ES2263175T3 - Inmunoliposomas que optimizan la internalizacion en celulas diana. - Google Patents

Inmunoliposomas que optimizan la internalizacion en celulas diana.

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Abstract

EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTAN INMUNOLIPOSOMAS QUE OPTIMIZAN LA INTERNALIZACION DE UN FARMACO EN CELULAS DIANA QUE COMPRENDEN UN MARCADOR CARACTERISTICO EN LA SUPERFICIE CELULAR. LOS INMUNOLIPOSOMAS COMPRENDEN UN DOMINIO FAB'' DE UN ANTICUERPO QUE SE ENLAZA ESPECIFICAMENTE AL MARCADOR CARACTERISTICO, UN LIPIDO FORMADOR DE VESICULAS ANFIPATICAS Y UN LIPIDO DERIVADO DEL POLIETILENGLICOL. EN LA INVENCION TAMBIEN SE PRESENTAN INMUNOLIPOSOMAS INHIBIDORES DEL CRECIMIENTO QUE AUN CARECIENDO DE AGENTES TERAPEUTICOS INHIBIDORES DEL CRECIMIENTO SON CAPACES DE INHIBIR EL CRECIMIENTO Y PROLIFERACION DE CELULAS DIANA.

Description

Inmunoliposomas que optimizan la internalización en células diana.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los liposomas. En particular, la presente invención se refiere a liposomas específicamente dirigidos a un marcador característico sobre células diana.
Antecedentes de la invención
Una serie de agentes farmacéuticos y agentes farmacéuticos potenciales tienen baja solubilidad acuosa, altos niveles de antigenicidad, toxicidad o se degradan con rapidez en el suero, lo cual dificulta el desarrollo de formulaciones clínicas adecuadas. Una solución a estos problemas ha sido encapsular el agente farmacéutico en un vehículo de transporte que es soluble en disoluciones acuosas y que protege al agente del contacto directo con tejidos y sangre. En particular, las formulaciones basadas en la tecnología de los liposomas son de interés significativo. Los liposomas son vesículas formadas por bicapas de fosfolípidos ordenadas de modo concéntrico que encapsulan una fase acuosa. Se forman de manera espontánea cuando los fosfolípidos se exponen a disoluciones acuosas y pueden alojar a una diversidad de moléculas bioactivas.
Los liposomas han demostrado ser una herramienta valiosa como sistema de transporte in vivo para potenciar la eficacia de diversas moléculas farmacológicamente activas (Ostro et al., Liposomes form Biophysics to Therapeutics, Dekker, Nueva York, pp. 1-369 (1987)). Estudios en animales han demostrado que los liposomas pueden disminuir la toxicidad de varios fármacos antitumorales y antifúngicos, conduciendo a ensayos clínicos con resultados prometedores (Sculier et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 24:527-538; Gabizon et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 25:1795-1803 (1989); Treat et al., J. Natl. Cancer Inst., 82:1706-1710 (1990); López-Berestein et al., J. Infect. Dis., 151:704-710 (1985); Presant et al., Cancer, 62:905-911 (1988)). Además, los liposomas han demostrado ser vehículos eficaces de fármacos antiparasitarios para tratar infecciones intracelulares del sistema reticuloendotelial (RES), para activar células de macrófagos para que se vuelvan tumoricidas, en modelos de metástasis, y para potenciar la respuesta inmunológica a antígenos encapsulados, facilitando, con ello, la formulación de vacunas artificiales (Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer, López-Berestein y Fidler, eds., Liss, Nueva York (1989); Alving et al., Immunol. Lett., 25:275-280 (1990)).
Todos estos efectos se derivan de la capacidad de las células de macrófagos en el hígado y bazo (sistema fagocítico mononuclear, MPS, o sistema reticuloendotelial, RES) para retirar la mayoría de los liposomas de la circulación sanguínea en pocos minutos (Liposomes as Drug Carriers, Gregoriadis, ed., Wiley, Nueva York (1988)). Sin embargo, esta eliminación rápida de los liposomas limita sus perspectivas como sistema de transporte in vivo para transportar fármacos a sitios de enfermedad más allá del RES.
Informes recientes han descrito el uso de diversos polímeros para aumentar la semivida sérica de los liposomas. En particular, se ha reconocido que las formulaciones de liposomas que contienen monosialogangliósido (GM_{1}) o derivados lipídicos de polietilenglicol evitan la eliminación del MPS y aumentan significativamente la semivida sérica (Allen et al., FEBS Lett., 223:42-46 (1987); Klibanov et al., FEBS Lett., 268:235-237 (1990); Blume et al., Biochim. Biophys. Acta, 1029:91-97 (1990); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1066:29-36 (1991); Papahadjopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:11460-11464 (1991); Senior et al., Biochim. Biophys. Acta, 1062:77-82 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1068:133-141 (1991)).
Muchos informes han demostrado que la rápida eliminación de los liposomas en la circulación in vivo por células del sistema fagocítico mononuclear (MPS) puede solucionarse mediante la incorporación de lípidos derivatizados con el polímero hidrofílico polietilenglicol (PEG). Estos liposomas se denominan liposomas estéricamente estabilizados o "sigilosos". Con un PEG que tiene un peso molecular en el intervalo de 1000 a 5000 se logra una circulación prolongada y una captación reducida por el MPS (Woodle y Lasic, Biochim. Biophys. Acta, 1113:171-199 (1992)). Sin embargo, esta reducción en la eliminación por el MPS también está asociada con una reducción en la captación por una diversidad de células (Lee, K.D. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1103:185-197 (1992)). Además, la presencia de polímeros hidrofílicos sobre la superficie de los liposomas parece interferir con el reconocimiento de ligandos específicos por los restos de transporte dirigido conjugados al liposoma. Probablemente esto suceda debido a un impedimento estérico del sitio activo del resto de transporte dirigido debido a las moléculas de PEG de cadena larga (Klibanov et al., Biochim. Biophys. Acta, 1062:148-148 (1991)).
Por último, mientras que la mayoría de los agentes terapéuticos transportados por liposomas deben entrar en el citoplasma de la célula diana para expresar su actividad biológica, se aprecia, en general, que la mayoría de los liposomas no son realmente internalizados por las células diana o, cuando se produce la captación, en general se realiza a través de la vía endocitótica. Por tanto, el transporte real del fármaco a la célula diana supone, de forma típica, la liberación desde el liposoma (por ejemplo, mediante la ruptura del liposoma en sí mismo o mediante "filtración") en la cercanía de la célula diana, y después la posterior captación (a través de difusión, endocitosis, fagocitosis, o transporte activo) por la célula diana del agente terapéutico desde la disolución. En efecto, los inmunoliposomas se han diseñado para inducir realmente la desestabilización y fragmentación del liposoma cuando el anticuerpo de transporte dirigido se ha unido a la diana, liberando con ello el contenido del liposoma (véase la Patente de EE.UU. nº 4.957.735). Incluso estos liposomas "sensibles a la diana" pierden una cantidad considerable del agente terapéutico en disolución antes de que la célula diana puedan captarlos. Como alternativa, si el liposoma es internalizado mediante un proceso endocitótico, en último término se incorpora en un liposoma en el que existen unas condiciones ácidas fuertes que pueden degradar una serie de agentes terapéuticos (por ejemplo, proteínas).
Por tanto, el transporte de dosis eficaces de agentes terapéuticos al citoplasma de la célula diana se ve dificultado por el bajo tiempo de residencia en el suero, un transporte ineficaz cuando se aumentan los tiempos de residencia, una pérdida considerable del agente terapéutico en disolución antes de que pueda ser captado por la célula diana, y la degradación del agente terapéutico en la vía endosómica/lisosómica. De manera evidente, sería deseable obtener un liposoma con una mayor semivida sérica, capaz de dirigirse específicamente a células concretas, y también capaz de ser internalizado hacia el citoplasma de las células diana evitando, con ello, la pérdida del agente terapéutico o la degradación a través de la vía endosómica/lisosómica.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona nuevos inmunoliposomas optimizados para transportar agentes terapéuticos hacia el citoplasma de una célula diana. Estos inmunoliposomas muestran una mayor semivida en sangre, son capaces de dirigirse específicamente a células concretas, y son capaces de ser internalizados hacia el citoplasma de las células diana evitando, con ello, la pérdida de los agentes terapéuticos o la degradación a través de la vía endolisosómica.
Por tanto, la invención proporciona un inmunoliposoma que se internaliza en una célula que porta un receptor del factor del crecimiento HER2, comprendiendo dicho liposoma:
un fragmento de anticuerpo que se une de forma específica al receptor HER2, estando dicho fragmento unido a un polímero hidrofílico;
un lípido formador de vesículas anfipático, formando dicho lípido formador de vesícula un liposoma;
otro polímero hidrofílico;
en el que cuando dicho inmunoliposoma se pone en contacto con dicha célula, dicho inmunoliposoma se internaliza en dicha célula.
El fragmento de anticuerpo es preferiblemente un dominio Fab'. El polímero hidrofílico es preferiblemente un lípido derivatizado con polietilenglicol (PEG). El PEG tiene preferiblemente un peso molecular medio entre aproximadamente 750 D y 5000 D, más preferiblemente entre aproximadamente 1200 D y aproximadamente 3000 D, y lo más preferible aproximadamente 1900 D. El lípido derivatizado está presente preferiblemente hasta aproximadamente 1,2% molar, más preferiblemente hasta aproximadamente 2,4% molar, y lo más preferible hasta aproximadamente 3,6% molar de lípidos totales. El dominio Fab' puede ser un dominio Fab' humanizado de un anticuerpo monoclonal. El inmunoliposoma puede comprender también una fosfatidiletinolamina derivatizada con maleimida (M-PE) que forma un enlace tioéter con el dominio Fab' de un anticuerpo. El lípido formador de vesículas puede ser un fosfolípido, un glicolípido, un esfinglípido, o un esterol. Los inmunoliposomas tienen preferiblemente un diámetro medio que varía de 50 nm a 500 nm, más preferiblemente de 75 nm a 300 nm, y lo más preferible de aproximadamente 100 nm. El liposoma puede comprender un agente terapéutico. Los agentes terapéuticos en el liposoma pueden incluir daunomicina, idarrubicina, mitoxantrona, mitomicina, cisplatina y otros análogos de platino II, vincristina, epirrubicina, aclacinomicina, metotrexato, etopósido, doxorrubicina, arabinósido de citosina, fluorouracilo y otras pirimidinas, purinas o nucleósidos fluorados, bleomicina, mitomicina, plicamicina, dactinomicina, ciclofosfamida y sus derivados, tiotepa, BCNU, taxol, taxótero y otros derivados y aislados de taxano, camptotecinas, polipéptidos, un ácido nucleico, un ácido nucleico que tiene un enlace fosforotioato internucleotídico, y un ácido nucleico que tiene un enlace poliamida internucleotídico.
En un inmunoliposoma particularmente preferido, el dominio del anticuerpo Fab' es el de rhuMAbHER2, estando el dominio Fab' conjugado con una fosfatidiletinolamina derivatizada con maleimida (M-PE), siendo el lípido formador de vesículas fosfatidilcolina (PC) y colesterol (Col), y el lípido derivatizado con polietilenglicol es fosfatidiletinolamina derivatizada con polietilenglicol (PEG-PE), en el que el componente de polietilenglicol tiene un peso molecular de aproximadamente 1900 D, y en el que la proporción PC:Col:M-PE es 150:100:3, y la PEG-PE está presente en una cantidad de hasta aproximadamente 3,6% molar de lípidos totales.
