MX2007013200A - Composicion de inmunoliposoma para el direccionamiento hacia un receptor de la celula her2. - Google Patents

Composicion de inmunoliposoma para el direccionamiento hacia un receptor de la celula her2.

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Abstract

Se describe una composicion de inmunoliposoma comprendida de liposomas que contienen un ligando para el direccionamiento a las celulas que expresan un receptor del factor de crecimiento, tal como HER2; la union del inmunoliposoma a las celulas que expresan HER2 resulta en la internalizacion de inmunoliposoma para la administracion citoplasmica de un farmaco atrapado.

Description

COMPOSICIÓN DE SNMUNOL-PQSOMA PARA EL DIRECCIONAM1ENTQ HACIA UN RECEPTOR DE LA CÉLULA HER2 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una composición de liposoma. En particular, de invención se refiere a liposomas dirigidos hacia un receptor celular específico para la administración a la célula de un fármaco atrapado por el liposoma.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los liposomas son vesículas esféricas comprendidas de bicapas concéntricamente ordenadas que encapsulan una fase acuosa. Los líposomas sirven como un vehículo para administración de agentes terapéuticos contenidos en la fase acuosa o en las bicapas lípídícas. La administración de fármacos en forma atrapada por el liposoma puede proveer una variedad de ventajas, dependiendo del fármaco, incluyendo, por ejemplo, una toxicidad disminuida del fármaco, farmacocinéticas alteradas, o solubilidad mejorada del fármaco. Cuando los liposomas se formulan para incluir un revestimiento de superficie de cadenas polimérícas hidrófilas, denominado Stealth® o liposomas de larga circulación, ofrecen la ventaja adicional de un largo tiempo de vida en circulación sanguínea, debido en parte a la remoción reducida de los liposomas por el sistema de fagocito mononuclear. Frecuentemente es necesario un tiempo de vida extendido con el objeto de que los liposomas alcancen su región objetivo deseado o célula a partir del sitio de la inyección. Los liposomas dirigidos tienen ligandos direccionadores o porciones de afinidad unidas a la superficie de los liposomas. Los ligandos direccionadores pueden ser anticuerpos o fragmentos de los mismos, en cuyo caso los liposomas se refieren como inmunoliposomas. Cuando se administran sistémicamente los liposomas dirigidos suministran el agente terapéutico atrapado a un tejido blanco, región o, célula. Debido a que los liposomas dirigidos se dirigen a una región específica o célula, el tejido sano no se expone al agente terapéutico. Dichos lígandos dirigidos se pueden unir directamente a las superficies de los liposomas mediante acoplamiento covalente del ligando dirigido hacia los residuos del grupo que la cabeza polar de los componentes de lípido liposomal (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,013,556). Sin embargo, este método es principalmente adecuado para liposomas que carecen de cadenas polimé cas unidas a la superficie, puesto que las cadenas poliméricas intervienen con la interacción entre el ligando direccionador y su blanco pretendido (Klibanov, A.L., et al., Biochim. Biophys. Acta., 1062: 142-148 (1991 ); Hansen, C. B., et al., Biochim. Biophys. Acta., 1239: 133-144 (1995)). Alternativamente, los ligandos direccíonadores se pueden unir a los extremos libres de las cadenas poliméricas formando el revestimiento de superficie sobre los liposomas (Alien, T. M., et al., Biochim. Biophys. Acta., 1237: 99-108 (1995); Blume, G. et al., Biochim. Biophys. Acta., 1149: 180-184 (1993)). En este método, el ligando direccionador se expone y está disponible fácilmente para interacción con el blanco pretendido. El protoncogén HER2 (c-erbB2, neu) y p185HER2, el receptor del factor de crecimiento-tirosina cinasa que codifica, parecen desempeñar un papel en la patogénesis de muchos cánceres de humano. La sobreproducción de p185HER2 se presenten 20- 30% de los cánceres de mama, y predice un pronóstico malo de estos pacientes (Park, J.W. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 92: 1327 (1995)). El receptor p185HER2 es un blanco atractivo para una terapia basada en anticuerpo, puesto que cuando se presenta, generalmente ocurre la sobre expresión de P185HRE2 de manera homogénea en los tumores de mama primarios, aunque se expresa solamente a bajos niveles en ciertas células epiteliales normales. Se ha desarrollado un anticuerpo monoclonal de murino anti-p185, muAb4D5, y una versión humanizada de este anticuerpo, trastuzumab (Cárter, P. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 89: 4285 (1992); Patente de E.U.A. No. 5,677,171 ). También se han descrito diversos anticuerpos que se unen a P185HER2 (WO 99/55367). Se han reportado los liposomas que contienen un anticuerpo específico para el receptor HER2 (Park, J.W. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 92: 1327 (1995); Park, J.W. et al., J. Controlled Reléase, 74: 95 (2001 ); Nielsen, U.B. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1591 : 109 (2002); Patente de E.U.A. No. 6,214,388). Se describe una relación evidente entre el número de anticuerpos por liposoma, por ejemplo, densidad del anticuerpo, sobre el grado de unión y toma celular (Nielsen, U.B. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1591 : 109 (2002). Los resultados de ese estudio indican que la variación de la densidad de anticuerpos sobre la superficie de liposoma de 0 a 30 corresponde a un incremento en la toma celular, lo cual alcanza un máxima de 30 anticuerpos por liposoma. Al incrementar el número de anticuerpos anti-HER2 de 30 a 100 por liposoma no se incrementa la toma celular de los liposomas. La efectividad de un tratamiento para el cáncer se relaciona directamente con la capacidad del tratamiento para dirigirse y para eliminar las células cancerosas a la vez que se afectan tan pocas células sanas como sea posible. Aunque el concepto de direccionamiento de un fármaco de manera específica hacia una célula tumoral se ha discutido ampliamente, permanece una necesidad para una formulación que sea altamente selectiva para ciertas células cancerosas y que se diseña para la unión óptima a dichas ciertas células cancerosas. Se pretende que los ejemplos precedentes de la técnica relacionada y limitaciones relacionadas con los mismos sean ilustrativos y no exclusivos. Otras limitaciones de la técnica relacionada serán evidentes a aquellos expertos en la técnica después de una lectura de la especificación y un estudio de los dibujos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA BNVENC-ON En un aspecto, se describe una composición, la composición comprendiendo liposomas comprendidos de (i) lípidos formadores de vesículas; (¡i) un lipopolímero; (iii) un conjugado del anticuerpo receptor anti-HER2 que comprende una porción hidrófoba, un polímero hidrófilo; y (iv) un fármaco atrapado. La cantidad de conjugado está presente en una cantidad efectiva para proveer más de aproximadamente 2 anticuerpos por liposoma, en promedio, y menos de aproximadamente 25 anticuerpos por liposoma, en promedio. En una modalidad, el anticuerpo tiene un peso molecular de entre 5,000-50,000 Daltones, más preferiblemente de entre 10,000-50,000, e incluso más preferiblemente de entre 10,000-30,000. En otra modalidad, en anticuerpo tiene un peso molecular de menos de 100,000 Daltones, más preferiblemente de menos de aproximadamente 35,000 Daltones, e incluso más preferiblemente de menos de 30,000 Daltones. En otra modalidad, el anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80%, preferiblemente al menos aproximadamente 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90%, de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, el polímero hidrófilo es polietilenglicol de tiene un peso molecular de entre 75-5000 Daltones.
En otra modalidad, el fármaco atrapado es un fármaco citotóxico. En incluso otra modalidad, el fármaco atrapado es un agente anti-tumoral. Un fármaco atrapado ejemplar es antraciclina, tal como doxorubicina. En otra modalidad, la cantidad de conjugado provee menos de aproximadamente 20 anticuerpos por liposoma, en promedio, 48 horas después de la administración in vivo. En otro aspecto, se provee una formulación de ¡nmunoliposoma, la formulación comprendiendo liposomas comprendidos de (i) al menos un lípido que forma una vesícula rígida; (ii) un lipopolímero comprendido de una porción hidrófoba y polietilenglicol; (iii) un conjugado comprendido de una porción hidrófoba, polietilenglicol, y un anticuerpo de cadena sencilla antireceptor Her-2 que tiene al menos 80% de identidad con SEQ ID NO: 2, y (iv) un fármaco atrapado que tiene actividad anti-tumoral. Los liposomas se caracterizan por una cantidad de conjugado efectiva para proveer más de aproximadamente 2 y menos de aproximadamente 15 anticuerpos por liposoma 96 horas después de la administración in vivo. En una modalidad, el lípido que forma una vesícula rígida es fosfatidílcolina hidrogenada de soya. En otra modalidad, los liposomas comprenden adicionalmente colesterol. En incluso otro aspecto, se describe una formulación de inmunoliposoma, la formulación comprendiendo liposomas comprendidos de (i) al menos un lípido que forma una vesícula rígida; (ii) un lipopolímero comprendido de una porción hidrófoba y polietilenglicol; (iíi) un conjugado comprendido de una porción hidrófoba, polietilenglicol, y un anticuerpo de cadena sencilla anti-receptor Her-2 que tiene la identidad de SEQ ID NO: 2; y (¡v) un fármaco atrapado que tiene actividad anti-tumoral. La formulación de inmunoliposoma cuando se administra in vivo provee un área bajo la curva que es mayor que o no mayor de 25% menor que el área bajo la curva de los liposomas comprendidos por componentes similares pero que carecen del anticuerpo. En una modalidad, la cantidad del conjugado provee menos de aproximadamente 20 anticuerpos por liposoma, en promedio, 48 horas después de la administración ¡n vivo. En otra modalidad, la cantidad de conjugado provee menos de aproximadamente 15 anticuerpos por liposoma, en promedio, 96 horas después de la administración in vivo. En incluso otra modalidad, la cantidad de conjugado provee más de dos anticuerpos por líposoma, en promedio, 48 horas después de la administración in vivo y menos de aproximadamente 20 anticuerpos por liposoma, en promedio, 48 horas después de la administración in vivo. En incluso otro aspecto, se describe una formulación de inmunoliposoma, en donde la formulación comprende liposomas comprendidos de (i) al menos un lípido que forma una vesícula rígida; (ii) opcionalmente, un lipopolímero comprendido de una porción hidrófoba y polietilenglicol; (iii) un conjugado comprendido de una porción hidrófoba, polietilenglicol, y un anticuerpo de cadena sencilla anti-receptor Her-2 que tiene al menos 80% de identidad con SEQ ID NO: 2; y (iv) un fármaco atrapado que tiene actividad anti-tumoral. La composición se caracteriza por la característica de que 96 horas después de la administración de los inmunoliposomas, entre 30-60% de los anticuerpos se disocian a partir de cada liposoma para provee una composición, 96 horas después de la administración in vivo que tiene menos de aproximadamente 25 anticuerpos por liposoma. En incluso otro aspecto, se describe una composición de liposoma preparada de conformidad con cierto procedimiento, el procedimiento estando comprendido de (a) la provisión de liposomas, que opcionalmente tienen una cubierta externa de cadenas poliméricas hidrófilas y/o un fármaco atrapado; (b) incubar los liposomas con una cantidad de conjugado comprendido de una porción hidrófoba, polietilenglicol, y un anticuerpo de cadena sencilla anti-receptor Her-2 que tiene al menos 80% de identidad con SEQ ID NO: 2; y la cantidad de conjugado siendo seleccionada para proveer (i) más de dos anticuerpos por liposoma en promedio 96 horas después de la administración in vivo; (ii) menos de 150 anticuerpos por liposoma en promedio; y/o (iií) menos de aproximadamente 15 anticuerpos por liposoma en promedio 96 horas después de la administración in vivo. En una modalidad, la cantidad de conjugado provee 12 o menos, alternativamente 10 o menos, alternativamente 8 o menos, anticuerpos por liposoma en promedio.
En otro aspecto, se describe una composición, la composición comprendiendo liposomas como se describió anteriormente, pero en donde los liposomas antes de la administración in vivo tienen menos de 25 anticuerpos por liposoma y después de la administración in vivo, los liposomas pierden entre aproximadamente 20-50% de los anticuerpos aunque retienen la unión al receptor Her-2 suficiente para la citotoxícidad. En incluso otro aspecto, se provee un método para preparar una composición de inmunoliposoma. El método comprende proveer inmunolíposomas comprendidos de (i) lípídos que forman una vesícula; (ii) opcionalmente, un lípopolímero; (iii) un conjugado comprendido de una porción hidrófoba, un polímero hidrófilo, y un anticuerpo que tiene afinidad de unión por un blanco, tal como un dominio extracelular de un receptor Her-2; y (iv) un fármaco atrapado. El conjugado se incluyó en la composición en una primera cantidad suficiente para proveer un primer número seleccionado de anticuerpos por liposoma. Los liposomas se ponen en contacto con la sangre, in vitro o in vivo, y se determina el número de anticuerpos por liposoma en una o más puntos del tiempo después del contacto de los liposomas con la sangre, por ejemplo mediante una técnica analítica adecuada tal como cromatografía. Basándose en la determinación del número de anticuerpos en un primer punto de tiempo seleccionado después del contacto con la sangre, se selecciona una segunda cantidad de conjugado suficiente para proveer un segundo número más elevado de anticuerpos por liposoma con el objeto de proveer al menos dos anticuerpos por liposoma después del contacto con la sangre en ese punto de tiempo. En una modalidad, el método incluye la selección de una segunda cantidad de conjugado efectiva para proveer menos de 50 anticuerpos por líposoma. En otra modalidad, se selecciona una segunda cantidad de conjugado efectiva para proveer 30 o menos anticuerpos por líposoma. En otra modalidad, el método incluye proveer liposomas que tienen una primera cantidad de conjugado que provee menos de 150 anticuerpos por liposoma, más preferiblemente 100 o menos anticuerpos por liposoma, e incluso más preferiblemente 75 o menos anticuerpos por liposoma. Además de los aspectos ejemplares y modalidades anteriormente descritas, serán evidentes aspectos adicionales y modalidades por referencia los dibujos y por el estudio de las siguientes descripciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1A muestra la viabilidad celular, expresada como un porcentaje de las células control no tratadas, como una función de la concentración de doxorubicína, en µg/mL, después de 10 minutos de exposición a la doxorubicina administrada como fármaco libre (triángulos), atrapada en liposomas (círculos), o atrapada en inmunoliposomas que contienen 2 (círculos), 5 (cuadros), 7.5 (diamantes), o 15 (triángulos) anticuerpos por liposoma; La figura 1 B muestra la viabilidad celular, expresada como un porcentaje de las células control no tratadas, como una función de la concentración de doxorubicina, en µg/mL, después de cuatro horas de exposición a la doxorubicina administrada como fármaco libre (diamantes), atrapada en liposomas (triángulos), o atrapada en inmunoliposomas que contienen 7.5 (símbolos X), 15 (símbolos *), 30 (círculos), o 45 (cuadros) anticuerpos por liposoma; Las figuras 2A-2H muestran los perfiles de elución de scFv radiomarcados (125l) a partir de inmunoliposomas que tienen 15 anticuerpos scFv por liposoma a partir de las alícuotas removidas durante la incubación de los inmunoliposomas en plasma de humano, las alícuotas removidas a tiempos de 0 horas (figura 2A), 1 hora (figura 2B), 4 horas (figura 2C), 8 horas (figura 2D), 24 horas (figura 2E), 48 horas (figura 2F), 72 horas (figura 2G), y 96 horas (figura 2H); La figura 3A muestra la disociación del anticuerpo scFv marcado con 125l a partir de formulaciones de ¡nmunoliposoma que tienen relaciones de anticuerpo/liposoma de 7.5:1 (diamantes), 15:1 (cuadros), 30:1 (círculos), 45:1 (triángulos), y 90:1 (*) como una función del tiempo de incubación, en horas, en plasma humano in vitro; La figura 3B muestra el porcentaje de marca 125l remanente en los inmunoliposomas que tienen relaciones de anticuerpo/liposoma de 7.5:1 (diamantes), 15:1 (cuadros), 30:1 (círculos), 45:1 (triángulos), y 90:1 (*) como una función del tiempo de incubación, en horas, en plasma de humano in vitro; La figura 4A muestra el porcentaje de anticuerpo radiomarcado disociado a partir de la formulación del inmunoliposoma que tiene 15 anticuerpos por liposoma en dos diferentes estudios (diamantes, cuadros) como una función del tiempo de incubación, en horas, en plasma de humano in vitro; La figura 4B muestra el porcentaje de anticuerpo radiomarcado remanente en los inmunoliposomas (diamantes) y disociados a partir de los inmunoliposomas (cuadros) a partir de la formulación de inmunoliposoma que tiene 15 anticuerpos por liposoma como una función del tiempo de incubación, en horas, en plasma de humano; La figura 5A muestra el porcentaje de anticuerpo scFv marcado con 125l recuperado en la fracción liposomal de las muestras de plasma como una función del tiempo, en horas, después de la administración de una formulación de inmunolíposoma 15:1 a las ratas; La figura 5B muestra la concentración de anticuerpo scFv marcado con 125l, en ng/mL, recuperado en la fracción liposomal del plasma de rata después de la separación sobre la columna de Sepharose CL-4B como una función del tiempo, en horas, después de la administración de una formulación de inmunoliposoma 15:1 a las ratas; La figura 5C muestra la concentración de anticuerpo scFv marcado con 125l, en ng/mL, recuperado en la fracción libre o plasmática de plasma de rata después de la separación sobre una columna de Sepharose CL-4B como una función del tiempo, en horas, después de la administración de una formulación de ¡nmunoliposoma 15:1 a las ratas; La figura 6A muestra el porcentaje de scFv marcado con 125l remanente en el plasma (diamantes), en la sangre (cuadros cerrados) y el porcentaje de doxorubicina en el plasma (triángulos) como una función del tiempo, en horas, después de la administración de una formulación de liposoma 15:1 a las ratas. También se muestra el porcentaje del anticuerpo scFv marcado con 125l en el plasma (círculos abiertos) y en la sangre (cuadros abiertos) como una función del tiempo, en horas, después de la administración como un conjugado libre a las ratas a una dosis de doxorubicina de 2 mg/kg; La figura 6B muestra la concentración plasmática de doxorubicina, en µg/mL, como