JPS6042207B2 - 胎盤よりプラスミノ−ゲン型活性化合物を抽出する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はなるべくはヒトに由来するプラスミノーゲン型
の活性化合物、それらの化合物を含有する医薬及びそれ
らの活性化合物を胎盤パルプより抽出する方法に関する
。

プラスミノーゲンは又プロフィブリノリジンとも言われ
、普通は血しよう中に存在し、キナーゼのような活性化
剤の作用でプラスミン（又はフィブリノリジン）に変換
されうる蛋白質である。

血液の凝固をすみやかに溶解させるというプラスミンの
有する性質を考慮して、血栓溶解剤の活性成分としてプ
ラスミノーゲンを用いることが提案されている。プラス
ミノーゲンを抽出する種々の方法が提案されている。

なるべくは、血栓溶解剤の活性成分としての使用を考慮
する時には特に、このプラスミノーゲンはヒトに由来せ
ねばならない。それゆえに考慮されるプラスミノーゲン
の原料は、血しようより本質的に成立ち、そして、利用
の程度は小であれヒトの胎盤であつた。実際、血しよう
は基本的に、プラスミノーゲンに有利な材料となつてい
る。

実際に、このものは、他の蛋白質とあわせて血しよう中
に溶存しており分別操作特に分別沈澱を用いて比較的に
容易に分離しうる。例えば、やや酸性の媒体、特に５．
３から６の間のｐＨで、ある種のプラスミノーゲン活性
化阻害剤’がプラスミノーゲンの溶解性を増加させると
いう既知の性質を応用して、血しよう調製物中てプラス
ミノーゲンをずい伴する蛋白質の一定量を沈澱さすこと
が提案された。

別の用途のために血しようが用いられるので、一般的に
、プラスミノーゲンの可能の原料として、ヒトの胎盤、
更に具体的には胎盤血液を用いることに興味が持たれた
。

然し、実験室で研究された、血しようよりプラスミノー
ゲンを抽出する技術は、そのままでは、胎盤血液よりプ
ラスミノーゲンを抽出することにあてはめ得ないことが
知られており、これは疑いもなく胎盤血液中のプラスミ
ノーゲンに伴う蛋白質、脂質の性質が異なることによる
。胎盤血液は特に高い割合でプラスミンを含有するので
ある。プラスミンよりのプラスミノーゲンの分離は達成
し難い。更に留意すべきこととして、ヒトの胎盤血液よ
リプラスミノーゲンを抽出する既知のすべての方法では
、この原料中で、プラスミノーゲンに伴なう天然のアク
チベーターの影響下に、特にプラスミノーゲンをプラス
ミンに活性化するのを防止する目的で、酸性抽出媒体を
必要としている。

然し、留意すべきこととして、抽出媒体のＰＨは、得ら
れるプラスミノーゲンの物理的性質に影響のないわけで
はない。特に、媒体を酸性、特に５から６よりも低いＰ
Ｈとすると、プラスミノーゲンのある種の物理的性質が
変化する。実際、酸性で得られるプラスミノーゲンの中
性媒体中での安定性および溶解性は、自然のままのプラ
スミノーゲンに比して著しく減少する。プラスミノーゲ
ン不活化の作用を持つある種の阻害剤を媒体に添加する
か、又は特に塩をある割合で添加して媒体のイオン強度
を変化させることにより、より可逆的な様式で、これら
の条件で得られるプラスミノーゲンの可溶性をいくらか
改良しうることは確実である。