En otra realización particularmente preferida, el dominio Fab' del anticuerpo puede unirse al extremo distal del lípido derivatizado con polietilenglicol. En este caso, el inmunoliposoma puede contener un lípido derivatizado con polietilenglicol, en cuyo caso el dominio Fab' está unido preferiblemente sólo a una pequeña fracción de los lípidos derivatizados con PEG o, como alternativa, el inmunoliposoma puede contener dos o más especies diferentes de lípidos derivatizados con PEG, en cuyo caso una especie de lípido derivatizado con PEG puede actuar como conector para el dominio Fab' del anticuerpo, mientras que el otro lípido derivatizado con PEG, que está preferiblemente presente a mayor concentración, proporciona una estabilización "estérica" reduciendo, con ello, la velocidad de eliminación del liposoma. En una realización preferida, el Fab' unido al lípido derivatizado con PEG comprende de 0,6% molar a 1% molar de fosfolípidos totales, mientras que el lípido derivatizado con PEG total comprende de 10% molar a 12% molar de fosfolípidos totales. El Fab' está unido preferiblemente a PEG-PE, o a PEG-DSPE.
Los inmunoliposomas de la invención pueden utilizarse en un método para internalizar el agente terapéutico en la célula que porta el receptor HER2, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con el inmunoliposoma, en el que dicho contacto produce la internalización de dicho agente en dicha célula.
Los inmunoliposomas de la invención también pueden utilizarse en un método para inhibir el crecimiento de una célula que porta un receptor HER2, poniendo en contacot la célula con los liposomas.
En otra realización, esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un inmunoliposoma descrito anteriormente. La composición farmacéutica comprende una dosis terapéuticamente eficaz del inmunoliposoma, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra histogramas de flujo citométricos que muestran la unión de inmunoliposomas anti-p185^{HER2} a células SK-BR-3. Se detectaron inmunoliposomas unidos a las células SK-BR-3 después de lavar, mediante anti-IgG humana de cabra marcada con FITC, que reconoce fragmentos rhuMAbHER2-Fab'. Las células SK-BR-3 se incubaron con inmunoliposomas convencionales (A), inmunoliposomas estéricamente estabilizados (al 6% molar de PEG-PE) (B), y fragmentos rhuMAbHER2-Fab' libres (C) a concentraciones equivalentes de anticuerpo (3,3 \mug/ml).
La Figura 2 muestra la unión de inmunoliposomas convencionales anti-p185^{HER2} a células BT-474. (A) Las células BT-474 en cultivo de monocapa se trataron con inmunoliposomas convencionales en presencia de rhuMAbHER2 marcado con ^{125}-I competitivo, como se describe en Métodos. (B) Transformación Scatchard de los datos que aparecen en (A).
La Figura 3 ilustra la actividad antiproliferativa de inmunoliposomas anti-p185^{HER2} contra células SK-BR-3. Las células SK-BR-3 en cultivo de monocapa se trataron con inmunoliposomas a las dosis de anticuerpos indicadas en el eje de abscisas, y la proliferación celular relativa se determina como se describe en Métodos. Los liposomas control sin anticuerpo se dosificaron según la concentración de liposomas, y se representaron gráficamente según la concentración de liposomas equivalente con el inmunoliposoma correspondiente apropiado. Se muestran los liposomas convencionales control (sin anticuerpo); los liposomas control estéricamente estabilizados (al 6% molar de PEG-PE); los inmunoliposomas convencionales; los inmunoliposomas estéricamente estabilizados anti-p185^{HER2} (al 6% molar de PEG-PE); rhuMAbHER2-Fab' libre (no liposómico); y el anticuerpo bivalente rhuMAbHER2 libre, como se indica en la clave.
La Figura 4 muestra la citotoxicidad de inmunoliposomas anti-p185^{HER2} que contienen doxorrubicina. HSPC: los inmunoliposomas Col se cargaron con doxorrubicina como se describe en Métodos. (A) células SK-BR-3. (B) células WI-38. Las células en cultivo se trataron durante una hora con inmunoliposomas convencionales (triángulos); inmunoliposomas estéricamente estabilizados (al 2% molar de PEG-PE) (círculos negros); inmunoliposomas estéricamente estabilizados (al 2% molar de PEG-PE) control (anticuerpo irrelevante) (círculos blancos); o doxorrubicina libre sólo (cuadrados negros). Los inmunoliposomas contienen 60-70 \mug de anticuerpo/\mumol de fosfolípido, y 55-80 \mug de doxorrubicina/\mumol de fosfolípido; la proporción de anticuerpo/doxorrubicina es 0,8-1,2. Las células se contaron 3 días después del tratamiento como se describe en Métodos.
Descripción de la realización preferida Definiciones y parámetros generales
Se ofrecen las siguientes definiciones para ilustrar y definir el significado y alcance de los diversos términos y expresiones utilizados para describir la invención en la presente.
En la presente se utilizan las siguientes abreviaturas: DOX, doxorrubicina; Col, colesterol; PA, ácido fosfatídico; PC, fosfatidilcolina; PI, fosfatidilinositol; SM, esfingomielina; M-DPE, dipalmitoiletanolamina derivatizada con maleimida; PBS, disolución salina tamponada con fosfato; LUV, vesículas unilaminares grandes; MLV, vesículas multilaminares; PE, fosfatidiletanolamina; PEG, polietilenglicol; PEG-PE, fosfatidiletanolamina derivatizada con polietilenglicol.
La expresión "lípido formador de vesículas anfipático" pretende incluir cualquier lípido anfipático que tenga restos con grupos de cabezas polares e hidrofóbicos, y que, en sí mismo, puede formar de manera espontánea vesículas de bicapa en agua, como por ejemplo fosfolípidos, o (b) se incorpora de forma estable en bicapas lipídicas en combinación con fosfolípidos, estando su resto hidrofóbico en contacto con la región interior hidrofóbica de la membrana de la bicapa, y su resto con grupo de cabeza polar orientado hacia la superficie exterior polar de la membrana. Un ejemplo de este último tipo de lípido formador de vesículas es el colesterol y derivados de colesterol, como sulfato de colesterol y hemisuccinato de colesterol.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "unión específica" se refiere a la unión que se produce entre pares de especies como enzima/sustrato, receptor/agonista, anticuerpo/antígeno, y lectina/carbohidrato, que puede estar mediada por interacciones covalentes o no covalentes, o una combinación de interacciones covalentes y no covalentes. Cuando la interacción de las dos especies produce un complejo unido de modo no covalente, la unión que se produce es, de forma típica, electrostática, una unión de hidrógeno, o el resultado de interacciones lipofílicas. Por consiguiente, se produce una "unión específica" entre pares de especies cuando existe una interacción entra ambas que produce un complejo unido que tiene las características de una interacción anticuerpo/antígeno o enzima/sustrato. En particular, la unión específica se caracteriza por la unión de un miembro de un par a una especie concreta y no a otra especie dentro de la familia de compuestos a la cual pertenece el correspondiente miembro del miembro de unión. Así, por ejemplo, un anticuerpo se une preferiblemente a un único epitopo y no a otro epitopo dentro de la familia de proteínas.
El término "inmunoliposoma" se refiere a un liposoma que porta un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que actúa como resto de transporte dirigido, permitiendo al liposoma unirse de modo específico a una molécula "diana" particular que puede existir en disolución, o que puede estar unida a la superficie de una célula. Cuando la molécula diana se encuentra, de forma típica, en exceso relativo (por ejemplo, \geq 10 veces) y en asociación con un tipo celular particular o, como alternativa, en una multiplicidad de tipos celulares que expresan una condición fisiológica particular, se dice que la molécula diana es un "marcador característico" de este tipo celular o esa condición fisiológica. Así, por ejemplo, un cáncer puede estar caracterizado por la sobreexpresión de un marcador concreto, como el protooncogén HER2 (c-erbB-2/neu) en el caso de cáncer de mama.
Un "polímero hidrofílico", tal como se utiliza en la presente, se refiere a polímeros neutros flexibles muy hidratados de cadena larga unidos a moléculas de lípidos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a lípidos modificados con polietilenglicol y polipropilenglicol, fosfatidilinositol (PI), sulfato de cerebrósido (CS) y monosialogangliósido (GM_{1}).
La expresión "porcentaje (%) molar", cuando se refiere al porcentaje de polímero hidrofílico en un liposoma, se expresa en relación con los lípidos totales en el liposoma, a menos que se indique lo contrario. Así, por ejemplo, en un liposoma que comprende una proporción de fosfatidilcolina (PC) a colesterol (Col) de 150:100, un porcentaje de 4% molar de polímero hidrofílico (por ejemplo, PEG) representa una proporción de PC:Col:PEG de aproximadamente 150:100:10.
El término "proliferación" se refiere a la división celular o mitosis. La proliferación puede medirse mediante ensayos convencionales, como mediante la captación de nucleótidos radiactivos (timidina) o mediante observación directa.
Inmunoliposomas en el transporte de fármacos
Como se indicó anteriormente, la presente invención proporciona inmunoliposomas para el transporte selectivo de agentes terapéuticos hasta tejidos específicos en un hospedante, y usos para estos liposomas. Los liposomas de esta invención emplean una composición que optimiza la internalización de los liposomas hacia el citoplasma de las células del tejido diana. La expresión "optimiza la internalización" o "internalización óptima" se utiliza para indicar el transporte de los contenidos del liposoma, de forma que se logra el máximo transporte hacia el citoplasma de la célula diana y, por tanto, el máximo efecto terapéutico. Se reconoce que la internalización de un inmunoliposoma hacia el citoplasma de una célula está en función de la semivida sanguínea del liposoma, la capacidad del liposoma para reconocer y unirse a su célula diana, y la captación del liposoma hacia el citoplasma de la célula diana. Se sabe que la adición de un polímero hidrofílico a los liposomas aumenta la semivida sérica mediante la disminución de la aglomeración liposómica (agregación) y la captación de los liposomas por el RES. Sin estar limitados a ninguna teoría, se cree que los polímeros hidrofílicos a concentraciones altas interfieren con el reconocimiento y unión del resto o ligando de transporte dirigido y con la posterior captación por la célula diana, disminuyendo, con ello, la internalización del contenido de los liposomas por la célula diana. La internalización óptima hacia el citoplasma de la célula se refiere a la condición en la que se logra la captación máxima hacia el citoplasma de la célula diana mientras que se mantiene una semivida sanguínea significativamente mayor que la semivida sanguínea de los liposomas que carecen de cualquier polímero hidrofílico y son adecuados para fines de transporte
dirigido.
En particular, esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento inesperado de que un liposoma que contiene un polímero hidrofílico (por ejemplo, un lípido modificado con PEG) en una cantidad de hasta aproximadamente 3,6% molar de lípidos totales (formadores de vesículas) muestra una velocidad inesperadamente alta de internalización hacia el citoplasma de la célula diana, mientras que mantiene una semivida sanguínea sustancialmente mayor que la que se observa en liposomas que carecen de polímero hidrofílico. Esto es particularmente cierto cuando el inmunoliposoma se dirige con fragmentos Fab' conjugados con uno o más constituyentes lipídicos del liposoma.
