ES2262819T3 - Ligando natural para el receptor gpr86 acoplado a proteinas g huerfano y metodos de uso. - Google Patents

Ligando natural para el receptor gpr86 acoplado a proteinas g huerfano y metodos de uso.

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ES2262819T3
ES2262819T3 ES02748870T ES02748870T ES2262819T3 ES 2262819 T3 ES2262819 T3 ES 2262819T3 ES 02748870 T ES02748870 T ES 02748870T ES 02748870 T ES02748870 T ES 02748870T ES 2262819 T3 ES2262819 T3 ES 2262819T3
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Stephane Brezillon
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Abstract

Método para detectar la actividad de GPR86 en una muestra que comprende las etapas de: a) incubar una muestra que comprende GPR86 con ADP en condiciones que permiten la unión de GPR86 y ADP, y b) detectar un segundo mensajero.

Description

Ligando natural para el receptor GPR86 acoplado a proteínas G huérfano y métodos de uso.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al ligando natural para el receptor GPR86 acoplado a proteínas G huérfano y métodos de uso.
Antecedentes de la invención y estado de la técnica
Los nucleótidos de adenina y uridina inducen respuestas farmacológicas y fisiológicas a través de diversos receptores acoplados a proteínas G (P2Y) y canales de catión dependientes de ligando (P2X) (1, 2). La familia de P2Y abarca dos purinoceptores selectivos: los receptores P2Y_{1} y P2Y_{11} humanos que se activan preferentemente por ADP y ATP, respectivamente (3-5). Los receptores de nucleótidos que responden a los nucleótidos tanto de adenina como de uracilo son el receptor P2Y_{2}, activado de manera equipotente por ATP y por UTP (6, 7) así como el receptor P2Y_{8} de Xenopus (8) y tp2y del pavo (9) activados igualmente por todos los nucleótidos trifosfato. También hay pirimidinoceptores: los receptores P2Y_{3} del pollo (10) y P2Y_{6} humano (11-13) activados preferentemente por UDP, y el receptor P2Y_{4} humano (13-15) activado preferentemente por UTP. Todos estos subtipos de P2Y s acoplan a la ruta del fosfoinositido. Los receptores P2Y_{11} y tp2y se acoplan adicionalmente a la estimulación e inhibición, respectivamente, de la adenilil ciclasa. Otros receptores (P2Y_{5} (16), P2Y_{7} (17), P2Y_{9} y P2Y_{10}), se han incluido por error en la familia de P2Y (18-20). Recientemente, se ha clonado un subtipo de P2Y_{12} que corresponde al receptor de ADP plaquetario denominado anteriormente P_{2T} (21, 22). Se acopla a una inhibición de la adenilil ciclasa y se expresa específicamente en las plaquetas y en el cerebro. Su estructura primaria no está relacionada con los otros receptores P2Y, pero está relacionada con la del receptor de UDP-glucosa (23).
Se han clonado más de 300 receptores acoplados a proteínas G (GPCR) hasta el momento y se supone generalmente que existen bastantes más de 1000 de tales receptores. Mecanísticamente, aproximadamente el 30-50% de todos los fármacos clínicamente relevantes actúan mediante la modulación de las funciones de diversos GPCR (34).
Los GPCR conocidos y desconocidos constituyen ahora dianas principales para la acción y desarrollo de fármacos.
El GPR86 es un miembro de la familia de receptores de tipo rodopsina, clonado en 1997 (24). Muestra una homología del 49% con el receptor de ADP plaquetario recientemente identificado, P2T.
El ORF identificado de 1002 pb de dicho receptor está precedido por un codón de terminación 18 pb en sentido de 5', y la supuesta señal de poli(A) AATAAA está presente 1672 pb en sentido de 3' de la secuencia codificante. El hGPR86 tiene la misma localización genómica que el hGPR87 en el cromosoma 3q24, pero al contrario que el hGPR87, su secuencia codificante carece de intrones. La secuencia deducida de 333 residuos de aminoácidos del hGPR86 muestra la típica estructura de transmembrana 7 (7TM) de un GPCR, sin péptido señal. Muestra esencialmente los mismos motivos que los descritos para GPR87 y KIAA0001, y por lo tanto también es un miembro de la familia de GPCR 1. En lugar del motivo DRY, hay un motivo DRF presente que también se observa en las secuencias de receptores purinérgicos, los receptores C5A y Bonzo, y los precursores del receptor de trombina.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere al receptor GPR86 (P2Y_{13}) (identificado a continuación en el presente documento como SEQ ID NO. 1) (o cualquier secuencia homóloga) y una célula recombinante (transformada mediante un vector adecuado) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para el receptor, así como los ligandos naturales (ADP y moléculas equivalentes tales como 2MeSADP, ADP\betaS incluyendo cualquiera de los análogos de ADP presentados en la patente de los EE.UU. número 5.700.786) para su uso en ensayos de selección para la identificación de compuestos agonistas, agonistas inversos o antagonistas útiles para el desarrollo de nuevos fármacos y la mejora de diversos diagnósticos de enfermedades.
Una secuencia homóloga (que puede existir en otras especies de mamíferos o grupos específicos de poblaciones humanas), en la que homología indica identidad de secuencia, significa una secuencia que presenta una elevada identidad de secuencia (identidad de secuencia de más del 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98%) con la secuencia de nucleótidos o aminoácidos humana completa descrita a continuación en el presente documento, y se caracteriza preferiblemente por la misma farmacología, especialmente una preferencia por la unión a ADP >> IDP > UDP (la afinidad de ADP por GPR86 fue de aproximadamente 1000 veces superior a la de IDP y UDP (ADP > IDP > UDP)).
La célula recombinante según la invención es una célula recombinante transformada mediante un vector de plásmido o viral, tal como un baculovirus, un adenovirus, un virus del bosque Semliki, y la célula puede seleccionarse del grupo que consiste en células bacterianas, células de levaduras, células de insectos o células de mamíferos.
Según otra realización de la presente invención, la célula se selecciona del grupo que consiste en células COS7, una célula CHO, una célula LM (TK-), una célula NIH-3T3, célula HEK-293, célula K-562 y una célula de astrocitoma 1321N1 pero también otras líneas celulares transfectables. El vector puede comprender todos los elementos reguladores, operativamente unidos a la secuencia de polinucleótido que codifica para el receptor según la invención de modo que permita la expresión del mismo.
Tal como será obvio para un experto en la técnica, según otra realización de la presente invención, el GPR86 puede estar presente en membranas celulares.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de una parte activa específica de las secuencias. Tal como se usa en el presente documento, una "parte activa" se refiere a una parte de una secuencia que es de tamaño suficiente como para mostrar farmacología normal o próxima a la normal (por ejemplo, actividad de receptor (tal como se define en el presente documento), la respuesta a un activador o inhibidor, o unión de ligandos son de al menos el 90% del nivel de actividad, respuesta o unión mostradas por un receptor de tipo natural). "Una parte" ya que se refiere a una secuencia que codifica para un receptor, se refiere a menos del 100% de la secuencia (es decir, al 99, 90, 80, 70, 60, 50%, etc.). La parte activa puede ser un receptor que comprende una deleción parcial de la secuencia de nucleótidos o aminoácidos completa y que todavía mantiene el(los) sitio(s) activo(s) y dominio(s) de proteína necesario(s) para la unión de, e interacción con, un ligando específico, tal como ADP.
En otra realización de cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la puesta en contacto se realiza en o sobre liposomas sintéticos (véase, Tajib Mirzabekov, Harry Kontos, Michael Farzan, Wayne Marasco, Joseph Sodroski (2000) Paramagnetic proteoliposomes containing a pure, native, and oriented seven-transmembrane segment protein, CCR5. Nature Biotechnology 18, 649-654, que se incorpora al presente documento como referencia) o membranas de gemación inducidas por virus que contienen un polipéptido de GPR86 (véase la solicitud de patente WO0102551, Virus-like particles, their Preparation and their Use preferably in Pharmaceutical Screening and Functional Genomics (2001) incorporado al presente documento como referencia).
Por lo tanto, se entenderá que según otro aspecto de la invención, el GPR86 puede estar presente en, o asociado con, una célula, tal como las células descritas anteriormente, membranas celulares, o en o sobre membranas de gemación inducidas por virus.
Tal como se usa en el presente documento, "ligando" se refiere a un resto que puede asociarse o unirse a un receptor. Según el método de la invención, un ligando y un receptor tienen una constante de unión que es lo suficientemente fuerte como para permitir la detección de la unión mediante un método de ensayo que es apropiado para la detección de una unión de ligando a un receptor (por ejemplo, un ensayo de segundo mensajero para detectar un aumento o disminución en la producción de un segundo mensajero en respuesta a la unión del ligando al receptor, un ensayo de unión para medir la unión proteína-ligando o un inmunoensayo para medir las interacciones antígeno-anticuerpo). Un ligando según la invención incluye la molécula real que se une al receptor (por ejemplo, ADP es un ligando para GPR86) o un ligando puede ser cualquier nucleótido, anticuerpo, antígeno, enzima, péptido, polipéptido o ácido nucleico que pueda unirse al receptor. Un ligando puede ser un nucleótido pero también puede incluir un polipéptido, un péptido o una secuencia de ácido nucleico. Según el método de la invención, un ligando y receptor se unen específicamente entre ellos (por ejemplo, mediante enlaces covalentes o de hidrógeno o mediante una interacción entre, por ejemplo, una proteína y un ligando, un anticuerpo y un antígeno o subunidades de
proteína).
Tal como se usa en el presente documento, "ADP" se refiere a un nucleótido que se produce mediante hidrólisis del fosfato terminal de ATP y tiene una estructura que comprende adenina, ribosa y dos grupos fosfato (figura 7). Se contempla que se considerarán análogos de ADP como equivalentes de ADP. Los análogos de ADP según la invención incluyen, pero no se limitan a, 2MeSADP, ADP\betas. Un análogo de ADP según la invención mostrará la misma estructura básica que el ADP, definido anteriormente y presentado en la figura 7, así como uno o más diferentes grupos sustituyentes incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de los análogos de ADP presentados en la patente de los EE.UU. número 5.700.786. Un análogo de ADP según la invención mostrará unión a GPR86 que es equivalente
a ADP.
Tal como se usa en el presente documento, "actividad de GPR" se refiere a la actividad de un receptor que comprende la secuencia presentada en la figura 1, o una secuencia que muestra una identidad de al menos el 70% (por ejemplo, el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, etc.) con la secuencia presentada en la figura 1. Un receptor que tiene "actividad de GPR" se unirá a ADP con una afinidad que es al menos 100 veces, o 500 veces o incluso 1000 veces superior a la de IDP y UDP (ADP > IDP > UDP).
Secuencias homólogas de una secuencia según la invención pueden incluir una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que codifica para un receptor similar que existe en otros mamíferos, por ejemplo otras especies animales (rata, ratón, gato, perro, etc.) o en grupos de poblaciones humanas específicas, pero que están implicados en la misma ruta bioquímica. De manera similar, la presente invención contempla ortólogos, que son por definición genes en dos especies diferentes que han evolucionado a partir de un único gen en su antiguo ancestro común. Es posible que los ortólogos tengan la misma función en ambas especies.
Tales secuencias homólogas pueden comprender adiciones, deleciones o sustituciones de uno o más aminoácidos o nucleótidos, que no alteran sustancialmente las características funcionales del receptor según la invención, tales como la unión de un ligando al receptor.
Tales secuencias homólogas también pueden ser secuencias de nucleótidos de más de 400, 600, 800 ó 1000 nucleótidos que pueden hibridarse a la secuencia humana completa en condiciones de hibridación rigurosas (tales como las descritas por SAMBROOK et al., 1989, Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory Press, Nueva York).
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la selección, detección y posible recuperación de moduladores candidatos de un receptor de la invención que comprende las etapas de: poner en contacto una célula que expresa GPR86 con ADP en condiciones que permiten la unión de ADP a GPR86, en presencia de un modulador candidato, realizar un ensayo de segundo mensajero, y comparar los resultados del ensayo de segundo mensajero obtenidos en presencia y ausencia del modulador candidato.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la selección, detección y posible recuperación de moduladores candidatos de un receptor de la invención que comprende las etapas de: poner en contacto una membrana celular que expresa GPR86 con ADP en condiciones que permiten la unión de ADP a GPR86, realizar un ensayo de segundo mensajero, y comparar los resultados del ensayo de segundo mensajero obtenidos en presencia y ausencia del modulador candidato.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para identificar un agente que modula la función de GPR86, comprendiendo dicho método: a) poner en contacto un polipéptido de GPR86 con ADP en presencia y ausencia de un modulador candidato en condiciones que permiten la unión de ADP al polipéptido de GPR86; y b) medir la unión del polipéptido de GPR86 al modulador candidato, con respecto a la unión en ausencia del modulador candidato, se identifica al modulador candidato como un agente que modula la función de GPR86.
En otra realización, se selecciona un modulador, agente o compuesto candidato del grupo que consiste en un péptido sintético o natural, un polipéptido, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un lípido, un hidrato de carbono, un ácido nucleico, y una molécula orgánica pequeña.
En otra realización, la etapa de detectar o medir una actividad de señalización del polipéptido de GPR86 comprende detectar un cambio en el nivel de un segundo mensajero.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al modulador candidato de la actividad de GPR86, compuestos agonistas y/o antagonistas desconocidos que pueden obtenerse, identificarse y/o recuperarse mediante un método de la invención, así como a un kit de diagnóstico que comprende dichos compuestos (desconocidos) o una composición farmacéutica (incluyendo una vacuna) que comprende un excipiente farmacéutico adecuado y una cantidad suficiente de dicho compuesto (desconocido).
Se entenderá que un modulador candidato de la actividad de GPR86 incluye, pero no se limita a, ATP, 2MeSADP, ADP\betaS, 2MeSATP, Ap3A, RB-2, suramina o PPADS.
Un compuesto antagonista según la invención significa una molécula o un grupo de moléculas que pueden unirse al receptor según la invención y bloquear o disminuir la unión de compuestos naturales, tales como ADP o una molécula equivalente, por ejemplo 2MeSADP, ADP\betaS, ATP, 2MeSATP o Ap3A e incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de los análogos de ADP presentados en la patente de los EE.UU. número 5.700.786. Compuestos antagonistas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, RB-2, suramina o PPADS.
La invención abarca adicionalmente un método para detectar la presencia, en una muestra, de un agente que modula la función de GPR86, comprendiendo el método: a) poner en contacto un polipéptido de GPR86 con la muestra; b) detectar una actividad de señalización del polipéptido de GPR86 en presencia de la muestra; y c) comparar la actividad medida en presencia de la muestra con la actividad medida en una reacción con polipéptido de GPR86 y ADP a CE_{50}, en el que se detecta un agente que modula la función de GPR86 si la cantidad de la actividad específica de GPR86 medida en presencia de la muestra es de al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más de la cantidad inducida por ADP presente a su CE_{50}.
La invención abarca adicionalmente un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de GPR86, comprendiendo el método: a) poner en contacto una muestra de tejido con un anticuerpo específico para un polipéptido de GPR86; b) detectar la unión del anticuerpo a la muestra de tejido; y c) comparar la unión detectada en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia en la unión con respecto al patrón es diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de GPR86.
La invención abarca adicionalmente un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de GPR86, comprendiendo el método: a) poner en contacto una muestra de tejido con un anticuerpo específico para un ligando de GPR86; b) detectar la unión del anticuerpo a la muestra de tejido; y c) comparar la unión detectada en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia en la unión con respecto al patrón es diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de GPR86.
La invención abarca adicionalmente un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de GPR86, comprendiendo el método: a) poner en contacto una muestra de tejido con un anticuerpo específico para un polipéptido de GPR86 y un anticuerpo específico para un ligando de GPR86;
b) detectar la unión de los anticuerpos a la muestra de tejido; y c) comparar la unión detectada en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia en la unión de cualquier anticuerpo o de ambos, con respecto al patrón es diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de GPR86.
La invención abarca adicionalmente un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de GPR86, comprendiendo el método: a) aislar ácido nucleico a partir de una muestra de tejido; b) amplificar un polinucleótido de GPR86, usando el ácido nucleico como molde; y c) comparar la cantidad o la secuencia de polinucleótido de GPR86 amplificado producido en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia en la cantidad o la secuencia de polinucleótido de GPR86 amplificado con respecto al patrón es diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de GPR86.
La invención abarca adicionalmente un método para diagnosticar una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de GPR86, comprendiendo el método: a) aislar ácido nucleico a partir de una muestra de tejido; b) amplificar un polinucleótido que codifica para un ligando de polipéptido específico de GPR86, usando el ácido nucleico como molde; y c) comparar la cantidad o la secuencia de polinucleótido de ligando específico de GPR86 amplificado producido en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia en la cantidad o la secuencia de polinucleótido de ligando específico de GPR86 amplificado con respecto al patrón es diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de GPR86.
En otra realización, la etapa de amplificación comprende RT/PCR. En otra realización, el patrón es SEQ ID NO: 1. En otra realización, la etapa de comparación de la secuencia comprende la minisecuenciación. En otra realización, la etapa de comparación de la secuencia o la cantidad se realiza sobre una micromatriz.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un mamífero no humano transgénico, que comprende una recombinación homóloga (knockout (deficiente)) del polinucleótido que codifica para el receptor GPR86 (P2Y_{13}) según la invención o un mamífero no humano transgénico que sobreexpresa el polipéptido por encima del nivel natural de expresión. Tal como se usa en el presente documento, "por encima del nivel natural de expresión" se refiere a un nivel que es de al menos 2 veces, o 5 veces, o 10 veces o incluso 100 veces o más (es decir, 150 veces, 200 veces, 250 veces, 500 veces, 1000 veces, 10.000 veces, etc.) comparado con el nivel de expresión del receptor endógeno. Puede obtenerse un mamífero no humano transgénico mediante un método bien conocido por un experto en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO 98/20112 usando la técnica clásica basada en la transfección de células madre
embrionarias, preferiblemente según el método descrito por Carmeliet et al. (Nature, vol. 380, págs. 435-439, 1996).
"Selección como diana de genes" es un tipo de recombinación homóloga que se produce cuando se introduce un fragmento de ADN genómico en una célula de mamífero y ese fragmento se localiza y recombina con secuencias homólogas endógenas tal como se muestra como ejemplo en la patente de los EE.UU. número 5.464.764 y la patente de los EE.UU. número 5.777.195, cuyos contenidos se incorporan al presente documento como referencia en su totalidad. Tal como se usa en el presente documento, el término "animal transgénico" se refiere a un animal no humano en el que una o más, o esencialmente todas, las células del animal contienen un transgén introducido mediante intervención humana, tal como mediante técnicas transgénicas conocidas en la técnica. El transgén puede introducirse en la célula, directa o indirectamente mediante la introducción en un precursor de la célula, mediante manipulación genética deliberada, tal como mediante microinyección o mediante infección con un virus recombinante.
El mamífero no humano transgénico que sobreexpresa el polinucleótido que codifica para el receptor GPR86 (P2Y_{13}) según la invención comprende el polinucleótido incorporado en un constructo de ADN con un promotor inducible que permite la sobreexpresión del receptor y posiblemente también elementos reguladores específicos de tejido y célula.
En consecuencia, otro aspecto de la presente invención se refiere a un mamífero no humano que comprende una deleción parcial o total de la secuencia ortóloga del polinucleótido humano (SEQ ID NO. 1), tal como un mamífero no humano que comprende un recombinante homólogo knockout en dicho polinucleótido o un mamífero no humano transgénico que sobreexpresa dicho polinucleótido por encima del nivel natural.
Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo y los diversos usos del mismo, específico para un polipéptido de GPR86, así como un anticuerpo y los usos del mismo específicos para un modulador de la actividad de GPR86.
El kit de diagnóstico según la invención incluye al menos receptor GPR86 y, acondicionado por separado, ADP y también puede comprender posiblemente todos los medios y métodos necesarios para realizar una detección de unión específica (por ejemplo de ADP) al receptor GPR86 de la invención y posiblemente correlacionando la detección de unión específica con un método de monitorización de uno o más de los síntomas de las enfermedades descritas a continuación en el presente documento. Además, el kit según la invención puede comprender adicionalmente componentes de un ensayo de segundo mensajero.
Posiblemente, el kit comprende elementos para una dosis o diagnóstico específico de tales compuestos unidos mediante técnicas de selección de alto rendimiento, bien conocidas por la persona experta en la técnica, especialmente la descrita en el documento WO 00/02045. La monitorización y dosis de diagnóstico de selección de alto rendimiento puede realizarse usando diversos soportes sólidos, tales como placas de microtitulación o biochips seleccionados por la persona experta en la técnica.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al modulador candidato de la actividad de GPR86 tal como se describe en el presente documento, o al anticuerpo tal como se describe en el presente documento para su uso como composición farmacéutica o medicamento para prevenir, tratar y/o aliviar enfermedades o trastornos caracterizados por una desregulación de la señalización de GPR86. También, la presente invención se refiere al uso del modulador candidato de la actividad de GPR86 tal como se describe en el presente documento, o al anticuerpo tal como se describe en el presente documento para la fabricación de una composición farmacéutica o medicamento para prevenir, tratar y/o aliviar enfermedades o trastornos caracterizados por una desregulación de la señalización de GPR86.
En la composición farmacéutica según la invención, el excipiente farmacéutico adecuado es un excipiente en forma sólida, líquida o gaseosa, que puede seleccionarse por la persona experta en la técnica según el tipo de administración y los posibles efectos secundarios del compuesto según la invención. La razón entre el excipiente farmacológico y el compuesto específico puede seleccionarse por la persona experta en la técnica según el paciente tratado, la administración y los posibles efectos secundarios del compuesto, así como del tipo de enfermedad o trastorno tratado o sometido a una prevención específica.
1. La composición farmacéutica encuentra ventajosas aplicaciones en el campo del tratamiento y/o la prevención de diversas enfermedades o trastornos, y posiblemente seleccionados del grupo que consiste en hipertrofia prostática, migraña, vómitos, trastornos psicóticos y neurológicos, incluyendo ansiedad, esquizofrenia, depresión maníaca, depresión, delirio, demencia y retraso mental grave, enfermedades degenerativas, enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer o enfermedad de Parkinson, y discinesias, tales como enfermedad de Huntington o síndrome de Gilles de la Tourett y otras enfermedades relacionadas incluyendo trombosis y otras enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias.
2. Entre las enfermedades mencionadas, las aplicaciones están, por ejemplo, relacionadas con agentes terapéuticos dirigidos hacia receptores 7TM que pueden desempeñar una función en la prevención, mejora o corrección de disfunciones o enfermedades, incluyendo, pero sin limitarse a, fertilidad, desarrollo del feto, infecciones tales como infecciones bacterianas, fúngicas, protozoarias y virales, incluyendo infecciones producidas por VIH1 y VIH2, dolor, cáncer, anorexia, bulimia, asma, enfermedad de Parkinson, insuficiencia cardiaca aguda, hipertensión, retención urinaria, osteoporosis, angina de pecho, infarto de miocardio, úlceras, asma, alergias, hipertrofia prostática benigna, trastornos psicóticos y neurológicos incluyendo ansiedad, depresión, migraña, vómitos, accidente cerebrovascular, esquizofrenia, depresión maniaca, delirio, demencia, retraso mental grave y discinesias, tales como enfermedad de Huntington o síndrome de Gilles de la Tourett incluyendo trombosis y otras enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la producción de una composición farmacéutica que comprende las etapas de mezclar el modulador candidato según la presente invención o el anticuerpo según la presente invención, con un excipiente farmacéutico.
