ES2264122T3

ES2264122T3 - Metodo para la prevencion de deterioros neuronales inducidos por el complejo receptor nmda.

Info

Publication number: ES2264122T3
Application number: ES93923724T
Authority: ES
Inventors: Stuart A. Lipton
Original assignee: Boston Children's Hospital
Current assignee: Boston Children's Hospital
Priority date: 1992-09-22
Filing date: 1993-09-22
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2013-09-22
Also published as: ATE330606T1; AU5348194A; EP0661973A4; DE69334035T2; US5455279A; DK0661973T3; US5747545A; WO1994006428A1; EP0661973B1; US5801203A; DE69334035D1; EP0661973A1

Abstract

SE DESCRIBE UN METODO PARA DISMINUIR EL DAÑO CEREBRAL MEDIATIZADO POR RECEPTOR NMDA EN UN MAMIFERO ADMINISTRANDOLE UN COMPUESTO NITROSO QUE GENERA OXIDO-NITRICO O ESPECIES DE REDUCCION-OXIDACION RELACIONADAS, EN UNA CONCENTRACION EFECTIVA PARA ALCANZAR LA NEUROPROTECCION. TAMBIEN SE DESCUBRE UN METODO PARA DISMINUIR EL DAÑO CEREBRAL MEDIATIZADO POR RECEPTOR NMDA EN MAMIFEROS ADMINISTRANDOLES UN COMPUESTO NITROSO QUE GENERA OXIDO NITRICO (O ESPECIE DE REDUCCION-OXIDACION RELACIONADA COMO NO O NO+ EQUIVALENTE) O UNA CONCENTRACION FISIOLOGICAMENTE EFECTIVA PARA CAUSAR TAL NEUROPROTECCION.

Description

Método para la prevención de deterioros neuronales inducidos por el complejo receptor NMDA.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a compuestos útiles para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso, en especial enfermedades mediadas por el subtipo N-metil-D-aspartato (NMDA) del complejo receptor de aminoácido excitatorio.

Se ha implicado al glutamato o congéneres relacionados como un factor significativo en la neurotoxicidad asociada con la encefalopatía hipóxica isquémica, anoxia, hipoglicemia, convulsiones, trauma, y diversas enfermedades neurológicas neurodegenerativas. Hahn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6556, 1988; Choi, Neuron 1:623, 1988; Rothman et al., Trends Neurosci. 10:299, 1987; Meldrum et al., Trends Pharm. Sci. 11:379, 1990 En muchas neuronas centrales, la forma predominante de esta neurotoxicidad parece estar mediada por la activación del subtipo NMDA del receptor glutamato y el posterior influjo de Ca^{2+} (Choi, ibid; Weiss et al., Science 247:1474, 1990). Lei et al. Neuron 8:1087-1099 (1992) excesivo describe el uso de compuestos nitrosos (compuestos que contienen el grupo NO) para tratar enfermedades neurológicas. Stamler et al. Science 258:1898-1902 (1992) haciendo referencia a Lei et al. (1992) también describe el uso de compuestos nitrosos para tratar enfermedades neurológicas.

Resumen de la invención

Los autores han descubierto que determinados compuestos protegen a las neuronas contra los daños neuronales mediados por receptores NMDA. Específicamente, nitroglicerina, nitroprusida, y sus derivados de compuestos nitrosos proporcionan dicha protección. Por lo tanto, se describe un método para reducir los daños neuronales mediados por el complejo receptor NMDA en mamíferos administrando uno de los compuestos anteriormente descritos al mamífero, en una concentración efectiva para reducir dichos daños.

En relación con los compuestos descritos anteriormente, los autores no desean vincularse a ninguna teoría o mecanismo de acción determinado. Sin embargo, parece que la oxidación del grupo(s) tiol del sitio modulador redox del receptor NMDA protege contra los daños neuronales mediados I por el receptor NMDA. También se sabe que las especies activas de nitroglicerina y nitroprusida es óxido nítrico o especies redox NO relacionadas. ^{1} Véase, p. ej., Garthwaite et al. (Trends in Neurosciences 14:60, (1991). Un posible mecanismo para el efecto protector descubierto es la oxidación inducida por NO del complejo del canal del receptor NMDA, posiblemente mediada por una reacción de nitrosación que implica la transferencia del grupo NO al(a los) tiol(es) del sitio modulador redox del receptor NMDA, que tiene como resultado un RS-NO (equivalente a NO^{+}). De forma similar, el anión nitroxilo (NO^{-}) de las especies redox también puede reaccionar con grupos tiol. En contraposición, bajo condiciones fisiológicas, el NO. (óxido nítrico) reacciona directamente con los grupos tiol de forma deficiente, o no lo hace en absoluto.