Además, también resultó un descubrimiento inesperado que cuando los liposomas que comprenden hasta 3,6% molar de un polímero hidrofílico se conjugaban con un fragmento Fab' de un anticuerpo como resto de transporte dirigido, el liposoma muestra un alto grado de especificidad celular y una afinidad de unión mayor que los de los fragmentos Fab' por sí solos. De hecho, la especifidad de unión lograda por los inmunoliposomas de la presente invención es comparable con la especificidad de unión del anticuerpo intacto. Este resultado es particularmente sorprendente puesto que el anticuerpo intacto es un tetrámero que comprende un par de "brazos" de dominio variable que son, en gran medida, responsables de la especificidad y avidez del anticuerpo. Las regiones Fab', que consisten sólo en un "brazo", de forma típica carecen de la especificidad y avidez de unión del anticuerpo intacto. Por tanto, se espera que, de manera típica, formen restos de transporte dirigido inadecuados.
Aunque el fragmento Fab' puede conjugarse con cualquier porción del liposoma, un descubrimiento sorprendente de esta invención es que cuando el fragmento Fab' está unido a los extremos distales del polímero hidrofílico (por ejemplo, polietilenglicol), se logran unos niveles elevados de internalización del liposoma por la célula diana, aunque estén presentes niveles elevados de polímero hidrofílico (por ejemplo, hasta 15% molar de fosfolípidos totales, más preferiblemente de aproximadamente 10% a 12% molar de fosfolípidos totales). Por tanto, en una realización preferida, esta invención proporciona un liposoma que es internalizado por una célula diana, en el que el liposoma incluye un fragmento Fab' unido a los extremos distales de un polímero hidrofílico, por ejemplo, polietilenglicol. El fragmento Fab' preferiblemente no está unido a incluso la mayoría del polímero hidrofílico. De forma típica, el Fab' estará unido sólo a aproximadamente 1% hasta aproximadamente 20% del polímero hidrofílico, más preferiblemente a aproximadamente 4% hasta aproximadamente 10% molar del polímero hidrofílico, y lo más preferible a aproximadamente 6% hasta aproximadamente 10% molar del polímero hidrofílico. El polímero hidrofílico que porta los fragmentos Fab' (por ejemplo, PEG-Fab') está presente, por tanto, a aproximadamente 0,1% hasta 2,0% molar de fosfolípidos totales, más preferiblemente a aproximadamente 0,4% a aproximadamente 1,0% molar, y lo más preferible a aproximadamente 0,6% a aproximadamente 1,0% molar de fosfolípidos
totales.
Los inmunoliposomas de esta invención optimizan el transporte de agentes terapéuticos hacia el citoplasma de la célula diana mediante el mantenimiento de una semivida sanguínea elevada, comparados con un liposoma que carece de polímero hidrofílico, mediante el mantenimiento de un alto grado de especificidad de diana, y mediante la internalización eficaz del liposoma en sí mismo (que porta el agente terapéutico), evitando, con ello, una pérdida considerable del agente terapéutico en disolución o la degradación del agente terapéutico a través de la vía endosómica/lisosómica. Los liposomas de la presente invención, por tanto, son particularmente útiles como vehículos para el transporte de agentes terapéuticos a células diana específicas.
Inmunoliposomas como inhibidores del crecimiento celular
Los inmunoliposomas de la invención pueden utilizarse para inhibir la proliferación de células tumorales y, por tanto, proporcionan una actividad antitumoral sin encapsular un agente terapéutico inhibidor del crecimiento. De hecho, los inmunoliposomas inhibidores del crecimiento de la presente invención son eficaces cuando no contienen agente terapéutico. Los inmunoliposomas inhibidores del crecimiento de esta invención comprenden, en general, el dominio Fab' de un anticuerpo monoclonal anti-HER2. En una realización preferida, el anticuerpo es el fragmento Fab' del anticuerpo monoclonal anti-HER2 humano (rhuMAbHER2-Fab'). A diferencia del rhuMAbHER2-Fab' libre en disolución, el anclaje liposómico (a la membrana) del fragmento Fab' monovalente produce una actividad antiproliferativa y antitumoral comparable al rhuMAbHER2 bivalente. El anticuerpo rhuMAbHER2-Fab' en disolución no tiene esta propiedad. Sin estar limitados a ninguna teoría, se cree que el anclaje a la membrana del fragmento Fab' en el inmunoliposoma anti-HER2 confiere esta propiedad antiproliferativa probablemente permitiendo la reticulación de p185^{HER2} a la superficie de la célula tumoral.
Los fragmentos Fab' pueden conjugarse a cualquier porción del liposoma. Así, por ejemplo, en una realización, el Fab' puede conjugarse directamente al liposoma, mientras que en otra realización, los Fab' pueden conjugarse al polímero hidrofílico (por ejemplo, PEG).
Como se indicó anteriormente, los inmunoliposomas inhibidores del crecimiento no contienen un agente inhibidor del crecimiento. Un "agente inhibidor del crecimiento" se refiere a un agente químico que reduce la velocidad de crecimiento de las células a las cuales se administra. En el caso extremo, un agente inhibidor del crecimiento puede ser citotóxico para la células al cual se administra. Tal como se utiliza en la presente, la velocidad de crecimiento de las células se refiere a la velocidad de proliferación de las células. Una mayor velocidad de proliferación está asociada, de forma típica, con una mayor velocidad metabólica y, por tanto, las velocidades de proliferación pueden ensayarse para detectar las velocidades metabólicas (por ejemplo, mediante la captación de un precursor metabólico marcado, como timidina tritiada). Por tanto, un aumento en la velocidad de crecimiento o de proliferación puede tomarse como indicación de un aumento de la velocidad metabólica o viceversa.
Los agentes inhibidores del crecimiento son muy conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a doxorrubicina, ricina A, gelonina. Se reconocerá que algunas composiciones (por ejemplo, antibióticos) pueden mostrar una pequeña actividad inhibidora del crecimiento como consecuencia secundaria de su actividad primaria. Estas composiciones no se consideran en la presente como agentes inhibidores del crecimiento. La frase un "liposoma que no contiene agente terapéutico inhibidor del crecimiento" pretende capturar el hecho de que la inhibición del crecimiento y proliferación celular obtenida con los inmunoliposomas inhibidores del crecimiento de la presente invención es una consecuencia del contenido del liposoma. Por tanto, un agente inhibidor del crecimiento, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un agente que, cuando está presente en un inmunoliposoma inhibidor del crecimiento, produce una disminución en la velocidad de proliferación celular al menos 10% mayor que la disminución en la velocidad de proliferación celular observada por la administración de los mismos inmunoliposomas que carecen de agente terapéutico o inhibidor del crecimiento.
Aunque los liposomas inhibidores del crecimiento de esta invención inhiben el crecimiento y proliferación celular incluso cuando no portan agente terapéutico y, por tanto, pueden administrarse "vacíos", un experto en la técnica apreciará que puede ser deseable encapsular un agente terapéutico distinto de un agente terapéutico inhibidor del crecimiento, logrando, con ello, un liposoma que muestra actividades duales, aditivas o supraditivas. Así, por ejemplo, un inmunoliposoma cargado con un antibiótico mostrará actividad antibiótica, así como la capacidad de inhibir el crecimiento y proliferación de las células diana.
Los liposomas inhibidores del crecimiento y los inmunoliposomas que portan el agente terapéutico de la presente invención pueden utilizarse para inhibir la proliferación de células tumorales, o para dirigir agentes terapéuticos a células específicas en una amplia variedad de hospedantes. Los hospedantes preferidos incluyen especies de mamífero, como seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, ganado vacuno, caballos, ovejas, roedores, lagomorfos y similares.
Composición de los liposomas
Los inmunoliposomas de la presente invención comprenden uno o más lípidos formadores de vesículas, un fragmento de anticuerpo que actúa como resto de transporte dirigido, y un polímero hidrofílico. Sin estar limitados a ninguna teoría, se cree que los lípidos formadores de vesículas actúan para formar una bicapa que encapsula el agente terapéutico cuando está presente, el polímero hidrofílico actúa para evitar la aglomeración de los liposomas y también disminuye la captación de los liposomas por el RES y, por tanto, aumenta la semivida sanguínea, y el ligando (el fragmento de anticuerpo) actúa para unir los liposomas de forma específica a una célula o tejido que porta una diana (es decir, un marcador característico) para el cual el ligando es específico. El bajo porcentaje molar del polímero hidrofílico acoplado con el uso del fragmento de anticuerpo permite el transporte específico del liposoma y produce, como resultado inesperado, un alto nivel de internalización del liposoma entero hacia el citoplasma de la célula diana.
A) Lípidos formadores de vesículas
El lípido formador de vesículas es preferiblemente un lípido que tiene dos cadenas hidrocarbonadas, de forma típica cadenas de acilo y un grupo de cabeza polar. En esta clase se incluyen los fosfolípidos, como fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilinositol (PI) y esfingomielina (SM), en los que las dos cadenas hidrocarbonadas tienen, de forma típica, una longitud de aproximadamente 14-22 átomos de carbono, y grados variables de instauración, o son fosfolípidos saturados con una cadena de 14-18 carbonos. En esta clase también se incluyen glicolípidos como cerebrósidos y gangliósidos.
En una realización preferida, el principal componente lipídico en los liposomas es fosfatidilcolina. Están disponibles fosfatidilcolinas que tienen una diversidad de grupos de cadena acilo con diversas longitudes de cadena y grados de saturación, o pueden aislarse o sintetizarse mediante técnicas muy conocidas. En general, es más fácil ajustar el tamaño de las fosfatidilcolinas menos saturados, en particular cuando los liposomas deben tener un tamaño por debajo de 0,3 micras, para fines de esterilización por filtración. Se prefieren las fosfatidilcolinas que contienen ácidos grasos con una longitud de la cadena carbonada en el intervalo de C_{14} a C_{22}. También pueden utilizarse fosfatidilcolinas con ácidos grasos mono- o diinsaturados, y mezclas de ácidos grasos saturados e insaturados. Los liposomas útiles en la presente invención también pueden estar compuestos de esfingomielina o fosfolípidos con grupos de cabeza distintos de colina, como etanolamina, serina, glicerol e inositol. En particular, los fosfolípidos adecuados para la formación de liposomas útiles en los métodos y composiciones de la presente invención incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, lecitina, \beta,\gamma-dipalmitoil-\alpha-lecitina, esfingomielina, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cloruro de N-(2,3-di(9-(Z)-octadeceniloxi))-prop-1-il-N,N,N-trimetilamonio, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, cefalina, cardiolipina, cerebrósidos, dicetilfosfato, dioleoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilglicerol, dioleilfosfatidilglicerol, palmitoiloleilfosfatidilcolina, diestearoilfosfatidilcolina, estearoilpalmitoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidiletanolamina, diestearoilfosfatidil-etanolamina, dimiristoilfosfatidilserina, dioleilfosfatidilcolina y similares. También pueden utilizarse lípidos que no contienen fósforo en los liposomas de las composiciones de la presente invención. Éstos incluyen, por ejemplo, estearilamina, docecilamina, palmitato de acetilo, amidas de ácidos grasos, y similares. Otros lípidos adecuados para su utilización en los liposomas de la presente invención son muy conocidos por los expertos en la técnica y se citan en una diversidad de fuentes bien conocidas, por ejemplo, McCutcheon's Detergents and Emulsifiers y McCutcheon's Functional Materials, Allured Publishing Co., Ridgewood, N.J., incorporándose ambos como referencia en la presente. Los liposomas preferidos incluyen un esterol, preferiblemente colesterol, a una proporción molar de 0,1 a 1,0 (colesterol:fosfolípido). Las composiciones de liposomas más preferidas son fosfatidilcolina/colesterol, diestearoilfosfatidil-colina/colesterol, dipalmitoilfosfatidilcolina/colesterol, y esfingomielina/colesterol. A menudo están presentes pequeñas cantidades (es decir, < 10%) de otros lípidos derivatizados en los liposomas que tienen estas composiciones.
