ES2263583T3 - Sistema y procedimiento de analisis inmunitario. - Google Patents
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Abstract
Sistema de análisis inmunitario que comprende: un recipiente de filtros que presenta una placa de filtros, pudiendo el recipiente de filtros contener una muestra para analizar; una estufa en la que puede disponerse el recipiente de filtros, alojando la estufa el recipiente de filtros mientras la muestra a analizar y uno o más reactivos reaccionan; un sistema de separación de muestras muy próximo a la estufa, encontrándose diseñado el sistema de separación de muestras para separar la muestra a analizar y los reactivos en diversos componentes; una pipeta robotizada que comprende un brazo robotizado a una distancia de alcance del recipiente de filtros, la estufa, el sistema de separación de la muestra y el sistema de captura de imágenes, encontrándose diseñado la pipeta robotizada para transferir la muestra o los reactivos entre el recipiente de filtros, la estufa, el sistema de separación de la muestra y el sistema de captura de imágenes; y un sistema de captura de imágenes muy próximo al sistema de separación de muestras y al recipiente de muestras, caracterizado porque el sistema de captura de imágenes se encuentra diseñado para analizar ópticamente y detectar la presencia de interacciones entre los componentes y los reactivos de la mezcla a analizar por encima de la placa de filtro en el recipiente de filtros.
Description
Sistema y procedimiento de análisis
inmunitario.
La presente solicitud reivindica prioridad para
la solicitud en tramitación de la patente provisional US titulada
"Method for Diagnostic Laboratory Testing using DFS Columns"
("Procedimiento de análisis de laboratorio para diagnóstico
utilizando columnas DFS") presentada el 31 de enero de 2000 y a
la que se asignó el número de serie 60/179.248, que se incorpora
completamente en la presente memoria a modo de referencia.
La presente invención se refiere en líneas
generales a un sistema de análisis inmunológico y, más
particularmente, se refiere a un sistema y procedimiento de
separación de componentes de muestras inmunitarias e
inmunohemotógicas.
Los análisis inmunitarios se diseñan para
detectar las reacciones que se producen entre anticuerpos y
antígenos. Dichos análisis utilizan habitualmente células, tales
como los eritrocitos (RBCs) o microsferas como
"transportadores" de antígenos. En la configuración adecuada
del análisis, los análisis pueden formar enlaces con los
transportadores de los antígenos, originando un gran conjunto
tridimensional antígeno - anticuerpo a partir de lo que inicialmente
eran transportadores de antígenos y anticuerpos individuales. En
otras configuraciones, los anticuerpos se unen a los transportadores
de los antígenos sin formar enlaces con los mismos.
Los análisis de inmunohematología en el ámbito
de los bancos de sangre utilizan los eritrocitos y los anticuerpos
para determinar la compatibilidad entre el donante y el receptor en
una transfusión antes de realizar la misma. Por ejemplo, el donante
y el receptor resultan incompatibles si los anticuerpos del receptor
forman enlaces (se aglutinan) con los eritrocitos del donante,
provocando la formación de grandes cúmulos de eritrocitos. Los
reactivos actuales para análisis disponibles comercialmente se
diseñan para distinguir dichos cúmulos de los eritrocitos
individuales sin aglutinar. Por ejemplo, en una "prueba en
tubo" ordinaria, los eritrocitos se mezclan con los anticuerpos,
se centrifuga a aproximadamente 1000 g durante un breve período de
tiempos aproximadamente 30 segundos, a fin de favorecer la formación
de complejos antígeno - anticuerpo, y a continuación se vuelven a
suspender suavemente a mano a fin de poder distinguir los
eritrocitos aglutinados de los no aglutinados. El análisis en tubo
resulta un trabajo laborioso y poco agradecido.
Un enfoque alternativo utilizado para
identificar los eritrocitos aglutinados es la tecnología de columna
giratoria, que se basa en los principios cromatográficos habituales.
Mediante dicha metodología, se utilizan los tubos llenos con un
material matricial homogéneo, por ejemplo, microsferas, gel o
poliacrilamida para separar los eritrocitos aglutinados de los
individuales. El material matricial se diseña con orificios o poros
de un tamaño específico de modo que sometido a fuerzas centrífugas
cuidadosamente controladas, los cúmulos grandes ("4+") apenas
entran en la matriz. Sin embargo, los cúmulos con un tamaño
progresivamente menor (de "3+" hasta "1+") penetran en la
matriz en un grado cada vez mayor, y los eritrocitos no aglutinados
no únicamente penetran en la matriz, sino que sedimentan
completamente en el fondo del tubo. A fin de que una única matriz
cromatográfica homogénea pueda separar de un modo eficaz los
eritrocitos individuales de los cúmulos de eritrocitos de tamaños
diversos, se ha de realizar una centrifugación relativamente larga,
de aproximadamente 10 minutos, con unas condiciones de
centrifugación a baja velocidad de 80 g cuidadosamente controladas.
Las desviaciones de las condiciones óptimas de centrifugación, por
ejemplo unas velocidades de centrifugación superiores con la
intención de reducir el tiempo del análisis, provocan una mala
separación de los eritrocitos, afectando a la capacidad del análisis
para determinar la compatibilidad entre la sangre del donante y la
del receptor. Dicha metodología resulta en cierto modo susceptible
de automatizarse y depende en un menor grado de la habilidad del
operador.
