ES2263267T3 - Oligonucleotidos antisentido optimizados complementarios a las secuencias de la adn metiltransferasa. - Google Patents
Oligonucleotidos antisentido optimizados complementarios a las secuencias de la adn metiltransferasa.Info
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Abstract
Un oligonucleótido antisentido complementario a secuencias de ácido nucleico de ARN o ADN de doble hebra que codifica la ADN MeTasa y que inhibe la expresión del gen de la ADN metiltransferasa, donde se selecciona el oligonucleótido a partir del grupo que consiste en SEC ID NeM: 8, SEC ID NeM: 9, SEC ID NeM: 10, SEC ID NeM: 13, Y SEC ID NeM: 17.
Description
Oligonucleótidos antisentido optimizados
complementarios a las secuencias de la ADN metiltransferasa.
La invención se refiere a la modulación de la
expresión genética. En particular, la invención se refiere a la
modulación de la expresión genética del gen que codifica la ADN
metiltransferasa, y a la modulación de la expresión genética que
regula la enzima ADN metiltransferasa.
La modulación de la expresión genética se ha
convertido en una aproximación cada vez más importante hacia el
entendimiento de varios procesos celulares y sus vías bioquímicas
fundamentales. Tal entendimiento enriquece el conocimiento
científico y ayuda a conducir hacia nuevos descubrimientos sobre
como aberraciones en tales vías pueden conducir a estados de
enfermedad serios. Finalmente, tales descubrimientos pueden conducir
al desarrollo de tratamientos terapéuticos efectivos para estas
enfermedades.
Un tipo de proceso celular que es de particular
interés es como la célula regula la expresión de sus genes. La
expresión genética aberrante parece que es responsable de una amplia
variedad de desórdenes genéticos heredados, y también ha estado
implicada en numerosos cánceres y otras enfermedades. La regulación
de la expresión genética es un proceso complejo, y muchos aspectos
de este proceso quedan por ser entendidos. Uno de los misterios de
este proceso reside en el hecho de que mientras la información
genética es la misma en todos los tejidos que constituyen un
orga-
nismo multicelular, la expresión de funciones codificadas por el genoma varía significativamente en diferentes tejidos.
nismo multicelular, la expresión de funciones codificadas por el genoma varía significativamente en diferentes tejidos.
En algunos casos, se conoce que los factores de
transcripción específicos por tejido juegan un papel en este
fenómeno (Ver Maniatis y col., Science 1987,
236, 1247-1245; Ingarham y col.,
Annual Review of Physiology 1990, 52,
773-791). Sin embargo, existen varios casos
importantes que no se pueden explicar fácilmente mediante la acción
de los factores de transcripción solamente. Por ejemplo, Midgeon,
Trends. Genet. 1994, 10,
230-235, enseña que la inactivación de X implica la
inactivación de un alelo de un gen que reside en el cromosoma X
inactivo, mientras que el alelo en el cromosoma X activo permanece
para ser expresado. Además, Peterson y Sapienza, Annu. Rev.
Genet. 1993, 27, 7-31, describen
la "huella genética", donde un alelo de un gen que se hereda de
un pariente es activo y el otro alelo que se hereda del otro
pariente es inactivo. En ambos casos, ambos alelos existen en un
entorno que contiene los mismos factores de transcripción, aunque se
expresa un alelo y el otro es silencioso. Así, debe estar implicado
algo diferente a los factores de transcripción en estos
fenómenos.
Los investigadores han estado sondeando que tipo
de "información epigenética" puede estar implicada en este
control adicional de la pauta de expresión del genoma. Holliday,
Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1990,
326, 329-338 discute el posible papel de la
metilación del ADN en tal herencia epigenética. El ADN contiene un
conjunto de modificaciones que no están codificadas en la secuencia
genética, pero se añaden covalentemente al ADN usando una maquinaria
enzimática diferente. Estas modificaciones toman la forma de
metilación en la posición 5 de las bases de citosina en los
dinucleótidos CpG. Numerosos estudios han sugerido que tal
metilación puede estar implicada en regular la expresión genética,
pero su papel preciso ha permanecido huidizo. Por ejemplo, Lock y
col., Cell 1987, 48, 39-46,
plantea preguntas sobre si la temporización de la hipermetilación y
la inactivación X es consistente con un papel causal para la
metilación. Similarmente, Bartolometi y col., Genes
Dev. 1993, 7, 1663-1673 y Brandeis
y col., EMBO J. 1993, 12,
3669-3677, exponen preguntas de
temporización/causalidad para el papel de la metilación en la huella
genética.
Algunas de las limitaciones de los estudios
existentes sobre el papel de la metilación del ADN en la expresión
genética residen en las herramientas que están actualmente
disponibles para llevar a cabo los estudios. Varios estudios han
empleado 5-azaC para inhibir la metilación del ADN.
Sin embargo, el 5-azaC es un análogo de nucleósido
que tiene efectos múltiples en los mecanismos celulares aparte de la
metilación del ADN, haciendo así difícil interpretar los datos
obtenidos a partir de estos estudios. Similarmente, el
5-azadC forma un inhibidor basado en un mecanismo en
la integración en el ADN, pero puede causar el atrapamiento de las
moléculas de la ADN metiltransferasa (de ahora en adelante, ADN
MeTasa) en el ADN, resultando en toxicidades que pueden oscurecer la
interpretación de los datos.
Más recientemente, Szyf y col., J.
