ES2263190T3 - Procedimiento para la produccion de un preparado conteniendo hialuronidasa. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE UN PREPARADO QUE CONTIENE HIALURONIDASA EN EL CUAL, TESTICULOS DE TORO SE DESMENUZAN PARA CONVERTIRLO EN UNA PAPILLA, Y EN EL CUAL ESTA PAPILLA SE DISUELVE EN PROTEINAS Y ENZIMAS EN ACIDO PARA FORMAR UN ELUIDO, SOMETIENDO EL ELUIDO A UNA PRECIPITACION FRACCIONADA MEDIANTE UN SULFATO DE AMONIO, Y OBTENIENDOSE DE ESTA MANERA UNA FRACCION DE PRECIPITACION DE HIALURONIDASA, SOMETIENDOSE LA PRECIPITACION O FRACCION DE HIALURONIDASA A UNA DIALISIS PARA SEPARAR EL SULFATO DE AMONIO Y LA HIALURONIDASA SE SOMETE A UN PROCEDIMIENTO DE ABSORCION Y DESABSORCION PARA PURIFICARLA CON HIDRATO DE OXIDO DE ALUMINIO, Y SE OBTIENE LA FRACCION DE HIALURONIDASA PURIFICADA Y PRECINTADA QUE SE PUEDE UTILIZAR DE MANERA GALENICA. LA INVENCION SE CARACTERIZA PORQUE LA PRECIPITACION FRACCIONADA CON SULFATO DE AMONIO SE REALIZA EN UNA PRIMERA ETAPA DE PRECIPITACION EN UNA SOLUCION ACUOSA DE SULFATO DE AMONIO AL 10-29 % EN PESO Y EN UNA SEGUNDA ETAPA DE PRECIPITACION EN UNA DISOLUCION DE SULFATO DE AMONIO ACUOSA CON UN 15-65 % EN PESO, Y QUE LA FRACCION DE HIALURONIDASA PURIFICADA ANTES DE LA OBTENCION PARA GALENICA SE SOMETE A UNA ULTRAFILTRACION PARA OBTENER UN PESO MOLECULAR DE 5.000 A 30.000 DALTON.

Description

Procedimiento para la producción de un preparado conteniendo hialuronidasa.

El invento está referido a un procedimiento para la producción de un preparado que contenga hialuronidasa, procedimiento en el que los testículos de mamíferos, especialmente testículos de toro son triturados hasta convertirlos en una papilla, de la que se desprenden proteínas y encimas formando un eluato en un medio ácido. Este eluato es sometido a la acción de un precipitado de sulfato amónico, obteniéndose de esta manera una fracción de precipitado de hialuronidasa, fracción que es sometida a un procedimiento de diálisis para la separación de sulfato amónico. La fracción obtenida mediante el procedimiento de diálisis es sometida a la acción de un hidrato de óxido de aluminio para depurar gradualmente una fase del procedimiento de adsorción y desorción. La fracción depurada de precipitado de hialuronidasa es preparada galénicamente.