^{1} Los autores utilizan la expresión NO (monóxido de nitrógeno) para incluir las especies redox relacionadas, es decir, NO. (óxido nítrico), NO^{+} (ión nitrosonio) y NO- (anión nitroxilo). Véase Stamler et al., mencionados anteriormente.

Un primer aspecto de la invención incorpora el uso de un compuesto nitroso que genera óxido nítrico o una especie redox relacionada de óxido nítrico, o una sal fisiológicamente aceptable de dicho compuesto, en una concentración eficaz para provocar neuroprotección, por ejemplo, una disminución de dichos daños, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de los daños neuronales mediados por el complejo receptor NMDA en mamíferos, siempre que dicho compuesto no sea nitroglicerina, nitroprusida o derivados de nitroglicerina seleccionados del grupo formado por mononitrato de isosorbida, dinitrato de isosorbida, nitroglicerina sublingual, NT-1, Nitrocor, Nitroderm, Nitrodisc, Nitro-dur, Nitro-Dur II, Nitrofilm, Nitrogard, Nitroglin, Nitropen, Tridil y 6-cloro-2-piridilmetil nitrato. Sin el deseo de vincularse a ningún mecanismo de acción específico, parece que NO o una especie redox relacionada actúa en
el(los) grupo(s) tiol del sitio modulador redox del complejo del canal del receptor NMDA para proteger contra los daños mediados por el receptor NMDA. En los modos de aplicación preferidos de la invención, el mamífero es un paciente humano infectado con un virus que afecta al sistema nervioso, por ej., sarampión o virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En particular, el paciente al que se le administra el compuesto de la invención puede estar infectado con VIH y puede manifestar síntomas del complejo relacionado con el SIDA o síndrome de inmunodeficiencia adquirida (por ejemplo, manifestaciones neurológicas del VIH (véase, por ej., USSN 571.949), tales como las que pueden ser tratadas con el compuesto usado en la presente invención, lo cual incluye complejo de demencia del SIDA o déficits cognitivo-motores-sensoriales de demencia progresiva o incipiente). Otros estados neurodegenerativos que pueden tratarse con los compuestos usados en la invención incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS o enfermedad de las neuronas motoras), enfermedad de Parkinson, neurolatirismo, enfermedad de Guam, y las enumeradas a continuación en la tabla 2.

Alternativamente, el paciente puede presentar (o es probable que esté sujeto a) un trastorno agudo tal como hipoxia, anoxia, envenenamiento por monóxido de carbono, isquemia, trauma CNS, hipoglicemia, convulsiones, apoplejía (con lo cual los autores incluyen ataques asociados con isquemia o hemorragia subaracnoide), envenenamiento por ácido domoico, envenenamiento por plomo, u otros trastornos agudos descritos a continuación en la Tabla 1. Cuando el paciente está sometido a uno de los trastornos mencionados anteriormente, los compuestos usados en la invención pueden usarse para proporcionar tratamiento profiláctico. Otras enfermedades mediadas (al menos en parte) por la toxicidad de aminoácidos excitatorios y que pueden tratarse mediante la modulación del complejo receptor NMDA usando un compuesto según la presente invención. Dichas enfermedades incluyen: 1) ALS (esclerosis lateral amiotrófica o enfermedad de las neuronas motoras); 2) tipos dolorosos de "neuropatía periférica" que pueden estar mediados por una estimulación excesiva del receptor glutamato (NMDA), por ej., causalgia y otros tipos de síndromes de dolor neuropático, que incluyen tipos dolorosos de neuropatía periférica que pueden incluir (aunque no necesariamente) un componente del sistema nervioso central.

