JPH04337446A - 微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置 - Google Patents
微粒子計測方法、定量方法および微粒子計測装置Info
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- JPH04337446A JPH04337446A JP3110336A JP11033691A JPH04337446A JP H04337446 A JPH04337446 A JP H04337446A JP 3110336 A JP3110336 A JP 3110336A JP 11033691 A JP11033691 A JP 11033691A JP H04337446 A JPH04337446 A JP H04337446A
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- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
- G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
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- F02B2075/022—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle
- F02B2075/027—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle four
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- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、液体中に存在する微弱
な蛍光強度の微粒子を精度よく検出して、解析する微粒
子計測方法および微粒子計測装置、ならびに微粒子を使
用した免疫分析、遺伝子診断の分野での定量方法および
その装置に関する。
な蛍光強度の微粒子を精度よく検出して、解析する微粒
子計測方法および微粒子計測装置、ならびに微粒子を使
用した免疫分析、遺伝子診断の分野での定量方法および
その装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】（イ）粒子等を分析する方法として、フ
ロ−サイトメ−タによる分析方法がある。フロ−サイト
メ−タでは、粒子液をシ−スフロ−セルに導いて、その
ほぼ中央部を粒子が１個ずつ分離して流れるようにして
、その流れる粒子にレ−ザ光を照射することにより、そ
れにより生じる散乱光または蛍光（粒子が蛍光性を有す
る場合）を、光電子増倍管等の光検出器で計測している
。この方法では、散乱光または蛍光の信号パルスの波高
値または積分値により、粒子の性質が解析できる。この
ような方法で、解析精度を向上させるために、例えば特
開昭５８−４１３３６号公報に記載されているように、
パルス波高値にパルス幅の情報を付加する方法、あるい
は特開昭６４−３５３４５号公報に記載されているよう
に、信号パルスを遅延させて、そのパルス波高値または
積分値の解析開始時間を実質的に早くする方法が提案さ
れている。 （ロ）また、粒子を用いた免疫測定方法としては、表面
に抗体を結合させたラテックス粒子と抗原とを反応させ
、抗原抗体反応により生成するラテックス粒子の凝集状
態を吸光度または散乱光強度により測定して抗原濃度を
測定する方法が知られている。さらに、この凝集状態を
精度よく解析するために、凝集反応液をフロ−サイトメ
−タに導いて解析する方法も知られている。この方法で
は、個々の凝集塊の大きさを散乱光強度から算定し、抗
原濃度をより精度よく測定することができる。この方法
は、例えば、『検査と技術』１６（１９８８）．ｐ．６
０７〜６１３に記載されている。 （ハ）さらに、例えば、特開昭５６−１５１３５７号公
報に記載されているように、ヘテロジニアス系の反応に
より、０．５μｍ程度の径の粒子を測定抗原と結合させ
て、顕微鏡でその粒子数を計数し、抗原濃度を定量する
方法が提案されている。
ロ−サイトメ−タによる分析方法がある。フロ−サイト
メ−タでは、粒子液をシ−スフロ−セルに導いて、その
ほぼ中央部を粒子が１個ずつ分離して流れるようにして
、その流れる粒子にレ−ザ光を照射することにより、そ
れにより生じる散乱光または蛍光（粒子が蛍光性を有す
る場合）を、光電子増倍管等の光検出器で計測している
。この方法では、散乱光または蛍光の信号パルスの波高
値または積分値により、粒子の性質が解析できる。この
ような方法で、解析精度を向上させるために、例えば特
開昭５８−４１３３６号公報に記載されているように、
パルス波高値にパルス幅の情報を付加する方法、あるい
は特開昭６４−３５３４５号公報に記載されているよう
に、信号パルスを遅延させて、そのパルス波高値または
積分値の解析開始時間を実質的に早くする方法が提案さ
れている。 （ロ）また、粒子を用いた免疫測定方法としては、表面
に抗体を結合させたラテックス粒子と抗原とを反応させ
、抗原抗体反応により生成するラテックス粒子の凝集状
態を吸光度または散乱光強度により測定して抗原濃度を
測定する方法が知られている。さらに、この凝集状態を
精度よく解析するために、凝集反応液をフロ−サイトメ
−タに導いて解析する方法も知られている。この方法で
は、個々の凝集塊の大きさを散乱光強度から算定し、抗
原濃度をより精度よく測定することができる。この方法
は、例えば、『検査と技術』１６（１９８８）．ｐ．６
０７〜６１３に記載されている。 （ハ）さらに、例えば、特開昭５６−１５１３５７号公
報に記載されているように、ヘテロジニアス系の反応に
より、０．５μｍ程度の径の粒子を測定抗原と結合させ
て、顕微鏡でその粒子数を計数し、抗原濃度を定量する
方法が提案されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】（イ）上述のフロ−サ
イトメ−タでは、粒子がレ−ザ光の照射範囲を通過する
際に生じる蛍光強度等を光電子増倍管等の光検出器によ
り測定し、その時間変化を信号パルスとしているので、
基本的には直流的な信号強度を測定しているに過ぎない
。そのために、蛍光強度がノイズレベルに比べて十分に
強ければ、粒子の通過に基づく信号パルスを精度よく識
別することができるが、粒子径が小さくなる等の要因に
より蛍光強度が小さくなると、熱雑音やショット雑音が
相対的に増大するため、蛍光強度のＳ／Ｎが低下する。 蛍光強度のＳ／Ｎが低下すると、粒子の通過に基づく信
号パルスの識別が悪くなり、測定精度が低下して、粒子
の性質の解析が困難になる。この現象は、特に蛍光強度
がシングル・フォトン・エベント状態にあるときに顕著
となる。この状態では、光検出器に到達する光子と、次
に到達する光子との間の時間間隔が光検出器の応答時間
よりも長くなるため、蛍光強度と信号パルスのピ−クが
比例しなくなり、ピ−ク強度等を測定する方法では、正
確な蛍光強度を測定することができなくなる。すなわち
、蛍光強度が弱いとき、例えば、粒子内の蛍光物質の量
が少ないとき、またはレ−ザ光等の励起光強度が小さい
ときには、従来の方法では、正確に測定することは困難
である。
イトメ−タでは、粒子がレ−ザ光の照射範囲を通過する
際に生じる蛍光強度等を光電子増倍管等の光検出器によ
り測定し、その時間変化を信号パルスとしているので、
基本的には直流的な信号強度を測定しているに過ぎない
。そのために、蛍光強度がノイズレベルに比べて十分に
強ければ、粒子の通過に基づく信号パルスを精度よく識
別することができるが、粒子径が小さくなる等の要因に
より蛍光強度が小さくなると、熱雑音やショット雑音が
相対的に増大するため、蛍光強度のＳ／Ｎが低下する。 蛍光強度のＳ／Ｎが低下すると、粒子の通過に基づく信
号パルスの識別が悪くなり、測定精度が低下して、粒子
の性質の解析が困難になる。この現象は、特に蛍光強度
がシングル・フォトン・エベント状態にあるときに顕著
となる。この状態では、光検出器に到達する光子と、次
に到達する光子との間の時間間隔が光検出器の応答時間
よりも長くなるため、蛍光強度と信号パルスのピ−クが
比例しなくなり、ピ−ク強度等を測定する方法では、正
確な蛍光強度を測定することができなくなる。すなわち
、蛍光強度が弱いとき、例えば、粒子内の蛍光物質の量
が少ないとき、またはレ−ザ光等の励起光強度が小さい
ときには、従来の方法では、正確に測定することは困難
である。
【０００４】（ロ）粒子の凝集反応による免疫測定方法
では、前述のように、凝集反応により形成される種々の
大きさの凝集塊を含む反応液をフロ−サイトメ−タで測
定している。この方法では、個々の凝集塊の大きさを計
測することができ、抗原濃度の算出精度を向上させるこ
とができる。しかしながら、この方法では、液体中のゴ
ミを除去したり、フロ−セルまたは液体自体からの散乱
光の影響を除去することが困難である。また、試料中に
存在する散乱体や色素等の吸収体、蛍光体の影響を完全
に除去することも困難である。さらに、抗原と微粒子と
が１対１に対応しないので、凝集塊の数を計数する従来
の方法では、特に極低濃度領域での計数値に誤差が発生
し易い。
では、前述のように、凝集反応により形成される種々の
大きさの凝集塊を含む反応液をフロ−サイトメ−タで測
定している。この方法では、個々の凝集塊の大きさを計
測することができ、抗原濃度の算出精度を向上させるこ
とができる。しかしながら、この方法では、液体中のゴ
ミを除去したり、フロ−セルまたは液体自体からの散乱
光の影響を除去することが困難である。また、試料中に
存在する散乱体や色素等の吸収体、蛍光体の影響を完全
に除去することも困難である。さらに、抗原と微粒子と
が１対１に対応しないので、凝集塊の数を計数する従来
の方法では、特に極低濃度領域での計数値に誤差が発生
し易い。
【０００５】（ハ）ヘテロジニアス系の反応を利用する
特開昭５６−１５１３５７号公報に開示されている方法
では、使用できる粒子径については特に設定されていな
い。しかしながら、反応液等の液体中の粒子の観察に顕
微鏡を使用することになるため、使用できる粒子のサイ
ズはその顕微鏡の分解能等により決定される。顕微鏡の
観察方法としては、透過光、散乱光、蛍光の各観察があ
る。透過光や散乱光での観察では、液中に存在するゴミ
等と粒子の識別が困難である。ゴミ等の影響を少なくす
るためには、蛍光法で観察することが望ましい。しかし
ながら、粒子径が小さくなると、粒子からの蛍光強度も
小さくなり、通常の方法では観察が困難になる。そのた
めに、使用する粒子は０．１μｍよりも大きな径である
必要がある。検出限界は、正確には粒子内の蛍光体の種
類とその分子数で決定されるが、実際には、０．２μｍ
程度以上の径の粒子を使用すると有効である。しかし、
粒子径が大きくなると、また別の問題が生じる。すなわ
ち、粒子径が大きくなると、粒子の液体中での拡散速度
が小さくなるため、反応速度を低下させる可能性がある
。また、抗原分子と比較して粒子が大き過ぎるために、
粒子サイズより小さな領域に存在し得る複数の抗原分子
に対して抗原分子の数に相当した粒子数が反応し結合で
きないという反応障害の可能性もある。さらに、粒子懸
濁液の分散性がよくないために、反応が不均一となり、
抗原濃度の定量精度が低下する可能性もある。また、粒
子径が大きくなると粒子の受ける力が大きくなるために
、相対的に抗原分子との結合が弱くなり、結合が切れ易
くなって、定量精度は低下する。大きな径の粒子に対し
ては、以上のような問題が存在するために、これを回避
することが必要となる。すなわち、免疫反応での定量精
度を高くし、かつ反応時間を短縮するために、より小さ
な径の微粒子を使用することが望ましい。しかしながら
、径が小さくなると、信号強度も小さくなる。従来の方
法では、公報等にも、このような微弱な信号の場合につ
いて、観察方法に関する説明はなく、通常の方法では、
０．１μｍ程度以下の径の微粒子を使用すると、微粒子
の弁別および計数が困難になる。
特開昭５６−１５１３５７号公報に開示されている方法
では、使用できる粒子径については特に設定されていな
い。しかしながら、反応液等の液体中の粒子の観察に顕
微鏡を使用することになるため、使用できる粒子のサイ
ズはその顕微鏡の分解能等により決定される。顕微鏡の
観察方法としては、透過光、散乱光、蛍光の各観察があ
る。透過光や散乱光での観察では、液中に存在するゴミ
等と粒子の識別が困難である。ゴミ等の影響を少なくす
るためには、蛍光法で観察することが望ましい。しかし
ながら、粒子径が小さくなると、粒子からの蛍光強度も