En consecuencia, la presente invención también se refiere a una composición que comprende el modulador candidato tal como se describe en el presente documento, tal como, por ejemplo, ATP, 2MeSATP, 2MeSADP, ADP\betaS, Ap3A, RB-2, suramina o PPADS, o el anticuerpo tal como se describe en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, un "antagonista" es un ligando que se une competitivamente al receptor en el mismo sitio que un agonista, pero no activa una respuesta intracelular iniciada por una forma activa de un receptor, y por tanto inhibe la respuesta intracelular inducida por un agonista, por ejemplo, ADP, en al menos el 10%, o el 15-25%, o el 25-50%, o el 50-100%, comparado con la respuesta intracelular en presencia de un agonista y en ausencia de un antagonista.
Tal como se usa en el presente documento, un "agonista" se refiere a un ligando que activa una respuesta intracelular cuando se une a un receptor en concentraciones iguales o inferiores a las concentraciones de ADP que inducen una respuesta intracelular. Un agonista según la invención puede aumentar la respuesta intracelular mediada por un receptor en al menos 2 veces, o 5 veces, o 10 veces, o 100 veces o más (es decir, 150 veces, 200 veces, 250 veces, 500 veces, 1000 veces, 10.000 veces, etc.), comparado con la respuesta intracelular en ausencia de agonista. Un agonista, según la invención, puede disminuir la internalización de un receptor de superficie celular de tal modo que la expresión en la superficie celular de un receptor se aumenta en al menos 2 veces, o 5 veces, o 10 veces, o 100 veces o más (es decir, 150 veces, 200 veces, 250 veces, 500 veces, 1000 veces, 10.000 veces, etc.), comparado con el número de receptores de superficie celular presentes sobre la superficie de una célula en ausencia de un agonista. En otra realización de la invención, un agonista estabiliza un receptor de superficie celular y aumenta la expresión en la superficie celular de un receptor en al menos 2 veces, o 5 veces, o 10 veces, o 100 veces o más (es decir, 200 veces, 250 veces, 500 veces, 1000 veces, 10.000 veces, etc.), comparado con el número de receptores de superficie celular presentes sobre la superficie de una célula en ausencia de agonista.
Tal como se usa en el presente documento, un "agonista inverso" se refiere a un ligando que disminuye una actividad constitutiva de un receptor de superficie celular cuando se une a un receptor. Un agonista inverso según la invención puede disminuir la respuesta intracelular constitutiva mediada por un receptor en al menos 2 veces, o 5 veces, o 10 veces, o 100 veces o más (es decir, 150 veces, 200 veces, 250 veces, 500 veces, 1000 veces, 10.000 veces, etc.), comparado con la respuesta intracelular en ausencia del agonista inverso.
Un compuesto "inhibidor" según la invención es una molécula dirigida frente al receptor o frente al ligando natural para el receptor que disminuye la unión del ligando al receptor en al menos el 10%, o incluso el 15-25%, o incluso el 25-50% e incluso el 50-100%, en presencia de ADP, comparado con la unión en presencia de ADP y en ausencia de inhibidor. Un compuesto "inhibidor" de la invención puede disminuir la respuesta intracelular inducida por un agonista, por ejemplo ADP, en al menos el 10%, o el 15-25%, o incluso el 25-50%, o incluso el 50-100%. Un "inhibidor" también se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica para un compuesto inhibidor de la invención.
Tal como se usa en el presente documento, "ligando natural" se refiere a un ligando que se produce de manera natural, que se encuentra en la naturaleza, que se une a un receptor de manera que es equivalente a ADP (es decir, con una afinidad por el ligando que es superior a la afinidad de IDP y UDP (ADP > IDP > UDP)). Un "ligando natural" no se refiere a un ligando diseñado mediante ingeniería que no se encuentra en la naturaleza y que se diseña mediante ingeniería para que se una a un receptor, cuando anteriormente no lo hacía de una manera diferente, ya sea en grado o clase, de la que se diseñó mediante ingeniería para que lo hiciese, ya no se produce de manera natural, sino que es "no natural" y se deriva de una molécula que se produce de manera natural.
Tal como se usa en el presente documento, un "modulador" y "agente que modula", que se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a cualquier compuesto que "modula", es decir, aumenta o disminuye la expresión en la superficie celular de un receptor de la invención, aumenta o disminuye la unión de un ligando a un receptor de la invención, o cualquier compuesto que aumenta o disminuye la respuesta intracelular iniciada por una forma activa del receptor de la invención, ya sea en presencia o ausencia de un agonista, y en presencia de un ligando para el receptor, por ejemplo ADP. Un modulador incluye un agonista, antagonista, inhibidor o agonista inverso, tal como se definen en el presente documento. Un modulador puede ser una proteína, un ácido nucleico, un anticuerpo o fragmento del mismo, tal como un fragmento de unión a antígeno, una proteína, un polipéptido, un péptido, un lípido, un hidrato de carbono, una molécula orgánica o inorgánica pequeña, etc. Los moduladores candidatos pueden ser compuestos naturales o sintéticos, incluyendo, por ejemplo, moléculas pequeñas, compuestos contenidos en extractos de células animales, vegetales, bacterianas o fúngicas, así como medios condicionados de tales células.
Tal como se usa en el presente documento, el término "molécula pequeña" se refiere a un compuesto que tiene una masa molecular inferior a 300 Dalton, o incluso inferior a 2000 ó 1500, o incluso inferior a 100, e incluso inferior a 600 Dalton. Una "molécula orgánica pequeña" es una molécula pequeña que comprende carbono.
Tal como se usa en el presente documento, el término "cambio en la unión" o "cambio en la actividad" y los términos equivalentes "diferencia en la unión" o "diferencia en la actividad" o diferencia en la cantidad de producto de PCR "amplificado" se refieren a un aumento o disminución de al menos el 10% en la unión con respecto al patrón, o actividad de señalización o niveles de ARNm con respecto al patrón en un ensayo dado.
Tal como se usa en el presente documento, el término "desregulación" se refiere a la actividad de señalización de GPR86 en una muestra en la que:
a)
se mide un aumento o disminución del 10% en la cantidad de los niveles de polipéptido o ARNm del ligando de polipéptido de GPR86 o de GPR86 con respecto al patrón, tal como se define en el presente documento, de un ensayo dado, o;
b)
se detecta al menos un cambio de un único par de bases en la secuencia codificante del ligando de polipéptido de GPR86 o de GPR86 con respecto al patrón, tal como se define en el presente documento, de un ensayo dado y da como resultado una alteración de la actividad de señalización de GPR86 tal como se define en los párrafos a), c), o d), o;
c)
se mide un aumento o disminución del 10% en la cantidad de actividad de unión del ligando de GPR86 con respecto al patrón, tal como se define en el presente documento, de un ensayo dado, o;
d)
se mide un aumento o disminución del 10% en ensayos de segundo mensajero, tal como se define en el presente documento, con respecto al patrón, tal como se define en el presente documento, de un ensayo dado.
Tal como se usa en el presente documento, el término "condiciones que permiten la unión de ADP a GPR86" se refiere a condiciones de, por ejemplo, temperatura, concentración salina, pH y concentración de proteína en las que ADP se une a GPR86. Las condiciones de unión exactas variarán dependiendo de la naturaleza del ensayo, por ejemplo, si el ensayo usa células viables o sólo fracciones de membrana de células. Sin embargo, dado que GPR86 es una proteína de superficie celular, las condiciones favorecidas incluirán generalmente sal fisiológica (90 mM) y pH (aproximadamente de 7,0 a 8,0). Las temperaturas para la unión pueden variar desde 15ºC hasta 37ºC, pero serán generalmente de entre la temperatura ambiente y aproximadamente 30ºC. La concentración de ADP y polipéptido de GPR86 en una reacción de unión también variarán, pero serán preferiblemente de aproximadamente 0,1 nM (por ejemplo, en una reacción con ADP indicador radiomarcado, en la que la concentración es generalmente inferior a K_{d}) a 1 \muM (por ejemplo, ADP como competidor).
Tal como se usa en el presente documento, el término "muestra" se refiere a la fuente de moléculas que están sometiéndose a prueba para determinar la presencia de un agente o compuesto modulador que modula la unión a, o la actividad de señalización de, un polipéptido de GPR86. Una muestra puede ser una muestra del entorno, un extracto natural de células o tejidos animales, vegetales, de levaduras o bacterianos, una muestra clínica, una muestra sintética, o un medio condicionado a partir de células recombinantes o un proceso de fermentación. El término "muestra de tejido" se refiere a un tejido que se somete a prueba para determinar la presencia, abundancia, cantidad o una actividad de un polipéptido de GPR86, un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de GPR86, o un agente o compuesto que modifica o modula la actividad o unión de ligando de un polipéptido de GPR86.
Tal como se usa en el presente documento, un "tejido" es un agregado de células que realiza una función particular en un organismo. El término "tejido" tal como se usa en el presente documento se refiere a material celular procedente de una región fisiológica particular. Las células en un tejido particular pueden comprender diversos tipos de células diferentes. Un ejemplo no limitativo de esto sería tejido cerebral que comprende adicionalmente neuronas y células de la glía, así como células endoteliales capilares y células sanguíneas, todas contenidas en una sección o muestra de tejido dada. Además de tejidos sólidos, el término "tejido" también se pretende que abarque tejidos no sólidos, tales como la sangre.
Tal como se usa en el presente documento, los términos "fracción de membrana" y "membranas celulares" se refieren a una preparación de membranas lipídicas celulares que comprende un polipéptido de GPR86. Tal como se usa el término en el presente documento, una "fracción de membrana" o una "membrana celular" es distinto de homogeneizado celular, en que se han eliminado al menos una parte (es decir, al menos el 10% o más) de los constituyentes celulares no asociados a la membrana. El término "asociado a la membrana" así como términos similares tales como "membranas que llevan" y "presente en membranas celulares" se refieren a aquellos constituyentes celulares que están o bien integrados en una membrana lipídica o bien están físicamente asociados con un componente que está integrado en una membrana lipídica.
Tal como se usa en el presente documento, detectar o medir una actividad de señalización puede realizarse mediante un "ensayo de segundo mensajero", que comprende la medición de la unión o intercambio del nucleótido guanina, actividad adenilato ciclasa, AMPc intracelular, inositol fosfato intracelular, concentración de diacilglicerol intracelular, concentración de ácido araquinoide, actividad de MAP cinasa(s) o tirosina cinasa(s), actividad de proteína cinasa C, calcio intracelular, diacilglicerol, degradación de fosfatidilinositol, o expresión del gen indicador o un ensayo basado en aecuorina según métodos conocidos en la técnica y definidos en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, el término "segundo mensajero" se refiere a una molécula, generada o que se hace variar en concentración mediante la activación de un receptor acoplado a proteínas G (GPCR), que participa en la transducción de una señal a partir de ese GPCR. Ejemplos no limitativos de segundos mensajeros incluyen AMPc, diacilglicerol, inositol trifosfato, liberación de ácido araquidónico, inositol trifosfatos y calcio intracelular. El término "cambio en el nivel de un segundo mensajero" se refiere a un aumento o disminución de al menos el 10% en el nivel detectado de un segundo mensajero dado con respecto a la cantidad detectada en un ensayo realizado en ausencia de modulador candidato.
Tal como se usa en el presente documento, el término "ensayo basado en aecuorina" se refiere a un ensayo para determinar la actividad de GPCR que mide el flujo de calcio intracelular inducido por GPCR activado, en el que se mide el flujo de calcio intracelular mediante la luminiscencia de aecuorina expresada en la célula. La invención se refiere al uso de un receptor acoplado a proteínas G humano, GPR86 (P2Y_{13}), como herramienta de selección para identificar agonistas o antagonistas de la luminiscencia de aecuorina resultante de la expresión de este receptor.
Tal como se usa en el presente documento, el término "unión" se refiere a la asociación física de un ligando (por ejemplo, ADP o un anticuerpo) con un receptor (por ejemplo, GPR86). Tal como se usa el término en el presente documento, la unión es "específica" si se produce con una CE_{50} o una K_{d} de 100 nM o inferior, generalmente en el intervalo de 100 nM a 10 pM. Por ejemplo, la unión es específica si la CE_{50} o K_{d} es de 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 950 pM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 550 pM, 500 pM, 450 pM, 400 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 75 pM, 50 pM, 25 pM o 10 pM o inferior.
Tal como se usa en el presente documento, el término "CE_{50}" se refiere a la concentración de un compuesto a la que una actividad dada, incluyendo la unión de ADP u otro ligando y una actividad funcional de un polipéptido de GPR86, es del 50% del máximo de esa actividad de GPR86 que puede medirse usando el mismo ensayo en ausencia de compuesto. Enunciado de otra manera, la "CE_{50}" es la concentración de un compuesto que da una activación del 50%, cuando se fija la activación del 100% como la cantidad de actividad que no aumenta con la adición de más agonista. Debe observarse que la "CE_{50} de ADP" variará según la identidad del análogo de ADP usado en el ensayo; por ejemplo, los análogos de ADP pueden tener valores de CE_{50} superiores, inferiores o iguales a los de ADP. Por lo tanto, cuando un análogo de ADP difiere de ADP, un experto en la técnica puede determinar la CE_{50} para ese análogo según métodos convencionales. La CE_{50} de un ADP dado se mide mediante la realización de un ensayo para determinar la actividad de una cantidad fijada de polipéptido de GPR86 en presencia de dosis de ADP que aumentan hasta que la respuesta de GPR86 está saturada o es máxima, y entonces se representa la actividad de GPR86 medida frente a la concentración de ADP.
Tal como se usa en el presente documento, el término "saturación" se refiere a la concentración de ADP u otro ligando a la que aumentos adicionales en la concentración de ligando no pueden aumentar la unión de ligando de ADP ni la actividad de señalización específica de GPR86.
Tal como se usa en el presente documento, el término "CI_{50}" es la concentración de un antagonista o agonista inverso que reduce la activación máxima de un receptor GPR86 en el 50%.
Tal como se usa en el presente documento, el término "disminución de la unión" se refiere a una disminución de al menos el 10% en la cantidad de unión detectada en un ensayo dado con un modulador conocido o sospechado de GPR86 con respecto a la unión detectada en un ensayo que carece de ese modulador conocido o sospechado.
Tal como se usa en el presente documento, el término "suministrar", cuando se usa en referencia a un fármaco o agente, significa la adición del fármaco o agente a una mezcla de ensayo, o a una célula en cultivo. El término también se refiere a la administración del fármaco o agente a un animal. Tal administración puede ser, por ejemplo, mediante inyección (en un excipiente adecuado, por ejemplo, agua o solución salina estéril) o mediante inhalación, o mediante una vía oral, transdérmica, rectal, vaginal, u otra vía común de administración de fármacos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "patrón" se refiere a una muestra tomada a partir de un individuo que no está afectado por una enfermedad o trastorno caracterizado por la desregulación de la actividad de GPR86. El "patrón" se usa como referencia para la comparación de los niveles y calidad de ARNm de GPR86 (es decir, tipo mutante frente a natural), así como para la comparación de las actividades de GPR86. Por ejemplo, el patrón es la secuencia caracterizada por SEQ ID NO 1.
Tal como se usa en el presente documento, el término "amplificación" cuando se aplica a una secuencia de ácido nucleico, se refiere a un procedimiento mediante el cual se genera una o más copias de una secuencia de ácido nucleico a partir de un ácido nucleico de molde. Un método adecuado de "amplificación" es PCR o RT/PCR.
Tal como se usa en el presente documento, el término "receptor acoplado a proteínas G" o "GPCR" se refiere a un polipéptido asociado a la membrana con 7 dominios transmembrana de hélice alfa. Los GPCR funcionales se asocian con un ligando o agonista y también se asocian con y activan proteínas G. GPR86 es un GPCR.
Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" es la molécula de inmunoglobulina convencional, así como fragmentos de la misma que también son específicamente reactivos con uno de los polipéptidos o moduladores objeto. Los anticuerpos pueden fragmentarse usando técnicas convencionales y seleccionarse los fragmentos por su utilidad de la misma manera que se describe a continuación en el presente documento para anticuerpos completos. Por ejemplo, pueden generarse fragmentos F(ab)_{2} tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)_{2}
resultante puede tratarse para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab. Se pretende adicionalmente que el anticuerpo de la presente invención incluya moléculas biespecíficas, de cadena sencilla, y quiméricas y humanizadas que tienen afinidad por un polipéptido conferida por al menos una región CDR del anticuerpo. En otras realizaciones, el anticuerpo comprende adicionalmente un marcador unido al mismo y que puede detectarse (por ejemplo, el marcador puede ser un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto quimioluminiscente, enzima, o cofactor enzimático). Los anticuerpos, monoclonales o policlonales, y las partes hipervariables de los mismos (FAB, FAB'', etc.) así como la célula de hibridoma que produce los anticuerpos son un aspecto adicional de la presente invención que encuentra una aplicación industrial específica en el campo del diagnóstico y la monitorización de enfermedades específicas, preferiblemente las descritas a continuación en el presente documento.
Los inhibidores según la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales y policlonales marcados o partes hipervariables de los anticuerpos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "animal transgénico" se refiere a cualquier animal, tal como un mamífero no humano, pájaro, pez o anfibio, en el que una o más de las células del animal contienen ácido nucleico heterólogo introducido mediante intervención humana, tal como mediante técnicas transgénicas bien conocidas en la técnica. El ácido nucleico se introduce en la célula, directa o indirectamente mediante introducción en un precursor de la célula, mediante manipulación genética deliberada, tal como mediante microinyección o mediante infección con un virus recombinante. El término manipulación genética no incluye el cruce clásico, ni la fertilización in vitro, sino que más bien se refiere a la introducción de una molécula de ADN recombinante. Esta molécula puede integrarse dentro de un cromosoma, o puede ser ADN que se replica extracromosómicamente. En los animales transgénicos típicos descritos en el presente documento, el transgen provoca que las células expresen una forma recombinante de uno de los polipéptidos objeto, por ejemplo, o bien la forma agonista o bien la antagonista. Sin embargo, también se consideran los animales transgénicos en los que el gen recombinante es silencioso, tal como, por ejemplo, los constructos dependientes de FLP o CRE recombinasa descritos a continuación. Además, "animal transgénico" también incluye los animales recombinantes en los que se provoca la interrupción génica de uno o más genes por intervención humana, incluyendo técnicas tanto de recombinación como antisentido.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 representa la secuencia de aminoácidos deducida y de nucleótidos del receptor GPR86 humano (P2Y_{13}) según la invención.
La figura 2 es un dendrograma que representa la relación estructural del receptor GPR86 (P2Y_{13}) con los demás subtipos de P2Y.
La figura 3 representa la distribución tisular del receptor GPR86 humano (P2Y_{13}).
Las figuras 4A a 4C representan respectivamente:
-
curvas de concentración-acción de ADP, 2MeSADP y ADP\betaS sobre la acumulación de IP_{3} en células 1321N1-G\alpha16 que expresan el receptor GPR86 humano (P2Y_{13});
-
efectos agonistas de ADP, ATP y 2MeSATP sobre la acumulación de IP_{3} en células 1321N1 que expresan el receptor GPR86 humano (P2Y_{13}) junto con G\alpha_{16} y;
-
el efecto de la toxina de la tos ferina sobre la acumulación de IP_{3} inducida por ADP sobre células 1321N1 que expresan el receptor GPR86 humano junto con G\alpha_{16}.
Las figuras 5A y B representan respectivamente una curva de concentración-acción de ADP sobre la acumulación de AMPc en células CHO-K1 que expresan el receptor GPR86 humano (P2Y_{13}) y el efecto de la toxina de la tos ferina sobre la acumulación de AMPc inducida por ADP en células CHO-K1 que expresan el receptor GPR86 humano (P2Y_{13}) según la invención.
La figura 6 muestra un análisis de western blot (inmunotransferencia) de proteínas Erk1 y Erk2 fosforiladas en células CHO-K1 que expresan el receptor GPR86 humano (P2Y_{13}) según la invención.
La figura 7 muestra la estructura de ADP.
La figura 8 muestra la curva de concentración-respuesta de la activación de GPR86 por ATP y 2MeSATP.
La figura 9 muestra la activación de GPR86 por diferentes diadenosina polifosfatos.
La figura 10 muestra la curva de concentración-respuesta de la activación de GPR86 por poli[A] y poli[A].[G].
La figura 11 muestra la curva de concentración-respuesta de la activación de GPR86 por ADP en presencia de los antagonistas del receptor RB-2, suramina, PPADS, MRS-2179.
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere al descubrimiento de que ADP es un ligando natural para el receptor GPR86 acoplado a proteínas G huérfano y a métodos para usar la unión de este ligando al receptor en un método de selección de fármacos. El ligando conocido y su interacción con el receptor GPR86 también proporcionan el diagnóstico de estados que implican actividad del receptor desregulada. La invención también se refiere a un kit que comprende GPR86 (P2Y_{13}) y secuencias homólogas, sus correspondientes polinucleótidos y/o células recombinantes que expresan el polinucleótido, para identificar compuestos agonistas, antagonistas y agonistas inversos del polipéptido del receptor y/o su polinucleótido correspondiente. Tales kits son útiles para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos.
La invención también se refiere a compuestos agonistas, antagonistas y agonistas inversos novedosos del polipéptido del receptor y su polinucleótido correspondiente, identificado según el método de la invención.
Todas las referencias referidas a continuación y anteriormente se incorporan al presente documento como referencia en su totalidad.
Secuencias
La invención se refiere a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que codifican para GPR86 (presentado en la figura 1). La invención también se refiere a ortólogos y a secuencias que son homólogas a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos que codifican para GPR86.
Cálculo de la homología de secuencia
Puede determinarse la identidad de secuencia con respecto a cualquiera de las secuencias presentadas en el presente documento mediante una simple comparación "visual" (es decir, una comparación estricta) de una cualquiera o más de las secuencias con otra secuencia para ver si la otra secuencia tiene, por ejemplo, una identidad de secuencia de al menos el 70% con respecto a la(s) secuencia(s).
También puede determinarse la identidad de secuencia relativa mediante programas informáticos comercialmente disponibles que pueden calcular el % de identidad entre dos o más secuencias usando cualquier algoritmo adecuado para determinar la identidad, usando por ejemplo parámetros por defecto. Un ejemplo típico de un programa informático de este tipo es CLUSTAL. Otros métodos de programas informáticos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12: 387) y FASTA (Altschul et al 1990 J Molec Biol 403-410).
Puede calcularse el % de homología a lo largo de secuencias contiguas, es decir, se alinea una secuencia con la otra secuencia y se compara directamente cada aminoácido en una secuencia con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se denomina alineación sin huecos. Normalmente, tales alineaciones sin huecos se realizan sólo a lo largo de un número de residuos relativamente corto.
Aunque es un método muy simple y sistemático, no consigue tener en consideración que, por ejemplo, en un par de secuencias que por lo demás es idéntico, una inserción o deleción provocará que los siguientes residuos de aminoácidos queden sin alinear, dando potencialmente así como resultado una gran reducción en el % de homología cuando se realiza una alineación global. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineaciones óptimas que tienen en consideración posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación de homología global. Esto se consigue insertando "huecos" en la alineación de secuencia para intentar maximizar la homología local.
Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de hueco" a cada hueco que se produce en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencia con tan pocos huecos como es posible (que refleja una mayor relación entre las dos secuencias comparadas) conseguirá una puntuación superior que otra con muchos huecos. Normalmente se usan "costes de hueco afines" que cargan un coste relativamente elevado por la existencia de un hueco y una penalización menor para cada residuo posterior en el hueco. Éste es el sistema de puntuación de huecos más comúnmente usado. Por supuesto, elevadas penalizaciones de huecos producirán alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones de hueco. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se usa un software de este tipo para comparaciones de secuencia. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización de hueco por defecto para las secuencias de aminoácidos es de -12 para un hueco y -4 para cada
extensión.
Por tanto, el cálculo del % de homología máximo requiere en primer lugar la producción de una alineación óptima, teniendo en consideración penalizaciones de hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo una alineación de este tipo es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387). Ejemplos de otro software que puede realizar comparaciones de secuencia incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (Ausuble et al., 1995, Short Protocols in Molecular Biology, 3ª edición, John Wiley & Sons), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) y la serie GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas fuera de línea y en línea (Ausubel et al., 1999, citado anteriormente, páginas 7-58 a 7-60).
Aunque el % de homología final puede medirse en cuanto a la identidad, normalmente el procedimiento de alineación en sí mismo no se basa en una comparación de pares todo o nada. En su lugar, generalmente se usa una matriz de puntuación de similitud graduada que asigna puntuaciones a cada comparación por pares basándose en la similitud química o la distancia de evolución. Un ejemplo de una matriz de este tipo que se usa comúnmente es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto para la serie BLAST de programas. Generalmente, los programas GCG Wisconsin usan o bien los valores por defecto públicos o bien una tabla de comparación de símbolos adaptada si se suministra. Se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.
Ventajosamente, se emplea el algoritmo BLAST, con parámetros fijados en los valores por defecto. El algoritmo BLAST se describe en detalle en:
http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html, que se incorpora en el presente documento como referencia. Los parámetros de búsqueda se definen tal como sigue, y pueden fijarse ventajosamente en unos parámetros por defecto definidos.
Ventajosamente, "identidad sustancial" cuando se evalúa mediante BLAST equivale a secuencias que coinciden con un valor EXPECT de al menos aproximadamente 7, preferiblemente de al menos aproximadamente 9 y lo más preferiblemente de 10 o más. El umbral por defecto para EXPECT en la búsqueda con BLAST es normalmente de 10.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - Herramienta de búsqueda por alineación local básica) es el algoritmo de búsqueda heurístico empleado por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn, y tblastx; estos programas atribuyen significación a sus hallazgos usando los métodos estadísticos de Karlin y Altschul (Karlin y Altschul 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68; Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7; véase http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html) con algunas mejoras. Los programas BLAST se realizan a medida para la búsqueda de la similitud de secuencia, por ejemplo, para identificar homólogos de una secuencia de consulta. Para una discusión sobre asuntos básicos en la búsqueda de similitud de bases de datos de secuencias, véase Altschul et al (1994) Nature Genetics 6: 119-129.
Los cinco programas BLAST disponibles en http://www.ncbi.nih.gov realizan las siguientes tareas: blastp - compara una secuencia de consulta de aminoácidos frente a una base de datos de secuencias de proteínas; blastn - compara una secuencia de consulta de nucleótidos frente a una base de datos de secuencias de nucleótidos; blastx - compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia de consulta de nucleótidos (ambas cadenas) frente a una base de datos de secuencias de proteínas; tblastn - compara una secuencia de consulta de proteínas frente a una base de datos de secuencias de nucleótidos traducida dinámicamente en los seis marcos de lectura (ambas cadenas); tblastx - compara las traducciones de seis marcos de una secuencia de consulta de nucleótidos frente a las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleótidos.
BLAST usa los siguientes parámetros de búsqueda:
HISTOGRAM (HISTOGRAMA) - Presenta un histograma de puntuaciones para cada búsqueda; por defecto es "sí". (Véase el parámetro H en el manual de BLAST).
DESCRIPTIONS (DESCRIPCIONES) - Restringe el número de descripciones cortas de secuencias que corresponden notificadas al número especificado; el límite por defecto es de 100 descripciones. (Véase el parámetro V en la página del manual).
EXPECT (ESPERADO) - El umbral de significancia estadística para notificar correspondencias frente a secuencias de la base de datos; el valor por defecto es 10, de tal modo que se espera encontrar 10 correspondencias simplemente por suerte, según el modelo estocástico de Karlin y Altschul (1990). Si la significancia estadística atribuida a una correspondencia es superior al umbral de EXPECT, no se notificará la correspondencia. Umbrales inferiores de EXPECT son más estrictos, lo que conduce a notificar menos correspondencias por suerte. Son aceptables valores fraccionales. (Véase el parámetro E en el manual de BLAST).
CUTOFF (TOPE) - La puntuación de tope para notificar pares de segmentos de elevada puntuación. El valor por defecto se calcula a partir del valor EXPECT (véase anteriormente). Se notifican HSP (High-scoring segment
pair - par de segmentos de elevada puntuación) para una secuencia de la base de datos sólo si la significancia estadística atribuida a ellos es al menos igual de elevada que la que se atribuiría a un HSP sólo que tuviese una puntuación igual al valor CUTOFF. Valores superiores de CUTOFF son más estrictos, lo que conduce a notificar menos correspondencias por suerte. (Véase el parámetro S en el manual de BLAST). Normalmente, los umbrales de significancia pueden controlarse más intuitivamente usando EXPECT.
ALIGNMENTS (ALINEACIONES) - Restringe las secuencias de la base de datos al número especificado para el que se notifican pares de segmentos de elevada puntuación (HSP); el límite por defecto es de 50. Si sucede que más secuencias de la base de datos satisfacen el umbral de significancia estadística para notificar (véase EXPECT y CUTOFF a continuación), sólo se notifican las correspondencias a las que se atribuye la mayor significancia estadística. (Véase el parámetro B en el manual de BLAST).
MATRIX (MATRIZ) - Especifica una matriz de puntuación alterna para BLASTP, BLASTX, TBLASTN y
TBLASTX. La matriz por defecto es BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff, 1992). Las elecciones alternativas válidas incluyen: PAM40, PAM120, PAM250 e IDENTITY. No hay matrices de puntuación alterna para BLASTN; especificar la directriz MATRIX en la solicitud de BLASTN devuelve una respuesta de error.
STRAND (CADENA) - Restringe una búsqueda de TBLASTN a tan sólo la cadena superior o inferior de las secuencias de la base de datos; o restringe una búsqueda de BLASTN, BLASTX o TBLASTX a tan sólo marcos de lectura en la cadena superior o inferior de la secuencia de consulta.
FILTER (FILTRO) - Enmascara segmentos de la secuencia de consulta que tienen una complejidad de composición baja, según se determina mediante el programa SEG de Wootton y Federen (1993) Computers and Chemistry 17: 149-163, o segmentos que consisten en repeticiones internas de corta periodicidad, según se determina mediante el programa XNU de Claverie y States (1993), Computers and Chemistry 17: 191-201, o, para BLAST, mediante el programa DUST de Tatusov y Lipman (véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Filtrar puede eliminar informes estadísticamente significativos pero biológicamente sin interés de la salida de blast (por ejemplo, éxitos frente a regiones ácidas, básicas o ricas en prolina comunes), dejando las regiones más interesantes biológicamente de la secuencia de consulta disponibles para correspondencia específica frente a secuencias de la base de datos.
La secuencia de baja complejidad encontrada por un programa de filtro se sustituye usando la letra "N" en la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, "NNNNNNNNNNNNN") y la letra "X" en secuencias de proteínas (por ejemplo, "XXXXXXXXX").
Filtrar sólo se aplica a la secuencia de consulta (o sus productos de traducción), no a las secuencias de la base de datos. El filtrado por defecto es DUST para BLASTN, SEG para otros programas.
No es inusual que no se enmascare nada mediante SEG, XNU, o ambos, cuando se aplican a secuencias en SWISS-PROT, por tanto no debe esperarse que el filtrado siempre de un efecto.
Además, en algunos casos, se enmascaran las secuencias en su totalidad, indicando que debe sospecharse de la significancia estadística de cualquier correspondencia notificada frente a la secuencia de consulta no filtrada.
NCBI-gi - Hace que se muestren identificadores de NCBI gi en la salida, además de la adquisición y/o el nombre de locus.
De la manera más preferible, se realizan comparaciones de secuencias usando el algoritmo de búsqueda de BLAST simple proporcionado en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. En algunas realizaciones de la presente invención, no se usan penalizaciones de espacios cuando se determina la identidad de secuencia.
Hibridación
La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse con las secuencias presentadas en el presente documento, o cualquier fragmento o derivado de las mismas, o con el complemento de cualquiera de las anteriores.
Hibridación significa un "procedimiento mediante el cual una cadena de ácido nucleico se une a una cadena complementaria a través de un apareamiento de bases" (Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nueva York, NY) así como al procedimiento de amplificación tal como se lleva a cabo en las tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa tal como se describen por Dieffenbach CW y GS Dveksler (1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY).
Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tf) del complejo de unión al ácido nucleico, tal como se enseña por Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, San Diego, CA), y confieren un "rigor" definido tal como se explica a continuación.
Las secuencias de nucleótidos de la invención que pueden hibridarse selectivamente con las secuencias de nucleótidos presentadas en el presente documento, o con su complemento, serán generalmente homólogas al menos al 70%, o al menos al 75%, o al menos al 85 o al 90% e incluso al menos al 95% o al 98% a las secuencias de nucleótidos correspondientes presentadas en el presente documento a lo largo de una región de al menos 20, o al menos 25 ó 30, por ejemplo al menos 40, 60 ó 100 o más nucleótidos contiguos.
El término "que puede hibridarse selectivamente" significa que la secuencia de nucleótidos usada como sonda se usa en condiciones en las que se encuentra que una secuencia de nucleótidos diana de la invención hibrida con la sonda a un nivel significativamente por encima de la de fondo. La hibridación de fondo puede producirse debido a otras secuencias de nucleótidos presentes, por ejemplo, en la biblioteca de ADN genómico o ADNc que está examinándose. En este caso, el fondo implica un nivel de señal generado mediante interacción entre la sonda y un elemento de ADN no específico de la biblioteca que es menos de 10 veces, o incluso menos de 100 veces tan intenso que la interacción específica observada con el ADN diana. Puede medirse la intensidad de interacción, por ejemplo, radiomarcando la sonda, por ejemplo, con ^{32}P.
También se incluyen dentro del alcance de la presente invención secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse con las secuencias de nucleótidos presentadas en el presente documento en condiciones de rigor intermedio a máximo. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de fusión (Tf) del complejo de unión al ácido nucleico, tal como se enseña por Berger y Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, San Diego, CA), y confieren un "rigor" definido tal como se explica a
continuación.
El rigor máximo se produce normalmente a aproximadamente Tf - 5ºC (5ºC por debajo de la Tf de la sonda); rigor alto a aproximadamente de 5ºC a 10ºC por debajo de Tf; rigor intermedio a aproximadamente de 10ºC a 20ºC por debajo de Tf; y rigor bajo a aproximadamente de 20ºC a 25ºC por debajo de Tf. Tal como entenderán aquellos expertos en la técnica, puede usarse la hibridación de rigor máximo para identificar o detectar secuencias de nucleótidos idénticas mientras que puede usarse una hibridación de rigor intermedio (o bajo) para identificar o detectar secuencias de nucleótidos similares o relacionadas.
En otra realización, la presente invención cubre secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse con una o más de las secuencias de nucleótidos de GPCR de la presente invención en condiciones rigurosas (por ejemplo, 65ºC y 0,1 x SSC {1 x SSC = NaCl 0,15 M, citrato de Na_{3} 0,015M, pH 7,0). Cuando la secuencia de nucleótidos de la invención es de doble cadena, la presente invención abarca ambas cadenas del dúplex, ya sea individualmente o en combinación. Cuando la secuencia de nucleótidos es de cadena sencilla, debe entenderse que la secuencia complementaria de esa secuencia de nucleótidos también está incluida dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención también abarca secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse con las secuencias que son complementarias a las secuencias presentadas en el presente documento, o cualquier fragmento o derivado de las mismas. Del mismo modo, la presente invención abarca secuencias de nucleótidos que son complementarias de las secuencias que pueden hibridarse con la secuencia de la presente invención. Estos tipos de secuencias de nucleótidos son ejemplos de secuencias de nucleótidos variantes. En este sentido, el término "variante" abarca secuencias que son complementarias a secuencias que pueden hibridarse con las secuencias de nucleótidos presentadas en el presente documento. Sin embargo, el término "variante" abarca también secuencias que son complementarias de secuencias que pueden hibridarse en condiciones rigurosas (por ejemplo, 65ºC y 0,1 x SSC {1 x SSC = NaCl 0,15 M, citrato de Na_{3} 0,015M, pH 7,0) con las secuencias de nucleótidos presentadas en el presente documento.
Células
Una célula que es útil según la invención puede seleccionarse del grupo que consiste en células bacterianas, células de levaduras, células de insectos o células de mamíferos.
Una célula que es útil según la invención puede ser cualquier célula en la que puede introducirse o está presente una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un receptor según la invención de tal modo que el receptor se expresa a niveles naturales o por encima de niveles naturales, tal como se define en el presente documento. Un receptor de la invención que se expresa en una célula puede mostrar farmacología normal o próxima a la normal, tal como se define en el presente documento. Un receptor de la invención que se expresa en una célula puede comprender la secuencia de nucleótidos o aminoácidos presentada en la figura 1 o una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que es idéntica en al menos el 70% a la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 1. Un receptor de la invención que se expresa en una célula puede unirse a ADP con una afinidad que es al menos 100 veces, o 500 veces, o incluso 1.000 veces superior a la afinidad por IDP y UDP.
Según otra realización de la presente invención, se selecciona una célula del grupo que consiste en células COS7, una célula CHO, una célula LM (TK-), una célula NIH-3T3, célula HEK-293, célula K-562 y una célula de astrocitoma 1321N1 pero también otras líneas celulares transfectables. Resultará evidente que las membranas celulares de la presente invención pueden derivarse de esas células.
I Ensayos para la identificación de agentes que modulan la actividad de GPR86
Pueden identificarse agentes que modulan la actividad de GPR86 de varias maneras que toman ventaja de la interacción del receptor con ADP o cualquier otro ligando. Por ejemplo, la capacidad para reconstituir la unión GPR86/ADP ya sea in vitro, sobre células cultivadas o in vivo proporciona una diana para la identificación de agentes que alteran esa unión. Los ensayos basados en la alteración de la unión pueden identificar agentes, tales como moléculas orgánicas pequeñas, a partir de bibliotecas o colecciones de tales moléculas. Alternativamente, tales ensayos pueden identificar agentes en muestras o extractos de fuentes naturales, por ejemplo, extractos vegetales, fúngicos o bacterianos o incluso en muestras de tejido humano (por ejemplo, tejido tumoral). En un aspecto, pueden prepararse los extractos a partir de células que expresan una biblioteca de polipéptidos, péptidos o ácidos nucleicos variantes. Entonces, pueden seleccionarse los moduladores de la unión GPR86/ADP usando un ensayo de unión o un ensayo funcional que mide la señalización en sentido 3' a través del receptor.
Otro enfoque que utiliza la interacción GPR86/ADP más directamente para identificar agentes que modulan la función de GPR86 mide cambios en la señalización en sentido 3'de GPR86 inducidos por agentes candidatos o moduladores candidatos. Estos ensayos funcionales pueden realizarse en fracciones de membrana celular aisladas o en células que expresan el receptor sobre sus superficies.
El descubrimiento de que ADP es un ligando del receptor GPR86 permite ensayos de selección para identificar agonistas, antagonistas y agonistas inversos de la actividad del receptor. Los ensayos de selección tendrán dos enfoques generales.
1) Ensayos de unión a ligando, en los que se exponen células que expresan GPR86, extractos de membranas de tales células, membranas de gemación inducidas por virus que contienen un polipéptido de GPR86 o membranas lipídicas inmovilizadas que comprenden GPR86 a ADP marcado y compuesto candidato. Tras la incubación, se mide la mezcla de reacción para determinar unión específica del ADP marcado al receptor GPR86. Los compuestos que interfieren con la unión o desplazan el ADP marcado pueden ser agonistas, antagonistas o agonistas inversos de la actividad de GPR86. Entonces puede realizarse un análisis funcional posterior sobre compuestos positivos para determinar a cuál de esas categorías pertenecen.
2) Ensayos funcionales, en los que se mide una actividad de señalización de GPR86.
a) Para la selección de agonistas, se incuban células que expresan GPR86 o membranas preparadas a partir de ellas con un compuesto candidato, y se mide una actividad de señalización de GPR86. Se compara la actividad inducida por compuestos que modulan la actividad del receptor con la inducida por ADP. Un agonista o agonista parcial tendrá una actividad biológica máxima correspondiente a al menos el 10% de la actividad máxima de ADP cuando está presente el agonista o agonista parcial a 10 nM o menos, e incluso tendrá una potencia que es al menos tan potente como
el ADP.
b) Para la selección de antagonistas o agonistas inversos, se someten a ensayo células que expresan GPR86 o membranas aisladas a partir de ellas para detectar actividad de señalización en presencia de ADP con o sin compuesto candidato. Los antagonistas reducirán el nivel de actividad del receptor estimulada por ADP en al menos el 10%, con respecto a reacciones que carecen de antagonista en presencia de ADP. Los agonistas inversos reducirán la actividad constitutiva del receptor en al menos el 10%, con respecto a reacciones que carecen de agonista inverso.
c) Para la selección de agonistas inversos, se usan células que expresan actividad de GPR86 constitutiva o membranas aisladas a partir de ellas en un ensayo funcional que mide una actividad del receptor en presencia de un compuesto candidato. Los agonistas inversos son aquellos compuestos que reducen la actividad constitutiva del receptor en al menos el 10%. La sobreexpresión de GPR86 puede conducir a la activación constitutiva. El GPR86 puede sobreexpresarse colocándolo bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, por ejemplo, el promotor temprano de CMV. Alternativamente, ciertas mutaciones de dominios de aminoácidos o aminoácidos de GPCR conservados tienden a conducir a actividad constitutiva. Véase, por ejemplo, Kjelsberg et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 1430; McWhinney et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 2087; Ren et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 16483; Samama et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 4625; Parma et al., 1993, Nature 365: 649; Parma et al., 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther. 286: 85; y Parent et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 7949.
Ensayos de desplazamiento y unión a ligando
Pueden usarse polipéptidos de GPR86 expresados sobre una célula, o membranas aisladas que contienen polipéptidos de receptor, junto con ADP para seleccionar compuestos que inhiben la unión de ADP a GPR86. Cuando se identifican en un ensayo que mide la unión o desplazamiento de ADP sólo, deberá someterse los compuestos a una prueba funcional para determinar si actúan como agonistas, antagonistas o agonistas inversos.
Para experimentos de desplazamiento, se incuban células que expresan un polipéptido de GPR86 (generalmente 25 x 10^{3} células por ensayo o de 1 a 100 \mug de extractos de membrana) en tampón de unión con ADP marcado en presencia o ausencia de concentraciones en aumento de un modulador candidato. Para validar y calibrar el ensayo, pueden realizarse reacciones control de competición usando concentraciones en aumento de ADP sin marcar. Tras la incubación, se lavan las células extensamente, y se mide el ADP unido, marcado, según sea apropiado para el marcador dado (por ejemplo, recuento de centelleo, fluorescencia, etc.). Una disminución de al menos el 10% en la cantidad de ADP marcado unido en presencia del modulador candidato indica desplazamiento de la unión por el modulador candidato. Se considera que los moduladores candidatos se unen específicamente en este u otros ensayos descritos en el presente documento si desplazan el 50% de ADP marcado (dosis de ADP inferior a la saturación) a una concentración de 10 nM o inferior.
Alternativamente, puede monitorizarse la unión o desplazamiento de la unión mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). Pueden usarse ensayos de resonancia de plasmón superficial como método cuantitativo para medir la unión entre dos moléculas mediante el cambio en la masa cerca de un sensor inmovilizado provocado por la unión o pérdida de unión de ADP a partir de la fase acuosa a un polipéptido de GPR86 inmovilizado en una membrana sobre el sensor. Este cambio en la masa se mide como unidades de resonancia frente al tiempo tras la inyección o eliminación del ADP o modulador candidato y se mide usando un Biacore Biosensor (Biacore AB). Puede inmovilizarse el GPR86 sobre un chip sensor (por ejemplo, chip CM5 de grado de investigación; Biacore AB) en una membrana lipídica de película delgada según métodos descritos por Salamon et al. (Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283-294; Salamon et al., 2001, Biophys J. 80: 1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213-219, cada uno de los cuales se incorpora al presente documento como referencia). Sarrio et al. demostraron que puede usarse la SPR para detectar la unión de ligando al receptor GPCR A(1) de adenosina inmovilizado en una capa lipídica sobre el chip (Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174, incorporado al presente documento como referencia). Puede realizarse un ajuste fino de las condiciones para la unión de ADP a GPR86 en un ensayo de SPR por un experto en la técnica usando las condiciones notificadas por Sarrio et al. como punto de partida.
La SPR puede someter a ensayo para determinar moduladores de unión al menos de dos maneras. En primer lugar, puede unirse previamente ADP a polipéptido de GPR86 inmovilizado, seguido por inyección de modulador candidato a una concentración que oscila desde 0,1 nM hasta 1 \muM. El desplazamiento del ADP unido puede cuantificarse, permitiendo la detección de unión del modulador. Alternativamente, puede incubarse previamente el polipéptido de GPR86 unido a membrana con modulador candidato y exponerlo con ADP. Una diferencia en la unión de ADP al GPR86 expuesto al modulador con respecto al que está sobre un chip no expuesto previamente al modulador demostrará unión o desplazamiento de ADP en presencia de modulador. En cualquier ensayo, una disminución del 10% o más en la cantidad de ADP unido en presencia de modulador candidato, con respecto a la cantidad de ADP unido en ausencia de modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de GPR86 y ADP.
Otro método para detectar la inhibición de la unión de ADP a GPR86 usa la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). La FRET es un fenómeno mecánico cuántico que se produce entre un donador de fluorescencia (D) y un aceptor de fluorescencia (A) en cercana proximidad entre ellos (normalmente < 100 \ring{A} de separación) si el espectro de emisión de D se superpone con el espectro de excitación de A. Las moléculas que van a probarse, por ejemplo, ADP y un polipéptido de GPR86, se marcan con un par complementario de fluoróforos donador y aceptor. Mientras están unidos estrechamente entre sí por la interacción GPR86:ADP, la fluorescencia emitida con la excitación del fluoróforo donador tendrá una longitud de onda diferente que la emitida en respuesta a esa longitud de onda de excitación cuando el ADP y el polipéptido de GPR86 no están unidos, proporcionando una cuantificación de moléculas unidas frente a no unidas mediante la medición de la intensidad de emisión en cada longitud de onda. Los fluoróforos donadores con los que marcar el polipéptido de GPR86 se conocen bien en la técnica. Son de interés las variantes de la GFP A. victoria conocida como FP cian (CFP, donador (D)) y FP amarilla (YFP, aceptor (A)). Como ejemplo, puede prepararse la variante YFP como una proteína de fusión con GPR86. Los vectores para la expresión de variantes de GFP como fusiones (Clontech) así como compuestos de ADP marcados con fluoróforo (Molecular Probes) se conocen en la técnica. La adición de un modulador candidato a la mezcla de ADP marcado y proteína YFP-GPR86 dará como resultado una inhibición de la transferencia de energía evidenciada, por ejemplo, por una disminución en la fluorescencia de YFP con respecto a una muestra sin el modulador candidato. En un ensayo que usa la FRET para la detección de interacción GPR86:ADP, una disminución del 10% o superior en la intensidad de la emisión fluorescente en la longitud de onda del aceptor en muestras que contienen un modulador candidato, con respecto a muestras sin el modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción GPR86:ADP.
