ES2263597T3

ES2263597T3 - Procedimiento para la produccion de vacunas que contienen una mezcla tratada termicamente de por lo menos un antigeno con por lo menos un adyuvante.

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Publication number: ES2263597T3
Application number: ES01913372T
Authority: ES
Inventors: Hans Dr. Loibner; Helmut Eckert
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-03-21
Filing date: 2001-03-21
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2021-03-21
Also published as: ATE325622T1; WO2001070264A1; US7615226B2; DE50109757D1; EP1265631B1; CA2404108C; MXPA02009161A; US20030143221A1; AU2001239001A1; CA2404108A1; AT410172B; ATA4722000A; EP1265631A1

Abstract

Procedimiento para la mejora de la adhesión de antígenos a adyuvantes, caracterizado porque por lo menos un antígeno a base de polipéptidos se mezcla con por lo menos un adyuvante y la mezcla se somete, a continuación, a un tratamiento térmico a una temperatura de más de 80ºC durante un periodo de por lo menos 5 min.

Description

Procedimiento para la producción de vacunas que contienen una mezcla tratada térmicamente de por lo menos un antígeno con por la menos un adyuvante.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de vacunas, que comprenden por lo menos un antígeno y por lo menos un adyuvante.

La vacunación preventiva es uno de los avances más eficaces y con más éxito de la medicina moderna por todo el mundo. La inmunización activa y pasiva del hombre y de los animales contra una amplia gama de enfermedades se utilizan para combatir de forma eficaz los casos de enfermedad y muerte por todo el mundo causados por las "plagas de la humanidad" anteriores. En particular la inmunización activa, en la que se administran antígenos bacterianos o virales incapaces de multiplicación, puede considerarse por todo el mundo como el método más eficaz para la profilaxis de enfermedades de este tipo.

Puesto que muchas veces los propios antígenos seleccionados para una vacunación inician una respuesta inmune sólo pequeña o insuficiente en el organismo durante la vacunación, con lo cual no se obtiene una protección verdadera contra la enfermedad, en una formulación de vacunación están previstos normalmente, además del principio activo que inicia la respuesta inmune, también auxiliares estimuladores de la respuesta inmune. Por tanto, casi todas las vacunas habituales contienen los denominados adyuvantes, con los cuales se pretende mejorar la respuesta inmune a antígenos específicos determinados. Así, por ejemplo, la unión a adyuvantes determinados, tales como hidróxido de aluminio, permite mejorar sustancialmente la respuesta inmune inducida por vacunas.

En Cooper et al., Vaccine, 9 (5) (1991), 351-357, se describe un adyuvante de una vacuna constituido por gamma-inulina y alumbre. La Gamma-inulina es un polifructosano lineal con aproximadamente 30 a 60 unidades de fructosa en un enlace beta-2,1, presentes en la forma furano.

El documento WO 98/56419 A se refiere a un procedimiento para la prevención del desarrollo de tumores asociados a HMFG utilizando el anticuerpo antiidiotípico 11D10. En dicho documento, se describen varias opciones de cómo puede administrarse dicho anticuerpo o proporcionarlo como medicamento. Por ejemplo, el anticuerpo 11D10 puede someterse a un tratamiento térmico antes de ser administrado. El tratamiento térmico puede llevarse a cabo a una temperatura comprendida entre aproximadamente 40 y 80ºC, preferentemente entre 45 y 60ºC, durante un periodo comprendido entre 5 minutos y 2 horas.

Kreuter, Journal of controlled release, 16 (1-2) (1991), 169-176 se refiere a nanopartículas preparadas por polimerización o bien por irradiación gamma o bien por tratamiento térmico en presencia de peroxodisulfato de potasio o amonio. Si se desea, las nanopartículas de este tipo pueden emulsionarse también en aceite caliente (120 a 180ºC).

En Speidel et al., European Journal of Immunology, 27 (9) (1997), 2391-2399 se describe que un preparado de un virus total de influenza, que ha sido calentado a 100ºC o incluso tratado en un autoclave, es capaz de cebar CTL específico de H en ratones B6 con menor eficacia. Al mismo tiempo, se menciona que en algunos experimentos puede utilizarse hidróxido de aluminio como adyuvante, el cual se ha adicionado al material a inyectar antes de la inyección.