然し、得られる溶液中にこれらの阻害剤又はこれらの塩
が存在すると、不可能でないにしても、これらの溶液を
医薬の構成に使用することは困難となる。

特に、注射用に用いる場合に然りである。これらの阻害
剤又は塩をあらかじめ分離しようとする試みにおいては
いずれもこれらの溶液よリプラスミノーゲンが再沈殿す
ることになる。又、特にフランス特許ＮＯ．ｌ，３４７
，Ｏ２９に抽出方法が記載されたがこの方法では、凍結
させそしてバルブ状とした全胎盤より、プラスミノーゲ
ンの性質を有する物質を分離している。この方法は、牛
血液をストレプトキナーゼ作用に感受性とするのに特に
適当である。然し、これもなお酸性媒体て抽出する方法
である。上記の便宜的方法によつた時には特にそうであ
るが、ある程度は可溶性の生成物が得られる。然し、著
しい量の蛋白質、特にプラスミン蛋白質を含有する。更
にこれらの異質蛋白質が存在すると、生成物の可溶化に
無視しえぬ影響を示すことが分つた。即ち蛋白質を更に
分解するに当つて、プラスミノーゲン活性に富む分画を
沈殿さすことになる。本発明の目的はこれらの難点を克
服することで、プラスミノーゲン型化合物を高純度で含
有し、実質的にないしはまつたくプラスミンを含有せず
、更にはプラスミノーゲン活性化阻害剤又は無機塩がな
くとも中性媒体に完全に可溶の生成物を供与することで
ある。

更に、酸性とする中間段階をはさまないで、胎盤よりこ
の生成物を分離する方法にも関する。本発明は、プラス
ミノーゲン活性化阻害剤の存在で中性ＰＨで胎盤バルブ
を離解さすことにより、胎盤血液を除いたあとの、プラ
スミノーゲン型化合物を、胎盤バルブに保持されている
か、更には固定されたままであつても、抽出することが
できるという発明にもとづいている。

別言すれば、本発明に従う方法は胎盤血液と胎盤バルブ
とを分けること、５から１０までの間のＰＨｌなるべく
は中性のＰＨの溶液中でプラスミノーゲン活性化阻害剤
特にイプシロンアミノ酸の存在でバルブを離解さすこと
、およびバルブを除くことを特徴としている。かくして
、特に阻害剤を分・離したあとに、プラスミノーゲン型
の上記した化合物を含有する粗生成物の溶液が得られる
。このものは、以下、便宜上、“゜胎盤プラスミノーゲ
ン゛と包括的にしばしば称することとする。なお、ここ
で用いる１胎盤パルプョなる用語は抽出しうるプラスミ
ノーゲンの一部を含有するフィブリン凝塊をも含むもの
である。すなわち、胎盤バルブは分離しうる液状血液を
除去した後、つまり凍結胎盤を解凍し、液状血液を除去
した後に得られるすべての固形物からなるものである。
興味深いこととして、プラスミノーゲンが胎盤バルブに
保持されている様式は、ある程度は、アフイニテイ ク
ロマトグラフィーにおいて基質上に酵素が固定されてい
る様式に類似している。この場合、酵素の特異的阻害剤
の溶液で酵素を溶出している。無機塩の存在しない状態
で、つまり水の中でこの抽出を実施しうる。

然し、生理的血清、なるべくは等張クロライド溶液、特
に９〜１１０（４）塩化ナトリウム溶液で実施するのが
有利である。実際、こ・れらの溶液を用いると異質蛋白
質の抽出は最小におさえられ、それで、この抽出操作の
あと、胎盤プラスミノーゲンの特徴を有しそしてプラス
ミンに活性化されうる化合物又は物質の非常に濃縮され
た分画をうることが可能となる。以下の記載で、これら
の化合物又は物質の“強力なプラスミン活性゛について
言及することとする。本発明方法の更に重要な利点は、
抽出操作自体を実施する間、つまり、普通ではもつとも
活性化されやすい時に、つまり生理的ＰＨで、胎盤プラ
スミノーゲンが活性化されることを防ぎうるという事実
てある。

本発明の有利な具体例として、用いる阻害剤の濃度は、
一般的に約０．００１から０．１モルの間、なるべくは
０．０３５モルの付近とする。

本発明方法を用いるに特に有利なプラスミノーゲン活性
化阻害剤は、式を有するＬ−リジン、 式 を有するイプシロンアミノカプロン酸（ＡεＡＣ）又は
、式 を有するトランスー４ アミノメチルシクロヘキサンカ
ルボン酸（ＡＭＣＨＡ）がある。

