ES2262352T3

ES2262352T3 - Procedimiento de diagnostico o tratamiento de enfermedades neurologicas.

Info

Publication number: ES2262352T3
Application number: ES99960975T
Authority: ES
Inventors: Roger Nitsch; Isabell Greeve
Original assignee: Evotec Neurosciences GmbH
Current assignee: Evotec Neurosciences GmbH
Priority date: 1998-11-12
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2019-11-12
Also published as: JP2002530076A; WO2000029569A1; JP4663121B2; EP1129191A1; ATE321135T1; DE69930545T2; US20050239169A1; DE69930545D1; US20080261302A1; EP1002862A1; EP1129191B1; DK1129191T3

Abstract

Un ácido nucleico aislado que codifica una molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1.

Description

Procedimientos de diagnóstico o tratamiento de enfermedades neurológicas.

La muerte celular es una característica común que ocurre en la naturaleza de dos maneras diferentes. La necrosis es el resultado de una agresión física o química mientras que la apoptosis o muerte celular programada es el resultado de un programa de autodestrucción en el interior de la célula como respuesta a estímulos internos y externos. Este último proceso es una forma de muerte celular dirigida genéticamente que es esencial para el desarrollo y mantenimiento normales de los organismos multicelulares. Un trabajo reciente ha demostrado claramente que la desregulación de la apoptosis puede ser la base de la patogénesis de una variedad de enfermedades. Se ha descrito que la apoptosis puede ocurrir en afecciones caracterizadas por isquemia, por ejemplo, infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. Esta se encuentra implicada en una cantidad de trastornos hepáticos incluyendo la ictericia obstructiva. El daño hepático debido a las toxinas y fármacos también está asociado con la apoptosis en los hepatocitos. La apoptosis se ha identificado también como un fenómeno clave en algunas enfermedades del riñón, por ejemplo riñón poliquístico, así como en trastornos del páncreas como la pancreatitis inducida por el alcohol y la diabetes. El SIDA y los trastornos neurodegenerativos como el Alzheimer y la enfermedad de Parkinson representan el grupo más ampliamente estudiado de trastornos en los que está implicado un exceso de apoptosis. La esclerosis lateral amiotrópica, la retinitis pigmentosa, la epilepsia y el daño cerebral causado por el alcohol son otros trastornos neurológicos en los que está implicada la apoptosis.

Los trastornos neurológicos se encuentran muy difundidos dentro de la población, y tiene un alto impacto no sólo en la vida del paciente sino también en la sociedad como tal. Por lo tanto, existe una gran necesidad de dilucidar las causas y la patogénesis de base de tales enfermedades neurológicas. Entre tales enfermedades neurológicas, la enfermedad de Alzheimer (AD) tiene en una posición predominante. La enfermedad de Alzheimer, que fuera descrita por primera vez por el psiquiatra bávaro Alois Alzheimer en 1907, es un trastorno neurológico progresivo que comienza con una pérdida de la memoria reciente y continúa con una pérdida de las funciones cognitivas, desorientación, deterioro del juicio y el razonamiento y, finalmente, demencia. Es la causa más común de demencia. Se ha estimado que la AD afecta del 5 al 11 por ciento de la población después de los 65 años y alcanza al 47 por ciento de la población de más de 85 años. Además, ya que los adultos nacidos durante el crecimiento rápido de la población en las décadas de los años 1940 y 1950, se acercan a la edad en que la AD se hace más prevalente, el control y tratamiento de la AD se convertirá en un problema de salud aún más significativo. Las formas familiares de la AD son genéticamente heterogéneas, pero la mayoría con establecimiento temprano están ligadas a mutaciones en los genes de presenilinas PSEN1 y PSEN2, así como a las mutaciones del gen precursor del amiloide APP. La mayoría de los pacientes con AD no tienen una historia familiar obvia y se clasifica como AD esporádica. La neuropatología de la AD se caracteriza por una pérdida sustancial de neuronas y sinapsis, y por la formación de placas amiloides en el cerebro y ovillos neurofibrilares. Las placas amiloides se distribuyen uniformemente en todo el neocórtex y el hipocampo, mientras que la neurodegeneración neuronal se da predominantemente en los lóbulos temporales inferiores, el córtex entorrinal y el hipocampo. Neuronas similares en los lóbulos frontales, parietales y occipitales están mucho más preservadas de la degeneración aún en las etapas terminales severas de la AD. Estas observaciones indican una vulnerabilidad selectiva de poblaciones específicas de neuronas. Se desconocen los factores que determinan la vulnerabilidad selectiva de las neuronas en los cerebros con AD.

En un nuevo enfoque de la identificación sistemática de genes humanos expresados no identificados, Nomura y col. (DNA Research, 1:27-35, 1994) construyeron una biblioteca de ADNc de tamaño mediano a partir de ADNc humano fraccionado. Los autores usaron una línea celular mieloide inmadura humana (KG-1) como fuente de ARNm para la construcción de la biblioteca. Se aislaron los clones conteniendo secuencias no descritas en sus extremos 5' terminales e inserciones en el intervalo de 2-6 kb y se determinaron sus secuencias de nucleótidos. De este modo, se identificaron transcriptos de tamaño casi completo de 40 genes nuevos y se predijeron sus posibles regiones codificadoras mediante un análisis computarizado. De acuerdo con Nomura y col., uno de esos genes descritos, originalmente denominado KIAA0018 (Emhum2 ingreso en base de datos Hsrsc390: número de acceso D13643), se trascribe en un ADNc de 4186 pb de longitud, con una región codificadora de proteína potencial de 402 aminoácidos. Nomura y col. describieron una expresión ubicua, del ARNm de KIAA0018 en 16 tejidos humanos diferentes. La ubicación genómica del gen KIAA0018 se mapeó en el cromosoma humano 1.

El objetivo general de la presente invención es dilucidar las causas de la degeneración celular y de la muerte celular. Más específicamente, la presente invención intenta dilucidar las causas de la patogénesis subyacente de las enfermedades neurológicas, en particular la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proveer los medios para comprender la patogénesis de las enfermedades neurológicas y proveer los procedimientos y mate-
riales adecuados para el diagnóstico y tratamiento de dichas enfermedades, degeneración celular y muerte celular.

La invención incorpora una molécula de ácido nucleico aislado que codifica una molécula de proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 así como la molécula de proteína de acuerdo con SEQ ID Nº 1. De aquí en más, la molécula de proteína de SEQ ID Nº 1 se denominará "SELADIN-1". Una función de SELADIN-1 es proteger las células contra la degeneración y muerte celular. En particular, se protegen las células del sistema nervioso, sistema muscular, próstata, estómago, testículos, ovarios, glándulas adrenales, glándulas mamarias, hígado, bazo, pulmón, tráquea o placenta contra la degeneración y/o muerte celular. Por lo tanto, la presente invención también incorpora las variantes funcionales del SELADIN-1 que podría tener una modificación de la estructura primaria dada del SELADIN-1, pero cuyas funciones biológicas esenciales no se ven afectadas. Las "variantes" de una molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1 incluyen, por ejemplo, proteínas con sustituciones de aminoácidos conservativas en regiones altamente conservativas. Por ejemplo, isoleucina, valina y leucina pueden estar sustituidas unas con otras. Aspartato y glutamato pueden estar sustituidos el uno con el otro. Glutamina y la asparagina pueden estar sustituidas la una con la otra. Serina y treonina pueden estar sustituidos el uno con el otro. Las sustituciones de aminoácidos en regiones menos conservativas incluyen, por ejemplo: isoleucina, valina y leucina pueden estar sustituidas unas por otras. Aspartato y glutamato pueden estar sustituidos el uno por el otro. Glutamina y la asparagina pueden estar sustituidas la una por la otra. Serina y treonina pueden estar sustituidas la una por la otra. Glicina y alanina estar sustituidas la una por la otra. Alanina y valina pueden estar sustituidas la una por la otra. Metionina puede estar substituida tanto por leucina, como isoleucina o valina, y viceversa. Lisina y arginina pueden estar sustituidas la una por la otra. Uno de aspartato y glutamato pueden estar sustituidos por uno de arginina o lisina y viceversa. Histidina puede estar sustituida por arginina o lisina y viceversa. Glutamina y glutamato pueden estar sustituidos el uno por el otro. Asparagina y aspartato pueden estar sustituidos el uno por el otro. Otros ejemplos de las modificaciones de la proteína incluyen la glicosilación y otras modificaciones posteriores a la traducción. La invención también se ocupa de las moléculas de ácido nucleico que codifican tales variantes funcionales de la molécula de proteína de SEQ ID Nº 1. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser moléculas de ADN, tales como moléculas de ADN genómico o moléculas de ADNc o moléculas de ARN, tales como moléculas de ARNm. En particular, tal molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADNc que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nº 2. La invención también se ocupa de una molécula de ADN aislada capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 bajo condiciones rigurosas. Los ejemplos de condiciones rigurosas incluyen (i) 0,2xSSC (solución salina citrato estándar) y SDS al 0,1% a 60ºC y (ii) formamida al 50%, 4xSSC, HEPES 50 mM, pH 7,0, 10x solución de Denhardt, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado térmicamente a 42ºC.

