ES2263652T3 - Sistema de transfeccion potenciada. - Google Patents
Sistema de transfeccion potenciada.Info
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Abstract
Una composición que comprende un plásmido, comprendiendo el plásmido (a) un elemento oriP y ácido nucleico que codifica EBNA 1, (b) promotor/potenciador CMV (c) ácido nucleico que codifica TAT y TAR; y (d) ADN que codifica una proteína heteróloga.
Description
Sistema de transfección potenciada.
Esta invención se refiere en general a una
mejora en los sistemas de expresión de células de mamífero y
específicamente se refiere a un sistema vector de expresión génica
de células de mamíferos que incluye un sistema de mantenimiento
episomal, un potente promotor/potenciador, un sistema de
transactivación de proteínas y ADN que codifica una proteína
heteróloga.
Se sabe bien que diversos huéspedes celulares,
tales como células microbianas, células de levadura, células de
insecto y células de mamífero son capaces de producir pequeñas
cantidades (cantidades en miligramos) de proteínas específicas en
periodos de tiempo relativamente cortos. También, se sabe que las
proteínas de diferentes sistemas de células huésped manipuladas
genéticamente, generan proteínas que tienen diferentes perfiles de
glucosilación, dependiendo de la célula usada. Para aplicaciones
farmacéuticas, en algunos casos es deseable producir proteínas que
tienen perfiles de glucosilación que son similares a los que se
encuentran en seres humanos. Estos normalmente se realiza usando un
sistema de células de mamífero, puesto que dichos sistemas producen
proteínas con glucosilaciones que son compatibles con aplicaciones
clínicas. La desventaja de usar células de mamífero es que
típicamente requieren un periodo de tiempo más largo para producir
una cantidad equivalente de proteínas. Por tanto, sería muy
deseable tener un sistema de expresión de células de mamífero
manipuladas genéticamente (para expresar proteínas heterólogas) que
pueda expresar grandes cantidades de la proteína en cortos periodos
de tiempo.
Se sabe que diversos elementos de mantenimiento
episomal pueden introducirse en un vector en un sistema de
expresión génica para asegurar la replicación. También se sabe bien
que los sistemas manipulados genéticamente pueden y, en algunos
casos, deben incluir sistemas promotor/potenciador potentes. Además,
se sabe bien que las líneas celulares manipuladas genéticamente
pueden incluir sistemas de transactivación de proteínas para
potenciar la expresión de proteínas de ADN que codifica una proteína
heteróloga, que también se incorpora en el sistema. En contraste
con estos antecedentes, no se conoce ningún intento o sugerencia
para incorporar los cuatro elementos o sistemas anteriores, en un
único sistema de expresión de células de mamífero de modo que las
ventajas combinadas de todos los elementos estén presentes en un
único sistema que funciona y que expresa proteínas heterólogas.
Sorprendentemente, cuando la combinación anterior se realizó usando
las técnicas descritas a continuación se descubrió lo que parece
ser un efecto sinérgico sobre la expresión de proteínas. Ejemplos
representativos para dos proteínas heterólogas (denominadas
IL-2SA e IL-4SA) se describen a continuación.
IL-2SA e IL-4SA) se describen a continuación.
El documento WO 0028060 se refiere a células que
pueden usarse para la producción de vectores adenovirales
dependientes de auxiliares en ausencia de auxiliares adicionales,
puesto que contienen unidades génicas capaces de expresar las
funciones necesarias para completar el ciclo viral, que están
ausentes en dichos vectores.
El documento de Tsang TC y col (International
Journal of Molecular Medicine 5(3): 295-300,
2000.) se refiere a la Construcción de nuevos vectores
amplificadores de expresión para niveles altos de expresión génica
de IL-2.
Ninguna de las citas mencionan el plásmido de la
presente invención.
El sistema de vector de expresión génica de
células de mamífero comprende:
- (a)
- un sistema de mantenimiento episomal,
- (b)
- un potente promotor/potenciador,
- (c)
- un sistema de transactivación de proteínas, y
- (d)
- ADN que codifica proteína heteróloga.
El sistema de mantenimiento episomal y el
sistema de transactivación de proteínas pueden incluir
sub-elementos que se sitúan en el mismo o en
diferentes plásmidos dentro del sistema de expresión de células de
mamífero. En un sistema preferido, el sistema de mantenimiento
episomal comprende un elemento oriP y un gen que expresa EBNA1. Un
potenciador/promotor potente preferido, es CMV y el sistema de
transactivación de proteínas preferido incluye los elementos TAT y
TAR. Una secuencia codificante de ADN preferida para las proteínas
heterólogas, incluye ADN que codifica sustancias (descritas con más
detalle a continuación) conocidas como IL-2SA e
IL-4SA. Una línea celular de mamífero preferida
proviene de un primate, aunque pueden usarse otras líneas celulares
de mamífero. Debe observarse, sin embargo, que las líneas celulares
preferidas no deben ser de roedor por razones que se dan a
continuación.
Los componentes usados para demostrar el sistema
se describen a continuación.
1. Un vector de expresión basado en pBR322 se
suplementó con un elemento potenciador/promotor CMV humano y
5'-IS para expresión de células de mamífero. Este
plásmido es pSM97 (descrito en la Patente de Estados Unidos Nº
5.854.021).