Biol. Chem. 1995, 267,
12831-12836, expone una aproximación más prometedora
usando la expresión del ARN antisentido complementario al gen de la
ADN MeTasa para estudiar el efecto de la metilación en células
cancerosas. ZIF y von Hofe, Patente U.S. Núm. 5,578,716, y
Ramchandani y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1997, 94, 684-689 exponen el uso de
oligonucleótidos antisentido complementarios al gen de la ADN MeTasa
para inhibir la tumorigenicidad. Estos desarrollos han proporcionado
nuevas herramientas poderosas para examinar el papel de la
metilación en numerosos procesos celulares. Además, han
proporcionado nuevas aproximaciones prometedoras para desarrollar
compuestos terapéuticos que puedan modular la metilación del ADN. La
promesa de estas aproximaciones subraya la importancia de
desarrollar oligonucleótidos antisentido complementarios a las
secuencias de la ADN metiltransferasa que tengan una actividad
óptima en la inhibición de la expresión genética de la ADN
metiltransferasa. Existe, por lo tanto, una necesidad de tales
oligonucleótidos antisentido optimizados.
La invención proporciona oligonucleótidos
antisentido complementarios a las secuencias de la ADN
metiltransferasa que tienen una actividad óptima en la inhibición de
la expresión del gen de la ADN metiltransferasa. En ciertas
incorporaciones, se caracterizan los oligonucleótidos antisentido
optimizados por tener secuencias de ácidos nucleicos que
proporcionan una eficacia sorprendentemente alta. En algunas de
estas incorporaciones, se caracterizan más los oligonucleótidos
antisentido optimizados de acuerdo con la invención por tener
distintas modificaciones químicas que incrementan más su eficacia.
Finalmente, la invención proporciona métodos para usar tales
oligonucleótidos antisentido como herramientas analíticas y
diagnósticas, como potenciadores de estudios de plantas y animales
transgénicos y para aproximaciones de terapia genética, y como
agentes terapéuticos potenciales.
En un primer aspecto, la invención proporciona
nuevos oligonucleótidos antisentido optimizados que inhiben la
expresión genética de la ADN MeTasa a menores niveles de
concentración de oligonucleótido que los oligonucleótidos que se
conocen previamente. Tales oligonucleótidos antisentido son
complementarios a las secuencias de ácidos nucleicos de ARN o ADN de
doble hebra que codifica la ADN MeTasa. Preferiblemente, tales
oligonucleótidos antisentido contienen uno o más enlaces
internucleósido modificados y pueden contener opcionalmente
desoxiribonucleósidos, ribonucleósidos
2'-O-sustituidos, o cualquier
combinación de ellos. Los oligonucleótidos antisentido que se
prefieren particularmente de acuerdo con este aspecto de la
invención incluyen los oligonucleótidos quiméricos y los
oligonucleótidos híbridos.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un método para investigar el papel de la ADN MeTasa en el
crecimiento celular, incluyendo el crecimiento de células tumorales.
En el método de acuerdo con este aspecto de la invención, se pone en
contacto el tipo de célula de interés con un oligonucleótido
antisentido de acuerdo con la invención, resultando en la inhibición
de la expresión de la ADN MeTasa en la célula. Se pueden administrar
los oligonucleótidos antisentido en diferentes puntos en el ciclo de
la célula, o junto con promotores o inhibidores del crecimiento de
la célula para determinar el papel de la ADN MeTasa en el
crecimiento del tipo de célula de
interés.
interés.
En un tercer aspecto, la invención proporciona
métodos para inhibir el crecimiento tumoral que comprende
administrar a un mamífero, incluyendo un humano, oligonucleótidos
antisentido de acuerdo con la invención. Se administra en el método
de acuerdo con este aspecto de la invención una cantidad
terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido antisentido de
acuerdo con la invención durante un período terapéuticamente
efectivo de tiempo a un mamífero, incluyendo un humano, que tiene
células tumorales presentes en su cuerpo.
La Figura 1 muestra la secuencia objetivo óptima
de nucleótidos de la ADN MeTasa para ciertos oligonucleótidos que se
prefieren complementarios al ARN de la ADN MeTasa, que se fijan a
continuación en los Listados de Secuencias como SEC ID NÚM 1, SEC ID
NÚM 2, SEC ID NÚM 3, SEC ID NÚM 4, SEC ID NÚM 5, SEC ID NÚM 6, y
SEC ID NÚM 7.
La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos
de ciertos oligonucleótidos que se prefieren complementarios al ARN
de la ADN MeTasa, que se fijan a continuación en los Listados de
Secuencias como SEC ID NÚM 8, SEC ID NÚM 9, SEC ID NÚM 10, SEC ID
NÚM 11, SEC ID NÚM 12, SEC ID NÚM 13, SEC ID NÚM 14, SEC ID NÚM 15,
SEC ID NÚM 16, SEC ID NÚM 17, SEC ID NÚM 18, SEC ID NÚM 19, y SEC ID
NÚM 20.
La Figura 3 muestra los valores de IC_{50}
para varios oligonucleótidos antisentido que se prefieren
complementarios al mARN de la ADN MeTasa, tal como se midió por la
reducción de los niveles de mARN de la ADN MeTasa en las células
cancerosas de pulmón humano A549 in vitro.
La Figura 4 muestra los niveles de mARN de la
ADN MeTasa en células del carcinoma de pecho humano
MDA-231 que se trataron con los oligonucleótidos
antisentido optimizados de la invención (-\blacksquare-) tal como
se comparó con los oligonucleótidos que se conocían previamente
(-\blacklozenge-).