Según una característica importante de la invención, el lípido formador de vesículas puede ser un lípido relativamente fluido, lo cual significa, de forma típica, que la fase lipídica tiene una temperatura de fusión de líquido a líquido cristalino relativamente baja, por ejemplo, a temperatura ambiente o más baja, o es un lípido relativamente rígido, lo cual significa que el lípido tiene una temperatura de fusión relativamente alta, por ejemplo, hasta 60°C. Como norma, los lípidos más rígidos, es decir, los lípidos saturados, contribuyen a la rigidez de la membrana en una estructura de bicapa lipídica, y también contribuyen a una mayor estabilidad de la bicapa en sangre. También se sabe que otros componentes lipídicos, como el colesterol, contribuyen a la rigidez y estabilidad de la membrana en las estructuras de bicapa lipídica. Como se mencionó anteriormente, un lípido saturado de cadena larga (por ejemplo, C_{14}-C_{22}) más colesterol es una composición preferida para transportar composiciones terapéuticas hasta tejidos diana, como tumores sólidos, puesto que estos liposomas no tienden a liberar los fármacos hacia el plasma cuando están circulando por la corriente sanguínea. Los fosfolípidos cuyas cadenas acilo tienen una diversidad de grados de saturación pueden obtenerse en el mercado. Por ejemplo, la fosfatidilcolina de huevo (EPC) puede obtenerse en Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL), y la fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) puede obtenerse en Natterman (Cologne, FRG). Como alternativa, los fosfolípidos pueden prepararse según métodos publicados (véase D.M. Small, "The physical chemistry of lipids" (1986), Plenum Press, N.Y., o D.D. Lasic, "Liposomes: from physics to applications" (1993), Elsevier, Amsterdam, N.Y.).
B) Polímero hidrofílico
Como se indicó anteriormente, la presencia de polímeros hidrofílicos tiende a aumentar la semivida sanguínea de un liposoma (véase, por ejemplo, Woodle et al., Biochim. Biophys. Acta, 1113:171-199 (1992)). A menudo resulta deseable añadir un polímero hidrofílico, como lípidos modificados con polietilenglicol (PEG) o gangliósido G_{MI} a los liposomas. La adición de estos componentes evita la agregación de los liposomas durante el acoplamiento del resto de transporte dirigido al liposoma. Estos componentes también proporcionan un medio para aumentar la vida en circulación del fosfolípido. Sin embargo, se ha observado que aunque los polímeros hidrofílicos disminuyen la captación de liposomas por el RES y, por tanto, aumentan la semivida sanguínea, existe una correspondiente disminución en la captación por los tejidos diana también. Un descubrimiento inesperado de la presente invención es que una concentración de polímero hidrofílico (por ejemplo, PEG) de 1% a 4% molar de lípido formador de vesículas (excluyendo el colesterol) proporciona una captación celular óptima combinada con una adecuada semivida sanguínea.
Puede utilizarse una serie de métodos diferentes para la preparación de PEG para su incorporación en liposomas. En una realización preferida, el PEG se incorpora como fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE) o diestearoilfosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-DSPE). Los métodos para preparar PEG-PE son muy conocidos e implican, de forma típica, la utilización de un metoxi-PEG activado (con un único extremo reactivo) y PE. Por tanto, el succinato de succinimidilo-PEG puede hacerse reaccionar en un disolvente orgánico básico (Klibanov et al., FEBS Lett., 268:235-237 (1990)). Un método particularmente preferido de preparación de PEG-PE se basa en la reacción del PEG con carbonildiimidazol, seguido de la adición de PE (véase Woodle et al., Proc. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 17:77-78 (1990), Papahadjopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:11460-11464 (1991), Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1066:29-36 (1991), Woodle et al., Biochim. Biophys. Acta, 1105:193-200 (1992), y Woodle et al., Period. Biol., 93:349-352 (1991)). De forma similar, el PEG activado con cloruro cianúrico en un disolvente orgánico básico se describe en Blume et al., Biochim. Biophys. Acta, 1029:91-97 (1990), y la Patente de EE.UU. nº 5.213.804, que se incorpora como referencia en la presente.
Un enfoque completamente diferente se basa en el acoplamiento del PEG con liposomas preformados que utiliza PEG activado con cloruro de tresilo, que entonces se añade a los liposomas que contienen PE a pH alto (Señor et al., Biochim. Biophys. Acta, 1-62:77-82 (1991)). El PEG derivatizado también está disponible en el mercado. Así, por ejemplo, el PEG-PE está disponible en Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama), o Liposome Technology (Menlo Park, California, EEUU). Un experto en la técnica sabrá que muchos otros enlaces están disponibles.
C) Fragmento de anticuerpo
Un "anticuerpo" se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulinas o fragmentos de genes de inmunoglobulinas. Los genes de inmunoglobulinas reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que, a su vez, definen la clases de inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Se sabe que la unidad estructural básica de inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipéptidicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena variable ligera (V_{L}) y cadena variable pesada (V_{H}) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas, respectivamente.
Los anticuerpos pueden existir como inmunoglobulinas intactas, o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos mediante digestión con diversas peptidasas. En particular, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región de bisagra para producir F(ab)'_{2}, un dímero de Fab que, en sí mismo, es una cadena ligera unida a V_{H}-C_{H}1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'_{2} puede reducirse bajo condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región de bisagra convirtiendo con ello el dímero F(ab)'_{2} en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con una parte de la región de bisagra (véase Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993) para más terminologías de fragmentos de anticuerpos). Aunque el dominio Fab' se define en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la técnica apreciará que estos fragmentos Fab' pueden sintetizarse de novo de modo químico, o utilizando una metodología de ADN recombinante. En términos generales, la región Fab' de un anticuerpo es un monómero que comprende las regiones variables y la región C_{H}1 de un brazo de un anticuerpo.
Las regiones Fab' utilizadas en la presente invención pueden derivarse de anticuerpos de animales (en especial de ratón o rata) o tener origen humano, o pueden ser quiméricos (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984), incorporándose ambos como referencia en la presente), o humanizados (Jones et al., Nature, 321, 522-525 (1986), y la solicitud de Patente del Reino Unido publicada nº 8707252, incorporándose ambos como referencia en la presente).
La región Fab' se selecciona para unirse de forma específica al receptor HER2. El cáncer de mama se caracteriza por la sobreexpresión del receptor HER2 (c-erbB-2, neu) codificado por un protooncogén.
Se apreciará que no es necesario que el marcador característico (el receptor HER2) sea un marcador que aparece en la naturaleza, sino que puede introducirse en la célula diana concreta. Esto puede lograrse mediante el marcaje directo de una célula o tejido con el marcador (por ejemplo, inyectando directamente el marcador en el tejido diana concreto) o, como alternativa, administrando al organismo entero un marcador que es incorporado de forma selectiva por el tejido. En una realización, el marcador puede ser un producto génico que es codificado por un ácido nucleico en un módulo de expresión. El gen marcador puede estar bajo el control de un promotor que es activo sólo en las células diana concretas. Por tanto, la introducción de un vector que contiene el módulo de expresión producirá la expresión del marcador sólo en las células diana concretas. Un experto en la técnica reconocerá que existen numerosos enfoques que utilizan la metodología del ADN recombinante para introducir marcadores característicos en células
diana.
Los inmunoliposomas de la presente invención pueden prepararse mediante la incorporación del fragmento de anticuerpo en los liposomas por medio de una diversidad de técnicas muy conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, un Fab' conjugado con biotina puede unirse a un liposoma que contiene una estreptavidina. Como alternativa, el Fab' biotinilado puede conjugarse con un liposoma derivatizado con biotina mediante un conector de avidina o estreptavidina. Así, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biotinilado se biotinila y se une a liposomas que contienen fosfatidiletanolamina biotinilada mediante un conector de avidina (véase, por ejemplo, Ahmad et al., Cancer Res., 52:4817-4820 (1992)). De forma típica, se utilizan de aproximadamente 30 a 125, y de forma más típica de aproximadamente 50 a 100 moléculas de Fab' por liposoma.
En una realización preferida, el resto de transporte dirigido puede conjugarse directamente con el liposoma. Estos medios de conjugación directa son muy conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, G. Gregoriadis (1984), "Liposome Technology", CRC Press, Boca Ratón, Florida, y D.D. Lasic, "Liposomes: from physics to applications" (1993), Elsevier, Amsterdam, N.Y.. Se prefiere particularmente la conjugación a través de un enlace tioéter. Esto puede lograrse haciendo reaccionar el anticuerpo con un lípido derivatizado con maleimida, como fosfatidiletanolamina derivatizada con maleimida (M-PE) o dipalmitoiletanolamina derivatizada con maleimida (M-DEP). Este enfoque se describe en detalle en Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982), que se incorpora como referencia en la presente.
En otra realización preferida, el resto de transporte dirigido (por ejemplo, el fragmento Fab') puede unirse al polímero hidrofílico (por ejemplo, un PEG). Los medios para unir las moléculas de transporte dirigido a los conectores de polímeros son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, el capítulo 4 de Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch y Lennox, eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1995); y Blume et al., Biochem. Biophys. Acta, 1149:180-184 (1993)). En una realización particularmente preferida, un fragmento Fab' se une a un PEG derivatizado con maleimida a través del grupo -SII del Fab'. Para proporcionar un grupo conector, se sintetiza un \alpha-diestearoilfosfatidiletanolaminocarbonil-\omega-malimidopropionilamidopolietilenglicol a partir de diestearoilfosfatidiletanolamina y un derivado de PEG heterobifuncional, N-hidroxisuccinimidil-PEG-maleimida, según métodos convencionales. El derivado de maleimida de PEG-PE se incluye en la preparación de liposomas como se describe anterior y posteriormente, y el fragmento Fab' puede conjugarse con el liposoma mediante el grupo sulfhidrilo a pH 7,2.
Preparación de los liposomas
Una diversidad de métodos están disponibles para preparar liposomas como se describe, por ejemplo, en Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467 (1980); Patentes de EE.UU. n^{os} 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, 4.946.787; publicación PCT nº WO 91/17424; Szoka y Papahadjopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4194-4198 (1978); Deamer y Bangham, Biochim. Biophys. Acta, 443:629-634 (1976); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3348-3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta, 812:55-65 (1985); Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta, 858:161-168 (1986); Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:242-246 (1988); el texto Liposomes, Marc J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1983, capítulo 1; y Hope et al., Chem. Phys. Lip., 40:89 (1986). Los métodos adecuados incluyen, por ejemplo, sonicación, extrusión, alta presión/homogeneización, microfluidización, diálisis de detergentes, fusión inducida por calcio de vesículas de liposomas pequeños, y métodos de infusión de éter, siendo todos bien conocidos en la técnica. Un método produce vesículas multilaminares de tamaños heterogéneos. En este método, los lípidos formadores de vesículas se disuelven en un disolvente orgánico adecuado o sistema de disolvente, y se seca al vacío o en un gas inerte para formar una película fina de lípidos. Si se desea, la película puede redisolverse en un disolvente adecuado, como butanol terciario, y después liofilizarse para formar una mezcla de lípidos más homogénea, que está en una forma de tipo polvo que se hidrata con más facilidad. Esta película se cubre con una disolución tamponada acuosa y se deja hidratar, de forma típica a lo largo de un periodo de 15-60 minutos con agitación. La distribución de tamaño de las vesículas multilaminares resultantes puede desplazarse hacia tamaños más pequeños hidratando los lípidos bajo condiciones de agitación más vigorosas, o añadiendo detergentes solubilizantes, como desoxicolato.