En otro aspecto, la invención incorpora un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1. También incorpora un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o la muerte celular, en el que la secuencia de aminoácidos de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma. En las formas de realización de preferencia, un virus, un bacteriófago o un plásmido comprenden el ácido nucleico descrito. En particular, un plásmido adaptado para la expresión en una célula bacteriana comprende dicha molécula de ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1 y los elementos regulatorios necesarios para la expresión de dicha molécula en la célula bacteriana. En otro aspecto, la invención incorpora un plásmido adaptado para la expresión en una célula de levadura que comprende dicha molécula de ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1, y los elementos regulatorios necesarios para la expresión de dicha molécula en la célula de levadura. En otro aspecto, la invención incorpora un plásmido adaptado para la expresión en una célula de mamífero que comprende una molécula de ácido nucleico, por ejemplo una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína mostrada en SEQ ID Nº 1 y los elementos regulatorios necesarios para la expresión de dicha molécula en la célula de un mamífero.

En otro aspecto, la invención incorpora una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1. La Invención también incorpora células que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de proteína cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular y cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma. También incorpora las células que comprenden una molécula de ADN capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2, bajo condiciones rigurosas. En formas de realización de preferencia, dicha célula es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de mamífero o una célula de un insecto. En particular, la invención incorpora una célula bacteriana que comprende un plásmido adaptado para la expresión en una célula bacteriana, dicho plásmido comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1, y los elementos regulatorios necesarios para la expresión de dicha molécula en la célula bacteriana. La invención también incorpora una célula de levadura que comprende un plásmido adaptado para la expresión en una célula de levadura, y dicho plásmido comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1, y los elementos regulatorios necesarios para la expresión de dicha molécula en la célula de levadura. Además incorpora una célula de mamífero que comprende un plásmido adaptado para la expresión en una célula de mamífero, dicho plásmido comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1, y los elementos regulatorios necesarios para la expresión de dicha molécula en la célula de mamífero.

La invención además incorpora un anticuerpo específicamente inmunorreactivo con un inmunógeno, en la que dicho inmunógeno se muestra en SEQ ID Nº 1 o en la que dicho inmunógeno es una molécula de proteína, cuya función es proteger las células contra la degeneración y/o muerte celular, en que la secuencia de aminoácido de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma. En otro aspecto, la invención apunta a un procedimiento in vitro para detectar células patológicas en un sujeto que comprende la tinción inmunocitoquímica de células con el anticuerpo antes mencionado, en la que un bajo grado de coloración en dicha célula, comparado con una célula de referencia, que representa un estado conocido de salud, indica un cambio patológico en dicha célula. La invención es particularmente adecuada para detectar estructuras patológicas en el cerebro de un sujeto, el procedimiento de detección comprende la tinción inmunocitoquímica de dichas estructuras patológicas con dicho anticuerpo. También es especialmente adecuada para detectar células patológicas en el sistema muscular, próstata, estómago, testículos, ovarios, glándulas adrenales, glándulas mamarias, hígado, bazo, pulmón, tráquea o placenta.

En otro aspecto, la invención incorpora un procedimiento in vitro para diagnosticar o pronosticar una enfermedad, en particular una enfermedad neurológica, en un sujeto que comprende:

determinar un nivel o una actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad de al menos una sustancia seleccionada del grupo constituido por

(a) una molécula de ADN que codifica una molécula de proteína, en la que la secuencia de aminoácido de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma,

(b) un producto de transcripción de una molécula de ADN que codifica una molécula de proteína, en la que la secuencia de aminoácido de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma,

(c) una molécula de proteína en la que la secuencia de aminoácido de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma,

(d) una molécula de ADN capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2, bajo condiciones rigurosas,

(e) un producto de transcripción de una molécula de ADN, en el que dicha molécula de ADN es capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 bajo condiciones rigurosas,

(f) un producto de la traducción de una molécula de ADN, en el que dicha molécula de ADN es capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 bajo condiciones rigurosas,

(g) una molécula que afecta un nivel o una actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una sustancia que se selecciona del grupo constituido por (a) a (f),

(h) una molécula que es afectada en su nivel o su actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, por al menos una sustancia que se selecciona del grupo constituido por (a) a (f),

y comparar dicho nivel o dicha actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una de dichas
sustancias (a) a (h) con un valor de referencia que representa una enfermedad conocida o un estado de salud, diagnosticando o pronosticando de este modo una enfermedad, en particular una enfermedad neurológica, en dicho
sujeto.

En otro aspecto, la presente invención incorpora un procedimiento in vitro para controlar la progresión de una enfermedad, en particular una enfermedad neurológica, en un sujeto, que comprende:

determinar un nivel o una actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad de al menos una sustancia seleccionada del grupo constituido por:

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y comparar dicho nivel o dicha actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una de dichas
sustancias (a) a (h) con un valor de referencia que representa una enfermedad conocida o un estado de salud, controlando de este modo la progresión de una enfermedad, en particular una enfermedad neurológica, en dicho
sujeto.

En otro aspecto aún, la invención incorpora un procedimiento in vitro para evaluar un tratamiento para una enfermedad, en particular una enfermedad neurológica, en un sujeto, dicho procedimiento comprende:

y comparar dicho nivel o dicha actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una de dichas sustancias (a) a (h) con un valor de referencia que representa una enfermedad conocida o un estado de salud, evaluando de este modo un tratamiento para una enfermedad, en particular una enfermedad neurológica, en dicho sujeto.

En otro aspecto, la invención incorpora un equipo para el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad, dicho equipo comprende:

(1) al menos un reactivo, seleccionado del grupo constituido por reactivos que detectan selectivamente:

(a): una molécula de ADN que codifica una molécula de proteína, en la que la secuencia de aminoácido de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma,

(b): un producto de transcripción de una molécula de ADN que codifica una molécula de proteína, en la que la secuencia de aminoácido de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma,

(c): una molécula de proteína en la que la secuencia de aminoácido de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma,

(d): una molécula de ADN capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2, bajo condiciones rigurosas,

(e): un producto de transcripción de una molécula de ADN, en el que dicha molécula de ADN es capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 bajo condiciones rigurosas,

(f): un producto de la traducción de una molécula de ADN, en el que dicha molécula de ADN es capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 bajo condiciones rigurosas,

(g): una molécula que afecta un nivel o una actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una sustancia que se selecciona del grupo constituido por (a) a (f),

(h): una molécula que es afectada en su nivel o su actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, por al menos una sustancia que se selecciona del grupo constituido por (a) a (f),

(2) instrucciones para diagnosticar o pronosticar dicha enfermedad mediante

(i): la detección de un nivel o una actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una sustancia que se selecciona del grupo constituido por (a) a (h) en una muestra de dicho sujeto;

y

(ii): el diagnóstico o pronóstico de dicha enfermedad en el que

: un nivel variado o actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una sustancia que se selecciona del grupo constituido por (a) a (h) comparado con un valor de referencia que representa un estado de salud conocido;

: o un nivel o actividad o bien ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una sustancia que se selecciona del grupo constituido por (a) a (h) similar o igual a un valor de referencia que representa un estado de enfermedad conocido que indica diagnóstico o pronóstico de dicha enfermedad.

En otro aspecto, el equipo puede usarse para controlar el éxito o el fracaso de un tratamiento terapéutico de dicho sujeto. También puede usarse para controlar la progresión de la enfermedad.

Las formas de realización de preferencia de los procedimientos y equipos antes mencionados de diagnóstico o pronóstico de las enfermedades o el control de la progresión de las mismas o evaluación de un tratamiento, se describen a continuación en detalle.

En una forma de realización de preferencia, la función de dicha molécula de proteína o de una variante funcional de la misma es proteger a las células de la degeneración y/o muerte celular.

En otra forma de realización de preferencia, dicha molécula de ADN capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular.