Como hialuronidasa se califica a un grupo de encimas que tienen la capacidad de separar el ácido hialurónico. El ácido hialurónico está compuesto de manera lineal y alternante por ácido glucurónico y restos de N-acetilglucosamina, y tiene un peso molecular por debajo de 20.000 y hasta bastante más de 1.000.000. En un organismo, el ácido hialurónico es especialmente un componente principal de determinados proteoglicanos con un alto peso molecular, los cuales se encuentran, entre otras partes, en tejidos epiteliares, cartilaginosos y conjuntivos. En este tipo de proteoglicanos como, por ejemplo,sulfato de condroitina 4/6 y sulfato de mucoitina o sulfato de dermatán, el ácido hialurónico forma una unidad básica central, que sin embargo no es covalente con la proteína. Las hialuronidasas pueden hacer tejidos permeables a sustancias extrañas gracias a la disociación de los proteoglicanos. Se encuentran especialmente en el acrosoma de espermas, y su efecto disociador de los proteoglicanos posibilita a la postre a las células espermatozoides una fusión de manera natural con un óvulo. Este es el motivo por el cual, en principio, los espermas contenidos en los testículos de toda clase de animales son apropiados para obtener hialuronidasas en cantidades suficientes para ser aprovechadas económicamente. Especialmente aprovechables son testículos de reses grandes de consumo. En un precipitado de proteínas, las proteínas y/o encimas disueltas se precipitan mediante la reacción con el precipitante. En el caso de una precipitación fraccionada, se aprovecha el hecho de que diversas proteínas y/o encimas muestran una diferente afinidad con el precipitante, obteniéndose y separándose mayormente en un primer paso de la precipitación proteínas y/o encimas no deseadas. Luego, en una segunda fase de la precipitación, de la disolución restante se precipitan proteínas y/o encimas deseadas, añadiéndose la fracción precipitada así obtenida para una elaboración posterior. En la precipitación fraccionada es esencial acompasar, en cada una de las fases de la precipitación, las cantidades del precipitante, referidas al material inicial empleado, es decir, a la cantidad de material inicial empleado. Este acompasamiento se consigue generalmente a través del grado de concentración de precipitante en las proteínas y/o encimas contenidas en la solución. Así, por ejemplo, si se ha trabajado en una primera fase de precipitación con una concentración de precipitante demasiado alta, también se separan y se pierden de manera molesta proteínas y/o encimas deseadas. Si por el contrario se trabaja en una primera fase de precipitación con una concentración demasiado baja de precipitante, quedan en la solución muchas proteínas y/o encimas molestas y no deseadas. Esto mismo es válido para la segunda fase de la precipitación, en la que deben precipitarse las proteínas y/o encimas deseadas. Con la expresión diálisis se especifica la separación de las moléculas disueltas en función de su tamaño, como consecuencia de la difusión por retención conseguida mediante una membrana semipermeable. La diálisis se emplea especialmente para separar materiales de alto peso molecular como proteínas y encimas, y para materiales de bajo peso molecular como sales, monosacáridos, aminoácidos, etc. En el caso de una depuración por adsorción y desorción se trata de un método de enriquecimiento que utiliza diferentes propiedades de la adsorción de diferentes agentes adsortivos en un adsorbente. Mediante la elección del adsorbente y la regulación de determinadas condiciones de la adsorción pueden preferirse determinadas sustancias que han sido fijadas como objetivo, las cuales pueden ser adsorbidas y/o desorbidas o enriquecidas, mientras que las sustancias no deseadas o no son adsorbidas, y separadas en la pase líquida, o no son desorbidas, y separadas con la fase sólida. La expresión de la preparación galénica significa la transformación de una sustancia en un preparado que inmediatamente o como solución como, por ejemplo, suero fisiológico puede ser incorporado a un organismo sin que se presenten problemas de
tolerancia.

En la práctica es conocido el hecho de depurar hialuronidasa con precipitación de metal pesado. Este precedimiento exige, eso sí, retirar con especial cuidado todas las partículas de metal pesado del preparado obtenido, debido ello a su toxicidad. También es conocido en la práctica el hecho de que la hialuronidasa puede obtenerse mediante la precipitación fracmentada de etanol. Hay que tener en cuenta que los preparados libre de elementos pirógenos no pueden conseguirse sin más. Finalmente también es conocida la depuración mediante diversos adsorbentes como, por ejemplo, carbón activo, fosfato de calcio o hidróxido de aluminio. Pero en este caso el rendimiento obtenible no es satisfactorio.

Un procedimiento del tipo que ha sido mencionado anteriormente es conocido en la bibliografía existente, concretamente bajo DD-PS-24229.Dentro del marco del hasta ese punto conocido procedimiento, se trabaja en conexión con una precipitación de sultato de amónico con dos fases en el procedimiento de adsorción y desorción, con hidrato de óxido de aluminio, utilizándose diferentes sistemas de soluciones. En la precipitación de sulfato amónico, en la primera fase de la precipitación, se trabaja en la primera fase con una concentración de sulfato amónico de un 30%, y en la segunda fase se trabaja con un 70% de concentración de sulfato amónico. Con ello se obtiene un preparado libre de elementos pirógenos con un rendimiento insatisfactorio, además, el gasto es inquietantemente
elevado.

En la siguiente documentación DATABASE WPI Section Ch, Week 199534 Derwent Publications Ltd., London, GB; Class B04, AN 1995-262302 XP002155221 & RU 2 027759 C (PAK V N), 27. Enero 1995, DATABASE WPI Section Ch, Week 199647 Derwent Publications Ltd., Landon, GB; Class B04, AN 1996-475152 XP002155222 & RU 2 054 943 C (KHARK BIOLEK ENTERP), 27. Febrero 1996, Yang et al., Biochimica et Biophysica ACTA 391(2):382-387 (1975), WO 96/31596, y Meyer et al., FEBS Letters 413:385-388 (1997) pueden verse diferentes procedimientos conocidos para la obtención y subsiguiente elaboración de hialuronidasa.