La invención se refiere a la modulación de la
expresión genética. En particular, la invención se refiere a la
modulación de la expresión genética que codifica la ADN
metiltransferasa (ADN MeTasa), y a la modulación de la expresión
genética que regula la ADN MeTasa. Las patentes y publicaciones que
se identifican en esta especificación están dentro del conocimiento
de aquéllos hábiles en este campo y se incorporan por la presente
por referencia en su
totalidad.
totalidad.
La invención proporciona oligonucleótidos
antisentido complementarios a las secuencias de ADN MeTasa objetivo
óptimas que tienen una actividad óptima en la inhibición de la
expresión genética de la ADN metiltransferasa. En ciertas
realizaciones, se caracterizan los oligonucleótidos antisentido
optimizados por tener secuencias de ácidos nucleicos que
proporcionen una eficacia sorprendentemente alta. En algunas de
estas realizaciones, se caracterizan más los oligonucleótidos
antisentido optimizados de acuerdo con la invención por tener
diferentes modificaciones químicas que incrementan más su eficacia.
Finalmente, la invención proporciona métodos para usar tales
oligonucleótidos antisentido como herramientas analíticas y
diagnósticas, como potenciadores de estudios transgénicos de plantas
y animales y para aproximaciones a la terapia genética, y como
agentes terapéuticos potenciales.
En un primer aspecto, la invención proporciona
secuencias de la ADN MeTasa objetivo óptimas para ser usadas como
objetivos preferidos para la hibridación de oligonucleótidos
antisentido optimizados. El emparejamiento intramolecular de bases
juega un papel pivote en el secuestro de secuencias, previniendo el
emparejamiento intramolecular esencial para la actividad
antisentido. Se cree que se confina la formación de dúplex entre
oligonucleótidos antisentido y secuencias objetivo a aquellas
regiones que proporcionan una subestructura accesible como lugar
para la nucleación y que tienen así bases desapareadas. La formación
de un dúplex progresará desde el lugar de nucleación a través de un
proceso de "cierre de cremallera", y parará cuando este proceso
encuentre una barrera de energía. Tales barreras pueden incluir por
ejemplo los finales de los tallos o de los giros cerrados en el ARN
plegado. Así la susceptibilidad de una secuencia objetivo frente a
la interacción antisentido varía enormemente de una parte de la
secuencia a otra y se relaciona directamente con un potencial de
secuencia particular para ensamblar en un heterodúplex.
Sin desear estar atado a cualquier teoría
particular, el inventor cree que sus esfuerzos han conducido a la
identificación de las secuencias de la ADN MeTasa abiertas a la
formación de dúplex.
Los ejemplos de secuencias objetivo óptimas de
nucleótidos de la ADN MeTasa para ser usadas como objetivo
preferido para la hibridación de oligonucleótidos antisentido
optimizados se muestran abajo. Las secuencias de nucleótidos de la
ADN MeTasa objetivo óptimas adicionales tienen secuencias que
incluyen como mínimo un solapamiento de nucleótido con las
secuencias objetivo que se muestran abajo.
5' AUCCGAGGAGGGCUACCUGG 3' [SEC ID NÚM 1]
5' GGAGAACGGUGCUCAUGCUU 3' [SEC ID NÚM 2]
5' GUGGCCUUGGCUGACAUGAA 3' [SEC ID NÚM 3]
5' AAGCUGUUGUGUGAGGUUCG 3' [SEC ID NÚM 4]
5' UUGUGUGAGGUUCGCUUAUC 3' [SEC ID NÚM 5]
5' CAUGGUGUUUGUGGCCUUGG 3' [SEC ID NÚM 6]
5' UAGAGUGGGAAUGGCAGAUG 3' [SEC ID NÚM 7]
El primer aspecto de la invención también
proporciona nuevos oligonucleótidos antisentido optimizados que
inhiben la expresión genética de la ADN MeTasa. Tales
oligonucleótidos antisentido son complementarios a las secuencias
de ácidos nucleicos objetivo óptimas de ARN o de ADN de doble hebra
que codifica la ADN MeTasa, preferiblemente la ADN MeTasa humana, y
se caracterizan por su habilidad para inhibir la expresión genética
de la ADN metiltransferasa con un IC_{50} de menos de 100 nM,
preferiblemente de 90 nM o menos, más preferiblemente de 80 nM o
menos, todavía más preferiblemente de 70 nM o menos, incluso más
preferiblemente de 60 nM o menos, y sobre todo preferiblemente de 50
nM o menos. Preferiblemente, se mide tal inhibición determinando los
niveles de mARN de ADN metiltransferasa en las células cancerosas de
pulmón humano A549 in vitro. Para los propósitos de la
invención, "complementario" significa ser suficientemente
complementario para tener la habilidad de hibridar bajo condiciones
fisiológicas hacia una secuencia de nucleótidos de la ADN MeTasa que
puede ser una región genómica, un gen, o un transcripto del ARN de
ella. Tal hibridación es ordinariamente el resultado de un enlace
hidrógeno específico de bases entre hebras complementarias,
preferiblemente para formar los pares de bases de
Watson-Crick o Hoogsteen, aunque otros modos de
enlace de hidrógeno, así como de apilamiento de bases también pueden
conducir a la hibridación. Los oligonucleótidos antisentido de la