小さくなり、通常の方法では観察が困難になる。そのた
めに、使用する粒子は０．１μｍよりも大きな径である
必要がある。検出限界は、正確には粒子内の蛍光体の種
類とその分子数で決定されるが、実際には、０．２μｍ
程度以上の径の粒子を使用すると有効である。しかし、
粒子径が大きくなると、また別の問題が生じる。すなわ
ち、粒子径が大きくなると、粒子の液体中での拡散速度
が小さくなるため、反応速度を低下させる可能性がある
。また、抗原分子と比較して粒子が大き過ぎるために、
粒子サイズより小さな領域に存在し得る複数の抗原分子
に対して抗原分子の数に相当した粒子数が反応し結合で
きないという反応障害の可能性もある。さらに、粒子懸
濁液の分散性がよくないために、反応が不均一となり、
抗原濃度の定量精度が低下する可能性もある。また、粒
子径が大きくなると粒子の受ける力が大きくなるために
、相対的に抗原分子との結合が弱くなり、結合が切れ易
くなって、定量精度は低下する。大きな径の粒子に対し
ては、以上のような問題が存在するために、これを回避
することが必要となる。すなわち、免疫反応での定量精
度を高くし、かつ反応時間を短縮するために、より小さ
な径の微粒子を使用することが望ましい。しかしながら
、径が小さくなると、信号強度も小さくなる。従来の方
法では、公報等にも、このような微弱な信号の場合につ
いて、観察方法に関する説明はなく、通常の方法では、
０．１μｍ程度以下の径の微粒子を使用すると、微粒子
の弁別および計数が困難になる。
【０００６】本発明の目的は、このような従来の課題を
解決し、蛍光強度の小さな微粒子を正確に弁別すること
が可能で、高感度な微粒子計測方法および計測装置を提
供することにある。また、本発明の他の目的は、蛍光微
粒子からの蛍光の時間変化を正確に測定することができ
、蛍光微粒子を高精度に解析することができる微粒子計
測方法および計測装置を提供することにある。さらに、
本発明の他の目的は、標識物の直接計数が可能であり、
標識物質の反応効率が高められ、被測定物質との結合の
安定性が高められ、被測定物質の量を高精度、高感度に
定量することができる微粒子定量方法を提供することに
ある。本発明の他の目的は、特に０．１μｍ以下の径の
微粒子を標識物とするのに好適な定量方法を提供するこ
とにある。
解決し、蛍光強度の小さな微粒子を正確に弁別すること
が可能で、高感度な微粒子計測方法および計測装置を提
供することにある。また、本発明の他の目的は、蛍光微
粒子からの蛍光の時間変化を正確に測定することができ
、蛍光微粒子を高精度に解析することができる微粒子計
測方法および計測装置を提供することにある。さらに、
本発明の他の目的は、標識物の直接計数が可能であり、
標識物質の反応効率が高められ、被測定物質との結合の
安定性が高められ、被測定物質の量を高精度、高感度に
定量することができる微粒子定量方法を提供することに
ある。本発明の他の目的は、特に０．１μｍ以下の径の
微粒子を標識物とするのに好適な定量方法を提供するこ
とにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
、本発明の微粒子計測方法は、（イ）光の照射位置に微
粒子をほぼ１個ずつ導入することにより、または、ほぼ
１個の微粒子が存在し得る領域を照射するように調整し
た光を順次走査して、微粒子の位置に導くことにより、
液体中の該微粒子に光を照射する処理と、光の照射によ
り生じる蛍光の単一光子に基づく信号パルスを取り出す
処理と、予め定めた基準時間当りで計測される信号パル
スの数に基づいて、微粒子の存在を識別する処理とを有
することに特徴がある。また、（ロ）液体中の微粒子に
光を照射する処理と、光の照射により生じる蛍光を検出
して、単一光子に基づく信号パルスを取り出す処理と、
信号パルスを予め定めた繰り返し周期で連続的に計数す
る処理と、連続する少なくとも２周期以上の計数値を記
憶し、１周期毎に記憶した２周期以上の計数値を積算す
る処理と、積算値から微粒子の存在を識別する処理とを
有することにも特徴がある。また、（ハ）予め定めた基
準時間内に発生する信号パルスの数を連続的に計数して
、所定の閾値を超える計数値のときに微粒子の存在を判
定し、計数値から微粒子の種類を算定することにも特徴
がある。（ニ）予め定めた基準時間当りで計測される信
号パルスの計数値は、２個以上のＮ（Ｎ≧２）個のカウ
ンタを用い、各カウンタのカウント動作時間を基準時間
とし、基準時間より長い周期Ｔで動作させ、かつ各カウ
ンタの位相を互いにずらし、ｎ（Ｎ≧ｎ≧２）番目とｎ
−１番目のカウンタの動作時間のずれ、すなわち動作間
隔をＴ／Ｎとし、Ｔ／Ｎの動作間隔毎に適当なカウンタ
の計数値を取り出すことにより得ることにも特徴がある
。また、（ホ）基準時間は、微粒子に光が照射されてい
る時間にほぼ等しいか、あるいは微粒子に光が照射され
てる時間の約２倍程度以内にすることにも特徴がある。 また、本発明の微粒子計測装置は、（ヘ）（ａ）微粒子
から蛍光を生じさせるための励起光照射手段と、（ｂ）
微粒子からの蛍光を集光する蛍光集光手段と、（ｃ）蛍
光を検出し、検出した１つの光子に基づく電気パルスを
取り出す検出手段と、（ｄ）電気パルスの数を計数する
カウンタ手段と、（ｅ）カウンタの動作時間、周期およ
びカウンタ間のカウント動作間隔を制御するカウンタ制
御手段と、（ｆ）各カウンタ間の動作間隔毎に各カウン
タの計数値を逐次取り出す計数値選択手段と、（ｇ）計
数値のピ−クを検出するピ−ク検出手段とを具備するこ
とに特徴がある。また、（ト）カウンタ制御手段は、複
数のカウンタのカウント動作時間を同じにし、各カウン
タ間の動作間隔をカウント動作時間よりも短くなるよう
に制御することにも特徴がある。また、（チ）計数値選
択手段とピ−ク検出手段との間に、計数値選択手段で得
られる計数値を所定の閾値と比較するための比較回路を
設けたことにも特徴がある。（リ）液体中の微粒子を該
微粒子が発する光の光学的変化に基づいて計数し、微粒
子を解析する微粒子計測装置において、少なくとも、（
ａ）微粒子から発する光の単一光子に基づく電気パルス
を取り出す光検出手段と、（ｂ）電気パルスの数を所定
の繰り返し周期で連続的に計数する少なくとも１個のカ
ウンタと、（ｃ）連続する少なくとも２周期以上の計数
値を記憶し、１周期毎に記憶した２周期以上の計数値を
積算する積算回路を具備することにも特徴がある。さら
に、（ヌ）カウンタの計数動作を行う所定の繰り返し周
期は、微粒子に光が照射されている時間より短く、かつ
積算の結果得られる計数値を得るために要する計数時間
が微粒子からの蛍光発生時間にほぼ等しいか、あるいは
蛍光発生時間の１ないし２倍の時間であることにも特徴
がある。また、本発明の微粒子による定量方法は、（ル
）測定試料中の被測定物質と特異的に結合する物質を固
定化した反応固相または被測定物質が結合し得る反応固
相と、被測定物質と特異的に結合する物質を固定化した
蛍光性の微粒子を使用し、反応固相と被測定物質と微粒
子を接触させることにより、微粒子を反応固相に捕捉す
る処理と、捕捉した微粒子を請求項１または請求項２の
微粒子測定方法で計測する処理とを有することに特徴が
ある。さらに、（ワ）微粒子として、０．１μｍ以下の
径の微粒子を使用することにも特徴がある。
、本発明の微粒子計測方法は、（イ）光の照射位置に微
粒子をほぼ１個ずつ導入することにより、または、ほぼ
１個の微粒子が存在し得る領域を照射するように調整し
た光を順次走査して、微粒子の位置に導くことにより、
液体中の該微粒子に光を照射する処理と、光の照射によ
り生じる蛍光の単一光子に基づく信号パルスを取り出す
処理と、予め定めた基準時間当りで計測される信号パル
スの数に基づいて、微粒子の存在を識別する処理とを有
することに特徴がある。また、（ロ）液体中の微粒子に
光を照射する処理と、光の照射により生じる蛍光を検出
して、単一光子に基づく信号パルスを取り出す処理と、
信号パルスを予め定めた繰り返し周期で連続的に計数す
る処理と、連続する少なくとも２周期以上の計数値を記
憶し、１周期毎に記憶した２周期以上の計数値を積算す
る処理と、積算値から微粒子の存在を識別する処理とを
有することにも特徴がある。また、（ハ）予め定めた基
準時間内に発生する信号パルスの数を連続的に計数して
、所定の閾値を超える計数値のときに微粒子の存在を判
定し、計数値から微粒子の種類を算定することにも特徴
がある。（ニ）予め定めた基準時間当りで計測される信
号パルスの計数値は、２個以上のＮ（Ｎ≧２）個のカウ
ンタを用い、各カウンタのカウント動作時間を基準時間
とし、基準時間より長い周期Ｔで動作させ、かつ各カウ
ンタの位相を互いにずらし、ｎ（Ｎ≧ｎ≧２）番目とｎ
−１番目のカウンタの動作時間のずれ、すなわち動作間
隔をＴ／Ｎとし、Ｔ／Ｎの動作間隔毎に適当なカウンタ
の計数値を取り出すことにより得ることにも特徴がある
。また、（ホ）基準時間は、微粒子に光が照射されてい
る時間にほぼ等しいか、あるいは微粒子に光が照射され
てる時間の約２倍程度以内にすることにも特徴がある。 また、本発明の微粒子計測装置は、（ヘ）（ａ）微粒子
から蛍光を生じさせるための励起光照射手段と、（ｂ）
微粒子からの蛍光を集光する蛍光集光手段と、（ｃ）蛍
光を検出し、検出した１つの光子に基づく電気パルスを
取り出す検出手段と、（ｄ）電気パルスの数を計数する
カウンタ手段と、（ｅ）カウンタの動作時間、周期およ
びカウンタ間のカウント動作間隔を制御するカウンタ制
御手段と、（ｆ）各カウンタ間の動作間隔毎に各カウン
タの計数値を逐次取り出す計数値選択手段と、（ｇ）計
数値のピ−クを検出するピ−ク検出手段とを具備するこ
とに特徴がある。また、（ト）カウンタ制御手段は、複
数のカウンタのカウント動作時間を同じにし、各カウン
タ間の動作間隔をカウント動作時間よりも短くなるよう
に制御することにも特徴がある。また、（チ）計数値選
択手段とピ−ク検出手段との間に、計数値選択手段で得
られる計数値を所定の閾値と比較するための比較回路を
設けたことにも特徴がある。（リ）液体中の微粒子を該
微粒子が発する光の光学的変化に基づいて計数し、微粒
子を解析する微粒子計測装置において、少なくとも、（
ａ）微粒子から発する光の単一光子に基づく電気パルス
を取り出す光検出手段と、（ｂ）電気パルスの数を所定
の繰り返し周期で連続的に計数する少なくとも１個のカ
ウンタと、（ｃ）連続する少なくとも２周期以上の計数
値を記憶し、１周期毎に記憶した２周期以上の計数値を
積算する積算回路を具備することにも特徴がある。さら
に、（ヌ）カウンタの計数動作を行う所定の繰り返し周
期は、微粒子に光が照射されている時間より短く、かつ
積算の結果得られる計数値を得るために要する計数時間
が微粒子からの蛍光発生時間にほぼ等しいか、あるいは
蛍光発生時間の１ないし２倍の時間であることにも特徴
がある。また、本発明の微粒子による定量方法は、（ル
）測定試料中の被測定物質と特異的に結合する物質を固
定化した反応固相または被測定物質が結合し得る反応固
相と、被測定物質と特異的に結合する物質を固定化した
蛍光性の微粒子を使用し、反応固相と被測定物質と微粒
子を接触させることにより、微粒子を反応固相に捕捉す
る処理と、捕捉した微粒子を請求項１または請求項２の
微粒子測定方法で計測する処理とを有することに特徴が
ある。さらに、（ワ）微粒子として、０．１μｍ以下の
径の微粒子を使用することにも特徴がある。
【０００８】
【作用】本発明においては、光検出器として光電子増倍
管等を使用し、光電子計数法により入射する光子をパル
ス信号に変換して、そのパルス数を計数し、蛍光強度を
測定する。この光電子計数法では、光子検出に基づくパ
ルス波高値とそれ以外の熱雑音等の雑音に基づくパルス
波高値とが異なることを利用したパルス波高値分別によ
り、ノイズ成分の除去を容易にし、Ｓ／Ｎの高い測定を
可能にする。先ず、（ａ）励起光照射部により粒子に励
起光を照射し、蛍光を生じさせる。励起光には、レ−ザ
光、例えばアルゴンレ−ザ、ヘリウムネオンレ−ザ、ヘ
リウムカドミウムレ−ザ、ＹＡＧレ−ザ、半導体レ−ザ
等の光が適当である。また、キセノンランプや水銀ラン
プを分光した光も使用できる。（ｂ）蛍光集光部により
生じた蛍光を集光する。（ｃ）光検出部により蛍光を検
出し、その単一光子に基づく電気パルスを出力する。 （ｄ）カウンタ部では、電気パルスの数を複数のカウン
タで計数する。（ｅ）カウンタ制御部では、各カウンタ
の動作時間、周期およびカウンタ間の動作間隔を制御し
、カウンタを動作させる。（ｆ）計数値選択部により、
各カウンタの動作間隔毎に各カウンタの計数値を逐次的
に取り出す。（ｇ）比較回路部により計数値選択部で得
られる計数値を所定の閾値と比較し、閾値を超えたとき
に計数値を通過させる。（ｈ）ピ−ク検出部により、閾