una función del tiempo, en horas, después de la administración de una formulación de inmunoliposoma 15:1 a las ratas a una dosis de 2 mg/kg; La figura 7 es una gráfica de la relación del anticuerpo scFv marcado con 125l con respecto a la doxorubicína en la sangre, en ng/µg, como una función del tiempo, en horas, después de la administración de una formulación de ¡nmunoliposoma 15:1 a las ratas; La figura 8 es una gráfica de la concentración de doxorubicina en plasma, en µg/mL, como una función del tiempo, en horas, después de la administración in vivo de liposomas PEGilados que contienen doxorubicina (diamantes) o de inmunoliposomas que contienen 15 (cuadros), 75 (triángulos), 150 (x) o 300 (*) anticuerpos scFv por liposoma; Las figuras 9A-9B muestran el volumen tumoral, en relación porcentual con respecto al tamaño inicial del tumor, (figura 9A) y el porcentaje de cambio en el peso corporal (figura 9B) en ratones que contenían un xenoinjerto de tumor de mama y tratados con solución salina (círculos abiertos), liposomas PEGilados que contenían doxorubicina (cuadros abiertos) o inmunoliposomas que contenían 7.5 (diamantes), 15 (triángulos), 30 (cuadros cerrados), 45 (círculos cerrados) anticuerpos scFv por liposoma; La figura 10 es una gráfica del volumen tumoral relativo, tomado como un porcentaje del volumen tumoral inicial, como una función del tiempo, en días, en ratones que contienen un xenoinjerto de tumor de mama y que fueron tratados con solución salina (círculos abiertos), liposomas PEGilados que contenían doxorubicina a dosis de 2 mg/kg (cuadros abiertos) y 3 mg/kg (diamantes abiertos) o con una formulación de inmunoliposoma 15:1 a dosis de 2 mg/kg (cuadros cerrados), 3 mg/kg (diamantes cerrados) o 4 mg/kg (triángulos cerrados); La figura 11 es una gráfica de la concentración de doxorubicína en plasma, en ng/mL, como una función del tiempo, en horas, después de la administración intravenosa a los monos de doxorubicína (10 mg/ml) atrapada en inmunoliposomas que contenían 15 anticuerpos scFv por liposoma, en promedio, (círculos) o atrapada en liposomasPEGilados (cuadros); La figura 12A es una gráfica de la concentración de doxorubicina en plasma, en ng/mL, como una función del tiempo, en horas, después de la administración intravenosa a monos de doxorubicina atrapada en inmunoliposomas que contenían 15 anticuerpos scFv por liposoma, en promedio, la doxorubicina administrada a dosis de 1 mg/kg (círculos), 5 mg/kg (cuadros), y 10 mg/kg (triángulos); La figura 12B es una gráfica de la concentración del anticuerpo en plasma, en ng/mL, como una función del tiempo, en horas, después de la administración intravenosa a monos de doxorubicina atrapada en inmunoliposomas que contenían 15 anticuerpos scFv por liposoma, en promedio, los inmunoliposomas administrados a dosis de doxorubícina de 1 mg/kg (círculos), 5 mg/kg (cuadros), y 10 mg/kg (triángulos); La figura 13A es una gráfica de la relación de anticuerpo scFv/concentración de doxorubícina en plasma, en ng/µg, como una función del tiempo, en horas, después de la administración a monos de doxorubicina atrapada en inmunoliposomas que contenían 15 anticuerpos scFv por liposoma, en promedio, los inmunoliposomas administrados a dosis de doxorubicina de 1 mg/kg (diamantes), 5 mg/kg (cuadros), y 10 mg/kg (triángulos); La figura 13B es una gráfica de la relación de anticuerpo scFv/concentración de doxorubicina en plasma normalizado con respecto a la relación inicial de anticuerpo/doxorubicina, como una función del tiempo, en horas, después de la administración a monos de doxorubicína atrapada en inmunoliposomas que contenían 15 anticuerpos scFv por liposoma, en promedio, los inmunoliposomas administrados a dosis de doxorubicina de 1 mg/kg (diamantes), 5 mg/kg (cuadros), y 10 mg/kg (triángulos); y La figura 14A es una gráfica de la concentración de doxorubicina, en ng/mL, como una función del tiempo, en horas, después de la administración a monos de doxorubicina atrapada en inmunolíposomas que contenían 15 anticuerpos scFv por liposoma, en promedio, los inmunoliposomas administrados a dosis de doxorubícina de 0.5 mg/kg (cuadros), 2 mg/kg (triángulos), y 4 mg/kg (triángulos invertidos); La figura 14B es una gráfica de la concentración de doxorubicina, en ng/mL, como una función del tiempo, en horas, después de la administración a monos de doxorubicina atrapada en ¡nmunoliposomas que contenían 15 anticuerpos scFv por liposoma, en promedio, los ¡nmunoliposomas administrados a dosis de doxorubicina de 4 mg/kg seis veces durante un periodo de seis meses, los datos correspondiendo a la primera dosis (triángulos invertidos) y a la sexta dosis (cuadros); La figura 14C es una gráfica de la concentración de doxorubicina, en ng/mL, como una función del tiempo, en horas, después de la administración a monos de 4 mg/kg de doxorubicina en forma libre (triángulos), atrapada en liposomas PEGilados (DOXIL®; cuadros), o atrapada en ¡nmunoliposomas que contenían 15 anticuerpos scFv por liposoma, en promedio, (triángulos invertidos).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS La SEQ ID NO: 1 es la secuencia nucleotídica de un anticuerpo que tiene afinidad de unión para el dominio extracelular del receptor c-erb-B2, también referido en la presente invención como el receptor HER2 y el receptor p185HER2. La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) designado F5, que tiene la capacidad de unirse específicamente al dominio extracelular del receptor HER2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Definiciones A menos que se mencione de otra manera, el término "lípido que forma una vesícula" se refiere a cualquier lípído capaz de formar parte de una micela estable o composición de liposoma y típicamente incluye una o dos cadenas hidrófobas, de hidrocarburo o un grupo esteroide y puede contener un grupo químicamente reactivo, tal como una amina, ácido, éster, aldehido o alcohol, es un grupo de cabeza polar. Como se utiliza en la presente invención, un "anticuerpo" incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión al antígeno o cadena sencilla del mismo. Por lo tanto, el anticuerpo incluye cualquier proteína o péptido que contiene una molécula que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como pero no limitada a al menos una región determinante de la complementariedad (CDR - por sus siglas en inglés) o una cadena pesada o ligera o una porción de la misma para unión al ligando, una región variable de cadena pesada o de cadena ligera, una región constante de cadena pesada o de cadena ligera, una región de estructura base (FR - por sus siglas en inglés), o cualquier porción de la misma, o al menos una porción de una proteína de unión. El término "anticuerpo" se utiliza adicionalmente para comprender fragmentos de la digestión del anticuerpo, porciones especificadas y variantes de las mismas, incluyendo anticuerpos miméticos o que comprenden dominios de anticuerpos que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento especificado o porción del mismo, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla y fragmentos de los mismos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos para unión al antígeno que se unen a una proteína HER2 de mamífero la cual es un receptor del factor de crecimiento. Los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro de término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH; (ií) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab asociados mediante un puente disulfuro a la región de charnela; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo particular de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., Nature, 741 : 544-546 (1989)), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, éstos se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite el ser elaborados como una cadena proteica particular en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase por ejemplo, Bird et al. Science, 242: 423-426 (1988), Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 85: 5879-5883 (1988)). También se pretende que dichos anticuerpos de cadena sencilla sean comprendidos dentro de término anticuerpo. Estos anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la técnica, y los fragmentos se exploran para utilidad de la misma manera como se realiza con los anticuerpos intactos. Dichos fragmentos se pueden producir mediante escisión enzimática, técnicas sintéticas o recombinantes, como se conoce en la técnica y/o como se describe en la presente invención. Los anticuerpos también se pueden producir en una variedad de formas truncadas utilizando genes para anticuerpo en los cuales se han introducido uno o más codones de paro hacia el extremo 5' del sitio de paro natural. Por ejemplo, una porción del gen que codifica una porción de cadena pesada de F(ab')2 se puede diseñar para que incluya secuencias de ADN que codifican el dominio CH-i y/o la región de charnela de la cadena pesada. Las diversas porciones de anticuerpos se pueden unir juntas químicamente mediante técnicas convencionales, o se pueden preparar como una proteína contigua utilizando técnicas de ingeniería genética. Por "receptor HER2" y "p185HER2" se entiende la proteína codificada por el gen HER2 o ERRB2 (v-erb-b2, homólogo 2 del oncogén viral de la leucemia eritroblástica) y también se denomina el homólogo del oncogén derivado de neuro/glioblastoma; homólogo 2 del oncogén viral (v-erb-b2) de la leucemia eritroblástica aviar; homólogo 2 del oncogén viral de la leucemia eritroblástica aviar v-erb-b2 (homólogo del oncogén derivado de neuro/glioblastoma). El gen HER2/ERRB2 codifica un miembro de la familia de receptor del factor de crecimiento epidémico (EGF) del receptor de tirosina cinasas. La secuencia codificante para HER2 se proporciona por la secuencia de referencia NM_004448 cuyo producto de traducción se proporciona por NP_004439. El receptor HER2 no tiene dominio de unión al ligando por sí mismo y por lo tanto no se puede unir a los factores de crecimiento. Sin embargo, se une de manera estrecha a otros miembros de la familia del receptor EGF unidos por ligando para formar un heterodímero, estabilizando la unión al ligando y mejorando la activación mediada por cinasa de las rutas de señalización cascada abajo, tales como aquellas que incluyen la proteína cinasa activada por mitógeno y la fosfatidilinositol-3 cinasa. Las variaciones alélicas en las posiciones de aminoácidos 654 y 655 de la ¡soforma a (posiciones 624 y 625 de la isoforma b) se han reportado, con el alelo más común, Ile654/lle655. El procesamiento alternativo resulta en diversas variantes adicionales del transcrito, algunas codificando diferentes isoformas.
Todas las variantes alélicas y de procesamiento se incluyen en el significado de "receptor HER2". Un "anticuerpo para internalización" es un anticuerpo que, después de unirse a un receptor o a otro ligando sobre una superficie celular, se transporta dentro de la célula, por ejemplo, dentro de un lisozoma u otro organelo o dentro de citoplasma. El término "aislado" se refiere al material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan tal como se encuentra en su estado nativo. El término "idéntico" o "identidad" porcentual u "homología" porcentual en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o de nucleótidos que son los mismos, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima, como se mide mediante inspección visual o utilizando un algoritmo de computadora. Como se utiliza en la presente invención, el término "afinidad" de un anticuerpo se refiere a la constante de disociación, KD, el anticuerpo para un antígeno predeterminado. Los anticuerpos con alta afinidad tienen una KD de 10~8 M o menor, más preferiblemente 10~9 M o menor e incluso más preferiblemente 10"10 M o menor, para un antígeno predeterminado. Los términos "Kdis" o "KD", O "Kd" como se utilizan en la presente invención, se pretende que se refieren a la velocidad de disociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno. La "KD", es la relación de la velocidad de disociación (k2), también denominada la "velocidad de separación (k0ff)", con respecto a la relación de la velocidad de asociación (ki) o "velocidad de unión (kon)". Por lo tanto, KD es igual a k2/k1 o k0ff/k0n y se expresa como una concentración molar (M). Por lo tanto a menor KD, mayor unión. De manera que una KD de 10"6 M (o 1 µM) indica una unión débil en comparación con 10"9 M (o 1 nM). Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". Como se utiliza en la presente invención, "unión específica" y "que se une específicamente" se refieren a una unión del anticuerpo con un antígeno predeterminado con mayor afinidad que para otros antígenos o proteínas. Típicamente, el anticuerpo se une con una constante de disociación (KD) de 10"6 M o menor, y se une al antígeno predeterminado con una KD que es al menos dos veces menor que su KD para la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína, o cualquier otro polipéptido especificado) diferente al antígeno predeterminado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". Como se describe y se reclama en la presente invención, la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2 incluye "modificaciones conservativas de secuencia", por ejemplo, modificaciones de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos que no afectan o alteran de manera significativa las características de unión del anticuerpo codificado por la secuencia nucleotídica o que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservativas de secuencia incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y de aminoácidos. Las modificaciones se pueden introducir dentro de SEQ ID NO: 2 mediante técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como mutagénesis sitio dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen una en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, thptofano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, ¡soleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificación beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucína) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
II. Composición del liposoma En un aspecto, la invención se refiere a una composición de liposoma que comprende liposomas que incluyen como un ligando direccionador un anticuerpo que tiene especificidad de unión por un receptor HER2 del factor de crecimiento. En ligando direccionador HER2 se incorpora dentro de los liposomas en la forma de un conjugado de lípido-polímero-antícuerpo, también referido en la presente invención como un conjugado de lípido-polímero-ligando. Como se describirá a continuación, el anticuerpo tiene afinidad específica para el dominio externo de receptor HER2 y dirige los liposomas hacia las células que expresan el receptor HER2. Las siguientes secciones describen los componentes del liposoma, incluyendo los lípidos del liposoma y los agentes terapéuticos, preparación de los liposomas que contienen un ligando direccionador HER2, y métodos para utilizar la composición liposomal para tratamiento de los trastornos.
A. Componentes lípidos del liposoma Los liposomas adecuados para uso en la composición de la presente invención incluyen aquellos compuestos principalmente de lípídos que forman vesículas. Dicho lípido que forma vesículas es uno que puede formar espontáneamente vesículas en bícapa en el agua, como se ejemplifica por los fosfolípidos, con su porción hidrófoba en contacto con la región interior, hidrófoba de la membrana en bicapa, y su porción de grupo de cabeza orientado hacia el exterior, hacia la superficie polar de la membrana. Los lípidos capaces de ser incorporados de manera estable dentro de bicapas lipídicas, tales como el colesterol y sus diversos análogos, también se pueden utilizar en los liposomas. Los lípidos que forman vesículas preferiblemente son lípidos que tienen dos cadenas hidrocarburo, típicamente cadenas acílo, y un grupo de cabeza, ya sea polar o no polar. Existe una variedad de lípídos sintéticos que forman vesículas y de lípidos que forman vesículas que se presentan de manera natural, incluyendo los fosfolípidos tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidílinositol, y esfingomíelina, en donde las dos cadenas de hidrocarburo típicamente son de entre aproximadamente 14-22 átomos de carbono en longitud, y tienen grados variables de insaturación. Los lípídos anteriormente descritos y fosfolípídos cuyas cadenas de carbono tienen grados variables de saturación se pueden obtener comercialmente o preparar de conformidad con métodos publicados. Otros lípidos adecuados incluyen glicolípidos, cerebrósidos y esteróles, tal como colesterol. Los lípidos catiónicos también son adecuados para uso en los liposomas de la invención, en donde el lípído catíónico se puede incluir como un componente menor de la composición lipídica o como un componente principal o único. Dichos lípídos catiónicos típicamente tienen una porción lipófíla, tal como una cadena esterol, una cadena acilo o una cadena diacilo, y en donde el lípido tiene una carga neta positiva general. Preferiblemente, el grupo de cabeza del lípido porta la carga positiva. Los lípidos catiónicos ejemplares incluyen 1 ,2-dioleiloxi-3-(thmetilamino)propano (DOTAP); bromuro de N-[1 -(2,3,-ditetradeciloxi)propil]-N,N-dimetíl-N-hidrox¡etilamonio (DMRIE); bromuro de N-[1-(2,3,-dioleíloxi)propil]-N,N-dimet¡l-N-hidroxi etilamonio (DORIE); cloruro de N-[1-(2,3,-dioleiloxí)propil]-N,N,N-thmetilamonio (DOTMA); 3 [N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Col); y dimetildioctadecilamonio (DDAB). El lípido catiónico que forma la vesícula también puede ser un lípido neutral, tal como dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) o un lípido amfipático, tal como un fosfolípído, derivado con un lípído catiónico, tal como polilisina u otros lípidos de poliamina. Por ejemplo, el lípido neutral (DOPE) se puede derivar con polilisina para formar un lípído catiónico. El lípido que forma la vesícula se puede seleccionar para lograr un grado especificado de fluidez o de rigidez, para controlar la estabilidad del liposoma en suero, para controlar las condiciones efectivas para la inserción del conjugado direccionador, como se describirá, y/o para controlar la velocidad de liberación del agente atrapado en el liposoma. Los liposomas que tienen una bicapa lipídica más rígida, o una bicapa cristalina líquida, se logran mediante la incorporación de un lípido relativamente rígido, por ejemplo, un lípído que tiene una temperatura de transición de fase relativamente alta, por ejemplo, hasta 60°C. Los lípidos rígidos, por ejemplo, saturados, contribuyen a una mayor rigidez de la membrana en la bicapa lipídica. Otros lípidos componentes, tales como el colesterol, también se sabe que contribuyen a la rigidez de la membrana en las estructuras en bicapa lipídica.