En una realización preferida, se producen liposomas multilaminares mediante el método de la evaporación en fase inversa de Szoka y Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4194-4198 (1978).
Las vesículas unilaminares se preparan, en general, mediante sonicación o extrusión. La sonicación se realiza, en general, con un sonificador con punta, como un sonificador con punta Branson, en un baño de hielo. De forma típica, la suspensión se somete a varios ciclos de sonicación. La extrusión puede realizarse mediante extrusores de biomembranas, como el extrusor de biomembrana Lipex. El tamaño de poro definido en los filtros de extrusión puede generar vesículas liposómicas unilaminares de tamaños específicos. Los liposomas también pueden formarse mediante extrusión a través de un filtro cerámico asimétrico, como un microfiltro Ceraflow, disponible en el mercado en the Norton Company, Worcester, MA.
Después de la preparación de los liposomas, los liposomas que no se han ajustado al tamaño durante la formación pueden ajustarse al tamaño para lograr un intervalo de tamaño deseado y una distribución de tamaño relativamente estrecha de los liposomas. Un intervalo de tamaño de aproximadamente 0,2-0,4 micras permite que la suspensión de liposomas se esterilice mediante filtración a través de un filtro convencional, de forma típica un filtro de 0,22 micras. El método de esterilización mediante filtración puede realizarse con una base de alta transferencia si los liposomas se han ajustado a un tamaño disminuyéndolo hasta aproximadamente 0,2-0,4 micras.
Varias técnicas están disponibles para ajustar el tamaño de los liposomas hasta el tamaño deseado. Un método de ajuste de tamaño se describe en la Patente de EE.UU. n^{os} 4.529.561 o 4.737.323. La sonicación de una suspensión de liposomas mediante sonicación de sonda o baño produce una reducción de tamaño progresiva hasta lograr vesículas unilaminares pequeñas con un tamaño menor que aproximadamente 0,05 micras. La homogeneización de otro método que se basa en la energía de cizallamiento para fragmentar liposomas grandes para producir liposomas más pequeños. En un procedimiento de homogeneización típica, se recirculan vesículas multilaminares a través de un homogeneizador de emulsión convencional hasta que se observan los tamaños de liposomas seleccionados, de forma típica entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micras. El tamaño de las vesículas liposómicas puede determinarse mediante dispersión de luz cuasieléctrica (QELS), como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng.¸10:421-450 (1981). El diámetro medio de los liposomas puede reducirse mediante sonicación de los liposomas formados. Pueden alternarse ciclos de sonicación intermitentes con el evaluación mediante QELS para guiar una síntesis eficaz de liposomas.
La extrusión de los liposomas a través de una membrana de policarbonato de poros pequeños o una membrana cerámica asimétrica también es un método eficaz para reducir el tamaño de los liposomas hasta una distribución de tamaño relativamente bien definida. De modo típico, la suspensión se cicla a través de la membrana una o más veces hasta que se logra la distribución de tamaño deseada de los liposomas. Los liposomas pueden extrusionarse a través de membranas de poros sucesivamente menores para lograr una reducción gradual del tamaño de los liposomas. Para su utilización en la presente invención, los liposomas tienen un tamaño de aproximadamente 0,05 micras a aproximadamente 0,15 micras. Los liposomas más preferidos tienen un tamaño de aproximadamente 0,05 a 0,5 micras.
Contenido de los inmunoliposomas
El agente terapéutico que puede utilizarse es cualquier compuesto incluyendo los listados a continuación, que puede atraparse de forma estable en liposomas con un factor de carga adecuado, y que puede administrarse a una dosis terapéuticamente eficaz (indicada a continuación entre paréntesis después de cada compuesto, m^{2} se refiere a superficie específica corporal). Éstos incluyen compuestos antitumorales anfipáticos, como los alcaloides vegetales vincristina (1,4 mg/m^{2}), vinblastina (4-18 mg/m^{2}) y etopósido (35-100 mg/m^{2}), y los antibióticos de antraciclina, incluyendo doxorrubicina (60-75 mg/m^{2}), epirrubicina (60-120 mg/m^{2}) y daunorrubicina (25-45 mg/m^{2}). En este contexto también son útiles los antimetabolitos solubles en agua, como metotrexato (3 mg/m^{2}), arabinósido de citosina (100 mg/m^{2}) y fluorouracilo (10-15 mg/kg), los antibióticos, como bleomicina (10-20 unidades/m^{2}), mitomicina (20 mg/m^{2}), plicamicina (25-30 \mug/m^{2}) y dactinomicina (15 \mug/m^{2}), y los agentes alquilantes, incluyendo ciclofosfamidas y sus derivados (3-25 mg/kg), tiotepa (0,3-0,4 mg/kg) y BCNU (150-200 mg/m^{2}). Otros fármacos adecuados incluyen aclacinomicina, idarrubicina, mitoxantrona, cisplatina y otros análogos de platino II. Los liposomas también pueden contener taxanos, incluyendo taxol, taxótero, dihidroxitaxanos, camptotecinas y otros derivados y aislados de taxano. Además, los liposomas pueden contener péptidos terapéuticos contra tumores encapsulados (por ejemplo, toxinas derivadas de plantas o bacterias) y fármacos proteicos, como IL-2 y/o TNF, y/o inmunomoduladores, como M-CSF, que están presentes por sí solos o en combinación con fármacos antitumorales, como fármacos de antibióticos de antraciclina. Los inmunoliposomas pueden contener nucleósidos o bases de pirimidina y purina fluorados. Los inmunoliposomas también pueden contener ácidos nucleicos, como oligonucleótidos que contienen bases naturales o modificadas, y que tienen un enlace fosfodiéster internucleotídico o enlaces internucleotídicos modificados, como enlaces fosforotioato o poliamida. Un experto en la técnica reconocerá que los ácidos nucleicos pueden utilizarse como moléculas antisentido o formadoras de tríplex para bloquear la transcripción y traducción mediante su unión al ADN o ARN. Como alternativa, los ácidos nucleicos pueden utilizarse para transformar células y para inducir la expresión de proteínas heterólogas. En este último contexto, el ácido nucleico comprenderá un módulo de expresión que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína que se va a expresar bajo el control de un promotor.
Carga de las composiciones terapéuticas en los inmunoliposomas
Los métodos para cargar fármacos convencionales en liposomas son muy conocidos por los expertos en la técnica. Los métodos más habituales incluyen una técnica de encapsulación y el método de carga de potencial transmembrana. En la técnica de encapsulación, el fármaco se coloca en el tampón a partir del cual se forman los liposomas. Este último método se ha descrito en detalle en la Patente de EE.UU. nº 4.885.172, la Patente de EE.UU. nº 5.059.421, y la Patente de EE.UU. nº 5.171.578.
De forma breve, el método de carga de potencial transmembrana puede utilizarse fundamentalmente con cualquier fármaco convencional que pueda existir en un estado cargado cuando se disuelve en un medio acuoso apropiado. Preferiblemente, el fármaco será relativamente lipofílico de forma que se reparta en las membranas de los liposomas. Se crea un potencial transmembrana a través de las bicapas de los liposomas o los conjugados de liposomas con restos de transporte dirigido, y el fármaco se carga en el liposoma mediante el potencial transmembrana. El potencial transmembrana se genera creando un gradiente de concentración para una o más especies cargadas (por ejemplo, Na^{+}, K^{+} y/o H^{+}) a través de las membranas. Este gradiente de concentración se genera mediante la producción de liposomas o conjugados de liposomas con restos de transporte dirigido que tienen diferentes medios internos y externos. Así, para un fármaco que tiene carga positiva cuando se ioniza, se crea un potencial transmembrana a través de las membranas que tiene un potencial interno que es negativo en relación con el potencial externo, mientras que para un fármaco con carga negativa se utiliza la orientación opuesta.
Ensayo de la semivida sanguínea
Uno de los requerimientos para la localización de liposomas en un tejido diana es una vida larga del inmunoliposoma en la corriente sanguínea después de su administración. Una medida de la vida del inmunoliposoma en la corriente sanguínea es la proporción sangre/RES determinada en un momento seleccionado después de la administración del liposoma. De modo típico, los inmunoliposomas que contienen un marcador (por ejemplo, un marcador fluorescente, un reactivo denso a electrones o un marcador radiactivo) interno al liposoma o unido a un lípido que forma el liposoma, se inyectan en el organismo de ensayo. Un periodo de tiempo fijado después el organismo se sacrifica, y la cantidad de marcador detectado en la sangre (por ejemplo, midiendo la luminiscencia o mediante recuento de centelleo) se compara con la encontrada en tejidos concretos (por ejemplo, hígado o bazo).
El tiempo de retención de los inmunoliposomas en la sangre también puede determinarse de forma sencilla tomando muestras sanguíneas a intervalos fijos después de la administración de los liposomas que contienen el marcador, y determinando la cantidad de marcador que permanece en la circulación. El resultado puede expresarse como la fracción de la dosis original.
Ensayo de la captación hacia el citoplasma de células dianas y determinación de la distribución tisular
La captación e internalización de inmunoliposomas hacia el citoplasma de células diana puede determinarse, de forma similar, mediante la administración de los inmunoliposomas que contienen un marcador (por ejemplo, un marcador fluorescente, un reactivo denso a electrones o un marcador radiactivo) y posteriormente detectar la presencia o ausencia de ese marcador en el citoplasma de la célula diana. Por ejemplo, un inmunoliposoma que contiene un marcador fluorescente, como rodamina conjugada al lípido que constituye el liposoma en sí mismo, puede administrarse al organismo, o simplemente a células en un cultivo. Los tejidos o células entonces pueden fijarse y detectarse la fluorescencia utilizando microscopía de fluorescencia. De modo similar, un marcador denso a electrones (por ejemplo, oro) puede utilizarse y detectarse empleando microscopía electrónica. Un experto en la técnica reconocerá que muchos marcadores son adecuados, y que el método de detección reflejará la elección del marcador.
Ensayo de la actividad antiproliferativa de los inmunoliposomas
La presente invención proporciona inmunoliposomas inhibidores del crecimiento que tienen un fragmento de anticuerpo que se une de forma específica a un receptor HER2. La identificación de inmunoliposomas que son inhibidores particularmente eficaces de la proliferación celular puede lograrse con una selección rutinaria. Esto implica proporcionar un cultivo celular en el que las células portan un receptor HER2, poner en contacto las células en el cultivo con el inmunoliposoma que se va a ensayar, y medir el cambio resultante en la velocidad de proliferación celular. Los medios para medir la velocidad de proliferación celular son muy conocidos por los expertos en la técnica.