値を超えた計数値のピ−ク値を検出する。このピ−ク値
を、デ−タ処理部により解析する。反応容器に補捉した
蛍光微粒子を測定するには、顕微鏡下で蛍光微粒子の存
在する位置に焦点を合わせ、レ−ザ光をＸ−Ｙ方向に走
査し、またはステ−ジをＸ−Ｙ方向に走査することによ
り、微粒子をほぼ１個ずつレ−ザ光で照射し、生じる蛍
光の変化を上記微粒子測定方法で測定した後、これを解
析して、微粒子数を計数する。また、反応容器に補捉し
た蛍光微粒子を、物理的あるいは化学的に反応容器から
剥がすことにより、微粒子懸濁液を調製し、この微粒子
懸濁液をシ−スフロ−セル等の測光セルに導き、励起光
の照射位置を微粒子がほぼ１個ずつ通過するようにして
、上記微粒子測定方法でその蛍光を測定し、解析して微
粒子数を計数する。本発明で使用する蛍光性微粒子は、
微粒子内部に蛍光物質を含ませることにより、あるいは
微粒子表面に蛍光物質を結合させることにより、得るこ
とができる。微粒子の材質には、例えば、ポリスチレン
、ポリメタクリル酸メチル、スチレン−ブタジェン共重
合体等が使用できる。また、ポリアミドアミンを骨格と
した構造の微粒子状物質を使用することもできる。なお
、反応に使用する微粒子には、測定試料中の被測定物質
と特異的に結合する物質を結合させる必要がある。測定
試料中の被測定物質および被測定物質と特異的に結合す
る物質の組み合わせとしては、抗原（または抗体）と抗
体（または抗原）が代表的な組み合わせである。その他
に、例えば、ホルモンとレセプタ−、糖とクレチンの組
み合わせ、またはハイブリダイゼ−ション反応による特
定のＤＮＡとプロ−ブＤＮＡの組み合わせ等も可能であ
る。また、この微粒子の表面に抗体（または抗原）等を
結合させるには、通常知られている物理吸着、化学結合
等が利用できる。
管等を使用し、光電子計数法により入射する光子をパル
ス信号に変換して、そのパルス数を計数し、蛍光強度を
測定する。この光電子計数法では、光子検出に基づくパ
ルス波高値とそれ以外の熱雑音等の雑音に基づくパルス
波高値とが異なることを利用したパルス波高値分別によ
り、ノイズ成分の除去を容易にし、Ｓ／Ｎの高い測定を
可能にする。先ず、（ａ）励起光照射部により粒子に励
起光を照射し、蛍光を生じさせる。励起光には、レ−ザ
光、例えばアルゴンレ−ザ、ヘリウムネオンレ−ザ、ヘ
リウムカドミウムレ−ザ、ＹＡＧレ−ザ、半導体レ−ザ
等の光が適当である。また、キセノンランプや水銀ラン
プを分光した光も使用できる。（ｂ）蛍光集光部により
生じた蛍光を集光する。（ｃ）光検出部により蛍光を検
出し、その単一光子に基づく電気パルスを出力する。 （ｄ）カウンタ部では、電気パルスの数を複数のカウン
タで計数する。（ｅ）カウンタ制御部では、各カウンタ
の動作時間、周期およびカウンタ間の動作間隔を制御し
、カウンタを動作させる。（ｆ）計数値選択部により、
各カウンタの動作間隔毎に各カウンタの計数値を逐次的
に取り出す。（ｇ）比較回路部により計数値選択部で得
られる計数値を所定の閾値と比較し、閾値を超えたとき
に計数値を通過させる。（ｈ）ピ−ク検出部により、閾
値を超えた計数値のピ−ク値を検出する。このピ−ク値
を、デ−タ処理部により解析する。反応容器に補捉した
蛍光微粒子を測定するには、顕微鏡下で蛍光微粒子の存
在する位置に焦点を合わせ、レ−ザ光をＸ−Ｙ方向に走
査し、またはステ−ジをＸ−Ｙ方向に走査することによ
り、微粒子をほぼ１個ずつレ−ザ光で照射し、生じる蛍
光の変化を上記微粒子測定方法で測定した後、これを解
析して、微粒子数を計数する。また、反応容器に補捉し
た蛍光微粒子を、物理的あるいは化学的に反応容器から
剥がすことにより、微粒子懸濁液を調製し、この微粒子
懸濁液をシ−スフロ−セル等の測光セルに導き、励起光
の照射位置を微粒子がほぼ１個ずつ通過するようにして
、上記微粒子測定方法でその蛍光を測定し、解析して微
粒子数を計数する。本発明で使用する蛍光性微粒子は、
微粒子内部に蛍光物質を含ませることにより、あるいは
微粒子表面に蛍光物質を結合させることにより、得るこ
とができる。微粒子の材質には、例えば、ポリスチレン
、ポリメタクリル酸メチル、スチレン−ブタジェン共重
合体等が使用できる。また、ポリアミドアミンを骨格と
した構造の微粒子状物質を使用することもできる。なお
、反応に使用する微粒子には、測定試料中の被測定物質
と特異的に結合する物質を結合させる必要がある。測定
試料中の被測定物質および被測定物質と特異的に結合す
る物質の組み合わせとしては、抗原（または抗体）と抗
体（または抗原）が代表的な組み合わせである。その他
に、例えば、ホルモンとレセプタ−、糖とクレチンの組
み合わせ、またはハイブリダイゼ−ション反応による特
定のＤＮＡとプロ−ブＤＮＡの組み合わせ等も可能であ
る。また、この微粒子の表面に抗体（または抗原）等を
結合させるには、通常知られている物理吸着、化学結合
等が利用できる。
【０００９】
【実施例】以下、本発明の実施例を、図面により詳細に
説明する。図１は、本発明の第１の実施例を示す蛍光微
粒子の計測装置のブロック構成図である。図１の計測装
置は、蛍光微粒子の懸濁液をフロ−させて連続的に計測
する装置である。この計測装置は、試料導入部（３〜６
）と励起光照射部（１１，１２）と蛍光集光部（１３〜
１６）と光検出部（１７〜１９）とカウンタ部（２０ａ
〜２０ｄ）とカウンタ制御部（２１）と計数値選択部（
２２）と比較回路部（２３）とピ−ク検出部（２４）と
デ−タ処理部（２５）とで構成される。１〜１６の構成
は従来より知られている部分であるのに対して、１７〜
２５の構成が本発明により新たに設けられた部分である
。すなわち、試料導入部としては、容器１に入った微粒
子懸濁液２を吸引する試料吸引ノズル３と、流路を切り
換えるための電磁バルブ４と、試料液を吸引および排出
するシリンジピペッタ５と、微粒子懸濁液２およびシ−
ス液８を導入するシ−スフロ−セル６等とからなる。 励起光照射部は、レ−ザ装置１１と集光レンズ１２とで
構成される。蛍光集光部は、集光レンズ１３、１５と分
光フィルタ１４とスリット１６で構成される。光検出部
は、光電子増倍管１７と増幅器１８と波高弁別・波形整
形器１９から構成される。また、カウンタ部は、複数の
カウンタ２０ａ〜２０ｄから構成される。カウンタ制御
部として、カウンタ制御器２１が、計数値選択部として
、カウント値逐次出力回路２２が、比較回路部として、
比較器２３が、ピ−ク検出部として、ピ−ク検出器２４
が、それぞれ設けられる。
説明する。図１は、本発明の第１の実施例を示す蛍光微
粒子の計測装置のブロック構成図である。図１の計測装
置は、蛍光微粒子の懸濁液をフロ−させて連続的に計測
する装置である。この計測装置は、試料導入部（３〜６
）と励起光照射部（１１，１２）と蛍光集光部（１３〜
１６）と光検出部（１７〜１９）とカウンタ部（２０ａ
〜２０ｄ）とカウンタ制御部（２１）と計数値選択部（
２２）と比較回路部（２３）とピ−ク検出部（２４）と
デ−タ処理部（２５）とで構成される。１〜１６の構成
は従来より知られている部分であるのに対して、１７〜
２５の構成が本発明により新たに設けられた部分である
。すなわち、試料導入部としては、容器１に入った微粒
子懸濁液２を吸引する試料吸引ノズル３と、流路を切り
換えるための電磁バルブ４と、試料液を吸引および排出
するシリンジピペッタ５と、微粒子懸濁液２およびシ−
ス液８を導入するシ−スフロ−セル６等とからなる。 励起光照射部は、レ−ザ装置１１と集光レンズ１２とで
構成される。蛍光集光部は、集光レンズ１３、１５と分
光フィルタ１４とスリット１６で構成される。光検出部
は、光電子増倍管１７と増幅器１８と波高弁別・波形整
形器１９から構成される。また、カウンタ部は、複数の
カウンタ２０ａ〜２０ｄから構成される。カウンタ制御
部として、カウンタ制御器２１が、計数値選択部として
、カウント値逐次出力回路２２が、比較回路部として、
比較器２３が、ピ−ク検出部として、ピ−ク検出器２４
が、それぞれ設けられる。
【００１０】次に、図１の計測装置の動作を説明する。
測定する試料液（微粒子懸濁液２）およびシ−ス液８を
シ−スフロ−セル６に導き、試料液２をシ−ス液８で包
んで微細な流れにして、蛍光測定を行う。そのために、
先ず容器１内の微粒子懸濁液２を吸引ノズル３、電磁バ
ルブ４を介してシリンジピペッタ５で吸引する。次に、
電磁バルブ４を切り換えて、吸引した微粒子懸濁液２を
シ−スフロ−セル６の試料導入管６ａから一定流速で排
出する。また、同時にシ−ス液容器７内のシ−ス液８を
一定流速ポンプ９によりシ−スフロ−セル６のシ−ス液
導入管６ｂから導入することにより、微粒子懸濁液２を
細く絞ってシ−スフロ−セル６の測光部６ｃを通過させ
、最終的に廃液容器１０に廃棄する。次に、蛍光測定に
ついて説明する。蛍光微粒子を励起するため、レ−ザ装
置１１から発するレ−ザ光をレンズ１２により集光し、
シ−スフロ−セル６の測光部６ｃ内を流れる微粒子懸濁
液２に照射する。レ−ザ装置１１としては、Ａｒレ−ザ
、あるいは半導体レ−ザが用いられる。蛍光微粒子から
発する蛍光は、レンズ１３で集光され、バンドパス干渉
フィルタ等の分光フィルタ１４で散乱光を可能な限り除
去して、透過する蛍光を再度レンズ１５により集光し、
スリット１６上に結像させる。そして、蛍光微粒子から
の像のみを通過させて、光検出器である光電子増倍管１
７で検出する。光電子増倍管１７の出力は、光電子計数
法に基づいて増幅器１８で増幅した後、波高弁別・波形
整形器１９により、光電子増倍管１７に入射する光子を
パルス信号に変換して出力する。
シ−スフロ−セル６に導き、試料液２をシ−ス液８で包
んで微細な流れにして、蛍光測定を行う。そのために、
先ず容器１内の微粒子懸濁液２を吸引ノズル３、電磁バ
ルブ４を介してシリンジピペッタ５で吸引する。次に、
電磁バルブ４を切り換えて、吸引した微粒子懸濁液２を
シ−スフロ−セル６の試料導入管６ａから一定流速で排
出する。また、同時にシ−ス液容器７内のシ−ス液８を
一定流速ポンプ９によりシ−スフロ−セル６のシ−ス液
導入管６ｂから導入することにより、微粒子懸濁液２を
細く絞ってシ−スフロ−セル６の測光部６ｃを通過させ
、最終的に廃液容器１０に廃棄する。次に、蛍光測定に
ついて説明する。蛍光微粒子を励起するため、レ−ザ装
置１１から発するレ−ザ光をレンズ１２により集光し、
シ−スフロ−セル６の測光部６ｃ内を流れる微粒子懸濁
液２に照射する。レ−ザ装置１１としては、Ａｒレ−ザ
、あるいは半導体レ−ザが用いられる。蛍光微粒子から
発する蛍光は、レンズ１３で集光され、バンドパス干渉
フィルタ等の分光フィルタ１４で散乱光を可能な限り除
去して、透過する蛍光を再度レンズ１５により集光し、
スリット１６上に結像させる。そして、蛍光微粒子から
の像のみを通過させて、光検出器である光電子増倍管１
７で検出する。光電子増倍管１７の出力は、光電子計数
法に基づいて増幅器１８で増幅した後、波高弁別・波形
整形器１９により、光電子増倍管１７に入射する光子を
パルス信号に変換して出力する。
【００１１】次に、この光子の検出に基づくパルス信号
を、カウンタ２０ａ〜２０ｄにより計数する。カウンタ
の動作は、カウンタ制御器２１で制御される。各カウン
タ２０ａ〜２０ｄの動作周期は、一定の時間であり、各
カウンタの位相を１／４周期ずつずらして動作させる。 動作周期は、蛍光微粒子が励起光束を通過する時間とほ
ぼ同等に設定される。各カウンタの計数値は、各周期毎
にカウント値逐次出力回路２２に入力され、新たに計数
値が入力されるまでその値が保持される。その結果、カ
ウント値逐次出力回路２２では、１／４周期毎に１周期
ずつの計数値を示す段階的なパルス波形が得られて、そ
の結果が比較器２３に出力される。比較器２３では、計
数値を所定の閾値と比較して、その閾値を超える計数値
のときに値をピ−ク検出器２４に送出する。閾値は、蛍
光微粒子からの蛍光に依存しない散乱光等の雑音の影響
を少なくするために設けられており、装置の光学系の状
態等により設定される。ピ−ク検出器２４では、閾値を
超えた計数値の時間的な変化から、そのピ−ク値を検出
する。デ−タ処理部２５は、このピ−ク値を解析するた
め、ピ−ク値に対する頻度を積算して特定の範囲のピ−
ク値を有するパルス総数、つまり微粒子数を算定する等
の処理を行う。
を、カウンタ２０ａ〜２０ｄにより計数する。カウンタ
の動作は、カウンタ制御器２１で制御される。各カウン
タ２０ａ〜２０ｄの動作周期は、一定の時間であり、各
カウンタの位相を１／４周期ずつずらして動作させる。 動作周期は、蛍光微粒子が励起光束を通過する時間とほ
ぼ同等に設定される。各カウンタの計数値は、各周期毎
にカウント値逐次出力回路２２に入力され、新たに計数
値が入力されるまでその値が保持される。その結果、カ
ウント値逐次出力回路２２では、１／４周期毎に１周期