En las formas de realización de preferencia, dichos sujetos sufren de enfermedad de Alzheimer y trastornos neurofibrilares relacionados o estados degenerativos, por ejemplo, estados neurodegenerativos caracterizados por degeneración celular o muerte celular. Otros ejemplos de enfermedades neurológicas son la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y enfermedad de Pick.

Es de particular preferencia que dicha muestra sea un tejido cerebral u otras células corporales, incluyendo células del sistema muscular, próstata, estómago, testículos, ovarios, glándulas adrenales, glándulas mamarias, hígado, bazo, pulmón, tráquea o placenta. La muestra también puede ser líquido cefalorraquídeo u otro fluido corporal.

De acuerdo con la presente invención, la presencia de un estado patológico en dicho sujeto está indicada por una reducción en el nivel o actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de (i) un producto de transcripción de una molécula de ADN que codifica una molécula de proteína, cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma o (ii) una molécula de proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma, en una muestra tomada de dicho sujeto en relación con un valor de referencia que representa un estado de salud conocido. En particular, una reducción en el nivel o actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad del SELADIN-1 o transcriptos de SELADIN-1 en las regiones cerebrales de dicho sujeto afectadas fuertemente por una neurodegeneración en relación con un valor de referencia que representa un estado de salud conocido indica un diagnóstico o pronóstico de la enfermedad de Alzheimer. Predominantemente las neuronas dentro del lóbulo temporal inferior, el córtex entorrinal, el hipocampo y la amígdala degeneran en la enfermedad de Alzheimer.

Sería de preferencia que se haya determinado previamente que dicho sujeto tenga uno o más factores que indiquen que tal sujeto está afectado con una, enfermedad bajo estudio, en particular una enfermedad neurológica.

En formas de realización de preferencia, dicho sujeto puede ser un ser humano, un animal experimental, por ejemplo una rata o un ratón, un animal doméstico o un primate no humano, por ejemplo, un mono. El animal experimental puede ser un animal modelo para una enfermedad, por ejemplo, un ratón transgénico con una neuropatología de tipo Alzheimer.

En formas de realización de preferencia, se detecta al menos una de las mencionadas sustancias usando un inmunoensayo, un ensayo de actividad enzimática y/o un ensayo de unión.

En formas de realización de preferencia, se realiza una medición del nivel de los productos de transcripción del gen de SELADIN-1 o una variante funcional del mismo, en células corporales usando ensayos de transferencia Northern con sondas específicas para el gen de SELADIN-1 o dicha variante. También se puede aplicar PCR cuantitativo con combinaciones de cebadores para amplificar las secuencias específicas del gen SELADIN-1 del ADNc obtenido por la transcripción reversa del ARN extraído de las células corporales de un sujeto. Estas técnicas son conocidas por aquellos expertos en la técnica común (ver, por ejemplo Watson y col., Rekombinierte DNA, 2nd edition, Spektrum Akademischer Verlag GMBH, Heildelberg, 1993; Watson y col., Recombinant ADN, 2nd ed., W.H. Freeman and Company, 1992).

En formas de realización de preferencia, se detecta dicho nivel o actividad de la molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional o un fragmento de la misma, usando un inmunoensayo. Estos ensayos pueden medir la cantidad de unión entre dicha molécula de proteína y el anticuerpo antiproteína, por ejemplo un anticuerpo anti SELADIN-1, mediante el uso de marcadores enzimáticos, cromodinámicos, radioactivos o luminiscentes que se adhieren tanto a un anticuerpo antiproteína como a un anticuerpo secundario que une el anticuerpo antiproteína. Además, se pueden usarse otros ligandos de alta afinidad. Los inmunoensayos que pueden usarse incluyen por ejemplo ELISAs, transferencias Western y otras técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica (ver Harlow y col., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

El anticuerpo o ligando a usarse debería de preferencia detectar específicamente el SELADIN-1 o una variante funcional o fragmento del mismo. Resulta de preferencia que no interactúe sustancialmente con otra proteína presente en dicha muestra.

Los anticuerpos monoclonales capaces de reconocer una molécula de proteína de SEQ ID Nº 1 o una variante funcional o fragmento de la misma pueden prepararse usando procedimientos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo Köhler and Milstein, Nature 256, 495-497 1975; Kozbor y col., Inmunol. Today 4, 72, 1983; Cole y col., Monoclonal antibodies and cancer therapy, Alan R. Liss, Inc., pág 77-96, 1985; Marks y col., J. Biol. Chem., 16007-16010, 1992; cuyos contenidos están incorporados en este documento como referencia). Tales anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos pueden también producirse mediante procedimientos alternativos conocidos por los expertos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante (ver, por ejemplo Sastry y col., PNAS 86:5728, 1989; Watson y col., Rekombinierte DNA, 2nd ed., Spektrum Akademischer Verlag GMBH, 1993; Watson y col., Recombinant DNA, 2nd ed., W. H. Freeman and Company, 1992; cuyos contenidos se incorporan como referencia en este documento). Los anticuerpos monoclonales útiles en los procedimientos de la invención están dirigidos a un epitope de SELADIN-1 o a una variante funcional o fragmento del mismo, de manera tal que el complejo formado entre el anticuerpo y SELADIN-1 o entre el anticuerpo y dicha variante funcional o fragmento pueden reconocerse en ensayos de detección. El término "anticuerpo" abarca todas las formas de anticuerpos conocidas en la técnica, tales como anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, recombinatorios, de cadena simple así como fragmentos de los mismos que se unen específicamente a SELADIN-1 o a una variante funcional o a fragmento del mismo.

Podrían usarse también anticuerpos o ligandos para detectar específicamente las moléculas mencionadas en los procedimientos y equipos descritos anteriormente en g) y h).

Si se usan marcadores luminiscentes en cualquier ensayo de detección, resulta de preferencia usar un dispositivo óptico confocal.

En otra forma de realización de preferencia, dicho valor de referencia es el de un nivel o una actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al lo menos una sustancia que se selecciona del grupo constituido por (a) a (h) descritos anteriormente de una muestra de un sujeto que no sufre de la enfermedad bajo estudio, en particular una enfermedad neurológica tal como la enfermedad de Alzheimer. El sujeto sano puede ser del mismo peso, edad y género que el sujeto que está siendo diagnosticado o pronosticado para esa enfermedad. En algunos casos, sería de preferencia usar un valor de referencia del sujeto que se diagnostica.

En una forma de realización de preferencia, el nivel o la actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una de dichas sustancias (a) a (h) descritas anteriormente en una muestra se determina al menos dos veces, por ejemplo, en dos momentos separados por semanas o meses. Los niveles o actividades de esos dos puntos temporales se comparan para controlar la progresión de dicha enfermedad. Sería de preferencia tomar una serie de muestras durante un período de tiempo. En otras formas de realización de preferencia, dicho sujeto recibe un tratamiento previo a la toma de una o más muestras.

La invención puede emplearse en un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, en particular una enfermedad neurológica, a un sujeto y comprende la administración a dicho sujeto de un agente o agentes en una cantidad terapéuticamente eficaz, que afecta un nivel o una actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una sustancia seleccionada del grupo constituido por

En una forma de realización de preferencia, la función de dicha molécula de proteína o una variante funcional de la misma es proteger a las células de la degeneración y/o muerte celular.

En otra forma de realización de preferencia, dicha molécula de ADN capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células de la degeneración y/o muerte celular.

En formas de realización de preferencia, dichos sujetos sufren de la enfermedad de Alzheimer y de trastornos neurofibrilares relacionados o estados degenerativos, tales como estados neurodegenerativos, caracterizados por degeneración celular o muerte celular. Otros ejemplos de enfermedades neurológicas son, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y la enfermedad de Pick.

En formas de realización de preferencia, el procedimiento comprende la aplicación de procedimientos conocidos per se de tecnología de ácido nucleico de terapia génica para administrar dicho agente o dichos agentes.

En general, la terapia génica incluye diversos enfoques: reemplazo molecular de un gen mutado, agregado de un nuevo gen que da como resultado la síntesis de una proteína terapéutica, y modulación de la expresión génica celular endógena mediante procedimientos de expresión recombinantes o mediante fármacos. Las técnicas de transferencia génica están descritas en detalle (ver, por ejemplo Behr, Acc. Chem. Res. 26, 274-278, 1993; Mulligan, Science 260, 926-931, 1993; cuyos contenidos están incorporado como referencia en este documento) e incluyen las técnicas de transferencia genética directas tales como microinyección mecánica de ADN en una célula así como también técnicas indirectas que usan vectores biológicos (como virus recombinantes, especialmente retrovirus) o liposomas modelo o técnicas basadas en la transfección con coprecipitación de ADN con policationes, perturbación de la membrana celular mediante medios químicos (solventes, detergentes, polímeros, enzimas) o físicos (mecánicos, osmóticos, térmicos, choques eléctricos. La transferencia del gen postnatal dentro del sistema nervioso central se describió en detalle (ver, por ejemplo, Wolf, Current Opinion in Neurobiology, 3, 743-748, 1993; cuyos contenidos están incorporados en este trabajo como referencia).