En un enfoque, por ejemplo, la velocidad de proliferación puede evaluarse directamente midiendo el cambio en el número real de células a lo largo de un periodo de tiempo fijado. Así, como se ilustra en el ejemplo 3, células tumorales como células SK-BK-3 o BT-474 se cultivan en cultivos de monocapa y después se incuban a 37ºC con diversas concentraciones de inmunoliposomas basadas en el contenido en anticuerpos. Después de un tratamiento continuo durante 4 días, las monocapas celulares se lavaron con PBS y se tiñeron con tinte de violeta cristal (al 0,5% en metanol) para la determinación de la proliferación relativa como se describió previamente (Hudziak et al., Mol. Cell Biol., 9:1165-1172 (1989), que se incorpora como referencia en la presente).
Como alternativa, se sabe que los aumentos en la velocidad de proliferación celular vienen acompañados, de modo típico, por aumentos en la velocidad metabólica. Por tanto, la proliferación puede evaluarse de modo indirecto midiendo los cambios en la velocidad metabólica de células expuestas al inmunoliposoma que se va a ensayar. Los expertos en la técnica conocen numerosos medios para medir la velocidad metabólica. Un enfoque particularmente preferido es medir la velocidad de captación de un precursor metabólico marcado, como timidina tritiada. De modo breve, esto se logra mediante la administración de [^{3}H]-timidina a un cultivo de ensayo que contiene el inmunoliposoma y a un cultivo control que carece del inmunoliposoma. Después de un periodo de tiempo fijado, las células se recogen y se mide la cantidad de [^{3}H]-timidina captada por las células, utilizando técnicas convencionales (por ejemplo, recuento de centelleo). La comparación de las células de ensayo y control indica los cambios en la actividad metabólica y, por tanto, la velocidad de proliferación.
Composiciones farmacéuticas
Se preparan composiciones farmacéuticas que comprenden los inmunoliposomas de la invención según técnicas convencionales y comprenden, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En general, se empleará disolución salina normal como vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, agua, agua tamponada, disolución salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares, incluyendo glicoproteínas para potenciar la estabilidad, como albúmina, lipoproteínas, globulina, etc. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales muy conocidas. Las disoluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso, o filtrarse bajo condiciones asépticas y liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una disolución acuosa estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a condiciones fisiológicas, como agentes tamponantes y de ajuste del pH, agentes para ajustar la tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. Además, la suspensión de liposomas puede incluir agentes protectores de lípidos que protegen a los lípidos contra los daños provocados por radicales libres y los daños peroxidativos a los lípidos durante su conservación. Son adecuados captadores de radicales libres lipofílicos, como alfatocoferol, y quelantes específicos de hierro solubles en agua, como ferrioxamina.
La concentración de inmunoliposomas en las formulaciones farmacéuticas puede variar en gran medida, es decir, desde menos de aproximadamente 0,05%, normalmente a 2-5% o al menos aproximadamente a 2-5%, hasta 10% a 30% en peso, y se seleccionará principalmente según los volúmenes de fluido, viscosidades, etc., según la vía de administración concreta seleccionada. Por ejemplo, la concentración puede aumentarse para disminuir la carga de fluido asociada al tratamiento. Esto puede resultar particularmente deseable en pacientes que tienen insuficiencia cardíaca congestiva asociada a aterosclerosis o hipertensión grave. Como alternativa, los inmunoliposomas compuestos de lípidos irritantes pueden diluirse hasta concentraciones bajas para disminuir la inflamación en el sitio de la administración. La cantidad de inmunoliposomas administrada dependerá del fragmento de anticuerpo concreto utilizado, el estado de enfermedad que se está tratando, el agente terapéutico que se está administrando, y el criterio del médico. En general, la cantidad de inmunoliposomas administrada será suficiente para transportar una dosis terapéuticamente eficaz del agente farmacológico concreto. La cantidad de inmunoliposomas necesaria para transportar una dosis terapéuticamente eficaz puede determinarse mediante los ensayos de captación como se describió anteriormente. Las dosificaciones terapéuticamente eficaces para diversos agentes farmacológicos son muy conocidas por los expertos en la técnica, y se ofrecieron anteriormente unos intervalos representativos para una serie de agentes farmacéuticos. Las dosificaciones de inmunoliposomas típicas estarán, en general, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal.
Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía parenteral, es decir, por vía intraarticular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Más preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa o intraperitoneal mediante una inyección en embolada. Las formulaciones particulares que son adecuados para este uso se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia, PA, 17ª ed. (1985). De forma típica, las formulaciones comprenderán una disolución de los liposomas suspendidos en un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Puede utilizarse una diversidad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, disolución salina isotónica al 0,9% y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización conocidas convencionales, o pueden esterilizarse mediante filtración. Las disoluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso tal cual, o pueden liofilizarse, combinándose la preparación liofilizada con una disolución acuosa estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes tamponantes y de ajuste del pH, agentes para ajustar la tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.
Ejemplos
La invención se ilustra mediante los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se ofrecen como ilustración, pero no limitan la presente invención.
Ejemplo 1 Preparación de liposomas e inmunoliposomas A) Materiales
La fosfatidilcolina de huevo (EPC) se obtuvo en Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL); el colesterol (Col) en Calbiochem (San Diego, CA); el ácido N-tris[hidroximetil]-2-aminoetansulfónico (TES) en Sigma; la fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) en Natterman (Colonia, FRG); los fosfolípidos marcados con rodamina en Avanti; el mesilato de desferrioxamina (desferal) en Ciba-Geigy (Summit, NJ); la doxorrubicina en Farmitalia, Carlo Erba (Milán, Italia) o en Cetus (Emeryville, CA); y la N-[4-p-maleimidofenil)butiril]fosfatidiletanolamina (M-PE) en Molecular Probes (Portland, OR). La fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (M_{r} = 1900) (PEG-PE) se sintetizó como se describe (Allen
et al., Biochim. Biophys. Acta, 1066:29-36 (1991)), y se obtuvo en Liposome Technology, Inc. (Menlo Park, CA).
B) Preparación de los fragmentos Fab'
Las secuencias rhuMAbHER2 clonadas para la cadena pesada y ligera se coexpresaron en E. coli como se describió previamente (Carter et al., Biotechnology, 10:163-167 (1992)). El fragmento del anticuerpo, rhuMAbHER2-Fab', se recuperó de las pastas de fermentación de E. coli mediante cromatografía de afinidad con proteína G estreptocócica (Carter et al., Biotechnology, 10:163-167 (1992), produciendo, de forma típica, un Fab' que contiene 60-90% de tiol libre reducido (Fab'-SH). Como control se utilizó un Fab' humanizado irrelevante. Derivado de un anticuerpo monoclonal anti-CD 18 murino, el rhuMAbH52-Fab' se diferencia de rhuMAbHER2-Fab' sólo por la sustitución de los bucles de unión al antígeno, y no mostró unión detectable a ningún antígeno murino o humano conocido (Eigenbort et al., Proteins: Structure, Function, and Genetics, 18:49-62 (1994)).
C) Preparación de los liposomas
Se prepararon liposomas según el método de evaporación en fase inversa (Szoka y Papahadjopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4194-4198 (1978)), con una composición de lípidos que incluye EPC:Col (2:1) o, cuando se indica, HSPC:Col (3:2) y PEG-PE (al 0-6% molar). Los liposomas posteriormente se extrusionaron repetidamente a presión positiva con argón gaseoso a través de filtros de membrana de policarbonato de tamaño de poro definido de manera secuencial de 0,1 a 0,05 \mum (Olson et al., Biochim. Biophys. Acta, 55:9-23 (1979); Szoka et al., Biochim. Biophys. Acta, 601:559-571 (1980)). Este procedimiento produce liposomas con un diámetro de 60-120 nm según se determina mediante dispersión de luz dinámica. Se determinó la concentración de liposomas mediante un ensayo de fosfato (Bartlett, J. Biol. Chem., 234:466-468 (1959)). Para las preparaciones de inmunoliposomas se incluyó M-PE al 2% molar (de fosfolípidos totales) en la mezcla de lípidos en cloroformo, antes de la preparación de los liposomas (Martin y Papahadjopoulos, J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982)). Los liposomas sin doxorrubicina encapsulada se prepararon en tampón HEPES-NaCl, pH 7,2, 300 mOsm. Los liposomas HSPC/Col que contienen doxorrubicina se prepararon en sulfato de amonio 250 mM que contiene desferal 1 mM a pH 5,5. El sulfato de amonio sin encapsular se retiró mediante filtración en gel con G-75 Sephadex. Entonces la doxorrubicina en forma de polvo se disolvió en esta suspensión de liposomas a 0,1 mg de doxorrubicina/\mumol de fosfolípidos (Papahadjopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:11460-11464 (1991); Huang et al., Cancer Res., 52:6774-6781 (1992)), que atrapa la doxorrubicina dentro del espacio interior del liposoma (Lasic et al., FEBS Lett., 312:255-258 (1992)). La eficacia de la carga del fármaco mediante un gradiente salino es alta, y alcanzó > 99% de carga cuando se utilizó 1 mg de fármaco por 10 \mumol de fosfolípidos.
El Fab' se conjugó con los liposomas después de la carga del fármaco mediante enlace tioéter, como se describió previamente (Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982). Puesto que la maleimida es más estable a pH más bajo, todos los procedimientos se realizaron a pH 5,5. El Fab' sin reaccionar se separó de los inmunoliposomas mediante filtración en gel con Sephacryl S-400. El grupo maleimida en los inmunoliposomas se desactivó después de la conjugación en un exceso de 2 veces de mecaptoetanol al M-PE. La cantidad de Fab' conjugado se determinó mediante un ensayo de proteína BioRad.
Se prepararon cuatro tipos de liposomas. Los liposomas "convencionales" sin anticuerpo estaban compuestos sólo de fosfatidilcolina y colesterol. Los liposomas "estéricamente estabilizados" contenían además PEG-PE. Los inmunoliposomas se prepararon mediante la conjugación de los anteriores con fragmentos Fab' derivados del anticuerpo humanizado rhuMAbHER2, para producir inmunoliposomas convencionales o estéricamente estabilizados. Se utilizaron fragmentos Fab', en lugar del anticuerpo intacto, por las siguientes razones: 1) los fragmentos rhuMAbHER2-Fab' pueden expresarse como proteínas recombinantes en E. coli con una eficacia muy alta (Carter et al., supra); 2) el grupo tiol libre en la región de bisagra de Fab' proporciona un sitio fácilmente disponible para la unión covalente a liposomas modificados, y está alejado del sitio de unión del antígeno; y 3) el rhuMAbHER2-Fab' tiene mucha menos actividad antiproliferativa que el rhuMAbHER2 intacto y, por tanto, resulta interesante saber si la unión de anti-p185^{HER2}-Fab' a los liposomas reconstituye esta actividad. De forma típica, la conjugación produce aproximadamente 50-100 moléculas de Fab' por partícula de liposoma.
Ejemplo 2 Unión de inmunoliposomas
Se evaluó la capacidad de inmunoliposomas anti-p185^{HER2} para unirse in vitro a células de cáncer de mama que sobreexpresan el receptor p185^{HER2} mediante dos métodos: un ensayo citométrico de flujo y un ensayo de unión competitiva. Para el ensayo citométrico de flujo, células SK-BR-3, que expresan niveles altos de p185^{HER2}, o células MCF-7, se expusieron a inmunoliposomas anti-p185^{HER2} durante 45 minutos en hielo, se lavaron con PBS, se tiñeron con un anticuerpo anti-humano secundario para detectar los inmunoliposomas unidos (anti-IgG humana de cabra marcado con FITC), se volvieron a lavar con PBS, y después se sometieron a una citometría de flujo (Figura 1). Las células SK-BR-3 unieron cantidades significativas de inmunoliposomas anti-p185^{HER2} convencionales o estéricamente estabilizados, pero no los liposomas control que carecen de Fab'. Las células de cáncer de mama MCF-7, que no sobreexpresan p185^{HER2}, mostraron una unión mínima a los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} (los datos no se muestran).