ずつの計数値を示す段階的なパルス波形が得られて、そ
の結果が比較器２３に出力される。比較器２３では、計
数値を所定の閾値と比較して、その閾値を超える計数値
のときに値をピ−ク検出器２４に送出する。閾値は、蛍
光微粒子からの蛍光に依存しない散乱光等の雑音の影響
を少なくするために設けられており、装置の光学系の状
態等により設定される。ピ−ク検出器２４では、閾値を
超えた計数値の時間的な変化から、そのピ−ク値を検出
する。デ−タ処理部２５は、このピ−ク値を解析するた
め、ピ−ク値に対する頻度を積算して特定の範囲のピ−
ク値を有するパルス総数、つまり微粒子数を算定する等
の処理を行う。
【００１２】図２は、図１における信号処理の流れを示
すタイミングチャ−トである。図２（ａ）は、光電子増
倍管１７の出力の時間経過を示している。この出力中に
は、光子の検出に基づいた比較的大きなパルスと、光電
子増倍管１７自体の暗電流に基づいた比較的小さなパル
スが含まれている。増幅器１８と波高弁別・波形整形器
１９は、閾値（点線で示す）を境にして両者を弁別し、
図２（ｂ）に示すように光子の検出に基づいたパルスの
みを取り出す。（ｃ１）〜（ｃ４）は、カウンタ制御器
２１で制御される４つのカウンタ２０ａ〜２０ｄのゲ−
トの状態の時間経過を示している。ここでは、ハイレベ
ルのときに、各カウンタ２０ａ〜２０ｄは計数動作を行
わせ、それぞれ位相を１／４周期ずつずらすように設定
する。（ｃ１）〜（ｃ４）に対応する各カウンタ２０ａ
〜２０ｄの出力の時間経過は、（ｄ１）〜（ｄ４）に示
すようになる。カウンタは、計数動作後にその計数値を
示すパルスを出力し、この動作を繰り返す。これらの出
力は、カウント値逐次出力回路２２に送出される。カウ
ント値逐次出力回路２２では、（ｅ）に示すように１／
４周期毎にステップ的に変化する信号を出力する。 （ｅ）の縦軸は、計数値を示している。ダ−クパルスに
相当する計数の影響を除去するために、適当な閾値を設
けて、この閾値を超える計数値のピ−ク値をピ−ク検出
器２４で取り出す。ピ−ク検出器２４の出力が（ｆ）で
ある。このパルス波高値の頻度を波高分析器で構成され
たデ−タ処理部２５で解析し、特定の範囲の波高値を有
するパルスの発生頻度から微粒子の数を算定する。
すタイミングチャ−トである。図２（ａ）は、光電子増
倍管１７の出力の時間経過を示している。この出力中に
は、光子の検出に基づいた比較的大きなパルスと、光電
子増倍管１７自体の暗電流に基づいた比較的小さなパル
スが含まれている。増幅器１８と波高弁別・波形整形器
１９は、閾値（点線で示す）を境にして両者を弁別し、
図２（ｂ）に示すように光子の検出に基づいたパルスの
みを取り出す。（ｃ１）〜（ｃ４）は、カウンタ制御器
２１で制御される４つのカウンタ２０ａ〜２０ｄのゲ−
トの状態の時間経過を示している。ここでは、ハイレベ
ルのときに、各カウンタ２０ａ〜２０ｄは計数動作を行
わせ、それぞれ位相を１／４周期ずつずらすように設定
する。（ｃ１）〜（ｃ４）に対応する各カウンタ２０ａ
〜２０ｄの出力の時間経過は、（ｄ１）〜（ｄ４）に示
すようになる。カウンタは、計数動作後にその計数値を
示すパルスを出力し、この動作を繰り返す。これらの出
力は、カウント値逐次出力回路２２に送出される。カウ
ント値逐次出力回路２２では、（ｅ）に示すように１／
４周期毎にステップ的に変化する信号を出力する。 （ｅ）の縦軸は、計数値を示している。ダ−クパルスに
相当する計数の影響を除去するために、適当な閾値を設
けて、この閾値を超える計数値のピ−ク値をピ−ク検出
器２４で取り出す。ピ−ク検出器２４の出力が（ｆ）で
ある。このパルス波高値の頻度を波高分析器で構成され
たデ−タ処理部２５で解析し、特定の範囲の波高値を有
するパルスの発生頻度から微粒子の数を算定する。
【００１３】図３は、図１において、単位時間当りに検
出される光子数（蛍光微粒子の蛍光強度）とその発生頻
度、つまりヒストグラムの一例を示す図であり、図４は
、図１において得られる試料中に含ませた蛍光微粒子の
総数と、検出される蛍光微粒子の総数との関係図である
。以下、図１における具体例を述べる。アルゴンレ−ザ
（波長４８８ｎｍ、出力１０ｍＷ）を使用して適当に減
光し、これを２０μｍ径程度に絞ってシ−スフロ−セル
６の測光部６ｃに照射する。蛍光微粒子として、フルオ
レセイン含有のポリスチレン微粒子（直径０．０９μｍ
）を使用し、微粒子懸濁液２をシ−スフロ−セル６に導
き、微粒子懸濁液２を１０μｍ径程度に細く絞って測光
部６ｃを通過させる。流速は、０．５ｍ／ｓ程度に調整
する。生じる蛍光は４０倍の対物レンズ１３で集光し、
並行光として５１０〜５５０ｎｍの光を透過する干渉フ
ィルタ１４により分光する。再びレンズ１５により流れ
る蛍光微粒子の像を幅５００μｍ、長さ１ｍｍの短冊状
の開口を有するスリット１６に結像させ、通過する蛍光
を光電子増倍管１７で検出して、上述の信号処理を施す
。カウント動作時間を６０μｓ、カウンタ２０ａ〜２０
ｄの動作周期を６５μｓとする。その時に得られる結果
は、図３に示すようになる。図３の横軸は、ピ−ク検出
器２４で得られるピ−ク値であり、これは単位時間（カ
ウント動作時間：６０μｓ）当りに検出される蛍光の光
子数を意味し、蛍光強度に比例するものである。また、
図３の縦軸は、その値の発生頻度を示している。横軸の
値の光子数の小さな部分の山はノイズの裾の一部である
。すなわち、光子数の０に近い箇所は、散乱光等による
ノイズの数であり、閾値で切断した後に残った山の裾野
の部分である。また、光子数の大きな部分の山は、蛍光
微粒子からの信号であって、この山の積分値が検出され
る蛍光微粒子の総数となる。試料の微粒子懸濁液２中の
微粒子の濃度を変えて測定する場合、試料中の蛍光微粒
子の総数と、検出される蛍光微粒子の総数との関係は、
図４に示すような特性曲線になる。これからも明らかな
ように、低濃度から高濃度までほぼ直線関係が保持され
、定量感度が高いことを示しており、また再現性も高い
。
出される光子数（蛍光微粒子の蛍光強度）とその発生頻
度、つまりヒストグラムの一例を示す図であり、図４は
、図１において得られる試料中に含ませた蛍光微粒子の
総数と、検出される蛍光微粒子の総数との関係図である
。以下、図１における具体例を述べる。アルゴンレ−ザ
（波長４８８ｎｍ、出力１０ｍＷ）を使用して適当に減
光し、これを２０μｍ径程度に絞ってシ−スフロ−セル
６の測光部６ｃに照射する。蛍光微粒子として、フルオ
レセイン含有のポリスチレン微粒子（直径０．０９μｍ
）を使用し、微粒子懸濁液２をシ−スフロ−セル６に導
き、微粒子懸濁液２を１０μｍ径程度に細く絞って測光
部６ｃを通過させる。流速は、０．５ｍ／ｓ程度に調整
する。生じる蛍光は４０倍の対物レンズ１３で集光し、
並行光として５１０〜５５０ｎｍの光を透過する干渉フ
ィルタ１４により分光する。再びレンズ１５により流れ
る蛍光微粒子の像を幅５００μｍ、長さ１ｍｍの短冊状
の開口を有するスリット１６に結像させ、通過する蛍光
を光電子増倍管１７で検出して、上述の信号処理を施す
。カウント動作時間を６０μｓ、カウンタ２０ａ〜２０
ｄの動作周期を６５μｓとする。その時に得られる結果
は、図３に示すようになる。図３の横軸は、ピ−ク検出
器２４で得られるピ−ク値であり、これは単位時間（カ
ウント動作時間：６０μｓ）当りに検出される蛍光の光
子数を意味し、蛍光強度に比例するものである。また、
図３の縦軸は、その値の発生頻度を示している。横軸の
値の光子数の小さな部分の山はノイズの裾の一部である
。すなわち、光子数の０に近い箇所は、散乱光等による
ノイズの数であり、閾値で切断した後に残った山の裾野
の部分である。また、光子数の大きな部分の山は、蛍光
微粒子からの信号であって、この山の積分値が検出され
る蛍光微粒子の総数となる。試料の微粒子懸濁液２中の
微粒子の濃度を変えて測定する場合、試料中の蛍光微粒
子の総数と、検出される蛍光微粒子の総数との関係は、
図４に示すような特性曲線になる。これからも明らかな
ように、低濃度から高濃度までほぼ直線関係が保持され
、定量感度が高いことを示しており、また再現性も高い
。
【００１４】本実施例においては、光電子計数法による
蛍光測定を行うことになるので、原理的に蛍光強度を高
感度に計測することができる。従って、蛍光強度の小さ
い蛍光微粒子、つまり大きさが小さい微粒子、微粒子の
内部または表面に存在する蛍光物質の量が少ない微粒子
、蛍光の収率の小さな蛍光物質を含む微粒子等を高精度
に計数することができる。また、励起光強度を強くする
ことなく計数できるとともに、適当な蛍光物質を選べば
、光出力の小さな半導体レ−ザが使用できるので、装置
の小型化を実現できる。さらに、原理的に、微粒子懸濁
液を全量測定して微粒子数を測定する場合でも、微粒子
懸濁液の一部分を測定して微粒子数を算定する場合でも
、蛍光微粒子を１個１個計数することができるので、蛍
光微粒子を高感度、かつ高精度で測定することが可能で
ある。
蛍光測定を行うことになるので、原理的に蛍光強度を高
感度に計測することができる。従って、蛍光強度の小さ
い蛍光微粒子、つまり大きさが小さい微粒子、微粒子の
内部または表面に存在する蛍光物質の量が少ない微粒子
、蛍光の収率の小さな蛍光物質を含む微粒子等を高精度
に計数することができる。また、励起光強度を強くする
ことなく計数できるとともに、適当な蛍光物質を選べば
、光出力の小さな半導体レ−ザが使用できるので、装置
の小型化を実現できる。さらに、原理的に、微粒子懸濁
液を全量測定して微粒子数を測定する場合でも、微粒子
懸濁液の一部分を測定して微粒子数を算定する場合でも
、蛍光微粒子を１個１個計数することができるので、蛍
光微粒子を高感度、かつ高精度で測定することが可能で
ある。
【００１５】また、本実施例のように、複数のカウンタ
のカウント動作時間を同じにして、各カウンタの動作の
位相をずらしてカウンタ間の動作間隔を動作時間よりも
短くなるように制御することにより、カウンタの動作時
間当りの計数値をより細かい時間間隔で取り出すことが
でき、高精度に測定することが可能である。なお、図１
では、カウンタが４個の場合を示しているが、２個以上
のｎ個のカウンタで構成することができる。この場合、
各カウンタの動作の位相は、１／ｎ周期ずつずらして動
作させ、逐次、その計数値を読み込むことにより実現で
きる。また、比較器２３は、後段の回路の帯域を減少さ
せるために有効であるが、ピ−ク検出器２４やデ−タ処
理部２５等における帯域を十分に高帯域とすることによ
り、比較器の使用を不要にすることも可能である。さら
に、図１では、波高分析器により、単位時間当りの光子
数を表わすパルス波高値を解析しているが、予め分布が
分っている場合には、一定の範囲のピ−ク値のみをカウ
ントするカウンタで計数することも可能である。
のカウント動作時間を同じにして、各カウンタの動作の
位相をずらしてカウンタ間の動作間隔を動作時間よりも
短くなるように制御することにより、カウンタの動作時
間当りの計数値をより細かい時間間隔で取り出すことが
でき、高精度に測定することが可能である。なお、図１
では、カウンタが４個の場合を示しているが、２個以上
のｎ個のカウンタで構成することができる。この場合、
各カウンタの動作の位相は、１／ｎ周期ずつずらして動
作させ、逐次、その計数値を読み込むことにより実現で
きる。また、比較器２３は、後段の回路の帯域を減少さ
せるために有効であるが、ピ−ク検出器２４やデ−タ処
理部２５等における帯域を十分に高帯域とすることによ
り、比較器の使用を不要にすることも可能である。さら
に、図１では、波高分析器により、単位時間当りの光子
数を表わすパルス波高値を解析しているが、予め分布が
分っている場合には、一定の範囲のピ−ク値のみをカウ
ントするカウンタで計数することも可能である。
【００１６】図５は、本発明の第２の実施例を示す微粒
子計測装置の構成図である。図１では、微粒子が含まれ
る液、例えば微粒子懸濁液２中の微粒子の数を計数する
方法を示しているが、図５では、基板上に付着した蛍光
微粒子の計測方法を示している。ここでは、表面にカル
ボキシル基を有する蛍光微粒子の懸濁液２を、スライド
ガラス等のガラス基体上にのせて、そのガラス表面に蛍
光微粒子を付着させ、蛍光微粒子の数を計数する。図５
において、光検出部１７から信号処理部２５までの構成
は、図１の構成と同じである。蛍光微粒子２６の付着し
ているガラス基体２７をＸ−Ｙ移動台２８に保持し、Ｘ
−Ｙ方向に走査する。励起光の照射および蛍光の集光は
、落射蛍光顕微鏡の構成と同じである。レ−ザ装置２９
からの励起用レ−ザ光に対して、先ずビ−ムエキスパン
ダ３０で光束を拡大し、正方形の開口を有するスリット
３１で透過するレ−ザ光束を整形し、ダイクロイックミ