2. Los elementos EBNA1 y oriP, que pueden apoyar
el mantenimiento del plásmido de ADN en forma de estructura
episomal (Yates y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3806:3810 y
Patente de Estados Unidos Nº 4.686.186), se añadieron al vector de
expresión anterior.
3. Elementos TAT (gen transactivador) y TAR
(secuencia sensible a transactivación), que pueden apoyar la función
de transactivación de la proteína TAT (descrita en la Patente de
Estados Unidos Nº 5.801.056), denominados en este documento como
elementos TAT/TAR, se añadieron al vector de expresión para dar como
resultado un vector de expresión de oriP combinado con los
elementos TAT/TAR.
4. El transactivador BMLF1 (Lieberman y col., J
Virol 60:140-148, 1986, Kenney y col., J Virol,
63:3890-3877, 1989, y Ruvolo y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95: 8852-8857) originado a partir de
virus Epstein-Barr, se insertó en el vector.
Las Figuras 1-1 y
1-2 muestran mapas físicos de vectores de expresión
de una muteína de Interleuquina-2 (denominada
IL-2SA), usados para el estudio de transfección de
la optimización de vectores de expresión, que incluyeron elementos
combinados oriP y TAT/TAR.
La Figura 2 muestra mapas físicos de vectores de
expresión usados para el estudio de transfección del efecto de
transactivación de BMLF.
La Figura 3 es una diagrama que muestra la
potenciación de la secreción de IL-2SA en ensayos de
transfección transitoria usados para identificar y comparar el
efecto de oriP, el efecto de transactivación de TAT/TAR, y los
efectos de transactivación TAT/TAR más oriP. Obsérvese que se supone
el pSS179 linealizado como punto de referencia del nivel de
expresión de IL-2SA porque la función de oriP debe
suprimirse después de la linealización, usando una enzima de
restricción y de forma similar con el pSS185 linealizado.
La Figura 4 muestra los efectos de
transactivación de BMLF1 sobre la secreción de
IL-2SA a partir de células CHO en un periodo de
cultivo prolongado. A los 3 dpt, las células se trataron con
tripsina y se sembró la misma cantidad de células en un pocillo con
un medio fresco suplementado con FBS al 5%. Los niveles de secreción
de IL-2SA de células CHO transfectadas con pSS179
se mantuvieron a lo largo de 4-7 dpt de forma
similar a los de 3 dpt. Sin embargo, los niveles de expresión de
IL-2SA de células CHO transfectadas con pSS212, 213
y 214 después de 4 dpt no mostraron ningún efecto potenciado de
actividad de transfección de BMLF1 que se mostró en 3 dpt.
La Figura 5 muestra los efectos de
transactivación de BMLF1 sobre la secreción de
IL-2SA de células HKB11 en un periodo de cultivo
prolongado en selección con fármaco. Los efectos de transactivación
de BMLF1 observados a los 3 dpt, de células HKB11 transfectadas con
pSS212, 213 y 214, se suprimieron después de añadir HygB, aunque el
efecto de TAT/TAR se mantuvo en selección con fármaco como se
muestra en la Figura 6.
La Figura 6 muestra los efectos de
transactivación de TAT/TAR en la secreción de IL-2SA
de células HKB11 en selección con higromicina B. Las células
transfectadas se mantuvieron como se describe en el texto.
La Figura 7 muestras mapas físicos de vectores
de expresión usados para estudio de cotransfección para expresión
de alta producción.
Células embrionarias de riñón humano (293) (ATTC
CRL-1573) de 293 EBNA (células 293 que expresan
EBNA1) obtenidos de Invitrongen (Carlsbad, CA).
Las células CHO (de Ovario de Hámster Chino)
negativas para dihidrofolato reductasa (dhfr) se obtuvieron de
Genentech Inc.
HKB11 (ATCC, CRL-12568) es una
línea celular híbrida somática de seres humanos (Solicitud de
Patente de Estados Unidos Nº 09/209.920) obtenida de la fusión
celular de células embrionarias de riñón humano (293S) y células de
origen del linfoma de Burkitt (P3HR-1).
La IL-2SA es una muteína de
IL-2 que tiene una única sustitución de aminoácidos
(N88R), como se ha descrito en el documento WO 99/60128. Una breve
descripción de los vectores de expresión individuales de las Figuras
1-1 y
1-2 es la siguiente.
1-2 es la siguiente.
pSL160N: la secuencia que codifica
IL-2SA se insertó en el sitio PvuII de pSM97 y se
modificó adicionalmente añadiendo el elemento HSAG1 (fragmento
EcoRI y XbaI; 1447 pb) descrito en el documento de McArthur y
Stanners (J Biol Chem 266:6000-6005, 1991) en el
sitio SpeI de pSM97, y EBV-TR (Cho y col., Solicitud
de Patente de Estados Unidos Nº 09/209.915) en el sitio NaeI de
pSM97.
pSS179: La secuencia que codifica
IL-2SA se insertó en el sitio BamHI/XhoI de
pCEP4.
pSS178: El elemento TAR (82 pb) se sitúa cadena
arriba de la IL-2SA de pSS179.
pSS185: Un elemento TAT funcional, descrito en
la construcción del plásmido, se insertó en el sitio NruI (sitio
cadena arriba del promotor TK) de pSS178.
pSH201: Una secuencia intrónica, MIS (\sim270
pb) se situó en el extremo 3' de la secuencia TAR (NotI/HindIII) de
pSS185.
pSC221: El elemento HSAG de pSL160N se suprimió,
y el elemento TAR se situó en el extremo 3' de CMVe/p y en el
extremo 5' de MIS.
pSS225: Los segmentos que expresaba EBNA1 y TAT
funcional y hph, se eliminaron de pSH201.
pSS226: Un elemento que expresaba TAT funcional
se insertó en el extremo 5' de un gen amp-r de
pSS225.