La tecnología de columna resulta
significativamente más costosa que las pruebas en tubo, debido a los
costes de producción de las columnas. El material matricial se
encuentra en disolución y normalmente resulta necesario que se
envase, se transporte y se almacene de un modo cuidadosamente
controlado. Además, el análisis resulta más lento que las pruebas en
tubo debido a la larga etapa de centrifugación, unos 10 minutos
aproximadamente, comparado con los 30 segundos aproximadamente de
las pruebas en tubo. La interpretación de los resultados del
análisis requiere además la formación del operador, ya que la
lectura de salida es analógica, es decir, normalmente se ha de
realizar la estimación de la distancia de migración de los
eritrocitos a través de la matriz.
Por lo tanto, hasta el momento existe la
necesidad en la industria de corregir las deficiencias e
insuficiencias mencionadas anteriormente.
Un procedimiento y un dispositivo de análisis de
reacciones de aglutinación se dan a conocer en el documento DE 41 24
778 A1. Dicho dispositivo comprende una pluralidad de recipientes de
filtro, una placa de microvaloración, un dispositivo de lectura y
una pipeta robotizada. Dicho procedimiento comprende la etapa de
incubar el recipiente de filtros.
La presente invención proporciona un sistema y
un procedimiento de análisis inmunitario e inmunohematológico según
las reivindicaciones independientes 1 y 9.
En una forma de realización alternativa, si la
etapa de analizar el recipiente de filtros proporciona unos
resultados poco claros, el procedimiento puede comprender también
las etapas de colocar la muestra que se encuentra en el recipiente
de filtros en un lavador, separar el transportador de los
componentes líquidos de la muestra capturando el transportador de
antígeno por encima del filtro en el recipiente de filtros, lavar el
transportador del antígeno en el recipiente de filtros disminuyendo
la densidad del aire o mediante centrifugación con una disolución
fisiológica salina para eliminar el excedente de anticuerpos no
enlazados con el transportador del antígeno, añadir anticuerpos que
pueden actuar como reactivos al transportador del antígeno que se
encuentra en el recipiente de filtros, incubar la mezcla en el
recipiente de filtros, separar el transportador del antígeno de los
componentes líquidos de la mezcla capturando el transportador del
antígeno por encima del filtro en el recipiente de filtros y
analizar de nuevo el recipiente de filtros a fin de determinar la
presencia de interacciones entre la muestra y el reactivo.
Otros procedimientos, características y ventajas
de la presente invención se pondrán de manifiesto para los expertos
en la materia al examinar los siguientes dibujos y la siguiente
descripción detallada. Se pretende que dichos procedimientos,
características y ventajas adicionales que se comprenden en la
presente de descripción, se encuentren dentro del campo de la
presente invención, y estén protegidas por las reivindicaciones
adjuntas.
Otros procedimientos, características y ventajas
de la presente invención se pondrán de manifiesto para los expertos
en la materia al examinar los siguientes dibujos y la siguiente
descripción detallada. Se pretende que dichos procedimientos,
características y ventajas adicionales que se comprenden en la
presente de descripción, se encuentren dentro del campo de la
presente invención, y estén protegidas por las reivindicaciones
adjuntas.
La presente invención puede comprenderse mejor
haciendo referencia a los siguientes dibujos. Los componentes de los
dibujos no se encuentran necesariamente a escala y en vez de ello se
ha hecho énfasis en aquellos aspectos que ilustran claramente los
principios de la presente invención. Además, en los dibujos, las
referencias numéricas designan las partes correspondientes desde
diversos puntos de vista.
La Figura 1 es un diagrama que ilustra un
sistema de análisis inmunitario de la presente invención.
La Figura 2 es un diagrama que ilustra un
sistema de recipientes de filtro, un ejemplo del tipo de recipiente
de filtros que sirve como componente del sistema de análisis
inmunitario de la Figura 1.
La Figura 3 es un diagrama que ilustra un
ejemplo de un componente del sistema de muestras del sistema de
análisis inmunitario de la Figura 1 cuando se disminuye la densidad
del aire.
La Figura 4 es un diagrama que ilustra un
dispositivo de centrifugación, otro ejemplo de componente del
sistema de separación de muestras del sistema de análisis
inmunitario de la Figura 1.
La Figura 5 es un organigrama de un
procedimiento de análisis inmunitario de la presente invención que
utiliza el sistema de análisis inmunitario de la Figura 1.
En general, la presente invención se refiere a
un sistema y procedimiento de separación y análisis de muestras
inmunitarias e inmunohematológicas. En este sentido, el sistema de
análisis inmunitario supera los inconvenientes del análisis en tubo
actual y de la tecnología de columna giratoria, mientras que al
mismo tiempo la tecnología de análisis inmunitario resulta más
susceptible a la automatización. En una forma de realización
preferida, el sistema de análisis inmunitario consiste en un
instrumento que comprende un sistema de recipientes de filtro
comprendiendo uno o más filtros que presentan un peso molecular
discreto y unos valores límite de tamaño debido a la presencia de
una pluralidad de orificios o poros de tamaños específicos en el
filtro. Una muestra inmunitaria se mezcla con un reactivo y se
dispone por encima del / de los filtro(s). Tras disminuir la
densidad del aire o realizar la centrifugación o cualquier otro
procedimiento destinado a hacer pasar la muestra a través del
filtro, se separan los componentes de la muestra entre sí según su
tamaño mediante los filtros diversos.