Sin embargo, en el transcurso de la presente invención, se ha hallado que la unión de los antígenos, en particular de los antígenos a base de polipéptidos, a adyuvantes de este tipo es lábil y no especifica, por lo cual, inmediatamente tras la administración de formulaciones de vacunas de este tipo, se separa el antígeno en su mayor parte del adyuvante y queda sólo un pequeño porcentaje del antígeno específico unido al adyuvante.

Por tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar formulaciones de vacunas mejoradas que puedan iniciar una unión modificada del antígeno a un adyuvante de este tipo y por ello una mejor respuesta inmune.

La invención se refiere a un procedimiento para mejorar la adhesión de antígenos a adyuvantes, caracterizado porque se mezcla por lo menos un antígeno con por lo menos un adyuvante y, a continuación, se somete la mezcla a un tratamiento térmico a una temperatura de por lo menos 80ºC durante un periodo de por lo menos 5 min en una solución o suspensión. Se ha hallado que durante este proceso se cambia la adhesión de los antígenos al adyuvante de forma decisiva, con lo cual la introducción de las vacunas preparadas según la invención en el individuo a inmunizar (hombre/animal) no da lugar a un intercambio inmediato del antígeno inmune con las proteínas presentes en el lugar de administración.

Preferentemente, según la invención, los antígenos utilizados son antígenos a base de polipéptidos, es decir, antígenos peptídicos o antígenos de proteínas. Los antígenos peptídicos de este tipo presentan una longitud a partir de aproximadamente 6 aminoácidos (por ejemplo 8 a 11 aminoácidos), pero pueden estar comprendidos también por cadenas de polipéptidos mucho más largas, que comprenden por ejemplo la proteína entera nativa de antígeno o las subunidades de proteína de antígeno correspondientes o partes o derivados de la misma.

Básicamente, el antígeno de proteína contenido en la mezcla puede ser cualquier proteína que como antígeno es apta para una vacunación. Por proteínas se entienden en la presente invención polipéptidos de más de cinco aminoácidos, que adicionalmente pueden contener otras sustancias con enlace covalente con la estructura molecular (tales como por ejemplo azucares, lípidos, grupos fosfato). Los grupos laterales no se limitan a modificaciones de polipéptidos naturales, sino que pueden ser también modificaciones artificiales (tal como por ejemplo polietilenglicol). En una forma de realización preferida del procedimiento según la invención, el antígeno de proteína es un anticuerpo.

Dichos antígenos de la presente invención no se limitan a antígenos determinados, con lo cual pueden utilizarse también antígenos virales (por ejemplo contra VAH, VBH, VCH o VIH) y bacterianos así como alérgenos, antígenos contra tumores o antígenos procedentes de patógenos eucariontes. Entre estos, los antígenos que son aptos son también partículas de virus enteras, bacterias o fragmentos de las mismas.

Los adyuvantes que pueden utilizarse según la invención son sólidos tensioactivos en los cuales pueden adsorberse los antígenos. Los adyuvantes particularmente preferidos, que pueden utilizarse para los fines de la presente invención, son adyuvantes a base de aluminio, por ejemplo fosfato de aluminio, pero en particular hidróxido de aluminio, que por lo general ha dado buenos resultados como adyuvante para vacunas.

Se ha hallado que la presente invención, a pesar de la aplicación de temperaturas relativamente elevadas a la combinación de adyuvante y antígeno en suspensión o solución, no da lugar a un cambio o sólo a un cambio no significativo del potencial antígeno incluso de antígenos complejos, con lo cual pueden utilizarse, en las formulaciones de vacunas según la invención, también estructuras de proteína antígenas sensibles lábiles.

Según la invención, se ha hallado que el tratamiento térmico debe llevarse a cabo por lo menos a una temperatura de 80ºC, con el fin de conseguir los efectos según la invención. Esto también explica porque el efecto según la invención no se observa durante una pasteurización convencional, que se lleva a cabo en la mayoría de los casos alrededor de 65ºC. Resulta particularmente favorable durante el tratamiento térmico la aplicación de temperaturas comprendidas entre 90ºC y 130ºC, en particular entre 100ºC y 125ºC, así como la aplicación (a temperaturas por encima del punto de ebullición de la solución a presión estándar) de sistemas cerrados, por ejemplo dispositivos de autoclave u otros recipientes presurizados, en los cuales se trabajará a presión positiva.