\vskip1.000000\baselineskip
Una descripción individual del vector de
expresión de la Figura 2 es la siguiente.
pSS210: El plásmido oriP que expresa BMLF1 y hph
se describió en una parte de construcción de plásmidos.
pSS212: La secuencia que codifica
IL-2SA se situó en el extremo 3' de CMVe/p de
pSS210.
pSS213: Un elemento TAR se sitúa en el extremo
5' de IL-2SA de pSS212.
pSS214: Una secuencia intrónica, MIS, se añade
adicionalmente en el extremo 5' de IL-2SA de
pSS213.
\vskip1.000000\baselineskip
Una breve descripción de la estructura
individual de los plásmidos de la Figura 7 es la siguiente.
pSS223: Este plásmido es básicamente el mismo
que pSS225 pero saltando la secuencia que codifica
IL-2SA.
pSC186: Una secuencia que codifica TAT se situó
en extremo 3' de CMVe/p de pCEP4 y se delecionó el sistema de
expresión de hph funcional.
pSS240: La secuencia que codifica
IL-2SA se insertó en el sitio PvuII de pSS223.
pSS241: La secuencia que codifica
IL-4 se insertó en el sitio PvuII de pSS223.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión en células de mamíferos
basado en pBR322 con una expresión génica de dhfr funcional (pSM97;
Cho y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.854.021). El vector pCEP4
constituido por oriP, EBNA1, y la expresión génica de hph funcional
en base a pBR322 se obtuvo de Invitrogen (Carlsbad, CA).
Ochenta y dos pares de bases de un elemento TAR
se prepararon mediante PCR usando pBennCAT (Gendelman H.E. y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:9759-9763, 1986) como
plantilla. Se fabricaron dos cebadores añadiendo un sitio KpnI en
el extremo 5' de TAR y un sitio HindIII en el extremo 3' de TAR. El
producto de PCR resultante se digirió con HindIII y KpnI y se
insertó en pCEP4 después de digerir pCEP4 con KpnI y HindIII. El
segmento que expresa el gen TAT funcional, se preparó de pSVTAT
(Peterlin B.M. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
9734-9738, 1986) digiriéndolo con BamHI (modificado
con fragmento de Klenow) y HpaI.
Este fragmento se insertó a pSV_{2}neo después
de digerir con PvuII y HpaI. Este segmento que expresaba TAT
funcional puede eliminarse fácilmente digiriendo con PvuII y BamHI
para insertarlo en cualquier otro vector de expresión, como se
muestra en la Figura 1 (pSS185 y pSC221). La secuencia que codifica
BMLF1 y el área de señal de poliA se prepararon de
B95-8 EBV abarcando secuencias de ADN de 84301
(NheI) a 82180 (HindIII) de los datos de secuencia B95/8 EBV (P.J.
Farrell, "Epstein-Barr Virus Genome" en
Advanced Viral Oncology; editado por G. Klein; Ravens Press, Ltd.:
Nueva York 1989, págs. 103-132) y se insertaron en
el sitio PvuII de pCEP4, un vector con CMVe/p. Esta expresión de
BMLF1 está ahora bajo el control de CMVe/p.
El segmento de expresión de BMLF1 funcional se
retiró mediante digestión con SpeI y NheI de este vector y se
construyó un nuevo vector de expresión. Este plásmido resultante
pSS210 mostrado en la Figura 2. La muteína de
interleuquina-2 (N88R) conocida como
IL-2SA (Archivo de Solicitud de Patente Nº
WO9960128, IL-2 Selective Agonists and Antagonists)
se usó como gen informador.
Se realizaron las transfecciones estacionarias
usando las células cultivadas de modo dependiente de anclaje.
Células HKB11 cultivadas en crecimiento logarítmico (1,5 x 10^{6}
células) en 4 ml de medio fresco con FBS al 5% o sin suero, se
sembraran en un pocillo de una placa de cultivo tisular de formato
de 6 pocillos (Corning Inc., Corning, NY) y se les permitió unirse
al fondo de la placa durante dos o más horas en una incubadora de
CO_{2} humidificada a 37ºC. Se preparó un cóctel (1 ml)
constituido por 5 \mug de ADN y 20 \mul de reactivo
DMRIE-C (Life Technologies, Rockville, MD) de
acuerdo con el protocolo del fabricante y se añadió al pocillo y se
mezcló suavemente. Las placas se incubaron en la incubadora de
CO_{2}.
Se realizaron las transfecciones con agitación
usando células adaptadas a condiciones de suspensión libre de
suero. Células HKB11 cultivadas en crecimiento logarítmico (5 x
10^{6} células) en 4 ml de medio fresco, se mezclaron con un ml
del complejo ADN/DMRIE-C como en la transfección
estacionaria anterior. Estos 5 ml de células transfectadas en un
formato de 6 pocillos se incubaron a un agitador
(90-100 rpm) en una incubadora de CO_{2}
humidificada. Las células transfectadas se
sub-cultivaron en 3 y 7 días después de la
transfección (dpt) dividiéndolas a 1:4 o 1:5. El volumen total de
cultivo aumentó del volumen inicial de transfección hasta 20 veces
en el día 10 dpt. El sobrenadante del cultivo tisular se analizó
mediante un ELISA para determinar los niveles de secreción de
proteínas.