El sistema de análisis inmunitario de la
presente invención puede utilizarse para determinar las
interacciones que se producen entre los anticuerpos y las células, o
en algunos casos entre los anticuerpos y microsferas sintéticas que
pueden modificarse y/o configurarse para que actúen como
transportadores de antígenos. El sistema de análisis inmunitario
puede utilizarse por lo menos de dos modos distintos. En un
procedimiento, los "componentes celulares" de las muestras del
paciente, por ejemplo, eritrocitos (RCBs), leucocitos (WBCs) o
trombocitos se mezclan con "anticuerpos que pueden actuar como
reactivos". Se separan los componentes de la mezcla y a
continuación se analizan para determinar la presencia de interacción
entre los componentes celulares y los anticuerpos reactivos. En otro
procedimiento, el sistema de análisis inmunitario puede utilizarse
en un procedimiento de análisis que mezcla las muestras que
contienen anticuerpos del paciente, por ejemplo, muestras de plasma
o de suero, con transportadores de antígenos que pueden consistir en
microsferas sintéticas o en células que pueden actuar como
reactivos, por ejemplo, eritrocitos, leucocitos o trombocitos. A
continuación se separa dicha mezcla y se analizan los componentes
para determinar la presencia de interacciones entre las mezclas de
anticuerpos y de las células que pueden actuar como reactivos o las
microsferas sintéticas.
La Figura 1 ilustra el sistema de análisis
inmunitario 100 de la presente invención. El sistema de análisis
inmunitario 100 consiste en un instrumento que comprende un
recipiente de filtros 105 que puede comprender una muestra de
análisis, una estufa 110 opcional dentro del que se coloca el
recipiente de filtros, un sistema de separación de muestras 115
dispuesto muy próximo a la estufa 110 o dispuesto en el mismo, un
sistema de captura de imágenes 130 opcional próximo al sistema de
separación de muestras 115 y una pipeta robotizada 135 opcional que
comprende un brazo robotizado a una distancia de alcance del
recipiente de filtros 105, la estufa 110, el sistema de separación
de la muestra 115 y/o el sistema de captura de imágenes 130. El
sistema de análisis inmunitario 100 puede también comprender un
lavador 140 opcional dispuesto en el mismo, un sistema giratorio 145
opcional que presenta dispuestos en el mismo unos soportes 146
destinados a sujetar la muestra a analizar. Además, el sistema de
análisis inmunitario 100 puede comprender opcionalmente tubos con la
muestra a analizar 147 y/o tubos con reactivo 148.
La estufa opcional 110 dispuesta en el sistema
de análisis inmunitario 100 presenta una forma y un tamaño que
permiten que el recipiente de filtros 105 se disponga en el mismo. A
pesar de que pueden utilizarse diversos tamaños y formas de estufas,
en una forma de realización preferida, la estufa 110 presenta una
forma y un tamaño que permite que se dispongan en el mismo una
pluralidad de recipientes de filtro 105 o una placa para los
recipientes de filtro 106. La estufa 110 puede comprender además un
elemento de calefacción opcional capaz de calentar los recipientes
de filtro cuando se disponen en la estufa 110.
El sistema de separación de muestras 115
presenta también una forma y un tamaño que permiten que se disponga
en el mismo un recipiente de filtros 105. A pesar de que pueden
utilizarse diversos tamaños y formas de sistemas de separación de
muestras, en una forma de realización preferida, pueden disponerse
en el mismo una pluralidad de recipientes de filtro 105 y/o una
placa para los recipientes de filtro 106. El sistema de separación
de muestras 115 puede consistir, sin verse limitado a ello, a un
dispositivo de aspiración 120, una máquina centrífuga 125 y/o un
campo eléctrico aplicado. El sistema de separación de muestras 115
es de un tipo que cuando el recipiente de filtros 115 se dispone en
el sistema de separación de muestras 115, una muestra a analizar 147
dispuesta en el recipiente de filtros 105 se desplaza a través de un
filtro 150 (véase Figura 2), separando de este modo la muestra a
analizar en diversos componentes en función de su tamaño.
El sistema de captura de imágenes 130 opcional
puede consistir, por ejemplo, pero sin limitarse a ello, en una
cámara, en un citómetro de flujo, una lente especial tal como un
microscopio, o incluso un ojo humano. Normalmente, la muestra se
analiza mediante un sistema de captura de imágenes 130 una vez se ha
extraído del sistema de separación de muestras 115. El sistema de
captura de imágenes 130 permite el análisis del recipiente de
filtros 105 a fin de determinar la presencia o la ausencia de
material por encima del filtro 150 dispuesto en el recipiente de
filtros 105. El sistema de captura de imágenes 130, particularmente
cuando presenta la forma de un citómetro de flujo, puede utilizarse
también para determinar el tamaño del material que se encuentra por
encima del filtro 150, por ejemplo si el material se encuentra en la
forma de transportadores de antígeno individuales o de cúmulos de
transportadores de antígeno, así como para determinar si los
anticuerpos se encuentran enlazados a los transportadores de
antígeno que se encuentran presentes por encima del filtro.
La pipeta robotizada 135 opcional utilizada en
el sistema es del tipo conocido habitualmente y utilizado por los
expertos en la materia. Por ejemplo, pero sin limitarse al mismo, el
sistema de pipeta robotizada que se fabrica y se encuentra
disponible comercialmente en Tomtec, Inc. (Hamden, Connecticut,
EE.UU.) o en CRS Robotics Corporation (Burlington, Ontario, Canadá),
puede utilizarse según una forma de realización de la presente
invención.