Por otro lado, en este descubrimiento hay un problema de orden técnico, que es conseguir un procedimiento para la producción de un preparado que contenga hialuronidasa, con el que se obtenga una buena rentabilidad en relación al gasto y al rendimiento, y que, además, suministre un preparado que sea especialmente efectivo para su uso en medicina.

Para solucionar este problema, el descubrimiento nos enseña que el precipitado fraccionado de sulfato amónico en una primera fase de la precipitación se lleva a cabo en una solución acuosa de sulfato amónico de un 10 a un 29%, preferentemente de un 12 a un 25% en peso (Gew-%), y en una segunda fase de la precipitación, en una solución acuosa de un 15 a un 65% en peso (Gew-%), preferentemente en una solución acuosa de sulfato amónico de un 25 a un 50% en peso (Gew-%), y que la fracción depurada de hialuronidasa del preparado, antes de la preparación galénica, es sometida a una ultrafiltración con un límite de exclusión de 5.000 a 30.000 Dalton, preferentemente hasta 15.000 Dalton. Con la expresión ultrafiltración se especifica un precedimiento de filtrado, en el que, bajo presión, se separan partículas mayores y/o moléculas de disolventes, así como moléculas pequeñas. Un ultrafiltro se caracteriza por el límite de exclusión, que indica cuál es la masa molecular que puede dejarse pasar en las moléculas a través de la membrana del filtro. La expresión Gew.-% expresa los gramos de sulfato amónico por cada 100 gramos de solución de sulfato amónico.

Sorprendentemente, con el precedimiento descubierto se obtiene un preparado que sobresale especialmente por su alta efectividad fisiológica y que, en comparación, resulta sencillo de producir y muy favorable en el gasto. Especialmente significativo es el hecho de que la efectividad fisiológica no es una función monótona de la pureza del preparado. Más bien se ha descubierto que un preparado que contenga hialuronidasa, y que tenga un grado extremo de pureza, tiene menor efectividad fisiológica que un preparado elaborado conforme a lo que se ha descrito en el descubrimiento. Esto puede deberse a varios motivos. Por una parte, en el caso de una pureza extrema, puede faltar el efecto estabilizador de proteínas extrañas (inactivas), lo que conduce a su vez a una menor actividad de la propia hialuronidasa. Semejante comportamiento también puede conllevar claramente un mayor tiempo de permanencia de la hialuronidasa en el organismo. Por otra parte, no puede excluirse la posibilidad de que, en el caso de una pureza extrema de la hialuronidasa, hayan sido separadas proteínas extrañas (inactivas) que puedan tener un efecto coadyuvante de la hialuronidasa. Sin embargo, un preparado obtenido según el procedimiento del descubrimiento muestra, respecto a diversos efectos fisiológicos, una actividad óptima, lo que presumiblemente puede deberse especialmente, en comparación con lo expuesto en el antes mencionado documento DD-PS-24229, al relativamente estrecho grado de concentración dentro del marco de la precipitación fraccionada de sulfato amónico.

Por lo demás, hay diversas posibilidades para llevar a cabo la ejecución del procedimiento, ateniéndose al descubrimiento, prefiriéndose las siguientes:

La solución en medio ácido de las proteínas y encimas de la pasta puede hacerse mediante 0.02 a 0.2 moles, preferentemente 0.1 moles de ácido acético, debiendo ser la relación de peso entre el ácido acético y los testículos de toro de 0,2:1, hasta 5:1, y preferentemente de 0,8:1, hasta 1,2:1, y especialmente preferente de aproximadamente 1:1, debiéndose revolver la mezcla de papilla y ácido acético por lo menos 2 horas, y preferentemente más de 4 horas, debiéndose separarse luego el eluato obtenido del cuerpo sólido no disuelto, mediante centrifugado o filtrado

De manera ventajosa, la precipitación fraccionada de sulfato amónico se lleva a cabo en la primera fase en una solución acuosa de sulfato amónico de 15-20% en peso (Gew-%), preferentemente de aproximadamente 17.5% en peso (Gew-%), y en una segunda fase,de 30-40% en peso (Gew-%), preferentemente de aproximadamente 34,3% en peso (Gew-%). Las proteínas y encimas no deseadas obtenidas en la primera fase de la precipitación, y la fracción del precipitado de hialuronidasa obtenida en la segunda fase pueden separarse mediante centrifugado o filtrado de la fase líquida.