それで、離解浴より阻害剤を分けたあとただちに、塩濃
度及びＰＨについて生理的条件にあるプラスミノーゲン
溶液が得られる。

プラスミノーゲン阻害剤の存在しないまま同じ離解操作
を行なうと、以下に示すように、胎盤プラスミノーゲン
はほんのわずかしか更にはまつたく抽出されない。

得られる溶液中に含まれる胎盤プラスミノーゲーンは生
理的媒体に可溶であることを強調したい。

それは、分離及び離解の操作のすべてを、この状態を保
つのに相容れるＰＨで実施しているからである。次に、
従来法によりプラスミノーゲン阻害剤の分離に進むこと
が可能である。

それの応用は、プラスミノーゲン型の化合物と阻害剤の
分子量が著しく異なるので、それだけにしばしば容易と
なる。たとえばプラスミノーゲン型の化合物の酵素的性
質を変えることのない試剤を用いて、分画沈澱を用いる
分離法を記載してみる。有利な試剤は、特に安価であり
高い濃度となしうる硫酸アンモニウムである。もちろん
、同じ目的で用いる他ノの塩も使用しうる。たとえば、
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウ
ムを用いうる。他の分画沈澱剤たとえばアルコールも用
いうるが、その時には、溶液中に残存するアミノ酸より
沈澱の形のプラスミノーゲンを分けうる。物理的方法、
特に透析、分子ふるいによる沖過、たとえば゜゜ＳＥＰ
ＨＡＤＥＸ゛として知られるゲルによる枦過による分離
を実施することもできる。更に、中性又は非常に弱いア
ルカリ性の媒体中ノで、たとえばＰＨ８でイオン交換操
作を行なうことも可能である。

この場合、阻害剤は溶出され、プラスミノーゲンは樹脂
に吸収されて残る。もちろん、プラスミノーゲン型の化
合物を離解溶液より非常に容易に分離しうることを説明
しようとして、以上のような種々の方法のあることを示
したことはいうまでもない。胎盤プラスミノーゲンの粗
溶液は、胎盤プラスミノーゲンの他に、大部分（特に９
０から９５％）が蛋白質性のものである不純物を含む。

これら蛋白性不純物は既知の方法で分けうる。

然し、粗プラスミノーゲン及び蛋白性不純物のかなりを
含有する溶液を特に上記した塩によつて分画沈殿し、胎
盤プラスミノーゲンを含有する沈殿を水溶液に溶解して
透析し、透析内液を、プラスミノーゲン活性化阻害剤、
なるべくはリジンが共有結合て結合した基質上での親和
性によるクロマトグラフィーに処し、基質に保持されて
いる胎盤プラスミノーゲンを、プラスミノーゲン活性化
阻害剤、特にイプシロンアミノカプロン酸の溶液で溶出
し、最後にふたたび溶出液を透析して阻害剤を除く。こ
れらの操作はすべて、５を超えるＰＨで実施する。これ
ら胎盤プラスミノーゲンに潜在するプラスミン活性は、
以下に示す医薬としての性質から分るように極度に高い
。胎盤プラスミノーゲンを分析して調べると、以下に“
予備活性化されたプラスミノーゲゾ゛と称するペプチド
を高い割合で含有する。