El lavador 140 opcional se dispone a distancia
de alcance del brazo robotizado de la pipeta robotizada 135 del
sistema de captura de imágenes 130. Si el análisis del material que
se encuentra por encima del filtro 150 del recipiente de filtros 105
por parte del sistema de captura de imágenes 130 produce unos
resultados poco claros, la muestra a analizar tal como se encuentra
en el recipiente de filtros 105 puede disponerse en el lavador 140.
El lavador 140 presenta un tamaño y una forma que permiten disponer
en el mismo el recipiente de filtros 105, una pluralidad de
recipientes de filtros 105, y/o una placa de recipientes de filtros
106. El lavador 140 se diseña de modo que lave todos los reactivos
de los transportadores de antígeno presentes en la mezcla del
análisis, y a través del filtro 150 del recipiente de filtros 105. A
pesar de que el lavador 140 puede presentar diversas
configuraciones, en la forma de realización preferida, el lavador
140 presenta el mismo sistema que el dispositivo de aspiración
120.
La Figura 2 ilustra el recipiente de filtros 105
que forma parte del sistema de análisis inmunitario 100 de la Figura
1. "Recipiente de filtros" 105 significa un recipiente que
puede contener la muestra a analizar y comprender uno o más filtros
dispuestos en el mismo. La Figura 2 representa el recipiente de
filtros 105 (a) antes de colocarse en el sistema de separación de
muestras 115, y (b) tras su extracción del sistema de separación de
muestras 115. Tal como puede observarse en la Figura 2, en el
recipiente de filtros 105 se encuentran dispuestos uno o más filtros
150. El filtro 150 comprende un material inerte que comprende una
pluralidad de poros. El tamaño de poro del filtro 150 puede
variarse, según las diversas formas de realización de la presente
invención. Por ejemplo, los poros del filtro 150 pueden presentar un
tamaño comprendido entre aproximadamente 0,01 micrómetros y
aproximadamente 50 micrómetros. El tamaño de los poros del filtro
150 dependerá de la aplicación del recipiente de filtros 105.
Si se pretende que el filtro 150 se utilice para
retener, por ejemplo, los cúmulos de eritrocitos, al mismo tiempo
que permite que los eritrocitos individuales pasen a través de los
poros del filtro 150, en una forma de realización de la presente
aplicación, el tamaño del poro se encuentra comprendido entre
aproximadamente 3 micrómetros hasta aproximadamente 40 micrómetros.
A pesar de que pueden utilizarse otros tamaños de poro, en la forma
de realización preferida, el tamaño de poro se encuentra comprendido
entre aproximadamente 3 micrómetros hasta aproximadamente 5
micrómetros. Si, no obstante, se utiliza el recipiente de filtros
105 para filtrar el fluido alejándolo de los transportadores de
antígeno (eritrocitos, leucocitos, trombocitos o microsferas
sintéticas) allí donde el filtro 150 se utilice para retener los
transportadores de antígenos, pero se permite que el fluido que
contiene los anticuerpos pase a través del mismo, el tamaño de poro
en la forma de realización preferida es de aproximadamente 0,1 hasta
aproximadamente 3 micrómetros. El tamaño de poro óptimo para dicha
metodología es de 0,2 micrómetros.
El espesor del filtro 150 puede también variar
en las distintas formas de realización del recipiente de filtros
105, en función de la aplicación del filtro 150. Por ejemplo, el
espesor del filtro 150 puede variar entre aproximadamente 3
micrómetros hasta aproximadamente 5 mm. En la forma de realización
preferida el filtro 150 presenta un tamaño comprendido entre
aproximadamente 3 micrómetros y aproximadamente 100 micrómetros.
Óptimamente, el espesor del filtro 150 presenta un tamaño
comprendido entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente
75 micrómetros.
El material utilizado en el filtro 150 puede
consistir en cualquier material de las diversas formas de
realización del recipiente de filtros 105, preferentemente un
material inerte que comprenda una pluralidad de poros. El material
del filtro 150 puede ser variado, en función de la aplicación del
filtro 150. Si la función del filtro 150 consiste en retener cúmulos
de eritrocitos, al mismo tiempo que se permite que los eritrocitos
individuales pasen a través del mismo, el material del filtro puede
consistir en, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, una malla de
poliéster, una malla de nailon, en una membrana de policarbonato con
surcos grabados. Un filtro 150 que presente un material de dicho
tipo se fabrica y se encuentra comercialmente disponible en Sefar,
Inc. en Kansas City, Missouri, EE.UU. Si la aplicación del filtro
150 es para retener todos los eritrocitos, pero permitiendo que
otros fluidos que contienen anticuerpos pasen a través de ellos, el
material utilizado para la membrana filtrante en la forma de
realización preferida es el difluoruro de polivinilideno de 0,2
micras fabricado y disponible comercialmente en Coming Life
Sciences, Inc. en Acton, Massachusetts, EE.UU. Alternativamente
puede utilizarse también para la presente aplicación una membrana
con soporte de acetato de celulosa, por ejemplo una membrana Acetate
Plus™ fabricada y disponible comercialmente en Osmonics, Inc.
(Minneapolis, Minnesota, EE.UU.).
Tal como puede observarse en la Figura 2, el
recipiente de filtros 105 puede contener una pluralidad de filtros
150. Si se utiliza una pluralidad de filtros 150, los filtros 150'
dispuestos por debajo del primer filtro 150, normalmente presentan,
en la forma de realización preferida, un tamaño de poro inferior,
separando de este modo la muestra a analizar en sus diversos
componentes en función de su tamaño. Tal como puede observarse en la
Figura 2, una muestra a analizar 147 (no necesariamente forma parte
de la invención) se coloca en el recipiente de filtros 150 por
encima del primer filtro 150. En (b), tras someterse a la
separación, los cúmulos de transportadores de antígeno 155 con un
tamaño mayor de la muestra 147 permanecen por encima del primer
filtro 150. Los cúmulos sin aglutinar o de tamaño inferior 156 de la
muestra 147 permanecen por encima o pasa a través del segundo filtro
150'.