La fracción del precipitado de hialorunidasa se suspende preferentemente en agua, y la diálisis se lleva a cabo hasta una osmolaridad entre 10-40 mosm/kg, preferentemente entre 20-30 mosm/kg. El contenido proteínico de la fracción sometida al proceso de diálisis y precipitada de hialuronidasa se sitúa sobre los siguientes valores, medidos entre 1,0-4,0%, preferentemente entre 1,9-2,1%, según Kjeldahl. Por lo que entonces el pH se sitúa entre 4,5-5,8, preferentemente sobre aproximadamente 5,1, y se centrifuga el precipitado resultante. El efecto de ósmosis está definido por la ecuación m = (-ln a_{A})/M_{A}, siendo m la osmolaridad en Mol/kg (o sea. mosm/kg), a_{A} la actividad del disolvente A (aquí agua) y M_{A} la masa molecular del disolvente A. La determinación del contenido proteínico según Kjeldahl es en esencia el conocido método de Kjeldahl de identificación de nitrógeno, por el que partiendo del cual se puede volver a verificar el contenido proteínico. Al respecto puede remitirse, por ejemplo, a Römpp, Chemie Lexikon, 1995, Edición Paperback, tomo 3, página 2246, así como a las citas allí contenidas.

Por lo demás, se prefiere que el contenido proteínico de la fracción precipitada de hialuronidasa en la primera fase del procedimiento de adsorción se sitúe en 1,0-2,0, preferentemente en 1,4-1,6%, medido según Kjeldahl, añadiendo luego en solución de citrato (pH 8,0) de 1/5-1/20, preferentemente 1/10 del volumen de la fracción empleada del precipitado de hialuronidasa, realizándose luego la fase del procedimiento de adsorción, añadiendo una solución de hidrato de óxido de aluminio de 1,0-10%, preferentemente de 2,5-3,5%, debiendo contener la cantidad añadida de solución de hidrato de óxido de aluminio de 10-50 ml/g de proteína, preferentemente de 20-40 ml/g, y con mayor preferencia aún de aproximadamente 30 ml/g, debiendo efectuarse después de la fase de adsorción del procedimiento por lo menos un lavado, preferentemente dos, del sedimento resultante, con un pH de 7,5-9,5, preferentemente de aproximadamente 8,5, llevándose a cabo luego la fase de procedimiento de desorción, removiéndolo en una solución acuosa con un pH de 3,5-6,0, preferentemente con un pH de aproximadamente 4,2. Los lavados se efectúan preferentemente con una solución compuesta de una parte en solución de citrato (pH 8,) y 1-50 partes de agua, preferentemente 10 partes (referidas a los pesos), debiendo corresponder el volumen de la solución de cada lavado al volumen total de la hialuronidasa + solución en solución de citrato, debiendo situarse, cada vez que se remueva el sedimento en la solución de lavado, con 0,1 m de ácido cítrico, en aproximadamente 8.5

También se prefiere que la ultrafiltración se lleve a cabo con un límite de desdoblamiento de entre 9.000 - 11.000 Dalton, preferentemente de 10.000 Dalton, y cuando la ultrafiltración se efectúa en la inteligencia de que la actividad de la hialuronidasa obtenida sea de, por lo menos, 3000 unidades internacionales/ml, preferentemente de, por lo menos, 5500 unidades internacionales/ml. La actividad de la hialuronidasa se determina con un test que explica detalladamente la ejecución mediante un ejemplo. A continuación de la ultrafiltración puede realizarse una diálisis con una osmolaridad de entre 5-50 mosm/kg, preferentemente entre 10-30 mosm/kg.

Con respecto a la separación de gérmenes patógenos y para evitar la formación de pirógenos, es ventajoso que a continuación de la diálisis, para separar el sulfato amónico y/o antes de la ultrafilfración, se efectúe una filtración de esterilización, para la cual se emplea un filtro con unos poros, cuyo tamaño garantice la retención de bacterias e incluso virus, si los hubiese.