invención pueden incluir una o más bases modificadas capaces de la
hibridación. Los oligonucleótidos antisentido de la invención pueden
incluir una o más bases modificadas capaces de la hibridación. El
término "base modificada" tal como se usa aquí denota una base
que sea otra que las cinco bases nitrogenadas tradicionales:
adenina, timina, guanina, uridina, y citosina. Tales bases
modificadas son capaces de la hibridación con una base tradicional
complementaria o con una base modificada. Aquí, por ejemplo un
oligonucleótido antisentido de acuerdo con la invención puede
comprender la inosina, la 5-bromocitosina, o la
5-fluorocitosina, cada una de las cuales es capaz de
hibridar hacia una base guanina en la secuencia de la ADN MeTasa
objetivo. Las bases modificadas de acuerdo con la invención incluyen
sin limitación la 4-acetilcitidina, la
5-(carboxihidroximetil)uridina, la
2'-O-metilcitidina, la
5-carboximetilaminometil-2-tioridina,
la 5-carboximetilaminometiluridina, la
dihidrouridina, la
2'-O-metilpseudouridina, la beta,
D-galactosilqueosina, la
2'-O-metilguanosina, la inosina, la
N6-isopenteniladenosina, la
1-metiladenosina, la
1-metilpseudouridina, la
1-metilguanosina, la
1-metilinosina, la
1,2-dimetilguanosina, la
2-metiladenosina, la
2-metilguanosina, la
3-metilcitidina, la
5-metilcitidina, la
N6-metiladenosina, la
7-metilguanosina, la
5-metilaminometiluridina, la
5-metoxiaminometil-2-tiouridina,
la beta, D-manosilqueosina, la
5-metoxicarbonilmetiluridina, la
5-metoxiuridina, la
2-metiltio-N6-isopenteniladenosina,
la
N-((9-beta-D-ribufuranosil-2-metiltiopurina-6-il)carbamoil)treonina,
la
N-((9-beta-D-ribofuranosilpurina-6-il)N-metil-carbamoil)treonina,
el metiléster del ácido
uridina-5-oxiacético, el ácido
uridina-5-oxiacético (v), la
wybutoxosina, la pseudouridina, la queosina, la
2-tiocitidina, la
5-metil-2-tiouridina,
la 2-tiouridina, la 4-tiouridina, la
5-metiluridina, la
N-((9-beta-D-ribofuranosilpurina-6-il)carbamoil)treonina,
la
2'-O-metil-5-metiluridina,
la 2'-O-metiluridina, la
wybutosina, y la
3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina,
(acp3)u. Como un asunto práctico, se puede inferir tal
complementariedad a partir de la observación de la inhibición
específica de la expresión del gen de la ADN MeTasa, tal como se
describió arriba. Preferiblemente, tales oligonucleótidos
antisentido contienen uno o más enlaces internucleósido modificados
y pueden contener opcionalmente ya sea desoxiribonucleósidos,
ribonucleósidos o ribonucleósidos
2'-O-sustituidos, o cualquier
combinación de ellos. Los oligonucleótidos antisentido que se
prefieren particularmente de acuerdo con este aspecto de la
invención incluyen los oligonucleótidos quiméricos y los
oligonucleótidos híbridos.
Para los propósitos de la invención, el término
"oligonucleótido" incluye polímeros de dos o más
desoxiribonucleósidos, ribonucleósidos, o residuos de
ribonucleósidos 2'-O-sustituidos, o
cualquier combinación de ellos. Preferiblemente, tales
oligonucleótidos tienen desde aproximadamente 8 hasta
aproximadamente 50 residuos de nucleósidos, preferiblemente desde
aproximadamente 21 hasta aproximadamente 50 residuos de nucleósidos,
más preferiblemente desde 21 aproximadamente hasta aproximadamente
35 residuos de nucleósidos, y sobre todo preferiblemente desde
aproximadamente 13 hasta aproximadamente 19 residuos de nucleósidos.
Los residuos de nucleósidos pueden estar acoplados el uno con el
otro por cualquiera de los numerosos enlaces internucleósido que se
conocen. Tales enlaces internucleósido incluyen sin limitación
enlaces internucleótido fosforotioato, fosforoditioato,
alquilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriéster, fosforamidato,
siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato,
tioéter, fosforamidato puente, fosfonato de metileno puente,
fosforotioato puente y sulfona. En ciertas incorporaciones que se
prefieren, estos enlaces internucleósido pueden ser enlaces
fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato, o fosforamidato, o
combinaciones de ellos. El término oligonucleótido también comprende
tales polímeros que tienen bases químicamente modificadas o azúcares
y/o que tienen sustituyentes adicionales, incluyendo sin limitación
grupos lipofílicos, agentes intercaladores, diaminas y el
adamantano. Para propósitos de la invención el término
"2'-O-sustituido" significa
sustitución de la posición 2' de la fracción pentosa con un grupo
alquilo -O-menor que contiene 1-6
átomos de carbono saturados o insaturados, o con un grupo
-O-arilo o alilo que tiene 2-6
átomos de carbono, donde tal grupo alquilo, arilo o alilo puede no
estar sustituido o puede estar sustituido, p. ej., con grupos halo,
hidroxil, trifluorometil, ciano, nitro, acil, aciloxi, alcoxi,
carboxil, carbalcoxil, o amino; o tal sustitución 2' puede ser con
un grupo hidroxilo (para producir un ribonucleósido), un grupo amino
o haluro, pero no con un grupo 2'-H.