Resulta que a temperaturas más elevadas pueden preverse también tiempos de tratamiento más cortos que los de la pasteurización convencional (incluso, en el caso de proteínas determinadas que muestran una unión particularmente rápida al adyuvante a altas temperaturas, por debajo de 5 min), con lo cual los tratamientos térmicos pueden llevarse a cabo preferentemente durante un periodo comprendido entre 20 y 200 min, en particular durante 30 y 60 min (sobre todo a temperaturas más elevadas). Normalmente, en el procesos rutinario, se calentarán las formulaciones de vacunas a 121ºC durante 30 min. Al disminuir la temperatura de tratamiento en 10º, estará provisto normalmente el doble de la duración de calentamiento.

Un "efecto secundario" de la presente invención radica en que durante el tratamiento térmico pueden desactivarse con éxito también agentes patógenos potenciales que puedan estar presentes, en particular virus humanopatógenos. Puesto que, debido a la presencia de los adyuvantes, pueden preverse temperaturas por encima de 80ºC, sin que provoquen deterioros decisivos en la estructura de antígeno, puede proporcionarse según la invención también una vacuna sustancialmente mejorada con relación a su seguridad viral o una vacuna que contiene una proporción mucho más baja de componentes desnaturalizados.

A pesar de que a las temperaturas previstas según la invención se desnaturalizan normalmente los proteínas en solución de forma irreversible, sorprendentemente la mezcla de antígeno/adyuvante según la presente invención conserva sus propiedades inmunogénicos en su mayor parte y pueden utilizarse como antes como una vacuna eficaz.

Debido al tratamiento térmico y a la mejor fijación en el adyuvante asociada al mismo, el preparado según la invención presenta ventajas decisivas tanto durante la preparación como en el almacenaje y distribución. La ventaja de la seguridad viral más elevada es muy importante en particular con los antígenos de proteínas procedentes de material humano o animal. El procedimiento según la invención y la esterilización realizada por el mismo permiten realizar el tratamiento térmico, pero también las etapas de envasado sin sustancias conservantes o sustancias estabilizadoras. La aplicación del procedimiento según la invención a la vacuna ya envasada permite, como resultado de la esterilización, prescindir de conservantes en la formulación, tal como por ejemplo timerosal.

Para los fines de la invención, el término "vacuna" significa un agente para la inmunización activa, es decir, una inducción de una respuesta inmune específica por administración (por ejemplo subcutánea, intradermal, intramuscular, si se desea, también oral, nasal) de pequeñas cantidades de un antígeno (una sustancia reconocida por el sistema inmune del individuo vacunado como ajena y por tanto inmunogénica) en una formulación inmunogénica apropiada. Por tanto, el antígeno se utiliza como iniciador para el sistema inmune, con el fin de construir una respuesta inmune específica para el antígeno. Básicamente, las cantidades requeridas para ello pueden ser muy pequeñas (algunas vacunas sólo contienen unos 5 a 10 \mug de antígeno por dosis de vacunación). Lo característico de una inmunización activa es una curva de la dosis/acción dependiente sólo en grado menor de la cantidad dentro de una gama amplia. Esto quiere decir que la respuesta inmune es aproximadamente igual en una amplia gama de dosis. De esto resulta que durante una vacunación el efecto deseado, es decir la inducción de una respuesta inmune, puede conseguirse con cantidades relativamente pequeñas de antígeno, pero también con cantidades sustancialmente más altas con un efecto comparable. Sin embargo, naturalmente es deseable trabajar básicamente con cantidades de dosis las más bajas posibles, en particular en vista de efectos secundarios, costes de material, etc., que están involucrados al llevarse a cabo una vacunación.

Las vacunas pueden utilizarse para una amplia variedad de fines. Para establecer un estado inmune de este tipo de las personas o animales vacunados, que los protege contra microorganismos patógenos, tales como por ejemplo virus o bacterias determinados. Entre estos se incluyen también vacunas contra el cáncer. El objetivo es activar el sistema inmune de pacientes de cáncer de forma selectiva para combatir células malignas. Esto se ha intentado por medio de una amplia variedad de planteamientos. Un método nuevo de la vacunación contra el cáncer se ha descrito en la solicitud WO 0041722. El anticuerpo monoclonal HE2 descrito en dicha solicitud, que se utiliza como antígeno de vacuna en una vacunación contra el cáncer sirve de ejemplo, pero no se limita al mismo, de una formulación de una vacuna según el método descrito en la presente memoria.

Una vacuna para los fines de la presente invención puede utilizarse básicamente tanto en el sentido terapéutico como en el profiláctico (como con todas las vacunas antimicrobianas).