La hialuronidasa obtenida con arreglo a lo expuesto en el descubrimiento puede ser empleada en la producción de un medicamento o de un paquete de medicamentos para el tratamiento de enfermedades tumorales, mezclándose el preparado con uno o con varios ciclostáticos usuales y tratado galénicamente o convirtiendo por separado el preparado que contiene hialuronidasa y uno o varios citostáticos en componentes que han de ser administrados por separado del paquete de medicamentos. Por paquete de medicamentos se entiende un paquete combinado en el que se han acomodado en espacios separados dos preparados de agentes activos que, sin embargo, están previstos para ser administrados al mismo tiempo o con un cierto desfase. En este último caso puede preferirse determinar que el preparado de hialuronidasa sea administrado antes del citostático. Por citostáticos se entienden aquellas sustancias que pueden matar especialmente células tumorales o que, por lo menos, tengan un efecto obstaculizador o paralizador.

Como enfermedades debidas a la formación de placas en los vasos sanguíneos pueden nombrarse, por ejemplo, la arterioesclerosis, especialmente de los vasos coronarios, de la carótida y de las arterias que llevan al cerebro. En casos graves esto provoca cuadros de infartos de corazón, apoplejías, trastornos circulatorios en las extremidades, de tejidos conjuntivos y de otros órganos, como testículos, etc. Estas enfermedades se originan por lo general debido a concreciones en las paredes internas de los vasos sanguíneos, concreciones que reducen el flujo de sangre en los vasos sanguíneos. A estas concreciones en las paredes internas se las llaman placas. Las placas pueden eliminarse mediante medios mecánicos, por ejemplo mediante un cateter del corazón, y también por medios químicos o bioquímicos. En este último caso, las sustancias de las que se compone la placa (por ejemplo concreciones calcáreas hialinas) son descompuestas y de esta manera por lo menos parcialmente disueltas. Sorprendentemente se ha constatado, mediante análisis del riego circulatorio efectuados en vasos sanguíneos extraídos que eran más estrechos debido a la placas, que con el empleo de un preparado con hialuronidasa, obtenido con arreglo al procedimiento descrito en el descubrimiento, en el medio de la corriente circulatoria se obtenía una considerable mejora en la resistencia a la corriente circulatoria. Esto se debe a la disolución de la placa por efecto de la hialuronidasa. En unos primeros reconocimientos clínicos también se ha constatado que el estado de los pacientes con trastornos en el sistema cardiocirculatorio originados por placas, ha experimentado una considerable mejoría tras la toma del preparado. Las tomas se llevaron a cabo mediante inyección intravenosa de 1500 unidades del preparado, disuelto en suero fisiológico, tres veces por semana. También es posible la toma mediante inyección intraperitoneal o intramuscular, o la elección de otras concentraciones o dosis. Igualmente es posible el uso como profilaxis.

Al emplear este tipo de preparado para la producción de un medicamento o de un paquete de medicamentos para el tratamiento de enfermedades tumorales, se constató sorprendentemente que este preparado en concreto tenía un efecto especialmente bueno como coadyuvante para diferentes citostáticos. Esto se debe posiblemente a la acción de permeabilización del tejido ejercida por la hialuronidasa. Como antineoplástika o citostáticos apropiados se citan, a título de ejemplo: Perfosamid, Cyclophosphamid, Lomustin, Mechlorethamin, Prednison, Vincristin, Methotrexat, Procarbazin, Peptichemio, Doxorubicin, Vindesin, Cisplatin y Mitomycin (C). Sin embargo, especialmente se prefiere el empleo de citostáticos pertenecientes al grupo de sustancias antagonistas de la pirimidina, especialmente gematabine. Los citados citostáticos pueden obtenerse y comprarse libremente. Tras los primeros ensayos, el empleo de un preparado de este tipo conjuntamente con gematabine es especialmente muy prometedor para el tratamiento de carcinomas colorectales, especialmente en el caso de pacientes resistentes a la 5-FU/Leucovorina. Suministrándose gematabine mezclada con un preparado obtenido según el procedimiento del descubrimiento, o por separado, en una dosis de 200 a 5000, preferentemente de 500 a 4000 mg/m^{2} y más preferente aún de hasta un máximo de 1000 mg/m^{2} en los días 1, 8, 15, seguidos de un período de descanso de una semana, y volviendo a empezar durante un período de 30-60 minutos, siendo suministrada mediante infusión. Cada una de las cantidades así suministradas, o de 1/2 a 3 horas antes, de hialuronidasa alcanzan de 100 hasta 4000 unidades, preferentemente de 300 a 1000 unidades. Lógicamente es posible variar la cronología de las tomas.