Mediante "daño neuronal mediado por el receptor NMDA" se hace referencia a cualquier lesión neuronal asociada con la estimulación o con la coestimulación del complejo del canal del receptor NMDA, un complejo del canal del receptor que se encuentra en un subconjunto de neuronas de mamíferos y que incluye un sitio de unión para una molécula tal como glutamato, NMDA, o agonistas similares (véase a continuación). La activación de este complejo del canal del receptor uniendo agonistas induce la excitación neuronal al abrir canales de iones específicos en la membrana.

Mediante "compuesto nitroso" se hace referencia a cualquier compuesto que produzca una cantidad suficiente de NO (más probablemente una especie redox relacionada tal como un equivalente NO^{+} ó NO^{-}) tras su administración a un mamífero para disminuir los daños o lesiones neuronales. Para más comodidad, los autores también han usado la expresión menos precisa "compuesto generador de NO" para incluir compuestos que producen las especies redox asociadas a NO^{-} (por ej., RS-NO, un equivalente de NO^{+}, ó NO^{-}) o una de sus sales fisiológicamente aceptables.

Compuestos útiles para su uso en la invención incluyen cualquier compuesto nitroso, excepto nitroglicerina, nitroprusida, o derivados de nitroglicerina seleccionados del grupo formado por mononitrato de isosorbida, dinitrato de isosorbida, nitroglicerina sublingual, NT-1, Nitrocor, Nitroderm, Nitrodisc, Nitro-dur, Nitro-Dur II, Nitrofilm, Nitrogard, Nitroglin, Nitropen, Tridil y 6-cloro-2-piridilmetil nitrato. La verificación de que un compuesto determinado proporciona oxidación protectora del propio receptor NMDA es un paso bien entendido por los expertos en la técnica (véase, por ej., Lipton, PCT WO 91/02810).

Los dos compuestos preferidos que pueden usarse en un método para disminuir los daños neuronales mediados por el complejo receptor NMDA, tal y como se ha descrito anteriormente, (es decir, nitroglicerina y nitroprusida sódica que no entran dentro del alcance de la presente invención) proporcionan la ventaja de un registro demostrado de administración segura en humanos (es decir, para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares). Compuestos nitrosos según la presente invención que pueden usarse de este modo incluyen: dinitrato de isosorbida (isordil); S-nitrosocaptoprilo (Snocap); Albúmina de suero acoplada a óxido nítrico ("SA-NO"); Catepsina acoplada a óxido nítrico (catepsina - NO); Activador del plasminógeno de los tejidos acoplados a NO (TPA-NO); Complejos de catión nitrosilo SIN-1 (o molsidomina), incluidos complejos Fe^{2+}-nitrosilo; Nicorandilo; S-nitrosoglutatión; NO acoplado a un derivado adamantino, lo cual incluye memantina (véase solicitud de patente estadounidense SN 07/934.824) S-nitrosotioles incluido S-nitrosocisteína; sidnoniminas o nonoatos con la fórmula

X ---

\delm{N}{\delm{\para}{\delm{N}{\delm{\dpara}{O \cdot }}}}

--- O^{-},

donde X es cualquier nucleófilo que incluye una amina; y agentes que generan una cascada oxidante similar a la generada por NO^{2} tal como ácido \alpha-lipoico (ácido tióctico y sus enantiómeros); dihidrolipoato; glutatión; ascorbato; y vitamina E.

^{2} Sin estar vinculado a ninguna teoría específica, dichas cascadas se caracterizan por un intercambio de electrones con compuestos nitrosos.

Cualquiera de los compuestos nitrosos descritos anteriormente pueden combinarse con otros compuestos redox que facilitan la producción y mantenimiento de NO. Por ejemplo, pueden combinarse generadores directos de NO con pirroloquinolina quinona (PQQ), un conocido modulador redox de NNDA (véase patente estadounidense 5.091.391) o ésteres derivados de PQQ, u otras quinonas tales como ubiquinona.

En relación con los compuestos usados en la invención, la capacidad de NO para ser transportada a las membranas de las células transversales hace que dichos compuestos sean útiles en el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente.