このものは、プラスミノーゲンの全体つまり生のままの
プラスミノーゲンより、６８個程度のアミノ酸よりなる
分子量７０００から８０００程度のペプチド鎖が遊離Ｎ
Ｈ２基を有するアミノ酸（主にグルタミン酸）側よりは
ずれて生じたものである。なお、プラスミノーゲンペプ
チド鎖の別の末端は、ＲＯＢＢＩＮＳ等Ｊ．ＢｌＯｌ．
Ｃｈｅｍ．２４２，２３３３−２３４２，１９６７によ
れば、基本的にアスパラギンより成立ち、それのカルボ
キシ基が遊離している。胎盤プラスミノーゲンに含まれ
る、潜在的プラスミン活性を有する残りの部分は生のま
まのプラスミノーゲンである。予備活性化されたプラス
ミノーゲンのうちでかなりに存在するものとしては、メ
チオニンより成立つ、遊離アミノ基を有する末端アミノ
酸を有するペプチド鎖がかなりある。以下に、この予備
活性化されたプラスミノーゲンを、゜゜メチオニンープ
ラスミノーゲゾ゛と称することにする。予備活性化され
たプラスミノーゲンのかなり高い割合は、バリンより成
立つアミノ酸を遊離アミノ基末端とするもので、以下に
゜“バリンープラスミノーゲゾ゛と称することにする。
それで、本発明は、大きい割合、少なくとも約４０％の
メチオニンープラスミノーゲンを含有するプラスミノー
ゲン型の組成物に関している。

本発明の胎盤プラスミノーゲンは、特に、４０から６０
重量％の程度のメチオニンープラスミノーゲンを含有し
ている。特に、本発明は、潜在的プラスミン活性を有す
る化合物を含有する組成物に関し、このものは、約４０
から約６０重量％のメチオニンプラスミノーゲンと、約
１０から約２田Ｆ量％のバリンプラスミノーゲンと、約
２０から約５踵量％の生のままのプラスミノーゲンとを
含有している。

生のままのプラスミノーゲンの分子量が９０，０００±
５，０００のあいだにあることを考慮して、予備活性化
されたプラスミノーゲンのそれは８３，０００±５，０
０ｑ早度となる。

更に具体的には、本発明は、９５％に達し更にはこれを
超える純度を有し、残余は蛋白質又は不活性の不純物よ
り成立つ以上に記載した型の胎盤プラスミノーゲンに関
し、これらの精製胎盤プラスミノーゲンは上記の粗製プ
ラスミノーゲンから従来法によるプラスミノーゲン精製
法、たとえば以下に示す有利な一般的操作方法で得られ
る。

本発明は又、注射用無菌媒体又は無菌分散液とあわせて
上記胎盤プラスミノーゲンを使用する。一般的に、ヒト
の血しように特に適用しうる、次の一般的操作様式を用
いうる。以下の記載でプラスミノーゲンの抽出に言及す
る場合に、当然、それは、上記定義の゜゜胎盤プラスミ
ノーゲゾ゛と理解されるべきである。凍結状態で入手さ
れた胎盤はマイナス２０度Ｃて貯蔵し、凍結状態で機械
的にバルブ化する。

得られるバルブはプラス３０からプラス４０度Ｃで、水
浴中で機械的にかきまぜて融解させる。温度が１度Ｃ以
上、なるべくは４度Ｃに達した時に、融解を完了する。
得られた液状塊は２５００回転／分て遠心し血液を除く
、これはほとんどプラスミノーゲンを含有していないが
、大量の蛋白質及びプラスミンを含有する。

血液を除いたバルブは、等張塩化物溶液の浴中で、０か
らプラス２０度Ｃまでの温度、なるべくはプラス４度Ｃ
の温度て３時間離解させる。

この浴は、上記阻害剤を低いモル濃度、０．００１モル
より高い濃度、なるべくは０．０３５モルに近い濃度で
含有する。

全体のＰＨは修正せず、それで７．２である。ｌ 離解
時間が経過したら、全体は２５００回転／分で遠心し、
抽出浴よりバルブを分ける。

このようにして胎盤１キロについて抽出液１リットルが
得られる。

１２０ＣＡＵ（力ティン分解活性）を含有し、１５ｍｇ
の純プラスミノーゲンに相当７する。

使用する滴定法は“力ティン分解法ＣＡＳＥＩＮＯＬＹ
ＴＩＣＭＥＴＨＯＤ″として知られるものである。得ら
れる溶液中に含まれるプラスミノーゲンは、既知の方法
で採取しそして精製しうる。