Una variación de la FRET usa la extinción de fluorescencia para monitorizar interacciones moleculares. Una molécula en el par que interacciona puede marcarse con un fluoróforo, y la otra con una molécula que extingue la fluorescencia del fluoróforo cuando se pone en aposición cercana con el mismo. Un cambio en la fluorescencia con la excitación es indicativo de un cambio en la asociación de las moléculas marcadas con el par fluoróforo:extintor. Generalmente, un aumento en la fluorescencia del polipéptido de GPR86 marcado es indicativo de que se ha desplazado la molécula de ADP que lleva el extintor. Para ensayos de extinción, un aumento del 10% o superior en la intensidad de emisión de fluorescencia en muestras que contienen un modulador candidato, con respecto a moléculas sin el modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción GPR86:ADP.
Además de los métodos de resonancia de plasmón superficial y FRET, la medición de la polarización de fluorescencia es útil para cuantificar la unión. El valor de polarización de fluorescencia para una molécula marcada fluorescentemente depende del tiempo de correlación rotacional o velocidad de rotación. Los complejos, tales como los formados por GPR86 que se asocia con un ADP marcado fluorescentemente, tienen valores de polarización superiores que ADP marcado sin complejar. La inclusión de un inhibidor de la interacción GPR86:ADP candidato da como resultado una disminución de la polarización de fluorescencia, con respecto a una mezcla sin el inhibidor candidato, si el inhibidor candidato altera o inhibe la interacción de GPR86 con ADP. La polarización de fluorescencia está bien adecuada para la identificación de moléculas pequeñas que alteran la formación de complejos receptor:ligando. Una disminución del 10% o más en la polarización de fluorescencia en muestras que contienen un modulador candidato, con respecto a la polarización de fluorescencia en una muestra que carece del modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción GPR86:ADP.
Otra alternativa para monitorizar interacciones GPR86:ADP usa un ensayo de biosensor. Se han descrito biosensores ICS en la técnica (Australian Membrane Biotechnology Research Institute; http//www.ambri.com.au/; Cornell B,
Braach-_Maksvytis V, King L, Osman P, Raguse B, Wieczorek L, and Pace R. "A biosensor that uses ion-channel switches" Nature 1997, 387, 580). En esta tecnología, la asociación de GPR86 y su ligando se acopla al cierre de canales iónicos facilitados por gramicidina en bicapas de membrana suspendidas y por tanto a un cambio que puede medirse en la admitancia (similar a la impedancia) del biosensor. Este enfoque es lineal a lo largo de seis órdenes de magnitud de cambio de admitancia y es idealmente adecuado para una selección de gran escala, de alto rendimiento de bibliotecas combinatorias de moléculas pequeñas. Un cambio (aumento o disminución) del 10% o superior en la admitancia en una muestra que contiene un modulador candidato, con respecto a la admitancia de una muestra que carece del modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de GPR86 y ADP. Es importante observar que en ensayos que prueban la interacción de GPR86 con ADP, es posible que un modulador de la interacción no necesite interaccionar necesariamente de manera directa con el (los) dominio(s) de las proteínas que interaccionan físicamente con ADP. También es posible que un modulador interaccione en una localización retirada del sitio de interacción y provoque, por ejemplo, un cambio conformacional en el polipéptido de GPR86. Los moduladores (inhibidores o agonistas) que actúan de esta manera son de todos modos interesantes como agentes para modular la actividad de GPR86.
En consecuencia, un método de selección de un modulador candidato de la actividad de GPR86 usando células que expresan GPR86 puede comprender: a) incubar una primera muestra de las células en presencia de un modulador candidato y una segunda muestra de las células en ausencia del modulador candidato, ambas de estas muestras en condiciones que permiten la unión de ADP a GPR86; b) detectar una actividad de señalización de polipéptido de GPR86 en estas primera y segunda muestras, y; c) comparar los resultados de los ensayos de segundo mensajero para las primera y segunda muestras. También, un método de selección de un modulador candidato de la actividad de GPR86 usando membranas celulares que llevan GPR86, puede comprender: a) incubar una primera muestra de las membranas celulares en presencia del modulador candidato y una segunda muestra de las membranas celulares en ausencia del modulador candidato, ambas muestras en condiciones que permiten la unión de ADP a GPR86; b) detectar una actividad de señalización de polipéptido de GPR86 en esas primera y segunda muestras, y; c) comparar los resultados de los ensayos de segundo mensajero para las primera y segunda muestras. Además, un método para determinar si un modulador candidato aumenta o disminuye la actividad de GPR86 usando células que expresan GPR86 puede comprender: a) incubar una primera muestra de las células en presencia del modulador candidato y una segunda muestra de las células en ausencia del modulador candidato, ambas de estas muestras en condiciones que permiten la unión de ADP a GPR86; b) detectar una actividad de señalización de polipéptido de GPR86 en las primera y segunda muestras, y; c) comparar los resultados de los ensayos de segundo mensajero para las primera y segunda muestras. A continuación, un método para determinar si un modulador candidato aumenta o disminuye la actividad de GPR86 usando membranas celulares que llevan GPR86 puede comprender: a) incubar una primera muestra de las membranas celulares en presencia del modulador candidato y una segunda muestra de las membranas celulares en ausencia del modulador candidato, ambas muestras en condiciones que permiten la unión de ADP a GPR86; b) detectar una actividad de señalización de polipéptido de GPR86 en las primera y segunda muestras, y; c) comparar los resultados de los ensayos de segundo mensajero para las primera y segunda muestras.
3. Otros ligandos
Debe entenderse que cualquiera de los métodos o ensayos de unión descritos en el presente documento pueden realizarse con un ligando distinto de ADP (por ejemplo, agonista, antagonista, etc.) de GPR86, por ejemplo, una molécula pequeña identificada tal como se describe en el presente documento o análogos de ADP que incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los análogos de ADP presentados en la patente de los EE.UU. número 5.700.786, un péptido natural o sintético, un polipéptido, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un lípido, un hidrato de carbono, y una molécula orgánica pequeña.
Cualquiera de los métodos o ensayos de unión descritos pueden usarse para determinar la presencia de un agente en una muestra, por ejemplo, una muestra de tejido, que se une a la molécula de receptor GPR86, o que afecta a la unión de ADP al receptor. Para ello, se hace reaccionar polipéptido de GPR86 con ADP u otro ligando en presencia o ausencia de la muestra, y se mide la unión de ADP o ligando según sea apropiado para el ensayo de unión que está usándose. Una disminución del 10% o más en la unión de ADP u otro ligando indica que la muestra contiene un agente que modula la unión de ADP o ligando al polipéptido de receptor.
En consecuencia, la presente invención también se refiere a métodos tal como se describen en el presente documento, en los que se sustituye ADP por un modulador tal como se describe en el presente documento, tal como, por ejemplo, ATP, 2MeSATP, 2MeSADP, ADP\betaS, Ap3A, RB-2, suramina o PPADS.
Además, el agente o modulador identificado o caracterizado por la presente invención puede usarse en un método de modulación de la actividad de GPR86 de un polipéptido en una célula, comprendiendo dicho método la etapa de suministrar a dicha célula un agente que modula la actividad de GPR86 de un polipéptido, de tal manera que se modula la actividad de GPR86.
Ensayos funcionales de la actividad de receptor i. Ensayos de unión GTPasa/GTP
Para GPCR tales como GPR86, una medida de la actividad de receptor es la unión de GTP por membranas celulares que contienen receptores. En el método descrito por Traynor y Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47: 848-854, incorporado al presente documento como referencia, puede medirse esencialmente el acoplamiento de proteína G a membranas mediante la detección de la unión de GTP marcado. Para ensayos de unión de GTP, se incuban membranas aisladas de células que expresan el receptor en un tampón que contiene HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, y MgCl2 10 mM, ^{35}S-GTP\gammaS 80 pM y GDP 30 \muM. Se incuba la mezcla de ensayo durante 60 minutos a 30ºC, tras lo cual se elimina GTP marcado no unido mediante filtración sobre filtros GF/B. Se mide el GTP marcado, unido, mediante recuento de centelleo líquido. Con el fin de someter a ensayo para determinar la modulación de la actividad de GPR86 inducida por ADP, se mezclan membranas preparadas a partir de células que expresan un polipéptido de GPR86 con ADP, y se realiza el ensayo de unión GTP en presencia y ausencia de un modulador candidato de la actividad de GPR86. Una disminución del 10% o más en la unión de GTP marcado según se mide mediante recuento de centelleo en un ensayo de esta clase que contiene un modulador candidato, con respecto a un ensayo sin el modulador, indica que el modulador candidato inhibe la actividad de GPR86. Puede realizarse un ensayo de unión de GTP similar sin ADP para identificar compuestos que actúan como agonistas. En este caso, se usa la unión de GTP estimulada por ADP como patrón. Un compuesto se considera un agonista si induce al menos el 50% del nivel de unión de GTP inducido por ADP cuando el compuesto está presente a 1 \muM o menos, o inducirá un nivel igual o superior al inducido por ADP. Se mide la actividad de GTPasa mediante incubación de membranas que contienen un polipéptido de GPR86 con \gamma^{32}P-GTP. La GTPasa activa liberará el marcador como fosfato inorgánico, lo que se detecta mediante separación de fosfato inorgánico libre en una suspensión al 5% de carbón vegetal activado en H_{3}PO_{4} 20 mM, seguido de recuento de centelleo. Los controles incluyen ensayos usando membranas aisladas de células que no expresan GPR86 (transfectadas simuladas), con el fin de excluir posibles efectos no específicos de los compuestos
candidatos.
Con el fin de someter a ensayo para determinar el efecto de un modulador candidato sobre la actividad de GTPasa regulada por GPR86, se incuban muestras de membranas con ADP, con y sin el modulador, seguido del ensayo de GTPasa. Un cambio (aumento o disminución) del 10% o más en el nivel de unión de GTP o actividad de GTPasa con respecto a muestras sin modulador es indicativo de modulación de GPR86 por el modulador candidato.
ii. Ensayos de activación de ruta en sentido 3' a. Flujo de calcio - el ensayo basado en aecuorina
El ensayo de aecuorina toma ventaja de la capacidad de respuesta de la apoaecuorina mitocondrial a la liberación de calcio intracelular inducida por la activación de GPCR (Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115-126; Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192 1501-1508; ambos de los cuales se incorporan en el presente documento como referencia). Brevemente, se transfectan clones que expresan GPR86 para coexpresar apoaecuorina mitocondrial y G\alpha16. Se incuban las células con coelenterazina H 5 \muM (Molecular Probes) durante 4 horas a temperatura ambiente, se lavan en medio de cultivo DMEM-F12 y se vuelven a suspender a una concentración de 0,5 x 10^{6} células/ml. Entonces se mezclan las células con moléculas agonistas de prueba y se registra la emisión de luz por la aecuorina con un luminómetro durante 30 segundos. Los resultados se expresan como unidades de luz relativas (RLU). Los controles incluyen ensayos usando membranas aisladas de células que no expresan GPR86 (transfectadas simuladas), con el fin de excluir posibles efectos no específicos del compuesto candidato.
La actividad de aecuorina o niveles de calcio intracelular están "cambiados" si la intensidad de luz aumenta o disminuye en el 10% o más en una muestra de células, que expresan un polipéptido de GPR86 y se tratan con un modulador candidato, con respecto a una muestra de células que expresan el polipéptido de GPR86 pero no tratadas con el modulador candidato o con respecto a una muestra de células que no expresan el polipéptido de GPR86 (células transfectadas simuladas) pero tratadas con el modulador candidato.
Cuando se realiza en ausencia de ADP, el ensayo puede usarse para identificar un agonista de la actividad de GPR86. Cuando se realiza el ensayo en presencia de ADP, puede usarse para someter a ensayo para determinar un antagonista.
b. Ensayo de adenilato ciclasa
Los ensayos para determinar la actividad de adenilato ciclasa se describen por Kenimer y Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585-591, incorporado en el presente documento como referencia. Ese ensayo es una modificación del ensayo enseñado por Solomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58: 541-548, también incorporado en el presente documento como referencia. Brevemente, reacciones de 100 \mul que contienen tris-HCl 50 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 5 mM, creatina fosfato (sal de disodio) 20 mM, 10 unidades (71 \mug de proteína) de creatina fosfocinasa, \alpha-^{32}P-ATP (sal de tetrasodio, 2 \muCi) 1 mM, AMP cíclico 0,5 mM, AMP cíclico marcado con G-^{3}H- (aproximadamente 10.000 cpm), Ro20-1724 0,5 mM, etanol al 0,25%, y 50-200 \mug de homogeneizado de proteínas que van a probarse (es decir, homogeneizado de células que expresan o que no expresan un polipéptido de GPR86, tratadas o no tratadas con ADP con o sin un modulador candidato). Generalmente, se incuban las mezclas de reacción a 37ºC durante 6 minutos. Tras la incubación, se desproteinizan las mezclas de reacción mediante la adición de 0,9 ml de ácido tricloroacético al 6% frío. Se centrifugan los tubos a 1800 x g durante 20 minutos y se añade cada disolución de sobrenadante a una columna Dowex AG50W-X4. Se eluye la fracción de AMPc de la columna con 4 ml de imidazol-HCl 0,1 mM (pH 7,5) en un vial de recuento. Los ensayos deben realizarse por triplicado. Las reacciones de control también deben realizarse usando homogeneizado de proteínas de células que no expresan un polipéptido de GPR86.
Según la invención, la actividad de la adenilato ciclasa está "cambiada" si aumenta o disminuye en el 10% o más en una muestra tomada de células tratadas con un modulador candidato de la actividad de GPR86, con respecto a una muestra de células similar no tratada con el modulador candidato o con respecto a una muestra de células que no expresan el polipéptido de GPR86 (células transfectadas simuladas) pero tratadas con el modulador candidato.
c. Ensayo de AMPc
Se mide el AMPc intracelular o extracelular usando un radioinmunoensayo (RIA) de AMPc o proteína de unión a AMPc según métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, Horton y Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91-105, que se incorpora en el presente documento como referencia, describes un RIA para AMPc.
Hay una variedad de kits para la medición del AMPc comercialmente disponibles, tales como el ensayo homogéneo basado en la polarización de fluorescencia de alta eficacia comercializado por LJL Biosystems y NEN Life Science Products. Las reacciones de control deben realizarse usando extractos células transfectadas simuladas para excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidatos.
El nivel de AMPc está "cambiado" si el nivel de AMPc detectado en las células, que expresan un polipéptido de GPR86 y tratadas con un modulador candidato de la actividad de GPR86 (o en extractos de tales células), usando el ensayo basado en RIA de Horton y Baxendale, 1995, citado anteriormente, aumenta o disminuye en al menos el 10% con respecto al nivel de AMPc en células similares no tratadas con el modulador candidato.
d. Degradación de fosfolípidos, producción de DAG y niveles de inositol trifosfato
Los receptores que activan la degradación de los fosfolípidos pueden monitorizarse para determinar cambios debido a la actividad de moduladores conocidos o sospechados de GPR86 monitorizando la degradación de fosfolípidos, y la producción resultante de segundos mensajeros DAG y/o inositol trifosfato (IP_{3}). Se describen métodos de detección de cada uno de ellos en Phospholipid Signalling Protocols, editado por Ian M. Bird. Totowa, NJ, Humana Press, 1998, que se incorpora en el presente documento como referencia. Véase también Rudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 11824-11831, incorporado en el presente documento como referencia, que también describe un ensayo para determinar la degradación de fosfatidilinositol. Los ensayos deben realizarse usando células o extractos de células que expresan GPR86, tratadas o no tratadas con ADP con o sin un modulador candidato. Las reacciones de control deben realizarse usando células transfectadas simuladas, o extractos de ellas, con el fin de excluir efectos no específicos de algunos moduladores candidatos.
Según la invención, la degradación de fosfatidilinositol, y los niveles de diacilglicerol y/o inositol trifosfato están "cambiados" si aumentan o disminuyen en al menos el 10% en una muestra de células que expresan un polipéptido de GPR86 y tratadas con un modulador candidato, con respecto al nivel observado en una muestra de células que expresan un polipéptido de GPR86 que no se han tratado con el modulador candidato.
e. Ensayos de activación de PKC
Las tirosina cinasas del receptor del factor del crecimiento pueden señalizar mediante una ruta que implica la activación de la proteína cinasa C (PKC), que es una familia de proteína cinasas activadas por fosfolípidos y calcio. La activación de la PKC da como resultado en último lugar la transcripción de una serie de genes que codifican para el factor de transcripción de protooncogenes, incluyendo c-fos, c-mic y c-jun, proteasas, inhibidores de proteasas, incluyendo colagenasa de tipo I e inhibidor del activador del plasminógeno, y moléculas de adhesión, incluyendo molécula I de adhesión intracelular (ICAM I). Pueden usarse ensayos diseñados para detectar aumentos en los productos génicos inducidos por la PKC para monitorizar la activación de la PKC y así la actividad del receptor. Además, puede monitorizarse la actividad de receptores que señalizan mediante PKC a través del uso de constructos de gen indicador impulsados por las secuencias de control de genes activados mediante activación de PKC. Este tipo de ensayo basado en gen indicador se trata en más detalle a continuación.
Para una medición más directa de la actividad de PKC, puede usarse el método de Kikkawa et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 13341, incorporado en el presente documento como referencia. Este ensayo mide la fosforilación de un péptido de sustrato de PKC, que se separa posteriormente mediante unión a papel de fosfocelulosa. Puede usarse este sistema de ensayo de PKC para medir la actividad de cinasa purificada, o la actividad en extractos celulares crudos. Puede diluirse la muestra de proteína cinasa C en HEPES 20 mM / DTT 2 mM inmediatamente antes del
ensayo.
El sustrato para el ensayo es el péptido Ac-FKKSFKL-NH2, derivado de la proteína sustrato de la proteína cinasa C rica en alanina (MARCKS). El K_{m} de la enzima para este péptido es de aproximadamente 50 \muM. También pueden usarse otros péptidos básicos, selectivos de proteína cinasa C conocidos en la técnica, a una concentración de al menos 2-3 veces su K_{m}. Los cofactores requeridos para el ensayo incluyen calcio, magnesio, ATP, fosfatidilserina y diacilglicerol. Dependiendo de la intención del usuario, puede realizarse el ensayo para determinar la cantidad de PKC presente (condiciones de activación) o la cantidad de PKC activa presente (condiciones de no activación). Para la mayoría de los fines según la invención, se usarán condiciones de no activación, de tal modo que se mide la PKC, que es activa en la muestra cuando está aislada, en lugar de medir la PKC que puede activarse. Para condiciones de no activación, se omite el calcio del ensayo a favor de EGTA.
El ensayo se realiza en una mezcla que contiene HEPES 20 mM, pH 7,4, DTT 1-2 mM, MgCl_{2} 5 mM, ATP 100 \muM, \gamma-^{32}P-ATP \sim1 \muCi, 100 \mug/ml de sustrato de péptidos (\sim100 \muM), membranas de fosfatidilserina / diacilglicerol 140 \muM / 3,8 \muM, y calcio 100 \muM (o EGTA 500 \muM). Se usan 48 \mul de muestra, diluidos en HEPES 20 mM, pH 7,4, DTT 2 mM en un volumen de reacción final de 80 \mul. Las reacciones se realizan a 30ºC durante 5-10 minutos, seguido de adición de 25 \mul de ATP 100 mM, EDTA 100 mM, pH 8,0, lo que para las reacciones.
Tras parar la reacción, se coloca una parte (85 \mul) de cada reacción sobre un filtro de fosfato de celulosa Whatman P81, seguido de lavados: cuatro veces 500 ml en ácido fosfórico al 0,4%, (5-10 min por lavado); y un lavado final en 500 ml de EtOH al 95%, durante 2-5 min. Se mide la radioactividad unida mediante recuento de centelleo. Se determina la actividad específica (cpm/nmol) del ATP marcado colocando una muestra de la reacción sobre papel P81 y realizando un recuento sin lavado. Se calculan las unidades de actividad de PKC, definidas como nmol de fosfato transferido por min., tal como sigue:
La actividad, en unidades (nmol/min) es:
= \frac{(cpm \ sobre \ papel) \ x \ (105 \ \mu l \ total/85 \ \mu l \ colocados)}{(tiempo \ de \ ensayo, \ min) \ (actividad \ espec\text{í}fica \ de \ ATP \ cpm/nmol)}
\vskip1.000000\baselineskip
Puede realizarse un ensayo alternativo usando un kit de ensayo de proteína cinasa C vendido por PanVera (número de catálogo P2747).
Los ensayos se realizan sobre extractos de células que expresan un polipéptido de GPR86, tratadas o no tratadas con ADP con o sin un modulador candidato. Deben realizarse reacciones de control usando células transfectadas simuladas, o extractos de ellas con el fin de excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores
candidatos.
Según la invención, la actividad de PKC está "cambiada" por un modulador candidato cuando las unidades de PKC medidas por cualquier ensayo descrito anteriormente aumentan o disminuyen en al menos el 10%, en extractos de células que expresan GPR86 y tratadas con un modulador candidato, con respecto a una reacción realizada sobre una muestra similar de células no tratadas con un modulador candidato.
f. Ensayos de cinasa
Puede someterse a ensayo la actividad de MAP cinasa usando cualquiera de los diversos kits comercialmente disponibles, por ejemplo, el kit de ensayo de p38 MAP cinasa vendido por New England Biolabs (número de catálogo 9820) o los ensayos de MAP cinasa FlashPlate™ vendidos por Perkin-Elmer Life Sciences.
La actividad de MAP cinasa está "cambiada" si el nivel de actividad aumenta o disminuye en el 10% o más en una muestra de células, que expresan un polipéptido de GPR86, tratadas con un modulador candidato con respecto a la actividad de MAP cinasa en una muestra de células similares no tratadas con el modulador candidato.
Se conocen bien ensayos directos para la actividad de tirosina cinasa usando fosfato marcado y sustratos de tirosina cinasa sintéticos o naturales conocidos, como se conocen ensayos similares para otros tipos de cinasas (por ejemplo, Ser/Thr cinasas). Pueden realizarse ensayos de cinasa tanto con cinasas purificadas como con extractos crudos preparados a partir de células que expresan un polipéptido de GPR86, tratadas con o sin ADP, con o sin un modulador candidato. Deben realizarse reacciones de control usando células transfectadas simuladas, o extractos de ellas con el fin de excluir posibles efectos no específicos de algunos moduladores candidatos. Los sustratos pueden ser o bien proteína de cadena total o bien péptidos sintéticos que representan al sustrato. Pinna y Ruzzene (1996, Biochem. Biophys. Acta 1314: 191-225, incorporado en el presente documento como referencia) enumera una variedad de sitios de sustrato de fosforilación útiles para detectar actividades de cinasa. Hay una variedad de péptidos de sustrato de cinasa comercialmente disponibles. Uno que es particularmente útil es el "péptido relacionado con Src" RRLIEDAEYAARG (disponible de Sigma número A7433), que es un sustrato para muchas tirosina cinasas de receptor y no receptor. Debido a que el ensayo descrito a continuación requiere la unión de sustratos de péptidos a filtros, los sustratos de péptidos deben tener una carga neta positiva para facilitar la unión. Generalmente, los sustratos de péptidos deben tener al menos 2 residuos básicos y un extremo terminal de amina libre. Generalmente, las reacciones usan una concentración de péptido de 0,7-1,5 mM.