En formas de realización de preferencia, el procedimiento comprende el transplante de células del donante en el sistema nervioso central, de preferencia en el cerebro, de dicho sujeto y dichas células del sujeto o del donante de preferencia tratadas de modo de minimizar o reducir el rechazo al transplante, en el que dichas células del donante se modifican genéticamente mediante la inserción de al memos un transgen que codifica dicho agente o agentes. Dicho transgen puede ser transportado por un vector viral, en particular por un vector retroviral. El transgen puede insertarse dentro de las células del donante por una transfección física no viral de ADN que codifica un transgen, en particular mediante microinyección. La inserción del transgen puede también llevarse a cabo por medio de electroporación, transfección mediada químicamente, en particular por transfección de fosfato de calcio, transfección mediada liposomal, etc..

En formas de realización de preferencia, dicho agente es una proteína terapéutica que puede administrarse a dicho sujeto, de preferencia a un ser humano, mediante un procedimiento que comprende la introducción de células del sujeto dentro de dicho sujeto, células del sujeto que hayan sido tratadas in vitro para insertarles un segmento de ADN que codifica dicha proteína terapéutica, células del mismo sujeto que expresan in vivo en dicho sujeto una cantidad eficaz de dicha proteína terapéutica. Puede insertarse dicho segmento de ADN en dichas células in vitro mediante un vector viral, en particular, un vector retroviral.

En formas de realización de preferencia, el ácido nucleico o proteína terapéuticos reducen o previenen la degeneración de las células, en particular las neuronas y retrasa la formación de amiloide cerebral.

En otro aspecto, la invención incorpora un procedimiento para identificar un agente que afecta una actividad o nivel o ambos, dicho nivel o dicha actividad, de al menos una sustancia que se selecciona del grupo constituido por:

que comprende las etapas de:

(i): proveer una muestra que contiene al menos una sustancia seleccionada del grupo constituido por (a) a (f),

(ii): poner en contacto dicha muestra con al menos un agente,

(iii): comparar una actividad o nivel o ambos, dicha actividad y nivel, de al menos una de dichas sustancias antes y después de ponerlas en contacto.

De preferencia, la función de dicha molécula de proteína o de una variante de la misma es proteger las células de la degeneración y/o muerte celular. De preferencia, dicha molécula de ADN capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger las células contra la degeneración y/o muerte celular.

Otras características y ventajas de la invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de las figuras, los ejemplos y las reivindicaciones.

La Figura 1 muestra la vulnerabilidad selectiva de las regiones cerebrales en la enfermedad de Alzheimer. Predominantemente, las neuronas dentro del lóbulo temporal inferior, el córtex entorrinal, el hipocampo y la amígdala degeneran en enfermedad de Alzheimer (Terry y col., Annals of Neurology, 10, 184-192, 1981). Estas regiones cerebrales están involucradas predominantemente en el procesamiento de las funciones del aprendizaje y la memoria. En contraste, las neuronas dentro del córtex frontal, del córtex occipital y del cerebelo están en su mayor parte intactas y preservadas del proceso degenerativo en la enfermedad de Alzheimer.

La Figura 2 describe la identificación de genes expresados diferencialmente en regiones cerebrales de pacientes con Alzheimer. Se identificaron y se les extrajo el ARN a las áreas cerebrales con pérdidas masivas de células neuronales así como las áreas con neuronas altamente preservadas. Se realizó la síntesis del ADNc usando un cebador oligo d-T seguido por PCR usando el cebador oligo d-T en combinación con cebadores aleatorios y (\alpha^{35}S)-dATP. Las reacciones se separaron sobre geles de secuenciación de ADN, se visualizaron las bandas de ADN mediante autorradiografía y se recortaron bandas con iluminación de diferentes intensidades. Los fragmentos de ADN se reamplificaron mediante PCR, se clonaron en E. coli y se determinaron las secuencias. Se llevó a cabo la expresión y los análisis
funcionales.

La Figura 3 muestra las especificaciones del tejido cerebral de la enfermedad de Alzheimer del modo que se usó en los ejemplos. Se extrajeron tejidos cerebrales de los pacientes con enfermedad de Alzheimer y de los sujetos control dentro de las 6 horas de la muerte y se congelaron inmediatamente en hielo seco. Para la extracción de ARN se eligieron secciones de tejidos del lóbulo temporal inferior y del córtex frontal.

La Figura 4 describe la cuantificación de los transcriptos de SELADIN-1 en el tejido cerebral de los sujetos con enfermedad de Alzheimer y los sujetos control, mediante análisis de transferencia Northern. Los niveles transcriptos eran significativamente menores en las regiones cerebrales con neurodegeneraciones severas, es decir, el lóbulo temporal en la enfermedad de Alzheimer (AD 1-3) pero no en el cerebro normal (NB1-3) en comparación con las regiones protegidas del cerebro, es decir, el lóbulo frontal. Esta disminución fue específica como se indica mediante los niveles de transcriptos \beta-actina no cambiados usados como control para una carga igual de ARN.

La Figura 5 muestra los niveles de transcripción del gen de SELADIN-1 en diferentes regiones del cerebro humano. Se encontró que el gen de SELADIN-1 se expresó a través de todo el cerebro humano. En particular los niveles de transcripción son altos en todas las áreas corticales, el hipocampo, la amígdala, la médula espinal y la médula. Nótese los niveles sin cambio en el lóbulo temporal versus el lóbulo frontal en este cerebro derivado de un sujeto control cognitivamente normal sin signos de la enfermedad de Alzheimer. Los análisis de trascriptos de \beta-actina se usaron como control de carga.

La Figura 6 muestra la distribución de los transcriptos de SELADIN-1 en tejidos humanos. Se transfirieron muestras comparables de ARN sobre filtros de nitrocelulosa y se cuantificaron los transcriptos de SELADIN-1 mediante hibridación usando una sonda específica del gen de SENALDIN-1 marcada. Se encontraron niveles significativos de transcriptos del gen de SELADIN-1 en todas las regiones cerebrales probadas. También se detectaron transcriptos en otros tejidos, sin embargo, fuertes variaciones en la intensidad de la señal indicaron una regulación específica de tejido de la expresión de SELADIN-1.

La Figura 7 muestra la expresión del gen de SELADIN-1 en el córtex, hipocampo y núcleo basal del cerebro de ratas, analizados mediante hibridación in situ. Este patrón de tinción, junto con los mayores aumentos indica que SELADIN-1 se expresa predominantemente en neuronas. No se observaron señales de hibridación significativas en las células gliales.

La Figura 8 muestra la expresión de SELADIN-1 en núcleos cerebrales de ratas. Se encontró una fuerte expresión de SELADIN-1 en los núcleos oculomotor, paraventricular, rojo y facial. Los mayores aumentos indican una hibridación predominante con neuronas. No se observaron señales significativas de hibridación con las células gliales.

La Figura 9 muestra la expresión de SELADIN-1 en hipocampo y sustancia nigra cerebral en ratas. Se detectó la hibridación in situ con transcriptos de SELADIN-1 mediante autorradiografía con emulsión fotográfica, confirmando la expresión neuronal específica de este gen.

La Figura 10 describe la localización subcelular de una fusión SELADIN-1-EGFP (proteína fluorescente verde en células cos transfectadas. Las micrografías obtenidas con microscopia confocal muestran la localización conjunta de la fusión SELADIN-1-EGFP con la tinción específica de Golgi BODIPY TR ceramida que indica la localización de SELADIN-1 en el aparato de Golgi y el retículo endoplásmico.

La Figura 11 describe que la fusión SELADIN-1-EGFP no localiza en las mitocondrias en células cos transfectadas a pesar de una secuencia blanco mitocondrial putativa cercana al extremo N-terminal de la proteína SELADIN-1. Las micrografías obtenidas con microscopia confocal muestran los diferentes patrones de tinción causados por la fusión de SELADIN-1-EGFP y la tinción mitocondrial específica Mito Tracker Red CM-H_{2}XRos.