Por otra parte, la fluidez del lípido se logra mediante la incorporación de un lipido relativamente fluido, típicamente uno que tiene una fase lipídica con una temperatura de transición de fase líquida hacia líquido-cristalina relativamente baja, por ejemplo, a o por debajo de la temperatura ambiente. Los liposomas también incluyen un lípido formador de una vesícula covalentemente unido a un polímero hidrófilo, también referido en la presente invención como un "lipopolímero". Como se ha descrito, por ejemplo en la Patente de E.U.A. No. 5,013,556, la inclusión de dicho lípido derivado de polímero en la composición del liposoma forma un revestimiento de superficie de cadenas poliméricas hidrófilas alrededor del liposoma. El revestimiento de superficie de cadenas poliméricas hidrófilas es efectivo para incrementar el tiempo de vida en circulación sanguínea in vivo de los liposomas cuando se compara con los líposomas que carecen de dicho revestimiento. Los lípidos que forman vesículas adecuados para la derivación con un polímero hidrófilo incluyen cualesquiera de aquellos lípidos anteriormente listados, y, en particular fosfolípidos, tales como diestearoil fosfatidiletanolamina (DSPE). Los polímeros hidrófilos adecuados para derivación con un lípido formador de vesícula incluyen polivínilpírrolidona, polivinilmetiléter, polímetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxípropiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxípropilmetacrilato, políhidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol, poliaspartamida y secuencias peptídicas hidrófilas. Los polímeros se pueden emplear como homopolímeros o como copolímeros en bloque o al azar. Una cadena polimérica hidrófila preferida es polietilenglicol (PEG), preferiblemente como una cadena PEG que tiene un peso molecular entre 500-10,000 Daltones, más preferiblemente entre 750-10,000 Daltones, incluso más preferiblemente entre 750-5000 Daltones. Los análogos de PEG metoxi o etoxi modificadas en el extremo también son preferiblemente polímeros hidrófilos, comercialmente disponibles en una variedad de tamaños poliméricos, por ejemplo, 120-20,000 Daltones. La preparación de lípidos formadores de vesícula derivados con polímeros hidrófilos se ha descrito, por ejemplo en la Patente de E.U.A. No. 5,395,619. La preparación de liposomas incluyendo dichos lípídos derivados también se descrito, en donde se incluyen típicamente entre 1-20 moles porcentuales de dicho lípído derivado en la formulación del liposoma (véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 5,013,556).
B. Anticuerpo direccionador La composición del liposoma también incluye un anticuerpo que dirige la partícula lipídica a una célula. En una modernidad, el anticuerpo se une específicamente al receptor HER2 sobre la superficie de una célula derivada de tumor. En otra modalidad, el anticuerpo comprende al menos un dominio de unión que se une específicamente al receptor HER2 sobre la superficie de una célula derivada de tumor. En una modalidad alterna, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla que comprende al menos un dominio de unión que se une específicamente al receptor HER2 sobre la superficie de una célula derivada de tumor. En una modalidad preferida, el anticuerpo para uso en la composición del liposoma anteriormente descrita es un anticuerpo de cadena sencilla que comprende al menos un dominio de unión que se une específicamente al receptor HER2 sobre la superficie de una célula derivada de tumor y tiene una secuencia identificada en la presente invención como SEQ ID NO: 2. La preparación de este anticuerpo se describe en WO 99/55367 y el anticuerpo se designó F5. El anticuerpo es un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que se une específicamente al dominio extracelular del producto proteico c-erb-B2 del oncogén HER2/neu, y también se refiere la presente invención como el anticuerpo anti-HER2, o un anticuerpo que tiene afinidad de unión para el receptor HER2. El anticuerpo F5 está comprendido de dominios variables del anticuerpo de humano conectados mediante una molécula enlazadora que contiene 251 aminoácidos con una cisteína terminal (peso molecular 27.6 kD), y tiene una afinidad de unión moderada por el HER2 (Kd = 150-300 nM o 1.5-3 X 10-7 M). El anticuerpo anti-HER2 de la invención se internaliza rápidamente dentro de las células que expresan el receptor HER2 en su superficie membranal. En una modalidad, el anticuerpo anti-HER2 tiene una secuencia que representa la sustitución conservativa con respecto a SEQ ID NO: 2.
C. Preparación del conjugado de lípido-polímero-anticuerpo Como se describió anteriormente, el anticuerpo anti-HER2 esta covalentemente unido al extremo distal libre de una cadena poliméríca hidrófila, que está unida en su extremo proximal a un lípído formador de vesícula. Existe una amplia variedad de técnicas para unir un polímero hidrófilo seleccionado a un lípido seleccionado y activar el extremo libre, no unido del polímero para reacción con un ligando seleccionado, y en particular, se ha estudiado ampliamente el polímero hidrófilo polietilenglicol (PEG) (Alien, T.M., et al., Biochemíca et Biophysica Acta, 237: 99-108 (1995), Zalipsky, S., Bioconjugate Chem., 4 (4): 296-299 (1993); Zalipsky, S., et al. FEBS Lett., 353: 71-74 (1994); Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chemistry, 6 (6): 705-708 (1995); Zalipsky, S., en STEALTH LIPOSOMES (D. Lansic y F. Martin, Eds.) capítulo 9, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995)). Generalmente, las cadenas de PEG son funcionalizadas para que contengan grupos reactivos adecuados para acoplamiento con, por ejemplo, sulfhidrílos, grupos amino, y aldehidos o cetonas (típicamente derivados a partir de la oxidación leve de las porciones carbohidrato de un anticuerpo) presentes en una amplia variedad de ligandos. Los ejemplos de dichos grupos reactivos PEG-terminales incluyen maleimida (para reacción con grupos sulfhidrilo), N-hidroxisuccinimida (NHS) o NHS-carbonato éster (para reacción con aminas primarias), hidrazida o hidrazina (para reacción con aldehidos o cetonas), iodoacetilo (preferiblemente reactivo con grupos sulfhidrilo) y ditiopiridina (tiol-reactivo). Los esquemas de reacción sintética para la activación de PEG con dichos grupos se establecen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,631 ,018, 5,527,528, 5,395,619, y las secciones relevantes que describen procedimientos de reacción sintética se incorporan expresamente en la presente invención como referencias. Un esquema de reacción sintética ejemplar se muestra en el esquema 1A y esquema 1 B. Los detalles de la reacción se proporcionan en la Patente de E.U.A. No. 6,326,353. Brevemente, el polietílenglicol (PEG) bis (amina) (compuesto I) se hace reaccionar con cloruro de 2-nitrobencensulfonilo para generar el producto monoprotegido (compuesto II). El compuesto II se hace reaccionar con carbonil diímidazol en trietilamina (TEA) para formar el carbamato de imidazol de la mono 2-nitrobencensulfonamida (compuesto lll). El compuesto lll se hace reaccionar con DSPE en TEA para formar el lípido PE derivado protegido en un extremo con cloruro de 2-nitrobencilsulfonilo. El grupo protector se remueve mediante tratamiento con ácido para producir el producto DSPE-PEG (compuesto IX) que tiene una amina terminal en la cadena PEG. La reacción con anhídrido del ácido maléico produce el producto maleámico correspondiente (compuesto V), el cual en reacción con anhídrido acético produce el producto PE-PEG-maleimida deseado (compuesto VI). El compuesto es reactivo con grupos sulfhidrílo, para el acoplamiento de anticuerpos anti-integrína descritos en la presente invención a través de un enlace tioéter (compuesto Vil). Se apreciará que cualesquiera de los polímeros hidrófilos anteriormente mencionados en combinación con cualesquiera de los lípidos formadores de vesícula anteriormente mencionados se pueden emplear como agentes modificadores para preparar el conjugado direccionador de lípido-polímero-ligando y se pueden determinar las secuencias de reacción adecuadas para cualquier polímero seleccionado por aquellos expertos en la técnica.
D. Preparación del liposoma Se han descrito diversos métodos para la preparación de liposomas que tienen un ligando direccíonador unido al extremo distal de las cadenas poliméricas unidas al liposoma. Un método incluyen la preparación de vesícula lipídícas que incluyen un derivado lípido-polímero funcionalizado en el extremo; es decir, un conjugado lípído-polímero en donde el extremo polímérico libre es reactivo o "se activa" (véase, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 6,326,353 y 6,132,763). Dicho conjugado activado se incluye en la composición del liposoma y los extremos poliméricos activados se hacen reaccionar con un ligando direccionador después de la formación del liposoma. En otro método, el conjugado de lípido-polímero-ligando se incluye en la composición lipídica en el momento de la formación del liposoma (véase, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 6,224,903, 5,620,689). E incluso otro método, se incubó una solución micelar del conjugado de lípido-polímero-ligando con una suspensión de liposomas y el conjugado de lípido-polímero-ligando se insertó en los liposomas pre-formados (véase, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 6,056,973, 6.316,024).
Los liposomas que portan un agente atrapado y que contienen ligandos direccionadores unidos a la superficie, por ejemplo, liposomas direccionados, terapéuticos, se prepararon mediante cualesquiera de estos métodos. Un método preferido de preparación es el método de inserción, en donde los liposomas se preforman y se incuban con el conjugado direccionador para lograr la inserción del conjugado direccionador dentro de las bicapas liposomales. En este método, los liposomas se preparan mediante una variedad en técnicas, tales como aquellas descritas en Szoka, F., et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), y los ejemplos específicos de los liposomas preparados para apoyar la presente invención se describirán a continuación. Típicamente, los liposomas son vesículas multílamelares (MLVs), los cuales se pueden formar mediante técnicas simples de hidratación en película lipídica. En este procedimiento, una mezcla de lípidos que forman el liposoma del tipo anteriormente detallado disuelta en un solvente orgánico adecuado se evaporó en un recipiente para formar una película delgada, la cual se cubre entonces por un medio acuoso. La película lipídica se hidrata para formar MLVs, típicamente con tamaños entre aproximadamente 0.1 a 10 mieras. Los liposomas pueden incluir un lípído formador de vesícula derivado con un polímero hidrófilo para formar un revestimiento de superficie de cadenas poliméricas hidrófilas sobre la superficie de los liposomas. La adición de un conjugado de lípido-polímero es opcional, puesto que después del paso de inserción, descrito a continuación, los liposomas incluirán lípido- polímero-ligando direccionador. Las cadenas poliméricas adicionales añadidas a la mezcla del lípido en el momento de la formación del liposoma y la forma de un conjugado de lípido-polímero resultan en cadenas poliméricas que se extienden tanto a partir de las superficies internas y externas de las bicapas lipídicas liposomales. La adición de un conjugado de lípido-polímero en el momento de la formación del liposoma típicamente se logra mediante la inclusión de entre 1-20 moles porcentuales del lípído derivado de polímero con los componentes remanentes para formación del liposoma, por ejemplo, lípidos formadores de la vesícula. Los métodos ejemplares para la preparación de lípidos derivados de polímero y para la formación de liposomas revestidos con polímero se han descrito en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,013,556, 5,631 ,018 y 5,395,619, que se incorporan en la presente invención como referencias. Se apreciará que el polímero hidrófilo puede estar acoplado de manera estable al lípido, o puede estar acoplado a través de un enlace inestable, lo que permite que los liposomas revestidos para difundir el revestimiento de cadenas poliméricas conforme circulan en la corriente sanguínea o en respuesta a un estímulo. Los liposomas también incluyen un agente terapéutico diagnóstico, y los agentes ejemplares se proveen a continuación. El agente seleccionado se incorpora dentro de líposomas mediante métodos estándares, incluyendo (i) atrapado pasivo de un compuesto soluble en agua mediante la hidratación de una película lípídíca con una solución acuosa del agente, (¡i) atrapado pasivo de un compuesto lipófilo mediante la hidratación de una película lipídica que contienen el agente, y (iii) la carga de un fármaco ionizable en contra de un gradiente de pH del liposoma interno/externo. Otros métodos, tal como la evaporación en fase reversa, también son adecuados. Después de la formación del liposoma, los liposomas pueden ser ajustados en tamaño para obtener una población de liposomas que tienen un intervalo de tamaño sustancialmente homogéneo, típicamente entre aproximadamente 0.01 a 0.5 mieras, más preferiblemente entre 0.03-0.40 mieras. Un método de ajuste de tamaño efectivo para REVs y MLVs incluye la extrusión de una suspensión acuosa de los liposomas a través de una serie de membranas de policarbonato que tienen un tamaño de poro uniforme seleccionado en el intervalo de 0.03 a 0.2 mieras, típicamente de 0.05, 0.08, 0.1 , o 0.2 mieras. El tamaño de poro de la membrana corresponde aproximadamente a los tamaños más grandes de liposomas producidos por la extrusión a través de esa membrana, particularmente en donde la preparación se extruye dos o más veces a través de la misma membrana. Los métodos de homogeneización también son útiles para disminuir el tamaño de los liposomas a tamaños de 100 nm o menores (Martin, F.J., en SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS - MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY, P. Tyle, Ed., Marcel Dekker, New York, pp. 267-316 (1990)). Después de la formación de los líposomas, se incorpora un ligando díreccionador para lograr un direccionamiento hacia la célula del liposoma terapéutico. El ligando díreccionador se incorpora mediante la incubación de los liposomas preformados con el conjugado de lípido-polímero- ligando, preparado como se describió anteriormente. Los liposomas preformados y el conjugado se incuban bajo condiciones efectivas para llevar a cabo la asociación con el conjugado y los liposomas, que pueden incluir la interacción del conjugado con la bicapa liposomal externa o la inserción del conjugado dentro de la bicapa liposomal. Más específicamente, los dos componentes se incuban juntos bajo condiciones que permiten la asociación del conjugado con los liposomas de tal manera que el ligando direccionador se orienta hacia afuera a partir de la superficie del liposoma, y por lo tanto está disponible para interacción con su receptor cognado. Se apreciará que las condiciones efectivas para lograr dicha asociación o inserción se determinan basándose en diversas variables, incluyendo, la velocidad de inserción deseada, la temperatura a la cual el ligando se puede calentar de manera segura sin afectar su actividad, y en un menor grado la temperatura de transición de fase de los lípidos y de la composición lipídica. También se apreciará que la inserción puede variar por la presencia de solventes, tales como solventes amfipáticos incluyendo polietilenglicol y etanol, o detergentes. El conjugado direccionador, en la forma de un conjugado de lípido-polímero-ligando, típicamente formará una solución de micelas cuando el conjugado se mezcla con un solvente acuoso. La solución micelar de los conjugados se mezcla con una suspensión de liposomas preformados para incubación y asociación del conjugado con los liposomas o la inserción del conjugado dentro de las bicapas lipídicas liposomales. La incubación es efectiva para lograr la asociación o inserción del conjugado de lípido-polímero- anticuerpo con la hojilla de la bicapa externa de los liposomas, para formar un inmunoliposoma. Después de la preparación, los inmunoliposomas preferiblemente tienen un tamaño de menos de aproximadamente 150 nm, preferiblemente de entre aproximadamente 85-120 nm, y más preferiblemente de entre 90-110 nm, como se mire, por ejemplo, mediante diseminación dinámica de luz a 30° o a 90°.
E. Inmunoliposomas ejemplares En estudios que se llevaron a cabo para apoyar la invención, se prepararon los inmunoliposomas que tienen un anticuerpo antiHER2 scFv como se describe en el ejemplo 1. En breve, se prepararon los liposomas a partir de los lípidos HSPC, colesterol, y mPEG-DSPE. El agente terapéutico doxorubicina se cargó dentro de los liposomas mediante carga remota en contra de un gradiente de ion de amonio (Doxil®). Un conjugado direccionador de lípído-polímero-anticuerpo, preparado como se describió en el ejemplo 1 con un anticuerpo anti-HER2 que tiene la secuencia identificada en la presente invención como SEQ ID NO: 2 se insertó dentro de los liposomas preformados mediante incubación de una solución micelar que contenía una pluralidad de los conjugados con los liposomas preformados. Los inmunoliposomas que tienen un promedio de 2, 5, 7.5, 15, 30, 45, 75,100, 150, y 300 anticuerpos por liposoma, también referidos en la presente invención como formulaciones 2:1 , 5:1 , 7.5:1 , 15:1 , 30:1 , 45:1 , 75:1 , 100:1 , 150:1 , y 300:1 , se prepararon mediante el ajuste de las concentraciones del reactivo, como se detalla en el ejemplo 1. Se determinó la toma in vitro dentro de las células que expresan HER2 (SK-BR03) y dentro de las células que no expresan HER2 (MCF-7) de los liposomas que contenían 7.5, 15, 30, y 45 anticuerpos, como se describe en el ejemplo 2. Los resultados se resumen en el cuadro 1.