ラ−３２で反射させて対物レンズ３３で絞り、ガラス基
板２７の蛍光微粒子２６の上方から照射する。蛍光微粒
子２６から発する蛍光は、対物レンズ３３で集光され、
ダイクロイックミラ−３２およびバンドパス干渉フィル
タ等の分光フィルタ３４で散乱光が可能な限り除去され
る。次に、透過する蛍光を再度レンズ３５により集光し
、スリット３６上に結像させ、蛍光微粒子からの像のみ
を通過させて、光検出器である光電子増倍管１７で検出
する。光電子増倍管１７の出力は、図１の場合と同じよ
うに、光電子計数法に基づいて増幅器１８で増幅した後
、波高弁別・波形整形器１９を通過させることにより、
光電子増倍管１７に入射する光子をパルス信号に変換し
、出力する。次に、この光子の検出に基づくパルス信号
を図１と同じように信号処理し、単位時間当りに検出さ
れる光子の数を実時間でモニタして、これを解析する。
子計測装置の構成図である。図１では、微粒子が含まれ
る液、例えば微粒子懸濁液２中の微粒子の数を計数する
方法を示しているが、図５では、基板上に付着した蛍光
微粒子の計測方法を示している。ここでは、表面にカル
ボキシル基を有する蛍光微粒子の懸濁液２を、スライド
ガラス等のガラス基体上にのせて、そのガラス表面に蛍
光微粒子を付着させ、蛍光微粒子の数を計数する。図５
において、光検出部１７から信号処理部２５までの構成
は、図１の構成と同じである。蛍光微粒子２６の付着し
ているガラス基体２７をＸ−Ｙ移動台２８に保持し、Ｘ
−Ｙ方向に走査する。励起光の照射および蛍光の集光は
、落射蛍光顕微鏡の構成と同じである。レ−ザ装置２９
からの励起用レ−ザ光に対して、先ずビ−ムエキスパン
ダ３０で光束を拡大し、正方形の開口を有するスリット
３１で透過するレ−ザ光束を整形し、ダイクロイックミ
ラ−３２で反射させて対物レンズ３３で絞り、ガラス基
板２７の蛍光微粒子２６の上方から照射する。蛍光微粒
子２６から発する蛍光は、対物レンズ３３で集光され、
ダイクロイックミラ−３２およびバンドパス干渉フィル
タ等の分光フィルタ３４で散乱光が可能な限り除去され
る。次に、透過する蛍光を再度レンズ３５により集光し
、スリット３６上に結像させ、蛍光微粒子からの像のみ
を通過させて、光検出器である光電子増倍管１７で検出
する。光電子増倍管１７の出力は、図１の場合と同じよ
うに、光電子計数法に基づいて増幅器１８で増幅した後
、波高弁別・波形整形器１９を通過させることにより、
光電子増倍管１７に入射する光子をパルス信号に変換し
、出力する。次に、この光子の検出に基づくパルス信号
を図１と同じように信号処理し、単位時間当りに検出さ
れる光子の数を実時間でモニタして、これを解析する。
【００１７】図５において、レ−ザ装置２９としては、
アルゴンレ−ザ（波長４８８ｎｍ、出力５ｍＷ）を使用
し、適当に減光し、１μｍ角のスポットで蛍光微粒子に
照射する。Ｘ−Ｙ移動台２８により５ｍｍ／ｓの速度で
Ｘ−Ｙ方向に順次走査する。このときのカウンタの動作
時間を２００μｓとする。このとき得られる結果は、ほ
ぼ図３と同じような分布を有するヒストグラムが得られ
る。図５の実施例では、ガラス基板等の平面的な部分に
結合した蛍光微粒子をそのままの状態で計測することが
できる。また、光電子計数法により単位時間中の蛍光の
光子数を測定するので、蛍光強度の小さい蛍光微粒子を
高精度に計数することができる。さらに、図５では、Ｘ
−Ｙ移動台によりガラス基板をＸ−Ｙ方向に走査して、
平面上の蛍光微粒子数の解析を行う場合を示しているが
、逆に励起光であるレ−ザ光を走査しても同じように解
析することができる。
アルゴンレ−ザ（波長４８８ｎｍ、出力５ｍＷ）を使用
し、適当に減光し、１μｍ角のスポットで蛍光微粒子に
照射する。Ｘ−Ｙ移動台２８により５ｍｍ／ｓの速度で
Ｘ−Ｙ方向に順次走査する。このときのカウンタの動作
時間を２００μｓとする。このとき得られる結果は、ほ
ぼ図３と同じような分布を有するヒストグラムが得られ
る。図５の実施例では、ガラス基板等の平面的な部分に
結合した蛍光微粒子をそのままの状態で計測することが
できる。また、光電子計数法により単位時間中の蛍光の
光子数を測定するので、蛍光強度の小さい蛍光微粒子を
高精度に計数することができる。さらに、図５では、Ｘ
−Ｙ移動台によりガラス基板をＸ−Ｙ方向に走査して、
平面上の蛍光微粒子数の解析を行う場合を示しているが
、逆に励起光であるレ−ザ光を走査しても同じように解
析することができる。
【００１８】次に、本発明の第３の実施例について説明
する。すなわち、第３の実施例は、半導体レ−ザ装置を
使用した計測装置の場合である。図１において、レ−ザ
装置１１として、波長６７０ｎｍの半導体レ−ザを使用
する。その場合、蛍光体としてフルオレセイン等は使用
できないため、波長６７０ｎｍ付近に吸収のある物質を
使用する。例えば、アルミニュ−ム・フタロシアニン錯
体等を使用できる。このアルミニュ−ム・フタロシアニ
ン錯体等をその内部に含んだ微粒子、またはその表面に
結合させた微粒子を使用し、半導体レ−ザ光を励起光と
して蛍光測定する。アルミニュ−ム・フタロシアニン錯
体を蛍光体とする蛍光微粒子の径は、０．１μｍとする
。蛍光検出用の分光フィルタとして、波長６９５ｎｍか
ら７５０ｎｍを透過するバンドパス干渉フィルタを使用
する。光検出器である光電子増倍管は、長波長に感度の
あるものにして、光電面を冷却して使用する。その他の
処理、例えば蛍光微粒子懸濁液のフロ−セルへの導入、
信号処理等は、図１の第１の実施例と同じに行えばよく
、これにより、図３とほぼ同じ分布を有する結果を得る
ことができる。第３の実施例においては、光電子計数法
による蛍光測定を行うので、原理的に蛍光強度を高感度
に計数することができる。従って、蛍光強度の小さい蛍
光微粒子を高精度に計数することが可能である。この結
果、光出力の弱い半導体レ−ザ装置でも、効率よく蛍光
微粒子からの信号を得ることができ、高感度、高精度に
測定することができる。また、蛍光体の励起用の光源と
して半導体レ−ザを使用することができるので小型化が
図れ、また、励起光が長波長になることで散乱光を抑え
ることが容易となり、安価に装置を製造することが可能
である。
する。すなわち、第３の実施例は、半導体レ−ザ装置を
使用した計測装置の場合である。図１において、レ−ザ
装置１１として、波長６７０ｎｍの半導体レ−ザを使用
する。その場合、蛍光体としてフルオレセイン等は使用
できないため、波長６７０ｎｍ付近に吸収のある物質を
使用する。例えば、アルミニュ−ム・フタロシアニン錯
体等を使用できる。このアルミニュ−ム・フタロシアニ
ン錯体等をその内部に含んだ微粒子、またはその表面に
結合させた微粒子を使用し、半導体レ−ザ光を励起光と
して蛍光測定する。アルミニュ−ム・フタロシアニン錯
体を蛍光体とする蛍光微粒子の径は、０．１μｍとする
。蛍光検出用の分光フィルタとして、波長６９５ｎｍか
ら７５０ｎｍを透過するバンドパス干渉フィルタを使用
する。光検出器である光電子増倍管は、長波長に感度の
あるものにして、光電面を冷却して使用する。その他の
処理、例えば蛍光微粒子懸濁液のフロ−セルへの導入、
信号処理等は、図１の第１の実施例と同じに行えばよく
、これにより、図３とほぼ同じ分布を有する結果を得る
ことができる。第３の実施例においては、光電子計数法
による蛍光測定を行うので、原理的に蛍光強度を高感度
に計数することができる。従って、蛍光強度の小さい蛍
光微粒子を高精度に計数することが可能である。この結
果、光出力の弱い半導体レ−ザ装置でも、効率よく蛍光
微粒子からの信号を得ることができ、高感度、高精度に
測定することができる。また、蛍光体の励起用の光源と
して半導体レ−ザを使用することができるので小型化が
図れ、また、励起光が長波長になることで散乱光を抑え
ることが容易となり、安価に装置を製造することが可能
である。
【００１９】次に、本発明の第４の実施例について説明
する。第４の実施例は、２種類の蛍光微粒子を個々に弁
別し、計数する場合である。蛍光微粒子として、０．０
９μｍ径のフルオレセイン含有のポリスチレン微粒子と
、０．０６μｍ径のフルオレセイン含有のポリスチレン
微粒子とを混合し、この微粒子懸濁液を図１に示す計測
装置で解析すると、図６に示すような結果が得られる。 すなわち、双峰性の分布が得られ、光子数の違いにより
明らかに２種類の微粒子群に分けられる。なお、蛍光微
粒子の同時通過の影響を無くすために、十分に低い濃度
の蛍光微粒子懸濁液を用いた場合である。図６において
、横軸はピ−ク検出器で得られる単位時間当りに検出さ
れた蛍光の光子数のピ−ク値であり、これは蛍光強度に
比例する。また、縦軸は、その値の発生頻度を示してい
る。横軸の光子数の大きい方の山が０．０９μｍ径の微
粒子からの信号であり、光子数の小さい方の山が０．０
６μｍ径の蛍光微粒子からの信号である。これらの谷の
部分で、微粒子の種類を識別することが可能である。こ
のように、本実施例では、単位時間当りに検出される蛍
光の光子数から、２種類の蛍光微粒子を個々に弁別して
、これらを計数することが可能である。本実施例では、
異なる粒径の蛍光微粒子を個々に弁別することができ、
多種類の蛍光微粒子を識別計数することが可能である。 また、本実施例のように同一種類の蛍光体を使用する場
合でも、異なる種類の蛍光体を含む蛍光微粒子の場合で
も、同じように測定可能である。励起光が１種でよい場
合には、蛍光検出系を種類の異なる蛍光微粒子毎に設け
て、それぞれの信号を解析すればよい。また、励起光を
蛍光微粒子毎に変える必要がある場合には、励起光光学
系と蛍光検出系を蛍光微粒子毎に設けることにより解析
することができる。
する。第４の実施例は、２種類の蛍光微粒子を個々に弁
別し、計数する場合である。蛍光微粒子として、０．０
９μｍ径のフルオレセイン含有のポリスチレン微粒子と
、０．０６μｍ径のフルオレセイン含有のポリスチレン
微粒子とを混合し、この微粒子懸濁液を図１に示す計測
装置で解析すると、図６に示すような結果が得られる。 すなわち、双峰性の分布が得られ、光子数の違いにより
明らかに２種類の微粒子群に分けられる。なお、蛍光微
粒子の同時通過の影響を無くすために、十分に低い濃度
の蛍光微粒子懸濁液を用いた場合である。図６において
、横軸はピ−ク検出器で得られる単位時間当りに検出さ
れた蛍光の光子数のピ−ク値であり、これは蛍光強度に
比例する。また、縦軸は、その値の発生頻度を示してい
る。横軸の光子数の大きい方の山が０．０９μｍ径の微
粒子からの信号であり、光子数の小さい方の山が０．０
６μｍ径の蛍光微粒子からの信号である。これらの谷の
部分で、微粒子の種類を識別することが可能である。こ
のように、本実施例では、単位時間当りに検出される蛍
光の光子数から、２種類の蛍光微粒子を個々に弁別して
、これらを計数することが可能である。本実施例では、
異なる粒径の蛍光微粒子を個々に弁別することができ、
多種類の蛍光微粒子を識別計数することが可能である。 また、本実施例のように同一種類の蛍光体を使用する場
合でも、異なる種類の蛍光体を含む蛍光微粒子の場合で
も、同じように測定可能である。励起光が１種でよい場
合には、蛍光検出系を種類の異なる蛍光微粒子毎に設け
て、それぞれの信号を解析すればよい。また、励起光を
蛍光微粒子毎に変える必要がある場合には、励起光光学
系と蛍光検出系を蛍光微粒子毎に設けることにより解析
することができる。
【００２０】次に、本発明の第５の実施例として、微粒
子測定装置の免疫測定の応用について説明する。被測定
物質として、ヒトα−フェトプロティン（ヒトＡＦＰ）
抗原を例にとって、ヘテロジニアスサンドイッチイムノ
アッセイ法により反応容器に蛍光微粒子を捕捉し、この
蛍光微粒子を微粒子測定装置により計数し、抗原濃度を
定量する方法および測定装置について述べる。先ず、反
応容器として、マイクロタイタ−プレ−トのウェルを使
用し、各ウェルに抗体を固定化することにより反応用の
固相を調製する。また、標識用の微粒子として、抗体を
固定化した微粒子を調製する。その後、試料等を反応さ
せて、微粒子を計数する。 （反応用固相の調製）マイクロタイタ−プレ−トのウェ
ルに、抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化することにより、反応
用の固相を得て、このウェルを反応容器とする。先ず、
表面にアミノ基を有するポリスチレン製のマイクロタイ
タ−プレ−トのウェルに０．１％のグルタ−アルデヒド
溶液１００μｌを注入し、室温で一晩反応させた後、溶
液を除去して洗浄する。次に、抗ヒトＡＦＰ抗体溶液（
濃度１μｇ／ｍｌ）１００μｌをウェルに注入し、室温
で２時間間歇的に撹伴した後、さらに４゜Ｃで一晩反応