Generalmente, los ensayos se llevan a cabo en un volumen de 25 \mul que comprende 5 \mul de tampón de 5X cinasa (BSA 5 mg/mL, tris-HCl 150 mM (pH 7,5), MgCl_{2} 100 mM; dependiendo de la cinasa exacta que está sometiéndose a ensayo, puede usarse MnCl_{2} en lugar de o además de MgCl_{2}), 5 \mul de ATP 1,0 mM (concentración final de 0,2 mM), \gamma-^{32}P-ATP (100-500 cpm/pmol), 3 \mul de sustrato de péptidos 10 mM (concentración final de 1,2 mM), extracto de células que contiene la cinasa que va a probarse (los extractos de células usados para los ensayos de cinasa deben contener un inhibidor de fosfatasa (por ejemplo, ortovanadato de sodio 0,1-1 mM)), y H_{2}O hasta 25 \mul. Las reacciones se realizan a 30ºC, y se inician por la adición del extracto de células.
Las reacciones de cinasa se realizan durante de 30 segundos a aproximadamente 30 minutos, seguido por la adición de 45 \mul de ácido tricloroacético al 10% helado (TCA). Se centrifugan las muestras durante 2 minutos en una microcentrífuga, y se colocan 35 \mul del sobrenadante sobre círculos de filtro de fosfato de celulosa Whatman P81. Se lavan los filtros tres veces con 500 ml de ácido fosfórico al 0,5% frío, seguido por un lavado con 200 ml de acetona a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se secan los filtros y se mide el ^{32}P incorporado mediante recuento de centelleo. Se determina la actividad específica de ATP en la reacción de cinasa (por ejemplo, en cpm/pmol) colocando una muestra pequeña (2-5 \mul) de la reacción sobre un círculo de filtro P81 y contando directamente, sin lavado. Entonces se dividen los recuentos por minuto obtenidos en la reacción de cinasa (menos el blanco) por la actividad específica para determinar los moles de fosfato transferidos en la reacción.
La actividad de la tirosina cinasa está "cambiada" si el nivel de actividad de cinasa aumenta o disminuye en el 10% o más en una muestra de células, que expresan un polipéptido de GPR86, tratadas con un modulador candidato con respecto a la actividad de cinasa en una muestra de células similares no tratadas con el modulador candi-
dato.
g. Indicadores transcripcionales para la activación de la ruta en sentido 3'
La señal intracelular iniciada por la unión de un agonista a un receptor, por ejemplo, GPR86, pone en marcha una cascada de acontecimientos intracelulares, cuya última consecuencia es un cambio rápido y detectable en la transcripción o traducción de uno o más genes. Por tanto, puede monitorizarse la actividad del receptor detectando la expresión de un gen indicador impulsado por secuencias de control que responden a la activación de GPR86.
Tal como se usa en el presente documento, "promotor" se refiere a los elementos de control transcripcional necesarios para la regulación mediada por receptor de la expresión génica, incluyendo no solo el promotor basal, sino también cualquier potenciador o sitios de unión del factor de transcripción necesarios para la expresión regulada por receptor. Mediante la selección de promotores que responden a las señales intracelulares resultantes de la unión de agonistas, y el enlace de manera operativa de los promotores seleccionados a genes indicadores cuya transcripción, traducción o actividad final puede detectarse y medirse fácilmente, el ensayo de indicador basado en la transcripción proporciona una rápida indicación de si un indicador dado está activado.
En la técnica se conocen bien genes indicadores tales como luciferasa, CAT, GFP, \beta-lactamasa o \beta-galactosidasa como lo son los ensayos para la detección de sus productos.
Los genes particularmente bien adecuados para la monitorización de la actividad de receptor son los genes "inmediatos tempranos", que se inducen rápidamente, generalmente en un plazo de minutos desde el contacto entre el receptor y el ligando o proteína del efector. La inducción de la transcripción del gen inmediato temprano no requiere la síntesis de nuevas proteínas reguladoras. Además de la rápida respuesta a la unión de ligando, las características de los genes preferidos útiles para preparar constructos indicadores incluyen: expresión baja o indetectable en células inactivas; inducción que es transitoria e independiente de la síntesis de nuevas proteínas; la interrupción posterior de la transcripción requiere la síntesis de nuevas proteínas; y los ARNm transcritos a partir de esos genes tienen una semivida corta. Se prefiere, pero no es necesario, que un elemento de control transcripcional tenga todas esas propiedades para que sea útil.
Un ejemplo de un gen que responde a una variedad de estímulos diferentes es el protooncogen c-fos. El gen c-fos se activa de una manera independiente de la síntesis de proteínas mediante factores de crecimiento, hormonas, agentes específicos de la diferenciación, el estrés, y otros inductores de proteínas de superficie celular conocidos. La inducción de la expresión de c-fos es extremadamente rápida, produciéndose a menudo en un plazo de minutos desde la estimulación del receptor. Esta característica vuelve las regiones reguladoras del c-fos particularmente atractivas para su uso como un indicador de la activación del receptor.
Los elementos reguladores del c-fos incluyen (véase, Verma et al., 1987, Cell 51: 513-514): una caja TATA que se requiere para la iniciación de la transcripción; dos elementos en sentido 5' para la transcripción basal, y un potenciador, que incluye un elemento con simetría diada y que se requiere para la inducción por TPA, suero, EGF, y PMA.
El elemento potenciador transcripcional de c-fos de 20 pb localizado entre -317 y -298 pb en sentido 5' del sitio de caperuza de ARNm de c-fos, es esencial para la inducción por suero en células NIH 3T3 pobres en suero. Uno de los dos elementos en sentido 5' se localiza a de -63 a -57 y se parece a la secuencia de consenso para la regulación de AMPc.
El factor de transcripción CREB (proteína de unión a elemento de respuesta a AMP cíclico) responde, tal como implica el nombre, a niveles de AMPc intracelular. Por lo tanto, la activación de un receptor que señaliza mediante la modulación de niveles de AMPc puede monitorizarse mediante la detección o bien de la unión del factor de transcripción, o bien la expresión de un gen indicador unido a un elemento de unión a CREB (denominado CRE, o elemento de respuesta a AMPc). La secuencia de ADN del CRE es TGACGTCA. Los constructos indicadores que responden a la actividad de unión de CREB se describen en la patente de los EE.UU. número 5.919.649.
Otros promotores y elementos de control transcripcional, además de los elementos de c-fos constructos que responden a CREB, incluyen el promotor del gen del péptido intestinal vasoactivo (VIP) (que responde a AMPc; Fink et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6662-6666); el promotor del gen de la somastatina (que responde a AMPc; Montmini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 6682-6686); el promotor de la proencefalina (que responde a AMPc, agonistas nicotínicos y ésteres de forbol; Comb et al., 1986, Nature 323: 353-356); el promotor del gen de la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK) (que responde a AMPc; Short et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 9721-9726).
Ejemplos adicionales de elementos de control transcripcional que responden a cambios en la actividad de GPR incluyen, pero no se limitan a, aquellos que responden al factor de transcripción AP-1 y aquellos que responden a la actividad de NF-\kappaB. El sitio de unión de AP-1 de consenso es el palíndromo TGA(C/G)TCA (Lee et al., 1987, Nature 325: 368-372; Lee et al., 1987, Cell 49: 741-752). El sitio de AP-1 también es responsable de mediar la inducción por promotores tumorales tales como el éster de forbol 12-O-tetradecanoilforbol-\beta-acetato (TPA), y por tanto a veces también se les denomina TRE, por elemento de respuesta a TPA. El AP-1 activa varios genes que está implicados en la respuesta temprana de células a los estímulos del crecimiento. Ejemplos de genes que responden a AP-1- incluyen, pero no se limitan a, los genes para Fos y Jun (proteínas que constituyen en sí mismas actividad de AP-1), antígenos relacionados con Fos (Fra) 1 y 2, I\kappaB\alpha, ornitina descarboxilasa, y anexinas I y II.
El elemento de unión de NF-\kappaB tiene la secuencia de consenso GGGGACTTTCC. Se ha identificado un gran número de genes como que responden a NF-\kappaB, y sus elementos de control pueden enlazarse a un gen indicador para monitorizar la actividad de GPCR. Una pequeña muestra de los genes que responden a NF-\kappaB incluye los que codifican para IL-1\beta (Hiscott et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13: 6231-6240), TNF-\alpha (Shakhov et al., 1990, J. Exp. Med. 171: 35-47), CCR5 (Liu et al., 1998, AIDS Res. Hum. Retroviruses 14: 1509-1519), selección P (Pan y McEver, 1995, J. Biol. Chem. 270: 23077-23083), ligando Fas (Matsui et al., 1998, J. Immunol. 161: 3469-3473), GM-CSF (Schreck y Baeuerle, 1990, Mol. Cell. Biol. 10: 1281-1286) e I\kappaB\alpha (Haskill et al., 1991, Cell 65: 1281-1289). Cada una de estas referencias se incorpora en el presente documento como referencia. Los vectores que codifican para indicadores que responden a NF-\kappaB también se conocen en la técnica o pueden prepararse fácilmente por un experto en la técnica usando, por ejemplo, elementos de NF-\kappaB sintéticos y un promotor animal, o usando las secuencias que responden a NF-\kappaB de un gen conocido para someterlas a regulación por NF-\kappaB. Además, hay constructos indicadores que responden a NF-\kappaB comercialmente disponibles, por ejemplo, de CLONTECH.
Un constructo de promotor dado debe probarse exponiendo células que expresan GPR86, transfectadas con el constructo, a ADP. Un aumento de al menos dos veces en la expresión del indicador en respuesta al ADP indica que el indicador es un indicador de la actividad de GPR86.
Con el fin de someter a ensayo la actividad de GPR86 con un constructo de indicador transcripcional que responde a ADP, se transfectan de manera estable células que expresan de manera estable un polipéptido de GPR86 con el constructo indicador. Para seleccionar agonistas, se dejan las células sin tratar, se exponen a moduladores candidatos, o se exponen a ADP, y se mide la expresión del indicador. Los cultivos tratados con ADP sirven como patrón para el nivel de transcripción inducida por un agonista conocido. Un aumento de al menos el 50% en la expresión de indicador en presencia de un modulador candidato indica que el candidato es un modulador de la actividad de GPR86. Un agonista inducirá al menos tanta, la misma cantidad o más, de expresión de indicador que el ADP sólo. Este enfoque también puede usarse para seleccionar agonistas inversos en los que las células expresan un polipéptido de GPR86 a niveles tales que hay una actividad basal elevada del indicador en ausencia de ADP u otro agonista. Una disminución en la actividad de indicador del 10% o más en presencia de un modulador candidato, con respecto a su ausencia, indica que el compuesto es un agonista inverso.
Para seleccionar antagonistas, se exponen las células que expresan GPR86 y llevan el constructo indicador a ADP (u otro agonista) en presencia y ausencia de modulador candidato. Una disminución del 10% o más en la expresión de indicador en presencia de modulador candidato, con respecto a la ausencia del modulador candidato, indica que el candidato es un modulador de la actividad de GPR86.
Los controles para los ensayos de transcripción incluyen células que no expresan GPR86 pero llevan el constructo indicador, así como células con un constructo de indicador sin promotor. Los compuestos que se identifican como moduladores de la transcripción regulada por GPR86 deben analizarse también para determinar si afectan a la transcripción impulsada por otras secuencias reguladoras y por otros receptores, con el fin de determinar la especificidad y espectro de su actividad.
El ensayo de indicador transcripcional, y la mayoría de los ensayos basados en células, están bien adecuados para la examinación de bibliotecas de expresión para proteínas para aquellas que modulan la actividad de GPR86. Las bibliotecas pueden ser, por ejemplo, bibliotecas de ADNc a partir de fuentes naturales, por ejemplo, plantas, animales, bacterias, etc., o pueden ser bibliotecas que expresan variantes aleatoria o sistemáticamente mutadas de uno o más polipéptidos. También pueden usarse bibliotecas genómicas en vectores virales para expresar el contenido en ARNm de una célula o tejido, en las diferentes bibliotecas usadas para seleccionar GPR86.
h. Medición de inositol fosfatos (IP)
Se marcan las células de la invención, por ejemplo, células 1321N1, durante 24 horas con [^{3}H]inositol 10 \muCi/ml en DMEM libre de inositol que contiene SBF al 5%, antibióticos, anfotericina, piruvato de sodio y G418 400 \mug/ml. Se incuban las células durante 2 h en tampón de Krebs-Ringer Hepes (KRH) de la siguiente composición (NaCl 124 mM, KCl 5 mM, MgSO_{4} 1,25 mM, CaCl_{2} 1,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1,25 mM, Hepes 25 mM (pH: 7,4) y glucosa 8 mM). Entonces, se exponen las células con diversos nucleótidos durante 30 s. Se para la incubación mediante la adición de una disolución de ácido perclórico al 3% helada. Se extraen los IP y se separan sobre columnas Dowex tal como se describió previamente (25). Se tratan disoluciones de 2MeSATP y ATP (1 mM) a temperatura ambiente con 20 unidades/ml de CPK y CP 10 mM durante 90 min para sortear problemas que surgen de la contaminación y degradación de las disoluciones de nucleótido trifosfato.
II Ensayo de GPR86
La invención proporciona un ensayo para detectar la actividad de un receptor de la invención en una muestra. Por ejemplo, la actividad de GPR86 puede medirse en una muestra que comprende una célula o una membrana celular que expresa GPR86. El ensayo se lleva a cabo incubando la muestra en presencia o ausencia de ADP y llevando a cabo un ensayo de segundo mensajero, tal como se describió anteriormente. Los resultados del ensayo de segundo mensajero realizados en presencia o ausencia de ADP se comparan para determinar si el receptor GPR86 está activo. Un aumento del 10% o más en el nivel detectado de un segundo mensajero dado, tal como se define en el presente documento, en presencia de ADP con relación a la cantidad detectada en un ensayo realizado en ausencia de ADP, es indicativo de actividad de GPR86.
Cualquiera de los ensayos de la actividad del receptor, incluyendo pero sin limitarse a la unión de GTP, GTPasa, adenilato ciclasa, AMPc, rotura de fosfolípidos, diacilglicerol, inositol trifosfato, liberación de ácido araquidónico (véase más adelante), PKC, ensayos de indicador transcripcional y cinasa, pueden utilizarse para determinar la presencia de un agente en una muestra, por ejemplo, una muestra de tejido, que afecte a la actividad de la molécula del receptor GPR86. Para hacer esto, se somete a ensayo al polipéptido de GPR86 para determinar su actividad en presencia y ausencia de la muestra o un extracto de la muestra. Un aumento en la actividad de GPR86 en presencia de la muestra o de un extracto con relación a la ausencia de muestra, indica que la muestra contiene un agonista de la actividad de receptor. Una disminución en la actividad del receptor en presencia de ADP u otro agonista y la muestra, con relación a la actividad del receptor en presencia de ADP solo, indica que la muestra contiene un antagonista de la actividad de GPR86. Si se desea, las muestras pueden fraccionarse entonces y probarse adicionalmente para aislar o purificar el agonista o antagonista. La cantidad de aumento o disminución en la actividad medida necesaria para que se diga que una muestra contiene un modulador, depende del tipo de ensayo utilizado. En general, un cambio del 10% o mayor (aumento o disminución) con relación a un ensayo realizado en ausencia de una muestra indica la presencia de un modulador en la muestra. Una excepción en el ensayo del indicador transcripcional, en el que es necesario al menos un aumento de dos veces o una disminución del 10% en la señal para que se diga que una muestra contiene un modulador. Un agonista puede estimular al menos el 50%, o el 75% o el 100% o más, por ejemplo, 2 veces, 5 veces, 10 veces o más, la activación del receptor que con ADP solo.
Otros ensayos funcionales incluyen, por ejemplo, ensayos de microfisiómetro o biosensor (véase Hafner, 2000, Biosens. Bioelectron. 15: 149-158, incorporado al presente documento como referencia). El nivel intracelular de ácido araquidónico también puede determinarse tal como se describe en Gijón et al., 2000, J. Biol. Chem., 275: 20146-20156.
En consecuencia, un método para la detección de la actividad de GPR86 en una muestra puede comprender las etapas de incubar una muestra que comprende GPR86 y ADP en condiciones que permitan la unión de GPR86 y ADP, y detectar un segundo mensajero. Posiblemente, este método comprende además las etapas de incubar una segunda muestra que comprende GPR86 en ausencia de ADP en condiciones que permiten la unión de GPR86 y ADP, y detectar un segundo mensajero. La muestra puede comprender células que expresan GPR86 o membranas celulares que llevan GPR86. Alternativamente, la incubación puede llevarse a cabo en o sobre membranas de gemación inducidas por virus que contienen el polipéptido de GPR86.
III Ensayos diagnósticos basados en la interacción de GPR86 y ADP
La señalización a través de GPCR desempeña un papel decisivo en la patología de un gran número de enfermedades y trastornos. GPR86, que se expresa en células de los linajes de linfocitos, plaquetas, bazo, así como células leucémicas, puede desempeñar un papel en los procesos inmunitarios, cáncer, trombosis y trastornos o enfermedades asociados. El patrón de expresión de GPR86 también incluye el cerebro y sugiere además un papel potencial como neurotransmisor de ADP.
El patrón de expresión de GPR86 y el conocimiento con respecto a los trastornos mediados generalmente por GPCR sugiere que GPR86 puede estar implicado en alteraciones de la migración celular, cáncer, desarrollo de tumores y metástasis tumoral, procesos inflamatorios y neoplásicos, curación de heridas y huesos y disfunción de las funciones reguladoras del crecimiento, diabetes, obesidad, anorexia, bulimia, insuficiencia cardiaca aguda, hipotensión, hipertensión, retención urinaria, osteoporosis, angina de pecho, infarto de miocardio, reestenosis, aterosclerosis, trombosis y otras enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, enfermedades caracterizadas por excesiva proliferación de células del músculo liso, aneurismas, enfermedades caracterizadas por pérdida de células del músculo liso o proliferación reducida de células del músculo liso, accidente cerebrovascular, isquemia, úlceras, alergias, hipertrofia prostática benigna, migraña, vómitos, trastornos psicóticos y neurológicos, incluyendo ansiedad, esquizofrenia, depresión maníaca, depresión, delirio, demencia y retraso metal grave, enfermedades degenerativas, enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson, y discinesias, tales como la enfermedad de Huntington o el síndrome de Gilles de la Tourett y otras enfermedades relacionadas incluyendo trombosis y otras enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias.
La interacción de GPR86 con ADP puede utilizarse como la base de ensayos para el diagnóstico o la monitorización de enfermedades, trastornos o procesos que implican la señalización de GPR86. Los ensayos diagnósticos para las enfermedades o trastornos relacionados con GPR86 pueden tener varias formas diferentes. En primer lugar, los ensayos diagnósticos pueden medir la cantidad de GPR86, genes o ARNm en una muestra de tejido. Los ensayos que miden la cantidad de ARNm que codifica para el polipéptido de GPR86 también se ajustan a esta categoría. En segundo lugar, los ensayos pueden evaluar las cualidades del receptor o el ligando. Por ejemplo, los ensayos que determinan si un individuo expresa una forma mutante o variante de GPR86 o un ligando polipeptídico, pueden utilizarse para el diagnóstico. En tercer lugar, los ensayos que miden una o más actividades del polipéptido de GPR86 pueden utilizarse para el diagnóstico.
A. Ensayos que miden la cantidad de GPR86
Los niveles de GPR86 pueden medirse y compararse con patrones con el fin de determinar si está presente en una muestra un nivel anómalo del receptor o su ligando, indicando cualquiera de los dos una probable desregulación de la señalización de GPR86. Se miden los niveles de polipéptido, por ejemplo, mediante inmunohistoqímica utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido. Una muestra aislada de un individuo que se sospecha que padece una enfermedad o trastorno caracterizado por la actividad de GPR86 se pone en contacto con un anticuerpo frente a GPR86, y se mide la unión del anticuerpo tal como se conoce en la técnica (por ejemplo, mediante la medición de la actividad de una enzima conjugada con un anticuerpo secundario).
Otro enfoque para la medición de los niveles de GPR86 utiliza análisis de citometría de flujo de las células de un tejido afectado. Los métodos de citometría de flujo, incluyendo el marcaje fluorescente de anticuerpos específicos para GPR86, se conocen bien en la técnica. Otros enfoques incluyen radioinmunoensayo o ELISA. Los métodos para cada uno de éstos, también se conocen bien en la técnica.
La cantidad de unión detectada se compara con la unión en una muestra de tejido similar de un individuo sano, o de un sitio en el individuo afectado que no está tan afectado. Un aumento del 10% o más con relación al patrón es diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de GPR86.
La expresión de GPR86 también puede medirse determinando la cantidad de ARNm que codifica para los polipéptidos en una muestra de tejido. Los niveles de ARNm pueden medirse mediante PCR cuantitativa o semicuantitativa. Los métodos de la amplificación "cuantitativa" son bien conocidos por los expertos en la técnica, y las secuencias cebadoras para la amplificación de ambos GPR86 se describen en el presente documento. Un método común de PCR cuantitativa supone coamplificar simultáneamente una cantidad conocida de una secuencia control usando los mismos cebadores. Esto proporciona un patrón interno que puede usarse para calibrar la reacción de PCR. Se facilitan protocolos detallados para la PCR cuantitativa en PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y., (1990), que se incorpora al presente documento como referencia. Un aumento del 10% o más en la cantidad de ARNm que codifica para GPR86 en una muestra, con relación a la cantidad expresada en una muestra o tejido similar de un individuo sano o en una muestra de un tejido de una ubicación no afectada en un individuo afectado es diagnóstico para una enfermedad o trastorno caracterizado por la desregulación de la señalización de GPR86.
B. Ensayos cualitativos
Los ensayos que evalúan si el polipéptido de GPR86 o el ARNm que codifica para él son de tipo natural o no, pueden utilizarse para el diagnóstico. Con el fin de diagnosticar una enfermedad o trastorno caracterizado por la desregulación de GPR86 de esta manera, el ARN aislado de una muestra se utiliza como molde para la amplificación por PCR de GPR86. Las secuencias amplificadas o bien se secuencian directamente utilizando métodos convencionales, o se clonan primero en un vector, seguido por secuenciación. Una diferencia en la secuencia que cambia uno o más aminoácidos codificados con relación a la secuencia de GPR86 de tipo natural puede ser diagnóstica de una enfermedad o trastorno caracterizado por la desregulación de la señalización de GPR86. Puede ser útil, cuando se identifica un cambio en la secuencia codificante en una muestra, expresar el ligando o receptor variante y comparar su actividad con la de GPR86 de tipo natural. Entre otros beneficios, este enfoque puede proporcionar mutantes novedosos, incluyendo mutantes nulos y activos constitutivamente.