CUADRO 1 Resumen de la unión/toma de inmunoliposomas anti°HER2 en céBu-as SK-BR-3 y MCF°7 *NS = no significativo, por debajo del límite de detección. Los datos en el cuadro 1 muestran la unión de células positivas/toma de los inmunoliposomas anti-HER2 en las células SK-BR-3 positivas a HER-2, con niveles de doxorubicina de 2.58 pg por célula y 1.75 pg por célula para las formulaciones 15:1 y 30:1 , respectivamente. La unión/toma de los ¡nmunoliposomas anti-HER2 en las células MCF-7, las cuales tienen bajos niveles de expresión de HER2, no fue significativo. La unión/toma de los liposomas que no contienen anticuerpos anti-HER2 en ambas líneas celulares tampoco fue significativo. En otro estudio, descrito en el ejemplo 3, se evaluó la citotoxicidad de los inmunoliposomas anti-HER2 que contenían 2, 5, 7.5 y 15 anticuerpos por liposoma en células de carcinoma de mama de humano SK-BR-3. La doxorubicina libre y los liposomas cargados con doxorubicina PEGilada, sirvieron como controles positivos y negativos, respectivamente. Las células SK-BR-3 se expusieron a inmunoliposomas anti-HER2 por 10 minutos y luego se evaluó la viabilidad celular. Los resultados se muestran en la figura 1A. La figura 1A muestran la viabilidad celular, expresada como un porcentaje de las células control no tratadas, como una función de la concentración de doxorubicina, en µg/mL, cuando se administra como un fármaco libre (triángulos), atrapada en liposomas (círculos), o atrapada en ¡nmunoliposomas que contenían 2 (círculos), 5 (cuadros), 7.5 (diamantes), o 15 (triángulos) anticuerpos por liposoma. Las diferencias en la citotoxicidad de las composiciones de liposoma se vuelven evidentes a concentraciones de doxorubicina de aproximadamente 0.5 µg/mL, en donde los inmunolíposomas decorados con 5 (cuadros) o 7.5 (diamantes) anticuerpos por liposoma proveen una citotoxicidad in vitro que es aproximadamente la misma que el fármaco libre (triángulos). Sin embargo, los inmunolíposomas con 15 anticuerpos por liposoma (triángulos) fueron más citotóxicos que la misma concentración de fármaco libre, con una viabilidad celular de 50% a aproximadamente 4 µg/mL de doxorubicina. Los inmunoliposomas con 2 anticuerpos por liposoma fueron menos citotóxicos que la doxorubicína líposomal PEGilada no direccionada. El efecto eliminador de la célula de los inmunoliposomas direccionador por Her2 se relaciona con la densidad de anticuerpos por liposoma. Los valores IC50 para las formulaciones de inmunoliposomas anti-HER2 con relaciones de scFv/liposoma de 5, 7.5, y 15 después de una exposición de 10 minutos fueron de aproximadamente 30, 16 y 3.9 µg/mL, respectivamente. La citotoxicídad de las formulaciones de ¡nmunoliposoma anti-Her2 que tienen la relación de scFv/liposoma de 2 tuvieron poca o ninguna citotoxicidad después de una exposición al fármaco de 10 minutos. La IC50 para la doxorubicína libre fue de aproximadamente 9.5 µg/mL. Poca o ninguna citotoxicidad se observó para la doxorubicina atrapada en liposomas revestidos con PEG. Los inmunoliposomas anti-Her2 con una relación scFv/liposoma de 15 tuvieron una mayor citotoxicidad de la doxorubicina libre, indicando la ventaja de una formulación direccionadora con una unión rápida seguida por internalización. Por lo tanto, en una modalidad, se contempla una formulación de ¡nmunoliposoma que incluye una cantidad de conjugado de lípido-polímero-anticuerpo que provee más de 2 anticuerpos por liposoma, y en particular, que provee en promedio más de 2 anticuerpos por liposoma después de la circulación de los ¡nmunoliposomas en la sangre ¡n vivo por más de 24, 48, o 96 horas, como se discutirá adicionalmente a continuación. Se llevó a cabo un método alternativo para medir la citotoxicidad in vitro, en donde las formulaciones de liposoma y de ¡nmunoliposomas se incubaron con las células por cuatro horas. Las células se lavaron entonces y se incubaron a 37°C por tres días. El número celular al término de los tres días se estimó mediante tinción con cristal violeta. Los resultados se muestran en la figura 1 B. La figura 1 B muestra la viabilidad celular, expresada como un porcentaje de las células control no tratadas, como una función de la concentración de doxorubicina, en µg/mL. Cuatro horas de exposición a diversas concentraciones de doxorubicína a partir de los diversos inmunoliposomas ilustra la diferencia de citotoxicidad in vitro de las formulaciones. Los inmunoliposomas que portan 7.5 y 45 anticuerpos por liposoma fueron ligeramente menos citotóxicos que o tan citotóxicos como la doxorubicina libre (diamantes). Los inmunoliposomas con 15 y 30 anticuerpos fueron más citotóxicos que la doxorubicina libre. La figura 1 B también muestra que los inmunoliposomas con 15 y 30 anticuerpos fueron más potentes en la citotoxicidad célula que la doxorubicina libre. En otro estudio, descrito en el ejemplo 4, se evaluó la estabilidad de los liposomas direccionador por HER2 en la sangre. Los inmunoliposomas que contenían un anticuerpo scFv marcado con 125l se prepararon a relaciones de anticuerpo scFv/liposoma de 7.5, 15, 30, 45, y 90. Los ¡nmunoliposomas se incubaron en plasma de humano, y las alícuotas se removieron a tiempos seleccionados para análisis. Las alícuotas duplicadas del material liposomal en plasma de humano se removieron a partir de la incubación y se aplicaron sobre columnas de Sepharose CL-4B para cada punto de tiempo. Las figuras 2A-2H muestran los perfiles de elución del conjugado de lípído-PEG-scFv marcado con 125l a partir de inmunoliposomas que tienen 15 anticuerpos scFv por liposoma a partir de las alícuotas removidas durante la incubación de los inmunoliposomas en plasma de humano, las alícuotas removidas a los tiempos de 0 horas (figura 2A), 1 hora (figura 2B), 4 horas (figura 2C), 8 horas (figura 2D), 24 horas (figura 2E), 48 horas (figura 2F), 72 horas (figura 2G), y 96 horas (figura 2H). La radiactividad en la fracción liposomal se recuperó dentro de un intervalo muy estrecho de fracciones dentro de las fracciones 2-3 y típicamente dentro de 6-9 mL del eluyente total recolectado. Las fracciones plasmáticas, debido al amplio intervalo de tamaño de las proteínas plasmáticas, se eluyeron una partir de la columna de Sepharose CL-4B en al menos 12 fracciones. En todos los puntos de tiempo, se distinguieron las fracciones liposomales y plasmáticas entre sí. Con el objeto de calcular el porcentaje de conjugado disociado (y asociado correspondiente) de lípido-PEG-scFv marcado con 125l, la radiactividad a partir de las fracciones líposomales y plasmáticas se combinó para proveer una cantidad total de marca de 125l. Este total se evaluó como una relación de la radiactividad total en la muestra aplicada a la columna de Sepharose CL-4B.
La figura 3A muestra la disociación del anticuerpo scFv marcado con 125l a partir de las formulaciones de inmunoliposomas que tienen relaciones del anticuerpo scFv/liposoma de 7.5:1 (diamantes), 15:1 (cuadros), 30:1 (círculos), 45:1 (triángulos), y 90:1 (*) como una función del tiempo de incubación, en horas, en plasma de humano. La figura 3B gráfica los datos con un porcentaje de marca 125l remanente en los inmunoliposomas para las mismas formulaciones. La velocidad y grado de disociación del anticuerpo (en relación con la cantidad de doxorubicina) a partir de las formulaciones es esencialmente la misma sin importar la densidad inicial de los anticuerpos por liposoma. En otro estudio, se preparó una formulación de inmunoliposoma que tenía 15 anticuerpos por liposoma y se midió la disociación de la radiomarca a partir de la formulación durante la incubación in vitro en plasma de humano. Los resultados se muestran en las figuras 4A-4B. La figura 4A muestra el porcentaje de anticuerpo radiomarcado disociado a partir de la formulación de inmunoliposoma para los dos estudios (diamantes, cuadros) como una función del tiempo de incubación, en horas. Los resultados entre los dos estudios son consistentes e indican que 24 horas de incubación resultan en aproximadamente 30% de disociación del anticuerpo a partir del inmunoliposoma. Después de 96 horas de incubación en plasma de humano, ya no está asociado el 50% de los anticuerpos asociados con los inmunoliposomas.
La figura 4B gráfica los datos a partir de uno de los estudios utilizando la formulación de inmunoliposoma 15:1 como el porcentaje de anticuerpo radiomarcado remanente en los inmunoliposomas (diamantes) y como el porcentaje de anticuerpo radiomarcado disociado partir de los inmunoliposomas (cuadros), como una función del tiempo de incubación en plasma de humano en donde la disociación inducida por plasma se describe como la radiactividad recuperada en la fracción plasmática. La figura 4B muestra la disminución de scFv radiomarcado en la fracción liposomal con el incremento correspondiente en la fracción plasmática expresada como un porcentaje del material scFv total. Se observó un incremento inicial en la cantidad de anticuerpo scFv liberado alcanzando un estado estacionario en aproximadamente 48 horas. En el punto de tiempo cero, se recuperó 85% de la radiactividad en la fracción liposomal con el remanente en la fracción plasmática. La disminución en la radiactividad asociada con la fracción liposomal fue más pronunciada dentro de las primeras 24 horas con >30% del anticuerpo scFv disociado y recuperado a partir de la fracción plasmática. Puesto que el anticuerpo scFv inicial disminuye en la fracción líposomal, la cantidad de radiactividad en la fracción plasmática muestra un incremento correspondiente (con una disminución correspondiente en la fracción liposomal) durante el tiempo de incubación de 96 horas hasta aproximadamente una disociación del 50%. Por consiguiente, en una modalidad, se provee una composición de inmunoliposoma que tiene 24 horas después de la administración in vivo, más preferiblemente 48 horas después de la administración, e incluso más preferiblemente 96 horas después de la administración, más de dos anticuerpos por liposoma, en promedio, y menos de 150 anticuerpos por liposoma, en promedio. En otra modalidad, la composición de inmunoliposoma tiene una cantidad inicial de anticuerpos por liposoma en promedio, y entre 30-60% de los anticuerpos disociados a partir de la dosis de inmunoliposoma administrada ¡n vivo, para proveer una composición, 48 o 96 horas después de la administración in vivo que tiene menos de aproximadamente 50 anticuerpos por inmunoliposoma en promedio, más preferiblemente menos de aproximadamente 30 anticuerpos por inmunoliposoma en promedio, e incluso más preferiblemente menos de aproximadamente 15 anticuerpos por inmunoliposoma en promedio. En una modalidad preferida, los inmunoliposomas en promedio incluyen entre 2 y 15, inclusive, anticuerpos o inmunoliposoma. Se apreciará que el número de anticuerpos por liposoma in vivo puede ser aproximada utilizando un ensayo in vitro en donde el inmunoliposoma se incuba en plasma de humano a 37°C por un tiempo seleccionado, tal como 24, 48, o 96 horas y se analiza utilizando una técnica analítica adecuada para la disociación del anticuerpo (o la construcción de lípido-polímero-anticuerpo) a partir del liposoma. Se llevó a cabo un estudio ¡n vivo para evaluar la estabilidad del anticuerpo en los inmunoliposomas después de la administración intravenosa particular a las ratas. Como se describe en el ejemplo 5, las ratas se trataron intravenosamente ya sea con inmunoliposomas marcados con 125l (formulación 15:1 ) o con conjugado de anticuerpo scFv-PEG-DSPE marcado con 125l. Las muestras de sangre se recolectaron a los 5 minutos y a las 1 , 3, 8, 24 y 48 horas después de la dosificación. Las muestras de sangre total y de plasma se contaron para 125l y se expresaron como el porcentaje (%) de la dosis inyectada. Las muestras plasmáticas a partir del grupo tratado con los inmunoliposomas también se ensayaron para la concentración de doxorubicina. Además, se pasó una porción de la muestra plasmática en cada punto de tiempo a través de una columna de exclusión por tamaño para separar el conjugado libre a partir del conjugado unido al liposoma para determinar si la radiactividad se asociaba con la fracción líposomal. La figura 5A muestra el porcentaje de conjugado de anticuerpo scFv radiomarcado-PEG-DSPE recuperado en la fracción liposomal de las muestras plasmáticas. En todos los puntos de tiempo, >85% de la radiactividad se encontró solamente en la fracción liposomal. Esto indica que cualquier anticuerpo libre o conjugado libre (por ejemplo no asociado a liposoma) se removió rápidamente a partir de la circulación. La figura 5B muestra la concentración del anticuerpo scFv radíomarcado libre en la fracción liposomal de plasma después de la separación sobre la columna de Sepharose CL-4B. La cantidad de anticuerpo scFv libre en esta fracción es insignificante puesto que solamente se recuperaron cantidades pequeñas (100 ng/mL y menos). Durante la duración del estudio, la recuperación del anticuerpo scFv libre fue menor de 15% del total recuperado.
La concentración del anticuerpo scFv radiomarcado no se asocia con la fracción liposomal, por ejemplo, "anticuerpo libre" o "conjugado libre" después de la administración de la formulación de inmunolíposomas 15:1 a las ratas se muestra en la figura 5C. En el primer punto de tiempo (5 minutos), la concentración inicial del anticuerpo scFv radiomarcado disminuyó en un 20% de la dosis inyectada esperada. La velocidad inicial de eliminación del anticuerpo scFv radiomarcado fue rápida durante las primeras diez horas o aproximadamente después de la dosificación. Durante las primeras 48 horas después de la dosificación, la concentración del anticuerpo scFv radiomarcado disminuyó en un 90% con respecto a la concentración del anticuerpo scFv radiomarcado en el primer punto de tiempo. En comparación 40% de doxorubicina permanecía en circulación (figura 6A). También como se describen en el ejemplo 5, se determinaron los parámetros farmacocinéticos de los inmunolíposomas y de la doxorubícina. El cuadro 2 resume los parámetros farmacocinéticos y las figuras 6A-6B muestran las concentraciones como una función del tiempo.
CUADRO 2 Parámetros farmacocinéticos de la formulación de inmunoliposoma 15:1 y del conjugado de anticuerpo scFv-PEG-DSPE aCalculado utilizando el método trapezoidal del último punto de tiempo (96 horas después de la dosis). bVolumen de distribución en el estado estacionario, eliminación de la doxorubicina a partir del plasma.
La figura 6A muestra el porcentaje de anticuerpo scFv marcado con 125l remanente en el plasma (diamantes) y en la sangre (cuadros cerrados); el porcentaje de doxorubicina en el plasma (triángulos), como una función del tiempo, en horas, después de la administración de una formulación de inmunoliposoma 15:1 a las ratas. También se muestra el porcentaje de un anticuerpo scFv marcado con 1 5l en el plasma (círculos abiertos) y en la sangre (cuadros abiertos) como una función del tiempo, en horas, después de la administración como un conjugado libre. La radiactividad en la sangre y en el plasma tuvo un pico a los 5 minutos después de la dosificación tanto en animales dosificados con inmunoliposomas como en animales dosificados con el conjugado de anticuerpo scFv-PEG-DSPE marcado con 125l. En los animales tratados con los inmunoliposomas, el nivel de 125l en la sangre y en el plasma fue de 78.4 ± 4.1 y 77.2 ± 3.7% a los 5 minutos, y 4.4 ± 0.9 y 4.1 ± 0.8% a las 96 horas, respectivamente. El contenido de doxorubicina en plasma fue de 127 ± 19.7% o de 69.4 ± 10.8 µg/mL a los 5 minutos y de 11.8 ± 3.9% o de 6.4 ± 2.2 µg/mL a las 96 horas. El perfil de 125l eluido a partir de la columna de exclusión por tamaño mostró un pico particular, que correspondía a la fracción liposomal del efluente de la columna. Basándose en el porcentaje de dosis inyectada de 125l en la sangre y plasma, la vida media para eliminación de los inmunoliposomas fue de 25.6 horas y 25.0 horas, respectivamente. Basándose en la concentración de doxorubicina en el plasma, la vida media para eliminación de los inmunoliposomas fue de 31.6 horas. En los animales tratados con el conjugado de anticuerpo scFv-PEG-DSPE marcado con 125l, el nivel de 125l en la sangre y en el plasma fue de 41.8 ± 6.0 y de 20.8 ± 3.1 % a los 5 minutos, y de 2.9 ± 0.6 y de 2.7 ± 1.1% a las 8 horas, respectivamente. No se detectó radiactividad a los puntos de tiempo de 24 o 48 horas. La vida media para eliminación del conjugado en la sangre y en el plasma fue de 2.1 y de 2.0 horas, respectivamente. La figura 6B muestra la concentración plasmática de doxorubicina, en µg/mL, como una función del tiempo, en horas, después de la administración de una formulación de inmunoliposoma 15:1 a las ratas. Como se observa, la doxorubicina permanece en la sangre 96 horas después de la dosificación. La figura 7 es una gráfica de la relación del anticuerpo scFv marcado con 125l a la doxorubicina en la sangre, en ng/µg, como una función del tiempo, en horas, después de la administración de una formulación de inmunoliposoma 15:1 a las ratas. La relación de componentes disminuyó durante las primeras 24 horas después de la dosificación, y luego se presentó una meseta aproximadamente a las 50 horas después de la dosificación. La relación en disminución muestra que el anticuerpo scFv se pierde a partir de liposoma a una velocidad más rápida que con la eliminación del liposoma a partir de la circulación o la pérdida de doxorubicina a partir del liposoma. En resumen, los estudios in vivo mostraron que los inmunolíposomas permanecieron en circulación por más de 96 horas después de una administración intravenosa particular en las ratas. El conjugado de anticuerpo-PEG-DSPE se asoció cercanamente con los liposomas como se demuestra por cromatografía de exclusión por tamaño. La vida media de 125l en la sangre/plasma después de la administración de los inmunoliposomas marcados con 1 5l fue de aproximadamente 25 horas, y la vida media de la doxorubicina en el plasma fue de 31.6 horas. Cuando se administró en forma libre, el conjugado de anticuerpo-PEG-DSPE permaneció en circulación por aproximadamente 8 horas después de una administración intravenosa particular. La vida media en circulación del conjugado libre fue de aproximadamente 2 horas. Los datos in vivo que examinan la estabilidad de los inmunoliposomas en suero, mostraron que en todos los puntos de tiempo, > 85% de la radiactividad permanecía en la fracción liposomal indicando que el anticuerpo disociado o el anticuerpo libre-conjugado se removió rápidamente a partir de la fracción del suero. El inmunoliposoma tuvo una vida media medida tanto en suero como en sangre de aproximadamente 25 horas mientras que la vida media del anticuerpo libre o del anticuerpo-conjugado fue de aproximadamente 2 horas tanto en sangre como en plasma (cuadro 2). El ejemplo 6 describe otro estudio in vivo conducido para evaluar las farmacocinéticas de las formulaciones del inmunoliposoma que tienen 15, 75, 150, y 300 anticuerpos scFv por liposoma. En breve, se trataron con un bolo intravenoso particular de una de las formulaciones del ¡nmunoliposoma. A los ratones control se les administró doxorubicina liposomal PEGilada. El plasma se recolectó aproximadamente a los 5 minutos y a las 4, 8, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación y se ensayó para la doxorubicina total. Los resultados se muestran en la figura 8. Se observaron los perfiles similares de concentración de doxorubicina contra el tiempo en los animales tratados con la formulación control (diamantes) y con las formulaciones de inmunoliposoma 15:1 (cuadros cerrados) y 75:1 (triángulos). Se observaron valores considerablemente menores para Cmax, AUC, y vida media, acompañados por una eliminación más rápida y un volumen mayor de distribución, para los animales tratados con los inmunoliposomas que tenían 150 (símbolos X) y 300 (símbolos *) anticuerpos por liposoma. Los parámetros farmacocinéticos determinados a partir de los datos en la figura 8 se muestran en el cuadro 3.