También es posible emplear un preparado de este tipo como terapia o profilaxis tumoral sin aditamento de otras sustancias. Especialmente no es forzosamente necesario el aditamento de ningún citostático. Ello se basa en el conocimiento de que el preparado, mediante la disgregación del ácido de hialurónico en células tumorales, puede reconocerlas en cierto modo, teniendo como consecuencia que el propio sistema inmunológico del organismo reconoce y puede destruir las células tumorales descubiertas.

A continuación de explica más detalladamente el descubrimiento, mostrando un ejemplo de la fabricación. Se emplearon las siguientes soluciones: solución de citrato con un pH de 8,0 compuesto de 2,80% en volumen (Vol-%) 0,1 m ácido cítrico y 97,20% en volumen (Vol-%) 0,2 m bifosfato sódico; en solución de acetato sódico con un pH de 4,2, compuesto de 3,33% en volumen (Vol-%) 1 m acetato sódico, 6,66% en volumen (Vol-%) 1 m ácido acético y 90,01% en volumen (Vol-%) agua. En tanto en cuanto se emplee agua en la solución o en otras cosas en relación con el ejemplo de ejecución, se trata de un grado de pureza "para la inyección".

Como sistema para el test, para determinar la actividad de la hialuronidasa entre el producto intermedio y el producto final, se utiliza el test de disminución de enturbiamiento. Esta determinación se basa en el efecto de la hialuronidasa para hidrolizar ácido hialurónico. El ácido hialurónico, junto con sustancias apropiadas como, por ejemplo, suero normal de caballo o una solución de albúmina, produce un enturbiamiento. La disminución de ese enturbiamiento en la mezcla reactiva se observa espectométricamente (test de disminución de enturbiamiento). Si fuera necesario, los productos intermedios pueden diluirse previamente en solución de fosfato, y los productos finales o pueden diluirse con una solución de suero fisiológico (condiciones: temperatura ambiente). A continuación, se les mezcla con la solución indicada en el test (30 mg de ácido hialurónico en 25 ml de agua bisdestilada, diluida en una relación de 1+2 el día en que se vaya a llevar a cabo la determinación. Adicionalmente se añade una solución se suero de uso normal. Las cantidades de ácido hialurónico son elegidas de tal manera que se ponga en exceso respecto a la cantidad que se vaya a fijar de encimas. La disminución del enturbiamiento se determina fotométricamente en base a la extinción a los 640 nm. La actividad se calcula en base a la curva de referencia mediante la extinción recibida (resulta de diluciones standard).Como tipo standard se utiliza un standard interno que coincide con la composición del producto final y cuya actividad se constata en base a un índice WHO standard en pruebas múltiples. La actividad del índice WHO standard se determina en base a un apropiado Londoner Urstandards (standard internacional).

Primeramente se trituran en una máquina de picar carne 30 kgs de testículos de toro, desollados y limpios, en estado semicongelado. La pasta obtenida se remueven por lo menos durante 4 horas con 301 0.1 m de ácido acético, disolviéndose las proteínas y/o encimas. El eluato se separa mediante centrifugado o filtrado. Los residuos se desechan.

El eluato así obtenido se somete luego a una precipitación fraccionada de sulfato amónico. A esto se le mezcla, removiendo constantemente, 212 g de sulfato amónico por litro, removiéndose a continuación durante 30 minutos una vez se haya disuelto. De ello resulta una solución de sulfato amónico de aproximadamente 17,5% en peso (Gew-%) (suponiéndose que el espesor del extracto es de aproximadamente 1). El precipitado es separado por centrifugado o filtrado, y desechado. Lo obtenido mediante el filtrado o el centrifugado se mezcla luego con 282 g de sulfato amónico por litro y se remueve a continuación durante 30 minutos. De ello resulta una solución de sulfato amónico de aproximadamente 34,3% en peso (Gew-%) (suponiéndose que el espesor del extracto, debido al contenido de sulfato amónico, es de aproximadamente 1,1009). Por la noche se deja reposar la precipitación. La separación del precipitado se lleva a cabo mediante filtrado o centrifugado, obteniéndose la fracción de precipitado de hialuronidasa en forma sólida. La fracción de hialuronidasa se suspende o disuelve en aproximadamente 4l de agua, y se dializa. La diálisis se realiza hasta una osmolaridad de 20-30 mosm/kg. El contenido proteínico tras la diálisis se sitúa, mediante aditamento de agua, en 1,9-2,1%, según Kjendahl. El pH de la solución obtenida de esta manera se lleva hasta 5,1, con 1 n de NaOH. Después de centrifugar el precipitado de sulfato amónico obtenido de la diálisis, se lleva a cabo una filtración de esterilización.