La Figura 12 describe las características estructurales de la proteína de SELADIN-1 basadas en alineamientos de secuencias múltiples y predicciones de estructura secundaria. Cerca del extremo N-terminal, la proteína SELADIN-1 contiene una señal de localización mitocondrial putativa que parece estar inactiva en las células cos transfectadas o cuando se usan en fusiones EGFP. La región central de la proteína contiene una secuencia homóloga a una familia de oxidorreductasas y que contiene un sitio FAD para enlace covalente. Se predice que la proteína contiene cinco regiones transmembrana. La expresión en neuronas, la localización conjunta en el aparato de Golgi y el retículo endoplásmico de la proteína SELADIN-1, la proteína precursora del amiloide (APP) y las presenilinas PS1 y PS2 y además el carácter de transmembrana sugiere una relación funcional entre estas proteínas. Se demostró que las mutaciones, tanto en la APP como en la presenilina, causan un aumento en la producción de \beta-amiloide. De un modo similar la proteína SELADIN-1 podría estar involucrada en las vías biológicas comunes que influencian el procesamiento de la proteína precursora de amiloide y la generación de A\beta. Usando la proteína SENADIN-1 como una sonda, pueden identificarse componentes asociados en la interacción, que podría representar nuevos fármacos blanco en AD.

La Figura 13 describe la secuencia de la proteína SELADIN-1 (SEQ ID Nº 1). La proteína de tamaño completo está constituida por 516 residuos de aminoácidos. La secuencia está dada en el código de aminoácidos de una letra.

La Figura 14 describe la secuencia de nucleótidos de ADNc de SELADIN-1 clonado (SEQ ID Nº 2) que comprende 4248 nucleótidos. La secuencia que codifica la proteína SELADIN-1 comienza en la posición del nucleótido 100 y se detiene en la posición 1648.

La Figura 15 describe la comparación de las secuencias de nucleótidos del ADNc de SELADIN-1 clonado que comprende 4248 nucleótidos y el ADNc de KIAA0018 que comprende 4186 nucleótidos. Existe una diferencia significativa en la posición 1228 de la secuencia de SELADIN-1 donde falta un nucleótido C (C/G par de bases) en la secuencia KIAA0018. Esto da como resultado un cambio en el marco abierto de lectura en la secuencia de KIAA0018 en relación con la secuencia de SELADIN-1. La consecuencia es que el producto de traducción del gen KIAA0018 es de una longitud de 390 aminoácidos comparado con los 516 residuos de aminoácidos del producto de traducción de SELADIN-1. Además de la diferencia de longitud, el cambio de marco ocasiona una diferencia entre los 14 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína KIAA0018 y el área de la secuencia correspondiente del polipéptido SELADIN-1 (pos. 377-390). La secuencia de codificación para la proteína SELADIN-1 comienza en la posición del nucleótido 100 y se detiene en la posición 1648.

La Figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos de SELADIN-1. Un enfoque diferente (von der Kammer, H y col., Nucleic acid research, 27, 2211, 1999; von der Kammer, H. y col., J. Biol. Chem. 273, 14538, 1998) para identificar genes que están expresados de manera diferencial en poblaciones de células selectivamente vulnerables en el córtex temporal inferior con una neurodegeneración confirmada y en la corteza frontal o sensorial y motora notablemente preservada del mismo sujeto en tres cerebros con un diagnóstico histopatológico de enfermedad de Alzheimer y con intervalos de tiempo post mortem de menos de cuatro horas. Usando cuarenta diferentes combinaciones de cebadores, se clonaron y secuenciaron veintiocho de treinta y seis ADNc expresados diferencialmente. Estos ADNc se analizaron además mediante ensayos de transferencia Northern Inversa (Poirier G. M. C. y col., Nucleic Acid Res., 25, 913, 1997; Van Gelder R. N. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1663, 1990) para confirmar expresiones diferenciales entre las dos regiones cerebrales de la enfermedad de Alzheimer (AD). La expresión de uno de estos ADNc fue marcadamente menor en el lóbulo temporal inferior que en el córtex sensorial y motor. Por lo tanto, se investigó la importancia potencial de este transcripto para la vulnerabilidad selectiva en cerebros con AD. La secuencia de ADNc está constituida por 4248 nucleótidos y codifica un marco abierto de lectura de 516 residuos de aminoácidos. A causa de una inserción de citidina en la posición de nucleótido 1167, esta secuencia difirió de la región con código mucho más corta codificadora de su homólogo KIAA0018 depositada en GenBank (Nomubra y col., D N A Res., 1, 27, 1994; acceso a la base de datos GenBank HUMRSC390D13643, 1, 1992; DIMH Human Q15392, 1998). Se denominó al nuevo gen SELADIN-1. El dominio de homología para las oxidorreductasas está destacado en rojo; se subrayan las homologías de "proteínas símil diminuto" de otras especies. Los primeros 21 residuos de aminoácidos representan un péptido de señal putativa. Se destaca en color amarillo un posible motivo de reconocimiento de caspasa. Este posible motivo de reconocimiento de caspasa putativo "LEVD" está presente dentro de la secuencia de aminoácidos de SELADIN-1 en la posición 121-125. El clivaje in vitro de SELADIN-1 mediante caspasa 3 ó 6 generó cuatro fragmentos diferentes de SELADIN-1 de aproximadamente 50, 40, 30 y 20 kDa, respectivamente. Las predicciones de estructuras secundarias revelaron al menos cuatro posibles dominios transmembrana.

La Figura 17 muestra la transferencia Northern de un cerebro con la enfermedad de Alzheimer (AD) y de un cerebro normal control. En los cerebros con AD, la expresión de SELADIN-1 fue sustancialmente menor en el lóbulo temporal inferior en comparación con el córtex frontal. En contraste, no existió diferencia en la expresión entre estas dos regiones en los cerebros control normales (Fig. 17 A, B). Así, la expresión diferencial de SELADIN-1 entre el córtex temporal y frontal dentro de cerebros individuales con AD observadas inicialmente tanto mediante análisis de expresión diferencial como con transferencia Northern, se confirmó independientemente en otros tres pacientes. SELADIN-1 se expresa fuertemente a través del cerebro humano normal con una mayor expresión en los córtices, en la medulla oblongata y en la médula espinal así como en la sustancia nigra y el hipocampo (Fig.17B). A. Se separaron 10 \mug de ARN total por campo, extraídos con el reactivo Trizol Reagent (Gibco) del córtex frontal o del córtex temporal inferior de tres cerebros diferentes con AD en un gel de formaldehído-agarosa al 0,8% y se transfirieron a una Membrana Hybond-N+- de Nylon (Amersham). Cerebro 1: intervalo de tiempo post mortem 3:30 horas, masculino, 72 años. Cerebro 2: intervalo de tiempo post mortem una hora y media, masculino, 62 años. Cerebro 3: intervalo de tiempo post mortem 4 horas, femenino, 63 años. Cerebro control: cerebro normal, intervalo de tiempo post mortem 1:10 horas, femenino, 80 años. Se hibridaron las transferencias con una sonda de ADNc control marcada con ^{32}P de \beta-actina humana como la provista por Clontech para el análisis de transferencia Northern II y III para múltiple tejido cerebral humano. B. Ensayos de transferencia Northern II (Clontech 7755-1) y III (Clontech 7750-1) de tejido múltiple de cerebro humano conteniendo 2 \mug de poliA + ARN por campo de 16 diferentes regiones del cerebro humano. Se hibridaron las transferencias con las mismas sondas descritas en A.

La Figura 18 muestra la expresión de Seladin-1 en cerebro de rata. Se llevó a cabo la hibridación in situ de secciones obtenidas mediante criostato fijadas en paraformaldehído como describen Hartman y col. (Developmental Neuroscience 17, 246, 1995). Se amplificaron un fragmento de 650 pares de bases y uno de 900 pares de bases del marco abierto de lectura de Seladin-1 mediante PCR usando los siguientes cebadores:

1s (76-99) 5' GCG CTT ACC GCG CGG CGC CGC ACC 3'	(SEQ ID Nº 3)

1as (749-726) 5' GAC CAG GGT ACG GCA TAG AAC AGG 3'	(SEQ ID Nº 4)

3s (803-826) 5' AGA AGT ACG TCA AGC TGA GTT TCG 3'	(SEQ ID Nº 5) y

3as (1749) 5' TTC TCT TTG AAA GTG TGG ATC TAG 3'	(SEQ ID Nº 6).