CUADRO 3 AUCf¡nai = el área bajo la curva calculada para el último punto de tiempo medido.
Las concentraciones de doxorubicina en plasma tuvieron un pico en el primer punto de tiempo de la muestra, por ejemplo, aproximadamente 5 minutos después de la inyección. Los valores Cmax en ratones administrados con la formulación control liposomal PEGilada, la formulación de inmunoliposoma 15:1 , y la formulación de inmunoliposoma 75:1 fueron de 39.0 ± 0.27, 39.9 ± 5.49 y 43.3 ± 1.30 µg/mL, respectivamente. Los niveles del fármaco correspondiente disminuyeron a 10.1 ± 1.82, 9.05 ± 0.69, y 13.6 ± 5.0 µg/mL, respectivamente, a las 24 horas, y a 0.32 ± 0.19, 0.56 ± 0.41 , y 0.28 ± 0.12 µg/mL, respectivamente, a las 96 horas después de la administración. Se observaron perfiles farmacocinéticos muy similares en estos tres grupos de tratamiento. Los valores Cmax en ratones administrados con la formulación de inmunoliposoma 150:1 y la formulación de inmunoliposoma 300:1 fueron notablemente menores que aquellos tratados con las formulaciones de inmunoliposomas 75:1 o menores, por ejemplo, 20.6 ± 3.88 y 10.5 ± 6.13 µg/mL, respectivamente. Los niveles correspondientes del fármaco disminuyeron a 4.56 ± 0.52 y 0.58 ± 0.19 µg/mL, respectivamente a las 24 horas. Al término de las 96 horas, la mitad de los animales en los grupos de tratamiento con la formulación de inmunoliposomas 150:1 y 300:1 no tuvieron un nivel detectable del fármaco en el plasma. Los valores AUCf¡nai en los ratones administrados con la formulación control liposomal PEGilada, la formulación de inmunoliposoma 15:1 , y la formulación de inmunoliposoma 75:1 fueron de 751.5, 763.1 y 898.3 µg.h/mL, respectivamente. Los valores AUCf¡na? en ratones administrados con las formulaciones de inmunoliposomas 150:1 y 300:1 fueron de 287J y 81.5 µg.h/mL, respectivamente. La vida media en plasma en ratones administrados con la formulación control liposomal PEGilada, la formulación de inmunoliposoma 15:1 , y la formulación de inmunoliposoma 75:1 fue de 14.8, 17.0 y 12.8 horas respectivamente. La vida media en los ratones administrados con las formulaciones de inmunoliposoma 150:1 y 300:1 fue de 3.30 y 3.91 horas, respectivamente. La eliminación plasmática de la doxorubicina en ratones administrados con la formulación control liposomal PEGilada, la formulación de inmunolíposoma 15:1 , y la formulación de inmunoliposoma 75:1 fue de 0.070, 0.068 y 0.059 mL/hr, respectivamente. La eliminación plasmática de la doxorubicina en ratones administrados con las formulaciones inmunoliposomales 150:1 y 300:1 fue de 0.183 y 0.645 mL/hr, respectivamente. El volumen de la distribución en ratones administrados con la formulación control liposomal, la formulación de inmunoliposoma 15:1 , y la formulación de inmunoliposoma 75:1 fue de 1.49, 1.50 y 1.23, respectivamente. El volumen de la distribución en ratones administrados con formulaciones de inmunolíposomas 150:1 y 300:1 fue de 3.57 y 12.0 mL, respectivamente. Los hallazgos del ejemplo 6 muestran que los perfiles farmacocinéticos similares se observaron en ratones después de la administración de un bolo particular de ¡nmunoliposomas que contenían una relación de scFv/liposoma de 0, 15, o 75. Se observaron valores menores para Cmax, AUC, y la vida media, acompañados por una eliminación más rápida y un volumen más elevado de distribución, para animales tratados con inmunoliposomas que contenían una relación de scFv/liposoma de 150 o 300, en donde los parámetros fueron inversamente proporcionales a la densidad del ligando. Por consiguiente, en una modalidad, se provee una formulación de inmunolíposoma que tiene un AUC, Cmax, y/o vida media que es (i) mayor que o (ii) no más de 30%, preferiblemente no más de 25%, incluso más preferiblemente no más de 20%, menor que aquel AUC, Cmax, y/o vida media para una formulación liposomal similar que carece del anticuerpo direccíonador. Por ejemplo, el AUC de la formulación de liposoma control PEGilado que carece del anticuerpo fue de 751 µg.h/mL. Las AUCs de las formulaciones de inmunoliposoma 15:1 y 75:1 fueron de 763 µg.h/mL y 898 µg.h/mL, respectivamente. La formulación de inmunoliposoma 15:1 tuvo un valor AUC que fue 1.6% menor (por ejemplo, no mayor de 25% menor) que el AUC de la formulación liposomal correspondiente, idéntica en la composición excepto por la ausencia de los anticuerpos. La formulación de inmunoliposoma 75:1 tuvo un valor AUC que fue mayor que el AUC de la formulación liposomal correspondiente. En contraste, los valores AUC para las formulaciones de inmunoliposoma 150:1 y 300:1 fueron considerablemente mayores de 30% menores que el AUC de la formulación liposomal. De manera similar, los parámetros farmacocinéticos de Cmax y la vida media para las formulaciones de inmunoliposoma 75:1 y 15:1 fueron mayores de 25% menores que el parámetro correspondiente de la formulación liposomal, formulación liposomal no dirigida por anticuerpo. Por lo tanto, los datos en la figura 8 cuando se consideran con los datos en la figura 1A y la figura 4B indican que una formulación de ¡nmunoliposoma, y en una modalidad un inmunoliposoma que contiene un anticuerpo que tiene un peso molecular de entre aproximadamente 20,000-50,000 Daltones, más preferiblemente 25,000-35,000 Daltones, preferiblemente tiene antes de la administración in vivo entre aproximadamente 4-30 anticuerpos (inclusive de los puntos terminales), en promedio, por liposoma, y más preferiblemente entre aproximadamente 5-25 anticuerpos (inclusive de los puntos terminales) por liposoma, e incluso más preferiblemente entre aproximadamente 6-20 anticuerpos (inclusive de los puntos terminales) por liposoma. Otros intervalos preferidos para el número de anticuerpos por liposoma antes de la administración in vivo son entre aproximadamente 5-30, entre aproximadamente 6-25, y entre aproximadamente 4-15, y entre aproximadamente 7-15. En otra modalidad, la formulación de ¡nmunoliposoma tiene, en promedio, más de aproximadamente 2 anticuerpos por liposoma y menos de aproximadamente 16 anticuerpos aproximadamente 96 horas después de la administración in vivo, más preferiblemente tienen más de aproximadamente 2 anticuerpos por líposoma y menos de aproximadamente 12 anticuerpos aproximadamente 96 horas después de la administración in vivo, e incluso más preferiblemente tienen más de aproximadamente 2 anticuerpos por liposoma y menos de aproximadamente 10 anticuerpos aproximadamente 96 horas después de la administración in vivo, e incluso más preferiblemente tienen más de aproximadamente 2 anticuerpos por liposoma y menos de aproximadamente 8 anticuerpos aproximadamente 96 horas después de la administración in vivo. Alternativamente, la composición de inmunoliposoma tiene más de dos anticuerpos por liposoma, en promedio, después de aproximadamente 48 horas de circulación in vivo en la sangre y menos de aproximadamente 20 anticuerpos por liposoma, en promedio, aproximadamente 48 horas después de la administración intravenosa in vivo. En otra modalidad, la invención provee una formulación de inmunoliposomas que tiene un AUC que está dentro de 30%, preferiblemente 25%, más preferiblemente dentro de 20%, del AUC de una formulación de liposoma similar que carece de los anticuerpos díreccionadores. En otra modalidad, la invención provee una formulación de inmunoliposoma que tiene un AUC normalizado la dosis que se está dentro de 30%, preferiblemente 25%, más preferiblemente dentro de 20%, del AUC normalizado a la dosis de una formulación de liposoma similar que carece de los anticuerpos direccionadores. Otro estudio se llevó a cabo para evaluar la eficiencia antitumoral de la composición de inmunoliposoma. Como se describe en el ejemplo 7, los ratones que contienen xenoinjertos de carcinoma de mama de humano BT-474, que se sabe que exhibe el receptor HER2 sobre la superficie de las células, fueron tratados con formulaciones de inmunoliposoma que no tenían anticuerpos direccionadores (control) o que tenían 7.5, 15, 30, o 45 anticuerpos por liposoma. Los resultados se muestran en las figuras 9A-9B. La figura 9A muestra el volumen tumoral relativo, en porcentaje, en los ratones después de la dosificación con solución salina (círculos abiertos), liposomas PEGilados que contenían doxorubícina (cuadros abiertos), o ¡nmunoliposomas que contenían 7.5 (diamantes), 15 (triángulos), 30 (cuadros cerrados), o 45 (círculos cerrados) anticuerpos scFv por liposoma. Los tumores en el grupo control con solución salina (círculos abiertos) se cuadruplicaron en tamaño en un promedio de 23.9 ± 7.5 días. Los animales tratados con las formulaciones de ¡nmunoliposoma que tenían relaciones de anticuerpo: liposoma de 45:1 , 30:1 , 15:1 , y 7.5:1 tuvieron tiempos para cuadruplicar el volumen tumoral de más de 35.1 ± 2.9, 32.9 ± 4.4, 36.1 ± 1.9, y 38.0 ± 0 días, respectivamente. Los tumores en los animales tratados con la formulación liposomal control (Doxil®, cuadros abiertos) tuvieron tumores que se cuadruplicaron en tamaño en más de 29.2 ± 6.0 días. Al término del estudio al día 38, un animal de cada uno de los grupos de tratamiento dosificado con los inmunoliposomas que tuvo relaciones de anticuerpo: liposoma de 45:1 , 15:1 , y 7.5:1 no tuvo tumor presente o nodulos de un tamaño < 10 mm3. Se presentaron retrasos aparentes en el crecimiento tumoral en todos los animales tratados con doxorubicina liposomal o inmunoliposomal cuando se compara con los controles con solución salina. Los animales tratados con las formulaciones de inmunoliposoma direccionada por HER2 tuvieron retrasos ligeramente mayores en el crecimiento tumoral que los animales tratados con la doxorubicina liposomal no direccionadora (Doxil®). La figura 9B muestra el cambio porcentual en el peso corporal de los animales probados durante el período de tratamiento.