También se ha reconocido que las especies NO\bullet (óxido nítrico que contiene un electrón libre) conduce a la neurotoxicidad a través de la formación de peroxinitrito (ONOO^{-}) (o sus productos de descomposición) mediante reacción con O_{2} \bullet^{-} (véase la siguiente demostración en la Fig. 7). El solicitante observa que la literatura describe la enzima, NO sintasa, que produce óxido nítrico en determinados tipos de células; esta enzima y su papel en la función neuronal se describe en, por ej., Garthwaite et al. (Trends in Neurosciences 14:60, 1991), Hope et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2811, 1991), y Dawson et al., (Ann. Neurol. 32:297-311, 1992). Por lo tanto, el óxido nítrico sintasa puede inhibirse para efectuar la neuroprotección, pueden administrarse inhibidores de óxido nitrico sintasa para reducir la disponibilidad de NO\bullet y así disminuir la disponibilidad de peroxinitrito neurotóxico (ONOO^{-}). Esta identificación puede combinarse con la invención tal y como se ha descrito anteriormente, o bien puede administrarse el inhibidor de óxido nítrico sintasa independientemente para tratar manifestaciones neurológicas de infección con VIH, para tratar dolor neuropático mediado por la actividad del receptor NMDA, o para tratar ALS.

También se ha identificado que dosis neuroprotectoras de compuestos nitrosos usados en la invención pueden reducir la presión sanguínea como efecto no deseado en pacientes sin tratamiento previo, pero es posible construir tolerancia a este efecto secundario sin perder el efecto neuroprotector deseado. En consecuencia, un compuesto nitroso usado en la invención, capaz de proteger contra lesiones neuronales mediadas por el complejo receptor NMDA, puede administrarse de forma continuada durante un periodo prolongado escalando la posología gradualmente, comenzando en un nivel de dosis que no reduce sustancialmente la presión sanguínea del paciente y aumentando hasta un nivel de dosis final para producir una tolerancia sistémica del compuesto. El nivel de dosis final es lo suficientemente elevado para reducir la presión sanguínea de un paciente sin tratamiento previo, sin embargo, la administración continuada de los compuestos crea tolerancia al efecto de reducción de la presión sanguínea del compuesto, de modo que el nivel de la dosis final no reduce sustancialmente la presión sanguínea del paciente. En consecuencia, en un modo de aplicación preferido, la invención comprende usar el compuesto descrito anteriormente mediante administración continuada durante un periodo prolongado, preferiblemente superior a 12 horas, escalando gradualmente la dosis para establecer tolerancia sistémica de dicho compuesto comenzando en un primer nivel de dosis que no reduce sustancialmente la presión sanguínea del paciente y aumentando hasta un nivel final, siendo dicho nivel final lo suficientemente elevado como para reducir sustancialmente la presión sanguínea de dicho paciente si se administra a un paciente sin tratamiento previo, pero que no es adecuada para reducir sustancialmente la presión sanguínea de dicho paciente tras recibir dicha administración continuada durante un periodo prolongado. Preferiblemente dicho compuesto se administra en múltiples dosis progresivamente más elevadas hasta que se logra la dosis final, y a continuación dicho compuesto se administra en dosis múltiples en dicho nivel de dosis final.

El compuesto puede administrarse mediante un parche transdérmico tal y como se describe a continuación con detalle (por ej., un parche con un área superficial superior a 50 cm^{2}). Preferiblemente dicha administración es continua durante un periodo superior a 24 horas.

También resulta útil, cuando se administra de forma aguda un compuesto nitroso según la invención, coadministrar un compuesto para aumentar la presión sanguínea tal como dopamina.

También se describe la administración de superóxido dismutasa (SOD), catalasa, o ambos, para limitar la neurotoxicidad disminuyendo la formación de peroxinitrito de la reacción de NO\bullet con anión superóxido (O_{2}\bullet). El tratamiento puede complementarse con la administración de un compuesto según la invención o bien puede usarse independientemente, especialmente para tratar manifestaciones neurológicas de infección por VIH o por ALS.

Se usa polietilenglicol (PEG) para mejorar la absorción en el sistema nervioso central (CNS) y la eficacia de SOD y/o catalasa. Un símil de SOD, el polisacárido unido a proteínas de Coriolus versicolor QUEL, llamado "PS-K", también puede resultar útil en las vías de administración parenterales u orales, especialmente con PEG para mejorar la absorción de CNS, y dicha similitud puede sustituirse para SOD en este aspecto de la invención. Véase Kariya et al., Mol. Biother. 4:40-46 (1992); y Liu et al., (1989) Am. J. Physiol. 256:589-593.

Otras características y ventajas de la invención resultarán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

Descripción detallada

En primer lugar se describen brevemente los dibujos.