La Figura 3 ilustra un sistema de aspiración
120, que constituye un tipo de sistema de separación de muestras 115
que forma parte del sistema de análisis inmunitario 100. El
dispositivo de aspiración 120 se ilustra en la Figura 3 con una
pluralidad de recipientes de filtros 105 o una placa de recipientes
de filtros 106 dispuestos en el mismo. Se ha de considerar que en el
campo de la invención se comprende un dispositivo de aspiración con
uno o más recipientes de filtros 105 en el mismo. Un conducto de
aspiración 160 se encuentra conectado a los recipientes de filtros
individuales 105, que pasa a través de un controlador de aspiración
165 que se conecta a una bomba de aspiración 170.
La configuración preferida del dispositivo de
aspiración 120 tal como se ilustra en la Figura 3 utiliza un formato
en placa de 96 recipientes de filtros. A pesar de que resultan
posibles otras configuraciones en otras formas de realización, en la
forma de realización preferida el sistema de aspiración 120 se
dispone de tal modo que entra en contacto independientemente con
cada uno de los recipientes de filtros 105 y aplica presión a cada
filtro 105 independientemente de los otros recipientes de filtros
105. En la presente forma de realización, cada recipiente de filtros
105 de la placa de recipientes de filtros 106 (Figura 1) se pone en
contacto por debajo de una junta individual, que a su vez se une a
un conducto individual 160 que conecta los recipientes de filtros
105 a la bomba de aspiración 170. De este modo, se encuentran 96
segmentos de conductos desde la bomba 170 hasta la placa de
recipientes de filtros 106, y cada segmento del conducto 160 puede
presentar la presión de aspiración conectada o desconectada
independientemente. Sin embargo, se ha de comprender que el sistema
de aspiración 120 puede aplicar también la aspiración a un
subconjunto de recipientes de vacío 105 en un momento dado, o pueda
aplicar también la aspiración a la pluralidad entera de recipientes
de filtro 105 o a la placa de recipientes de filtro 106
simultáneamente.
La presión que puede aplicarse por parte del
sistema de aspiración puede variar desde aproximadamente -0,1 hasta
aproximadamente -100 pulgadas de mercurio (in. Hg) (-0,254 a -254 cm
de mercurio). En la forma de realización preferida, los valores de
presión se encuentran entre aproximadamente -0,1 hasta
aproximadamente -10 pulgadas de Hg (-0,254 a -25,4 cm de Hg).
Óptimamente, la presión que mantiene el dispositivo de aspiración
120 se encuentra comprendida entre aproximadamente -0,1 y
aproximadamente -3 pulgadas de Hg (-0,254 a -7,62 cm de Hg).
La Figura 4 ilustra el dispositivo de
centrifugación 125, que constituye otro tipo de sistema de
separación de muestras 115, que forma parte del sistema de análisis
inmunitario 100. Se ha de comprender que cualquier tipo de sistema
de centrifugación conocido y utilizado por los expertos en la
materia puede utilizarse como dispositivo de centrifugación 125. Por
ejemplo, un dispositivo de centrifugación típico fabricado y
disponible comercialmente en Beckman Coulter, Inc. (Fullerton,
California, EE.UU.) puede utilizarse según una forma de realización
de la presente invención siempre que el dispositivo de
centrifugación se modifique de modo que sujete los recipientes de
filtros 105. El dispositivo de centrifugación 125 ilustrado en la
Figura 4 ilustra el ángulo de centrifugación utilizado en la forma
de realización preferida. A pesar de que resultan válidos diversos
ángulos, en una forma de realización preferida el recipiente de
filtros 105 se coloca a un ángulo de 45º con respecto al eje de
rotación 175.
En una forma de realización del sistema de
análisis inmunitario 100 de la presente invención, la orientación
del recipiente de filtros 105, de la muestra y del filtro 150 es tal
que el sistema de separación de muestras 115 puede provocar que la
muestra entre en contacto con el filtro 150 y permitir que los
componentes de la muestra inferiores al tamaño nominal del poro del
filtro 150 pasen a través del filtro 150 hacia el depósito de
captación que se encuentra por debajo del filtro 150, o el siguiente
filtro 150', y se separe de este modo de los componentes de la
muestra que son demasiado grandes para atravesar los poros del
filtro y que permanecen en el recipiente de filtros 105 por encima
del filtro 150 y posiblemente el filtro 150'. También se incluye en
la presente invención un procedimiento de análisis inmunitario. El
procedimiento de análisis inmunitario 180 se ilustra en el
organigrama de la Figura 5. El procedimiento de análisis
inmunitarios 180 comprende la etapa opcional de, tal como puede
observarse en el registro 185, colocar una muestra para el análisis
inmunitario en el recipiente de filtros 105. En otra forma de
realización de la presente invención, la muestra para realizar el
análisis inmunitario puede disponerse también en un tubo de ensayo
estándar o en un tubo de microcentrifugación. Pueden utilizarse
otros recipientes para contener la muestra a analizar en otras
formas de realización del procedimiento 180. El registro 190 ilustra
la siguiente etapa opcional de añadir reactivos de análisis al
recipiente de filtros 105. La siguiente etapa, que se ilustra en el
registro 195, consiste en mezclar la muestra con el reactivo para
formar una mezcla de la muestra 200. El registro 205 ilustra la
etapa opcional de incubación de la mezcla de la muestra 200. En la
etapa de incubación del registro 205, la mezcla de la muestra 200
puede incubarse a una temperatura comprendida entre aproximadamente
4ºC y aproximadamente 37ºC. En una forma de realización preferida,
la mezcla de la muestra se incuba a una temperatura comprendida
entre aproximadamente la temperatura ambiente (20 a 25ºC) y
aproximadamente 37ºC. El período de incubación de la mezcla de la
muestra 200 puede variar desde que no exista incubación alguna hasta
aproximadamente 30 minutos. En una forma de realización preferida,
el período de incubación se encuentra comprendido entre
aproximadamente 2 minutos y aproximadamente 5 minutos.