En resumen, el estudio muestra que en este modelo de xenoinjerto de cáncer de mama de humano BT-474, el tratamiento con doxorubicina atrapada en liposoma o con doxorubicina atrapada en inmunoliposoma resulta en una mejoría en la actividad antitumoral en comparación con aquella de los animales control. No hubo diferencia en la eficiencia antitumoral al variar las relaciones de anticuerpo: liposoma en la formulación de ¡nmunoliposomas a partir de 7.5-45. La formulación de inmunoliposoma 15:1 se seleccionó para evaluación en un estudio con intervalo de dosis ¡n vivo en ratones que contenían el tumor. Como se describe en el ejemplo 8, los ratones fueron tratados con diversas dosis (2, 3, 4 mg/kg) de doxorubicína atrapada en liposomas pegilados o atrapada en inmunoliposomas. Todos los ratones recibieron una dosis intravenosa semanal de la formulación adecuada por tres semanas. El tamaño tumoral se midió dos veces a la semana para calcular el volumen tumoral, y los resultados se muestran en la figura 10. La figura 10 es una gráfica del volumen tumoral relativo, tomado como un porcentaje del volumen tumoral inicial, como una función del tiempo, en días, en ratones que contienen un xenoinjerto de tumor de mama y que fueron tratados con solución salina (círculos abiertos), liposomas PEGilados que contenían doxorubicina a dosis de 2 mg/kg (cuadros abiertos) y 3 mg/kg (diamantes abiertos) o con una formulación de inmunoliposoma 15:1 a dosis de 2 mg/kg (cuadros cerrados), 3 mg/kg (diamantes cerrados) o 4 mg/kg (triángulos cerrados). Los tumores en los animales control no tratados (círculos abiertos) tuvieron un volumen tumoral que se triplicó en el tiempo promedio (TVTT) de 11.1 ± 1.9 días. Los anímales tratados con doxorubicina liposomal a 2, 3 y 4 mg/kg (cuadros abiertos, diamantes, triángulos, respectivamente) tuvieron un volumen tumoral que se triplicó el tiempo (TVTT) de 16.7 ± 4.8 días, 26.0 ± 3.9, y > 34.2 ± 9.0 días, respectivamente. Los animales se trataron con la formulación de inmunoliposoma 15:1 TVTTs de más de 34.2 ± 6.6, 29.5 ± 8.6, y los niveles de dosis de 49.0 por 2, 3 y 4 mg/kg, respectivamente. El retraso en el crecimiento tumoral se observó para todos los grupos de tratamiento con el fármaco cuando se comparó con el grupo control no tratado. Hubo una relación evidente dosis respuesta para los grupos de tratamiento liposomal PEGilado pero no para los grupos de tratamiento con inmunoliposoma. Sin embargo, el tratamiento con inmunoliposoma 15:1 a 4 mg/kg resultó en un retraso mayor en el crecimiento tumoral en comparación con todos los otros grupos de tratamiento pero no fue evidente una relación para los grupos de tratamiento con inmunoliposoma. El tratamiento con ¡nmunoliposomas 15:1 a 2 y 4 mg/kg proveyó TVTTs media que fue mayor que los TVTTs medio que fueron mayores que el TVTT medio para los grupos tratados con liposomal PEGilado de ratones a 4 mg/kg. Además, en cada dosis, el TVTT medio para los liposoma 15:1 fue mayor que aquel del grupo de ratones tratados con liposomal PEGilado. En otro estudio, descrito en el ejemplo 9, una formulación de inmunoliposoma que contenía doxorubicina atrapada y que portaba 15 anticuerpos scFv, en promedio, por inmunoliposomas, se administró en tres dosis a los animales vía una inyección intravenosa particular. Se determinaron las farmacocinéticas de los inmunoliposomas, de la doxorubicína, y del anticuerpo y los resultados se muestran en las figuras 11-13A-13B. La figura 11 muestra la concentración de doxorubicina en plasma, en ng/mL, como una función del tiempo, en horas, después de la administración intravenosa a monos de la formulación de ¡nmunoliposoma 15:1 (círculos) y liposomas PEGilados (cuadros) a una dosis de doxorubicina de 10 mg/mL. El tiempo de vida de circulación en sangre de los inmunolíposomas fue esencialmente equivalente a los liposomas PEGilados que carecen del anticuerpo scFv. Las figuras 12A-12B muestran la concentración de doxorubicina en plasma (figura 12A) y la concentración del anticuerpo en plasma (figura 12B) como una función del tiempo después de la administración intravenosa de inmunoliposomas 15:1 a dosis de doxorubicina de 1 mg/kg (círculos), 5 mg/kg (cuadros), y 10 mg/kg (triángulos). La concentración total de doxorubicína (libre y atrapada) en el plasma disminuyó como una función de la administración después del tiempo (figura 12A). La concentración total de anticuerpo (libre y asociado a ¡nmunoliposoma) exhibe una disminución inicial más grande en las cuatro horas después de la administración seguido por una disminución más lenta posteriormente. La relación de la concentración del anticuerpo con respecto a la doxorubicina se determinó a partir de los datos presentados en las figuras 12A-12B y se muestra en las figuras 13A-13B. En la figura 13A, se muestra la relación de las concentraciones del anticuerpo scFv/concentración de doxorubicina en plasma, en ng/µg. En la figura 13B, la relación se normaliza a la relación inicial del anticuerpo/doxorubicina y se expresa como un porcentaje. En ambas figuras, los inmunoliposomas administrados a dosis de doxorubicina de 1 mg/kg, 5 mg/kg, y 10 mg/kg se identificaron por diamantes, cuadros, y triángulos, respectivamente. Ambas representaciones de los datos ilustran la pérdida en anticuerpo en las primeras cuatro horas después de la administración con aproximadamente 40% del anticuerpo disociado a partir del liposoma y eliminado a partir de la corriente sanguínea dentro de las primeras 8 horas después de la dosificación. Se apreciara que los datos ilustran la pérdida de anticuerpo, que puede ser una pérdida del anticuerpo a partir del inmunoliposoma o una pérdida de la construcción de lípido-polímero-anticuerpo a partir del inmunoliposoma. Por lo tanto, se contempla una formulación de inmunoliposomas, en donde los inmunoliposomas pierden 20-50% de los anticuerpos asociados durante la circulación in vivo por un tiempo de aproximadamente 24 horas, o 48 horas, pero aún así los ¡nmunoliposomas retienen la unión al receptor HER2 suficiente para la citotoxicidad. Como se ilustró anteriormente, se requieren más de aproximadamente dos anticuerpos para la citotoxicidad in vítro en comparación con la doxorubicina liposomal no direccionadora. Por consiguiente, se provee un método para la preparación de una formulación de inmunoliposoma para administración in vivo, en donde se incluye una construcción de función hidrófoba-polímero hidrófilo-anticuerpo en la formulación en una primera cantidad suficiente para proveer un primer número seleccionado de anticuerpos por inmunoliposoma. Los inmunoliposomas se ponen en contacto con la sangre, in vítro o in vivo, y se determina el número de anticuerpos por ¡nmunoliposoma en uno o más puntos de tiempo después del contacto de los liposomas con la sangre. Por ejemplo, se toma una alícuota de sangre a partir del contenedor in vitro o se retira una muestra de sangre a partir de un animal. La sangre se analiza para la cantidad de anticuerpo utilizando cualquiera de numerosas técnicas analítica adecuadas, tales como radioinmunoensayo, cromatografía, electroforesis en gel, etcétera. Si se determina el número de anticuerpos en más de un punto de tiempo, se puede construir una gráfica que muestra la pérdida de anticuerpos como una función del tiempo en la sangre. Utilizando esta información, se determina el número de anticuerpos en un punto de tiempo seleccionado después del contacto con la sangre y se selecciona una segunda cantidad de la construcción de porción hidrófoba-polímero hidrófilo-anticuerpo suficiente para proveer un segundo número de anticuerpos, mayor por liposoma con el objeto de proveer al menos dos anticuerpos por liposoma después del contacto con la sangre en dicho punto de tiempo. Los ¡nmunoliposomas se preparan entonces utilizando la segunda cantidad de la construcción. Por ejemplo, si se desea tener 5 anticuerpos por inmunoliposoma 96 horas después de la administración, y los datos de incubación en sangre muestran que aproximadamente 50% de los anticuerpos se disocian a partir del inmunoliposoma o no están disponibles de otra manera para interacción con el receptor blanco, entonces los ¡nmunoliposomas deberían contener inicialmente, antes de la dosificación in vivo, al menos diez anticuerpos. Generalmente, se selecciona la segunda cantidad de conjugado, es decir, la cantidad de conjugado seleccionada para proveer un número inicial de anticuerpos, antes de la dosificación, para producir menos de 50 anticuerpos por liposoma, más preferiblemente 30 o menos anticuerpos por liposoma. En otra modalidad, y basándose en parte en los datos farmacocinéticos anteriormente mencionados, el método incluye proveer liposomas que tienen una primera cantidad de conjugado que provee menos de 150 anticuerpos por liposoma, más preferiblemente 100 o menos anticuerpos por liposoma, e incluso más preferiblemente 75 o menos anticuerpos por liposoma. lll. Métodos de uso Los liposomas incluyen un agente terapéutico o diagnóstico en forma atrapada. Atrapado se pretende que incluya la encapsulación de un agente en el núcleo acuoso y espacios acuosos de los liposomas así como el atrapado de un agente en la bícapa(s) lipídica(s) de los liposomas. Los agentes contemplados para uso en la composición de la invención varían ampliamente, y los ejemplos de agentes adecuados para aplicaciones terapéuticas y diagnósticas se proporcionan a continuación.
La dosis administrada puede variar dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacocinéticas del agente particular, y su modo y ruta de administración; edad, salud, y peso del recipiente; naturaleza y grado de los síntomas, tipo de tratamiento concurrente, frecuencia del tratamiento, y el efecto deseado. La dosis puede ser una dosis proporcionada una sola vez o una dosis periódica que se proporciona a un intervalo seleccionado de horas, días, o semanas. Cualquier ruta de administraciones adecuada, con los modos intravenosos y otros modos parenterales siendo preferidos. En otro aspecto, se contempla un régimen de tratamiento combinado, en donde la composición de inmunoliposoma anteriormente descrita se administra en combinación con un segundo agente. El segundo agente puede ser cualquier agente terapéutico, incluyendo otros compuestos tipo fármaco así como agentes biológicos, tales como péptidos, anticuerpos, y los similares. El segundo agente se puede administrar simultáneamente con o de manera secuencial a la administración de los inmunoliposomas, mediante la misma ruta de administración o mediante una ruta diferente. Las combinaciones particularmente preferidas incluyen, pero no se limitan a, ciclofosfamida, taxanos, vinorelbina, Herpectin®, y Avastin®. Los liposomas direccionados por Her2 proveen una regresión tumoral más completa en relación con una dosis equivalente del mismo fármaco administrada en liposomas no direccionados, tal como DOXIL®. Por consiguiente, se contempla un régimen de tratamiento que comprende una dosis de un primer agente citotóxico atrapado en inmunoliposomas direccionados por Her2 y un segundo agente terapéutico, en donde uno o ambos agentes se administran a dosis menores que la dosis requerida para el agente administrado solo, para lograr un resultado clínico mejorado, tal como una regresión tumoral mayor que la esperada. También se apreciara que los inmunoliposomas direccionados por Her2 se pueden administrar en combinación con dos o más agentes. Los agentes adecuados para un paciente particular se pueden identificar por un médico experto. Se contempla un régimen de tratamiento comprendido de una composición de inmunoliposoma direccionada por Her2 que contiene un agente quimioterapéutico atrapado en los liposomas, y dos o más agentes adicionales, en donde al menos uno, y preferiblemente más de uno, de los agentes se administra a dosis menores a la dosis recomendada del agente cuando se proporciona solo, para lograr un resultado clínico mejorado. Los métodos de tratamiento descritos en la presente invención se pretenden, en una modalidad, para la administración a una población de pacientes que expresan más de 105 receptores HER2 por célula, y preferiblemente más de 106 receptores a HER2 por célula. La densidad de sectores celulares se puede determinar utilizando inmunohistoquímica y se pueden obtener los equipos para dicha determinación, tal como la Hercep Test®. Los objetos que expresan más de 105, preferiblemente más de 106 receptores a HER2 por célula, responden particularmente bien a la composición de inmunoliposomas direccíonada por HER2 descrita en la presente invención, debido a que el anticuerpo descrito en la presente invención se internaliza por las células, incrementando el fármaco administrado de manera intracelular. Un método en donde una biopsia o muestra biológica apropiada se obtiene a partir de un paciente, y esta muestra se ensaya para determinar el número de receptores HER2 por célula tumoral, y si el número de receptores es mayor de 106 receptores HER2 por célula del paciente se trata con la composición de inmunoliposoma descrita en la presente invención. En una modalidad preferida, el paciente tiene una evaluación IHC de 3+ (2,000,000) de receptores por célula.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la intención descrita en la presente invención y no se pretende que de ninguna manera limiten el alcance de la invención.
Materiales: La fosfatidilcolina hidrogenada de soya (HSPC) se obtuvo a partir de lipoid K.G. (Ludwigshafen, Alemania). El colesterol se recibió a partir de Croda, Inc. (New York, NY), y la sal sódica de N-(carbonil-metoxipolietilenglicol 2000)-1 ,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE) se recibió a partir de Syngena, Ltd. (Liestal, Suiza). El clorhidrato de doxorubicina se recibió a partir de Meiji Seika Kaisha Ltd.
(Tokio, Japón). El conjugado radiomarcado (scFv-PEG-DSPE) se recibió a partir de Hermes Biosciences (San Francisco, CA) a una actividad específica de 0.0983 mCi/mL. El plasma de humano se recibió a partir de Bioreclamation (East Meadow, NY). Componente de columna - Sepharose CL-4B se recibió a partir de Amersham Pharmacia, Uppsala, Suecia) Regulador de pH para elución - solución de cloruro de sodio (NaCI al 0.9%) fue a partir de Baxter (Deerfield, IL) y contenía 0.4% de azida de sodio (Sígma, St Louis, Mo).
EJEMPLO 1 Preparación de inmunoliposomas direccionados por HER2 Los liposomas que contenían doxorubicina atrapada se obtuvieron a partir de Alza Corporation Mountain View, CA (DOXIL®). Los liposomas estaban compuestos de fosfatidilcolina hidrogenada de soya (HSPC, 56.4 moles %), colesterol (38.3 moles%), y metoxipolietílenglicol-di-estearoil-fosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE, 5.3 moles%, mPEG PM 2000 Da). La concentración de doxorubicina en la preparación final fue de 100 µg/mM de lípido. El regulador de pH interno utilizado para la preparación fue sacarosa al 10% e histidina 10 mM. El diámetro promedio de los liposomas en la formulación final fue de 93 nm. El anticuerpo scFv anti-receptor HER2 (SEQ ID NO: 2) se conjugó inicialmente a un fosfolípido PEGilado derivado de maleimída (mPEG-DSPE) para formar un conjugado de lípído-PEG-scFv, de conformidad con los procedimientos bien conocidos en la técnica y brevemente discutidos anteriormente e ¡lustrados en el esquema 1A y esquema 1B. ESQUEMA 1A NH2-CH2-CH2<CH2CH20)nCH2CH2NHz III TEA, DSPE ACIDOLISIS t ESQUEMA 1B 'O— HS-anti-integpna Ab .0 -- II N -C)!2CI[2- ( OC«jCH, ) n -O-CH?CBjKH-C-h-H-05PE S " C anti-integrina ' *0 vrr La construcción del lípido-PEG-anticuerpo antí-HER2 se asoció entonces con bicapas liposomales de los liposomas cargados con doxorubicina mediante la incubación de los liposomas con una suspensión micelar de la construcción de lípido-copolímero-anticuerpo. Los inmunoliposomas que contenían un promedio de 2, 5, 7.5, 15, 30, 45, 75,100, 150, y 300 anticuerpos se prepararon mediante el ajuste de la cantidad de anticuerpo añadido por mol de fosfolípido, como se resume en el cuadro A.
CUADRO A El número promedio teórico de anticuerpos por inmunoliposoma se confirmó al determinar las concentraciones de proteína y de fosfolípido y calcular el número de anticuerpos, basándose en un promedio de 80,000 fosfolípidos por liposoma de 100 nm y un peso molecular del anticuerpo de 28.714 kDa. El número de anticuerpos en un inmunoliposoma se puede determinar después de la formación de los inmunoliposomas al determinar el peso molecular del anticuerpo, el tamaño del liposoma, y la composición del liposoma. A manera de ejemplo, para la formulación de inmunoliposoma 15:1 , 15 moles del anticuerpo scFv/8,000 moles del fosfolípido x 28.714 kDa = 5.4 moles. Asumiendo que 90% del conjugado insertado o asociado con los liposomas durante la incubación: 5.4/90% = 6 µg del anticuerpo scFv añadido por µmol de fosfolípido. Por lo tanto, el número de anticuerpos por inmunoliposoma reportado en la presente invención refleja una distribución promedio de anticuerpos en la población de liposomas, con el número reportado siendo el número medio de anticuerpos por liposoma en la población.
Después de la asociación de los conjugados de lípido-polímero-anticuerpo con los liposomas, la concentración de doxorubicina fue de 86-92 µg/mM de lípído y el diámetro promedio de los ¡nmunoliposomas después fue de 93-117 nm.
EJEMPLO 2 Toma in vitro de los inmunoliposomas Las células SK-BR-3 y MCF7 se obtuvieron a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células SK-BR-3 se mantuvieron en cultivo in vitro en medio modificado de McCoy 5A suplementado con 10% de suero de bovino fetal. Las células MCF7 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco con 10% de suero bovino fetal. Las células SK-BR-3 o MCF7 a 1.5 x 105 células/0.5 mL de medio de crecimiento por pozo se añadieron a una placa de 24 pozos.
Después de la incubación durante toda la noche para la unión y aclimatación, las células se trataron con inmunoliposomas (anticuerpos anti-HER2:liposoma 7.5:1 , 15:1 , 30:1 , y 45:1 ), o liposomas a 0.015 mg/mL en 0.5 mL de medio de crecimiento/pozo por duplicado. Las placas de 24 pozos se colocaron entonces en una plataforma para rotación dentro de una incubadora con rotación a 40-60 rpm a 37°C, 5% de C02, y 100% de humedad después de 4 horas. Después de la incubación, el medio celular se aspiró y las células se lavaron cuatro veces con solución salina balanceada de Hank (HBSS). Después de esto, las células fueron usadas mediante la adición de 0.1 mL de Tritín X-100 al 1 % a cada pozo. Las placas fueron registradas para mezclarlas y se colocaron sobre una plataforma con rotación por 15 minutos a temperatura ambiente. Durante este paso, las células se separaron del fondo de la plata y los núcleos celulares formaron acúmulos visibles. Se añadió isopropanol ácido (1.0 mL) a los pozos que contenían la solución de Tritón X-100 y se mezclaron mediante agitación o pipeteo hacia arriba y hacia abajo hasta que desaparecieron los acúmulos visibles. El contenido de doxorubícina en los lisados celulares se midió mediante un espectrofluorómetro utilizando una longitud de onda de excitación de 470 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. Los ajustes del espectrofluorómetro fueron los siguientes: ancho de ranura 2 nm, tiempo de integración 1 segundo, voltaje del fotomultiplicador 950 V, y modo de adquisición de la longitud de onda particular. La fluorescencia de fondo del lisado celular se sustrajo y se determinó la cantidad de doxorubicina en los lisados celulares a partir de los estándares concurrentemente medidos (10, 25, 50,100, 250, 500, 1000, y 2500 ng de doxorubicína por muestra) ajustados a una curva estándar utilizando regresión polinomial cuadrática. La toma celular de la doxorubicina se determinó mediante la interpolación a partir de la curva estándar. Los datos se expresan en pg de doxorubicina por células sembradas y se muestran en el cuadro 1. Los valores por debajo del nivel de detección fueron denominados no significativos (NS).
