ES2263481T3 - Proteina estructural de virus adenoasociados con propiedades cromatograficas modificadas. - Google Patents
Proteina estructural de virus adenoasociados con propiedades cromatograficas modificadas.Info
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Abstract
Uso de una proteína estructural de virus adenoasociados (VAA) para la purificación de VAA y/o partículas de VAA, caracterizado porque la proteína estructural contiene al menos una mutación en forma de una inserción, que produce una modificación de las propiedades cromatográficas del virus y que se sitúa tras al menos un aminoácido en la secuencia seleccionada de YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNG.
Description
Proteína estructural de virus adenoasociados con
propiedades cromatográficas modificadas.
La presente invención se refiere a una proteína
estructural de virus adenoasociados, que contiene al menos una
mutación, que produce una modificación de las propiedades
cromatográficas, a su producción y uso.
El virus VAA pertenece a la familia de los
parvovirus. Estos se caracterizan por una cápsida icosaédrica no
cubierta con un diámetro de desde 18 hasta 30 nm, que contiene una
cadena de ADN sencilla de aproximadamente 5 kb. Para un aumento
eficaz de los VAA es necesaria una coinfección de la célula huésped
con virus auxiliares, por ejemplo con adenovirus, virus herpes,
virus vaccinia. En ausencia de un virus auxiliar el VAA pasa a un
estado latente, pudiendo integrarse el genoma del virus en el genoma
de la célula huésped de manera estable. La propiedad del VAA de
integrarse en el genoma de la célula huésped lo convierte en
especialmente interesante como vector de transducción para células
de mamíferos. Para las funciones del vector son suficientes en
general las dos secuencias de repetición terminales invertidas de
aproximadamente 145 pb de longitud (ITR: "Inverted Terminal
Repeats"). Éstas aportan las señales "cis" necesarias
para la replicación, el empaquetamiento e integración en el genoma
de la célula huésped. Para el empaquetamiento en partículas
vectoriales recombinantes se transfecta un plásmido auxiliar, que
contiene los genes para las proteínas no estructurales (proteínas
rep) y para las estructurales (proteínas cap), en células adecuadas
para el empaquetamiento, por ejemplo células HeLa o 293, que en
base a esto se infectan con adenovirus. Tras unos días se obtiene un
lisado, que contiene partículas recombinantes de VAA. Plásmidos
auxiliares adecuados se describen por ejemplo por Chiorini et
al., (1995) Hum. Gene Ther. 6, 1531-1541 o por
Girod et al. (1999), Nat. Med.
La cápsida de VAA se compone de tres proteínas
diferentes: VP1, VP2 y VP3, cuyos porcentajes relativos son el 5%
de VP1, el 5% de VP2%, y el 90% de VP3. Los genes de las cápsidas de
VAA se localizan en el extremo derecho del genoma de VAA y se
codifican mediante secuencias solapantes del mismo marco de lectura
abierto (ORF) utilizando diferentes codones de iniciación así como
dos transcriptores empalmados de diferente manera. El gen VP1
contiene la secuencia génica completa del VP2, que a su vez contiene
la secuencia génica completa del VP3 con una zona
N-terminal específica. El hecho de que los marcos de
lectura solapantes codifiquen para las tres proteínas de cápsida de
VAA, es responsable de la expresión obligatoria de todas las
proteínas de cápsida aunque en porcentajes distintos.
Las masas moleculares de las proteínas de las
cápsidas son de 87 kD para VP1, 73 kD para VP2 y 62 kD para VP3.
Las secuencias de los genes de cápsidas se describen por ejemplo en
Srivastava, A. et al. (1983), J. Virol., 45,
555-564; Muzyczka, N. (1992), Curr. Top. Micro.
Immunol., 158, 97-129, Ruffing, N. et al.
(1992), J. Virol., 66, 6922-6930 o Rutledge, E. A.
et al. (1998) J. Virol. 72, 309-319. El mapa
físico y genético del genoma de VAA se describe por ejemplo en
Kotin, R. M. (1994) Human Gene Theray, 5,
793-801.
Además se conocen diversos serotipos de VAA, de
los cuales el serotipo 2 de VAA humano (VAA2) es el mejor
estudiado. En estos análisis se ha demostrado, que los virus VAA
como vectores viriales poseen propiedades ventajosas para la
terapia génica somática. Las ventajas fundamentales son la ausencia
de patogenicidad hacia los humanos, la integración estable del ADN
viral en el genoma celular, la capacidad de infectar células que no
se están dividiendo, la estabilidad de virión, que posibilita la
purificación obteniendo títulos (de 10^{13} a 10^{14}
partículas por ml), la escasa antigenicidad así como la falta de
genes virales y productos génicos en el vector recombinante VAA, lo
cual es ventajoso desde el punto de vista de la seguridad para su
uso en la terapia génica. La clonación de genes en el vector VAA se
lleva acabo entre tanto según los métodos conocidos en general por
del experto, tal como se describen por ejemplo en los documentos WO
95/23 867, en Chiorini, J. A. et al. (1995), Human Gene
Therapy, 6, 1531-1541 o en Kotin, R. M. (1994),
anteriormente.
Para el uso de VAA como vector de transducción
viral se precisan en general títulos elevados de partículas
recombinantes de VAA. Debido a la relativamente baja producción de
partículas dada por la naturaleza, es un camino para obtener
títulos elevados un enriquecimiento eficaz de las partículas. Además
las partículas para aplicaciones en vivo deben estar lo más
libres de impurezas posible, que pueden estar compuestas de
componentes celulares, ADN, proteínas, virus auxiliares, y
componentes del medio. Por eso es necesario disponer de una
purificación mejorada para partículas VAA.
Una posibilidad fundamental para la purificación
la ofrece la cromatografía. En este procedimiento físico de
separación la separación de las sustancias se lleva a cabo mediante
la distribución entre una fase móvil y una estacionaria.
Dependiendo de los procesos físicos puede dividirse la cromatografía
en dos grupos: la cromatografía de adsorción con un sólido como
fase estacionaria y la cromatografía de distribución en el caso de
dos fases inmiscibles entre sí, apareciendo en la mayoría de los
casos formas mixtas. El procedimiento de separación de una
sustancia en la cromatografía depende a este respecto de sus
propiedades cromatográficas, especialmente de su tamaño, de su
carga, de su capacidad de adsorción, así como de su afinidad
específica, de su hidrofobicidad, etc. Por consiguiente las
propiedades cromatográficas ofrecen un punto de partida central,
para conseguir a través de una modificación una mejora de la
purificación y por consiguiente por ejemplo un enriquecimiento o
una mayor pureza, permitiéndose así una modificación total, por
ejemplo con respecto al tipo natural, una separación y con esto una
mejor purificación.