有利フな例として、溶液中に含まれる蛋白質及びプラス
ミノーゲンを硫酸アンモニウムで分画沈澱させる。硫酸
アンモニウムを２０％飽和まで添加すると、溶液より蛋
白質の１部が沈澱する。但し、１リットル当り５４０ｇ
の硫酸アンモニウムを含有する時に１００％飽和と理解
されたい。硫酸アンモニウムを４０％飽和するとプラス
ミノーゲンが沈澱する。これらの操作は、５．５から９
．５の間のＰＨｌなるべくは中性のＰＨで実施する。沈
澱プラスミノーゲンは約６．５から約９．５の間のＰＨ
の緩衝溶液に再溶解し、特に残留硫酸アンモニウム除去
のための透析に付す。透析液はアフイニテイクロマトグ
ラフイーで精製する。たとえば、プラスミノーゲン活性
化阻害剤なるべくはリジンを共有結合で固定した寒天ゲ
ルのような基体を含むカラム上でエチレンージアミンー
テトラ酢酸ジナトリウム塩の存在下に、イプシロンアミ
ノカプロン酸を含有する緩衝液を用いてプラスミノーゲ
ンを採取する。特に阻害剤を除去するために必要に応じ
て、溶出液は更に透析により精製しうる。一般的にこれ
らの操作は文献記載の条件で実施しうるか、すべての場
合について、５より高いＰＨで実施する様式が選択され
る。

このようにして高いプラスミノーゲン活性を有する生成
物が得られる。

プラスミノーゲン含量は−４ＣＡＵ／Ｍｇより高く、プ
ラスミン含量は０．０４ＣＡＵ／Ｍｇより低くなしうる
。もちろん、以上の記載で、プラスミノーゲン含量はウ
ロキナーゼで活性化後のそれを表現し、プラスミン含量
は元来から存在しているプラスミン，である。

本発明方法で得られる胎盤プラスミノーゲンは、精製後
の特徴は次のようである。

電気泳動でモノディスパージョンを示す。

水、等張性塩溶液及び中性ＰＨで普通の組成の緩．”衝
液に可溶である。

中性ＰＨて安定で、１０ＣＡＵ／Ｋｇの投与量でうさぎ
に発熱性がない。

マウス１匹当り１０ＣＡＵの投与量で毒性を示さない。

例１記載の操作、即ち１つはプラスミノーゲン活性化阻
害剤の存在下て、又１つはその非存在下で操作して得ら
れる結果を比較することにより、本発明方法の効果が確
かめられる。例１ プラスミノーゲン活性化阻害剤の抽出効果１５００ｙの
ヒトの胎盤をマイナス２０度Ｃに凍結させてＳＴＥＰＩ
（ＡＮ型摩砕機でバルブ化する。

得られる塊を４０度Ｃの水浴と接触させステンレスステ
イール容器中で手でかくはんして、融解させる。融解に
は４紛を要する。塊の最終温度はプラス６度Ｃである。
プラス４度Ｃに冷却し毎時２５０旧転／分でカップ遠心
機中で融解塊を遠心して、胎盤血液を分ける。

２９０ｙの蛋白質及び７０ＣＡＵより少ない量のプラス
ミノーゲンを含有する胎盤血液（７９０ｙ）の７４０ｃ
ｃをうる。

得られるバルブ（７００ｆ）を２３３ｙ宛に３分する。

つまりＮＯ．ｌ、ＮＯ．２及びＮＯ．３である。これら
は同じ条件で同時処理するが、離解浴は次のようである
。ＮＯ．ｌ 蒸留水 ５００ｃｃ ＮａＣ１４．５ｙ フェノール（静菌剤）０．５ｙ 浴温 プラス５度Ｃ の組成の浴５００ｃｃ中で離解させる。