EJEMPLO 3 Citotoxicidad in vitro de ios liposomas direccionados por HER2 La línea celular de carcinoma de mamá de humano SK-Br-3 se obtuvo a partir de American Tissue Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células se mantuvieron en cultivo in vitro en medio modificado por McCoy 5A suplementado con 10% de suero de bovino fetal y se mantuvieron una incubadora humidificada a 37°C. Las células se expusieron por 10 minutos a doxorubicína (1.8 mg/mL) en forma libre, doxorubicina atrapada en liposomas PEGilados (2.06 mg/mL), o una formulación de inmunoliposoma que tenía 2 anticuerpos por liposoma (1.86 mg/mL), 5 anticuerpos por liposoma (2.12 mg/mL), 7.5 anticuerpos por liposoma (1.99 mg/mL), o 15 anticuerpos por liposoma (2 mg/mL). Las células de cáncer de mama SK-BR-3 en fase logarítmica se cosecharon utilizando Versene (1 :5000), se resuspendieron en medio de crecimiento a una concentración de 5 x 104 células/mL. Se añadió una alícuota de 0.1 mL (5x103 células) a pozos apropiados de una placa de 96 pozos. Después de la incubación durante toda la noche para unión, el medio se removió y se reemplazó con los materiales de prueba. Una alícuota de 0.1 mL de doxorubicina, S-DOX, o variantes de la formulación STEALTH 49, se diluyó con medio para crecimiento a 0.0137, 0.0412, 0.1235, 0.37, 1.11 , 3.33, 10, y 30 µg/mL, se añadió a cada pozo por triplicado. El medio sin el material de prueba se añadió a los pozos control. Las células se expusieron al artículo de prueba a 37°C por 10 minutos. Al término de la incubación, el medio que contenían el fármaco se aspiró y las células se lavaron con 0.1 mL de medio para crecimiento. Después del lavado, las células se incubaron en 0.2 mL de medio recientemente preparado bajo condiciones de crecimiento por otras 72 horas. Al término de la incubación, se determinó la cantidad de células viables utilizando el ensayo para proliferación de células en una solución acuosa Promega CelITíter 96® (un método colorimétrico basado en tetrazolio para la determinación del número de células viables en proliferación, Madison, Wl). Brevemente, los medios a partir de los pozos se aspiraron y se reemplazaron con 0.1 mL de medio recientemente preparado y 0.02 mL de Promega (número de lote 186817). Las placas se incubaron entonces por 3-4 horas después de lo cual se registró la absorbancia a 490 nm con un lector de microplacas. La viabilidad celular se calculó como el % del control sin tratamiento utilizando la fórmula: % de viabilidad = (A-A0)/(A?oo-A0) x 100% en donde A es la absorbancia medida, A0 es la absorbancia de los blancos, y A- o es la absorbancia de los pozos con células no tratadas. La viabilidad celular porcentual se gráfico como una función de la concentración del fármaco y la IC50 (concentración que resulta en 50% de la inhibición del crecimiento celular) se determinó por interpelación. La viabilidad celular como el porcentaje del control de las formulaciones de ¡nmunoliposoma se resume en la figura 1A.
EJEMPLO 4 Disociación in vitro de la porción direccionadora por Her2 a partir de liposomas en plasma Los liposomas PEGilados que contenían doxorubicina, preparados como se describió en el ejemplo 1 , se combinaron con un conjugado adecuado de lípido-PEG-scFv marcado con 25l, preparado como se describió en el ejemplo 1 , para generar un inmunoliposoma que tiene 7.5, 15, 30, 45, y 90 anticuerpos scFv por liposoma. Los liposomas y los conjugados se incubaron a 60°C por 1 hora para permitir la inserción del conjugado dentro de la bicapa externa de los liposomas. Al término de la incubación la solución se enfrío y subsecuentemente se almacenó a 2-8°C. Cada formulación de liposoma se dializó en contra de 10% de sacarosa/histidina 10 mM y se midió para el contenido de doxorubicina. Los liposomas en cada formulación se caracterizaron por su tamaño, encapsulación de doxorubicina, porcentaje de inserción del conjugado de lípido-PEG-anticuerpo, y la concentración del anticuerpo scFv, que se resumen en el cuadro B. La actividad específica final de la formulación que contenía 15 anticuerpos scFv fue de 28.4 µCi/rnL.
CUADRO B La disociación de la marca 125l a partir de los líposomas, indicativa de la disociación del anticuerpo, el conjugado, o ambos, se midió como sigue. El plasma de humano se mezcló con inmunolíposoma direccionado por HER2 marcado con 125l y se incubó a 37°C durante 96 horas. En cada punto de tiempo (0, 1 , 4, 8, 72, 96 horas) se removieron las alícuotas y se colocaron sobre una columna preparada de Sepharose CL-4B de 28 x 1.2 cm con un volumen de lecho de 32 mL. La columna de Sepharose CL-4B se pre-condicionó con 1 mL de liposomas placebo 100 mM y 1 mL de plasma de rata. Las columnas se eluyeron con solución salina al 0.9% que contenía 0.4% de azída de sodio. Cada fracción (1 mL) se contó utilizando un contador gamma para radioactividad de 125l. La actividad total también se determinó para cada alícuota y la recuperación a partir de la columna de Sepharose CL-4B fue de -90% o mayor para cada muestra aplicada. En todos los puntos de tiempo, no se presentó menos de una recuperación del 90% de la radioactividad a partir de la columna en relación con la fracción total removida a partir de la alícuota aplicada. Los resultados se muestran en el cuadro a continuación, y los perfiles de elución para la formulación de ¡nmunoliposoma 15:1 se muestran en las figuras 2A-2H. La figura 3A muestran la disociación de la marca de 125l a partir de las formulaciones de inmunoliposoma como una función del tiempo. La figura 3B muestra el porcentaje de marca 1 5l remanente en los liposomas como una función del tiempo. La figura 4A muestran la velocidad de disociación de la marca 125l a partir de la formulación de inmunoliposoma que tiene 15 anticuerpos por liposoma en dos estudios diferentes. La figura 4B muestran la liberación inducida por plasma de la marca 125l a partir de la formulación de ¡nmunoliposoma que tiene 15 anticuerpos por liposoma.
Liberación en plasma de 1258 F5 a partir de inmunoliposomas a diferentes relaciones de F5/liposoma EJEMPLO 5 Disociación in vivo de la porción direccionadotra por He?r2 a partir de liposomas en plasma El anticuerpo scFv marcado con 25l se preparó utilizando lechos de yodo utilizando técnicas conocidas. En breve, el anticuerpo scFv (SEQ ID NO: 2), Na[125l], y los lechos de yodo se combinaron y la reacción se dejó continuar por 20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con tiosulfato. Con el objeto de remover el exceso de Na[125l] se separó la solución que había reaccionario utilizando una columna desalada DG-20. El material en el primer pico que contenía la mayor cantidad de radioactividad se agrupó y se evaluó para concentración de proteína, lo cual se determinó utilizando A280. El anticuerpo scFv yodado se pasó finalmente a través de un filtro de 0.2 µm para estabilizar y se almacenó a 4°C. El material se utilizó dentro del primer mes después de su producción. Los inmunoliposomas que tenían 15 anticuerpos por liposoma se prepararon como se describió anteriormente medíante incubación de los liposomas preformados con el conjugado de anticuerpo scFv-PEG-lípido marcado con 125l a 60°C por 1 hora. Los inmunoliposomas se dializaron entonces en contra de sacarosa al 10%/histidina 10 mM y se midieron para contenido de doxorubicina. El contenido final de doxorubicina fue de 2.1 mg/mL. Una muestra de la formulación se caracterizó para tamaño = 96 nm, pH = 6.5, % de doxorubicina = 99%, porcentaje de inserción del anticuerpo = 89% y concentración del anticuerpo = 49 µg/mL. La actividad específica final de los inmunoliposomas fue de 0.018 mCi/mL. El anticuerpo scFv-PEG-lípido libre marcado con 1 5l se diluyó en sacarosa al 10%/histidina 10 mM hasta una concentración final de 49 µg/mL. Con el objeto de proveer un conjugado radiomarcado adecuado, se añadió un conjugado frío de anticuerpo scFv-PEG-lípido a la solución resultando en una actividad específica final de 0.5 µCi/mL. Nueve ratas CD-1 macho (Charles River Laboratories) de aproximadamente 11 semanas de edad y 358-376 g en peso se utilizaron en este estudio. Los animales se aclimataron a las condiciones de laboratorio por al menos 1 semana. Al día 0, todos los animales fueron calentados en una caja caliente antes de la dosificación. Los animales se sujetaron manualmente y se les administró un bolo intravenoso particular ya sea de ¡nmunoliposomas marcados con 125l o de conjugado 125I-F5 libre vía una vena lateral de la cola. La dosis administrada por rata fue de aproximadamente 2 mg/kg de doxorubicina y/o 49 mg/kg del conjugado de anticuerpo-PEG-lípido. Se registraron los pesos corporales y las observaciones clínicas al día de la dosificación (día 0). Las observaciones laterales en la jaula se realizaron diariamente por 4 días. Las muestras de sangre se recolectaron vía el seno retro-orbital bajo anestesia inhalada (isofluorano/O2) dentro de tubos heparinizados para microfuga. Seis ratas fueron administradas con inmunoliposomas y se recolectaron las muestras de sangre (-1-2 mL) (3 animales por punto de tiempo) aproximadamente a los 5 minutos, y 1 , 3, 8, 24, 48, 72, y 96 horas después de la dosificación. Tres ratas fueron administradas con el conjugado de anticuerpo-PEG-lípido, y las muestras de sangre (-0.6 mL) se recolectaron aproximadamente a los 5 minutos, y 1 , 3, 8, 24, y 48 horas después de la dosificación. Se contó una alícuota de 100 µL de una muestra de sangre total a partir de cada animal para 125l utilizando un contador gamma. La muestra de sangre remanente se centrifugó a 2500 RPM (-750 xg) por 20 minutos a 4-8°C para obtener el plasma. Se retuvo una alícuota de la muestra de plasma (50 o 100 µL) y se contó para 125l. Para las ratas dosificadas con inmunoliposomas, se almacenó una serie separada de muestras de plasma a -40°C y posteriormente se ensayaron para concentración de doxorubicina utilizando un espectrofluorómetro. El resto del plasma se diluyó a través de una columna de exclusión por tamaño para separar la forma libre del conjugado de liposoma-anticuerpo unido-PEG-DSPE. La columna contenía los lechos de Sepharose-CL-4B con un volumen de lecho de aproximadamente 22 mL. La solución de regulador de pH para columna (0.9% de solución salina y 0.02% de NaN3) se alimentó mediante gravedad a una velocidad de flujo de aproximadamente 0.5 mL/minuto. Para todas las muestras, se observó un pico principal cerca de las fracciones 10-15 que correspondían al anticuerpo scFv asociado con la fracción liposomal. La radiactividad recuperada partir de las fracciones más allá de la fracción liposomal se consideraron como "libres de anticuerpo anticuerpo scFv". Es decir, el conjugado de anticuerpo scFv micelar o monomérico-PEG-DSPE puede estar asociado con o incorporado dentro de proteínas plasmáticas. Aproximadamente se recolectaron cuarenta fracciones con 1 mL cada una y se contaron para 1 5l. El cuadro C muestra la concentración recuperada de anticuerpo asociado con la fracción liposomal y con la fracción disociada libre. Los resultados se muestran en las figuras 5A-5C.
CUADRO C Parámetros farmacocinéticos Las muestras de sangre total y de plasma se contaron para radiactividad (CPM, cuentas por minuto) de 125l en un contador Packard Cobra 5010 Gamma (número de serie 401611 ). Las CPM se convirtieron hacia porcentaje (%) de dosis infectada de conformidad con la siguiente fórmula, % Inyectado = [(CPM/mL observado)/((CPM/mL Inyectado x Vol. inyectado)/BW) x 0.065] x 100 en donde Inyectado: inyectado; BW: peso corporal; y 0.065 se utiliza para estimar el volumen de sangre total de un animal (por ejemplo 6.5% BW). Para calcular el porcentaje de dosis inyectada en el plasma, el volumen plasmático se estimó que era del 60% (0.6) en comparación con el volumen sanguíneo. La vida media para eliminación (T-?/2ß) de 1251 en la sangre y en el plasma se calculó como la siguiente, T1/2ß= ln(2)/Kel en donde ln(2) = 0.693 y Kel (constante de eliminación) = (ln(C1 )-ln(C2))/|T1-T2|, en donde C1 y C2 son iguales al porcentaje medio de dosis inyectada en el tiempo T1 y T2. Para las ratas dosificadas con inmunoliposomas, T1 y T2 fueron 8 horas y 96 horas, respectivamente, mientras que para las ratas dosificadas con el conjugado de scFv-PEG-DSPE, T1 y T2 fueron 5 minutos y 8 horas, respectivamente. Además, la concentración de doxorubicina en plasma se midió utilizando un espectrofluorómetro. Los parámetros farmacocinéticos, por ejemplo, área bajo la curva (AUC), volumen de distribución en el estado estacionario (Vss), eliminación (Clt) y vida media, se calcularon utilizando el problema de análisis no compartimental WINNONLIN versión 4.1. Los datos en bruto se muestran en el cuadro D. Los parámetros farmacocinéticos se muestran en el cuadro 2 y en las figuras y 6A-6B.
CUADRO D Porcentaje de dosis inyectada de I en sangre y plasma, porcentaje de dosis inyectada de doxorubicina (DOX) y concentración de doxorubicina en plasma 00 na = muestra no tomada número en [ ]= dato normalizado al % de la dosis total inyectada en el punto de tiempo de 5 minutos.
EJEMPLO 6 Administración in vivo de inmunoliposomas a los ratones Los liposomas que tenían un revestimiento de PEG y los inmunoliposomas que tenían 15, 75, 150, y 300 anticuerpos scFv por liposoma se prepararon como se describió en el ejemplo 1. Las formulaciones se resumen en el cuadro E.
CUADRO E Ciento quince (21 por grupo de dosis x 5 grupos de dosis más 10 extra = 115) ratonas ICR se obtuvieron a partir de Charles River. Los animales se alojaron en jaulas convencionales con fondo de plástico bajó un programa de luz de 12 horas/12 horas de luz/oscuridad con comida y agua ad libitum. Los animales se aclimataron a las condiciones de laboratorio por al menos 1 semana antes del inicio del estudio. En día de dosificación fue considerado el día 0. A todos ratones utilizados se les administró una inyección en bolo única ya sea del control o una de las formulaciones prueba de inmunoliposoma anteriormente descrita vía una vena lateral de la cola. Los volúmenes de dosificación se calcularon para cada individuo animal y tuvieron intervalo de 0.24 a 0.33 mL. Los ratones se calentaron antes de la inyección en una caja caliente para roedor. A los ratones se les administró la formulación de liposoma control y las formulaciones de inmunolíposomas 15:1 y 300:1 se utilizaron aproximadamente a 2.0 mg/kg. A los ratones que se les administró las formulaciones de inmunoliposoma 75:1 y 150:1 fueron dosificadas aproximadamente a 2.40 y 1.65 mg/kg, respectivamente. Se recolectaron las muestras de sangre (-1 mL cada una) a partir de tres ratones por punto de tiempo (5 minutos, 4, 8, 24, 48, 72 y 96 horas) por formulación. Las muestras de sangre se recolectaron vía la vena porta hepática bajo anestesia inhalada (oxígeno/isofluorano) en jeringas revestidas con heparina y se transfirieron inmediatamente a un Eppendorf de polipropileno. Las muestras de sangre se almacenaron entonces sobre hielo hasta la centrifugación a aproximadamente 2500 CPM (-750 xg) por 10 minutos a 3.8°C. Las muestras plasmáticas se recolectaron y se almacenaron a -40°C. Las muestras plasmáticas y las soluciones de dosis se ensayaron para doxorubicina total mediante análisis de LC/MS. Las concentraciones medias de doxorubicina en plasma se graficaron en contra del tiempo (figura 8) y se utilizaron para calcular los parámetros farmacocinéticos. Debido a que las concentraciones plasmáticas son todas a partir de animales individuales, los parámetros farmacocinéticos se calcularon utilizando las concentraciones medias de doxorubicína HCl en plasma y por lo tanto no están presentes las desviaciones estándares para los parámetros farmacocinéticos. Los parámetros farmacocinéticos se calcularon utilizando WINNOLIN versión 4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Los parámetros farmacocinéticos se muestran en el cuadro 3.
EJEMPLO 7 Eficiencia in vivo Los liposomas que tienen un revestimiento de PEG y los inmunoliposomas que tienen 15, 75, 150, y 300 anticuerpos scFv por liposoma se prepararon como se describió en el ejemplo 1. Las ratonas homocigotas NCR.nu/nu (Charles River Laboratories, Hollister, CA), de aproximadamente 4-5 semanas de edad, se utilizaron para los resultados obtenidos. El peso corporal promedio fue de aproximadamente 25 g. Los animales se mantuvieron en jaulas aislantes en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. La comida y el agua es disponibles ad libitum. Las células de mama de humano BT-474 se mantuvieron en cultivo in vitro (medio RPMI 1640 suplementado con 10 µg/mL de insulina de bovino, 300 mg/mL de L-glutamina, y 10% de suero bovino fetal) a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de C02. Las células de cáncer de mama en fase logarítmica se tripsinizaron y se cosecharon a partir de botellas para cultivo celular para producir una concentración final de 16 x 107 células/mL. Se realizó una inyección subcutánea (16 x 106 células en 0.1 mL) en la parte trasera del área del cuello de cada ratón. También se implantó de manera subcutánea un concentrado de estradiol (0.72 mg de 17ß estradiol, In unovative Research of America, Sarasota, FL) en el flanco de cada ratón un par de días antes de la inoculación de la célula tumoral para incrementar la tumorigenicidad. El tratamiento inició 23 días después de la inoculación de la célula tumoral cuando el volumen tumoral medio alcanzó aproximadamente 80 mm3. Cinco animales fueron asignados a cada grupo de tratamiento. Las formulaciones de inmunoliposoma que contenían diversas relaciones de anticuerpos:liposoma se diluyeron, como se fue apropiado, y se administraron intravenosamente (IV) en un volumen de aproximadamente 0.2 mL dentro de la vena lateral de la cola de los ratones sujetaron en un sujetador de cobre calentado (40°C). Inmediatamente antes de cada inyección, los ratones fueron mantenidos calientes en una jaula de acrilico bien ventilada con una bombilla de luz para calentamiento. El tratamiento con los liposomas control (Doxil®) también se incluyó y sirvió como un control positivo. Los animales tratados con solución salina sirvieron como controles negativos. La dosis de doxorubicina utilizada para todos los grupos de tratamiento fue de aproximadamente 4 mg/kg por semana (qw - por sus siglas en inglés) y el tratamiento se continuó por dos semanas. Se midieron los pesos corporales del animal dos veces a la semana para evaluar la toxicidad del fármaco. Los animales se removieron a partir del estudio y se sometieron a eutanasia si se presentaba una pérdida de peso de > 15% o se desarrollaban cualesquiera condiciones anormales. Las observaciones clínicas incluyeron conducta, actividad en la jaula, deshidratación, y signos de dolor o aflicción. Todas las observaciones clínicas se registraron en la carpeta de estudio. Al término del período de estudio, todos los animales fueron sometidos a eutanasia mediante inhalación de dióxido de carbono al 100% de conformidad con el AVMA Panel on Euthanasia (1993). Los tumores se midieron en tres dimensiones dos veces a la semana por hasta 38 días. El volumen tumoral se calculó de conformidad con la fórmula: V = 1/2 x DT x D2 x D3; en donde D?-3 son diámetros perpendiculares medidos en milímetros (mm).