Se obtuvo otra medida de la unión mediante un ensayo de unión competitiva, en el que células SK-BR-3 (células de cáncer de mama) o células BT-474 en cultivos de monocapa se incubaron de forma simultánea con rhuMAbHER2 o muMAb4D5 marcados con ^{125}I, a 0,1 nM durante 18 horas a 4ºC, y con concentraciones crecientes de inmunoliposomas anti-p185^{HER2} (Figura 2). Se determinaron las cuentas unidas mediante gamma-recuento. Los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} desplazaron de forma eficaz la unión de rhuMAbHER2 a las células SK-BR-3 (los datos no se muestran) y a las células BT-474 (que también expresan niveles altos de p185^{HER2}). Una aproximación a la afinidad de unión se obtuvo mediante un análisis de Scatchard de los datos de unión, asumiendo que el Fab' en los inmunoliposomas se comporta como un ligando libre. Utilizando este modelo, las constantes de unión aparente para los inmunoliposomas son comparables a las de rhuMAbHER2-Fab' libre (es decir, no liposómico) o rhuMAbHER2 intacto. Los liposomas control convencionales o estéricamente estabilizados (PEG-PE al 6% molar) que carece de Fab' mostraron una unión insignificante. En la Tabla 1 aparece un resumen de los datos de unión.
TABLA 1 Unión de inmunoliposomas anti-p185^{HER2} a células BT-474
Ligando K_{d} aparente (nM) EC_{50} (nM)
Liposomas control, convencionales No hay desplazamiento > 1000
Liposomas control, estéricamente estabilizados 2500 > 1000
Inmunoliposomas anti-p185^{HER2}, convencionales 9 15
Inmunoliposomas anti-p185^{HER2}, estéricamente estabilizados 58 78
rhuMAbHER2-Fab' 22 30
rhuMAbHER2 1 2
Ejemplo 3 Actividad antiproliferativa de inmunoliposomas "inhibidores del crecimiento"
Para ensayar la actividad antiproliferativa de los inmunoliposomas por sí solos, sin fármacos encapsulados, se cultivaron células tumorales, como SK-BR-3 o BT-474 en cultivos de monocapa y después se incubaron a 37ºC con diversas concentraciones de inmunoliposomas basándose en el contenido en anticuerpos. Después de un tratamiento continuo durante 4 días, las monocapas celulares se lavaron con PBS y se tiñeron con tinte de violeta cristal (al 0,5% en metanol) para la determinación de la proliferación relativa como se describió previamente (Hudziak et al., Mol. Cell Biol., 9:1165-1172 (1989)).
Aunque el rhuMAbHER2 intacto (bivalente) inhibía el crecimiento de las células de cáncer de mama que sobreexpresan p185^{HER2} en cultivos de monocapa, los fragmentos Fab' monovalentes de este anticuerpo (rhuMAbHER2-Fab') son mucho menos eficaces para inhibir el crecimiento (O'Connell et al., pp. 218-239 en Protein Folding In Vivo and In Vitro, Cleland, J.L., ed., Washington, D.C., American Chemical Society (1993)). Esta observación sugiere que la reticulación de los receptores p185^{HER2} por el anticuerpo bivalente es importante para el efecto antiproliferativo, y plantea la pregunta de si el anclaje liposómico de los fragmentos rhuMAbHER2-Fab' puede mejorar la actividad antiproliferativa de Fab' mediante el aumento de la valencia eficaz.
El efecto de los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} sobre las células SK-BR-3 en cultivos de monocapa se ensayó y se comparó con rhuMAbHER2 y rhuMAbHER2-Fab' (Figura 3). El tratamiento con liposomas control convencionales o estéricamente estabilizados que carecen de Fab' no afectó significativamente al crecimiento celular. Por contraste, los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} convencionales y estéricamente estabilizados inhibían el crecimiento de una manera dependiente de la dosis. El efecto inhibidor del crecimiento de los inmunoliposomas alcanzó una meseta de inhibición del crecimiento de aproximadamente 30% (70% de control del crecimiento), aproximándose a la inhibición del crecimiento de 40% observada con rhuMAbHER2 intacto libre. Por contraste rhuMAbHER2-Fab' indujo sólo una modesta inhibición del crecimiento. También se obtuvieron resultados similares con células de cáncer de mama BT-474 que sobreexpresan p185^{HER2} (los datos no se muestran).
Resulta notable que rhuMAbHER2-Fab' asociado a liposomas produce un efecto antiproliferativo mucho mayor que la misma cantidad de rhuMAbHER2-Fab' libre en disolución. Una explicación plausible es que el anclaje liposómico de rhuMAbHER2-Fab' permite la reticulación de p185^{HER2}, produciendo, con ello, una actividad biológica que es comparable a la del anticuerpo bivalente intacto.
Ejemplo 4 Citotoxicidad de inmunoliposomas anti-p185^{HER2} que contienen doxorrubicina
Aunque los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} vacíos muestra una actividad antiproliferativa contra células de cáncer de mama que sobreexpresan p185^{HER2} en cultivo, es posible aumentar en gran medida el efecto antineoplásico de los inmunoliposomas cargándolos con agentes citotóxicos, produciendo con ello un sistema de transporte de fármaco dirigido. Se utilizó doxorrubicina porque las pruebas preclínicas y clínicas sugieren que la doxorrubicina puede ser particularmente útil contra cánceres de mama que sobreexpresan p185^{HER2}, con o sin inmunoterapia concomitante. Por tanto, resulta interesante evaluar la citotoxicidad y especificidad de los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} cargados con doxorrubicina contra células de cáncer de mama que sobreexpresan p185^{HER2}, y contra células no malignas que no sobreexpresan p185^{HER2}.
Debido a la internalización eficaz mostrada por los inmunoliposomas p185^{HER2} (véase el ejemplo 5), se espera que los liposomas puedan ser tan eficaces para matar las células de cáncer de mama que sobreexpresan p185^{HER2} en cultivo como la doxorrubicina libre, una pequeña molécula anfipática (PM 544) que pasa con facilidad a través de la membrana celular. Por otra parte, las células que no sobreexpresan p185^{HER2}, aunque son susceptibles a la doxorrubicina libre, escapan a los daños citotóxicos producidos por los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} cargados con doxorrubicina debido a la incapacidad de los inmunoliposomas de dirigirse a ellas.
Para ensayar la citotoxicidad de los inmunoliposomas cargados con doxorrubicina, se cultivaron células SK-BR-3 o WI-38 en cultivos de monocapas con doxorrubicina libre o con inmunoliposomas cargados con doxorrubicina durante una hora, y después se lavaron a fondo con medio. Las células se volvieron a incubar a 37ºC durante 3 días, después de lo cual se estimó el número de células mediante tinción con violeta cristal como se describió anteriormente. La comparación con otros ensayos de crecimiento celular, que incluyen la tinción con azul alamar, la tinción con MTT, y el recuento directo de células, produjo esencialmente los mismos resultados.
El resultado de las células SK-BR-3 tratadas durante una hora con diversas preparaciones de inmunoliposomas cargados con doxorrubicina se muestra en la Figura 4. Bajo estas condiciones, el efecto antiproliferativo de rhuMAbHER2 no resulta evidente, puesto que requiere la exposición continua de las células a rhuMAbHER2 (Hudziak et al., Mol. Cell. Biol., 9:1165-1172 (1989)). Un tratamiento con doxorrubicina libre durante una hora produjo una citotoxicidad significativa con una IC_{50} de aproximadamente 0,3 \mug/ml. Los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} cargados con doxorrubicina muestran una citotoxicidad comparable dependiente de la dosis, con una IC_{50} de aproximadamente 0,2 \mug/ml para inmunoliposomas anti-p185^{HER2} convencionales, y aproximadamente 1,0 \mug/ml para inmunoliposomas anti-p185^{HER2} estéricamente estabilizados (PEG-PE al 2% molar). Estos resultados indican que el transporte de doxorrubicina por inmunoliposomas anti-p185^{HER2} hacia células que sobreexpresan p185^{HER2} en cultivo es un proceso tan eficaz como la difusión rápida de doxorrubicina libre hacia las células. Los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} cargados con doxorrubicina eran de 10 a 30 veces más citotóxicos que los inmunoliposomas cargados con doxorrubicina que portan Fab' irrelevantes, que sólo afectan al crecimiento celular a concentraciones relativamente altas (< 3,3 \mug/ml).
También se trataron células WI-38, una línea celular de fibroblastos pulmonares no maligna que expresa niveles mínimos de p185^{HER2}, con doxorrubicina y con inmunoliposomas anti-p185^{HER2} cargados con doxorrubicina (Figura 4B). La doxorrubicina libre, de nuevo, produjo una citotoxicidad significativa dependiente de la dosis contra células WI-38. Sin embargo, los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} cargados con doxorrubicina producían una citotoxicidad mucho más reducida (20 veces menor) contra estas células, y son indistinguibles de los inmunoliposomas cargados con doxorrubicina que portan Fab' irrelevantes. Estos resultados demuestran la especificidad del tratamiento con inmunoliposomas anti-p185^{HER2} de dianas que sobreexpresan p185^{HER2}, y también confirma que la citotoxicidad observada contra células SK-BR-3 no es simplemente debida a las filtraciones de doxorrubicina desde inmunoliposomas anti-p185^{HER2} hacia la disolución.
Ejemplo 5 Internalización de inmunoliposomas hacia el citoplasma de la célula diana
Para evaluar la internalización de inmunoliposomas hacia el citoplasma de la célula diana mediante un ensayo microscópico de fluorescencia, se prepararon liposomas e inmunoliposomas como se describe en el ejemplo 1 con la adición de rodamina-fosfatidiletanolamina al 1% molar de los componentes fosfolipídicos. Los liposomas o inmunoliposomas marcados con rodamina resultantes se incubaron durante diversas cantidades de tiempo a 37ºC con células SK-BR-3 cultivadas hasta la subconfluencia en portas. Las células entonces se fijaron con paraformaldehído al 3%, se montaron en glicerol al 90%/Tris 100 mM, pH 8,5, que contiene p-fenilendiamina al 0,1% (Sigma) como reactivo de antiblanqueamiento, y se observaron con un microscopio de fluorescencia Leitz Aristoplan, o un microscopio confocal Molecular Dynamics MultiProbe 2001.
Para evaluar la internalización y disposición intracelular mediante microscopía electrónica, los inmunoliposomas se cargaron con partículas de oro coloidal de 5-15 nm, como se describió previamente (Huang et al., Cancer Res., 52:5135-5143 (1992); Straubinger et al., Cell, 32:10639-1079 (1983)). Los inmunoliposomas que contienen oro se incubaron a 37ºC con células SK-BR-3 cultivadas en portas durante diversas cantidades de tiempo, y las células entonces se fijaron y se procesaron para la microscopía electrónica. La estabilización de los liposomas se logró utilizando ácido tánnico en la fijación primaria (Straubinger et al., supra), que proporcionó una conservación adecuada, aunque no óptima, de la ultraestructura.