El preparado en bruto obtenido de esta manera (fracción de la precipitación de hialuronidasa) es diluido hasta situarlo en un contenido de proteína de 1,4-1,6% (según Kjendahl) y a continuación se mezcla con un 1/10 de su volumen en solución de citrato. Tras añadir hidrato de óxido de aluminio (30 ml/g de proteína) en una solución de 2,5 a 3,5%, el pH se sitúa en 8,5, se remueve durante 30 minutos y a continuación se centrifuga. El remanente se decanta y se desecha. A continuación se efectúan dos lavados del precipitado con una solución de lavado (1 parte en solución de citrato y 10 partes de agua). En cada lavado, el volumen de la solución de lavado corresponde al volumen total del preparado en bruto y de la solución de citrato, situándose el pH en 8,5 con 0,1 m de ácido cítrico cada vez que se haya removido el sedimento en la solución de lavado. Los remanentes procedentes del centrifugado en cada lavado se desechan. El sedimento se remueve luego en un volumen doble en una solución de acetato de sodio, situando el pH en 4,2, añadiendo ácido acético (concentrado). Después de removerlo (30 minutos) se efectúa el centrifugado de la mezcla de desorción. El remanente decantado se sigue elaborando según se describe a continuación, desechándose el sedimento.

La fracción de la precipitación de hialuronidasa depurada hasta ese momento se filtra de forma esterilizada mediante un filtro de profundidad (capas de la empresa Seitz, del tipo BIO 10) y, luego, con un ultrafiltro con un límite de exclusión de 10.000 Dalton (cartuchos de fibra hueca o del sistema de casetes de la empresa Millipore) se la comprime hasta una eventual actividad mínima de 5.500 unidades internacionales/ml. Luego se dializa manteniendo un volumen constante hasta alcanzar una osmolaridad de 10-30 mosm/kg. Antes de proseguir con la elaboración se toma una prueba para determinar tanto las proteínas como la actividad, calculándose la relación unidades internacionales de hialuronidasa/mg de proteína (cálculo de determinación proteínica según Kjendahl).

A la cantidad por litro de producto obtenido de esta manera se le añaden 0,26 litros de hidrolizado parcial de gelatina de 3,6%, de manera que la mezcla contenga 7,5 mg por ml de hidrolizado parcial de gelatina. A continuación de ello, se lleva acabo una filtración de esterilización. Luego, conforme a la actividad deseada, puede efectuarse el envasado de cada una de las unidades. Para ello se añade la cantidad necesaria de hidrolizado parcial de gelatina, o de agua, habiéndose debido añadir siempre una cierta cantidad de hidrolizado parcial de gelatina como coloide de protección. Finalmente, el envasado se realiza, por ejemplo, mediante un filtro de membrana de 0,2 \mum, o de bujías filtrantes, en ampollas de 1 ml. Inmediatamente después de envasado se congelan las ampollas y se liofilizan. La licuefacción de las ampollas debería suceder de manera rápida y teniendo en cuenta que la humedad restante en el preparado contenido quede por debajo de un 5% (pérdida por secado según DAB10).

Claims (10)

1. \global\parskip0.950000\baselineskip

   1. Procedimiento para fabricar un preparado que contenga hialuronidasa, triturándose testículos de mamíferos, especialmente testículos de toro, separándose del del triturado obtenido proteínas y encimas en un medio ácido formando un eluato, sometiéndose el eluato a una precipitación fraccionada de sulfato amónico, obteniendo de esta manera una fracción de precipitación de hialuronidasa, sometiendo la fracción de precipitación de hialuronidasa a una diálisis para separar el sulfato amónico, sometiéndose la fracción de precipitación de hialuronidasa obtenida tras la diálisis, para su depuración, a una fase de un procedimiento de adsorción y desorción de con hidrato de óxido de aluminio, preparándose galénicamente la fracción de precipitación de hialuronidasa,

   caracterizada debido a

   que la precipitación fraccionada de sulfato amónico se lleva a cabo en una primera fase de la precipitación en una solución acuosa de 10-29% en peso (Gew.%) de sulfato amónico, y en una segunda fase de la precipitación, en una solución acuosa de sulfato amónico al 15-65% en peso (Gew-%) y a