Se muestran abajo los oligonucleótidos
antisentido optimizados complementarios al ARN o al ADN de doble
hebra que codifica la ADN MeTasa de acuerdo con la invención. Aún
los oligonucleótidos adicionales que se prefieren tienen secuencias
de nucleótidos de desde aproximadamente 13 hasta aproximadamente 19
nucleótidos de las secuencias de nucleótidos que se muestran
abajo.
5' CCAGGTAGCCCTCCTCGGAT 3' [SEC ID NÚM 8]
5' AAGCATGAGCACCGTTCTCC 3' [SEC ID NÚM 9]
5' TTCATGTCAGCCAAGGCCAC 3' [SEC ID NÚM 10]
5' CCAAGGCCACAAACACCATG 3' [SEC ID NÚM 13]
5' UUCATGTCAGCCAAGGCCAC 3' [SEC ID NÚM 17]
Los oligonucleótidos antisentido que se
prefieren particularmente de acuerdo con este aspecto de la
invención incluyen los oligonucleótidos quiméricos y los
oligonucleótidos híbridos.
Para propósitos de la invención, un
"oligonucleótido quimérico" se refiere a un oligonucleótido que
tiene más de un tipo de enlaces internucleósido. Una incorporación
que se prefiere de tal oligonucleótido quimérico es un
oligonucleótido quimérico que comprende una región fosforotioato,
fosfodiéster o fosforoditioato, que preferiblemente comprende desde
2 aproximadamente hasta 12 nucleótidos aproximadamente, y una región
alquilfosfonato o alquilfosfonotioato. Preferiblemente, tales
oligonucleótidos quiméricos contienen como mínimo tres enlaces
internucleósido consecutivos que se seleccionan a partir de enlaces
fosfodiéster y fosforotioato, o combinaciones de ellos.
Para propósitos de la invención, un
"oligonucleótido híbrido" se refiere a un oligonucleótido que
tiene más de un tipo de nucleósido. Una realización que se prefiere
de tal oligonucleótido híbrido comprende una región ribonucleótido o
ribonucleótido 2'-O-sustituido, que
preferiblemente comprende desde 2 aproximadamente hasta 12
nucleótidos 2'-O-sustituidos, y una
región desoxiribonucleótido. Preferiblemente, tal oligonucleótido
híbrido contendrá como mínimo tres desoxiribonucleósidos
consecutivos y también contendrá ribonucleósidos, ribonucleósidos
2'-O-sustituidos, o combinaciones de
ellos. En una incorporación preferida, la región desoxinucleótido
está flanqueada a cada lado por una región
2'-O-sustituida. En una realización
que se prefiere particularmente, las regiones
2'-O-sustituidas son regiones
2'-O-metilo, que tienen sobre todo
preferiblemente cuatro nucleósidos
2'-O-metilo. En ciertas
incorporaciones preferidas el esqueleto completo del oligonucleótido
es un esqueleto fosforotioato. Se demuestra después en esta
especificación la superioridad de los oligonucleótidos híbridos de
acuerdo con la invención.
Se puede variar la secuencia de nucleótidos
exacta y la estructura química de un oligonucleótido antisentido de
acuerdo con la invención, mientras el oligonucleótido retiene su
habilidad para inhibir la expresión de la ADN MeTasa a los altos
niveles de eficacia que se describen allí. Se determina esto
fácilmente ensayando si el oligonucleótido antisentido particular
es activo en un ensayo de mARN de la ADN MeTasa, un ensayo de la
enzima ADN MeTasa, un ensayo suave de crecimiento en agar, o en un
ensayo de crecimiento tumoral in vivo, describiendo todos con
detalle en esta especificación.
Se pueden sintetizar los oligonucleótidos
antisentido de acuerdo con la invención convenientemente sobre un
soporte sólido adecuado usando aproximaciones químicas que se
conocen bien, incluyendo la química del H-fosfonato,
la química del fosforamidito, o una combinación de la química del
H-fosfonato y la química del fosforamidito (esto es,
la química del H-fosfonato para algunos ciclos y la
química del fosforamidito para otros ciclos). Los soportes sólidos
adecuados incluyen cualquiera de los soportes sólidos estándar que
se usan para la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida, tales
como un vidrio de poro controlado (CPG). (Ver, p. ej., Pon,
Methods in Molec. Biol. 1993, 20, 465).
Los oligonucleótidos antisentido de acuerdo con
la invención son útiles para una variedad de propósitos. Por
ejemplo, se pueden usar como "sondas" de la función fisiológica
de la ADN MeTasa siendo usados para inhibir la actividad de la ADN
metiltransferasa en un cultivo celular o un sistema animal
experimental y para evaluar el efecto de inhibir tal actividad de la
ADN MeTasa. Se cumple esto administrando a una célula o un animal
un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la invención y
observando efectos fenotípicos de cualquier tipo. En este uso, los
oligonucleótidos antisentido de acuerdo con la invención son
preferibles respecto a las aproximaciones tradicionales de "noqueo
de genes" porque son más fáciles de usar y se pueden usar para
inhibir la actividad de la ADN MeTasa en etapas seleccionadas de
desarrollo o diferenciación. Así, los oligonucleótidos antisentido
de acuerdo con la invención pueden servir como sondas para ensayar
el papel de la metilación del ADN en varias etapas de
desarrollo.
Finalmente, los oligonucleótidos antisentido de
acuerdo con la invención son útiles en aproximaciones terapéuticas
para tumores benignos y malignos y otras enfermedades humanas que
incluyen la supresión de la expresión genética. Se describe en
detalle la utilidad antitumoral de los oligonucleótidos antisentido
de acuerdo con la invención en otra parte de esta especificación.