Procedimientos de purificación para VAA, en
especial por medio de cromatografía, se describen en el documento
WO 97/08298, pero no una mutación de las proteínas estructurales de
VAA. Por lo demás se remite en el documento WO 96/00587 a proteínas
de fusión de cápsida VAA, que no interfieren con la formación de
cápsidas y que deben contener epítopos heterólogos de antígenos de
relevancia clínica, mediante lo cual sólo debe inducirse una
respuesta inmunológica. La publicación contiene además sólo una nota
general sobre las proteínas de fusión sin indicar con más detalle
la viabilidad, especialmente en sitios de inserción. Una
modificación de las propiedades cromatográficas especialmente para
la mejora de la purificación no se describen por ejemplo mediante la
modificación de las afinidades.
Por tanto el objetivo de la presente solicitud
era cambiar las propiedades de purificación del virus VAA,
especialmente de una proteína estructural con respecto al tipo
natural.
Sorprendentemente se descubrió, que las
proteínas estructurales o de cápsida pueden modificarse de tal
manera que se obtienen con esto una modificación de las propiedades
cromatográficas.
Por tanto un objeto de la presente invención se
refiere al uso de una proteína estructural de virus adenoasociados
(VAA) para la purificación de VAA y/o las partículas VAA,
conteniendo la proteína estructural al menos una mutación en forma
de una inserción, que provoca una modificación de las propiedades
cromatográficas del virus y que se localiza en un aminoácido en la
secuencia seleccionada de YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA, YYLSR TNTPS,
EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT VDTNG. A este respecto
se prefiere, que la modificación de las propiedades cromatográficas
permita una mejora de la purificación, especialmente un
enriquecimiento del virus, preferiblemente de las partículas de
virus, para dar títulos más elevados, una purificación para dar una
mayor pureza y/o una purificación eficaz. Mediante las propiedades
cromatográficas modificadas puede lograrse por ejemplo en una etapa
de depuración más eficaz y/o más específica para partículas de virus
en el marco de una purificación, que conduce a títulos más elevados
de partículas, a partículas más puras o a una purificación más
eficaz. El título de partículas recombinantes puede determinarse por
ejemplo mediante la adición de una disolución que contiene
partículas en una serie de dilución sobre una membrana e hibridando
esta membrana con ADN de VAA marcado. Mediante la identificación
del ADN hibridado puede averiguarse cuantitativa o cualitativamente
la concentración de partículas según la realización del ensayo. La
pureza de las partículas puede determinarse mediante la razón de la
proteína estructural o de las proteínas de partícula con respecto a
las proteínas de partículas foráneas. Una purificación más eficaz
en el sentido de la presente invención tiene lugar cuando la
purificación consta por ejemplo de menos etapas, transcurre con
mayor velocidad o especialmente siendo más barata en la realización
para la aplicación a gran escala.
En el sentido de esta invención tiene lugar una
modificación de las propiedades cromatográficas del virus unida con
una mejora de la purificación por ejemplo ya cuando la mutación
provoca únicamente un traslado del fenómeno de elución a una
columna cromatográfica, o sea por ejemplo hacia concentraciones de
sal más altas o más bajas. Un problema general en la purificación
cromatográfica es que se eluyen con la misma fracción y con el
mismo contenido en sal las fracciones del producto deseadas (por
ejemplo partículas de virus) y fracciones de impurezas (otros
virus, virus de tipo natural, restos de lisados celulares, ADN,
proteínas, especialmente proteínas del suero). Mediante una
mutación selectiva según la invención y el desplazamiento unido a
ésta del comportamiento de elución, entonces la fracción con las
partícula de virus mutadas, deseadas ya no se eluye con la fracción
impureza, sino en otra fracción de elución (por ejemplo -según la
carga- a concentraciones de sal más altas o más bajas). En ciertas
circunstancias, pero no siempre, a este respecto los desplazamientos
para dar concentraciones altas de sal presentan ventajas
especiales, por ejemplo a través de la inserción de aminoácidos en
su mayoría de carga negativa o positiva o His-Tag en
la proteína de cápsida, ya que las impurezas son en la mayoría de
los casos componentes pequeños y se eluyen con los procedimientos de
purificación habituales en la mayoría de los casos a bajas
concentraciones de sal. Los mutantes de cápsida se unen mejor
entonces por ejemplo al material de la columna y se eluyen más
tarde, o sea a altas concentraciones de sal. Un efecto deseado
adicional debido a la incorporación de aminoácidos con carga es la
posibilidad de cargar un intercambiador de iones con
concentraciones de sal más elevadas, mediante lo cual puede
reducirse la cantidad de material de
columna necesario, lo que facilita el manejo así como ahorra costes en un procedimiento de fabricación industrial.
columna necesario, lo que facilita el manejo así como ahorra costes en un procedimiento de fabricación industrial.
Se prefiere especialmente, que la mutación en la
proteína estructural según invención no provoque una reducción
esencial de la infectividad del virus, pero especialmente también
aumente la infectividad. Por infectividad se entiende en el sentido
de esta invención la capacidad de transducir células.
Una conformación adicional de esta invención es
que la proteína estructural modificada con respecto al tipo natural
VAA presente un aumento de la estabilidad térmica. De esta manera
sería posible en el caso de un aumento de la estabilidad térmica
una mejor activación por calor de otros microorganismos o virus no
deseados, tal como es el caso para el tipo natural VAA. Las
proteínas estructurales de este tipo pudieron determinarse
fácilmente porque se sometió a ensayo un gran número de mutantes
con respecto a su estabilidad térmica.
Por lo demás la proteína estructural modificada
preferiblemente todavía puede formar partículas, es decir forma una
cápsida icosaédrica, especialmente en forma de una cápsida de VAA,
ya que las partículas o cápsidas son especialmente adecuadas. La
formación de las partículas puede probarse por ejemplo mediante
microscopía electrónica. Otra comprobación es el procedimiento de
sedimentación durante una centrifugación en gradiente de densidad
de cloruro de cesio con una comprobación posterior, opcional, del
ADN viral contenido en las partículas.
En general la(s) mutación(ones)
puede(n) encontrarse en la proteína estructural VP1, VP2 y/o
VP3, prefiriéndose la proteína estructural VP1 y/o la VP3. Por lo
demás puede derivarse la proteína estructural de todos los
serotipos de VAA, especialmente de serotipos humanos,
preferiblemente de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y/o VAA6, sobre
todo de VAA2, VAA3 y/o VAA6.
En una forma de realización preferida se
insertan aminoácidos de una secuencia funcional, que son adecuados
para la cromatografía de afinidad.