させる。最後に、０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含むリン酸緩衝液（０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ）で洗浄
することにより、反応容器を調製する。 （標識微粒子の調製）表面にカルボキシル基を有し、蛍
光物質をその内部に含有しているポリスチレン製の蛍光
微粒子を使用する。直径が０．０９μｍで、５４０ｎｍ
程度の波長に最大蛍光波長を有する蛍光微粒子の表面に
抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化することにより、標識微粒子
を調製する。具体的には、抗ヒトＡＦＰ抗体（（Ｆａｂ
′）２）を２−メルカプトエタノ−ルで処理し、抗ヒト
ＡＦＰ抗体（Ｆａｂ′）を調製する。また、別に、蛍光
微粒子を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド ハイドロクロライド、１，８−
ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン、Ｎ−（γ−マレ
イミドブチリルオキシ）サクシニイミドで処理する。こ
の蛍光微粒子と、先に調製した抗ヒトＡＦＰ抗体（Ｆａ
ｂ′）と反応させることにより、表面に抗ヒトＡＦＰ抗
体（Ｆａｂ′）を固定化した蛍光微粒子、つまり標識微
粒子を得る。この標識微粒子は、１％ＢＳＡを含むリン
酸緩衝液に懸濁させて使用する。懸濁時の標識微粒子の
濃度は、０．１％となるように調製するが、特に限定さ
れるものではなく、測定対象、反応時間、微粒子の種類
等によりその濃度は決定される。
子測定装置の免疫測定の応用について説明する。被測定
物質として、ヒトα−フェトプロティン（ヒトＡＦＰ）
抗原を例にとって、ヘテロジニアスサンドイッチイムノ
アッセイ法により反応容器に蛍光微粒子を捕捉し、この
蛍光微粒子を微粒子測定装置により計数し、抗原濃度を
定量する方法および測定装置について述べる。先ず、反
応容器として、マイクロタイタ−プレ−トのウェルを使
用し、各ウェルに抗体を固定化することにより反応用の
固相を調製する。また、標識用の微粒子として、抗体を
固定化した微粒子を調製する。その後、試料等を反応さ
せて、微粒子を計数する。 （反応用固相の調製）マイクロタイタ−プレ−トのウェ
ルに、抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化することにより、反応
用の固相を得て、このウェルを反応容器とする。先ず、
表面にアミノ基を有するポリスチレン製のマイクロタイ
タ−プレ−トのウェルに０．１％のグルタ−アルデヒド
溶液１００μｌを注入し、室温で一晩反応させた後、溶
液を除去して洗浄する。次に、抗ヒトＡＦＰ抗体溶液（
濃度１μｇ／ｍｌ）１００μｌをウェルに注入し、室温
で２時間間歇的に撹伴した後、さらに４゜Ｃで一晩反応
させる。最後に、０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含むリン酸緩衝液（０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ）で洗浄
することにより、反応容器を調製する。 （標識微粒子の調製）表面にカルボキシル基を有し、蛍
光物質をその内部に含有しているポリスチレン製の蛍光
微粒子を使用する。直径が０．０９μｍで、５４０ｎｍ
程度の波長に最大蛍光波長を有する蛍光微粒子の表面に
抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化することにより、標識微粒子
を調製する。具体的には、抗ヒトＡＦＰ抗体（（Ｆａｂ
′）２）を２−メルカプトエタノ−ルで処理し、抗ヒト
ＡＦＰ抗体（Ｆａｂ′）を調製する。また、別に、蛍光
微粒子を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド ハイドロクロライド、１，８−
ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン、Ｎ−（γ−マレ
イミドブチリルオキシ）サクシニイミドで処理する。こ
の蛍光微粒子と、先に調製した抗ヒトＡＦＰ抗体（Ｆａ
ｂ′）と反応させることにより、表面に抗ヒトＡＦＰ抗
体（Ｆａｂ′）を固定化した蛍光微粒子、つまり標識微
粒子を得る。この標識微粒子は、１％ＢＳＡを含むリン
酸緩衝液に懸濁させて使用する。懸濁時の標識微粒子の
濃度は、０．１％となるように調製するが、特に限定さ
れるものではなく、測定対象、反応時間、微粒子の種類
等によりその濃度は決定される。
【００２１】（反応手順）被測定物質であるヒトＡＦＰ
を含む試料溶液１００μｌを抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化
した反応容器（ウェル）に注入して、室温で２時間反応
させ、ヒトＡＦＰを抗ヒトＡＦＰ抗体を介してウェルに
捕捉する。その後、ウェル内の溶液を除去し、０．５％
ＢＳＡ−ＰＢＳでウェルを洗浄する。次に、微粒子濃度
が０．１％になるように調製した標識微粒子溶液１００
μｌを注入し、室温で２時間反応させ、ウェルに捕捉し
たヒトＡＦＰに標識微粒子を結合させた。その後、ウェ
ル内の溶液を除去し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで静かに
洗浄し、余分な標識微粒子を除去する。 （微粒子計測手順）上述の操作でウェルに被測定物質で
あるヒトＡＦＰの量に比例した標識微粒子を捕捉するこ
とができる。この捕捉した標識微粒子数を、図１の微粒
子測定装置で測定する。先ず、ウェルに捕捉された標識
微粒子を液中に懸濁させる。例えば、ウェルにｐＨ２の
塩酸−グリシン緩衝液を加えて、標識微粒子の結合を切
断し、液中に再分散させ、標識微粒子の懸濁液を得る。 標識微粒子の結合を切断するには、超音波等を作用させ
る等の機械的な方法もある。この標識微粒子懸濁液を、
図１の測定装置を使用して標識微粒子の数を計数する。 この計数値より、被測定物質であるヒトＡＦＰの量を定
量することができる。 そのためには、予め被測定物
質濃度に対する標識微粒子数を測定し、検量線とするこ
とによって、これが可能となる。再分散させた標識微粒
子懸濁液のうちの一定量を測定し、試料溶液中のヒトＡ
ＦＰの濃度と、計数される標識微粒子数の関係を図に示
すと、図７のようになる。これにより、極低濃度のヒト
ＡＦＰを定量することが可能である。原理的に被測定物
質の分子数と蛍光微粒子の総数が対応するので、正確な
定量測定が可能となる。
を含む試料溶液１００μｌを抗ヒトＡＦＰ抗体を固定化
した反応容器（ウェル）に注入して、室温で２時間反応
させ、ヒトＡＦＰを抗ヒトＡＦＰ抗体を介してウェルに
捕捉する。その後、ウェル内の溶液を除去し、０．５％
ＢＳＡ−ＰＢＳでウェルを洗浄する。次に、微粒子濃度
が０．１％になるように調製した標識微粒子溶液１００
μｌを注入し、室温で２時間反応させ、ウェルに捕捉し
たヒトＡＦＰに標識微粒子を結合させた。その後、ウェ
ル内の溶液を除去し、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで静かに
洗浄し、余分な標識微粒子を除去する。 （微粒子計測手順）上述の操作でウェルに被測定物質で
あるヒトＡＦＰの量に比例した標識微粒子を捕捉するこ
とができる。この捕捉した標識微粒子数を、図１の微粒
子測定装置で測定する。先ず、ウェルに捕捉された標識
微粒子を液中に懸濁させる。例えば、ウェルにｐＨ２の
塩酸−グリシン緩衝液を加えて、標識微粒子の結合を切
断し、液中に再分散させ、標識微粒子の懸濁液を得る。 標識微粒子の結合を切断するには、超音波等を作用させ
る等の機械的な方法もある。この標識微粒子懸濁液を、
図１の測定装置を使用して標識微粒子の数を計数する。 この計数値より、被測定物質であるヒトＡＦＰの量を定
量することができる。 そのためには、予め被測定物
質濃度に対する標識微粒子数を測定し、検量線とするこ
とによって、これが可能となる。再分散させた標識微粒
子懸濁液のうちの一定量を測定し、試料溶液中のヒトＡ
ＦＰの濃度と、計数される標識微粒子数の関係を図に示
すと、図７のようになる。これにより、極低濃度のヒト
ＡＦＰを定量することが可能である。原理的に被測定物
質の分子数と蛍光微粒子の総数が対応するので、正確な
定量測定が可能となる。
【００２２】本実施例では、蛍光微粒子を高精度に計数
することができるので、被測定物質の量を高精度に定量
することができる。なお、実施例では、微粒子懸濁液の
うちの一定量を測定したが、微粒子懸濁液の全量を測定
することも可能である。全量を測定する場合には、微粒
子数の総数が計数でき、被測定物質の量を正確に定量す
ることができる。また、本実施例のように微粒子懸濁液
の一部分を測定しても可能であるが、この場合には、測
定液量や測定開始時間等の条件を制御して、一定にする
ことにより再現性よく計数することが可能である。また
、反応容器に捕捉されている蛍光微粒子のはがし方には
、大きく２つの場合がある。つまり、蛍光微粒子を全て
はがす場合と、抗原抗体反応部を特異的にはがす場合で
ある。前者の場合には、物理吸着等の非特異吸着により
反応容器に結合している蛍光微粒子をもはがされるが、
操作が比較的簡単となる。後者の場合には、被測定物質
と抗原抗体反応により結合している蛍光微粒子のみを選
択的にはがすことができ、定量感度をさらに向上させる
ことができる。さらに、本実施例では、反応後に反応容
器に捕捉された蛍光微粒子をはがして微粒子懸濁液とし
て、図１のフロ−法を使用した装置で計数しているが、
蛍光微粒子の計数方法としては、図５に記載した装置で
も可能である。すなわち、蛍光微粒子の結合する反応容
器を図５のＸ−Ｙ移動台に保持し、Ｘ−Ｙ方向に走査す
ることにより容器内に捕捉された蛍光微粒子の数を計数
することも可能である。また、本実施例では、ヒトＡＦ
Ｐを被測定物質として定量する例を示したが、それ以外
の抗原やホルモン等も同じような免疫測定で定量するこ
とも可能である。さらに、特定の塩基配列を有するＤＮ
Ａの検出にも有効である。具体的には、検出したい塩基
配列を認識するプロ−ブＤＮＡに蛍光微粒子を結合させ
たプロ−ブＤＮＡ−微粒子複合体を調製する。先ず、試
料中のＤＮＡを熱変性またはアルカリ変性等により、１
本鎖の状態にして膜等の固相に結合させ、プロ−ブＤＮ
Ａ−微粒子複合体を反応させてハイブリダイゼ−ション
反応を起こす。洗浄の後、変性等を起こしてプロ−ブＤ
ＮＡ−微粒子複合体をはがし、微粒子懸濁液を得る。こ
の微粒子懸濁液を図１の装置を使用して分析し、微粒子
の数を計数する。この計数値からプロ−ブＤＮＡの数が
検出でき、試料中の目的ＤＮＡの量が測定できる。この
方法では、微粒子を介することにより擬似的にプロ−ブ
ＤＮＡ分子を検出することができるので、高感度な定量
方法を実現できる。
することができるので、被測定物質の量を高精度に定量
することができる。なお、実施例では、微粒子懸濁液の
うちの一定量を測定したが、微粒子懸濁液の全量を測定
することも可能である。全量を測定する場合には、微粒
子数の総数が計数でき、被測定物質の量を正確に定量す
ることができる。また、本実施例のように微粒子懸濁液
の一部分を測定しても可能であるが、この場合には、測
定液量や測定開始時間等の条件を制御して、一定にする
ことにより再現性よく計数することが可能である。また
、反応容器に捕捉されている蛍光微粒子のはがし方には
、大きく２つの場合がある。つまり、蛍光微粒子を全て
はがす場合と、抗原抗体反応部を特異的にはがす場合で
ある。前者の場合には、物理吸着等の非特異吸着により
反応容器に結合している蛍光微粒子をもはがされるが、
操作が比較的簡単となる。後者の場合には、被測定物質
と抗原抗体反応により結合している蛍光微粒子のみを選
択的にはがすことができ、定量感度をさらに向上させる
ことができる。さらに、本実施例では、反応後に反応容
器に捕捉された蛍光微粒子をはがして微粒子懸濁液とし
て、図１のフロ−法を使用した装置で計数しているが、
蛍光微粒子の計数方法としては、図５に記載した装置で
も可能である。すなわち、蛍光微粒子の結合する反応容
器を図５のＸ−Ｙ移動台に保持し、Ｘ−Ｙ方向に走査す
ることにより容器内に捕捉された蛍光微粒子の数を計数
することも可能である。また、本実施例では、ヒトＡＦ
Ｐを被測定物質として定量する例を示したが、それ以外
の抗原やホルモン等も同じような免疫測定で定量するこ
とも可能である。さらに、特定の塩基配列を有するＤＮ
Ａの検出にも有効である。具体的には、検出したい塩基
配列を認識するプロ−ブＤＮＡに蛍光微粒子を結合させ
たプロ−ブＤＮＡ−微粒子複合体を調製する。先ず、試
料中のＤＮＡを熱変性またはアルカリ変性等により、１