El anticuerpo rhuMAbHER2 fue internalizado con rapidez por las células tumorales que sobreexpresan p185^{HER2} a través de endocitosis mediada por receptores (Sarup et al., Growth Regul., 1:72-82 (1991)). Para evaluar si los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} se internalizan en las células SK-BR-3, las células se trataron con inmunoliposomas marcados con rodamina durante diferentes intervalos de tiempo, se fijaron y se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia. Las células SK-BR-3 tratadas con liposomas control convencionales o estéricamente estabilizados que carecen de Fab' no muestran fluorescencia de rodamina superficial o interna, lo cual es coherente con la incapacidad de los liposomas control para unirse a estas células. Cuando se tratan con inmunoliposomas anti-p185^{HER2} convencionales, las células SK-BR-3 muestra intensos focos de fluorescencia en la superficie celular e intracelularmente en los primeros 30 minutos del tratamiento. La microscopía de fluorescencia confocal confirmó que la fluorescencia de rodamina estaba presente en la superficie celular y también internalizada dentro del citoplasma de las células SK-BR-3. Por contraste, el tratamiento con inmunoliposomas anti-p185^{HER2} estéricamente estabilizados que contienen concentraciones elevadas de PEG-PE (al 6% molar) produjo una fluorescencia intracelular mínima después de 30 minutos. Debido a que parecía que la presencia de PEG-PE retrasa la internalización de los inmunoliposomas, se evaluaron los inmunoliposomas estéricamente estabilizados que contienen concentraciones reducidas de PEG-PE. Los inmunoliposomas que contienen PEG-PE al 2% molar produjeron un grado intermedio de fluorescencia intracelular después de 30 minutos, es decir, menor que la observada con inmunoliposomas convencionales, pero mayor que la observada con inmunoliposomas que contienen PEG-PE al 6% molar. A pesar de su internalización algo retrasada, los inmunoliposomas estéricamente estabilizados que contienen PEG-PE al 2% sí se acumularon intracelularmente con un mayor tiempo de incubación, como de 2 horas. Por tanto, mientras que los inmunoliposomas anti-p185^{HER2} se internalizaron en las células SK-BR-3, la velocidad de internalización estaba inversamente relacionada con el contenido de PEG-PE de los inmunoliposomas.
Para estudiar la disposición intracelular de los inmunoliposomas y sus contenidos, se realizó una microscopía electrónica utilizando inmunoliposomas que contienen partículas de oro coloidal encapsuladas. Las células SK-BR-3 tratadas con inmunoliposomas anti-p185^{HER2} convencionales durante 30 minutos mostraron numerosos inmunoliposomas que contienen oro unidos a la superficie celular y presentes intracelularmente. Muchos inmunoliposomas se observaron cercanos, y aparentemente unidos, a la membrana celular. Algunos inmunoliposomas se encontraron en huecos revestidos, así como dentro de vesículas revestidas, endosomas, cuerpos multivesiculares y lisosomas. Esta distribución intracelular resulta coherente con la internalización a través de la vía de huecos revestidos. Sin embargo, también se observaron inmunoliposomas aparentemente fundidos con la membrana celular, sin formación de huecos revestidos. Además, algunas partículas de oro aparecían libres en el citoplasma, no asociadas con una cápsula liposómica o un orgánulo unido a la membrana. Las partículas de oro libres dentro del citoplasma pueden ser el resultado de acontecimientos de fusión entre los inmunoliposomas y la membrana celular. Como alternativa, pueden haber surgido tras una endocitosis, habiéndose producido el escape desde las partículas de oro encapsuladas en algún momento a lo largo de la vía de huecos revestidos.
Ejemplo 6 Biodistribución y localización tumoral in vivo de inmunoliposomas y contenidos de los inmunoliposomas
Ratones SCID jóvenes (4-6 semanas) hembra fueron inyectados con células BT-474 en el tejido subcutáneo del flanco o en la almohadilla de grasa mamaria, y también se trataron con gránulos de estrógeno implantados por vía subcutánea para apoyar el crecimiento tumorigénico de estas células. Cuando los tumores palpables alcanzaron un tamaño de al menos 300 mm^{2} (de forma típica a los 14 días después de la inoculación) se administraron inmunoliposomas mediante una única inyección intravenosa (a través de la vena de la cola) o una única inyección intraperitoneal, en un volumen de aproximadamente 200 \mul que contiene aproximadamente 1 \mumol de lípidos totales. Los animales se sacrificaron en momentos determinados después de la inyección, los órganos se prefusionaron con disolución salina in situ, y los tejidos se retiraron inmediatamente para su análisis. Para el análisis de biodistribución y formación de imágenes después de la inyección de inmunoliposomas marcados con rodamina, los tejidos recién retirados se fijaron y se estudiaron mediante microscopía de fluorescencia confocal. Para la localización cuantitativa de la doxorrubicina transportada por los inmunoliposomas, los tejidos retirados se homogeneizaron y se sometieron a una extracción con etanol acidificada; la doxorrubicina extraída entonces se midió mediante ensayo espectrofluorimétrico como se describió previamente (Gabizon et al., J. Natl. Cancer Inst., 81:1484-1488 (1989)).
La biodistribución de inmunoliposomas anti-p185^{HER2} y su capacidad para localizar y acumularse dentro de tumores in vivo se evaluó en un modelo de xenotransplante de tumor. En este modelo, ratones inmunodeficientes que portan xenotransplantes de tumor BT-474 subcutáneos establecidos se trataron con inmunoliposomas mediante una única inyección intravenosa o intraperitoneal. Se realizaron estudios de formación de imágenes con microscopía de fluorescencia confocal para detectar los inmunoliposomas marcados con rodamina dentro de diversos tejidos de animales sacrificados después del tratamiento. A las 6 horas de la inyección intravenosa se visualizó fluorescencia de rodamina dentro del tumor xenotransplantado, mientras que no se observó fluorescencia significativa dentro del músculo circundante. Esta técnica, sin embargo, no permite la delineación precisa de inmunoliposomas dentro del tejido tumoral. Para una evaluación cuantitativa de la biodistribución y localización de la doxorrubicina transportada por los inmunoliposomas, la doxorrubicina se ensayó en extractos de tejidos de animales tratados. Veinticuatro horas después de la inyección intraperitoneal, la doxorrubicina transportada por inmunoliposomas anti-p185^{HER2} estéricamente estabilizados se había acumulado dentro de los xenotransplantes de tumores, encontrándose unos niveles menores de doxorrubicina en el músculo alrededor y en sangre (Tabla 2).
TABLA 2 Transporte de doxorrubicina por inmunoliposomas anti-p185^{HER2} in vivo: biodistribución 24 horas después de una única inyección intraperitoneal
Tejido/fluido Nivel de doxorrubicina (% de dosis inyectada/g de tejido
Tumor 1,64
Músculo 0,61
Hígado 13,46
Sangre ventricular 0,88
Proporción tumor/músculo 2,69
Proporción tumor/sangre 1,88
Ejemplo 5 Preparación de inmunoliposomas que portan Fab' en PEG
Para mejorar el transporte específico y la internalización de los inmunoliposomas de esta invención, se conjugaron fragmentos Fab' específicos de tumores (rhuMAbHER2-Fab') a los extremos distales de cadenas de polietilenglicol injertadas en liposomas, a través de grupos maleimida reactivos a sulfhidrilo. Para proporcionar el grupo conector (maleimida) para la reacción de SII con Fab', se sintetizó \alpha-diestearoil-fosfatidiletanolaminocarbonil-\omega-malimidopropionilamidopolietilenglicol a partir de diestearoilfosfatidiletanolamina y un derivado de PEG heterobifuncional (N-hidroxisuccinimidil-PEG-maleimida) según métodos convencionales. El derivado de maleimida de PEG-PE se incluye en la preparación de liposomas como se describió anteriormente, y el fragmento Fab' se conjugó con el liposoma mediante el grupo sulfhidrilo a pH 7,2.
La composición de liposomas es como se describió anteriormente, excepto que se eliminó la M-PE, puesto que ya no era necesaria para la unión al fragmento de anticuerpo. De forma típica, el PEG (PEG-PE) varía de aproximadamente 10% a aproximadamente 12% molar de fosfolípidos totales, y el lípido derivatizado con PEG conjugado a Fab' varía de aproximadamente 0,6% a aproximadamente 1% molar de lípidos totales.
En el cultivo de células de cáncer de mama que sobreexpresan HER, estos liposomas estéricamente estabilizados anti-HER2 presentaban la misma eficacia de unión e internalización, independientemente de la cantidad de fosfolípido modificado con polietilenglicol.

Claims (14)

1. Un inmunoliposoma que se internaliza en una célula que porta el receptor HER2 del factor del crecimiento, comprendiendo dicho inmunoliposoma:
un fragmento de anticuerpo que se une de forma específica al receptor HER2, estando dicho fragmento unido a un polímero hidrofílico;
un lípido formador de vesículas anfipático, formando dicho lípido formador de vesícula un liposoma;
otro polímero hidrofílico;
en el que cuando dicho inmunoliposoma se pone en contacto con dicha célula, dicho inmunoliposoma se internaliza en dicha célula.
2. El inmunoliposoma de la reivindicación 1, en el que dicho polímero hidrofílico es un lípido derivatizado con polietilenglicol (PEG).
3. El inmunoliposoma de la reivindicación 2, en el que dicho polietilenglicol tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 750 D y 5000 D.
4. El inmunoliposoma de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el fragmento de anticuerpo es un dominio Fab'.
5. El inmunoliposoma de la reivindicación 4, en el que dicho dominio Fab' es un dominio Fab' humanizado de un anticuerpo monoclonal.
6. El inmunoliposoma de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho lípido formador de vesículas se selecciona de un fosfolípido, un glicolípido, un esfingolípido y un esterol.
7. El inmunoliposoma de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende un agente terapéutico.
8. El inmunoliposoma de la reivindicación 7, en el que dicho agente terapéutico se selecciona de daunomicina, idarrubicina, mitoxantrona, mitomicina, cisplatina y otros análogos de platino II, vincristina, epirrubicina, aclacinomicina, metotrexato, etopósido, doxorrubicina, arabinósido de citosina, fluorouracilo y otras pirimidinas, purinas o nucleósidos fluorados, bleomicina, mitomicina, plicamicina, dactinomicina, ciclofosfamida y sus derivados, tiotepa, BCNU, taxol, taxótero y otros derivados y aislados de taxano, camptotecinas, polipéptidos, un ácido nucleico, un ácido nucleico que tiene un enlace fosforotioato internucleotídico, y un ácido nucleico que tiene un enlace poliamida internucleotídico.
9. El inmunoliposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que dicho fragmento de anticuerpo se une al extremo terminal distal de diestearoilfosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (DSPE).
10. El inmunoliposoma de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polímero hidrofílico está presente en una cantidad de hasta 3,6% molar de lípidos totales.
11. El inmunoliposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, para su utilización en un método para internalizar el agente terapéutico en la célula que porta el receptor HER2, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con el inmunoliposoma, en el que dicho contacto da como resultado la internalización de dicho agente en dicha célula.
12. El inmunoliposoma de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su utilización en un método para inhibir el crecimiento de la célula que porta el receptor HER2 poniendo en contacto la célula con el inmunoliposoma.
13. El uso del inmunoliposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la fabricación de un medicamento para inhibir el crecimiento de la célula que porta el receptor HER2.
14. Una composición farmacéutica que comprende el inmunoliposoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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