Además de los métodos de secuenciación convencionales, las secuencias amplificadas pueden someterse a ensayo para determinar la presencia de mutaciones específicas utilizando, por ejemplo, hibridación de sondas fluorescentes que distinguen entre las secuencias de tipo natural y variante. Los ensayos de hibridación que distinguen partiendo de la base de cambios de tan sólo un nucleótido se conocen bien en la técnica. Alternativamente, pueden llevarse a cabo cualquiera de varios ensayos de "minisecuenciación", incluyendo los descritos, por ejemplo, en las patentes de los EE.UU. 5.888.819, 6.004.744 y 6.013.431 (incorporadas al presente documento como referencia). Estos ensayos y otros conocidos en la técnica pueden determinar la presencia, en una muestra dada, de un ácido nucleico con un polimorfismo conocido.
Si se desea, pueden utilizarse métodos basados en matriz o micromatriz para analizar la expresión o la presencia de mutación, en las secuencias de GPR86. Los métodos basados en matriz para la minisecuenciación y para la cuantificación de la expresión de ácidos nucleicos se conocen bien en la técnica.
C. Ensayos funcionales
El diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por la desregulación de la señalización de GPR86 también puede llevarse a cabo utilizando ensayos funcionales. Para hacer esto, se utilizan membranas celulares o extractos celulares preparados a partir de una muestra de tejido en un ensayo de la actividad de GPR86, tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, ensayos de unión de ligando, ensayos de unión de GTP, ensayo de GTPasa, ensayo de adenilato ciclasa, ensayo de AMPc, nivel de ácido araquidónico, rotura de fosfolípidos, ensayos de diacilglicerol o inositol trifosfato, ensayos de activación de PKC, o ensayo de cinasa). La actividad detectada se compara con la de una muestra patrón tomada de un individuo sano o de un sitio no afectado en el individuo afectado. Como alternativa, una muestra o extracto de una muestra puede aplicarse a células que expresan GPR86, seguido por la medición de la actividad de señalización de GPR86 con relación a una muestra patrón. Una diferencia del 10% o más en la actividad medida en cualquiera de estos ensayos, con relación a la actividad del patrón, es diagnóstico para una enfermedad o trastorno caracterizado por la desregulación de la señalización de GPR86.
Modulación de la actividad de GPR86 en una célula según la invención
El descubrimiento del ADP como ligando de GPR86 proporciona métodos para modular la actividad del polipéptido de GPR86 en una célula. La actividad de GPR86 se modula en una célula mediante el suministro a esa célula de un agente que modula la función de un polipéptido de GPR86. Esta modulación puede llevarse a cabo en células en cultivo como parte de un ensayo para la identificación de agentes de modulación adicionales o, por ejemplo, en un animal, incluyendo un ser humano. Los agentes incluyen ADP y sus análogos tal como se define en el presente documento, así como moduladores adicionales identificados usando los métodos de selección descritos en el presente documento incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de los análogos de ADP presentados en la patente de los EE.UU. número 5.700.786.
Un agente puede suministrarse a una célula mediante su adición al medio de cultivo. La cantidad que ha de suministrarse variará con la identidad del agente y con el fin para el que suministra. Por ejemplo, en un ensayo de cultivo para identificar antagonistas de la actividad de GPR86, se añadirá generalmente una cantidad de ADP que active a la mitad del máximo los receptores (por ejemplo, aproximadamente CE_{50}), por ejemplo, sin superar la dosis requerida para la saturación de receptor. Esta dosis puede determinarse valorando la cantidad de ADP para determinar el punto en el que la adición adicional de ADP no tiene efecto adicional sobre la actividad de GPR86.
Cuando se administra un modulador de la actividad de GPR86 a un animal para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, la cantidad administrada puede ajustarse por un experto en la técnica partiendo de la base del resultado deseado. El tratamiento satisfactorio se logra cuando uno o más aspectos medibles de la patología (por ejemplo, crecimiento de las células tumorales, acumulación de las células inflamatorias) experimenta un cambio en al menos el 10% con relación al valor para ese aspecto antes del tratamiento.
Moduladores candidatos útiles según la invención
La invención proporciona un compuesto que es un modulador de un receptor de la invención.
Un modulador candidato puede ser un nucleótido o un nucleótido que se une a un azúcar incluyendo, pero sin limitarse a, ADP-glucosa o ADP-galactosa. Un modulador candidato también puede ser cualquier análogo de ADP conocido en la técnica, así como cualquier ligando que se una al receptor de la UDP-glucosa.
El compuesto candidato puede ser un compuesto sintético, o una mezcla de compuestos o puede ser un producto natural (por ejemplo, un extracto vegetal o sobrenadante de cultivo). Un compuesto candidato según la invención incluye una pequeña molécula que puede sintetizarse, un extracto natural, péptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, etc.
El modulador candidato puede ser, por ejemplo, ATP, 2MeSATP, 2MeSADP, ADP\betaS, Ap_{3}A, RB-2, suramina o PPADS.
Pueden seleccionarse compuestos moduladores candidatos de grandes bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. En la actualidad, se utilizan numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de compuestos basados en sacáridos, péptidos y ácidos nucleicos. Las bibliotecas de compuestos sintéticos están comercialmente disponibles de varias compañías incluyendo Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, RU), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH) y Microsource (New Milford, CT). Una biblioteca química poco común está disponible de Aldrich (Milwaukee, WI). Bibliotecas combinatorias están disponibles y pueden prepararse. Alternativamente, bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales, están disponibles de, por ejemplo, Pan Laboratories (Bothell, WA) o MycoSearch (NC), o pueden producirse fácilmente mediante métodos bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, las bibliotecas y los compuestos natural y sintéticamente producidos pueden modificarse fácilmente mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales.
Pueden encontrarse compuestos útiles dentro de numerosas clases químicas. Los compuestos útiles puede ser compuestos orgánicos, o compuestos orgánicos pequeños. Los compuestos orgánicos pequeños tienen un peso molecular de más de 50, pero inferior a aproximadamente 2.500 daltons, o inferior a aproximadamente 750, o inferior a aproximadamente 350 daltons. Clases a modo de ejemplo incluyen heterociclos, péptidos, sacáridos, esteroides, y similares. Los compuestos pueden modificarse para potenciar la eficacia, estabilidad, compatibilidad farmacéutica, y similares. La identificación estructural de un agente puede utilizarse para identificar, generar o seleccionar agentes adicionales. Por ejemplo, cuando se identifican agentes peptídicos, pueden modificarse en una variedad de formas para potenciar su estabilidad, tal como usando un aminoácido no natural, tal como un D-aminoácido, particularmente D-alanina, funcionalizando el extremo amino o carboxilo terminal, por ejemplo, para el grupo amino, acilación o alquilación, y para el grupo carboxilo, esterificación o amidificación, o similares.
Para la selección primaria, una concentración útil de un compuesto candidato según la invención es desde aproximadamente 1 \muM hasta aproximadamente 60 \muM o más (es decir, 100 \muM, 1 mM, 10 mM, 100 mM, 1 M, etc.). La concentración de selección primaria se utilizará como límite superior, junto con nueve concentraciones adicionales, en las que las concentraciones adicionales se determinan mediante la reducción de la concentración de selección primaria a intervalos semilogarítmicos (por ejemplo, para 9 concentraciones más) para las selecciones secundarias o para la generación de curvas de concentración.
Proteína G\alpha16
La invención proporciona ensayos y métodos en los que se lleva a cabo la incubación de GPR86 y un ligando, tal como ADP, en presencia de la proteína G\alpha16, que puede acoplar el receptor GPR86 a la fosfolipasa C.
Anticuerpos útiles según la invención
La invención proporciona anticuerpos frente a GPR86. Los anticuerpos pueden obtenerse utilizando protocolos convencionales conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Antibodies: a Laboratory Manual ed., de Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988). Un mamífero, tal como un ratón, hámster o conejo puede inmunizarse con una forma inmunogénica del péptido (por ejemplo, el polipéptido de GPR86 o un fragmento antigénico que puede provocar una respuesta de anticuerpo, o una proteína de fusión tal como se describió anteriormente en el presente documento). Los inmunógenos para obtener anticuerpos se preparan mezclando los polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos recombinantes aislados o péptidos sintéticos) con adyuvantes. Alternativamente, los péptidos o polipéptidos de GPR86 se preparan como proteínas de fusión para proteínas inmunogénicas más grandes. Los polipéptidos también pueden unirse covalentemente a otras proteínas inmunogénicas más grandes, tal como la hemocianina de la lapa californiana. Alternativamente, pueden utilizarse vectores virales o de plásmido que codifican para el polipéptido de GPR86, o un fragmento de estas proteínas, para expresar los polipéptidos y generar una respuesta inmunitaria en un animal, tal como se describe en Costagliola et al., 2000, J. Clin. Invest. 105:803-811, que se incorpora al presente documento como referencia. Con el fin de obtener anticuerpos, los inmunógenos se administran normalmente por vía intradérmica, subcutánea o intramuscular a animales de experimentación tales como conejos, ovejas y ratones. Además de los anticuerpos tratados anteriormente, pueden prepararse derivados de anticuerpos obtenidos por ingeniería genética, tales como anticuerpos de cadena única.
El progreso de la inmunización puede monitorizarse mediante la detección de títulos de anticuerpos en plasma o suero. También puede utilizarse ELISA, citometría de flujo u otros inmunoensayos convencionales con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos. Las preparaciones de anticuerpos pueden ser simplemente suero procedente de un animal inmunizado o, si se desea, pueden aislarse anticuerpos policlonales del suero mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad utilizando el inmunogéno inmovilizado.
Para producir anticuerpos monoclonales, pueden recogerse esplenocitos productores de anticuerpos de un animal inmunizado y fusionarse mediante procedimientos convencionales de fusión celular somática con células de inmortalización, tales como células de mieloma, para dar células de hibridoma. Tales técnicas se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, la técnica del hibridoma (desarrollada originalmente por Kohler y Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), y la técnica del VEB- hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. páginas 77-96). Las células de hibridoma pueden seleccionarse inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos reactivos específicamente con el polipéptido de GPR86, y anticuerpos monoclonales aislados de los medios de un cultivo que comprende tales células de hibridoma.
Kit de selección de alto rendimiento
Un kit de selección de alto rendimiento según la invención comprende todos los medios necesarios y métodos para llevar a cabo la detección de un compuesto modulador incluyendo, por ejemplo, un agonista, antagonista, agonista inverso o inhibidor para el receptor de la invención en presencia de ADP, por ejemplo a una concentración en un intervalo de 1 nM a 10 \muM. El kit comprende las siguientes etapas sucesivas. Las células recombinantes de la invención, que comprenden y expresan la secuencia de nucleótidos que codifica para el receptor GPR86 (P2Y_{13}), se hacen crecer sobre un soporte sólido, tal como una placa de microtítulo, por ejemplo, una placa de microtítulo de 96 pocillos, según métodos bien conocidos por el experto en la técnica, tal como se describe en el documento WO 00/02045 (incorporado específicamente al presente documento como referencia). Los compuestos moduladores según la invención, a concentraciones desde aproximadamente 1 nM hasta 10 \muM o más, se añaden a los medios de cultivo de los pocillos definidos en presencia de una concentración apropiada de ADP (por ejemplo, en el intervalo de 1 nM a 1 \muM).
Los ensayos de mensajero secundario, responsables de los análisis de selección de alto rendimiento, se llevan a cabo incluyendo, pero sin limitarse a, la medición de los niveles intracelulares de AMPc, el inositol fosfato intracelular, las concentraciones de diacilglicerol intracelular, la concentración de ácido araquidónico o la actividad de la MAP cinasa o la tirosina cinasa (tal como se describió anteriormente). Por ejemplo, la actividad de GPR86, medida en un ensayo de AMP cíclico, se cuantifica mediante un radioinmunoensayo, tal como se describió anteriormente (26). Los resultados se comparan con el nivel inicial de la actividad de GPR86 obtenida de las células recombinantes según la invención en presencia de ADP, pero en ausencia del compuesto modulador añadido. Los pocillos que muestran al menos un aumento o una disminución de 2 veces, o 5 veces, o 10 veces o incluso de 100 veces o más en la actividad de GPR86, en comparación con el nivel de actividad en ausencia de modulador, se seleccionan para el análisis adicional.
Otros kits útiles según la invención
La invención proporciona kits útiles para la selección o la detección de moduladores de, incluyendo agentes que modulan, la actividad de GPR86, kits para detectar la unión a GPR86 así como kits útiles para el diagnóstico de enfermedades o trastornos caracterizados por la desregulación de la señalización de GPR86. Los kits útiles según la invención pueden incluir un polipéptido de GPR86 aislado (incluyendo un polipéptido de GPR86 asociado a una célula o membrana, por ejemplo, en membranas aisladas, células que expresan GPR86 o, en un chip SPR). Los kit según la invención pueden comprender un ligando, tal como ADP. Además, un kit puede comprender además el polipéptido G\alpha16. Un kit también puede comprender un anticuerpo específico para GPR86. Alternativamente, o además, un kit puede contener células transformadas para expresar el polipéptido de GPR86. En una realización adicional, un kit según la invención puede contener un polinucleótido que codifica para un polipéptido de GPR86. En una realización todavía adicional, un kit según la invención puede comprender los cebadores específicos útiles para la amplificación de GPR86 tal como se describe más adelante. Posiblemente, los kits de la invención comprenden medios para detectar la señalización de GPR86. La detección de agentes, moduladores, diagnóstico o trastorno puede realizarse con un anticuerpo específico para GPR86 o una sonda de ácido nucleico específica de GPR86. En una realización adicional, los kits según la invención pueden comprender además un patrón de actividad de GPR86, por ejemplo, un patrón medido en una línea celular que expresa GPR86 en presencia de un ligando, tal como ADP. Todos los kit según la invención pueden comprender los artículos establecidos o combinaciones de artículos y materiales de acondicionamiento de los mismos. Los kits también pueden incluir instrucciones para su uso.
Animales transgénicos
Los ratones transgénicos proporcionan una herramienta útil para los estudios de biología genética y del desarrollo y para la determinación de la función de una secuencia novedosa. Según el método de la transgénesis convencional, copias adicionales de genes normales o modificados se inyectan en el pronúcleo masculino del zigoto y llegan a integrarse en el ADN genómico del ratón receptor. El transgén se transmite de una manera mendeliana en cepas transgénicas establecidas. Los constructos útiles para crear animales transgénicos comprenden genes bajo el control de sus promotores normales o de un promotor inducible, genes indicadores bajo el control de promotores que van a analizarse con respecto a sus modelos de regulación y expresión tisular, y constructos que contienen mutaciones dominantes, promotores mutantes y genes de fusión artificiales que van a estudiarse con respecto a su resultado de desarrollo específico. Normalmente, se utilizan fragmentos de ADN del orden de 10 kilobases o menos para construir un animal transgénico (Reeves, 1998, New. Anat., 253:19). Los animales transgénicos pueden crearse con un constructo que comprende un gen candidato que contiene uno o más polimorfismos según la invención. Alternativamente, un animal transgénico que expresa un gen candidato que contiene un único polimorfismo puede cruzarse con un segundo animal transgénico que expresa un gen candidato que contiene un polimorfismo diferente y los efectos combinados de los dos polimorfismos pueden estudiarse en los animales de la progenie.
Otros animales transgénicos
La invención proporciona animales transgénicos que incluyen, pero no se limitan a, ratones, conejos, ratas, cerdos, ovejas, caballos, vacas, cabras, etc., transgénicos. Un protocolo para la producción de un cerdo transgénico puede encontrarse en White y Yannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64^{th} Forum in Immunology, páginas 88-94; patente de los EE.UU. número 5.523.226; patente de los EE.UU. número 5.573.933; solicitud PCT WO93/25071; y solicitud PCT WO95/04744. Un protocolo para la producción de un ratón transgénico puede encontrarse en la patente de los EE.UU. número 5.530.177. Un protocolo para la producción de una rata transgénica puede encontrarse en Bader y Gaten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, citado anteriormente, 3: S81-S87, 1996. Un protocolo para la producción de una vaca transgénica puede encontrarse en Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc. Un protocolo para la producción de un conejo transgénico puede
encontrarse en Hammer et al., Nature 315: 680-683, 1985 y Taylor y Fan, Frontiers in Bioscience 2: d298-308, 1997.
Animales knockout i. Patrón
Los animales knockout se producen mediante el método de crear deleciones de genes con recombinación homóloga. Esta técnica se basa en el desarrollo de células madre embrionarias (ES) que se derivan de embriones, se mantienen en cultivo y tienen capacidad para participar en el desarrollo de cualquier tejido en el ratón cuando se introducen en un blastocisto huésped. Un animal knockout se produce dirigiendo recombinación homóloga hacia un gen diana específico en las células ES, produciendo así un alelo nulo del gen. Pueden analizarse las posibles consecuencias fenotípicas de este alelo nulo (o bien en la progenie heterocigótica o bien en la homocigótica) (Reeves, citado anteriormente).
ii. Deficiencia específica de tejido in vivo en ratones utilizando Cre-lox
El método de la recombinación homóloga dirigida se ha mejorado mediante el desarrollo de un sistema para la recombinación específica de sitio basada en la recombinasa Cre específica de sitio del bacteriófago P1. La ADN recombinasa específica de sitio Cre-loxP del bacteriófago P1 se utiliza en ensayos de ratón transgénico con el fin de crear deficiencias en genes limitadas a tejidos definidos o fases del desarrollo. La deleción genética regionalmente limitada, en oposición a la deficiencia genética global, tiene la ventaja de que puede atribuirse un fenotipo a una célula / tejido particular (Marth, 1996, Clin. Invest. 97: 1999). En el sistema Cre-loxP se obtiene una cepa de ratón transgénico por ingeniería, de modo que los sitios loxP flanquean uno o más exones del gen de interés. Los homocigotos para este denominado "gen floxed" se cruzan con un segundo ratón transgénico que expresa el gen Cre bajo el control de un promotor transcripcional de tipo celular/tisular. La proteína Cre escinde entonces el ADN entre las secuencias de reconocimiento de loxP y elimina eficazmente la función del gen diana (Sauer, 1998, Methods, 14:381). Ahora hay muchos ejemplos in vivo de este método, incluyendo la inactivación inducible de genes específicos de tejido mamario (Wagner et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25: 4323).
iii. Rescate de Bac de fenotipo knockout
Con el fin de verificar que un polimorfismo / mutación genético particular es responsable de la función alterada de la proteína in vivo, puede "rescatarse" la función de la proteína alterada introduciendo una copia de tipo natural del gen en cuestión. Para estos fines puede utilizarse la complementación in vivo con clones de cromosoma artificial bacteriano (BAC) expresados en ratones transgénicos. Este método se ha utilizado para la identificación del gen Clock circadiano de ratón (Antoch et al., 1997, Cell 89: 655).
Materiales
La tripsina procedía de Flow Laboratories (Bioggio, Suiza). Los medios de cultivo, G418, el suero bovino fetal (FBS), las enzimas de restricción, las ADN polimerasas Taq y Platinum Pfx se adquirieron de Life Technologies, Inc. (Merelbeke, Bélgica). El producto radiactivo mio-D-[2-^{3}H]inositol (17,7 Ci/mmol) procedía de Amersham (Ghent, Bélgica). Dowex AG1X8 (forma formato) procedía de Bio-Rad Laboratories (Richmond, Calif.). El ATP, ADP, adenosina, ADP\betaS (adenosina 5'-O-(2-tiodifosfato)), A2P5P (adenosina 2',5'-difosfato), A3P5P (adenosina 3',5'-difosfato), A3P5PS (adenosina 3'-fosfato-5'-fosfosulfato), UTP, UDP, ITP, IDP, UDP-glucosa y 3-isobutil-1-metil-xantina (IBMX) se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). El 2-metiltio-ADP (2MeSADP) y el 2-metiltio-ATP (2MeSATP) procedían de Researh Biochemicals International (Natick, MA). La forskolina se adquirió de Calbiochem. (Bierges, Bélgica). El rolipram fue un obsequio de los Laboratories Jacques Logeais (Trappes, Francia). El anticuerpo monoclonal específico para las formas doblemente fosforiladas de Erk1 y Erk2 (en Thr^{202} y Tyr^{204}) se obtuvo de New England Biolabs (Beverly, MA).
Dosis y modo de administración
A modo de ejemplo, un paciente puede tratarse tal como sigue mediante la administración de un modulador de GPR86 (por ejemplo, un agonista, antagonista o inhibidor de GPR86, de la invención). Un modulador de GPR86 de la invención puede administrarse a un paciente, por ejemplo, en una disolución biológicamente compatible o en un vehículo de administración farmacéuticamente aceptable, mediante ingestión, inyección, inhalación o cualquiera de otros métodos diversos. Las dosis administradas variarán de un paciente a otro; una "dosis terapéuticamente eficaz" puede determinarse, por ejemplo pero sin limitarse a, por el nivel de aumento de la función (por ejemplo, determinado en un ensayo de sendo mensajero descrito en el presente documento). La monitorización de la unión del ADP también permitirá que un experto en la técnica seleccione y ajuste las dosis administradas. La dosis de un modulador de GPR86 de la invención puede repetirse diaria, semanal, mensual, anualmente o como lo considere apropiado el médico que trata.
Composiciones farmacéuticas
La invención proporciona composiciones que comprenden un modulador de GPR86 según la invención, mezclado con un excipiente fisiológicamente compatible. Tal como se usa en el presente documento, "excipiente fisiológicamente compatible" se refiere a un diluyente fisiológicamente aceptable, tal como agua, solución salina tamponada con fosfato, o solución salina, y además puede incluir un adyuvante. Los adyuvantes tales como el adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre, son materiales bien conocidos en la técnica.
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas. Además de los principios activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener preparaciones adecuadas de excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse farmacéuticamente.
Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden formularse utilizando excipientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosis adecuadas para la administración oral. Tales excipientes permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones densas acuosas, suspensiones y similares, para la ingestión por parte del paciente.
Las preparaciones farmacéuticas para el uso oral pueden obtenerse mediante la combinación de los principios activos con un excipiente sólido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante, y tratando la mezcla de gránulos, tras añadir, compuestos auxiliares adecuados, si se desea, para obtener núcleos de grageas o comprimidos. Los excipientes adecuados son cargas de proteínas o hidratos de carbono tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa de sodio; y gomas incluyendo goma arábiga y tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desea pueden añadirse agentes disgregantes o solubilizantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o una sal del mismo, tal como el alginato de sodio.
Los núcleos de grageas están provistos de recubrimientos adecuados, tales como disoluciones concentradas de azúcar, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel Carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse materias colorantes o pigmentos a los recubrimientos de comprimidos o grageas para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad de principio activo, es decir, la dosis.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden utilizarse por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un recubrimiento tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener principios activos mezclados con una carga o aglutinantes tales como lactosa o almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los principios activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes.
Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de principios activos. Para la inyección, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como la solución de Hank, la solución de Ringer, o solución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Adicionalmente, las suspensiones de los disolventes o vehículos activos incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.
Para la administración nasal, se utilizan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera particular que debe permearse. Tales agentes penetrantes se conocen generalmente en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse de una manera conocida en la técnica, por ejemplo, mediante procedimientos convencionales de mezclado, disolución, granulación, preparación de grageas, levitación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
La composición farmacéutica puede proporcionarse como una sal y puede formarse con muchos ácidos incluyendo, pero sin limitarse a, clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protónicos de lo que lo son las formas básicas libres correspondientes. En otros casos, la preparación puede ser un polvo liofilizado en histidina 1 mM - 50 mM, sacarosa al
0,1% - 2%, manitol al 2% - 7% a un intervalo de pH de 4,5 a 5,5 que se combina con tampón antes de su uso.