ＮＯ．２ 蒸留水 ５００ＣＣ ＮａＣ１４．５１ フェノール ０．５ｙ イプシロンアミノカプロン酸 ２．５ｙつまり０．０３８モル
浴温 プラス５度Ｃの浴中て同様に処理
する。

ＮＯ．３ 蒸留水 ５００ｃｃ ＮａＣ１４．５ｑ フェノール ０．５ｙ １−ランスー４−アミノシクロ（ＡＭＣＨＡ）ヘキサン
カルボン酸 ２．５ダつまり０．０３２モル 浴温
プラス５度Ｃこれら３種の離解は、プラス
４度Ｃで１リツトルビーカー３個の中て同時に実施する
。

３時間離解し、その間時々手でかくはんする。

ＰＨはそのままとする。３例とも７．２である。

離解の時間を経過したら、２５００回転／分て１時間プ
ラス４度Ｃに冷却した遠心機中で同時に遠心する。

バルブを分け、次の容量の上清液をうる。

ＮＯ．ｌ５ＯＯｃｃＮＯ． ２５ＯＯｃｃ ＮＯ．３５Ｏ５ｃｃ これら３種の上清液について、攪拌下に２４０１／リッ
トルの硫酸アンモニウム結晶を添加し、硫酸アンモニウ
ム４０％飽和とする。

３例共塩添加終了後２紛間かくはんを続ける。

ＰＨは修正しないが、３例とも６．９てある。３例の溶
液共１時間３紛、２５００回転／分で、プラス４度Ｃで
同時に遠心する。

３例について上清を分け、３例の沈殿を集めて秤量する
。

沈殿１２３ｙ 沈殿２２３．２ｙ 沈殿３２４ダ これら３例の沈殿は、９０％の母液および１０％の蛋白
質より成立つ。

３例の沈殿はそれぞれ０．１モルＰＨ７．５のリン酸緩
一衝液５０ＴｎＬ中に溶解し、次に脱塩冷流水に対して
３時間透析する。

最後の透析は、プラス４度Ｃで０．０１モルのＰＨ７．
５リン酸緩衝液４０リットルに対してｌ？間実施する。
得られる３例の透析液は次の特性を有する。

透析液１容量８０ｃｃＰＨ７．５電導度９５０マイクロ
モー透析液２容量８２ｃｃＰＨ７．５電導度９４０マイ
クロモー透析液３容量９４ｃｃＰＨ７．５電導度９８０
マイクロモープラスミノーゲン活性は次のようである。

透析液１０．１６ＣＡＵ／Ｃｃ×８０ｃｃ＝１２．８Ｃ
ＡＵ透析液２０．８５ＣＡＵ／ＣｃＸ８２ｃｃ＝６９．
５ＣＡＵ透析液３０．７５ＣＡＵ／Ｃｃ×９４ｃｃ＝７
０．５ＣＡＵあとの２つの結果を検討してみると、本発
明に準する方法により得られる抽出結果の質が分かる。

次の例２は、胎盤より胎盤プラスミノーゲンを大規摸に
抽出する段階を記載する。例２ Ａブラスミノーゲンの抽出 ５００ｋｇのヒトの胎盤をマイナス２０度Ｃに冷凍させ
ＰＡＬ〜１ＡＮＮ型摩砕機で細かいバルブ状とする。

２重壁のＷＥＲＮＥＲ型ミキサーの中壁にプラス４０度
Ｃの水を通し、かくはんして塊を融解させる。

融解は２時間３紛で終え最終温度をプラス４度Ｃとする
。

ＲＯＵＳＳＥＬＥ，Ｔ型遠心機で２５００回転／分で１
５分間宛５回遠心し、融解させた塊より胎盤血液を分け
る。

２３８ｋｇのバルブ及び２６０ｋ９の血液をうる。

生理的血清 ５００リツトルイプシロンアミノ
カプロン酸 ２５００ｙ（０．０３８モル）フ
ェノール（静菌剤） ５００ｙ（１％）の組成の
離解浴を温度４度Ｃとしてバルブを浸す。