Dibujos

Las Figs. 1-3 son gráficos que muestran los niveles intracelulares de [Ca^{2+}] evocados por NMDA observados mediante fluorescencia Fura-2 a lo largo del tiempo a medida que se administran diferentes agentes redox incluido NTG a las neuronas cultivadas. (Véase los Ejemplos 1 y 2.)

La Fig. 4 es un gráfico en el que se muestran las corrientes evocadas por NMDA (incluida [Ca^{2+}] ) en las neuronas corticales y el efecto de diferentes agentes redox incluido NTG. (Véase el Ejemplo 3.)

Las Figs. 5A-B son gráficos que muestran la [Ca^{2+}] intracelular evocada por NMDA inducida en las neuronas corticales y el efecto de diferentes agentes redox incluida la S-nitrosocisteína (SNOC). (Véase el Ejemplo 5.)

Las Figs. 6A-D son gráficos de barras que muestran que la nitroprusida sódica (SNP) o nitroglicerina (NTG) evita la neurotoxicidad mediada por NMDA.

Las Figs. 7A y 7B son gráficos de barras que muestran el requisito superóxido de la neurotoxicidad inducida por S-nitrosocisteína (SNOC) o peroxinitrito (ONOO^{-}).

Se ha descubierto que los compuestos nitroprusida y nitroglicerina reducen el daño neuronal mediado por el complejo receptor NMDA (véase a continuación). Esta neuroprotección puede deberse a nitrosación u oxidación del receptor NMDA en el sitio modulador redox, lo cual tiene como resultado la transferencia del grupo NO al grupo(s) tiol del sitio modulador redox del receptor NMDA para formar un RS-NO (equivalente de NO^{+}). Esta reacción química conduce a una disminución de la activación del canal operada por el receptor NMDA mediante aminoácidos excitatorios (tales como NMDA o glutamato) y una disminución concomitante del influjo de calcio intracelular y mejora de la neurotoxicidad.

Un nivel o efecto aumentado de uno o más compuestos asociados a glutamato está asociado a muchas enfermedades neurodegenerativas (por ej., las indicadas anteriormente). Además del propio glutamato, las lesiones neuronales pueden ser resultado de la estimulación del complejo del canal del receptor NMDA u otros aminoácidos excitatorios, tales como aspartato, quinolinato, ácido homocisteico, ácido sulfónico de cisteína, cisteína o de la estimulación de péptidos excitatorios, tales como N-acetil aspartil glutamato.

Puede comprobarse la eficacia de compuestos útiles en la invención (es decir, compuestos nitrosos o compuestos generadores de NO y sus derivados) en la disminución de los daños neuronales usando los ensayos descritos a continuación - - es decir, en ensayos de corriente iónica evocada por NMDA (véase, e.g., PCT WO 91/02810), en ensayos de aumentos de Ca^{2+} intracelular evocados por NMDA (véase a continuación), o en ensayos de muerte de células neuronales (véase a continuación). Un compuesto eficaz provocará una disminución de la corriente iónica, concentración de Ca^{2+} intracelular o en la muerte de células neuronales, respectivamente. Los compuestos más preferidos en la invención son aquellos que ejercen la mayor protección de las neuronas contra lesiones mediadas por complejos receptores NMDA, por ej., lesiones que son resultado de la estimulación del receptor NMDA por NMDA (tal y como se muestra a continuación) u otros aminoácidos excitatorios o estimulación por péptidos excitatorios, tales como N-acetil aspartil glutamato.