Tras la etapa opcional de incubación, la
siguiente etapa opcional se ilustra en el registro 210 y consiste en
separar la mezcla de la muestra 200 en sus componentes diversos.
Dicha etapa se realiza habitualmente colocando la mezcla de la
muestra 200 en el sistema de separación de muestras 115. Si el
sistema de separación de muestras 115 utilizado en la etapa de
separación del registro 210 consiste en el dispositivo de
centrifugación 125, la velocidad de centrifugación se encuentra
habitualmente comprendida entre aproximadamente 10 g y 10.000 g, a
pesar de que pueden utilizarse otras velocidades. En la forma de
realización preferida, la velocidad de centrifugación se encuentra
habitualmente comprendida entre aproximadamente 1000 g y
aproximadamente 5.000 g. Óptimamente, la velocidad de centrifugación
es de 3000 g. El período de centrifugación puede variar desde
aproximadamente 5 segundos hasta aproximadamente 5 minutos. A pesar
de que pueden emplearse otros períodos, en la forma de realización
preferida, el período de centrifugación se encuentra comprendido
entre aproximadamente 10 segundos y aproximadamente 30 segundos.
Óptimamente, el período de centrifugación se encuentra comprendido
entre aproximadamente 15 segundos y aproximadamente 20 segundos.
Tal como se ilustra en el registro 215, tras la
etapa opcional de separación 210, puede analizarse opcionalmente el
recipiente de filtros 105 a fin de determinar la presencia o la
ausencia de interacciones entre la muestra a analizar y el reactivo
que permanece por encima del filtro 150. La muestra se analiza
colocando el recipiente de filtros 105 en el sistema de captura de
imágenes 130. Si se detectan interacciones entre la muestra a
analizar y el reactivo en el material que se encuentra por encima
del filtro 150 por parte del sistema de captura 130 en la tapa de
análisis del registro 215, se ha completado el procedimiento de
análisis inmunitario 180. El material se detectará por encima del
filtro si se han producido interacciones, por ejemplo, entre los
componentes celulares de la muestra analizar y los anticuerpos que
actúan como reactivos. La interacción se pondrá de manifiesto por sí
misma en forma de aglutinación o de coagulación de los componentes
celulares por parte de los anticuerpos. Dicha aglutinación puede
detectarse mediante el sistema de captura de imágenes 130. Asimismo,
la ausencia de indicios de aglutinación indica que no se produjeron
interacciones entre los componentes celulares y los anticuerpos que
actúan como reactivos. De un modo similar, el procedimiento de
análisis puede utilizarse para detectar interacciones entre
anticuerpos en la muestra a analizar y las células que actúan como
reactivos detectando la presencia o la ausencia de aglutinación de
las células que actúan como reactivos por parte de los anticuerpos
mediante el sistema de captura de imágenes 130.
Si los resultados de la etapa de análisis del
registro 215 resultan poco claros, y no se detectan interacciones en
el material por encima del filtro 150 del recipiente de filtros 105,
el procedimiento de análisis inmunitario 180 puede continuarse
opcionalmente hasta la etapa 220 de lavado de la mezcla de la
muestra 200 en el lavador 140. Tal como se ha señalado previamente,
en la forma de realización preferida el lavador 140 consiste también
en un dispositivo de aspiración 120. A pesar de que el dispositivo
de aspiración puede aplicarse durante distintos períodos de tiempo
según las diversas formas de realización, en una forma de
realización preferida se aplica un dispositivo de aspiración hasta
que se ha aspirado todo el fluido a través del filtro 150 del
sistema de recipientes de filtros. La duración de la aspiración que
se aplica depende de la presión de dicha aspiración, pero
normalmente se encuentra comprendida entre aproximadamente 5
segundos y aproximadamente 2 minutos, o hasta el momento en que el
componente líquido de la mezcla de la muestra 200 se ha extraído en
gran parte o completamente a través del filtro 150.
En la etapa opcional de lavado del registro 220,
la mezcla de la muestra 200 puede lavarse con una disolución
fisiológica salina. La disolución salina puede ser por ejemplo, pero
sin limitarse a la misma, una disolución salina de cloruro sódico
(NaCl) al 0,9%, una disolución de fosfato amortiguadora del pH, o
cualquier disolución salina que proteja la viabilidad de los
componentes celulares durante el procedimiento de análisis. La etapa
de lavado puede comprender las etapas de proporcionar la disolución
fisiológica salina, añadir de aproximadamente 10 microlitros hasta
aproximadamente 5 mililtros de disolución fisiológica salina a la
mezcla de la muestra 200, separar los transportadores del antígeno,
tanto componentes celulares como microesferas sintéticas, que
permanecen por encima del filtro 150 de los componentes líquidos que
pasan a través del filtro 150 y permanecen por debajo del mismo, y
repetir dichas etapas de adición y separación desde una hasta
aproximadamente diez veces, hasta que la mezcla de la muestra 200 se
encuentra suficientemente lavada para la aplica-
ción.
ción.