El tiempo que cuadruplicó el volumen tumoral (TVQT), se definió como el tiempo requerido para que un tumor crezca cuatro veces (4x) con respecto a su volumen inicial (en el tiempo de tratamiento), y se utilizó como punto terminal del estudio. El TVQT se determinó para cada grupo de tratamiento y se expresó que en días como la media ± error estándar (SE). En análisis estadístico del retraso en el crecimiento tumoral entre los diversos grupos de tratamiento se llevó a cabo mediante la prueba t de Student. Los resultados se muestran en las figuras 9A-9B y se resumen en el cuadro F.
CUADRO F aUn animal en el grupo 1 se excluyó del estudio debido a regresión tumoral. bSi cualquier tumor individual en un grupo de tratamiento no había alcanzado su volumen 4x al término del período de estudio de 38 días, el día 38 se utilizó en el cálculo, y un signo ">" se anotó para ese grupo. cTamaño tumoral < 10 mm3 para el día 38.
EJEMPLO 8 Estudio de intervalo de dosis in vivo Las ratonas atímicas nu/nu (Harían Laboratories, IN), de aproximadamente 4-5 semanas de edad, se utilizaron para el estudio. El peso corporal promedio fue de aproximadamente 20 g. Los animales se mantuvieron en jaulas aislantes en un signo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. La comida y el agua estuvieron disponibles ad libítum. Las células de mama de humano BT-474 se mantuvieron en cultivo in vitro (medio RPMI 1640 suplementado con 10 µg/mL de insulina de bovino, 300 mg/mL de L-glutamina, y 10% de suero bovino fetal) a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de C02. Las células de cáncer de mama en fase logarítmica se tripsinizaron y se cosecharon a partir de botellas para cultivo celular para producir una concentración final de 15 x 107 células/mL. Se realizó una inyección subcutánea (30 x 106 células en 0.2 mL) en la parte trasera del área del cuello de cada ratón. También se implantó de manera subcutánea un concentrado de estradiol (0J2 mg de 17ß estradiol, In unovative Research of America, Sarasota, FL) en el flanco de cada ratón un par de días antes de la inoculación de la célula tumoral para incrementar la tu origenicidad. El tratamiento inició 17 días después de la inoculación de la célula tumoral cuando el volumen tumoral medio para todos los grupos de tratamiento un intervalo de 106 a 126 mm3. Los grupos de tratamiento se resumen en el cuadro G. Siete animales fueron asignados a cada grupo de tratamiento. Las formulaciones de liposoma y de ínmunoliposoma se administraron intravenosamente (IV) en las venas laterales de la cola de ratones se sujetaron en un sujetador de cobre calentado (40°C) en el volumen de aproximadamente 0.2 mL. Inmediatamente antes de cada inyección, los ratones fueron mantenidos calientes en una jaula de acrílico bien ventilada con una bombilla de luz para calentamiento. La dosis de doxorubicina utilizada para la formulación de líposoma y las formulaciones de inmunoliposoma fue de 2, 3, o 4 mg/kg. Todos los tratamientos continuaron una vez a la semana por tres semanas.
CUADRO G aTiempo para triplicar el volumen tumoral Los tumores se midieron en tres dimensiones dos veces a la semana por hasta 49 días. El volumen tumoral se calculó de conformidad con la fórmula: V = 1/2 x Dl x D2 x D3; en donde D-?_3 son diámetros perpendiculares medidos en milímetros (mm).
El tiempo que triplicó el volumen tumoral (TVTT), se definió como el tiempo requerido para que un tumor crezca tres veces (3x) con respecto a su volumen inicial (en el tiempo de tratamiento), y se utilizó como punto terminal del estudio. El tiempo que triplicó el volumen tumoral se determinó para cada grupo de tratamiento y se expresó que en días como la media ± error estándar (SE). Los pesos corporales del animal se midieron dos veces a la semana para evaluar la toxicidad del fármaco. En análisis estadístico del retraso en el crecimiento tumoral entre los diversos grupos de tratamiento se llevó a cabo mediante la prueba t de Student. Los resultados se muestran en la figura 10.
EJEMPLO 9 Estudio farmacocinético y de toxicidad in vivo Treinta y ocho monos cynomolgus sin afección (Macaca fascicularis), de 3 a 8 años de edad y con un peso de 2.5 a 4.5 kilogramos, se asignaron al azar a seis grupos de tratamiento, con 3 machos y 3 hembras por grupo, resumido en el cuadro H.
CUADRO H Los inmunoliposomas que tenían 15 anticuerpos anti-HER2 de cadena sencilla, en promedio, se prepararon como se describió anteriormente. Al día 1 , a los animales se les proporcionó una inyección intravenosa lenta única (~1 mL/minuto) en una vena periférica, y se monitorearon por 28 días después de la dosificación. Las observaciones clínicas y un monitoreo del consumo de alimento se llevaron a cabo al menos una vez al día. Los pesos corporales se midieron dos veces a la semana. La sangre se recolectó para hematología y se realizó un análisis de la química del suero pre-dosificacíón y al día 1 (1 hora después de la dosis), 4, 14, y 28. La sangre se recolectó para análisis toxicocinético en la pre-dosís y a los 5 minutos, 1 , 4, 8, 24, 48, 72, y 96 horas después del término de la dosificación. Las muestras de sangre se analizaron para doxorubicina en plasma y concentración del anticuerpo. Los resultados se muestran en las figuras 11-13A-13B.
EJEMPLO 10 Estudio de toxicidad in vivo de la dosis repetida Setenta monos cynomolgus sin afección (Macaca fascicularis), de 3 a 8 años de edad y con un peso de 2.5 a 4.5 kilogramos, se asignaron al azar a siete grupos de tratamiento, con 5 machos y 5 hembras por grupo, resumido en el cuadro I.
CUADRO Los inmunoliposomas que tenían 15 anticuerpos de cadena sencilla con afinidad de unión para el receptor celular HER2, en promedio, se prepararon como se describió anteriormente. A los animales se les proporcionó la dosis indicada de manera intravenosa una vez cada cuatro semanas por un total de seis tratamientos. La sangre se recolectó para hematología y se realizó un análisis de la química del suero pre-dosificación y a puntos de tiempo seleccionados. Las muestras de sangre se analizaron para doxorubícina en plasma y los resultados se muestran en las figuras 14A-14C. Aunque se han discutido anteriormente numerosos aspectos ejemplares y modalidades, aquellos expertos en la técnica reconocerán ciertas modificaciones, permutaciones, adiciones y sub-combinacíones de las mismas. Por lo tanto se pretende que las siguientes reivindicaciones anexas y reivindicaciones introducidas en la presente invención se interpreten para que incluyan todas esas modificaciones, permutaciones, adiciones y sub-combinaciones como si se encontraran dentro de su espíritu y alcance verdadero.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una composición, que comprende: liposomas comprendidos de (i) lípidos formadores de vesículas; (ii) un lipopolímero; (iii) un conjugado comprendido por una porción hidrófoba, un polímero hidrófilo; y un anticuerpo que se une específicamente a un dominio extracelular de un receptor HER2; y (iv) un fármaco atrapado; dicho conjugado presente en una cantidad efectiva para proveer, en promedio, más de aproximadamente 2 y menos de aproximadamente 25 anticuerpos por liposoma. 2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho anticuerpo tiene un peso molecular de entre 20,000-50,000 Daltones. 3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicho anticuerpo tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2. 4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicho polímero hidrófilo es polietilenglicol que tiene un peso molecular de entre 75-5000 Daltones. 5.- La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada además porque dicho fármaco atrapado es un fármaco citotóxico o un agente antitumoral. 6.- La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada además porque dicho fármaco atrapado es una antraciclina. 1.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicho fármaco es doxorubicina. 8.- La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 -4, caracterizada además porque dicha cantidad de conjugado provee menos de aproximadamente 20 anticuerpos por liposoma en promedio, 48 horas después de la administración in vivo. 9.- Una formulación de liposoma, que comprende liposomas comprendidos de (i) al menos un lípido que forma una vesícula rígida; (ií) un lipopolímero comprendido de una porción hidrófoba y polietilenglicol; (iii) un conjugado comprendido de una porción hidrófoba, polietilenglicol, y un anticuerpo de cadena sencilla que se une específicamente a un dominio extracelular de un receptor HER2, dicho anticuerpo de cadena sencilla teniendo la identidad con SEQ ID NO: 2, o sustituciones conservativas a la misma; y (iv) un fármaco atrapado que tiene actividad antitumoral, en donde dichos liposomas se caracterizan por una cantidad de conjugado efectivo para proveer más de aproximadamente 2 y menos de aproximadamente 15 anticuerpos por liposoma 96 horas después de la administración in vivo, como se evidencia por un ensayo in vitro en donde los liposomas se incuban a 37°C por 96 horas y se determina la disociación del anticuerpo de cadena sencilla a partir del liposoma. 10.- La formulación de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicho lípido formador de vesícula rígida es fosfatidilcolina hidrogenada de soya. 11.- La formulación de conformidad con la reivindicación 9 o con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicho liposomas comprenden adicionalmente colesterol. 12.- La formulación de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 9-11 , caracterizada además porque dicho fármaco atrapado es una antraciclina. 13.- La formulación de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicho fármaco atrapado es doxorubicina. 14.- La formulación de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 9-11 , caracterizada además porque dicha cantidad del conjugado provee menos de aproximadamente 12 anticuerpos por liposoma en promedio, 48 horas después de la administración in vivo. 15.- Una formulación de inmunoliposoma, que comprende: liposomas comprendidos de (i) al menos un lípido que forma una vesícula rígida; (ii) un lipopolímero comprendido de una porción hidrófoba y polietilenglicol; (iii) un conjugado comprendido de una porción hidrófoba, polietilenglicol, y un anticuerpo de cadena sencilla que se une específicamente a un dominio extracelular de un receptor HER2, dicho anticuerpo de cadena sencilla teniendo al menos 80% de identidad con SEQ ID NO: 2; y (iv) un fármaco atrapado que tiene actividad antitumoral, dicha formulación de ¡nmunoliposoma cuando se administra in vivo provee un área bajo la curva que es mayor que o no más de 25% menor que el área bajo la curva de los liposomas comprendidos de componentes similares pero que carecen de dicho anticuerpo. 16.- La formulación de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicho lípido formador de vesícula rígida es fosfatidilcolina hidrogenada de soya. 17.- La formulación de conformidad con la reivindicación 15 o con la reivindicación 16, caracterizada además porque dicho liposomas comprenden adicionalmente colesterol. 18.- La formulación de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 15-17, caracterizada además porque dicho fármaco atrapado es una antraciclina. 19.- La formulación de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque dicho fármaco atrapado es doxorubicína. 20.- La formulación de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 15-17, caracterizada además porque dicha cantidad del conjugado provee más de dos anticuerpos por liposoma y menos de aproximadamente 20 anticuerpos por liposoma, en promedio, 48 horas después de la administración in vivo, como se evidencia por un ensayo in vitro en donde los liposomas se incuban a 37°C por 48 horas y se determina la disociación del anticuerpo de cadena sencilla a partir del líposoma. 21.- La formulación de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 15-17, caracterizada además porque dicha cantidad del conjugado provee más de dos anticuerpos por liposoma y menos de aproximadamente 15 anticuerpos por liposoma, en promedio, 96 horas después de la administración in vivo, como se evidencia por un ensayo in vitro en donde los liposomas se incuban a 37°C por 96 horas y se determina la disociación del anticuerpo de cadena sencilla a partir del liposoma. 22.- Una formulación de inmunoliposoma, que comprende inmunoliposomas comprendidos de (i) al menos un lípido que forma una vesícula rígida; (ii) un lipopolímero comprendido de una porción hidrófoba y polietilenglicol; (iii) un conjugado comprendido de una porción hidrófoba, polietilenglicol, y un anticuerpo de cadena sencilla que se une específicamente a un dominio extracelular de un receptor HER2 y que tiene una secuencia identificada como SEQ ID NO: 2; y (iv) un fármaco atrapado que tiene actividad antitumoral, en donde 96 horas después de la administración de dichos liposomas, entre 30-60% de los anticuerpos se disocian a partir de cada liposoma para proveer una composición, 96 horas después de la administración in vivo, que tiene menos de aproximadamente 25 anticuerpos por liposoma, como se evidencia por un ensayo in vitro en donde los liposomas se incuban a 37°C por 96 horas y se determina la disociación del anticuerpo de cadena sencilla a partir del liposoma. 23.- Una composición de liposoma preparada de conformidad con el procedimiento para proveer liposomas que tienen un revestimiento externo de cadenas poliméricas hidrófilas y un fármaco atrapado; incubar dicho liposomas con una cantidad de conjugado comprendido de una porción hidrófoba, polietilenglicol, y un anticuerpo de cadena sencilla que se une específicamente a un dominio extracelular de un receptor HER2; dicha cantidad de conjugado siendo seleccionada para proveer más de aproximadamente 2 y menos de aproximadamente 15 anticuerpos por liposoma en promedio 96 horas después de la administración in vivo, como se evidencia por un ensayo in vitro en donde los líposomas se incuban a 37°C por 96 horas y se determina la disociación del anticuerpo de cadena sencilla a partir del liposoma. 24.- La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque dicho anticuerpo tiene una secuencia identificada como SEQ ID NO: 2. 25.- La composición de conformidad con la reivindicación 23 o con la reivindicación 24, caracterizada además porque dicho fármaco es doxorubicina. 26.- La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 23-25, caracterizada además porque dicha cantidad de conjugado provee entre aproximadamente 2-10 anticuerpos por liposoma, en promedio. 27.- Una composición, que comprende: liposomas comprendidos de (i) lípidos formadores de vesícula; (ii) un lipopolímero; (iii) un conjugado comprendido de una porción hidrófoba, un polímero hidrófilo; y un anticuerpo que se une específicamente a un dominio extracelular de un receptor HER2; y (iv) un fármaco atrapado, dichos liposomas antes de la administración in vivo teniendo menos de 25 anticuerpos por liposoma, en donde después de la administración in vivo, dichos liposomas pierden 20-50% de dichos anticuerpos pero aún así requieren la unión ha dicho receptor Her-2 suficiente para citotoxicidad. 28.- La composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizará además porque dicho anticuerpo es SEQ ID NO: 2. 29.- La composición de conformidad con la reivindicación 27 o con la reivindicación 28, caracterizada además porque dicho fármaco es doxorubicina. 30.- Un método para la preparación de una composición de liposoma, que comprende: proveer liposomas comprendidos de (i) lípidos que forman vesículas; (ii) un lipopolímero; (¡ii) un conjugado comprendido de una porción hidrófoba, un polímero hidrófilo, y un anticuerpo que se une específicamente a un dominio extracelular de un receptor HER2; dicho conjugado incluido en una primera cantidad suficiente para proveer un primer número seleccionado de anticuerpos por liposoma; y (iv) un fármaco atrapado, poner en contacto dichos liposomas con la sangre; determinar el número de anticuerpos por liposoma en uno o más puntos de tiempo después del contacto de dichos liposomas con la sangre; seleccionar, basándose en dicha determinación, una segunda cantidad de conjugado suficiente para proveer un segundo número de anticuerpos, mayor, por liposoma con el objeto de proveer al menos dos anticuerpos por liposoma después del contacto con la sangre. 31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicho contacto incluye el contacto de dichos liposomas con la sangre in vitro. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicho contacto incluye el contacto de dichos liposomas con la sangre in vivo. 33.- El método de conformidad con la reivindicación 31 o con la reivindicación 32, caracterizado además porque dicha provisión incluye proveer liposomas que tienen un conjugado comprendido de un fosfolípido, una porción hidrófila de polietilenglicol, y un anticuerpo de cadena sencilla que tiene una secuencia identificada en la presente invención como SEQ ID NO: 2. 34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque dicha provisión incluye proveer liposomas que tienen doxorubicina como el fármaco atrapado. 35.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha selección comprende seleccionar una segunda cantidad del conjugado efectiva para proveer menos de 50 anticuerpos por liposoma. 36.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha provisión incluye proveer liposomas que tienen una primera cantidad de conjugado que provee menos de 150 anticuerpos por liposoma. 37.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha selección comprende seleccionar una segunda cantidad de conjugado efectiva para proveer 30 o menos anticuerpos por liposoma.
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