Por cromatografía de afinidad se entiende un
método de la cromatografía, que se basa en la capacidad de
determinadas partes asociadas tales como
antígeno-anticuerpo,
enzima-sustrato, etc., de reconocerse entre sí y de
interactuar entre sí. A este respecto se fija en la mayoría de los
casos una de las partes en un sorbente cromatográfico como soporte,
al que se une entonces el componente que corresponde
específicamente. Posteriormente se eluye con pH modificado, otra
fuerza iónica o por ejemplo análogos del componentes que
corresponde. Por consiguiente se comprende también la cromatografía
covalente por ejemplo a través de la formación de puentes disulfuro
y la cromatografía hidrófoba, en la que se aprovechan interacciones
hidrófobas.
Especialmente puede seleccionarse el aminoácido
insertado del grupo siguiente: un ligando de un receptor o el
receptor de un ligando, un anticuerpo o parte de un anticuerpo,
especialmente un epítopo de un anticuerpo, un antígeno o un epítopo
de un antígeno, una hormona, un receptor de una hormona, una enzima,
un sustrato enzimático, una lectina y/o un aminoácido que porta
azúcar.
Preferiblemente estos pueden ser:
- \bullet
- un péptido rico en histidina (His-TAG), que permite una purificación a través de un medio de afinidad de quelato metálico;
- \bullet
- un péptido con varias cargas, que modifica el procedimiento de unión o de elución durante una cromatografía en intercambiador iones y así configura de una manera más específica o más eficaz una etapa de purificación de este tipo;
- \bullet
- la glutatión-S-transferasa (GST-Tag), que permite una purificación a través de un medio de afinidad de glutatión;
- \bullet
- una parte F_{c} de un anticuerpo, que permite una purificación a través de un medio de afinidad de proteína A o proteína G;
- \bullet
- un dominio de unión que forma inmunoglobulina, por ejemplo la proteína A o proteína G o partes de las mismas, que permite una purificación a través de un medio de afinidad con un anticuerpo o un parte F_{c} de un anticuerpo;
- \bullet
- un determinado epítopo de un anticuerpo, que permite una purificación a través de un medio con anticuerpos acoplados, que son específicos para el epítopo;
- \bullet
- una lecitina, que permite una purificación a través de un medio de glucoproteína;
- \bullet
- un sitio de unión a ácido nucleico, que permite una purificación a través de medios de ácido nucleico;
- \bullet
- un sitio de unión a heparina, que permite una purificación a través de un medio de heparina, existiendo ya un sitio de unión a heparina intrínseco en el tipo natural VAA, de modo que un sitio de unión adicional únicamente reforzaría la unión;
- \bullet
- estreptavidina, que permite una purificación a través de biotina o proteínas biotiniladas;
- \bullet
- un ligando determinado, que permite una purificación a través de un medio con el receptor correspondiente o
- \bullet
- un receptor determinado, que permite una purificación a través de un medio con el ligando correspondiente.
También se prefieren una integrina, una citocina
o un dominio de unión a un receptor de una citocina, integrina o
factor de crecimiento, un anticuerpo de cadena sencilla que se une a
un receptor de la superficie celular, un anticuerpo contra las
estructuras de la superficie celular, un epítopo y/o una estructura
que se une a anticuerpos.
En una forma de realización preferida se inserta
un péptido con por ejemplo de 5 a 30 aminoácidos, preferiblemente
de 8 a 20 aminoácidos y especialmente de 10 a 18 aminoácidos. El
péptido tiene por ejemplo la secuencia QAGTFALRGDNPQG o una
secuencia, que es muy homóloga a ésta. En el caso de estos ligandos
especialmente preferidos se trata del péptido P1, que representa un
péptido de 14 aminoácidos de longitud de la secuencia núcleo de un
cadena alfa de la familia de la laminina. Esta secuencia es por
ejemplo suficiente, para reconocer un receptor de integrina, que
entre otros interviene en la endocitosis de partículas virales, por
ejemplo de adenovirus. El péptido P1 se une independientemente de
su conformación (lineal o circular) al receptor de integrina. Según
la presente invención se introduce la secuencia de ADN codificante
del péptido P1 en el gen que codifica para una proteína estructural
de VAA, que se encuentra por ejemplo en un plásmido auxiliar. Tras
el empaquetamiento con el plásmido auxiliar mutante se obtiene VAA
recombinante con P1 en la cápsida (rVAA-P1). Para la
inserción de este péptido pudo demostrarse, que estas partículas de
VAA en comparación con las partículas de VAA sin modificar ya se
eluyen con una conductividad menor de un intercambiador de cationes
y así, según las condiciones, permiten una separación mejorada (por
ejemplo del tipo natural) y una purificación.
Se prefiere especialmente una proteína
estructural según la invención, que contiene al menos una mutación
adicional. Por esto debe entenderse, que la proteína estructural
además de una mutación, que provoca una modificación de las
propiedades cromatográficas del virus, también contiene una mutación
adicional, que no necesariamente provoca también una modificación
de las propiedades cromatográficas del virus. Aquí se prefiere
especialmente una mutación adicional, que provoca una modificación,
preferiblemente un aumento, de la infectividad del virus.
Otro objeto preferido de la presente invención
es una proteína estructural de VAA, en la que la(s)
mutación(ones) adicional(es) provoca(n) una
reducción de la antigenicidad.
Por antigenicidad se entiende en el sentido de
esta invención la iniciación tanto de una formación de como una
unión a anticuerpos debido al sistema inmunitario. El término
comprende también la inmunogenicidad, es decir la iniciación de una
respuesta inmunitaria. Por tanto por reducción de la antigenicidad
se entiende la reducción de la formación de y la unión a
anticuerpos tanto por la reducción de los epítopos antigénicos,
como por la reducción de la acción antigénica de determinados
epítopos o por la modificación y la eliminación de determinados
epítopos existentes en el tipo natural. A este respecto la
antigenicidad modificada puede referirse tanto a la respuesta
inmunitaria tanto humoral como celular.
En otra forma de realización preferida
la(s) mutación(ones) adicional(es)
representa(n) una o varias deleciones y/o una o varias
inserciones en la proteína estructural o combinaciones de las
modificaciones mencionadas. A este respecto la inserción es
preferiblemente la inserción de un ligando de receptor de la
membrana celular, una proteína o péptido rep, por ejemplo en forma
de un dominio rep, de una proteína o péptido inmunosupresor y/o una
proteína o péptido con una señal para la síntesis de doble cadena de
un transgén o gen foráneo. A este respecto se prefiere por ejemplo
el péptido P1 (QAGTFALRGDNPQG) (véase anteriormente).
Ejemplos de inserciones en el caso de la
mutación adicional son entre otros la integrina, citocina o dominios
de unión a receptor de citocinas, integrinas o factores de
crecimiento, tales como por ejemplo GM-CSF,
IL-2, IL-12, CD40L, TNF, NGF, PDGF
o EGF, anticuerpos que se unen a receptores de la superficie
celular, los denominados anticuerpos "de cadena sencilla"
(scFv), por ejemplo anticuerpos de cadena sencilla que se unen a los
receptores de superficie CD40, CD40L, B7, CD28 o CD34, o epítopos o
sitios de unión a receptores, que por ejemplo pueden ser
reconocidos por su parte por determinados anticuerpos, por ejemplos
anticuerpos monoclonales anti-CD40L, o por
sustancias químicas u hormonas, por ejemplo catecolamina.