La presente invención se refiere también a una formulación de vacuna que se obtiene o se puede obtener por medio del procedimiento según la invención, en la que el adyuvante es un adyuvante a base de aluminio, en particular fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio. Lo expuesto anteriormente en conjunción con el procedimiento según la invención es también aplicable a las formas de realización preferidas.

La presente invención permite preparar formulaciones de vacunas humanas particularmente eficaces que contienen (contra) proteínas, de las cuales se creía hasta la actualidad que no resisten a los tratamientos térmicos a temperaturas tan elevadas, tales como las previstas según la invención. Sin embargo, precisamente para dichas proteínas, el tratamiento térmico combinado en presencia de adyuvantes no parece conllevar perjuicios o sólo perjuicios insustanciales para las propiedades inmunoestimulantes, por lo menos no se ve afectada la respuesta inmune funcional, es decir, el efecto protector deseado, por el tratamiento térmico según la invención.

Una de las ventajas decisivas de una formulación de vacuna de este tipo radica, tal como se ha mencionado, en la adhesión o unión cambiada del antígeno al adyuvante, con lo cual la unión no se separa de forma mensurable al ser administrado a un vacunado, incluso en presencia en exceso de otras proteínas en el lugar de administración. En las formulaciones de antígeno/adyuvante convencionales se ha hallado que, tal como se apreciará por los ejemplos que siguen a continuación, tarda sólo aproximadamente 1 min hasta que casi todo el antígeno ya no es presente en el organismo vacunado en una forma unido al adyuvante. Esto puede impedirse con éxito con la ayuda de la vacuna según la invención, con lo cual tiene lugar una desorción mucho más lenta del adyuvante. La vacuna tratada según la invención presenta una mejor desorción (más lenta) del antígeno del adyuvante en comparación con la vacuna no tratada en por lo menos un 50%, preferentemente en por lo menos un 90%, en particular en por lo menos un 99% (medida por ejemplo 10 min ó 1 h tras introducirse la formulación de vacuna en una solución de suero de ternera fetal al 2%).

A continuación, la invención se ilustrará con mayor detalle haciendo referencia al dibujo y los ejemplos que siguen, a los cuales, naturalmente, no debe ser limitada la invención.

En el dibujo, la Fig. 1 muestra la respuesta inmune que puede producirse en monos por medio de una vacuna de anticuerpo sometida a un tratamiento térmico (ver Ejemplo 1).

Ejemplos Ejemplo 1 Formulación esterilizada en caliente del anticuerpo monoclonal HE2 sobre hidróxido de aluminio

Se calentaron 0,5 mg de HE2 (anticuerpo monoclonal del ratón IgG_{2}a) adsortos sobre 1,67 mg de hidróxido de aluminio en 0,5 ml de un tampón de fosfato 1 mM pH 6,0/NaCl 155 mM a 121ºC durante 30 min. Cuatro macacos rhesus se inmunizaron por vía subcutánea con dicha dosis en cada de los días 1, 15, 29 y 57. Los sueros se analizaron a tiempos diferentes por medio de ELISA con respecto a la inducción de anticuerpos contra HE2. Para fines comparativos, la misma formulación, pero sin el tratamiento térmico, se vacunó y también se analizó (Figura 1). Puede apreciarse que la vacuna sometida a un tratamiento térmico produjo títulos contra el antígeno de proteína que eran apenas más bajos.

La siguiente tabla muestra la desorción reducida de la formulación de vacuna sometida al tratamiento térmico en comparación con la formulación sin tratar.

El suero de monos inmunizados (cada vez 4 individuos) se analizó en ELISA por la presencia de HE2. Sobre las placas de ELISA, se inmovilizó suero anti-HE2 de cabra purificado por cromatografía de afinidad. Los sueros se ensayaron en varias diluciones por presencia de anticuerpos específicos con el conyugado de la peroxidasa IgG antiratón. La sensibilidad del ensayo era de 10 ng de HE2 por ml. Las tomas de muestras se realizaron antes de la primera inmunización así como 1, 4 y 24 h tras la inmunización. El estándar externo cuantitativo utilizado era HE2. Puede apreciarse que la formulación de vacuna sometida al tratamiento térmico no provocó un nivel de HE2 mensurable en la sangre, mientras que la formulación de vacuna no sometida al tratamiento térmico pasó una gran parte del HE2 al suero dentro de 24 h.