全体はプラス４度Ｃで３時間かきませる。

媒体のＰＨは調整せず、７．２である。抽出液はＲＯＵ
ＳＳＥＬＥＴ型遠心機て遠心してバルブより分ける。

２５（４）回転／分て１５分間宛、５回遠心する。

抽出液の温度は８度Ｃ．ＰＨ７．２、容量５１０リット
ルである。

Ｂプラスミノーゲンの精製 得られる溶液中に含まれるプラスミノーゲンは次のよう
に精製する。

用いる精製法は親和性によるクロマトグラフィーとして
知られる方法の変法である。

抽出液体はまず澄明とするか、そのためには２０％飽和
に相当する硫酸アンモニウム添加後、ＳＯＬＫＡＦＬＯ
ＣＢＷ２Ｏ（澄明化？過）として市販されている酒過助
剤を添加しろ過するか又は高速度で遠心する。

この澄明化）ろ過又は遠心は、溶液中に残る可能性のあ
るバルブ漱粒子を除くことを目的としている。抽出液に
は次に硫酸アンモニウムを添加し４０％飽和しプラスミ
ノーゲンを沈殿させる。

澄明化（又は遠心）及び沈殿は、５．５から９．５まで
、なるべくは７のＰＨで実施する。

ＰＨは媒体に酸又は塩基を添加しない、自然のＰＨてあ
る。得られる沈殿は、上記阻害剤のうちのひとつを冷脱
塩水に含有する溶液（イ）．００１モルから０．０５モ
ルの間）に再溶解し、２０，０００マイクロモーなるべ
くは１２，０００マイクロモーより少ない電導度とする
。ＰＨは次に５．２から７までの間、なるべくは５．５
とする。

次に、前に添加した？過助剤と不活性不純物をＰ別する
。

得られる沖液は５．５から９までの、なるべくは７．２
のＰＨとし、次にそれに等しい容量の冷脱塩水を１度に
添加して希釈する。

硫酸アンモニウムを４０％飽和として、溶液より活性物
質を沈殿させる。

沈殿は遠心して集める。

沈殿は、ＰＨ６．５から９．５までなるべくは７．５の
、０．１モルから０．５モル、なるべくは０．３モルの
リン酸緩衝液に溶解し、冷脱塩水に対し７から８時間透
析する。

６０００から１００００マイクロモーの電導度とする。

透析内液を遠心するかろ過澄明化し、透析中に現われた
不溶物を除去する。澄明化したか又は遠心した溶液に、
それの１重量／容量％に当たるエチレンジアミン四酢酸
ジナトリウム塩（ＥＤＴＡ）を添加し、ＰＨを、オルト
リン酸及びカセイソーダを用いて、６から９の間、なる
べくは７．５とする。

溶液は寒天ゲルを含有するカラムに注加する。

なお、この寒天ゲルにはリジンを共有結合で固定させて
おき、ＰＨ６から９まで、なるべくは７．５の、０．０
５から０．４モル、なるべくは０．１５モルのリン酸緩
衝液（緩衝液ＮＯ．ｌ）であらかじめ平衡させておく。
溶液がすべてカラムを通つたら、カラムには緩衝液ＮＯ
．ｌを通過させ、流出液，に蛋白質の存在しない状態と
する。洗浄液は次に、ＰＨ６から９まで、なるべくは７
．５の、０．０５から０．４モル、なるべくは０．１モ
ルのリン酸緩衝液（緩衝液ＮＯ．２）に変える。次にカ
ラムは、０．０１モルから０．５モル、なるべくは０．
２モルのイ．ブシロンアミノカプロン酸を含有する緩衝
液ＮＯ．２で溶出する。溶出液を集める。