Además, se pueden usar los oligonucleótidos antisentido de acuerdo
con la invención para activar genes silenciados para proporcionar
una función genética ausente y así mejorar los síntomas de la
enfermedad. Por ejemplo, las enfermedades talasemia beta y anemia
falciforme son causadas por la expresión aberrante del gen de la
globina beta en el adulto. La mayoría de los individuos que sufren
estas enfermedades tienen copias normales del gen de la globina beta
fetal. Sin embargo, el gen fetal está hipermetilado y es silencioso.
La activación del gen de la globina fetal puede proporcionar la
función globina que se necesita, mejorando así los síntomas de la
enfermedad.
Para uso terapéutico, se pueden formular
opcionalmente los oligonucleótidos antisentido de acuerdo con la
invención con cualquiera de los portadores o diluyentes
farmacéuticamente aceptables que se conocen bien. Esta formulación
puede contener además uno o más inhibidores de la ADN MeTasa y/o uno
o más oligonucleótidos antisentido anti-ADN MeTasa
adicionales o puede contener cualquier otro agente
farmacológicamente activo.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un método para investigar el papel de la ADN MeTasa en el
crecimiento celular, incluyendo el crecimiento de células tumorales.
En el método de acuerdo con este aspecto de la invención, se pone en
contacto el tipo de célula de interés con un oligonucleótido
antisentido de acuerdo con la invención, resultando en la inhibición
de la expresión de la ADN MeTasa en la célula. Se pueden administrar
los oligonucleótidos antisentido en diferentes puntos en el ciclo de
la célula, o junto con promotores o inhibidores del crecimiento
celular para determinar el papel de la ADN MeTasa en el crecimiento
del tipo de célula de interés.
En un tercer aspecto, la invención proporciona
métodos para inhibir el crecimiento tumoral que comprende
administrar a un mamífero, incluyendo un humano, oligonucleótidos
antisentido de acuerdo con la invención. Se administra en el método
de acuerdo con este aspecto de la invención una cantidad
terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido antisentido de
acuerdo con la invención durante un período de tiempo
terapéuticamente efectivo a un mamífero, incluyendo un humano, que
tiene células tumorales presentes en su cuerpo.
Tal como se usa aquí se usa el término
"crecimiento tumoral" para referirse al crecimiento de una
célula tumoral. Una "célula tumoral" es una célula neoplástica.
Una célula tumoral puede ser benigna, esto es, una que no forma
metástasis y no invade ni destruye el tejido normal adyacente, o
maligna, esto es, una que invade los tejidos circundantes, y es
capaz de producir metástasis, puede volver a ocurrir después de la
eliminación pretendida, y es probable que cause la muerte del
huésped.
Se usan los términos "cantidad
terapéuticamente efectiva" y "período de tiempo
terapéuticamente efectivo" para denotar los tratamientos
conocidos a dosis y durante períodos de tiempo efectivos para
reducir el crecimiento de las células tumorales. Preferiblemente,
tal administración debería ser parenteral, oral, sublingual,
transdérmica, tópica, intranasal o intrarectal. Cuando se administra
sistémicamente, se administra la composición terapéutica
preferiblemente en una dosis suficiente para conseguir un nivel en
sangre de oligonucleótido antisentido desde aproximadamente 0,01 uM
hasta aproximadamente 10 uM. Para la administración localizada,
concentraciones mucho menores que ésta pueden ser efectivas, y se
pueden tolerar concentraciones mucho mayores. Preferiblemente, una
dosis total de inhibidor de la ADN MeTasa estará en el rango de
desde aproximadamente 0,1 mg de oligonucleótido por paciente por día
hasta aproximadamente 200 mg de oligonucleótido por kg de peso
corporal por día.
De acuerdo con otra realización, se pueden
administrar uno o más de los oligonucleótidos de la invención a un
animal. Este aspecto de la invención proporciona métodos para
inhibir el crecimiento tumoral que comprende administrar a un
animal, incluyendo un humano, de más de un oligonucleótido
antisentido de acuerdo con la invención ya sea secuencialmente o
simultáneamente en una cantidad terapéuticamente efectiva y durante
un período de tiempo terapéuticamente efectivo.
Se proponen los siguientes ejemplos para
ilustrar más ciertas incorporaciones preferidas de la invención y
no se limitan en naturaleza.
