congelación en porciones
durante un solo día laborable.
\newpage
Ensayo
El ensayo se realiza preferiblemente usando un
analizador de enzimas automático a 37ºC, ajustando los volúmenes, la
concentración de los sustratos y el tiempo de incubación de manera
que la velocidad de reacción es lineal al menos hasta 35 UI/ml. Los
patrones, las muestras y el sustrato precalicreína pueden diluirse
si fuera necesario usando el tampón B.
Se incuban los patrones o muestras diluidos con
sustrato precalicreína durante 10 min de manera que el volumen de la
muestra no diluida no es mayor de 1/10 veces el volumen total de la
mezcla de incubación para evitar los errores provocados por la
variación en la fuerza iónica y el pH en la mezcla de incubación. Se
incuba la mezcla o una parte de la misma con al menos un volumen
igual de una solución de un sustrato cromogénico sintético adecuado,
que se sabe que es específico para calicreína (por ejemplo, acetato
de
N-benzoil-L-prolil-L-fenilalanil-L-arginina-4-nitroanilida
R o
D-prolil-L-fenilalanil-L-arginina-4-nitroanilida-diclorhidrato
R), disuelto en tampón B. Se registra la velocidad de cambio en la
absorbancia por minuto durante 2 min a 10 min a la longitud de onda
específica para el sustrato usado. Se prepara un blanco para cada
mezcla de muestra o patrón usando tampón B en lugar de sustrato
precalicreína.
Se corrige \DeltaA/min restando el valor
obtenido para el blanco correspondiente. Se traza una curva de
calibrado usando los valores obtenidos de esta manera para la
preparación de referencia y las concentraciones respectivas; se usa
la curva para determinar la actividad PKA de la preparación a
examinar.
Tampón
A
| Tris(hidroximetil) aminometano | 6,055 g |
| Cloruro sódico | 1,17 g |
| Bromuro de hexadimetrina | 50 mg |
| Azida sódica | 0,100 g |
Se disuelven los ingredientes en agua, se ajusta
a pH 8,0 con ácido clorhídrico 2 M y se diluye a 1000 ml con
agua.
Tampón
B
| Tris (hidroximetil) aminometano | 6,055 g |
| Cloruro sódico | 8,77 g |
Se disuelven los ingredientes en agua, se ajusta
el pH a 8,0 con ácido clorhídrico 2 M y se diluye a 1000 ml con
agua.
| Etapa de producción | Valor de PKA (de acuerdo | Valor de PKA (ejemplo |
| con la invención) | comparativo) | |
| Después de IPBP* y filtración | 3 UI/ml | n.a. ** |
| estéril | ||
| Después de pasteurización en | < 2 UI/ml | 5 UI/ml |
| el recipiente final | ||
| Después de incubación | 4 UI/ml | 18 UI/ml |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Etapa de producción | Valor de PKA (de acuerdo | Valor de PKA (ejemplo |
| con la invención) | comparativo) | |
| Después de IPBP* y filtración | < 2 UI/ml | n.a. ** |
| estéril | ||
| Después de pasteurización en | < 2 UI/ml | 2 UI/ml |
| el recipiente final | ||
| Después de incubación | 3 UI/ml | 12 UI/ml |
| Etapa de producción | Valor de PKA (de acuerdo | Valor de PKA (ejemplo |
| con la invención) | comparativo) | |
| Después de IPBP* y filtración | < 2 UI/ml | n.a. ** |
| estéril | ||
| Después de pasteurización en | < 2 UI/ml | 5 UI/ml |
| el recipiente final | ||
| Después de incubación | 2 UI/ml | 20 UI/ml |
| *IBPP en el procedimiento de pasteurización a granel | ||
| **n.a. no aplicable. |
Claims (5)
1. Un procedimiento de fabricación de
una fracción enriquecida en albúmina que tiene un contenido reducido
de activador de precalicreína (PKA) que comprende las etapas de:
(a) reconstituir la pasta V, (fraccionamiento de
Cohn)
(b) realizar una etapa de concentración de la
fracción obtenida en la etapa (a),
(c) calendar la fracción obtenida en la etapa
(b) en un intervalo de 50ºC a 70ºC durante un tiempo suficiente para
pasteurizar la fracción,
(d) opcionalmente rellenar la fracción obtenida
para su uso y
(e) realizar una etapa de incubación en las
siguientes condiciones durante 10 días a 30-32ºC o 4
semanas a 20-25ºC.
2. El procedimiento de la reivindicación
1 en el que después del llenado se realiza una segunda etapa de
pasteurización.
3. El procedimiento de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 2 en el que la pasteurización se realiza
durante un periodo de tiempo de al menos 9 h a una temperatura de 58
a 65ºC.
4. Una fracción que contiene albúmina
que tiene un activador de precalicreína (PKA) reducido que puede
obtenerse de acuerdo con el procedimiento de al menos una de las
reivindicaciones 1 a 3.
5. La albúmina de la reivindicación 4
que tiene un contenido de PKA de menos de 12 UI/ml, preferiblemente
10 UI/ml, en el que el PKA se determina de acuerdo con la European
Pharmacopeia, Cuarta Edición.
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