\newpage

Tiempo	Vacuna sometida al tratamiento térmico	Vacuna no sometida al tratamiento térmico
0	0; 0; 0; 0 ng/ml	0; 0; 0; 0 ng/ml
1 h	0; 0; 0; 0 ng/ml	13; 17; 74; 280 ng/ml
4 h	0; 0; 0; 0 ng/ml	200; 280; 400; 740 ng/ml
24 h	0; 0; 0; 0 ng/ml	960; 960; 1000; 740 ng/ml

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Tratamiento térmico de una vacuna de hepatitis B

EngerixB (SmithKline Beecham; 20 \mug/ml) se introdujo en frasquitos para inyecciones y se sometió a un tratamiento térmico de 30 min a 121ºC.

La inmunogenicidad de la vacuna así tratada se ensayó en ratones. A tal fin, 8 ratones (Him: OF1, hembra; peso vivo 20 a 25 g) se inmunizaron cada una con la vacuna sometida y la vacuna no sometida al tratamiento térmico (0,155 ml; i.p.), mientras que otro grupo de control no se inmunizó. Tras 2 semanas, se tomó sangre de los ratones, y se determinó el título específico de hepatitis.

A tal fin, se recubrió una placa ELISA de 96 pocillos (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca) con antígeno HBs recombinante, subtipo adr (Fitzgerald Industries Inc., USA) (10 \mug/ml de tampón de recubrimiento; duración: durante la noche, a 4ºC). Tras el lavado, se aplicaron series de dilución de los sueros de los ratones individuales (en tampón de lavado) y se incubaron durante 8 h a temperatura ambiente. Tras otro lavado, se incubó la mezcla junto con el conjugado de peroxidasa de inmunoglobulina antiratón (Sigma, USA) en la dilución adecuada a temperatura ambiente (2 h). Tras otro lavado de las placas, se adicionó el substrato, se paró la coloración tras 30 min, y se midió en un fotómetro a

\hbox{492
nm.}

El incremento de título relativo se determinó comparando los títulos de los dos grupos de vacunas con el título de los ratones no vacunados. Se mostró que los incrementos de título relativos en los dos grupos de vacunas se encontraban al mismo nivel.

Material

Tampón de recubrimiento: Na_{2}CO_{3} 15 mM, NaHCO_{3} 35 mM, NaN_{3} 3 mM, valor pH: 9,6

PBS: NaCl 138 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4} 6,5 mM, valor pH: 7,2

Tampón de lavado: Tween 20 en PBS al 0,05%

Tampón de coloración: ácido cítrico 24,3 mM, Na_{2}HPO_{4} 51,4 mM, valor pH: 5,0

Substrato: 40 mg de dihidrocloruro de o-fenilendiamina; 100 ml de tampón de coloración, 20 \mul de H_{2}O_{2} (30%)

Solución de parada: H_{2}SO_{4} 4 N

Ejemplo 3 Estudio del comportamiento de adsorción y desorción del antígeno al gel de aluminio

Las formulaciones HE2 descritas en el Ejemplo 1 (desnaturalizadas en caliente y no desnaturalizadas en caliente) se investigaron en un ensayo de desplazamiento.

La suspensión de las vacunas se centrifugó, examinando el sobrenadante en un ensayo ELISA por presencia del antígeno (inmunoglobulina específica de ratón (HE2)). En el sobrenadante de las vacunas no sometidas al tratamiento térmico podía detectarse un 0,1% de la cantidad total de anticuerpo formulada, mientras que en el sobrenadante de las formulaciones desnaturalizadas en caliente no podía detectarse ningún antígeno.

Las vacunas aislados por centrifugación se suspendieron cada una en PBS más 2% de FKS (suero de ternera fetal) y la mezcla se agitó a 37ºC durante 1 h.

A continuación, se volvieron a centrifugar, y los sobrenadantes correspondientes se analizaron en el ensayo ELISA citado anteriormente. En el sobrenadante de la vacuna no sometida al tratamiento térmico, podía detectarse más de un 95% de la cantidad total de anticuerpos formulada, mientras que en el sobrenadante de la vacuna desnaturalizada en caliente, no podía detectarse otra vez ningún antígeno.

Los experimentos y resultados citados en este ejemplo demuestran que en la formulación de vacuna preparada según el procedimiento según la invención, el antígeno se encuentra (en condiciones fisiológicas) unido irreversiblemente al adyuvante.