これは、抽出プラスミノーケンのほとんどすべてを含有
する。次に低いモル濃度のＰＨ６から９、なるべくは０
．０１モル、ＰＨ．７．５のリン酸緩衝液に対して２４
時間透析する。そして凍結乾燥する。用いた胎盤１ｋ９
について１００から１２０ＣＡＵのプラスミノーゲンを
うる。上記粗溶液より出発して５．２ｙの凍結乾燥粉末
、をうる。

次の特徴を有する。プラスミノーゲン含量 ４．４ＣＡ
Ｕ／Ｍｇプラスミン含量 ０．０４ＣＡＵ／Ｔｆ
Ｌ９蛋白質含量５２％（差引き４８％はホスフェートで
ある）この粉末は７程度のＰＨで蒸留水に完全に溶解す
る。

又等張塩溶液及び普通の組成の緩衝液に完全に溶解し、
一般的に上記した特徴のすべてを有する。一般式に、胎
盤バルブより抽出されたプラスミノーゲン型の生成物は
、４ＣＡＵ／Ｍ９より高にプラスミノーゲン含量及び０
．０４ＣＡＵ／Ｍｇより少ないプラスミン含量を有する
。

このように得られる胎盤プラスミノーゲンは高い薬剤活
性及ひすぐれた治療剤としての性質を有する。

Ｒ．ＣＯｕｒｂｉｅｒ等がＡｎｎ．Ｃｈｉｒ．，ｌ９６
３，ｌ７，ＮＯ．５−６，３３１から３３８頁に記載の
方法を用い、急性血栓症をおこさせた犬にプラスミノー
ゲンによる治療試験を試みたところ、プラスミノーゲン
は凝血の大きさをすみやかに減少させ、更には、大多数
の例で完全に融解させてしまつた。

この点について、興味ある観察事項として、１３ｍ９の
蛋白質を含有し１００ＣＡＵの力価を有する量の本発明
の生成物は、上記の治療試験で、フランス特許１，３４
７，０２９により得られた２４０ｍ９の蛋白質を含有す
る生成物を用いて得られたものと実質的に類似する活性
を有する。

一般的に、胎盤プラスミノーゲンは、フィブリン分解機
能の欠落の治療に用いられる。

ヒトの胎盤プラスミノーゲンの使用は、次の臨床例に用
いて特に有利てある。

（ａ）プラスミノーゲンが完全にか又は部分的に欠如し
ている、新生児及び未熟児の急性呼吸障害。

この徴候は肺胞レベルでのフィブリンの沈着による。（
ｂ）塞栓性血栓症及ひ静脈血栓症。

特に、プラスミノーゲンの消費が肝臓の生産レベルを上
廻つている患者では、ストレプトキナーゼ又はウロキナ
ーゼのような医薬によるトロンビン分解治療先立つてプ
ラスミノーゲン投与が奨励される。（ｃ）本質的な脳ミ
クロ血栓症。

（ｄ）プラスミノーゲンの欠如で広がる傾向のある局所
的及びびまん性の急性、亜急性及び慢性の血管内凝血。

単に例示のためであるが、胎盤プラスミノーゲンは連続
的静脈潅流で投与しうる。その際、２４からあ時間に及
んで１，０００から１，２００ＣＡＵとする。又はこれ
を、ゆつくり静注する。これは、６０ｋ９体重の男性に
ついての量である。小児では、６時間毎に２００ＣＡＵ
とする。

ＰＨ７．４に緩衝された９％等張塩溶液で２鞘間をかけ
てゆつくりと潅流する。これらの投与形態では、医薬と
して許容されうるビヒクル、特に生理的血清、なるべく
はグルコース添加血清にプラスミノーゲンを溶解して投
与する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 胎盤血液を除いた胎盤パルプをプラスミノーゲン活
   性化阻害剤を含むｐＨ約５〜約１０の水性媒質で抽出す
   ることを特徴とするプラスミノーゲン型活性物質の抽出
   方法。