Se preparan los extractos nucleares a partir de
células humanas H446 de fase semi-logarítmica 1 x
10^{8} o células de ratón Y1 que se han hecho crecer bajo
condiciones estándar de cultivo celular. Se trataron las células
con medio suplementado con 1 mg/ml de un oligonucleótido antisentido
complementario a una secuencia del transcripto del ARN de la ADN
MeTasa o un oligonucleótido aleatorio (control negativo). Se
cultivan las células y se lavan dos veces con salino tamponado de
fosfato (PBS), entonces se resuspende la pastilla de célula en 0,5
ml de Tampón A (10 mM de Tris pH 8,0, 1,5 mM MgCl_{2}, 5 mM
KCl_{2}, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF y 0,5% Nonidet P40) para separar
los núcleos de otros componentes de las células. Se hacen pastillas
con los núcleos mediante centrifugación en una microcentrífuga
Eppendorf a 2,000 RPM durante 15 min. a 4ºC. Se lavan los núcleos
una vez en Tampón A y se vuelven a hacer las pastillas, entonces se
resuspenden en 0,5 ml de Tampón B (20 mM Tris pH 8,0, 0,25%
glicerol, 1,5 mM MgCl_{2}, 0,5 mM de PMSF, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM
DTT y 0,4 mM NaCl). Se incuban los núcleos resuspendidos en hielo
durante 15 minutos y entonces se hacen girar a 15,000 RPM para hacer
pastillas de los restos nucleares. Se separa el extracto nuclear en
el sobrenadante de las pastillas y se usa para ensayos para la
actividad de la ADN MeTasa. Para cada ensayo, que se llevó a cabo
por triplicado, se usan 3 ug de extracto nuclear en una mezcla de
reacción que contiene 0,1 ug de un sustrato sintético de moléculas
de ADN semimetiladas de 33 pares de bases con 0,5 uCi
S-[metil-^{3}H]
adenosil-L-metionina (78,9 Ci/mmol)
como el dador de metilo en un tampón que contiene 20 mM de
Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM EDTA, 25% glicerol, 0,2 mM
PMSF, y 20 mM de 2-mercaptoetanol. Se incuba la
mezcla de reacción durante 1 hora a 37ºC para medir la proporción
inicial de la ADN MeTasa. Se detiene la reacción añadiendo 10% TCA
para precipitar el ADN, entonces se incuban las muestras a 4ºC
durante 1 hora y se lavan los precipitados de TCA a través de
filtros GFC (Fischer, Hampton, NH). Los controles son ADN incubado
en la mezcla de reacción en ausencia de extracto nuclear, y extracto
nuclear incubado en la mezcla de reacción en ausencia de ADN. Se
disponen los filtros en viales de centelleo que contienen 5 ml de
coctail de centelleo y se cuentan los grupos metilo tritiados
incorporados en el ADN en un contador de centelleo de acuerdo con
métodos estándar. Para medir la inhibición de la expresión de la ADN
MeTasa, se compara la actividad específica del extracto nuclear a
partir de células tratadas con oligonucleótidos con la actividad
específica del extracto de células sin tratar. El tratamiento de
células con oligonucleótidos antisentido de la invención resulta en
la reducción en la actividad de la ADN MeTasa en el extracto
nuclear.
Se trataron las células A549 que crecían en el
cultivo con oligonucleótidos antisentido de ADN Metiltransferasa en
presencia de 6,25 ug/ml de lipofectina (GIBCO BRL) en un medio
Optimem libre de suero (GIBCO) durante 4 horas, se lavaron entonces
las células una vez con PBS y se devolvieron después las células al
medio DMEM (GIBCO) que contenía suero fetal bovino al 10%. Se aisló
el ARN celular total 24 horas después de la adición del
oligonucleótido a partir de células A549, se hizo correr sobre gel
de agarosa desnaturalizante, se transfirió a una membrana de nylon
(Northern Blot). Se hibridaron entonces las membranas con una
sonda específica de ADN Metiltransferasa radiomarcada, se lavaron y
se expusieron a una lámina de rayos-X. Se determinó
el nivel de la expresión de la ADN metiltransferasa en las células
de control y las tratadas mediante cuantificación de la señal de la
ADN Metiltransferasa. Se quitaron entonces las membranas y se
rehibridaron con una sonda específica para G3PDH (gliceraldehído
3-fosfato, deshidrogenasa) como un gen objetivo no
antisentido para controlar para efectos no específicos y para la
carga total del ARN. Se determinaron los niveles de ADN
metiltransferasa dividiendo la señal que se obtuvo para la ADN
Metiltransferasa por aquélla que se obtuvo para el G3PDH.
Se preparan los extractos nucleares a partir de
células tratadas con oligonucleótidos aleatorios y a partir de
células tratadas con oligonucleótidos antisentido (1 uM
oligonucleótido) tal como se describió en el Ejemplo 1. Se
resuspendió la pastilla de ADN en 0,5 ml de tampón de extracción de
ADN (0,15 M NaCl, 1% SDS, 20 mM de Tris-HCl pH 8,0,
5 mM EDTA), se añaden 100 ug de Proteinasa K, y se incuba la
suspensión a 50ºC durante 16 horas. Se extrajo el ADN en
fenol-cloroformo añadiendo 0,25 ml de fenol y 0,25
ml de cloroformo. Se mezcla la suspensión y se separan las fases
orgánica y acuosa mediante centrifugación en una microcentrífuga
durante 10 minutos a 15,000 RPM. Se añade 1 ml de etanol absoluto a
la fase acuosa y se precipita el ADN mediante centrifugación en una
microcentrífuga durante 15 minutos a 15,000 RPM. Se lava la pastilla
de ADN en etanol al 70% y se vuelve a hacer la pastilla mediante
centrifugación. Se resuspende el ADN en 100 ul de
Tris-HCl 20 mM de pH 8,0, 1 mM EDTA.