Se clonaron los fragmentos de PCR en el vector pGEM-Teasy (Promega), se cortaron con EcoRI y clonaron en pBluescript KS+. Se analizó la orientación de los fragmentos clonados en EcoRI por medio de PCR. Se generaron ribosondas con sentido y antisentido marcadas con ^{35}S-UPT usando el equipo Ambion Maxiscript, en plásmidos linealizados NotI y ClaI con T3 y T7 Polimerasa, respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se sumergieron las secciones hibridadas en emulsión fotográfica NTB-3 (Kodak), se expusieron durante 5 semanas y se realizó contratinción con hemalum de Mayer. A, D, G muestran microfotografías de las secciones sumergidas en la emulsión. pvn: núcleo paraventricular, bnM: núcleo basal de Meynert, amy: amígdadla, ocmm: núcleo oculomotor, rn: núcleo rojo, fn: núcleo facial. B es una ampliación de un campo oscuro de la región del hipocampo. dg: gyrus dentado. C es una ampliación de un campo oscuro de la capa cortical cinco cI V. E, H muestran microfotografías de campo claro más aumentadas de las regiones de interés de D y G. F, I DIC (contraste por interferencia diferencial) son aumentos mayores de E y H para demostrar neuronas teñidas con granos de plata. En el cerebro de rata, la expresión de SELADIN-1 fue alta en la región del hipocampo CA3 (Fig. 18 A, B), en las neuronas piramidales de la capa cortical cinco (Fig. 18 A, C), en la amígdala (Fig. 18 A), en las neuronas magnocelulares del núcleo basal de Meynert (Fig. 18 A) y en la zona reticular de la sustancia nigra (datos no mostrados). Además, se detectaron también trasncriptos en diversos núcleos del cerebro, incluyendo el núcleo paraventricular (Fig. 18 A), el núcleo oculomotor (Fig. 18 D, E), el núcleo facial (Fig. 18 G, F) así como en el núcleo rojo (Fig. 18 D, E).

La Figura 19 muestra la hibridación in situ de AD humana (A-D) y de cerebro normal (E-H). La hibridación in situ en las secciones incluidas se llevó a cabo como está descrito (U. Süsens, Dev. Neurosci. 19, 410, 1997). Las ribosondas marcadas con ^{35}S-UTP derivaron de los primeros 650 nucleótidos del marco abierto de lectura de Seladin-1 clonado en pBluescript KS+ como se describió en la Figura 18. Se sumergieron los portaobjetos hibridados en emulsión Kodak NTB-2, se expusieron durante 4 semanas. Tras el desarrollo, se tiñeron las secciones con Giemsa. A, C, E y G muestran imágenes de campo oscuro y B, D, F, H las correspondientes microfotografías en campo claro. Para potenciar la visibilidad de los granos de plata en las imágenes en campo claro, se muestran aumentos mayores. A, B patrón de hibridación representativo de Seladin-1 en córtex medio frontal de cerebro con AD. C, D patrón de hibridación representativo de Seladin-1 en córtex temporal superior de cerebro con AD. E, F patrón de hibridación representativo de Seladin-1 en córtex medio frontal en cerebro normal. G, H patrón de hibridación representativo de Seladin-1 en córtex temporal superior de cerebro normal. Los extremos de las flechas indican neuronas con granos de plata; las flechas indican neuronas con solo unos pocos granos (D). La hibridación in situ de cerebros humanos con AD y cerebros control para estudiar la expresión de SELADIN-1 dentro de neuronas únicas, demostró que el ARNm de SELADIN-1 estaba disminuido en las neuronas remanentes del córtex temporal en comparación con las neuronas en el córtex frontal en cerebros con AD (Fig. 19, A-D, flechas). En contraste, en los cerebros normales, la expresión neuronal de SELADIN-1 fue idéntica en el córtex frontal y el córtex temporal (Fig. 19, E-H, extremos de las flechas), confirmando los datos de los análisis de expresión diferencial y de transferencia Northern. Los niveles disminuidos de ARNm de SELADIN-1 en el córtex temporal comparado con el córtex frontal en el cerebro con AD se debieron no sólo a la pérdida de células sino que también se redujo dentro de las neuronas remanentes.

Figura 20. Para analizar la función de SELADIN-1 como una oxidorreductasa putativa, se transfectaron células de neuroglioma humano H4 con Seladin-1 fusionado en su extremo C-terminal a EGFP (proteína fluorescente verde, Clontech). A Se recogieron las células que se mantuvieron unidas a la placa de cultivo así como las células en el sobrenadante 10 y 16 horas tras la incubación de tres clones de seladin-1-EGFP y tres clones de EGFP-control en OptiMEM1 conteniendo 200 \muM de H_{2}O_{2}, y se tiñeron con 7-Amino-actinomicina D (7-ADD) como sonda de viabilidad estándar en citometría de flujo para distinguir células viables de no viables. Sólo las membranas de células muertas y dañadas son permeables a esta tinción de ADN y se tiñen positivamente. Se realizaron recuentos viva/muerta en FACSCalibur (Becton Dickinson) contando 10^{5} células por clon. Se muestran las medias de 2 experimentos por triplicado (\pm EEM). Todos los clones expresando SELADIN-1 toleraron es estrés oxidativo inducido con H_{2}O_{2} mucho mejor que los clones no transfectados o que expresan EGFP. Tras diez horas de tratamiento con 200 \muM de H_{2}O_{2} cerca del 90% de las células que expresan SELADIN-1 y 75-80% de las células control fueron viables; tras dieciséis horas de incubación con 200 \muM de H_{2}O_{2}, sin embargo, 80% de las células expresando SELADIN-1 estaban aún vivas mientras que sólo el 52% de las células control estaban vivas en este punto. Los clones control sin tratamiento revelaron un máximo de 5% de células muertas en intervalos de tiempo equivalentes. Las tasas de supervivencia aumentadas en las células que expresan SELADIN-1 tras la exposición prolongada al estrés oxidativo se confirmaron mediante dos enfoques independientes: Primero, se realizaron conteos de células vivas/muertas en células teñidas con azul tripán en placas de cultivo celular y se visualizaron en microscopio de contraste de fase en diez campos elegidos aleatoriamente. Segundo, se tiñeron los núcleos de células cultivadas en cubreobjetos y fijadas con paraformaldehído al 4%, con colorante 33342 de Hoechst (Molecular Probes) y se visualizaron por medio de microscopía de fluorescencia (datos no mostrados). Estas mediciones confirmaron que la expresión de SELADIN-1 confirió resistencia contra la inducción de muerte celular.

B Para determinar un marcador temprano de muerte celular apoptótica, se midió la actividad de caspasa 3 en lisados celulares de tres clones de SELADIN-1-EGFP y tres clones control EGFP usando el equipo de ensayo de caspasa 3 de Pharmingen. Tras la inducción de la apoptosis con 200 \muM de H_{2}O_{2} durante 2 ó 4 horas, respectivamente, se lavaron las células en PBS y se lisaron en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,5, NaCl 130 mM, Triton-X-100 1%, NaPPi 10 nM (2 millones de células/ml). Se incubaron 50 \mul de lisados celulares en 200 \mul de tampón HEPES durante 1 hora a 37ºC con 5 \mug de sustrato fluorogénico de caspasa Ac-DEBD-CHO en una placa de 96 pocillos. El AMC liberado de Ac-DEVD tras el clivaje con caspasa se midió en un espectrofluorómetro (Spectramax Gemini, Molecular Devices) con una longitud de onda de excitación de 380 nm y un espectro de longitudes de onda de emisión desde 420 hasta 460 nm. Se muestran los promedios de la actividad de caspasa 3, medidos en RFU (medidas de fluorescencia relativa) de dos experimentos por triplicado (\pm EEM). Dos horas tras la inducción de apoptosis con 200 \muM de H_{2}O_{2}, la actividad de caspasa 3 no fue detectable ni en los clones SELADIN-1EGFP no en los clones control EGFP. Tras 4 horas, sin embargo, la actividad de caspasa 3 aumentó fuertemente y resultó ser de aproximadamente el doble en tres clones control EGFP comparada con tres clones SELADIN-1-EGFP. Este aumento en la actividad de caspasa 3 se bloqueó en cualquier condición por el inhibidor de caspasa Ac-DEVD-CHO.