En una forma de realización preferida de la
mutación adicional se insertan estructuras que se unen a
anticuerpos, tales como por ejemplo proteína A, proteína G o
anticuerpos anti-F_{c}, o partes de estos. A estos
se acoplan a su vez anticuerpos específicos contra determinadas
estructuras de la superficie celular (por ejemplo contra el CD40 en
células linfáticas o contra el CD34 en células hematopoyéticas).
Preferiblemente la mutación(ones) se
localiza(n) en la superficie del virus. Para la determinación
de las zonas localizadas en la superficie de la proteína
estructural se encontró sorprendentemente según la presente
invención, que las estructuras y secuencias de CPV y VAA2 son
comparables. Por tanto puede recurrirse preferiblemente a
estructuras cristalinas conocidas de parvovirus tales como
parvovirus B19 o de CPV (parvovirus canino) y con ayuda de
comparación de homología identificar dominios de proteína, que se
localizan sobre la superficie del virus. Por tanto, según la
presente invención por ejemplo una comparación asistida por
ordenador entre CPV y VAA2 o parvovirus B19 y VAA2 de manera
sorprendentemente reproducible ha conducido a la identificación de
lazos (loops) en VP3, cuya secuencia varía, es decir que poseen una
homología reducida y que se localizan previsiblemente sobre la
superficie del virus. Ya que los antígenos para la respuesta
inmunitaria están disponibles para los anticuerpos y por
consiguiente deben estar sobre la superficie del virus, estos lazos
representan candidatos preferidos para las mutaciones. Así se tomó
como patrón la estructura cristalina conocida de la proteína de
cápsida VP2 de CPV (por ejemplo Luo M. (1988), J. Mol. Biol., 200,
209-211; Wu y Rossmann (1993), J. Mol. Biol., 233,
231-244) debido a la elevada similitud con la VP3 de
VAA2 en la estructura secundaria de la proteína, para descubrir las
regiones, que están expuestas sobre la superficie de la cápsida y
que debido a la secuencia de aminoácidos local son suficientemente
flexibles, para por ejemplo superar la inserción de una secuencia
de péptidos. A este respecto se prestó especial atención con mucho
cuidado, a que no se seleccionara ningún elemento estructural
secundario de la proteína de cápsida VAA2, que desestabilizara la
cápsida.
En una forma de realización preferida se
localizan la(s) mutación(ones) en el extremo
N-terminal de la proteína estructural, ya que se
descubrió, que por ejemplo en el caso de los parvovirus CPV y B19 el
extremo N-terminal se encuentra en la superficie
celular.
Otra posibilidad para la determinación de las
zonas localizadas en la superficie de las proteínas estructurales
es una comparación de las secuencias de aminoácidos que codifican
para las cápsidas de diferentes serotipos de VAA. Para esto puede
recurrirse por ejemplo a secuencias de ADN conocidas de diferentes
serotipos de VAA, tales como VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 o VAA6,
para los análisis estructurales de posibles morfologías de cápsida
de por ejemplo VAA2, pudiendo calcular desde el inicio posibles
estructuras terciarias y asignar zonas de secuencia debido a las
propiedades de los aminoácidos generalmente conocidas a las zonas de
cápsida internas o externas. Así pudieron determinarse por ejemplo
según la presente invención posibles sitios de inserción en la zona
de VP3 de la cápsida VAA2, que permitieron la inserción por ejemplo
de péptidos y su expresión sobre la superficie del virus (véase a
continuación).
En otra forma de realización preferida existen
una o más inserciones en la proteína estructural VP3 (Rutledge, E.
A. et al. (1998) anteriormente) antes y/o tras al menos un
aminoácido en la secuencia seleccionada de YKQIS SQSGA, YLTLN
NGSQA, YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT, EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT
VDTNG, ya que estos sitios se encuentran en los sitios expuestos de
un lazo, siendo el riesgo reducido, de modificar la estructura de
VP3.
La(s) inserción(ones) se
realiza(n) según métodos conocidos en general mediante la
inserción en el gen que codifica para la proteína estructural. Las
inserciones pueden incorporarse mediante métodos conocidos en
general por ejemplo por medio de hidrólisis mediante endonucleasas
de restricción de los genes correspondientes de la proteína
estructural y posterior reacción de la ligasa. La expresión
posterior del gen mutado conduce a la proteína estructural según la
invención.
Un objeto de la presente invención es también el
uso según la invención de la proteína estructural en forma de una
partícula de VAA, especialmente en forma de una cápsida de VAA, ya
que las partículas o cápsidas son especialmente adecuadas como
soportes de compuestos seleccionados, por ejemplo vectores de
transducción rVAA.
La presente descripción se refiere también a un
ácido nucleico, preferiblemente un ARN o ADN, especialmente un ADN
de doble cadena, que codifica para una proteína estructural según la
invención, y a una célula, preferiblemente una célula de mamífero
por ejemplo una célula COS, célula HeLa o célula 293, que contiene
el ácido nucleico en cuestión. Las células de este tipo son
adecuadas por ejemplo para la producción de las partículas de VAA
recombi-
nantes.
nantes.
Por tanto la presente descripción se refiere
también a un procedimiento para la producción de la proteína
estructural en cuestión, especialmente para la producción de la
proteína estructural en cuestión en forma de una partícula de VAA,
cultivándose una célula adecuada, que contiene un ácido nucleico,
que codifica para la proteína estructural correspondiente y dado el
caso aislándose la proteína estructural expresada. Por ejemplo
puede purificarse y aislarse la proteína estructural correspondiente
cromatográficamente.
La presente descripción se refiere también a un
fármaco, que contiene la proteína estructural en cuestión, a un
ácido nucleico correspondiente y/o a un célula correspondiente y
dado el caso a excipientes o aditivos adecuados tales como por
ejemplo una disolución de cloruro de sodio fisiológica,
estabilizantes, inhibidores de la proteinasa, o ADNasa, etc.
Otro objeto de la presente invención se refiere
al uso de la proteína estructural en cuestión, para la purificación
de VAA y partículas de VAA, para la modificación del tropismo de
VAA, para la modificación de la antigenicidad de VAA, para la
transformación de una célula, especialmente una célula, que antes
era poco accesible para una infección de VAA, tal como por ejemplo
una célula hematopoyética, para la dirección genómica, para el
diagnóstico, para los estudios de eficacia y/o (en forma de vectores
rVAA adecuados) para la terapia génica. Por terapia génica se
entiende una forma de terapia, mediante la cual se expresa un gen
efector, en la mayoría de los casos una proteína, mediante la
introducción de ácidos nucleicos en células. Se diferencian
principalmente procedimientos in vitro e in vivo. En
los procedimientos in vitro se eliminan células del organismo
y se transducen ex vivo con vectores, para posteriormente
introducirse de nuevo en el mismo o en otro organismo. En la terapia
génica in vivo se aplican por ejemplo para el control de
tumores, de manera sistémica (por ejemplo a través de la vía
sanguínea) o directamente en el tumor, el tejido o los órganos.