   que la fracción depurada de la precipitación de hialuronidasa es sometida, antes de su preparación galénica, a una ultrafiltración con un límite de exclusión de 5.000 a 30.000 Dalton.
2. 2. Procedimiento según reivindicación 1, caracterizado debido a que la solución en medio ácido de las proteínas y las encimas del triturado se lleva a cabo con 0,02-0,2 moles de ácido acético, preferentemente con 0,1 moles de ácido acético, siendo la relación de peso entre el ácido acético y los testículos de 0,2:1, y hasta 5:1, preferentemente de 0,8:1, y hasta 1,2:1, y más preferentemente aún de aproximadamente 1:1, debiéndose remover la mezcla del triturado y ácido acético por lo menos 2 horas, preferentemente más de 4 horas, separándose el eluato obtenido de esta manera, mediante centrifugado o filtrado, de los cuerpos sólidos no diluidos.
3. 3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado debido a que la precipitación fraccionada de sulfato amónico se lleva a cabo en una primera fase de la precipitación en una solución acuosa de sulfato amónico de 15-20% en peso (Gew-%), preferentemente de aproximadamente 17,5% en peso (Gew-%), y en una segunda fase de la precipitación, en una solución acuosa de sulfato amónico de 30-40% en peso (Gew-%), preferentemente de aproximadamente 34,3% en peso (Gew-%).
4. 4. Procedimiento según uno de las reivindicaciones de los puntos 1 a 3, caracterizado debido a que las proteínas y encimas no deseadas precipitadas en la primera fase de la precipitación, y a que la fracción de hialuronidasa de la precipitación obtenida en la segunda fase de la precipitación son separadas mediante centrifugado o filtrado de la fase líquida.
5. 5. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado debido a que la fracción de precipitación de hialuronidasa se suspende en agua y a que la diálisis se lleva a cabo hasta una osmolaridad de 10-40 mosm/kg, preferentemente de 20-30 mosm/kg, y a que el contenido proteínico de la fracción de precipitación de hialuronidasa sometida a diálisis se sitúa en 1,0-4,0%, preferentemente 1,9-2,1%, medido según Kjeldahl, y a que luego el pH se sitúa en 4,5-5,8, preferentemente aproximadamente 5,1 y a que la solución obtenida de la diálisis es centrifugada.
6. 6. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 5, caracterizado debido a que el contenido proteínico de la fracción de precipitación de hialorunidasa empleada en la fase de adsorción del procedimiento se sitúa en 1,0-2,0%, preferentemente en 1,4-1,6%, medido según Kjendahl, a que luego se añade en una solución de citrato en relación de 1/5-1/20, preferentemente 1/10, del volumen de la fracción de precipitación de hialuronidasa empleada, a que luego se lleva a cabo la fase del procedimiento de adsorción, añadiendo una solución de hidrato de óxido de aluminio en la proporción de 1,0-10%, preferentemente de 2,5-3,5%, debiendo ser la cantidad de proteína de la solución de hidrato de aluminio empleada de 10-50 ml/g, preferentemente de 20-40 ml/g, y más preferentemente aún de aproximadamente 30 ml/g de proteína, que después de la fase del procedimiento de adsorción el sedimento resultante sea sometido por lo menos a un lavado con un pH de 7,5-9,5, preferentemente con aproximadamente 8,5, y que luego se lleve a cabo la fase del procedimiento de desorción, removiendo en una solución acuosa con un pH de 3,5-6,0, preferentemente con un pH de aproximadamente 4,2.
7. 7. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 6, caracterizado debido a que la ultrafiltración se realiza con un límite de exclusión de 9.000 - 11.000 Dalton, preferentemente de 10.000 Dalton.
8. 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado debido a que la ultrafiltración se lleva a cabo en la inteligencia de que la actividad de la hiarulonidasa obtenida es de por lo menos 3000 unidades internacionales/ml, preferentemente de por lo menos 5500 unidades internacionales/ml.
9. 9. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 8, caracterizado debido a que a continuación de la ultrafiltración se lleva a cabo una diálisis hasta una osmolaridad de 5-50 monsm/kg, preferentemente de 10-30 mosm/kg.
10. 10. Procedimiento según una de las reivindicaciones de 1 a 9, caracterizado debido a que a continuación de la diálisis para la separación del sulfato amónico y/o antes de la ultrafiltración se lleva a cabo una filtración de esterilización.