Para la detección de IL-2SA, se
revistieron placas Dynatech Immulo-2 de fondo
redondo, con 1 \mug/ml de IL-2 antihumana de rata
purificada (PharMingen, San Diego, CA) usando tampón NaHCO_{2} 0,1
M (pH 8,2), incubado a 37ºC durante 3 horas en una cámara
humidificada, se lavó con PBS/Tween 20 al 0,05% (Sigma
P-1379, St Louis, MO) y se bloqueó con PBS/BSA al
1% durante una hora a temperatura ambiente. Los sobrenadantes del
cultivo que contenían IL-2SA y un patrón de
IL-2SA purificada (como una curva patrón) se
diluyeron en serie con PBS/BSA al 1% (50 \mul/pocillo) y se
incubaron a temperatura ambiente durante dos horas. La
IL-2SA capturada se detectó usando
IL-2 antihumana de ratón biotinilada (62,5 ng/ml,
PharMingen, San Diego, CA) seguida de incubación con
estreptavidina-HRP (125 ng/ml; Zymed Laboratories
Inc. Nº 43-4323, South San Francisco, CA). Entre
todas las incubaciones (cada una, una hora de incubación a
temperatura ambiente), las placas se lavaron con PBS/Tween 20. Las
placas se revelaron usando la solución de sustrato de
tetrametilbencidina (TMB; Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.
Producto Nº 50-65-00 y
50-76-01, Gaithersburg, MD) y la
reacción se interrumpió con HCL 1 N. La densidad óptica (OD) se
midió a 450 nm/570 nm usando un lector cinético de microplacas
Molecular Device de Vmax (S/N 04514, Sunnyvale, CA) y el programa
Softmax proporcionado por Molecular Devices. La concentración de
IL-2SA en el sobrenadante del cultivo tisular se
determinó comparándola con la OD de una curva patrón de
IL-2SA purificada.
Para medir la secreción de
interleuquina-4 (IL-4) humana, el
ensayo fue similar excepto que se usó anticuerpo de
IL-4 antihumano de ratón (PharMingen, Cat. Nº
18651D, San Diego, CA) para revestir la placa, y se usó anticuerpo
de IL-4 anti-rata biotinilada
(PharMingen, Cat. Nº 18502D, San Diego, CA) como anticuerpo de
detección. Una molécula de IL-4 purificada se usó
como patrón.
Vectores de expresión de células de mamífero
equipados con CMVe/p en plásmido pBR322 mostraron niveles de
expresión y secreción relativamente altos, de entre
1-20 \mug/ml de proteína heteróloga. Sin embargo,
algunas proteínas tuvieron mucha dificultad para expresarse, por
ejemplo IL-2SA. Por lo tanto, se construyeron
diversos vectores de expresión equipados con diferentes elementos
potenciadores, principalmente proteínas transactivadoras y el
elemento oriP para mantener el plásmido transfectado en forma de
episoma. Cada elemento por separado mostró un nivel pequeño de
aumentos (3-5 veces) en ensayos de transfección
transitoria. Se construyeron dos vectores de expresión, uno con
IL-2SA en vector pCEP4 (pSS179) y otro con la
adición de elementos transactivadores de TAT/TAR al pSS179
(pSS185). Los dos ADN de plásmidos que expresan
IL-2SA (pSS179 y pSS185) se digirieron con enzimas
de restricción y se transfectó la misma cantidad de ADN (5 \mug de
cada) de los dos, y de plásmidos sin cortar. Se usó en cada
transfección una pequeña cantidad de ambos ADN digeridos con enzimas
de restricción para confirmar la cantidad de ADN precipitado para
asegurar las mismas cantidades y calidad (para observar el 100% de
conversión a forma lineal). Las transfecciones se realizaron usando
un procedimiento de transfección estacionaria con medio
suplementado con FBS al 5%. Los niveles de expresión de cada
plásmido se analizaron suponiendo que la forma lineal del plásmido
suprimía la función de oriP, porque el ADN lineal no puede
replicarse en este estado. Aunque oriP y TAT/TAR tienen un efecto
potenciador, cuando se evalúan individualmente bajo la regulación
de un promotor CMV, el aumento es considerablemente bajo
(3-5 veces) en ensayos de transfección
transitoria.
Como se muestra en la Figura 3, los efectos del
elemento oriP (pSS179 sin cortar) y transactivación de TAT/TAR
(pSS185 cortado) sobre la secreción de IL-2SA fueron
2,7 y 6 veces, respectivamente más altos que los de la forma lineal
de pSS179 en 3 dpt. Las veces de aumento en 5 dpt fueron 5,6 y 10,
respectivamente. Sin embargo, el pSS185 sin cortar (transactivación
de TAT/TAR intacto y función oriP) mostró unos niveles
inesperadamente altos (26 veces en 3 dpt y 34 veces en 5 dpt) de
secreción de IL-2SA que los de pSS179 cortado.