La Figura 21 muestra la localización subcelular de SELADIN-1. Se cultivaron 114 células de neuroglioma humano que expresan establemente una proteína de fusión de SELADIN-1 con el extremo N-terminal de EGFP (Clontech) en cubreobjetos y se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS o se trataron durante 45 min con 250 nM del colorante mitocondrial fluorescente rojo MitoTracker red CM H_{2}Xros (Molecular Probes) previo a la fijación. Tras la fijación, las células que no se pretiñeron con el MitoTracker se permeabilizaron en Triton-X 100 al 0,2% en PBS y se bloquearon durante la noche a 4ºC en leche baja en grasas al 5%, Triton-X 100 al 0,1% en PBS. Se incubaron las células durante 2 horas a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal contra la antiproteína de ratón isomerasa disulfuro (antiPDImAb, StressGen Biotechnologies Corp.), un marcador para el retículo endoplásmico, se lavaron e incubaron durante otra hora con una IgG anti-ratón, anticuerpo secundario marcado CY3 (Amersham). Las células se visualizaron con microscopía de barrido confocal láser. A, D Distribución subcelular de la proteína fluorescente verde SELADIN-1-EGFP. B Tinción del retículo endoplásmico con antiPDImAb y el anticuerpo secundario marcado CY3 rojo fluorescente. C La superposición de A y B muestra la colocalización de SELADIN-1 con el marcador ER, indicado como fluorescencia amarilla. E Tinción de mitocondria con MitoTracker CM H_{2}Xros rojo fluorescente. F Superposición de D y E. Estos estudios de colocalización con marcadores y anticuerpos contra diversas organelas subcelulares indican que SELADIN-1-EGFP se localiza en su mayoría en el retículo endoplásmico y no en la mitocondria, a pesar de la presencia de una señal de localización mitocondrial putativa en el extremo N-terminal de SELADIN-1.

Se ha identificado un gen nuevo de SELADIN-1 que tiene holomogía con oxidorreductasas dependientes de FAD. Se demostró que sufrió una regulación negativa en regiones selectivamente vulnerables del cerebro con AD. La hibridación in situ de secciones de cerebros con AD demostró que los niveles disminuidos de ARNm no sólo se deben a la pérdida neuronal en las áreas afectadas sino que también reflejan la expresión disminuida de ARNm de las neuronas restantes. La expresión de SELADIN-1 en células H4 confirió resistencia a la apoptosis por estrés oxidativo, aún tras la ejecución de la apoptosis, SELADIN-1 es clivado en sitios de clivaje putativos de caspasa y es por lo tanto presumiblemente inactivado. Estos resultados indican que SELADIN-1 es un componente integral de la maquinaria celular protectora de células, en particular neuronas, del estrés oxidativo. Una vez que el estrés oxidativo se vuelve arrollador, SELADIN-1 se convierte en un blanco para la acción de caspasa en el curso de la apoptosis. El gen de SELADIN-1 es un buen candidato para intervención terapéutica para proteger a las células contra la degeneración y muerte celular. Es en particular, un gen apropiado para intervención terapéutica para proteger neuronas de la citotoxicidad inducida por A\beta.

Ejemplo I

Tejidos cerebrales de enfermedad de Alzheimer post-mortem

Se extrajeron tejidos cerebrales de pacientes con enfermedad de Alzheimer y sujetos control dentro de las 6 horas desde la muerte y se congelaron inmediatamente en hielo seco. Se fijaron secciones paralelas en formaldehído para confirmación histopatológica del diagnóstico y para hacer conteos celulares. Las áreas cerebrales con pérdida masiva de células neuronales así como las áreas muy conservadas se identificaron para comparar la expresión genética y se almacenaron a -80ºC hasta realizar la extracción de ARN.

Identificación de SELADIN-1 por medio de análisis PCR de expresión diferencial

Se preparó el ARN total de tejidos cerebrales post-mortem usando el equipo RNrasy (Qiagen). Se trataron las preparaciones de ARN con ADNasa I (Boehringer Mannheim) junto con ARNsin (Promega) durante 30 minutos, seguidamente se extrajo con fenol y se precipitó con etanol. Se transcribieron 0,2 mg de cada preparación de ARN al ADNc por medio de Expand Reverse Transcriptase (Boehringer Mannheim) con cebadores de anclaje de una base HT_{11}A, HT_{11}C y HT_{11}G. En la reacción de PCR siguiente, se amplificaron los ADNc usando sólo HT_{11}A con los cebadores HAP-5 (5'-TGCCGAAGCTTGGAGCTT-3') y HAO3-T (5'TGCCGAAGCTTTGGTCAT-3') aleatoriamente. Se usaron Taq-polimerasa (AmpliTaq, Perkin Elmer Corp.), dGTP, dCTP y dTTP (Amersham Pharmacia Biotech) y (\alpha^{35}S)-dATP (NEN productos de ciencias de la vida) en un protocolo de PCR de acuerdo con Zhao y col. Se separaron los productos de PCR en geles de secuenciación de poliacrilamida urea al 6% y se secaron subsiguientemente en papel de filtro de 3 mm (Whatman) y se expusieron a películas de rayos X (Dupont) durante 12 horas.

Clonación y secuenciación

Se extrajeron las bandas diferenciales del gel, se hirvieron en agua durante 10 minutos, se centrifugaron y se precipitó el ADNc de los fluidos sobrenadantes usando etanol y glucógeno/acetato de sodio, seguidamente se dializó contra glicerol al 10% durante 1 hora a través de filtros de 0,025 mm (tipo VS, Millipore). Se usaron los dializados como plantilla para las reacciones de reamplificación, que se realizaron en idénticas condiciones que el PCR de expresión diferencial, con la excepción del ciclo inicial para apareamiento no específico. Se separaron los productos de PCR por electoforesis en agarosa, se purificaron con el equipo QIAEXII Agarose Gel Extraction Kit (Qiagen) y se clonaron en el sitio de restricción Hind III de pBluescript KS (Stratagene). Los fragmentos de ADNc clonados se secuenciaron con un secuenciador ABI 377 ADN (Perkin Elmer Corp.) usando cebadores T3 y T7.

Amplificación de un fragmento de ADNc de SELADIN-1

Se amplificó un fragmento de ADNc de SELADIN-1 usando ADNc transcrito de tejido cerebral humano usando Taq polimerasa RNA High Fidelity (Boehringer Mannheim) y cebadores específicos de SELADIN-1 para una reacción PCR con 40 ciclos de apareamiento de 70ºC durante 1 minuto, y polimerización a 72ºC durante 3 minutos. Se separaron los productos de PCR con elecroforesis en gel de agarosa, se purificaron y se clonaron en un sitio de restricción Sma I de pBluescript KS (Stratagene). Se secuenció el producto de PCR clonado y se usó como sonda tanto para seleccionar la biblioteca de ADNc de cerebro humano como para las sondas de transferencia Northern.

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Transferencia Northern

Se preparó ARN total de cerebros humanos post-mortem usando reactivo Trizol (Gibco BRL, Life Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se separaron 5-10 mg de ARN en geles de agarosa conteniendo formaldehído al 1% y se colocó el ARN en membranas de nylon (Hybond-N^{+}, Amersham). Se hibridaron las membranas con sondas ADNc específicas de SELADIN-1 marcadas con (NEN) (\alpha^{32}P)-dCTP que se generaron usando el equipo de marcación Megaprime DNA (Amersham). Se lavaron las membranas bajo condiciones altamente rigurosas y se expusieron películas de rayos X durante 1 a 72 horas. Para controlar la carga equivalente de ARN, se sondaron las membranas idénticas con un fragmento de ADNc de 700 pb de glicerolaldehid-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) o con un fragmento de ADNc de b-actina (Clontech).

Hibridación in situ

Se clonaron diversas sondas de ADNc específicas de SELADIN-1 de 650 pb y de 900 pb que representan las dos partes iniciales del marco abierto de lectura en pBluescript (Stratagene) y se realizó transcripción inversa en presencia de ^{35}S-CTP usando el equipo de transcripción Ambion. La hibridación in situ se realizó con secciones de 14 mm de cerebro de rata adulta cortados con criomicrótomo, se montaron en portaobjetos tratados con aminoalquilsilano y se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Tras el lavado durante 5 minutos en PBS, se acetilaron las secciones durante 10 minutos, se pasaron a través de una serie soluciones de etanol de grados crecientes y se secaron al aire. Las prehibridaciones se realizaron en formamida desionizada al 50%, EDTA 25 mM, Pipes 25 mM, pH 6,8, NaCl 0,75 M, SDS 0,2%, 5 x Denhardt's, DTT 10 mM, 250 mg/ml de ADN desnaturalizado de esperma de arenque y 250 mg/ml de ARNt de levadura. La hibridación de los portaobjetos con ARN con sondas con sentido y antisentido diluidas a 2000-5000 cpm/ml en el mismo tampón con dextransulfato al 10% adicional se llevó a cabo a 50ºC durante 12 horas. Posteriormente se lavaron los portaobjetos cuatro veces en 4 x SCC durante 5 minutos cada uno, posteriormente se incubaron durante 30 minutos a 37ºC con 40 mg/ml de ARNseA en NaCl 0,5 M, tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM y otros 30 minutos sin ARNseA. Posteriormente se lavaron los portaobjetos durante 15 minutos a 50ºC en 2 x SCC y se secaron a través de un gradiente de etanol. Se expusieron los portaobjetos a películas de rayos X Kodak Biomax durante 15 días y a continuación se sumergieron en la emulsión de trazas nucleares Kodak NTB-3 y se expusieron durante 6 semanas. Tras el revelado en Kodak D19 y fijación en Kodak Unifix, se contratiñeron los portaobjetos con Hemalum de Mayer y se les colocaron cubreobjetos.