Una vez que las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la invención formulado en un vehículo aceptable se han preparado, pueden situarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de un estado indicado con información que incluya la cantidad, la frecuencia y el método de administración.
Ejemplos
La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes, en los que se emplean los siguientes materiales y métodos. La totalidad de la descripción de cada una de las referencias bibliográficas citadas a continuación en el presente documento se incorporan al presente documento como referencia.
Ejemplo 1 Clonación y secuenciación
Se identificó una secuencia codificante sin intrones que codifica para un receptor novedoso fuertemente relacionado con el receptor P2Y_{12} humano en el clon genómico RP11-25K24 (número de registro de GenBank AC024886) situado en la región 3q24 en la patente siguiente: WO 00/31258; ARENA; número de secuencia 18.
Los cebadores de oligonucleótidos específicos se sintetizaron partiendo de la base de la secuencia del receptor GPR86 humano: un cebador sentido 5'-CCGGAATTCACCATGAACACCACAGTGATGC-3' y un cebador antisentido 5'-CTTGTCTAGATCAGCCTAAGGTTATGTTGTC-3'. Se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tres ADNc de bazo diferentes utilizando la ADN polimerasa Platinum Pfx. Las condiciones de la amplificación fueron las siguientes: 94ºC, 15 s; 50ºC, 30 s; 68ºC, 2 min durante 35 ciclos. Las amplificaciones dieron como resultado un fragmento de 1 kilobase que contenía la secuencia codificante completa del gen de GPR86. Entonces se subclonó la secuencia codificante y se secuenció en ambas hebras para cada uno de los tres ADNc utilizando el kit de secuenciación BigDye Terminator Cycle (Applied Biosystems, Warrington, Gran Bretaña).
También se identificó recientemente este marco de lectura abierto de 1002 pares de bases (pb) por Wittenberger et al. (número de registro de GenBank AF295368) y se notificó que codificaba para un receptor acoplado a proteínas G huérfano que denominaron GPR86 (24). El codón de iniciación está precedido por un codón de terminación a 18 pb en el sentido de 5'. Se sintetizaron cebadores de oligonucleótidos partiendo de la base de esta secuencia codificante. Se utilizaron en PCR partiendo del ADNc de bazo. Se insertó un producto de la PCR con un tamaño compatible con la secuencia codificante de GPR86 en un vector de expresión y se secuenció en ambas hebras (figura 1). Los supuestos dominios de membrana están subrayados y numerados de I al VII. Los supuestos sitios de fosforilación por la proteína cinasa A o por la proteína cinasa C se indican respectivamente mediante un círculo negro (\bullet) o un triángulo negro (\blacktriangle). Los posibles sitios de N-glucosilación están indicados mediante un cuadrado negro (\blacksquare).
La secuencia obtenida corresponde perfectamente a la secuencia de Wittenberger et al. amplificada a partir de bibliotecas de ADNc humano procedentes de placenta y cerebro fetal. El marco de lectura abierto de 1002 pb comienza con un codón ATG en un consenso de Kozak y codifica para una proteína de 333 aminoácidos. La secuencia peptídica contiene tres posibles sitios para glucosilación unida a N (dos en la parte N-terminal extracelular (N^{2} y N^{10})
y uno en el tercer bucle extracelular (N^{264}), dos posibles sitios para la fosforilación por la proteína cinasa C (uno en el tercer bucle intracelular (S^{217}) y uno en la parte carboxilo terminal (T^{304})) y uno por la proteína cinasa A (en la parte carboxilo terminal (T^{316})) (figura 1). El receptor novedoso muestra una homología significativa con los receptores P2Y_{12} y de la UDP-glucosa humanos (figura 2), con un 48% y un 45% de identidad de aminoácidos, respectivamente. La similitud con los otros receptores P2Y es mucho menor (figura 2), por ejemplo, un 25% y un 26% de identidad de aminoácidos con los receptores P2Y_{1} y P2Y_{2} humanos, respectivamente. Se llevó a cabo la alineación de la secuencia de aminoácidos de GPR86 (P2Y_{13}) con los receptores purinérgicos (P2Y1, -2, -4, -6, -11, -12), el receptor de la UDP-glucosa y otras secuencias purinérgicas relacionadas (GPR17, GPR87, H963) utilizando el algoritmo ClustalX. A continuación se construyó un dendrograma utilizando el algoritmo TreeView (figura 2).
Ejemplo 2 Distribución tisular del receptor GPR86 humano
Se amplificó el ARNm de GPR86 mediante RT-PCR en varios tejidos humanos (figura 3A).
Se llevaron a cabo los experimentos de transcripción inversa - reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) utilizando un panel de ARN poli A+ (Clontech). Los cebadores de GPR86 fueron los siguientes: cebador sentido de GPR86 (5'-TGTGTCGTTTTTCTTCGGTG-3') y cebador antisentido de GPR86 (5'-CTGCCAAAAAGAGAGTTG-3'). El tamaño esperado de la banda de ADN amplificada fue de 575 pb. Se utilizaron dos cebadores sintetizados partiendo de la base de la secuencia codificante de la aldolasa como controles para producir un producto con un tamaño esperado de 443 pb: cebador sentido de la aldolasa 5'-GGCAAGGGCATCCTGGCTGC-3' y cebador inverso antisentido de la aldolasa 5'-TAACGGGCCAGAACATTGGCATT-3'. Se sometieron aproximadamente 75 ng de ARN poli A+ a transcripción inversa con Superscript II (Life Technologies, Inc., Merelbeke, Bélgica) y se utilizaron para la PCR. Se llevó a cabo la PCR utilizando la Taq polimerasa en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94ºC durante 3 min, 38 ciclos a 94ºC durante 1 min, 58ºC durante 2 min y 72ºC durante 2 min. Se analizaron alícuotas
(10 \mul) de la reacción de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Se llevaron a cabo experimentos de RT-PCR utilizando un panel de ARN poli A+ (Clontech) y cebadores específicos de la secuencia de GPR86. El tamaño esperado de las bandas de la aldolasa y el GPR86 amplificadas fue, respectivamente, de 575 y 443 pb. El ADNc (-) indica el control negativo de la reacción de PCR sin molde de ADNc. Se analizaron alícuotas (10 \mul) de la reacción de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se detectó una fuerte banda del tamaño esperado (575 pb) en el bazo y el cerebro (adulto), y a una intensidad menor en placenta, pulmón, hígado, médula espinal, timo, intestino delgado, útero, estómago, testículos, cerebro fetal y glándula suprarrenal, pero no en páncreas, corazón, riñón, músculo esquelético, ovario, aorta fetal ni el control negativo sin ADNc (figura 3A). También se detectó claramente una banda de 575 pb en el ganglio linfático y en la médula ósea, y se detectó débilmente en las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) (figura 3A). No se detectó señal en los linfocitos de sangre periférica (LSP) ni en las células polimorfonucleares (PMN) (figura 3A). Se detectaron mensajeros de GPR86 en diferentes regiones del cerebro (tálamo, núcleo caudado, sustancia negra, hipocampo, cerebelo, cuerpo calloso y núcleo amigdalino) (figura 3B). La amplificación de un fragmento de la secuencia codificante de la aldolasa se utilizó como control.
El análisis de Northern blot con hGPR86 reveló un fuerte transcrito de 2,9 kb en el bazo y uno más débil en hígado, placenta, leucocitos y cerebro. La evaluación de la expresión de hGPR86 en diferentes regiones del cerebro reveló que el transcrito de 2,9 kb daba una fuerte señal en la sustancia negra, tálamo y médula, menos fuerte en el lóbulo frontal y temporal, putamen, núcleo amigdalino, núcleo caudado, hipocampo, médula espinal, cuerpo calloso, y débil en cerebelo y lóbulo occipital. El transcrito no era detectable en la corteza cerebral. La expresión ampliamente extendida del hGPR86 mostrada en el análisis de Northern blot se refleja por el origen de 16 secuencias EST encontradas para este GPCR en la base de datos pública, derivada de diversos tejidos como tumores de células germinales, hígado fetal, bazo fetal, colon, útero con embarazo y lesiones por esclerosis múltiple. La amplificación por PCR de hGPR86 procedente de los ADNc del cerebro y la placenta también está de acuerdo con estos resultados (24).
Ejemplo 3 Expresión estable del receptor novedoso en células de astrocitoma 1321N1
Se introdujo la secuencia completa del receptor novedoso en un vector de expresión con el fin de transfectar la línea celular de astrocitoma 1321N1, utilizada anteriormente para caracterizar varios subtipos de P2Y (5, 13, 14). Se transfectaron las células de astrocitoma 1321N1 que expresan la proteína G\alpha_{16} con GPR86 recombinante - plásmido o con el plásmido solo.
Se transfectaron células CHO-K1 y 132IN1 con GPR86 recombinante - plásmido o con el plásmido solo utilizando el reactivo de transfección FuGENE™6 (Roche Molecular Biochemicals). Se transfectó un clon denominado AG32 correspondiente a las células 1321N1 previamente transfectadas con el plásmido pERAEQ2 que codifica para G\alpha_{16} (facilitado por Euroscreen). Se seleccionaron las células transfectadas CHO-K1 y 1321N1 con 400 \mug/ml de G418 en medio completo (10% de FBS, 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 2,5 \mug/ml de anfotericina B en, respectivamente medio F12 de Ham o DMEM (Medio Eagle modificado por Dulbecco) dos días después de la transfección y se mantuvieron en el mismo medio. Se mantuvieron las células AG32 en el mismo medio completo DMEM complementado con 500 \mug/ml de zeocina.
Se probó el conjunto de clones resistentes a G418 para determinar su respuesta funcional de IP_{3} a varios nucleótidos, según el método descrito anteriormente. Se expusieron las células a varios nucleótidos a una concentración de 100 \muM durante 30 s: ATP, ADP, UTP, UDP, ITP, IDP, TDP. No se obtuvo respuesta en las células 1321N1 que expresaban el receptor GPR86 solo, mientras que se observó una fuerte respuesta de IP_{3} a la histamina en estas células, pero ADP, UDP e IDP indujeron una respuesta de IP_{3} en las células 1321N1 que expresaban tanto el receptor GPR86 como la proteína G\alpha_{16}. No se observó respuesta de IP_{3} para los otros nucleótidos, excepto para ATP y 2MeSATP, pero estas respuestas se perdieron tras la purificación con HPLC en este caso (datos no mostrados; sin embargo, véase el ejemplo 7). No se observó respuesta de IP_{3} en respuesta a ningún nucleótido en las células 1321N1 ni en las 1321N1-G\alpha_{16} transfectadas con el vector de expresión de tipo natural y se utilizaron como control negativo.
En las células 1321N1 que expresaban tanto el receptor GPR86 como G\alpha_{16}, se establecieron curvas de concentración - acción para ADP, IDP y UDP y revelaron la fuerte afinidad de GPR86 por ADP. Se obtuvo el siguiente intervalo de potencia: ADP \may{3} IDP > UDP. La afinidad de GPR86 por el ADP fue aproximadamente mil veces mayor que la de IDP y UDP. Curvas de concentración - acción para ADP, 2MeSADP y ADP\betaS. Se obtuvieron los siguientes valores de CE_{50} para ADP, 2MeSADP y ADP\betaS, respectivamente: 11,4 \pm 2,2 nM, 14,2 \pm 3,0 nM y 48,4 \pm 0,4 nM (media \pm D.E. de tres experimentos independientes) (figura 4A). Se incubaron células transfectadas 1321N1 en presencia de varias concentraciones de ADP, 2MeSADP y ADP\betaS durante 30 s. Los datos representan la media \pm D.E. de los puntos experimentales por triplicado obtenidos en un experimento representativo de tres. No se obtuvo respuesta de IP_{3} para A2P5P (ADP 2',5'-difosfato), A3P5P (adenosina 3',5'-difosfato) y A3P5PS (adenosina 3'-fosfato-5'-fosfosulfato).
Se obtuvieron los efectos de 2MeSATP y ATP en concentraciones superiores que para los respectivos nucleótidos difosfato (figura 4B). Se preincubaron células transfectadas 1321N1 con o sin toxina pertussis 100 ng/ml durante 18 h y después se incubaron en presencia de ADP (300 nM) o agua (CONT) durante 30 s. Los datos representan la
media \pm D.E. de los puntos experimentales por triplicado obtenidos en un experimento representativo de dos.
Tal como se trató anteriormente, los polvos de nucleótidos comerciales a menudo se contaminan con productos de degradación (4, 13, 28). La contaminación normalmente supone un 1% para el ATP y aproximadamente un 10% para 2MeSATP (28). Se trataron disoluciones de 2MeSATP y ATP (1 mM) a temperatura ambiente con 20 unidades/ml de CPK y CP 10 mM durante 90 min. Este sistema de regeneración de ATP salva los problemas que surgen de la contaminación y la degradación de las disoluciones de nucleótido trifosfato (28). En estas condiciones, se suprimieron las respuestas a ATP y 2MeSATP (figura 4B).
Se observó inhibición del 86 \pm 8% (media \pm intervalo de dos experimentos independientes) de la respuesta del ADP (300 nM) tras un pretratamiento de 18 horas de las células transfectadas con toxina pertussis (PTx) 100 ng/ml (figura 4C). Se preincubaron células transfectadas 1321N1 con o sin toxina pertussis (PTx) 100 ng/ml durante 18 h y después se incubaron en presencia de ADP (300 nM) o medio control (CONT) durante 30 s. Los datos representan la media \pm D.E. de puntos experimentales por triplicado obtenidos en un experimento representativo de dos.
Ejemplo 4 Expresión estable del receptor novedoso en células CHO-K1
Se probó el posible efecto de los nucleótidos sobre la ruta del AMPc en células CHO-K1 que expresan el receptor GPR86 humano. Se observaron inhibiciones significativas del nivel de AMPc a bajas concentraciones de ADP (figura 5A) y 2MeSADP en presencia de forskolina (4 \muM). Se incubaron células transfectadas CHO-K1 en presencia de varias concentraciones de ADP y forskolina 4 \muM durante 10 min. Los datos representan la media \pm D.E. de puntos experimentales por triplicado obtenidos en un experimento representativo de tres y 2MeSADP en presencia de forskolina 4 \muM. La CI_{50} del ADP fue de 1,5 \pm 0,6 nM (media \pm D.E. de tres experimentos independientes) con un porcentaje de inhibición máxima del 52 \pm 7% a 30 nM (media \pm D.E. de tres experimentos independientes). Se observó una segunda fase a concentraciones superiores a 30 nM: la inhibición de la adenilil ciclasa disminuyó y se observó un pequeño aumento a 10 \muM (figura 5A). Tras un pretratamiento de 18 h de las células CHO-K1 transfectadas con toxina pertussis 100 ng/ml, el ADP (100 nM y 100 \muM) indujo aumentos significativos en el nivel de AMPc (figura 5B). Se incubaron células transfectadas CHO-K1 en presencia de varias concentraciones de ADP y forskolina 4 \muM durante 10 minutos. Los datos representan la media \pm D.E. de puntos experimentales por triplicado obtenidos en un experimento representativo de tres. Se preincubaron células transfectadas CHO-K1 con o sin toxina pertussis 100 ng/ml durante 18 h y después se incubaron en presencia de ADP (100 nM y 100 \muM) o agua (CONT) y forskilona 4 \muM durante 10 min. Los datos representan la media \pm D.E. de puntos experimentales por triplicado obtenidos en un experimento representativo de dos. Se ha reproducido el efecto bifásico del ADP sobre la adenilil ciclasa en células 1321N1 transfectadas con el receptor GPR86 humano.
Para investigar los cambios en el estado de activación de las MAP cinasas Erk1 y Erk2 con la estimulación del receptor GPR86 humano, se analizaron extractos de células transfectadas CHO-K1 completas mediante Western blot utilizando un anticuerpo específico para las cinasas doblemente fosforiladas (en Thr^{202} y Tyr^{204}), que son las formas activas de Erk. Análisis por Western Blot de las proteínas Erk1 y Erk2 fosforiladas.
Se sembraron células CHO-K1 transfectadas con GPR86 a 1,5 x 10^{6} células/placa. Tras 24 h, se privó a las células de suero durante 2 h en tampón KRH. Tras la estimulación con el agonista, se rascaron las células en 1 ml de PBS pH 7,3 (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4}.7H_{2}O 4,3 mM y KH_{2}PO_{4} 1,4 mM). Se recuperaron las células mediante centrifugación y se lisaron en 150 \mul de tampón Laemmli (glicerol al 10% (p/v), \beta-mercaptoetanol al 5% (v/v), SDS al 2,3% (p/v), Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8). Se determinó la concentración de proteínas utilizando el método de Minamide y Bamburg (27). Se sometió a electroforesis la misma cantidad de proteína para cada estado en un gel de SDS-poliacrilamida al 12%. Entonces se transfirieron las proteínas durante la noche a 60 V y 4ºC sobre una membrana de nitrocelulosa utilizando Tris 20 mM, glicina 154 mM, metanol al 20% (v/v) como tampón de transferencia. Se logró la inmunodetección utilizando el sistema de detección de Western blot por quimiolumiscencia mejorado (ECL, Amersham Pharmacia Biotech) utilizando un anticuerpo de ratón secundario biotinilado (1/25.000). Se utilizó el anticuerpo monoclonal específico para las formas doblemente fosforiladas de Erk1 y Erk2 (en Thr^{202} y Tyr^{204}) a una dilución 1/1000.
En las células CHO-K1, Erk1 y Erk2 fosforiladas tenían la masa molecular prevista de 44 y 42 kDa, respectivamente. La estimulación del receptor GPR86 humano expresado de manera estable en las células CHO-K1 con ADP o 2-MeSADP 1 \muM condujo a una fuerte fosforilación de Erk2 (figura 6A). Se estimularon células CHO-K1 transfectadas con GPR86 durante diferentes tiempos o con diversas concentraciones de ADP y 2MeSADP o agua (CONT). Se ha probado el efecto de la toxina pertussis (PTx) 100 ng/ml a 5 y 30 min en presencia de ADP o 2MeSADP 1 \muM. Se lograron la inmunotransferencia y la inmunodetección tal como se describe utilizando el sistema de detección de Western blot por quimioluminiscencia mejorado (ECL, Amersham Pharmacia Biotech).
Erk1 también estaba débilmente fosforilada. Se detectó la fosforilación de Erk tras 1 min de estimulación y aumentó con el tiempo (figura 6A). La respuesta máxima se obtuvo tras 5 min de estimulación con ADP o con 2-MeSADP, tras lo cual, la activación de Erk disminuyó lentamente hasta el nivel basal tras 1 h. Para determinar si los receptores endógenos pueden ser responsables de la activación de Erk dependiente de ADP o 2-MeSADP en las células CHO-K1, se probaron estos nucleótidos sobre células transfectadas con el vector vacío: no se observó la fosforilación de Erk1 o Erk2 cuando se incubaron las células control CHO-K1 5 min, 20 min o 1 h con 2-MeSADP o ADP 1 \muM. Se determinó la dependencia de la concentración de la fosforilación de Erk inducida por ADP en el pico de la respuesta transitoria (5 min). La estimulación del receptor GPR86 humano con ADP o 2MeSADP (de 1 nM a 10 \muM) condujo a una fosforilación dependiente de la concentración de Erk1 y Erk2 (figura 6B). Se obtuvo un efecto máximo a 1 \muM, pero ya se observó un efecto significativo a 10 nM para ambos agonistas. Con el fin de evaluar la implicación de la proteína G_{i} en estos efectos, se preincubaron células CHO-K1 transfectadas con GPR86 con toxina pertussis (100 ng/ml durante 18 h) antes de la estimulación con ADP (1 \muM) o 2-MeSADP (1 \muM). Se inhibió fuertemente la fosforilación de Erk inducida normalmente por 5 ó 30 minutos de tratamiento con ADP o 2-MeSADP
(figura 6B).
La clonación y la caracterización farmacológica de un receptor humano novedoso acoplado a proteínas G de la familia P2Y, provisionalmente denominado P2Y_{13}, corresponde al receptor huérfano GPR86 descrito anteriormente (24). Con respecto a su secuencia, la homología con los subtipos P2Y_{1} a P2Y_{11} se limita a aproximadamente el 25%. Por el contrario, el receptor GPR86 (P2Y_{13}) muestra una homología significativa con los receptores humanos P2Y_{12} y de la UDP-glucosa. El receptor acoplado a proteínas G más próximo es el receptor P2Y_{12} humano (48% de identidad de aminoácidos) que también es un receptor que responde a ADP. Los experimentos de mutagénesis con el receptor P2Y_{2} han identificado tres aminoácidos cargados positivamente en los dominios transmembrana sexto y séptimo (His^{262}, Arg^{265} y Arg^{292}), que desempeñan un papel crucial en la unión de nucleótidos (presumiblemente mediante la neutralización de la carga negativa de los grupos fosfato) (28). Los dos primeros residuos están conservados en el receptor GPR86 (P2Y_{13}) respectivamente en las posiciones 251 y 254. Estos dos residuos también están conservados en los receptores P2Y_{12} y de la UDP-glucosa. El residuo de Arg^{292} del receptor P2Y_{2} está sustituido por un residuo de glutamato cargado negativamente en los receptores P2Y_{12}, GPR86 (P2Y_{13}) y de la UDP-glucosa y podría tener una gran importancia para la farmacología del receptor.
Por tanto, los receptores P2Y_{12} y GPR86 (P2Y_{13}) forman un subgrupo de receptores P2Y, estructuralmente diferentes de otros receptores P2Y y que comparten una alta afinidad por su ligando, el ADP. El valor de CE_{50} del ADP para el receptor GPR86 (P2Y_{13}) es de 20 a 1000 veces inferior que el de los ligandos respectivos de otros receptores P2Y en líneas celulares transfectadas comparables. Desde un punto de vista farmacológico, las afinidades relativas del ADP y el 2MeSADP permiten discriminar entre los subtipos P2Y_{12} y GPR86 (P2Y_{13}). Se observaron afinidades similares para el receptor GPR86 (P2Y_{13}), mientras que 2MeSADP muestra una potencia de 10 a 100 veces mayor que ADP para el receptor P2Y_{12}, dependiendo del sistema de expresión (21, 22).
La presencia de la proteína G\alpha_{16} fue necesaria para acoplar el receptor GPR86 (P2Y_{13}) a la fosfolipasa C en las células 1321N1. El fuerte efecto inhibidor de la toxina pertussis sobre la acumulación de IP_{3} inducida por ADP en las células transfectadas 1321N1-G\alpha_{16} sugiere una sinergia entre las proteínas G\alpha_{16} y G_{i}. Se ha descrito anteriormente un fenómeno de este tipo en las células HEL, en las que la movilización de Ca^{2+} por agonistas de P2Y_{2} se inhibe completamente por G\alpha_{16} antisentido y parcialmente por la toxina pertussis (29).
La inhibición de la adenilil ciclasa y la estimulación de las MAP cinasas (ERK-1 y 2) son mecanismos de transducción asociados con el receptor GPR86 (P2Y_{13}) y que implican a ambas proteínas G_{i}. El efecto bifásico de ADP sobre la adenilil ciclasa recuerda al que se ha observado para otros receptores como el receptor \alpha2 adrenérgico (30, 31). A bajas concentraciones de agonista, hubo una inhibición de la adenilil ciclasa, mientras que se observó un incremento a concentraciones superiores, lo que sugiere el acoplamiento simultáneo de dos proteínas G con efectos opuestos. Este acoplamiento simultáneo podría ser un artefacto de sobreexpresión.