Se ensayaron también otras construcciones de
vector constituidas por el mismo elemento funcional. Los vectores
de expresión de IL-2SA, pSC221
(TAT/TAR-dhfr), pSH201 (TAT/TAR-oriP
con EBNA1), y pSS226 (TAT/TAR-oriP sin EBNA1) se
usaron para transfectar células HKB11 y 293EBNA para comparar dos
células huésped y para comparar vectores episomales de TAT/TAR y
TAT/TAR-oriP. Véase la Figura 1 para los mapas
físicos de los vectores de expresión. Como se muestra en la Tabla
1, el efecto de TAT/TAR-oriP (pSH201) sobre TAT/TAR
(pSC221) fue \sim9 veces más alto en células HKB11 y \sim4
veces más alto en células 293EBNA en 3 dpt. Este efecto fue similar
(4,4 veces) al que se observó usando pSS185 episomal y lineal
(Figura 3). Las células 293EBNA mostraron niveles de secreción de
IL-2SA ligeramente más bajos que las células HKB11,
sin embargo, estaba claro que el vector
TAT/TAR-oriP puede usarse en células diferentes de
HKB11, en este documento células 293EBNA, para una producción
máxima de proteínas. Se observó que el vector
TAT/TAR-oriP equipado con el gen EBNA1 era
ligeramente mejor que sin el gen EBNA1. Parece que las células
HKB11 y 293EBNA pueden no tener la suficiente proteína EBNA1 para
mantener el vector episomal.
Se ensayaron también otras construcciones de
vector constituidas por el mismo elemento funcional. Se usaron los
vectores de expresión de IL-2SA pSC221
(TAT/TAR-dhfr), pSH201 (TAT/TAR-oriP
con EBNA1), y pSS226 (TAT/TAR-oriP sin EBNA1) para
transfectar células HKB11 y 293EBNA para comparar dos células
huésped y para comparar vectores episomales de TAT/TAR y
TAT/TAR-oriP. Véase la Figura 1 para los mapas
físicos de los vectores de expresión. Como se muestra en la Tabla
1, el efecto de TAT/TAR-oriP (pSH201) sobre TAT/TAR
(pSC221)
fue \sim9 veces más alto en las células HKB11 y \sim4 veces más alto en las células 293EBNA. Estos efectos fueron similares (\sim5 veces) a los observados usando pSS185 episomal y lineal (Figura 2). Las células 293EBNA mostraron niveles de secreción de IL-2SA ligeramente más bajos que las células HKB11, sin embargo, estaba claro que el efecto sinérgico de TAT/TAR-oriP se observó también en células 293EBNA aparte de en células HKB11, para una producción máxima de proteínas. Se observó que el vector TAT/TAR-oriP equipado con el gen EBNA1 era ligeramente mejor que sin el gen EBNA1. Parece que las células HKB11 y 293EBNA pueden no tener la suficiente proteína EBNA1 para mantener el vector episomal.
fue \sim9 veces más alto en las células HKB11 y \sim4 veces más alto en las células 293EBNA. Estos efectos fueron similares (\sim5 veces) a los observados usando pSS185 episomal y lineal (Figura 2). Las células 293EBNA mostraron niveles de secreción de IL-2SA ligeramente más bajos que las células HKB11, sin embargo, estaba claro que el efecto sinérgico de TAT/TAR-oriP se observó también en células 293EBNA aparte de en células HKB11, para una producción máxima de proteínas. Se observó que el vector TAT/TAR-oriP equipado con el gen EBNA1 era ligeramente mejor que sin el gen EBNA1. Parece que las células HKB11 y 293EBNA pueden no tener la suficiente proteína EBNA1 para mantener el vector episomal.
| Vector de expresión | HKB11 | 293EBNA | ||
| Título (\mug/ml) | Veces de aumento | Título (\mug/ml) | Veces de aumento | |
| pSC221 | 0,5 | 1 | 0,62 | 1 |
| pSH201 | 4,45 | 8,9 | 2,55 | 4,11 |
| pSS226 | 2,98 | 5,9 | 2,27 | 3,6 |
| Nota: Las veces de aumento de IL-2SA mediante TAT/TAR y TAT/TAR-oriP se calcularon suponiendo | ||||
| la producción de IL-2SA de pSC221 como 1. |
BMLF1 se conocía originalmente como un
transactivador promiscuo (Lieberman y col., J Virol
60:140-148, 1986). Desde entonces, se ha
descubierto que esta proteína es un transactivador
post-transcripcional (Kenney y col., J. Virol,
63:3870-3877, 1989), y más recientemente, se ha
descrito como un transactivador de expresión de genes sin intrones
y como un inhibidor para la expresión de genes unidos a intrones
(Ruvolo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95:8852-8857). Se ensayó la proteína BMLF1 para la
función transactivadora de la expresión de genes de mamífero
(IL-2SA). La secuencia que codifica
IL-2SA sin 5'-IS insertado cadena
abajo de CMVe/p de pSS210 es pSS212. La secuencia que codifica la
expresión de IL-2SA se modificó añadiendo secuencia
TAR en el extremo 5' de IL-2SA (pSS213) y se
modificó adicionalmente añadiendo una secuencia intrónica (MIS) en
el extremo 5' de IL-2SA de pSS213, dando como
resultado el vector pSS214. Véase la Figura 2 para los mapas
físicos de los vectores de expresión individuales. Los ensayos de
transfección transitoria estacionaria indicaron que la proteína
BMFL1 potenció la expresión de IL-2SA
independientemente del intrón, en 3-4 veces en
células HKB11 (Tabla 2) y en 10-20 veces en células
CHO (Tabla 3) usando medio que contenía suero.