Expresión recombinante de proteínas de fusión SELADIN-1-EGFP en cultivos celulares

Se subclonó la región codificadora completa de SELADIN-1 en el extremo N-terminal del vector de expresión pEGFP-N1 (Clontech). Se transfectaron células Cos 7 con EGFP o con SELADIN-1-EGFP usando el reactivo de transfección SuperFect de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cultivaron las células en placas de 3 cm durante 2 días. Parte de las células se tiñeron para el aparto de Golgi con ceramida BODYTRIP TR 0,25 mM (Molecular Probes) durante una hora, la otra parte se trató con 250 nM de colorante mitocondrial Mito Tracker Red CM-H_{2}Xros (Molecular Probes) durante 45 minutos, se analizó la localización subcelular de la proteína de fusión SELADIN-1-EGFP con microscopia de barrido confocal láser usando la serie adecuada de filtros.

Claims

1. Un ácido nucleico aislado que codifica una molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular, en la que la secuencia de aminoácidos de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ Nº 1 o una variante funcional de la misma.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 3, en la que la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADNc.

5. Una molécula de ADN aislada que codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular, capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 bajo condiciones rigurosas.

6. Una molécula de ácido nucleico aislada de las reivindicaciones 2 ó 5 que codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células del sistema nervioso, sistema muscular, próstata, estómago, testículos, ovarios, glándulas adrenales, glándulas mamarias, hígado, bazo, pulmón, tráquea o placenta contra la degeneración y/o muerte celular.

7. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un vector de acuerdo con la reivindicación 7 en el que dicho vector es un plásmido, un virus o un bacteriofago.

9. Un plásmido de acuerdo con la reivindicación 8 en el que dicho plásmido está adaptado para la expresión en una célula de levadura y además comprende los elementos regulatorios necesarios para la expresión de dicha molécula de ácido nucleico.

10. Un plásmido de acuerdo con la reivindicación 8 en el que dicho plásmido está adaptado para la expresión en una célula bacteriana y además comprende los elementos regulatorios necesarios para la expresión de dicha molécula de ácido nucleico.

11. Un plásmido de acuerdo con la reivindicación 8 en el que dicho plásmido está adaptado para la expresión en una célula de mamífero y además comprende los elementos regulatorios necesarios para la expresión de dicha molécula de ácido nucleico.

12. Una célula transformada con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6.

13. Una célula de acuerdo con la reivindicación 12, en la que dicha célula es una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula de mamífero o una célula de insecto.

14. Una molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1.

15. Una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular, en la que la secuencia de aminoácidos de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma.

16. Una molécula de proteína de la reivindicación 14, cuya función es proteger a las células del sistema nervioso, sistema muscular, próstata, estómago, testículos, ovarios, glándulas adrenales, glándulas mamarias, hígado y bazo contra la degeneración y/o muerte celular.

17. Un anticuerpo específicamente inmunorreactivo con un inmunógeno, en el que dicho inmunógeno es una molécula de proteína mostrada en SEQ ID Nº 1.

18. Un anticuerpo específicamente inmunorreactivo con una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular, en el que la secuencia de aminoácidos de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma.

19. Un procedimiento para detectar in vitro células patológicas en un sujeto que comprende teñir inmunocitoquímicamente células con un anticuerpo de la reivindicación 17 ó 18, en el que un bajo grado de tinción en dichas células comparado con una célula que representa un estado de salud conocido indica un cambio patológico de dichas
células.

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20. Un procedimiento de la reivindicación 19, en el que se usan células del sistema nervioso, sistema muscular, próstata, estómago, testículos, ovarios, glándulas adrenales, glándulas mamarias, hígado, bazo, pulmón, tráquea o placenta.

21. Un procedimiento para diagnosticar o pronosticar in vitro una enfermedad, en un sujeto, dicho procedimiento comprende:

(a) una molécula de ADN que codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular, en la que la secuencia de aminoácido de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma,

(b) un producto de transcripción de una molécula de ADN que codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular, en la que la secuencia de aminoácido de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma,

(c) una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular, en la que la secuencia de aminoácido de la molécula de proteína comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma,

(d) una molécula de ADN que codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular, capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 bajo condiciones rigurosas,

(e) un producto de transcripción de una molécula de ADN, que codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular, capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 bajo condiciones rigurosas,

(f) un producto de la traducción de una molécula de ADN, que codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células contra la degeneración y/o muerte celular, capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 bajo condiciones rigurosas,

y comparar dicho nivel o dicha actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una de dichas sustancias (a) a (f) con un valor de referencia que representa una enfermedad conocida o un estado de salud, diagnosticando o pronosticando de este modo una enfermedad en dicho sujeto.

22. Un procedimiento para controlar in vitro la progresión de una enfermedad, en un sujeto, dicho procedimiento comprende:

y comparar dicho nivel o dicha actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una de dichas sustancias (a) a (f) con un valor de referencia que representa una enfermedad conocida o un estado de salud, controlando de este modo la progresión de una enfermedad en dicho sujeto.

23. Un procedimiento para evaluar in vitro el tratamiento de una enfermedad, en un sujeto, dicho procedimiento comprende:

y comparar dicho nivel o dicha actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una de dichas sustancias (a) a (f) con un valor de referencia que representa una enfermedad conocida o un estado de salud, evaluando de este modo un tratamiento de una enfermedad en dicho sujeto.

24. El procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 23, en el que una disminución de un nivel o una actividad de (i) un producto de transcripción de una molécula de ADN que codifica una molécula de proteína, cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma o (ii) una molécula de proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia mostrada en SEQ ID Nº 1 o una variante funcional de la misma, en una muestra de dicho sujeto en relación con un valor de referencia que representa un estado de salud conocido indica la presencia de una enfermedad, en dicho sujeto.

25. Los procedimientos de acuerdo con las reivindicaciones 21 a 24 en los que dicha enfermedad es una enfermedad neurológica.

26. El procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 21 a 25, en el que dicho sujeto sufre la enfermedad de Alzheimer o trastornos neurofibrilares relacionados o estados neurodegenerativos caracterizados por degeneración celular o muerte celular o enfermedad de Parkinson o enfermedad de Huntington o esclerosis lateral amiotrófica o enfermedad de Pick.

27. Un procedimiento para identificar un agente que afecta una actividad o un nivel o ambos dicha actividad y nivel, de al menos una sustancia seleccionada del grupo constituido por:

que comprende las etapas de:

(ii): poner en contacto dicha muestra con al menos un agente,

28. Un procedimiento de la reivindicación 27 en el que la función de dicha molécula de proteína o una variante de la misma, es proteger a las células de la degeneración y/o muerte celular.

29. Un procedimiento de la reivindicación 27 ó 28 en el que dicha molécula de ADN capaz de hibridar con el complemento del ADNc descrito en SEQ ID Nº 2 codifica una molécula de proteína, cuya función es proteger a las células de la degeneración y/o muerte celular.

30. Un equipo para diagnóstico o pronóstico de una enfermedad, dicho equipo comprende:

(1) al menos un reactivo seleccionado del grupo constituido por reactivos que detectan selectivamente:

(2) instrucciones para diagnosticar o pronosticar dicha enfermedad

(i): detectando un nivel o una actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad de al menos una sustancia seleccionada del grupo constituido por (a) a (f) en una muestra de dicho sujeto; y

(ii): diagnosticando o pronosticando dicha enfermedad, en el que la variación de un nivel o actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una sustancia seleccionada del grupo constituido por (a) a (f) comparada con un valor de referencia que representa un estado de salud conocido; o un nivel o actividad o ambos, dicho nivel y dicha actividad, de al menos una sustancia seleccionada del grupo constituido por (a) a (f) similar o igual a un valor de referencia que representa un estado conocido de enfermedad, indica diagnóstico o pronóstico de dicha enfermedad.