Con respecto a la distribución tisular del receptor GPR86 (P2Y_{13}) humano, se ha obtenido una buena correlación entre los datos actuales de RT-PCR y los datos de Northern blot obtenidos por Wittenberger et al. (24). El receptor GPR86 (P2Y_{13}) humano se expresa especialmente en el bazo y el cerebro humanos, en los que muestra una gran expresión en diferentes regiones del cerebro. El receptor P2Y_{12} también se detecta en el cerebro humano y presenta un patrón de expresión glial. Se ha descrito la inhibición de la formación de AMPc por el ADP en las células de glioma C6 de rata (32) y en las células endoteliales capilares del cerebro de rata (33). En ambos modelos, 2MeSADP fue mucho más potente que ADP y 2MeSATP tuvo una potencia similar a la de 2MeSADP: estas características sugieren la participación de P2Y_{12} en lugar de los receptores GPR86 (P2Y_{13}). La expresión del receptor GPR86 (P2Y_{13}) en el bazo, ganglios linfáticos y médula ósea sugiere que podría desempeñar un papel en la hematopoyesis y el sistema inmunitario.
Ejemplo 5 Producción de un animal transgénico
En el presente documento se describen métodos para generar animales transgénicos no humanos. Pueden introducirse constructos de ADN en la línea germinal de un mamífero para obtener un mamífero transgénico. Por ejemplo, pueden incorporarse una o varias copias del constructo en el genoma de un embrión de mamífero mediante técnicas transgénicas convencionales.
En una realización ejemplo, se produce un animal transgénico no humano mediante la introducción de un transgén en la línea germinal del animal no humano. Pueden introducirse transgenes en células diana embrionarias en varios estadios de desarrollo. Se utilizan diferentes métodos dependiendo del estadio de desarrollo de la célula diana embrionaria. La(s) línea(s) específica(s) de cualquier animal utilizado debe(n) seleccionarse, si es posible, según su buena salud general, buenos rendimientos embrionarios, buena visibilidad pronuclear en el embrión y buena capacidad reproductora.
Se lleva a cabo la introducción del transgén de proteína del receptor P2Y_{13} en el embrión mediante cualquiera de una variedad de medios conocidos en la técnica, tales como microinyección, electroporación o lipofección. Por ejemplo, se introduce un transgén de proteína del receptor P2Y_{13} en un mamífero mediante la microinyección del constructo en los pronúcleos del(de los) óvulo(s) de mamífero fertilizado(s) para producir una o más copias del constructo que va a conservarse en las células del(de los) animal(s) en desarrollo. Tras la introducción del constructo de transgén en el óvulo fertilizado, se incuba el óvulo in vitro durante diversas cantidades de tiempo, o se reimplanta en el huésped sustituto, o ambos. Un método común es incubar los embriones in vitro durante aproximadamente 1- 7 días, dependiendo de la especie, y luego reimplantarlos en el huésped sustituto.
Se somete a prueba la progenie de los embriones manipulados trangénicamente para determinar la presencia del constructo mediante el análisis por Southern blot de un segmento de tejido. Un embrión que tiene una o más copias del constructo clonado exógeno integradas de manera estable en el genoma se utiliza para establecer una línea de mamífero transgénico permanente que lleva el constructo introducido transgénicamente.
Se someten a ensayo las crías de los mamíferos modificados trangénicamente tras el nacimiento para determinar la incorporación del constructo en el genoma de la progenie. Esto se realiza mediante la hibridación de una sonda correspondiente a la secuencia de ADN que codifica para la proteína de fusión o un segmento de la misma en el material cromosómico de la progenie. Se hace crecer hasta la madurez aquella progenie de mamífero que se encuentre que contiene al menos una copia del constructo en su genoma. Se reproducen los mamíferos transgénicos para producir otra progenie transgénica.
Se someten a prueba las hembras transgénicas para determinar la expresión de proteínas utilizando una técnica de ensayo conocida en la técnica, por ejemplo, un Western blot o un ensayo enzimático.
Ejemplo 6 Actividad de GPR86
Puede detectarse o medirse la actividad de GPR 86 tal como sigue: se siembran células de mamífero recombinantes, por ejemplo células de astrocitoma 1321N1 o CHO-K1, transfectadas de manera estable con un vector de expresión adecuado de GPR86 (P2Y_{13}), en placas de cultivo tisular, tal como se describe en los ejemplos 3 y 4. A la densidad celular apropiada, normalmente entre el 50 - 75% de confluencia, se sustituyen los medios de cultivo con una disolución tampón KRH (Krebs-Ringer Hepes: NaCl 124 mM, KCl 5 mM, MgSO_{4} 1,25 mM, CaCl_{2} 1,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1,25 mM, Hepes 25 mM pH: 7,4 y glucosa 8 mM) que contiene el ligando ADP (por ejemplo, en el intervalo de 1 nM a 1 \muM) y se incuban las células durante 30 s adicionales a 37ºC grados. Tras esta incubación, se lavan las células y se lisan. Se determina la actividad de GPR86 en este extracto celular en ausencia o presencia de ligando mediante la detección de la actividad asociada de los segundos mensajeros posteriores, tales como AMPc, fosforilación por
ERK / MAP cinasa e IP_{3}, tal como se describe en los ejemplos 3 y 4. La actividad de GPR86 se define como un aumento de dos veces o más en la fosforilación por ERK o una disminución de dos veces o más en los niveles de AMPc en ausencia frente a presencia de ADP. La actividad también se define por un cambio de dos veces o más en los niveles de segundo mensajero en presencia frente a ausencia de una concentración óptima del ligando ADP.
Ejemplo 7 Efecto agonista parcial de ATP y 2MeSATP
La presente invención se refiere, en parte, a la activación de GPR86 por ADP, o una molécula análoga o equivalente, tal como 2MeSADP, ADP\betaS, o cualquiera de los análogos de ADP enseñados en la patente de los EE.UU. número 5.700.786. En consecuencia, se probaron dos análogos del ADP, el ATP y el 2MeSATP, en células AG32 transfectadas con el receptor P2Y_{13} humano, tal como se describió anteriormente. Las células AG32 son células 1321N1 transfectadas con la proteína G\alpha16.
Se sembraron células AG32 (2 x 10^{5} células por placa) en placas Petri de 35 mm (diámetro) y se marcaron durante 24 h con [^{3}H]-mioinositol 5 \muCi/ml en medio DMEM libre de inositol que contenía un 5% de suero de ternera fetal, antibióticos, anfotericina, piruvato de sodio y 400 \mug/ml de G418. Se incubaron las células durante 2 h en tapón Krebs-Ringer Hepes (KRH) (NaCl 124 mM, KCl 5 mM, MgSO_{4} 1,25 mM, CaCl_{2} 1,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1,25 mM, Hepes 25 mM (pH 7,4) y D-glucosa 8 mM). Se incubaron entonces las células en presencia de ADP, ATP o 2MeSATP durante 30 s. Se detuvo la incubación mediante la adición de 1 ml de una disolución de ácido perclórico al 3% helada. Antes de la estimulación, se incubó ATP y 2MeSATP (disoluciones 1 mM) durante 90 min a temperatura ambiente con 20 unidades/ml de creatina fosfocinasa (CPK) y creatina fosfato 10 mM (CP). Se detuvo la reacción mediante la adición de yodoacetamida 10 mM.
Tras el tratamiento con creatina fosfato y creatina fosfocinasa, el ATP y el 2MeSATP revelaron ser agonistas parciales del receptor P2Y_{13} humano. La figura 8 muestra la curva de concentración - respuesta de la activación de GPR86 estimulada por los análogos del ADP, ATP y 2MeSATP. Los datos se muestran como la concentración del agonista representada frente a los recuentos de [^{3}H]IP_{3} por minuto. La actividad del receptor GPR86 estimulada por ATP y 2MeSATP con una CE_{50} de 4,2 \pm 0,8 \muM y 1,5 \pm 0,2 \muM, respectivamente. Los datos representan la media \pm la desviación estándar de puntos experimentales por triplicado obtenidos en un experimento representativo de tres.
Ejemplo 8 Actividad de los diadenosina polifosfatos
Se probaron los análogos de ADP, Ap3A, Ap4A, Ap5A y Ap6A en células AG32 transfectadas con el receptor P2Y13 humano, tal como se describió anteriormente.
Se sembraron células AG32 (2 x 10^{5} células por placa) en placas Petri de 35 mm (diámetro) y se marcaron durante 24 h con [^{3}H]-mioinositol 5 \muCi/ml en medio DMEM libre de inositol que contiene el 5% de suero de ternera fetal, antibióticos, anfotericina, piruvato de sodio y 400 \mug/ml de G418. Se incubaron las células durante 2 h en tampón Krebs-Ringer Hepes (KRH) (NaCl 124 mM, KCl 5 mM, MgSO_{4} 1,25 mM, CaCl_{2} 1,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1,25 mM, Hepes 25 mM (pH 7,4) y D-glucosa 8 mM). Entonces se incubaron las células en presencia de dos concentraciones diferentes (100 nM y 10 \muM) de ADP o ApnA (n = 3-6) durante 30 s, respectivamente. Se detuvo la incubación mediante la adición de 1 ml de una disolución de ácido perclórico al 3% helada.
Tras 30 s de incubación, el efecto de Ap3A sobre la acumulación de IP_{3} fue casi igual al del ADP (figura 9) medido mediante la producción de [^{3}H]IP_{3}. Por el contrario, Ap_{4}A, Ap_{5}A y Ap_{6}A fueron inactivos. Los datos representan la media \pm la desviación estándar de puntos experimentales por triplicado obtenidos en un experimento representativo de tres.
Ejemplo 9 Actividad de poli[A]
Se probaron poli[A] y poli[A].[G] en células AG32 transfectadas con el receptor P2Y_{13} humano, tal como se describió anteriormente. Los presentes inventores consideraron que estos compuestos podían utilizarse en el tratamiento de vacunación de células dendríticas como dianas del receptor P2Y13 humano.
Se sembraron células AG32 (2 x 10^{5} células por placa) en placas Petri de 35 mm (diámetro) y se marcaron durante 24 h con [^{3}H]-mioinositol 5 \muCi/ml en medio DMEM libre de inositol que contiene el 5% de suero de ternera fetal, antibióticos, anfotericina, piruvato de sodio, y 400 \mug/ml de G418. Se incubaron las células durante 2 h en tampón Krebs-Ringer Hepes (KRH) (NaCl 124 mM, KCl 5 mM, MgSO_{4} 1,25 mM, CaCl_{2} 1,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1,25 mM, Hepes 25 mM (pH 7,4) y D-glucosa 8 mM). Entonces se incubaron las células en presencia de ADP (como indicador de la estimulación óptima), poli[A] o poli[A].[G], respectivamente, durante 30 s. Se detuvo la incubación mediante la adición de 1 ml de una disolución de ácido perclórico al 3% helada. Para fines de comparación, antes de incubar las células, se incubó poli[A] y poli[A].[G] (disoluciones 1 mM) durante 90 min a temperatura ambiente con 20 unidades/ml de creatina fosfocinasa (CPK) y creatina fosfato (CP) 10 mM, tras lo que se detuvo la reacción mediante la adición de yodoacetamida 10 mM. La figura 10 muestra la curva de concentración - respuesta para la activación del GPR86 humano con poli[A] y poli[A].[G].
Tras el tratamiento con creatina fosfato y creatina fosfocinasa, el poli[A] todavía podía activar al GPR86, si bien es cierto que con una CE_{50} inferior (205 \pm 60 \muM). Sin embargo, poli[A].[G] ya no era activo sobre el GPR86 humano (datos mostrados en la figura 10). La concentración de poli[A] y poli[A].[G] se expresaron en equivalentes de AMP. Los datos representan la media \pm la desviación estándar de puntos experimentales por triplicado obtenidos en un experimento representativo de tres.
Ejemplo 10 Actividad antagonista del reactivo Azul 2, suramina, PPADS y MRS-2179
Se probaron los agonistas en células AG32 transfectadas con GPR86 humano. Se sembraron las células AG32 (2 x 10^{5} células por placa) en placas Petri de 35 mm (diámetro) y se marcaron durante 24 h con [^{3}H]-mioinositol 5 \muCi/ml en medio DMEM libre de inositol que contiene el 5% de suero de ternera fetal, antibióticos, anfotericina, piruvato de sodio y 400 \mug/ml de G418. Se incubaron las células durante 2 h en tampón Krebs-Ringer Hepes (KRH) (NaCl 124 mM, KCl 5 mM, MgSO_{4} 1,25 mM, CaCl_{2} 1,45 mM, KH_{2}PO_{4} 1,25 mM, Hepes 25 mM (pH 7,4) y D-glucosa 8 mM). Antes de la estimulación, se preincubaron las células durante 10 min en presencia de reactivo Azul 2 (RB-2), suramina, PPADS o MRS-2179. Entonces se incubaron las células en presencia de ADP 100 nM durante 30 s. Se detuvo la incubación mediante la adición de 1 ml de una disolución de ácido perclórico al 3% helada. La figura 11 muestra la curva de concentración - respuesta para la activación de GPR86 mediante ADP en presencia de los compuestos antagonistas. Los datos representan la media \pm D.E. de puntos experimentales por triplicado obtenidos en un experimento representativo de tres.
La siguiente tabla contiene las CI_{50} para los compuestos respectivos.
Potencias de los antagonistas en las células P2Y13-AG32 humanas
El valor representa las medias \pm D.E. de tres experimentos independientes.
Antagonista CI_{50}
Reactivo Azul 2 1,9 \pm 0,1 \muM
Suramina 2,3 \pm 0,4 \muM
PPADS 11,7 \pm 0,9 \muM
MRS-2179 > 100 \muM 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 11 Selección de moduladores de la actividad de GPR86
Pueden identificarse moduladores candidatos de GPR86 tal como sigue: el ensayo descrito en el ejemplo 6 proporciona una premisa para seleccionar diferentes compuestos candidatos para "modular" la actividad de GPR86. Según esta perspectiva, se co-incuban células transfectadas de manera estable con GPR86 con una concentración apropiada del ligando ADP (por ejemplo, en el intervalo de desde 1 nM hasta 1 \muM) y concentraciones diferentes de un agonista, agonista inverso, antagonista u otro compuesto modulador candidato (por ejemplo, en el intervalo de desde 0,1 nM hasta 1 \muM o más). Tras la incubación a temperatura ambiente, se lavaron las células y se lisaron. Entonces se sometieron a prueba alícuotas del extracto celular en ensayos de segundo mensajero (tal como se describió anteriormente en los ejemplos 3, 4 y 6). De esta manera puede medirse el efecto de los compuestos moduladores sobre la actividad de GPR86 mediante la determinación de la actividad de los segundos mensajeros posteriores en presencia o ausencia de un compuesto modulador candidato en condiciones de prueba óptimas de concentración del ligando ADP, composición del tampón, tiempo de incubación y temperatura. El ensayo también puede llevarse a cabo en un formato de alto rendimiento (tal como se describe en la sección del kit) para probar simultáneamente múltiples moduladores candidatos en una diversidad de concentraciones. Se determina la actividad de GPR86, en presencia de una concentración óptima de ADP, detectando cualquier cambio en los niveles de segundo mensajero en presencia frente a ausencia de un compuesto modulador candidato a una concentración definida.
Otras realizaciones
Otras realizaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Debe entenderse que la descripción detallada anteriormente se facilita con fines de claridad únicamente y que es meramente un ejemplo. El espíritu y el alcance de la presente invención no se limitan a los ejemplos anteriores, sino que están englobados por las reivindicaciones siguientes.
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Claims (37)

1. Método para detectar la actividad de GPR86 en una muestra que comprende las etapas de:
a)
incubar una muestra que comprende GPR86 con ADP en condiciones que permiten la unión de GPR86 y ADP, y
b)
detectar un segundo mensajero.
2. Método según la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:
a)
incubar una segunda muestra que comprende GPR86 en ausencia de ADP en condiciones que permiten la unión de GRP86 y ADP, y
b)
detectar un segundo mensajero.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha muestra comprende células que expresan GPR86.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha muestra comprende membranas celulares que llevan GPR86.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha incubación se realiza en o sobre membranas de gemación inducidas por virus que contienen un polipéptido de GPR86.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa a) se realiza adicionalmente en presencia de polipéptido G\alpha16.
7. Método de identificación de un agente que se une a GPR86, comprendiendo dicho método:
(a)
poner en contacto un polipéptido de GPR86 con ADP en presencia o ausencia de un agente de unión candidato en condiciones que permiten la unión de dicho ADP a dicho polipéptido de GPR86; y
(b)
medir la unión de dicho polipéptido de GPR86 a dicho ADP, en el que una disminución en la unión en presencia de dicho agente de unión candidato, con respecto a la unión en ausencia de dicho agente de unión candidato, identifica a dicho agente de unión candidato como un agente que se une a GPR86.
8. Método según la reivindicación 7, en el que dicho agente está presente en una muestra.
9. Método de identificación de un agente que aumenta la actividad de señalización de GPR86, comprendiendo dicho método:
(a)
poner en contacto un polipéptido de GPR86 con un agente;
(b)
medir una actividad de señalización de dicho polipéptido de GPR86 en presencia de dicho agente; y
(c)
comparar dicha actividad medida en presencia de dicho agente con dicha actividad medida en una reacción en la que dicho polipéptido de GPR86 se pone en contacto con ADP, en el que dicho agente se identifica como un agonista que aumenta la señalización de dicho GPR86 cuando la cantidad de dicha actividad medida en presencia de dicho agente es de al menos el 10% de la cantidad inducida por dicho ADP.
10. Método según la reivindicación 9, en el que dicho agente está presente en una muestra.
11. Método de identificación de un agente que disminuye la actividad de señalización de GPR86, comprendiendo dicho método:
(a)
poner en contacto un polipéptido de GPR86 con ADP en presencia o ausencia de dicho agente;
(b)
medir una actividad de señalización de dicho polipéptido de GPR86;
(c)
comparar dicha cantidad de actividad medida en una reacción que contiene GPR86 y dicho ADP sin dicho agente con la cantidad de dicha actividad medida en una reacción que contiene dicho GPR86, dicho ADP y dicho agente, en el que una disminución de dicha actividad de al menos el 10% de la cantidad inducida por dicho ADP en presencia de dicho agente con respecto a la actividad en ausencia de dicho agente identifica a dicho agente como un antagonista para dicho GPR86.
12. Método según la reivindicación 11, en el que dicho agente está presente en una muestra.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que dicho GPR86 se expresa por células en su superficie.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que dicho GPR86 está presente en membranas celulares.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que dicho GPR86 está presente en o sobre membranas de gemación inducidas por virus.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 13 ó 14, en el que dichas células se seleccionan del grupo que consiste en: células COS7, una célula CHO, una célula LM (TK-), una célula NIH-3T3, célula HEK-293, célula K-562 y una célula de astrocitoma 1321N1 y otras líneas celulares.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 16, que se realiza adicionalmente en presencia de polipéptido G\alpha16.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicha medición o dicha detección se realiza usando un método seleccionado de desplazamiento de marcador, resonancia de plasmón superficial, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, extinción de fluorescencia, y polarización de fluorescencia.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 18, en el que dicho agente se selecciona del grupo que consiste en un péptido natural o sintético, un polipéptido, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, un lípido, un hidrato de carbono, un ácido nucleico, y una molécula orgánica pequeña.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 19, en el que dicha etapa de medir una actividad de señalización de dicho polipéptido de GPR86 comprende detectar un cambio en el nivel de un segundo mensajero.
21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, en el que la etapa de medir una actividad de señalización comprende medir la unión o intercambio del nucleótido guanina, actividad adenilato ciclasa, AMPc, actividad de proteína cinasa C, degradación de fosfatidilinositol, diacilglicerol, inositol trifosfato, calcio intracelular, concentración de ácido araquinoide, actividad MAP cinasa, actividad tirosina cinasa, expresión del gen indicador.
22. Método según la reivindicación 21, en el que dicha medición de una actividad de señalización comprende usar un ensayo basado en aecuorina.
23. Método para diagnosticar in vitro una enfermedad o trastorno caracterizado por la desregulación de la señalización de GPR86, comprendiendo dicho método:
a)
poner en contacto una muestra de tejido que comprende un polipéptido de GPR86 con ADP;
b)
detectar la unión de dicho ADP a dicha muestra de tejido; y
c)
comparar la unión detectada en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia en la unión con respecto a dicho patrón es diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la unión de ADP a GPR86.
24. Método para diagnosticar in vitro una enfermedad o trastorno caracterizado por la desregulación de la señalización de GPR86, comprendiendo dicho método:
a)
poner en contacto una muestra de tejido que comprende un polipéptido de GPR86 con ADP;
b)
detectar una actividad de señalización de polipéptido de GPR86 en dicha muestra de tejido; y
c)
comparar la actividad de señalización detectada en la etapa (b) con un patrón, en el que una diferencia de actividad de señalización con respecto a dicho patrón es diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por una desregulación de la señalización de ADP para GPR86.
25. Método según la reivindicación 23 ó 24, en el que dicha comparación se realiza sobre una micromatriz.
26. Kit para detectar la unión a GPR86, un agente de unión a GPR86 o un agente de disminución o aumento de la actividad de señalización de GPR86, comprendiendo dicho kit un polipéptido de GPR86 y ADP, y materiales de acondicionamiento de los mismos, en el que dicho polipéptido de GPR86 y ADP se acondicionan por
separado.
27. Kit según la reivindicación 26, en el que dicho polipéptido de GPR86 está presente en una célula que expresa GPR86 y en el que dicho kit comprende además un anticuerpo específico para GPR86 o una sonda nucleica específica de GPR86 acondicionados por separado.
28. Kit según la reivindicación 27, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en células COS7, una célula CHO, una célula LM (TK-), una célula NIH-3T3, célula HEK-293, célula K-562 y una célula de astrocitoma 1321N1 y otras líneas celulares.
29. Kit según la reivindicación 28, en el que dicho GPR86 está presente en una membrana celular aislada que lleva GPR86.
30. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 29, comprendiendo además dicho kit los componentes de un ensayo de segundo mensajero.
31. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, comprendiendo además dicho kit polipéptido G\alpha16.
32. Kit para la selección de agentes que aumentan o disminuyen la actividad de señalización de GPR86, comprendiendo dicho kit
(a)
un polinucleótido aislado que codifica para un polipéptido de GPR86, ADP y medios para detectar la señalización de GPR86, y materiales de acondicionamiento para los mismos, o
(b)
una célula transformada con un polinucleótido que codifica para un polipéptido de GPR86, ADP y medios para detectar la señalización de GPR86, en el que dicha célula y ADP se acondicionan separadamente.
33. Kit según la reivindicación 32, en el que dichos agentes se detectan usando un anticuerpo específico para GPR86 o una sonda de ácido nucleico específica de GPR86.
34. Kit según la reivindicación 32 para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno caracterizado por la desregulación de la señalización de GPR86.
35. Kit según la reivindicación 34, en el que dicha enfermedad o trastorno se detecta usando un anticuerpo específico para GPR86 o una sonda de ácido nucleico específica de GPR86.
36. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 35, que comprende además un patrón de actividad de GPR86 según se mide en una línea celular que expresa GPR86 en presencia de ADP.
37. Método o kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, en el que se sustituye ADP por 2MeSADP, ADP\betaS, Ap3A, o análogo de ADP.
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