| Vectores de Expresión | Títulos de IL-2SA (\mug/ml) | Veces de aumento (media) | ||
| Exp. I | Exp. II | Exp. III | ||
| pSS179 | 0,84 | 1,24 | 0,27 | 1 |
| pSS212 | 3 | 4,4 | 1,23 | 4 |
| pSS213 | 2,76 | 4,16 | 0,81 | 3,2 |
| pSS214 | 2,48 | 3,1 | 1,1 | 3,2 |
| \begin{minipage}[t]{160mm} Nota: Las veces de aumento de la producción de IL-2SA mediante BMLF1 se calcularon a partir de la media de 3 experimentos suponiendo la producción de IL-2SA de pSS179 como 1. \end{minipage} |
Como se describe en la Figura 3, pSS212, pSS213,
y pSS214 tienen segmentos de expresión de IL-2SA
equipados en el extremo 5' de la molécula con fragmento sin intrón,
fragmento sin intrón con TAR y fragmento TAR-MIS,
respectivamente.
| Vectores de Expresión | Títulos de IL-2SA (\mug/ml) | Veces de aumento (media) | ||
| Exp. I | Exp. II | Exp. III | ||
| pSS179 | 0,062 | 0,058 | 0,042 | 1 |
| pSS212 | 0,275 | 0,77 | 0,7 | 11,2 |
| pSS213 | 0,23 | 0,88 | 1,33 | 16,6 |
| pSS214 | 0,225 | 1,46 | 1,52 | 21,5 |
| Nota: Veces de aumento y vectores de expresión se describen en la Tabla 2. |
Para fabricar mayores cantidades de proteínas,
se ensayaron estas proteínas transactivadoras en plásmido oriP en
un periodo de tiempo de cultivo después de transfección prolongado
hasta 10 días. En este experimento, se usó un vector de expresión
de IL-2SA básico (pSL160N), un vector de expresión
de IL-2SA suplementado con elementos
transactivadores TAT/TAR (pSC221), un vector de expresión de
IL-2SA solamente con elemento oriP (pSS225), y un
elemento de expresión de IL-2SA tanto con elementos
transactivadores TAT/TAR como con elemento oriP (pSS185). Véase la
Figura 1 para los mapas físicos de la estructura del plásmidos. Las
células HKB11 adaptadas a una suspensión libre de suero se
transfectaron con el procedimiento de transfección con agitación
como se ha descrito anteriormente. Las células transfectadas se
sub-cultivaron usando medio libre de suero
dividiéndolas 4-5 veces en 3 dpt y 7 dpt durante un
periodo de 10 días después de la transfección. El volumen total de
cultivo transfectado aumentó en 20-25 veces.
Se observó que el efecto de oriP y los efectos
de transactivación de TAT/TAR (Tabla 4) fueron ligeramente
diferentes de los datos mostrados en la Figura 3, lo que podría
explicarse por los diferentes estados de plásmido de la forma
lineal del ADN del plásmido oriP (por ejemplo, pSS179 y pSS185
linealizados) y la estructura del plásmido sin elemento oriP (por
ejemplo, pSL160N y pSS221). Por ejemplo, se suponía que un vector de
expresión de referencia de pSS179 lineal mostraría el mismo
resultado con pSL160N y se suponía que pSS185 lineal sería el mismo
que pSS221 por causa de la función de oriP interrumpida linealizando
la estructura del plásmido. Sin embargo, el efecto combinado de
TAT/TAR y función oriP fue similar. Durante este periodo de cultivo
prolongado, como se muestra en la Tabla 4, el aumento observado en
la expresión de proteínas (títulos de IL-2SA) se
mantuvo sin niveles de expresión drásticamente disminuidos. El
rendimiento total de la producción de IL-2SA de
pSS185 (vector de expresión de IL-2SA con TAT/TAR y
elementos oriP) en el periodo de transfección transitoria prolongada
(10 días) mostró un rendimiento extremadamente alto de la proteína
(460,8 \mug) a partir de 5 \mug de ADN transfectado con un
número inicial de células de 5 x 10^{6}, mientras que el vector de
expresión no optimizado (pSL160N) en 3 días de cultivo usando las
mismas cantidades de ADN y células, pudo recoger solamente 28,8
\mug de la proteína en 10 dpt y 1,4 \mug de proteína en 3 dpt
usando un vector de expresión convencional.
Este sistema demostró que aumentaba a escala
fácilmente para el uso de una producción de proteínas eficaz, por
ejemplo, cuando se transfectaron 5 x 10^{6} células HKB11 (50 ml
de cultivo) con 50 \mug de pSS185, se pudieron obtener
aproximadamente 5 mg de proteína en 10 días después de la
transfección con un volumen final de cultivo de un litro. En este
experimento, se descubrió que este efecto es proporcional y que esta
producción de proteína a partir de 500 \mug de ADN usando un
matraz de agitación, era aproximadamente 100 veces mayor que la
descubierta en una transfección convencional usando 5 \mug de ADN
en formato de 6 pocillos. Este resultado de transfección a gran
escala, indica que se puede ahorrar en el coste de preparación de
ADN y reactivos de transfección usando este sistema de transfección
prolongada a gran escala, cuando se compara con el sistema de
transfección convencional que usa de 20-25 veces más
materiales iniciales (ADN, reactivo de transfección, y
células).