Una ventaja esencial de la presente invención
es, que mediante la mutagénesis según la invención de proteínas
estructurales de VAA a través de la modificación de las propiedades
cromatográficas pueden conseguirse nuevas posibilidades para
procedimientos de purificación más específicos esencialmente sin
pérdida de la eficacia de empaquetamiento de los vectores VAA
recombinantes en la cápsida del virus. Con esto se consiguen las
condiciones, para purificar VAA o partículas de VAA para dar
títulos más elevados y/o para dar una mayor pureza y de configurar
la depuración de una manera más eficaz y más económica. Esto a su
vez permite la aplicación a escala industrial de VAA recombinantes
para las transformaciones celulares y terapia génicas a escala
comercial.
Las siguientes figuras y ejemplos pretenden
explicar la invención con más detalle, sin limitarla.
La figura 1 muestra el cromatograma para una
muestra de VAA del tipo natural en una pasada a través de una
columna de intercambio catiónico POROS 50HS. Se representa el
volumen de flujo frente a la conductividad (eje y izquierdo) y
frente a la absorción a 280 nm (eje y derecho). Las partículas de
VAA se eluyen en las fracciones 12 y 13, lo que de media
corresponde a una conductividad de 30 mS/cm (NaCl 300 mM) (véase la
raya horizontal
gruesa).
gruesa).
La figura 2 muestra el cromatograma para una
muestra de VAA compuesta de partículas de VAA mutadas (inserción
del péptido QAGTFALRGDNPQG tras el aminoácido 587;
1-587 según el ejemplo 3) en una pasada a través de
una columna de intercambio catiónico POROS 50HS. Se representa el
volumen de flujo frente a la conductividad (eje y izquierdo) y
frente a la absorción a 280 nm (eje y derecho). Las partículas de
VAA modificadas se eluyen en las fracciones 6 y 7, lo que de media
corresponde a una conductividad de 22 mS/cm (NaCl 220 mM) (véase la
raya horizontal gruesa).
Ejemplo
1
Por medio de mutagénesis asistida por PCR y
cortes con las enzimas de restricción XhoI, BrsBI o HindIII se
produjeron las mutaciones siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Mutaciones en la VP1
- a)
- Deleción entre los sitios de corte XhoI-XhoI de la VP-1 (\DeltaXho; 62 aminoácidos, AA) (Hermonat et al. (1984) Journal of Viriology 51, 329-339),
- b)
- deleción entre los sitios de corte BsrBI y HindII de la VP-1, que se encuentra dentro de la deleción a) anterior y comprende 29 AA (\DeltaBH);
- c)
- deleción entre BsrBI y HindII. así como la inserción de un ligando (péptido P1) (\DeltaBH+L); y
- d)
- inserción total del ligando (péptido P1) en el sitio de corte BsrBI (B+L).
\vskip1.000000\baselineskip
Mutaciones en la VP3
- a)
- ins261; YKQIS SQSGA
- b)
- ins381; YLTLN NGSQA
- c)
- ins447; YYLSR TNTPS
- d)
- ins534; EEKFF PQSGV
- e)
- ins573; NPVAT EQYGS
- f)
- ins587; LQRGN RQAAT
- g)
- ins713; NVDFT VDTNG
\vskip1.000000\baselineskip
(Nomenclatura según el número de aminoácidos
(AA) contados tras los AA desde el comienzo del extremo
N-terminal en la VP-1 de VAA2,
enmarcados en cada caso por 5 aminoácidos de los mismos que se
encuentran en el extremo N-terminal y 5 de los
mismos que se encuentran en el extremo C-terminal;
el AA, tras el cual se ha introducido la inserción, está
representado en negrita).
También es posible, que en los cinco AA
inmediatamente contiguos, que se encuentran junto al aminoácido
marcado en negrita, también se introduzca una inserción, ya que
éstas están también dentro de un lazo de la cápsida de
VAA-2.
Ejemplo
2
Tras llevar a cabo las mutaciones en el genoma
VAA-2 y tras el empaquetamiento de los virus mutados
con el gen reportero LacZ se determinaron los títulos de los
vectores físicos mediante inmunotransferencia en mancha
(Dot-Blot) y título de cápsida con el ELISA de
anticuerpo A20 y se llevaron a cabo las primeras pruebas de
infección sobre células HeLa. Mediante esto pudo averiguarse si las
mutaciones alteran la estructura de las proteínas VP o la
interacción entre las diversas proteínas VP de tal manera que el
empaquetamiento no tiene lugar o se altera
(Tabla 1).
(Tabla 1).
| Cepa viral | Título genómico viral | Título de la cápsida |
| (ELISA con A20-MAb) | ||
| Cápsida de tipo natural | 1,10^{12} | 1-10^{11} |
| Mutantes VP-1 | ||
| \Deltaxho | 6,10^{12} | 5,10^{10} |
| \DeltaBH | 8,10^{11} | 4,10^{9} |
| \DeltaBH+L | 1,10^{13} | 5,10^{10} |
| B+L | 3,10^{12} | 5,10^{9} |
| Mutantes VP3 | ||
| ins261 1 | 1,10^{10} | < 10^{8} |
| ins381 | 3,10^{10} | < 10^{8} |
| ins447 | 1,10^{12} | 4,10^{10} |
| ins534 | 1,10^{10} | < 10^{8} |
| ins573 | 3-10^{10} | < 10^{8} |
| ins587 | 1,10^{12} | 2\cdot10^{10} |
| ins713 | 5,10^{10} | < 10^{8} |
\vskip1.000000\baselineskip
Se muestran los títulos genómicos
(inmunotransferencia en mancha) y los títulos de cápsida (ELISA de
cápsida A20). Las concentraciones se indican en partícula/ml.
Pudo demostrarse para los 4 mutantes
VP-1, que las mutaciones no influyen en la eficacia
de empaquetamiento y que todos los virus mutados podían
empaquetarse con títulos buenos similares así como vectores con
cápsida no mutada (10^{11} a 10^{13} partículas geonómicas/ml).
También pudieron empaquetarse con éxito los vectores VAA con
mutaciones en la zona VP3 (10^{10}-10^{12}
partículas genómicas/ml).