Tras la etapa opcional de lavado del registro
220, se inicia de nuevo el procedimiento de análisis inmunitario 180
en la etapa opcional 190 en la que los reactivos del análisis se
añaden a los transportadores del antígeno que permanecen por encima
del filtro 150 en el recipiente de filtros 105. Tras la etapa
opcional de mezclado 195 la mezcla de la muestra 200 resultante se
prosigue con la etapa opcional de incubación del registro 205, en el
que la mezcla de la muestra 200 se coloca de nuevo en la estufa 110.
Al incubar, la mezcla de la muestra 200 se coloca opcionalmente en
el sistema de separación de muestras 130 tal como se ilustra en el
registro 210 y a continuación se analiza de nuevo, tal como se
ilustra en el registro
215.
215.
En la forma de realización de la presente
invención en la que la muestra a analizar se coloca primero en un
tubo de ensayo ordinario o en un tubo de microcentrifugación, las
muestras se analizan primero con el sistema de captura de imágenes
130. A continuación, siempre que los resultados del análisis del
sistema de captura de imágenes 130 resulten poco claros, la mezcla
de la muestra 200 se coloca en el recipiente de filtros 105,
procediéndose a la etapa de lavado del registro 220, seguido por la
adición de los reactivos de análisis del registro 190, la mezcla de
la muestra y los reactivos del registro 195, la etapa de incubación
del registro 205, la etapa de separación de la mezcla del registro
210, y la etapa de análisis del registro 215.
Se ha de hacer hincapié en el hecho de que las
formas de realización de la presente invención descritas
anteriormente, particularmente cualquiera de las formas de
realización "preferidas", constituyen simplemente posibles
ejemplos de puestas en práctica, expuestas simplemente para una
comprensión más clara de los principios de la invención. Pueden
realizarse diversas variaciones y modificaciones de la(s)
forma(s) de realización de la invención descrita(s)
anteriormente sin apartarse sustancialmente del alcance de la
invención. Se pretende que dichas modificaciones y variaciones se
encuentren comprendidas en el presente documento dentro del campo de
la presente memoria y de la presente invención y protegidas por las
siguientes reivindicaciones.
Claims (19)
1. Sistema de análisis inmunitario que
comprende:
un recipiente de filtros que presenta una placa
de filtros, pudiendo el recipiente de filtros contener una muestra
para analizar;
una estufa en la que puede disponerse el
recipiente de filtros, alojando la estufa el recipiente de filtros
mientras la muestra a analizar y uno o más reactivos reaccionan;
un sistema de separación de muestras muy próximo
a la estufa, encontrándose diseñado el sistema de separación de
muestras para separar la muestra a analizar y los reactivos en
diversos componentes;
una pipeta robotizada que comprende un brazo
robotizado a una distancia de alcance del recipiente de filtros, la
estufa, el sistema de separación de la muestra y el sistema de
captura de imágenes, encontrándose diseñado la pipeta robotizada
para transferir la muestra o los reactivos entre el recipiente de
filtros, la estufa, el sistema de separación de la muestra y el
sistema de captura de imágenes; y
un sistema de captura de imágenes muy próximo al
sistema de separación de muestras y al recipiente de muestras,
caracterizado porque el sistema de captura de imágenes se
encuentra diseñado para analizar ópticamente y detectar la presencia
de interacciones entre los componentes y los reactivos de la mezcla
a analizar por encima de la placa de filtro en el recipiente de
filtros.
2. Sistema según la reivindicación 1, que
comprende además un lavador, encontrándose el lavador diseñado para
lavar la muestra a analizar mientras la muestra se dispone en el
recipiente de filtros.
3. Sistema según la reivindicación 1,
caracterizado porque el recipiente de filtros comprende un
filtro que comprende un material inerte que comprende una pluralidad
de poros.
4. Sistema según la reivindicación 3,
caracterizado porque el recipiente de filtros se encuentra
configurado para sujetar la muestra analizar de tal modo que la
muestra entre en contacto con el material filtrante.
5. Sistema según la reivindicación 3,
caracterizado porque los poros del material filtrante
presentan un tamaño comprendido entre aproximadamente 0,01
micrómetros y aproximadamente 50 micróme-
tros.
tros.
6. Sistema según la reivindicación 3,
caracterizado porque el material filtrante se selecciona de
entre el grupo que consiste en: una malla de poliéster, una malla de
nailon, en una membrana de policarbonato con surcos grabados, una
membrana de acetato de celulosa, una membrana filtrante de
difluoruro de polivinilideno.
7. Sistema según la reivindicación 1,
caracterizado porque el sistema de separación de muestras
consiste en un dispositivo de centrifugación o un sistema de
aspiración.
8. Sistema según la reivindicación 1,
caracterizado porque el sistema de captura de imágenes
consiste en un citómetro de flujo o en una cámara.
9. Procedimiento de análisis inmunitario que
comprende las etapas de:
incubación de una muestra inmunitaria y una
mezcla de reactivos en un recipiente de filtros;
separación de la muestra y la mezcla de
reactivos en el recipiente de filtros en componentes por encima y
por debajo de la placa de filtro; caracterizado porque
se analizan ópticamente los componentes que se
encuentran por encima de la placa de filtro en el recipiente de
filtros para determinar la presencia de interacciones entre los
componentes.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, que
comprende además la etapa de transferencia del recipiente de filtros
a un mecanismo giratorio tras la etapa de separación, pero antes de
la etapa de análisis.