Como se muestra en la Figura 4 y 5, el
transactivador BMLF1 no pudo utilizarse en un sistema de
transfección prolongada, porque los títulos de
IL-2SA y el número de células disminuyeron
drásticamente después de 3 dpt y, la proteína BMLF1 podría ser
tóxica, en última instancia, para las células que expresan BMLF1 en
el modo de transfección transitoria prolongada.
| Vectores de expresión | Título (\mug/ml) | Rendimientos totales (\mug) | ||||
| 3 dpt | 7 dpt | 10 dpt | 3 dpt | 7 dpt | 10 dpt | |
| pSL160N | 0,28 | 0,36 | 0,36 | 1,4 | 7,2 | 28,8 |
| pSS221 | 0,64 | 0,68 | 0,74 | 3,2 | 13,6 | 58,2 |
| pSS225 | 1,22 | 1,42 | 1,31 | 6,1 | 28,4 | 104,8 |
| pSS185 | 5,08 | 7,29 | 5,76 | 25 | 145,8 | 460,8 |
| Nota: Los rendimientos totales indican una multiplicación de los títulos de IL-2SA (\mug/ml) por volumen (ml). | ||||||
| \hskip0,5cm pSL160N: | secuencia que codifica IL-2SA en un vector dhfr | |||||
| \hskip0,5cm pSS221 | secuencia que codifica IL-2SA en un vector TAT/TAR | |||||
| \hskip0,5cm pSS225 | secuencia que codifica IL-2SA en un vector oriP | |||||
| \hskip0,5cm pSS185 | secuencia que codifica IL-2SA en un vector TAT/TAR-oriP |
Las células se dividieron 1:4 en 3 dpt y 1:5 en
7 dpt.
La expresión de IL-2SA de
vectores oriP, pSS178 y pSS179 (véase la Figura 1 para los mapas
físicos de los plásmidos), se ensayaron y se compararon con la
expresión de IL-2SA de un vector
TAT/TAR-oriP, pSS185, en selección con fármaco para
obtener células resistentes a fármaco para la producción de
proteínas a gran escala durante periodos de tiempo incluso más
largos. Células HKB11 cultivadas en un matraz de agitación en estado
libre de suero se transfectaron con los tres vectores de expresión
usando formato de 6 pocillos. Tres días después de la transfección,
las células transfectadas se inocularon en un matraz de agitación, 2
x 10^{6} células en 20 ml de medio que contenía suero (5%)
suplementado con 100 \mug/ml de higromicina B (HygB). Las células
se sub-cultivaron dos veces por semana usando estos
mismos medios de selección. Las células se centrifugaron y se
resuspendieron en el mismo volumen de medio fresco en los primeros
tres pasos. Después de esta fase de selección inicial, el cultivo
celular se sub-cultivó manteniendo la densidad
celular de 5 x 10^{5} células/ml. Los títulos de la producción de
IL-2SA de cada paso se midieron mediante un ELISA.
Cuatro semanas después de la producción, la productividad de
IL-2SA de pSS185 se mantenía en títulos más altos
que los de pSS178 y pSS179 por encima de 10 veces (Figura 6). Estos
resultados indican que los elementos transactivadores TAT/TAR junto
con los elementos de oriP (pSS185) en un sistema de selección con
fármacos muestran una productividad mucho más alta en comparación
con la productividad de IL-2SA de los vectores oriP,
pSS178 y pSS179.
Aunque el vector de expresión
TAT/TAR-oriP mostró una expresión inesperadamente
alta de proteínas, el tamaño del vector es demasiado grande para
usar en clonación de alta producción. Por lo tanto, se separó el
vector de expresión en dos grupos funcionales. El vector de
clonación principal (5,9 kb) constituido por CMVe/p, TAR, MIS,
sitio de clonación (PvuII) y señal poliA en un vector oriP, pSS223.
El vector oriP que expresa TAT (8,7 kb) plásmido pSC186 fue un
plásmido co-transfectado. En ensayos de transfección
transitoria para selección de alta producción, se pueden
transfectar 5 \mug de pSS223 con el gen de interés y 1 \mug de
plásmido pSS186 oriP que expresa TAT. Como se muestra en la Figura
7, se insertaron las secuencias que codifican IL-2SA
e IL-4 en el sitio de clonación PvuII de pSS223.
Los plásmidos resultantes son pSS240 y pSS241, respectivamente. Las
células HKB11 se co-transfectaron con 5 \mug de
pSS240 o pSS241 y 1 \mug de pSS186 en un modo de transfección con
agitación en estado libre de suero. Se observó un resultado similar
de un aumento de 3-5 veces en ensayos de
cotransfección (Tabla 5) al de un vector
TAT/TAR-oriP (pSS185) sobre un vector oriP (pSS225)
(Tabla 4). Este resultado indica que el procedimiento de
cotransfección de los dos plásmidos funcionalmente separados es
equivalente al de la transfección del vector de expresión único
constituido por los dos elementos TAT/TAR y oriP.