本鎖の状態にして膜等の固相に結合させ、プロ−ブＤＮ
Ａ−微粒子複合体を反応させてハイブリダイゼ−ション
反応を起こす。洗浄の後、変性等を起こしてプロ−ブＤ
ＮＡ−微粒子複合体をはがし、微粒子懸濁液を得る。こ
の微粒子懸濁液を図１の装置を使用して分析し、微粒子
の数を計数する。この計数値からプロ−ブＤＮＡの数が
検出でき、試料中の目的ＤＮＡの量が測定できる。この
方法では、微粒子を介することにより擬似的にプロ−ブ
ＤＮＡ分子を検出することができるので、高感度な定量
方法を実現できる。
【００２３】図８は、本発明の第６の実施例を示す微粒
子計測装置のブロック図である。図８において、図１の
構成と異なる点は、カウンタ以降の部分である。すなわ
ち、カウンタ部は１個のカウンタ３７から、またカウン
タ制御部はカウンタ制御器３８から、それぞれ構成され
る。積算回路部は、メモリ部３９ａ〜３９ｄ、加算器４
０からなる。ピ−ク検出部はピ−ク検出器２４から、ま
たデ−タ処理部は波高分析器またはカウンタまたはコン
ピュ−タ等のデ−タ処理器２５から、構成される。測定
する試料液とシ−ス液をシ−スフロ−セルに導き、試料
液をシ−ス液で包んで微細な流れとし、蛍光測定を行う
。そのために先ず容器１内の微粒子懸濁液２を吸引ノズ
ル３、電磁バルブ４を介してシリンジピペッタ５で吸引
する。次に、電磁バルブ４を切り換えて、吸引した微粒
子懸濁液２をシ−スフロ−セル６の試料導入管６ａから
一定流速で排出する。また、同時にシ−ス液容器７内の
シ−ス液８を一定流速ポンプ９によりシ−スフロ−セル
６のシ−ス液導入管６ｂから導入することにより、微粒
子懸濁液２を細く絞ってシ−スフロ−セル６の測光部６
ｃを通過させ、最終的に廃液容器１０に廃棄する。蛍光
微粒子を励起するため、レ−ザ装置１１から発するレ−
ザ光をレンズ１２により集光し、シ−スフロ−セル６の
測光部６ｃ内を流れる微粒子懸濁液２に照射する。蛍光
微粒子から発する蛍光は、レンズ１３で集光し、バンド
パス干渉フィルタ等の分光フィルタ１４で散乱光を可能
な限り除去し、透過する蛍光を再度レンズ１５により集
光してスリット１６上に結像させる。これにより、蛍光
微粒子からの像のみを通過させて、光検出器である光電
子増倍管１７で検出する。光電子増倍管１７の出力は、
光電子計数法に基づいて増幅器１８により増幅した後、
波高弁別・波形整形器１９により、光電子増倍管１７に
入射する光子をパルス信号に変換して出力する。
子計測装置のブロック図である。図８において、図１の
構成と異なる点は、カウンタ以降の部分である。すなわ
ち、カウンタ部は１個のカウンタ３７から、またカウン
タ制御部はカウンタ制御器３８から、それぞれ構成され
る。積算回路部は、メモリ部３９ａ〜３９ｄ、加算器４
０からなる。ピ−ク検出部はピ−ク検出器２４から、ま
たデ−タ処理部は波高分析器またはカウンタまたはコン
ピュ−タ等のデ−タ処理器２５から、構成される。測定
する試料液とシ−ス液をシ−スフロ−セルに導き、試料
液をシ−ス液で包んで微細な流れとし、蛍光測定を行う
。そのために先ず容器１内の微粒子懸濁液２を吸引ノズ
ル３、電磁バルブ４を介してシリンジピペッタ５で吸引
する。次に、電磁バルブ４を切り換えて、吸引した微粒
子懸濁液２をシ−スフロ−セル６の試料導入管６ａから
一定流速で排出する。また、同時にシ−ス液容器７内の
シ−ス液８を一定流速ポンプ９によりシ−スフロ−セル
６のシ−ス液導入管６ｂから導入することにより、微粒
子懸濁液２を細く絞ってシ−スフロ−セル６の測光部６
ｃを通過させ、最終的に廃液容器１０に廃棄する。蛍光
微粒子を励起するため、レ−ザ装置１１から発するレ−
ザ光をレンズ１２により集光し、シ−スフロ−セル６の
測光部６ｃ内を流れる微粒子懸濁液２に照射する。蛍光
微粒子から発する蛍光は、レンズ１３で集光し、バンド
パス干渉フィルタ等の分光フィルタ１４で散乱光を可能
な限り除去し、透過する蛍光を再度レンズ１５により集
光してスリット１６上に結像させる。これにより、蛍光
微粒子からの像のみを通過させて、光検出器である光電
子増倍管１７で検出する。光電子増倍管１７の出力は、
光電子計数法に基づいて増幅器１８により増幅した後、
波高弁別・波形整形器１９により、光電子増倍管１７に
入射する光子をパルス信号に変換して出力する。
【００２４】次に、この光子の検出に基づくパルス信号
を、カウンタ３７により計数する。カウンタ３７の動作
はカウンタ制御器３８により制御され、所定のタイミン
グと繰り返し周期（Ｔ）等に基づいたゲ−ト動作を行わ
せる。繰り返し周期（Ｔ）は、蛍光微粒子が励起光束を
通過して蛍光を発する時間より短くする。ここでは、周
期（Ｔ）を蛍光を発する時間の１／４として説明する。 カウンタ３７の計数結果の出力およびリセット動作は、
ほぼ瞬間的に行うように設定され、ゲ−ト時間は周期（
Ｔ）とほぼ同じにする。１周期毎のカウンタ３７の計数
値は、メモリ３９ａに出力され、記憶される。それと同
時に直前のメモリ３９ａ、３９ｂ、３９ｃの記憶値は、
それぞれメモリ３９ｂ，３９ｃ，３９ｄに転送される。 この動作は、カウンタ制御器３８からの繰り返し周期（
Ｔ）に同期したトリガにより行われ、カウンタ３７の周
期（Ｔ）毎の計数値の出力と同期して動作する。計数値
は、メモリ３９ａ→３９ｂ→３９ｃ→３９ｄの順で転送
され、任意の時間には最新の計数値がメモリ３９ａに、
１周期前の計数値がメモリ３９ｂに、２周期前の計数値
がメモリ３９ｃに、３周期前の計数値がメモリ３９ｄに
、それぞれ記憶されている。つまり、４周期分の計数値
が記憶されており、これらの値を加算器４０で加算する
ことにより、実質的に４×Ｔの時間範囲の総計数値が得
られる。この動作は、周期（Ｔ）毎に行われるので、そ
の結果、時間Ｔ毎に４×Ｔの時間範囲に検出される光子
の総数が連続的に得られる。ピ−ク検出器２４では、こ
の計数値の時間変化から計数値のピ−クを求め、デ−タ
処理部２５により解析する。デ−タ処理部２５では、ピ
−ク値に対する頻度を積算し、特定の範囲のピ−ク値を
有するパルス総数、つまり微粒子数を算定する等の処理
を行う。
を、カウンタ３７により計数する。カウンタ３７の動作
はカウンタ制御器３８により制御され、所定のタイミン
グと繰り返し周期（Ｔ）等に基づいたゲ−ト動作を行わ
せる。繰り返し周期（Ｔ）は、蛍光微粒子が励起光束を
通過して蛍光を発する時間より短くする。ここでは、周
期（Ｔ）を蛍光を発する時間の１／４として説明する。 カウンタ３７の計数結果の出力およびリセット動作は、
ほぼ瞬間的に行うように設定され、ゲ−ト時間は周期（
Ｔ）とほぼ同じにする。１周期毎のカウンタ３７の計数
値は、メモリ３９ａに出力され、記憶される。それと同
時に直前のメモリ３９ａ、３９ｂ、３９ｃの記憶値は、
それぞれメモリ３９ｂ，３９ｃ，３９ｄに転送される。 この動作は、カウンタ制御器３８からの繰り返し周期（
Ｔ）に同期したトリガにより行われ、カウンタ３７の周
期（Ｔ）毎の計数値の出力と同期して動作する。計数値
は、メモリ３９ａ→３９ｂ→３９ｃ→３９ｄの順で転送
され、任意の時間には最新の計数値がメモリ３９ａに、
１周期前の計数値がメモリ３９ｂに、２周期前の計数値
がメモリ３９ｃに、３周期前の計数値がメモリ３９ｄに
、それぞれ記憶されている。つまり、４周期分の計数値
が記憶されており、これらの値を加算器４０で加算する
ことにより、実質的に４×Ｔの時間範囲の総計数値が得
られる。この動作は、周期（Ｔ）毎に行われるので、そ
の結果、時間Ｔ毎に４×Ｔの時間範囲に検出される光子
の総数が連続的に得られる。ピ−ク検出器２４では、こ
の計数値の時間変化から計数値のピ−クを求め、デ−タ
処理部２５により解析する。デ−タ処理部２５では、ピ
−ク値に対する頻度を積算し、特定の範囲のピ−ク値を
有するパルス総数、つまり微粒子数を算定する等の処理
を行う。
【００２５】図９は、図８の信号処理の流れを示すタイ
ムチャ−トである。（ａ）は、光電子増倍管１７の出力
の時間経過を示す。この出力には、光子の検出に基づく
比較的大きなパルスと光電子増倍管１７の暗電流に基づ
く比較的小さなパルスが含まれる。両者を増幅器１８と
波高弁別・波形整形器１９により閾値を境にして弁別し
、（ｂ）のように、光子の検出に基づくパルスを取り出
す。（ｃ）は、カウンタ制御器２１から出力されるカウ
ンタ用のゲ−ト信号の時間経過を示しており、表示はロ
−レベルのときにカウンタに計数動作を起こさせること
を意味する。（ｄ）は、その結果得られるカウンタ３７
の計数値の出力の時間経過である。なお、表示上説明し
易くするために、ゲ−ト相互間の間隔を広げて表示して
いるが、実際には、ゲ−トの時間幅に対して無視できる
時間幅である。（ｅ１）〜（ｅ４）は、それぞれメモリ
３９ａ〜３９ｄで記憶されている計数値の時間経過を示
している。カウンタ３７の計数値は、先ずメモリ３９ａ
に記憶され、（ｅ１）の時間経過を示す。（ｅ２）〜（
ｅ４）は（ｅ１）をそれぞれ１，２，３周期遅らせた時
間経過を示す。（ｆ）は加算器４０の、（ｅ１）〜（ｅ
４）を加算した結果を示している。（ｇ）はピ−ク検出
器２４により、（ｆ）の信号から算定したピ−ク値を示
す。このピ−ク値およびその頻度をデ−タ処理部２５で
解析する。特定の範囲のピ−ク値を有するパルスの発生
頻度から微粒子の数を算定することができる。具体的に
、アルゴンレ−ザ（波長４８８ｎｍ，出力１５ｍＷ）を
使用して、ＮＤフィルタ等で適当に減光して、２０μｍ
径程度に絞ってシ−スフロ−セルの測光部に照射する。 蛍光微粒子として、フルオレセイン含有のポリスチレン
微粒子（直径０，０９μｍ）を使用し、微粒子懸濁液２
をシ−スフロ−セルに導き、微粒子懸濁液２を１０μｍ
径程度に細く絞って測光部を通過させる。流速は、０．
３ｍ／ｓ程度に調整する。これにより生じる蛍光は、４
０倍の対物レンズで集光され、並行光にされて、５１０
〜５５０ｎｍの光を透過する干渉フィルタにより分光さ
れる。次に、再びレンズにより、流れる蛍光微粒子の像
を幅５００μｍ、長さ１ｍｍの短冊状の開口を有するス
リットに結像させ、通過する蛍光を光電子増幅管で検出
して、上述の信号処理を施す。カウンタの繰り返し周期
は、微粒子へのレ−ザ光照射時間のほぼ１／４程度の２
０μｓとする。その時に得られる結果は、図１１に示す
ような特性となる。図１１の横軸はピ−ク検出器で得ら
れるピ−ク値であり、これは加算器で積算される実質的
な計数時間（８０μｓ）、つまり蛍光発光時間当りに検
出される蛍光の光子数を意味しており、蛍光強度に比例
する。また、縦軸は、その値の発生頻度を示している。 横軸の値の光子数の小さな部分の山は、ノイズの裾の一
部であり、また光子数の大きな部分の山が蛍光微粒子か
らの信号である。この山の積分値が、検出される蛍光微
粒子の総数として算定されることになる。また、図８で
は、メモリが４個の場合を示したが、２個以上のｎ個の
メモリで構成し、カウンタのゲ−ト時間を蛍光発光時間
の１／ｎ程度に設定することによっても実現できる。な
お、より精度を高めるためには、ｎの数をより増加させ
る方が好ましい。
ムチャ−トである。（ａ）は、光電子増倍管１７の出力
の時間経過を示す。この出力には、光子の検出に基づく
比較的大きなパルスと光電子増倍管１７の暗電流に基づ
く比較的小さなパルスが含まれる。両者を増幅器１８と
波高弁別・波形整形器１９により閾値を境にして弁別し
、（ｂ）のように、光子の検出に基づくパルスを取り出
す。（ｃ）は、カウンタ制御器２１から出力されるカウ
ンタ用のゲ−ト信号の時間経過を示しており、表示はロ
−レベルのときにカウンタに計数動作を起こさせること
を意味する。（ｄ）は、その結果得られるカウンタ３７
の計数値の出力の時間経過である。なお、表示上説明し
易くするために、ゲ−ト相互間の間隔を広げて表示して
いるが、実際には、ゲ−トの時間幅に対して無視できる
時間幅である。（ｅ１）〜（ｅ４）は、それぞれメモリ
３９ａ〜３９ｄで記憶されている計数値の時間経過を示
している。カウンタ３７の計数値は、先ずメモリ３９ａ
に記憶され、（ｅ１）の時間経過を示す。（ｅ２）〜（
ｅ４）は（ｅ１）をそれぞれ１，２，３周期遅らせた時
間経過を示す。（ｆ）は加算器４０の、（ｅ１）〜（ｅ
４）を加算した結果を示している。（ｇ）はピ−ク検出
器２４により、（ｆ）の信号から算定したピ−ク値を示
す。このピ−ク値およびその頻度をデ−タ処理部２５で
解析する。特定の範囲のピ−ク値を有するパルスの発生
頻度から微粒子の数を算定することができる。具体的に
、アルゴンレ−ザ（波長４８８ｎｍ，出力１５ｍＷ）を
使用して、ＮＤフィルタ等で適当に減光して、２０μｍ
径程度に絞ってシ−スフロ−セルの測光部に照射する。 蛍光微粒子として、フルオレセイン含有のポリスチレン
微粒子（直径０，０９μｍ）を使用し、微粒子懸濁液２
をシ−スフロ−セルに導き、微粒子懸濁液２を１０μｍ