ELISA

El ensayo ELISA se llevó a cabo según los métodos convencionales, a menos que no se indique otra cosa.

Los tiempos de incubación son para un recubrimiento de 30 min, para todas las demás etapas (muestras, conjugado) 1 h a 37ºC. Los volúmenes utilizados son en todas las etapas 100 \mul por pocillo, con la excepción del bloqueo (200 \mul por pocillo).

Para el recubrimiento de las placas ELISA, se utiliza un anticuerpo policlonal anti-HE2 de cabra (IGN111), que fue purificado por cromatografía por inmunoafinidad. Concentración de recubrimiento (10 g/ml de tampón de recubrimiento).

El estándar utilizado era HE2 (Mouse IgG 2a, kappa) (10 mg/ml en solución salina con tampón de fosfato; pH: 6,0).

Tanto del estándar como de las muestras, se prepararon series de dilución en PBS con 2% de FKS, y se aplicaron las diluciones individuales.

Para detectar el HE2 de las diluciones de las muestras y del estándar que había quedado unido al IGN111, se utilizó anti-mouse HRP (horseradish peroxidase) IgG2a (Zymad, USA) como conjugado de enzima.

Tras la coloración de enzima/substrato, se paró la reacción con ácido sulfúrico, y la coloración se midió a 492 nm. Para el análisis cuantitativo, se compararon las series de dilución de las muestras con la serie de dilución del estándar (HE2) de forma apropiada.

Material Tampón de lavado

\hskip0.5cm NaCl	21,2 g
\hskip0.5cm Triton-X-100	2,5 ml
\hskip0.5cm PBS	completar a 1.000,0 ml

Tampón de recubrimiento

\hskip0.5cm Na_{2}CO_{3}	1,59 g
\hskip0.5cm NaHCO_{3}	2,93 g
\hskip0.5cm Agua dest.	completar a 1.000,0 ml
\hskip0.5cm pH = 9,6

Tampón de coloración

\hskip0.5cm Ácido cítrico	5,6 g/l
\hskip0.5cm di-Na_{2}HPO_{4} x 2 H_{2}O	9,15 g/l
\hskip0.5cm Agua dest.	completar a 1.000,0 ml
\hskip0.5cm pH = 5,0

PBS

\hskip0.5cm NaCl	8,0 g/l
\hskip0.5cm KH_{2}PO_{4}	200,0 mg/l
\hskip0.5cm KCl	200 mg/l
\hskip0.5cm Na_{2}HPO_{4}	1,44 g/l
\hskip0.5cm Agua dest.	completar a 1.000,0 ml
\hskip0.5cm pH = 7,2

FKS (suero de ternera fetal)

: Desactivado en caliente (1 h a 56ºC)

: Gibco Life Technologies nº Cat: 10270-106

Solución de substrato: 1 comprimido de dihidrocloruro de o-fenilendiamina (Sigma, P-8287) por 10 ml de tampón de coloración más 60 \mul de H_{2}O_{2} al 30% (Merck 1.08597.1000).

H_{2}SO_{4} al 30%; Fluka, 84724.

Placa de ELISA: F 96 Maxisorp, Nunc-Immuno Plate, Nunc Brand Products, 442404

Claims

1. Procedimiento para la mejora de la adhesión de antígenos a adyuvantes, caracterizado porque por lo menos un antígeno a base de polipéptidos se mezcla con por lo menos un adyuvante y la mezcla se somete, a continuación, a un tratamiento térmico a una temperatura de más de 80ºC durante un periodo de por lo menos 5 min.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque uno o varios anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonados se utilizan como antígeno(s).

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se mezclan varios antígenos diferentes con por lo menos un adyuvante.

4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque los anticuerpos que presentan distintas especificidades se mezclan como antígenos con por lo menos un adyuvante.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el anticuerpo HE2 o un anticuerpo, que presenta la misma especificidad de unión que el anticuerpo HE2, se mezcla como anfígeno con por lo menos un adyuvante.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el tratamiento térmico se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 90º y 130ºC, en particular entre 100º y 125ºC.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un periodo comprendido entre 20 y 200, en particular entre 30 y 60 minutos.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque, el adyuvante utilizado es un sólido tensioactivo, preferentemente a base de aluminio, en particular hidróxido de aluminio.

9. Formulación de vacuna, que se pude obtener según una de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el adyuvante es un adyuvante a base de aluminio, en particular a base de fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.