11. Procedimiento según la reivindicación 9, que
comprende además:
una primera etapa de colocación de la muestra en
un recipiente de filtro, comprendiendo la muestra componentes
celulares;
una segunda etapa de adición de anticuerpos que
actúan como reactivos a la muestra;
en el que la etapa de separación de la mezcla y
la mezcla de reactivos comprende la separación de la mezcla de la
muestra en componentes celulares y componentes líquidos; y
en el que la etapa de análisis del recipiente de
filtros comprende el análisis de los componentes celulares que
permanecen por encima del filtro.
12. Procedimiento según la reivindicación 9, que
comprende además:
una primera etapa de colocación de la muestra en
un recipiente de filtro que presenta una placa de filtro, en la que
la muestra comprende muestras que contienen anticuerpos tales como
plasma o suero; y
una segunda etapa de adición de transportadores
de antígenos que actúan como reactivos, tales como eritrocitos o
microsferas sintéticas, en relación con la muestra que contiene
anticuerpos;
en el que la etapa de separación de la mezcla y
la mezcla de reactivos comprende la separación de la mezcla de la
muestra en los transportadores de antígenos y componentes líquidos;
y
en el que la etapa de análisis del recipiente de
filtros comprende el análisis de los transportadores de antígenos
que permanecen por encima del filtro.
13. Procedimiento según la reivindicación 9, que
comprende además:
una primera etapa de colocación de la muestra en
un recipiente de filtro que presenta una placa de filtro, en la que
la muestra comprende muestras que contienen anticuerpos tales como
plasma o suero;
una segunda etapa de adición de transportadores
de antígenos que actúan como reactivos, tales como eritrocitos o
microsferas sintéticas, en relación con la muestra que contiene
anticuerpos;
en el que la etapa de separación de la mezcla y
la mezcla de reactivos comprende la separación de la mezcla de la
muestra en los transportadores de antígenos y componentes líquidos;
y
en el que la etapa de análisis óptico del
recipiente de filtros comprende el análisis de los transportadores
de antígenos que permanecen por encima del filtro, y en el que se
realizan las siguientes etapas adicionales si la etapa de análisis
óptico de los componentes que se encuentran por encima de la placa
de filtro produce unos resultados poco claros:
separación de los transportadores de antígenos
de los componentes líquidos capturando los transportadores de
antígenos que se encuentran por encima del recipiente de
filtros;
lavado de los componentes que se encuentran por
encima del filtro con una disolución fisiológica salina;
separación de los transportadores de antígenos
de los componentes líquidos;
adición de los anticuerpos que actúan como
reactivos a los transportadores de antígenos lavados que permanecen
por encima del filtro en el recipiente de filtros;
incubación de los transportadores de antígenos y
de los anticuerpos que actúan como reactivos en el recipiente de
filtros;
separación de la muestra y la mezcla de
reactivos en el recipiente de filtros en componentes que se
encuentran por encima y por debajo del filtro;
lavado de los transportadores de antígenos que
se encuentran por encima del filtro con una disolución fisiológica
salina; y
análisis óptico de los componentes que se
encuentran por encima y por debajo del filtro en el recipiente de
filtros a fin de determinar la presencia de interacciones entre los
componentes.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque la etapa de lavado comprende las etapas
de:
proporcionar una disolución fisiológica salina
que se selecciona de entre el grupo que consiste en una disolución
salina, una disolución de fosfato amortiguadora del pH o cualquier
otra disolución fisiológica salina que proteja la viabilidad de los
componentes celulares durante el procedimiento de análisis;
adición de aproximadamente 10 microlitros hasta
aproximadamente 5 mililtros de disolución fisiológica salina a la
muestra;
separación de la muestra en los transportadores
de antígenos que permanecen por encima del filtro de los componentes
líquidos que se encuentran por debajo del filtro; y
repetición de dichas etapas de adición y
separación desde una hasta aproximadamente diez veces.
15. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque la etapa de separación de la muestra y
la mezcla de reactivos en el recipiente de filtros en los
componentes que se encuentran por encima y por debajo del filtro
comprende la etapa de separación de la muestra y la mezcla de
reactivos mediante un sistema de centrifugación.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
funcionando el sistema de centrifugación especialmente a una
velocidad comprendida entre aproximadamente 10 g y aproximadamente
10.000 g y/o durante un período comprendido entre aproximadamente
cinco segundos y aproximadamente cinco minutos.
17. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque la etapa de separación de la muestra y
la mezcla de reactivos en el recipiente de filtros en los
componentes que se encuentran por encima y por debajo del filtro
comprende la etapa de separación de la muestra y la mezcla de
reactivos mediante un sistema de aspiración.
18. Procedimiento según la reivindicación 17,
funcionando el sistema de aspiración especialmente a una presión
comprendida entre aproximadamente
-339 Pa (0,1 pulgadas de Hg) hasta aproximadamente
-339 kPa (100 pulgadas de Hg) (-0,254 a -254 cm
de Hg).
-339 Pa (0,1 pulgadas de Hg) hasta aproximadamente
-339 kPa (100 pulgadas de Hg) (-0,254 a -254 cm
de Hg).
19. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado porque la etapa de análisis de los componentes
que se encuentran por encima y por debajo del filtro comprende el
análisis de los componentes con un citómetro de flujo.
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