Ejemplo
3
En primer lugar se partió de un plásmido
pUC-AV2, que se produjo mediante subclonación del
fragmento BgIII de 4,8 kb del pAV2 (ATCC37261, ref. 53) en el sitio
de corte BamHI del pUC19 (New England BioLabs Inc.). Por medio de
la mutagénesis asistida por PCR conocida por el experto, se llevaron
a cabo mutaciones en sitios definidos del plásmido. A este respecto
se introdujo una secuencia que codifica para P1, un péptido de 14
AA, con la secuencia de AA QAGTFALRGDNPQG, que contiene el motivo de
unión RGD de un fragmento de laminina (Aumailly et al.
(1990) FEBS Lett. 262, 82-86) tras los nucleótidos
2985, 3543 y 3963. Esto corresponde a una inserción tras los
aminoácidos 261, 447 y 587 de la proteína de cápsida VAA2
(nomenclatura según el número de los aminoácidos (AA) contados tras
el AA a partir del comienzo del extremo N-terminal
en la VP-1 de VAA2). En la PCR posterior se
utilizan respectivamente 2 cebadores específicos de mutación y como
matriz un plásmido, pCap, que sólo contiene el gen cap y se forma,
porque se corta el fragmento EcoRI-BspMI de 2,2 kb
del pUC-Av2 y se introduce en el sitio de corte del
EcoRI del pUC19. Posteriormente se amplifican en bacterias los
productos de la PCR, se secuencian y se subclona el fragmento
EcoNI-XcmI de 1,4 kb, que contiene P1 en
pUC-AV2, en la que se cortó la secuencia cap
correspondiente del tipo natural. Por consiguiente los plásmidos
(mutantes) denominados según los sitios de inserción de AA
pI-261, pI-381,
pI-447 y pI-587 contenían el genoma
completo del VAA2. Se denominan las correspondientes proteínas
mutadas como I-261, I-381,
I-447 e I-587.
\newpage
Ejemplo
4
Se transfectaron células HeLa (una línea celular
del epitelio del cuello humana) con los plásmidos según el ejemplo
1, entonces se incubaron aproximadamente durante 20 h y
posteriormente se infectaron con el adenovirus de tipo 5. 72 h tras
la infección se abrieron las células y se purificaron las partículas
VAA2 mediante un gradiente de
CsCl.
CsCl.
Ejemplo
5
En estos ensayos debía determinarse si los
mutantes de cápsidas empaquetan el genoma viral y si pueden formar
cápsidas completas. Las partículas del VAA2 de los mutantes según el
ejemplo 4 se examinaron si el genoma del virus porta partículas y
en caso afirmativo cuántas y cuánto ADN estaba empaquetado en los
mutantes de cápsida. Para esto se trataron las partículas del virus
purificadas (mutantes y tipo natural) según el ejemplo 4 con
ADNasa, se sometieron a una inmunotransferencia y se hibridaron con
una sonda rep.
El título resultante no mostraba ninguna
diferencia cuantitativa o cualitativa en comparación con el tipo
natural (véase la tabla 2). Los virus mantuvieron la capacidad para
empaquetar el genoma.
Mediante el análisis con microscopio electrónico
pudo confirmarse además que también se forma la cápsida.
Por tanto no se llevaron a cabo las mutaciones
en zonas que son de importancia para el plegado correcto, la
composición de la cápsida o el empaquetamiento del genoma. Las
partículas VAA según invención no se ven alteradas en su
función.
Para poder detectar si las cápsidas mutadas se
forman completamente y que no muestran ninguna antigenicidad
modificada, se utilizaron en un experimento adicional anticuerpos
A20 monoclonales (A20-Mab) en un ELISA. Los
A20-Mab reaccionan de manera específica con cápsidas
compuestas en su totalidad por VAA2 del tipo natural (Wistuba et
al., (1997), J. Virol. 71, 1341-1352). También
aquí se representan los resultados en la tabla 2. A este respecto
se muestra que no se altera la formación de cápsidas mediante la
inserción en los mutantes I-477 y
1-587, mientras que en I-261 el
anticuerpo monoclonal A20 no se une, pero lo que se debe, ya que a
pesar de todo se forman las cápsidas según análisis con el
microscopio electrónico, a una modificación de la
antigenicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
| Cepa viral | Título del genoma viral | ELISA con A20-MAb |
| Cápsida del tipo natural | 8,10^{13} | 6,10^{12} |
| Mutantes | ||
| I-261 | 1,10^{12} | n.m |
| 1-381 | 1,10^{12} | n.m |
| 1-447 | 1-10^{13} | 8-10^{11} |
| I-587 | 4-10^{13} | 3,10^{12} |
\vskip1.000000\baselineskip
Se muestran los títulos de los genomas virales
(inmunotransferencia en mancha) y el título con el ELISA de cápsida
A20. Se indican las concentraciones en partículas/ml. "n.m."
quiere decir "no medible".
Ejemplo
6
Se cargaron los VAA recombinantes del tipo
natural (en Hepes 20 mM, pH 6,8, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 2 mM)
sobre una columna de intercambio catiónico POROS 20HS de 0,8 ml
(Perkin-Elmer, Weiterstadt). Se sometió con la ayuda
de un sistema Äkta (Pharmacia) a un gradiente de 30 volúmenes de
columna de NaCl de desde 100 hasta 700 mM en Hepes 20 mM de 6,8.
Según análisis de inmunotransferencia el VAA se eluía en las
fracciones 12 y 13, lo que corresponde a una elución del VAA del
tipo natural a 30 mS/cm (= aproximadamente NaCl 300 mM) (véase
la
figura 1).
figura 1).
Se aplicó sobre la misma columna de intercambio
catiónico POROS 20 HS de 0,8 ml (véase anteriormente) el mutante
de cápsida (1-587 según el ejemplo 3) del VAA (el
péptido P1 QAGTFALRGDNPQG se inserta tras el aminoácido 587; en
PBS, pH 6,8). Se eluyó en sistema Äkta con un gradiente de 30
volúmenes de columna de NaCl 50-1.000 mM en Hepes
20 mM pH 6,8. El mutante de VAA se encontraba según el análisis de
inmunotransferencia en las fracciones 6 y 7. Esto corresponde a una
elución de aproximadamente 22 ms/cm (= aproximadamente NaCl 220 mM)
(véase la figura 2).
Esto muestra que a través de la inserción del
péptido QAGTFALRGDNPQG se modifica el comportamiento de elución de
las partículas VAA de tal manera, que con el mismo pH las partículas
mutadas se eluyen en una concentración salina menor que las
partículas del tipo natural. Con esto se desplaza la fracción de
virus hacia otras fracciones, en ciertos casos con menos impurezas
o que son simplemente más adecuadas. Por tanto es posible modificar
las propiedades cromatográficas de las partículas VAA mediante
inserciones, deleciones o demás modificaciones de las proteínas de
las cápsidas. Especialmente pueden construirse en una variante de la
inserción mostrada, cápsidas de mutantes según la invención, por
medio de la introducción de aminoácidos que contienen principalmente
cargas positivas, por ejemplo en los sitios de inserción mostrados
en los ejemplos, que en comparación con el tipo natural (que se
eluye en un pico más ancho y con menos impurezas) se eluyen a
concentraciones de sal más altas. La afinidad del mutante hacia el
material de la columna se refuerza, de manera que la elución no
tiene lugar hasta concentraciones de sal altas, o sea en zonas, que
habitualmente están menos contaminadas por proteínas foráneas
más
pequeñas.
pequeñas.