| Transfección sencilla | Cotransfección con pSC186 | Veces de aumento | |
| IL-2SA (3 dpt) | 4,28 | 14,2 | 3,3 |
| IL-2SA (6 dpt) | 3,07 | 15,9 | 5,1 |
| IL-4 (3 dpt) | 13,4 | 41,6 | 3,1 |
| IL-4 (6 dpt) | 11,6 | 37,2 | 3,2 |
| Nota: las veces de aumento se calcularon de los valores de cotransfección sobre los valores de | |||
| transfección sencilla. |
Las proteínas heterólogas expresadas por células
de mamífero, normalmente tienen una mejor o más deseables
cualidades para caracterizar las proteínas que las proteínas
expresadas de células no de mamíferos y, por tanto, se prefieren
las células de mamífero. Sin embargo, la cantidad de proteínas
fabricada por las células de mamífero es normalmente más pequeña
que en otros sistemas. Para compensar los problemas anteriores, se
optimizó un sistema de transfección transitoria para producir
producción de proteínas "fast track". Los resultados se basan
en muchos factores de la siguiente forma:
La célula huésped HKB11 optimizada que se adaptó
a un estado de suspensión libre de suero.
1. Procedimientos de transfección con agitación
usando medio libre de suero. En este procedimiento, se puede usar
una mayor densidad celular inicial en condiciones de cultivo
óptimas, lo que puede, posteriormente, producir más proteína. En
transfecciones estacionarias, no se podía usar más de 1,5 x 10^{6}
células por pocillo para transfección, por causa del estado no
óptimo de cultivo de células cultivadas en forma de monocapa. Usando
células en monocapa (por ejemplo, células CHO) para
2. Transfección, las condiciones de agitación
del cultivo transfectado proporcionaron más secreción de proteína
(2-3 veces) que las condiciones de no agitación, por
razones no totalmente claras.
3. Los vectores de expresión optimizados usando
el elemento oriP, que puede mantener los plásmidos transfectados
como epitomas, y los elementos de transactivación, que pueden
potenciar la expresión de proteínas, simultáneamente.
4. La parte más crítica y el resultado más
inesperado de este sistema de transfección mejorada fue la
combinación de elemento oriP y elementos de transactivación TAT/TAR
para expresión de proteínas y dicha combinación en un único vector
o sistema de transfección no se ha sugerido en la técnica
anterior.
El experimento usando células CHO no se
prosiguió de forma intensiva después de obtener los datos ineficaces
en el sistema de transactivación TAT/TAR-oriP y en
base a la siguiente información publicada. Un plásmido oriP no se
replica eficazmente (Yates y col., Nature
313:812-815,1985 y Mizuguchi y col., FEBS lett
472:173-178, 2000) en células de roedor y las
células CHO carecen de factores celulares para un sistema de
transactivación TAT/TAR (Alonso y col., J Virol
66:4617-4621, 1992 y Wimmer y col., Virology
255:182-189, 1999).
Dada la descripción anterior, se entiende que
ahora se les ocurrirán variaciones a los especialistas en la
técnica. Por consiguiente, se pretende que los ejemplos anteriores
deben interpretarse como ilustrativos y que el alcance de las
invenciones descritas en este documento esté limitado solamente por
las siguientes reivindicaciones.
Claims (12)
1. Una composición que comprende un
plásmido, comprendiendo el plásmido
- (a)
- un elemento oriP y ácido nucleico que codifica EBNA 1,
- (b)
- promotor/potenciador CMV
- (c)
- ácido nucleico que codifica TAT y TAR; y
- (d)
- ADN que codifica una proteína heteróloga.
2. La composición de la reivindicación
1, que comprende además ácido nucleico que codifica BMLF1.
3. La composición de la reivindicación
1, que comprende además proteína BMLF1.
4. La composición de la reivindicación
1, en la que la proteína heteróloga se selecciona entre el grupo
constituido por IL-4 e IL-2SA.
5. Una línea celular de mamífero
transformada con la composición de la reivindicación 1.
6. Una composición que comprende un
primer plásmido y un segundo plásmido, en la que el primer plásmido
comprende un elemento oriP, ácido nucleico que codifica EBNA1, y
ácido nucleico que codifica TAT, y el segundo plásmido comprende un
elemento oriP, ácido nucleico que codifica TAR, y un
promotor/potenciador CMV unido de forma operativa a un ADN que
codifica una proteína heteróloga.
7. La composición de la reivindicación
6, en la que el primer plásmido comprende además ácido nucleico que
codifica BMLF1.
8. La composición de la reivindicación
6, en la que la composición comprende además proteína BMLF1.
9. La composición de la reivindicación
6, en la que la proteína heteróloga se selecciona entre el grupo
constituido por IL-4 e IL-2SA.
10. Una línea celular de mamífero
transformada con la composición de la reivindicación 6.
11. Un procedimiento para producir una
proteína heteróloga a partir de una célula huésped de mamífero, que
comprende las etapas de:
- (a)
- transformar una célula huésped de mamífero con la composición de la reivindicación 1;
- (b)
- expandir la célula huésped de la etapa (a) en cultivo; y
- (c)
- aislar la proteína heteróloga del cultivo de la etapa (b).
12. Un procedimiento para producir una
proteína heteróloga a partir de una célula huésped de mamífero, que
comprende las etapas de:
- (a)
- transformar una célula huésped de mamífero con la composición de la reivindicación 6;
- (b)
- expandir la célula huésped de la etapa (a) en cultivo; y
- (c)
- aislar la proteína heteróloga del cultivo de la etapa (b).
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