Se incuban dos ug de ADN a 37ºC durante 15
minutos con 0,1 unidades de ADNasa, 2,5 ul de
^{32}P-dGTP (3000 Ci/mmol, Amersham, (Cleveland,
OH) y entonces se añaden 2 unidades de ADN Polimerasa Kornberg
(Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) y se incuba la mezcla de
reacción durante 25 minutos adicionales a 30ºC. Se añaden entonces
cincuenta ul de H_{2}O y se elimina la radioactividad no
incorporada mediante el giro a través de una columna Microspin
S-300 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ). Se digiere el
ADN marcado (20 ul) con 70 ug de nucleasa micrococal (Pharmacia,
Piscataway, NJ) en el tampón recomendado por el fabricante durante
10 horas a 37ºC. Se cargan cantidades iguales de radioactividad en
las placas de fosfocelulosa de CCF (Merck, Darmstadt, Alemania) y se
separan los mononucleótidos 3' mediante cromatografía en una
dirección, en ácido isobutírico/H_{2}O/NH_{4}OH 66:33:1. Se
exponen los cromatogramas a una lámina XAR (Eastman Kodak,
Rochester, NY) y se escanean los autoradiogramas mediante
densitometría láser (Scanalytics, CSPI, Billerica, MA). Se
cuantifican las manchas correspondientes a la citosina y la
5-metilcitosina y se determina el porcentaje de
dinucleótidos CG no metilados. Se espera que los resultados
demuestren una reducción global en el porcentaje de dinucleótidos CG
no metilados en células tratadas con oligonucleótidos antisentido,
relativo a las células tratadas con randómeros.
Para evaluar la desmetilación de genes
específicos, se lleva a cabo un procedimiento tal como se describe
generalmente en J. Biol. Chem. 1995, 270,
12690-12696. Brevemente, se extrae el ADN genómico
(10 ug) y se somete a digestión por 25 unidades de HindIII, seguido
de digestión ya sea por 25 unidades de MspI (insensible a la
metilación CG) o por 25 unidades HpaII (sensible a la metilación CG)
durante 8 horas a 37ºC. Se separa el ADN digerido sobre un gel de
agarosa al 1,5% y se somete a la prueba de Southern Blotting
y a hibridación con sondas específicas. Se espera que los resultados
muestren que los genes que ordinariamente están fuertemente
metilados en las células de prueba se convierten en undermetilated,
mientras que los niveles de metilación para genes que no están
fuertemente metilados ordinariamente en las células de prueba no se
afectan significativamente.
Se hace una capa de células Y1 o H446 sobre una
placa de 6 pozos a una densidad de 80,000 células/pozo. Se añaden
fosforotioatos de oligonucleótidos antisentido complementarios en
las células a una región no codificante de la ADN MeTasa
(aproximadamente desde 0,5 hasta 20 uM). Se tratan las células
similarmente diariamente durante 7 días. Entonces, se cultivan las
células y se hace una capa con 3,000 células vivas en agar suave,
por ejemplo, tal como se describe en Freedman and Shin, Cell
1974, 3, 355-359. Dos semanas después
de hacer la placa, se contabiliza el número de colonias que se han
formado en el agar suave mediante examinación visual. En el caso de
oligonucleótidos antisentido activos, se observa una reducción en el
número de colonias dependiente de la dosis.
Se inyectaron subcutáneamente en ratones
desnudos hembra BALB/c de diez hasta doce semanas de edad (Taconic
Labs, Great Barrington, NY) en el área del flanco 2 x 10^{6}
células de carcinoma de pulmón humano A549 precondicionado o
células cancerosas de colon humano Colo205. Se hizo el
precondicionado de estas células con un mínimo de tres transplantes
de tumores consecutivos en la misma línea de ratones desnudos.
Seguidamente, se cortaron fragmentos de tumores de aproximadamente
25 mgs y se implantaron subcutáneamente en ratones, en el área del
flanco izquierdo bajo anestesia Forene (Abbott Labs., Ginebra,
Suiza). Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de 100
mm^{3}, se trataron los ratones intravenosamente, mediante una
infusión en bolo diaria en la vena de la cola, con preparaciones
salinas de oligonucleótidos que contenían 2 mg/kg de oligonucleótido
de acuerdo con la presente invención. Se establece la concentración
final óptima de oligonucleótido mediante experimentos de respuesta a
la dosis de acuerdo con protocolos estándar. Se calculó el volumen
del tumor de acuerdo con métodos estándar cada segundo día después
de la infusión (p. ej., Meyer y col. Int. J. Cancer
1989, 43, 851-856). El tratamiento con
los oligonucleótidos de la invención causó una reducción
significativa en el peso del tumor y en el volumen relativos a los
controles que se trataron con una secuencia antisentido invertida o
aleatoria (no se muestran los datos). Además, se midió la actividad
de la enzima de la ADN MeTasa y se encontró que estaba
significativamente reducida en relación a los controles tratados con
la aleatoria. Estos resultados muestran que los oligonucleótidos de
acuerdo con la invención son capaces de inhibir la actividad
enzimática de la MeTasa y el crecimiento tumoral.
Claims (5)
1. Un oligonucleótido antisentido complementario
a secuencias de ácido nucleico de ARN o ADN de doble hebra que
codifica la ADN MeTasa y que inhibe la expresión del gen de la ADN
metiltransferasa, donde se selecciona el oligonucleótido a partir
del grupo que consiste en SEC ID NÚM: 8, SEC ID NÚM: 9, SEC ID NÚM:
10, SEC ID NÚM: 13, Y SEC ID NÚM: 17.
2. El oligonucleótido de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el oligonucleótido es un oligonucleótido
quimérico que comprende una región de fosforotioato, fosfodiéster o
fosforoditioato y una región alquilfosfonato o
alquilfosfonotioato.
3. El oligonucleótido de acuerdo con la
reivindicación 1, donde el oligonucleótido comprende una región de
ribonucleótido o de ribonucleótido
2'-O-sustituido y una región de
desoxiribonucleótido.
4. Uso de un oligonucleótido antisentido de
acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de un
medicamento para inhibir el crecimiento tumoral.
5. El uso de la reivindicación 4, donde se usa
más de un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la
reivindicación 1.
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