Ejemplo
7
Para someter a prueba el tropismo de los
mutantes I-261, I-381,
I-447 y I-587 de cápsida se
infectaron con los virus mutados las líneas celulares
Co-115 y B16F10. Se utilizaron las células
Co-115 para someter a prueba el tropismo del
receptor de tipo natural de los viriones, ya que éstos pueden
transducirse con VAA2 de tipo natural y que no se unen al péptido
P1. Se utilizó la línea celular B16F10 por los motivos ya
mencionados en el ejemplo 9. Tres días tras la infección se
examinaron las células mediante medición de inmunofluorescencia con
ayuda de un anticuerpo anti-rep para probar si se
expresa la proteína rep viral (Wistuba et al. (1997) J.
Virol. 71, 1341-1352; Wistuba et al. (1995)
J. Virol. 69, 5311-5319). Se cultivaron las células
hasta una confluencia del 70% sobre portaobjetos y se incubaron en
un medio libre de suero junto al adenovirus 5 con distintas
concentraciones de preparaciones virales según la invención. Tres
días más tarde se determinó el título de las preparaciones virales
mediante la detección in situ de la síntesis de proteína rep
en un ensayo de inmunofluorescencia (título rep). A este respecto
se llevó a cabo la coloración de inmunofluorescencia con células
infectadas con VAA2 según un método de Wistuba et al.
(Wistuba et al. (1997) J. Virol. 71,
1341-1352; Wistuba et al. (1995) J. Virol.
69, 5311-5319). Se lavaron los portaobjetos una vez
con PBS, se fijaron en metanol (5 min, 4ºC) y posteriormente se
trataron con acetona (5 min, 4ºC). Entonces se incubaron las células
durante una hora a temperatura ambiente con el anticuerpo
monoclonal 76-3, que reacciona con proteínas rep
del VAA2. Posteriormente se lavó y se incubó durante una hora con un
anticuerpo secundario anti-ratón conjugado a la
rodamina con una dilución de 1:50 en PBS con un 1% de BSA. Se
calcularon los títulos a partir de la última dilución limitante de
la solución de partida viral, que habían conducido a células de
fluorescencia
positiva.
positiva.
Pudieron detectarse células CO115 rep positivas
tras la infección con VAA2 de tipo natural y con los mutantes
I-261, I-447 e
I-587. En las células Co115 la infectividad de
I-261, I-587 y 1-447
era de dos a tres órdenes de magnitud inferior que la del tipo
natural (tabla 3). La transfección de las células B16F10 era igual
de ineficaz con I-447 que aquella con el virus de
tipo natural. En clara oposición a esto pueden detectarse tras
infección con I-587 las células B16F10 positivas
rep, determinándose el título del virus 1-587 en 1 x
10^{6} Rep-EFU/ml (tabla 3).
Para examinar si se estableció una transfección
de las células B16F10 mediante el mutante 1-587
específicamente a través de la interacción entre la secuencia P1
sobre la superficie de la cápsida mutada y la superficie del
receptor de la integrina sobre la superficie de las células B16F10,
se incubaron las células antes de la infección con el virus o bien
con el RGDS competidor o bien con el péptido RGES inactivo en
concentraciones de 200 \mumol. La adición del péptido RGDS
neutralizó la infectividad de 1-587 hacia las
células B16F10 (tabla 3), mientras que el péptido de control RGES
no tuvo ningún efecto.
| Cepa viral | Título en células CO115 | Título en células B16F10 | |
| -RGDS | +RGDS | ||
| Cápsida de tipo natural | 2,10^{9} | < 1 | |
| Mutantes | |||
| I-261 | 7,10^{6} | nd | nd |
| I-381 | n.m. | nd | nd |
| I-447 | 1\cdot10^{6} | < 1 | nd |
| I-587 | 1\cdot10^{7} | 1\cdot10^{6} | < 1 |
| rVAA/LacZ | 5\cdot10^{7} | < 1 | nd |
| Mutantes | |||
| rVAA(I-587)/LacZ | 6\cdot10^{5} | 5\cdot10^{4} | < 1 |
Se muestran las títulos de las células CO115 que
son vulnerables al tipo natural y las células B16F10 que son
resistentes al tipo natural. Se expresan los títulos para
I-447 e I-587 como el tipo natural
en Rep-EFU/ml y para rVAA/LacZ y
rVAA(I-587)/LacZ en
LacZ-EFU/ml. A este respecto EFU significa unidades
formadoras de expresión (Expressing Forming Unit) y nd significa
"no determinado". "n.m" significa "no medible".
Ejemplo
8
Se produjeron en un ensayado basado en el
ejemplo 6 vectores rVAA con un gen reportero LacZ, que contenían o
bien el tipo natural (virión rVAA) o bien I-587
(virión rVAA(I-587)). Se denominaron las
preparaciones virales rVAA/LacZ y
rVAA(I-587)/LacZ y se usaron para la
infección de las células B16F10 o CO115 (controles).
Se sometieron a pruebas las células infectadas
tres días tras la infección mediante una coloración
X-Gal para determinar la expresión de la
\beta-galactosidasa. A este respecto se utilizó la
prueba in situ X-Gal para la coloración
citoquímica (título Lacz). Tras esto, para someter a prueba la
expresión de la \beta-galactosidasa, se lavaron
las células una vez con PBS y después se fijaron con glutaraldehído
al 1,5%. Posteriormente se trataron las células con
X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido),
tal como ya describió Chiorini et al. (1995) Hum. Gen. Ther.
6, 1531-1541. Se calcularon los títulos a partir de
la última dilución limitante de la solución madre viral, que habían
conducido a células productoras de
\beta-galactosidasa.
En los controles en las células CO115 ambos
viriones eran infecciosos, pero sin embargo rVAA
(I-587)/LacZ era dos órdenes de magnitud menos
eficaz. En el tipo B16F10 no se encontraron (como era de esperar)
tras la infección con rVAA/LacZ células de
\beta-galactosidasa positivas. Por el contrario
tras la infección con rVAA(I-587)/LacZ se
encontraron de manera sorprendente considerablemente muchas células
de de \beta-galactosidasa positivas. Se
determinó el título de rVAA-(I-587)/LacZ con 5 x
10^{4} LacZ-EFU por ml. Se mejoró la infectividad
de los vectores rVAA frente a las células B16F10 en más de cuatro
órdenes de magnitud mediante la mutación según la invención (tabla
3).