径程度に細く絞って測光部を通過させる。流速は、０．
３ｍ／ｓ程度に調整する。これにより生じる蛍光は、４
０倍の対物レンズで集光され、並行光にされて、５１０
〜５５０ｎｍの光を透過する干渉フィルタにより分光さ
れる。次に、再びレンズにより、流れる蛍光微粒子の像
を幅５００μｍ、長さ１ｍｍの短冊状の開口を有するス
リットに結像させ、通過する蛍光を光電子増幅管で検出
して、上述の信号処理を施す。カウンタの繰り返し周期
は、微粒子へのレ−ザ光照射時間のほぼ１／４程度の２
０μｓとする。その時に得られる結果は、図１１に示す
ような特性となる。図１１の横軸はピ−ク検出器で得ら
れるピ−ク値であり、これは加算器で積算される実質的
な計数時間（８０μｓ）、つまり蛍光発光時間当りに検
出される蛍光の光子数を意味しており、蛍光強度に比例
する。また、縦軸は、その値の発生頻度を示している。 横軸の値の光子数の小さな部分の山は、ノイズの裾の一
部であり、また光子数の大きな部分の山が蛍光微粒子か
らの信号である。この山の積分値が、検出される蛍光微
粒子の総数として算定されることになる。また、図８で
は、メモリが４個の場合を示したが、２個以上のｎ個の
メモリで構成し、カウンタのゲ−ト時間を蛍光発光時間
の１／ｎ程度に設定することによっても実現できる。な
お、より精度を高めるためには、ｎの数をより増加させ
る方が好ましい。
【００２６】図１０は、本発明の第７の実施例を示す微
粒子計測装置のブロック図である。ここでは、基板上に
付着した蛍光微粒子の計測を行う装置を示している。図
１０において、図５の構成と異なる点は、カウンタ以降
の部分である。カウンタ以降の部分は、図８の構成と同
じである。レ−ザ装置２９として、アルゴンレ−ザ（波
長４８８ｎｍ、出力１５ｍＷ）を使用して、減光フィル
タ等で適当に減光し、１μｍ角のスポットで蛍光微粒子
に照射する。Ｘ−Ｙ移動台２８により５ｍｍ／ｓの速度
でＸ−Ｙ方向に順次走査する。このときのカウンタの動
作時間を２００μｓとする。このとき得られる結果は、
ほぼ図１１と同じ分布のヒストグラムである。
粒子計測装置のブロック図である。ここでは、基板上に
付着した蛍光微粒子の計測を行う装置を示している。図
１０において、図５の構成と異なる点は、カウンタ以降
の部分である。カウンタ以降の部分は、図８の構成と同
じである。レ−ザ装置２９として、アルゴンレ−ザ（波
長４８８ｎｍ、出力１５ｍＷ）を使用して、減光フィル
タ等で適当に減光し、１μｍ角のスポットで蛍光微粒子
に照射する。Ｘ−Ｙ移動台２８により５ｍｍ／ｓの速度
でＸ−Ｙ方向に順次走査する。このときのカウンタの動
作時間を２００μｓとする。このとき得られる結果は、
ほぼ図１１と同じ分布のヒストグラムである。
【００２７】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
蛍光微粒子からの蛍光強度をその光子数により計測する
ので、ノイズの低減ができ、さらに、検出される蛍光の
光子数を計測して蛍光微粒子の弁別を行うので、蛍光強
度の小さな微粒子を正確に弁別することができる。また
、単位時間当りに検出される光子数を、単位時間より短
い時間間隔で測定できるので、蛍光微粒子からの蛍光の
時間変化を正確に測定でき、その結果、蛍光微粒子から
発する光子の数を正確に測定することができる。また、
本発明では、０．１μｍ以下の径の微粒子を精度よく弁
別することができることから、０．１μｍ以下の径の蛍
光微粒子を標識物質とすることができる。その結果、標
識物の直接計数が可能となり、かつ標識物質の反応効率
が向上し、被測定物質との結合の安定性も高められ、被
測定物質の量を高精度、高感度で定量することが可能と
なる。
蛍光微粒子からの蛍光強度をその光子数により計測する
ので、ノイズの低減ができ、さらに、検出される蛍光の
光子数を計測して蛍光微粒子の弁別を行うので、蛍光強
度の小さな微粒子を正確に弁別することができる。また
、単位時間当りに検出される光子数を、単位時間より短
い時間間隔で測定できるので、蛍光微粒子からの蛍光の
時間変化を正確に測定でき、その結果、蛍光微粒子から
発する光子の数を正確に測定することができる。また、
本発明では、０．１μｍ以下の径の微粒子を精度よく弁
別することができることから、０．１μｍ以下の径の蛍
光微粒子を標識物質とすることができる。その結果、標
識物の直接計数が可能となり、かつ標識物質の反応効率
が向上し、被測定物質との結合の安定性も高められ、被
測定物質の量を高精度、高感度で定量することが可能と
なる。
【００２８】
【図１】本発明の一実施例を示す蛍光微粒子の計測装置
のブロック図である。
のブロック図である。
【図２】図１における信号処理の流れを示すタイムチャ
−トである。
−トである。
【図３】図１の装置で得られる単位時間当りに検出され
る光子数とその発生頻度のヒストグラム図である。
る光子数とその発生頻度のヒストグラム図である。
【図４】図１の装置で得られる試料中に含まれた蛍光微
粒子の総数と検出される蛍光微粒子の総数との関係を示
す図である。
粒子の総数と検出される蛍光微粒子の総数との関係を示
す図である。
【図５】本発明の第２の実施例を示す蛍光微粒子の計測
装置のブロック図である。
装置のブロック図である。
【図６】２種類の蛍光微粒子を同時に測定する場合、単
位時間当りに検出される光子数とその発生頻度を示す図
である。
位時間当りに検出される光子数とその発生頻度を示す図
である。
【図７】試料溶液中のヒトＡＦＰの濃度と、計数される
標識微粒子数の関係を示す図である。
標識微粒子数の関係を示す図である。
【図８】本発明の第６の実施例を示す蛍光微粒子の計測
装置のブロック図である。
装置のブロック図である。
【図９】図８に示す装置の信号処理の流れを示すタイム
チャ−トである。
チャ−トである。
【図１０】本発明の第７の実施例を示す蛍光微粒子の計
測装置のブロック図である。
測装置のブロック図である。
【図１１】図８の装置で得られる蛍光発光時間当りに検
出される光子数とその発生頻度を示す図である。
出される光子数とその発生頻度を示す図である。
１ 容器
２ 微粒子懸濁液
３ 吸引ノズル
４ 電磁バルブ
５ シリンジピペッタ
６ シ−スフロ−セル
７ シ−ス液容器
８ シ−ス液
９ 一定流速ポンプ
１０ 廃液容器
１１ レ−ザ装置
１２，１３，１５，３５ レンズ
１４ 分光フィルタ
１６ スリット
１７ 光電子増倍管
１８ 増幅器
１９ 波高弁別・波形整形器
２０，２０ａ，２０ｂ，２０ｃ，２０ｄ，３７ カウ
ンタ ２１，３８ カウンタ制御器 ２２ カウント値逐次出力回路 ２３ 比較器 ２４ ピ−ク検出器 ２５ デ−タ処理部 ２６ 蛍光微粒子 ２７ ガラス基板 ２８ Ｘ−Ｙ移動台 ２９ レ−ザ装置 ３０ ビ−ムエキスパンダ ３１，３６ スリット ３２ ダイクロイックミラ− ３３ 対物レンズ ３４ 分光フィルタ ３９ａ，３９ｂ，３９ｃ，３９ｄ メモリ４０ 加
算器
ンタ ２１，３８ カウンタ制御器 ２２ カウント値逐次出力回路 ２３ 比較器 ２４ ピ−ク検出器 ２５ デ−タ処理部 ２６ 蛍光微粒子 ２７ ガラス基板 ２８ Ｘ−Ｙ移動台 ２９ レ−ザ装置 ３０ ビ−ムエキスパンダ ３１，３６ スリット ３２ ダイクロイックミラ− ３３ 対物レンズ ３４ 分光フィルタ ３９ａ，３９ｂ，３９ｃ，３９ｄ メモリ４０ 加
算器
Claims (12)
- 【請求項１】 液体中の微粒子の数を該微粒子の光学
的変化に基づいて計数し、該微粒子を解析する微粒子計
測方法において、光の照射位置に微粒子をほぼ１個ずつ
導入することにより、またはほぼ１個の微粒子が存在し
得る領域を照射するように調整した光を順次走査して、
微粒子の位置に導くことにより、液体中の該微粒子に光
を照射する処理と、光の照射により生じる蛍光の単一光
子に基づく信号パルスを取り出す処理と、予め定めた基
準時間当りで計測される信号パルスの数に基づいて、微
粒子の存在を識別する処理とを有することを特徴とする
微粒子計測方法。 - 【請求項２】 液体中の微粒子の数を該微粒子の光学
的変化に基づいて計数し、該微粒子を解析する微粒子計
測方法において、液体中の微粒子に光を照射する処理と
、光の照射により生じる蛍光を検出して、単一光子に基
づく信号パルスを取り出す処理と、該信号パルスを予め
定めた繰り返し周期で連続的に計数する処理と、連続す
る少なくとも２周期以上の計数値を記憶し、１周期毎に
記憶した２周期以上の計数値を積算する処理と、該積算
値から微粒子の存在を識別する処理とを有することを特
徴とする微粒子計測方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載の微粒子計測方法にお
いて、上記予め定めた基準時間内に発生する信号パルス
の数を連続的に計数して、所定の閾値を超える計数値の
ときに微粒子の存在を判定し、該計数値から微粒子の種
類を算定することを特徴とする微粒子計測方法。 - 【請求項４】 請求項１または３に記載の微粒子計測
方法において、上記予め定めた基準時間当りで計測され
る信号パルスの計数値は、２個以上のＮ（Ｎ≧２）個の
カウンタを用い、各カウンタのカウント動作時間を上記
基準時間とし、該基準時間より長い周期Ｔで動作させ、
かつ各カウンタの位相を互いにずらし、ｎ（Ｎ≧ｎ≧２
）番目とｎ−１番目のカウンタの動作時間のずれ、すな
わち動作間隔をＴ／Ｎとし、Ｔ／Ｎの動作間隔毎に適当
なカウンタの計数値を取り出すことにより得ることを特
徴とする微粒子計測方法。 - 【請求項５】 請求項１または４に記載の微粒子計測
方法において、上記基準時間は、微粒子に光が照射され
ている時間にほぼ等しいか、あるいは微粒子に光が照射
されてる時間の約２倍程度以内にすることを特徴とする
微粒子計測方法。 - 【請求項６】 液体中の微粒子を該微粒子が発する光
の光学的変化に基づいて計数し、該微粒子を解析する微
粒子計測装置において、（ａ）微粒子から蛍光を生じさ
せるための励起光照射手段と、（ｂ）微粒子からの蛍光
を集光する蛍光集光手段と、（ｃ）蛍光を検出し、検出
した単一光子に基づく電気パルスを取り出す検出手段と
、（ｄ）該電気パルスの数を計数するカウンタ手段と、
（ｅ）該カウンタのカウント動作時間、周期およびカウ
ンタ間の動作間隔を制御するカウンタ制御手段と、（ｆ
）各カウンタ間の動作間隔毎に各カウンタの計数値を逐
次取り出す計数値選択手段と、（ｇ）計数値のピ−クを
検出するピ−ク検出手段とを具備することを特徴とする
微粒子計測装置。 - 【請求項７】 請求項６に記載の微粒子計測装置にお
いて、上記カウンタ制御手段は、複数のカウンタのカウ
ント動作時間を同じにし、各カウンタ間の動作間隔をカ
ウント動作時間よりも短くなるように制御することを特
徴とする微粒子計測装置。 - 【請求項８】 請求項６に記載の微粒子計測装置にお
いて、上記計数値選択手段とピ−ク検出手段との間に、
該計数値選択手段で得られる計数値を所定の閾値と比較
するための比較回路を設けたことを特徴とする微粒子計
測装置。 - 【請求項９】 液体中の微粒子を該微粒子が発する光
の光学的変化に基づいて計数し、該微粒子を解析する微
粒子計測装置において、少なくとも、（ａ）微粒子から
発する光の単一光子に基づく電気パルスを取り出す光検
出手段と、（ｂ）該電気パルスの数を所定の繰り返し周
期で連続的に計数する少なくとも１個のカウンタと、（
ｃ）連続する少なくとも２周期以上の計数値を記憶し、
１周期毎に記憶した２周期以上の計数値を積算する積算
回路を具備することを特徴とする微粒子計測装置。 - 【請求項１０】 請求項２に記載の微粒子計測方法ま
たは請求項９に記載の微粒子計測装置において、上記カ
ウンタの計数動作を行う所定の繰り返し周期は、微粒子
に光が照射されている時間より短く、かつ積算の結果得
られる計数値を得るために要する計数時間が微粒子から
の蛍光発生時間にほぼ等しいか、あるいは蛍光発生時間
の１ないし２倍の時間であることを特徴とする微粒子計
測装置。 - 【請求項１１】 測定試料中の被測定物質と特異的に
結合する物質を固定化した反応固相または被測定物質が
結合し得る反応固相と、該被測定物質と特異的に結合す
る物質を固定化した蛍光性の微粒子を使用し、該反応固
相と被測定物質と該微粒子を接触させることにより、該
微粒子を反応固相に捕捉する処理と、捕捉した微粒子を
請求項１または請求項２の微粒子測定方法で計測する処
理とを有することを特徴とする微粒子を用いた定量方法
。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載の微粒子を用いた
定量方法において、上記微粒子は、０．１μｍ以下の径
の微粒子を使用することを特徴とする定量方法。
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