<110> MediGene Sociedad Anónima
\vskip0.400000\baselineskip
<120> proteína estructural de virus
adenoasociados con propiedades cromatográficas modificadas, su
producción
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipy uso
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 199 33 719.5-41
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 17.07.1999
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Microsoft Word 97
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGln Ala Gly Thr Phe Ala Leu Arg Gly Asp Asn Pro Gln Gly
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus adenoasociado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus adenoasociado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus adenoasociado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTyr Tyr Leu Ser Arg Thr Asn Thr Pro Ser
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus adenoasociado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGlu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus adenoasociado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAsn Pro Val Ala Thr
\hfill5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus adenoasociado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGlu Gln Tyr Gly Ser
\hfill5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus adenoasociado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipLeu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> virus adenoasociado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAsn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VP3 mutada de virus
adenoasociado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VP3 mutada de virus
adenoasociado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln Ala
\hfill10
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VP3 mutada de virus
adenoasociado
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTyr Tyr Leu Ser Arg Thr Asn Thr Pro Ser
\hfill10
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<210> 13
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> secuencia sintética
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<220>
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<223> VP3 mutada de virus
adenoasociado
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipGlu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val
\hfill10
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
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<213> secuencia sintética
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<220>
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<223> VP3 mutada de virus
adenoasociado
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<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipAsn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Ser
\hfill10
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<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
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<213> secuencia sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VP3 mutada de virus
adenoasociado
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<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipLeu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
\hfill10
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<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
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<213> secuencia sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VP3 mutada de virus
adenoasociado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipAsn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly
\hfill10
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<210> 17
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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<400> 17
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\hskip-.1em\dddseqskipArg Gly Asp Ser
\hfill4
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<210> 18
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<211> 4
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<212> PRT
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<213> secuencia sintética
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<220>
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<223> péptido de laminita mutado
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<400> 18
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\hskip-.1em\dddseqskipArg Gly Glu Ser
\hfill4
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Uso de una proteína estructural de
virus adenoasociados (VAA) para la purificación de VAA y/o
partículas de VAA, caracterizado porque la proteína
estructural contiene al menos una mutación en forma de una
inserción, que produce una modificación de las propiedades
cromatográficas del virus y que se sitúa tras al menos un
aminoácido en la secuencia seleccionada de YKQIS SQSGA, YLTLN NGSQA,
YYLSR TNTPS, EEKFF PQSGV, NPVAT EQYGS, LQRGN RQAAT, NVDFT
VDTNG.
2. Uso de una proteína estructural
según la reivindicación 1, caracterizado porque la
modificación de las propiedades cromatográficas posibilita una
mejora de la purificación, especialmente un enriquecimiento del
virus, preferiblemente de la partícula del virus, hasta títulos más
elevados, una purificación hasta una mayor pureza y/o una
purificación más eficaz.
3. Uso de una proteína estructural
según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque
la mutación no produce una disminución notable de la infectividad
del virus.
4. Uso de una proteína estructural
según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque
la proteína estructural puede formar partículas.
5. Uso de una proteína estructural
según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque
la proteína estructural aumenta la estabilidad térmica.
6. Uso de una proteína estructural
según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque
se selecciona de la VP1 mutada, VP2 mutada y/o VP3 mutada.
7. Uso de una proteína estructural
según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque
se derivada de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5 y/o VAA6 así como otros
serotipos de VAA derivados de éstos, especialmente de VAA2.
8. Uso de una proteína estructural
según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque
se insertan aminoácidos de una secuencia funcional, que
preferiblemente son adecuados para la cromatografía de
afinidad.
9. Uso de una proteína estructural
según la reivindicación 8, caracterizado porque se selecciona
la secuencia de aminoácidos insertada de un ligando de un receptor
o del receptor de un ligando, de un anticuerpo o parte de un
anticuerpo, especialmente de un epítopo de un anticuerpo, de un
antígeno, o de un epítopo de un antígeno, de una hormona, de un
receptor de una hormona, de una enzima, de un sustrato enzimático,
de una lectina, de un aminoácido portador de azúcares,
especialmente de un péptido rico en histidina
(His-Tag), de un péptido con múltiples cargas, de
glutatión-S-transferasa
(GST-Tag), de una parte F_{c} de un anticuerpo,
de un dominio de unión a inmunoglobulina, por ejemplo proteína A o
proteína G o parte de las mismas, de una lecitina, de un sitio de
unión a ácidos nucleicos, de un sitio de unión a heparina, de un
ligando específico, de un receptor específico, de una integrina, de
una citocina o de un dominio de unión al receptor de una citocina,
integrina o factor de crecimiento, de un anticuerpo de cadena
sencilla que se une a un receptor de la superficie celular, de un
anticuerpo contra estructuras de la superficie celular, de un
epítopo y/o de una estructura que se une a anticuerpos.
10. Uso de una proteína estructural según
una de las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque se
inserta un péptido, que tiene la secuencia QAGTFALRGDNPQG.
11. Uso de una proteína estructural según
una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la
proteína estructural contiene al menos una mutación adicional.
12. Uso de una proteína estructural según
la reivindicación 11, caracterizado porque la(s)
mutación(ones) adicional(es) producen una
modificación de la infectividad del virus.
13. Uso de una proteína estructural según
una de las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque
la(s) muta-
ción(ones) adicional(es) producen una disminución de la antigenicidad del virus.
ción(ones) adicional(es) producen una disminución de la antigenicidad del virus.
14. Uso de una proteína estructural según
una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque
la(s) muta-
ción(ones) adicional(es) es (son) una (o varias) deleción(ones), una (o varias) inserción(ones) o una combinación de las modificaciones mencionadas.
ción(ones) adicional(es) es (son) una (o varias) deleción(ones), una (o varias) inserción(ones) o una combinación de las modificaciones mencionadas.
15. Uso de una proteína estructural según
una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque la
inserción es un ligando del receptor de la membrana celular, una
proteína o péptido rep, una proteína o péptido inmunosupresor y/o
una proteína o péptido con una señal para la síntesis de la doble
cadena del gen foráneo.
16. Uso de una proteína estructural según
una de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizado porque la
inserción se selecciona de una integrina, de una citocina o de un
dominio de unión al receptor de una citocina, integrina o factor de
crecimiento, de un anticuerpo de cadena sencilla que se une a un
receptor de la superficie celular, de un anticuerpo contra
estructuras de la superficie celular, de una estructura de unión a
anticuerpos o de un epítopo.
17. Uso de una proteína estructural según
una de las reivindicaciones 1 a 16 en forma de una partícula de
VAA, especialmente en forma de una cápsida de VAA.
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