Ensayo de funcionamiento y muerte de células neuronales

Para comprobar la capacidad de los compuestos para evitar la neurotoxicidad, puede ensayarse la muerte de células neuronales del siguiente modo. Se prepararon neuronas corticales neonatales según el método general de Snodgrass et al. (1980) Brain Res. 190:123-138; y Rosenberg et al (1988) J. Neurosci. 8:2887-2899. Se monitorizan los cultivos tras una breve exposición (5-30 minutos) a 30-100 \muM de NMDA, ó a 5 mM de DTT (durante 5 minutos) seguido por 30-100 \muM de NMDA (durante 5-30 minutos adicionales) e incubación durante la noche (es decir, de 16 a 24 horas). Los experimentos in vivo sugieren que existe un estado de reducción química transitoria en el cerebro tras una apoplejía; la introducción del agente reductor químico DTT puede mimetizar este entorno reductor, aumentando la similitud del ensayo in vitro a la situación in vivo. El compuesto candidato se ensaya añadiendo (por ej., en una serie de concentraciones que oscilan de 0,1 nM-10 mM) tras el tratamiento con DTT pero antes del tratamiento con NMDA. El compuesto candidato puede añadirse durante minutos, horas o incluso días antes de su periodo de lavado. Tras la exposición a NMDA, los cultivos se incuban unas 16-24 h adicionales a 37ºC en una atmósfera de aire al 95% con 5% de CO_{2}. Se puntúa la supervivencia celular de los cultivos neuronales tras esta incubación durante la noche debido a que la toxicidad del NMDA a menudo se retrasa varias horas tras la exposición a NMDA. La capacidad de las neuronas corticales para mantener la apariencia brillante de fase y excluir el azul tripán se usa como un índice de supervivencia (Rosenberg et al., Neurosci. Lett. 103: 162-168, 1989).

Medición de Ca^{2+} intracelular

La concentración de Ca^{2+} intracelular libre ([Ca^{2+}]_{i}) se mide en las neuronas corticales neonatales mediante microscopia de imagen digital con la tinción fluorescente sensible a Ca^{2+} Fura 2, del siguiente modo. Se usan los mismos cultivos neuronales corticales descritos anteriormente. Durante las mediciones de Ca^{2+}, a menos que se indique lo contrario, el fluido que baña las neuronas está formado por las sales equilibradas de Hanks. 137,6 mM NaCl, 1 mM NaHCO_{3}, 0,34 mM Na_{2}HPO_{4}, 0,44 mM KH_{2}PO_{4}, 5,36 mM KCl, 1,25 mM CaCl_{2}, 0,5 mM MgSO_{4}, 0,5 mM MgCl_{2}, 5 mM Hepes NaOH, 22,2 mM de glucosa, y en ocasiones con indicador rojo fenol (0,001% v/v); pH 7,2. se aplica NMDA (en ausencia de Mg^{++}), glutamato, y otras sustancias a las neuronas mediante expulsión de la presión tras la dilución esta solución de baño. Se analiza la [Ca^{2+}]_{i} neuronal con fura 2-acetoxi-éster de metilo (AM) según se describe [Grynkiewicz, et al., J. Biol. Chem. 260:3440 (1985); Williams et al., Nature 318:558 (1985); Connor et al., J. Neurosci. 7:1384 (1987); Connor et al., Science 240:649 (1988); Cohan et al., J. Neurosci. 7:3588 (1987); Mattson, et al., ibid, 9:3728 (1989)]. Tras añadir el medio esencial mínimo de Eagle con 10 \mum de Fura 2-AM a las neuronas, se incuban los cultivos a 37ºC en una cámara de aire humidificado al 95% con 5% de CO_{2} y a continuación se aclaró. Se carga la tinción, se atrapa y se desesterifica en 1 hora, según determinen las relaciones de fluorescencia estables y el efecto de la Ca^{2+} ionoforo ionomicina en la [Ca^{2+}]_{i} medido. Durante la toma de imágenes de Ca^{2+}, las células se incuban en una solución tampón salina de Hepes con las sales equilibradas de Hanks. Se calcula la [Ca^{2+}]_{i} a partir de las imágenes obtenidas de la medición de la fluorescencia a 500 nm que se excita con luz de 350 nm y 380 nm con una cámara DAGE MTI 66 SIT ó QUANTEX QX-100 Intensified CCD montada sobre un microscopio Zeiss Axiovert 35. El tiempo de exposición de cada imagen es 500 ms. El análisis se realiza con un sistema de procesamiento de la imagen Quantex (Sunnyvale, CA) QX7-210. Puesto que las células se exponen a luz ultravioleta solo durante la recogida de datos (normalmente menos que un total de 20 s por célula), la decoloración de Fura 2 es mínima. Se ha demostrado que la neurotoxicidad mediada por el receptor NMDA está asociada con un primer aumento de la concentración de Ca^{2+} intracelular.

Pinzamiento zonal

Los pinzamientos zonales se realizaron en la configuración total de la célula usando generalmetne el procedimiento descrito por Hamill et al. (1981) modificado por Lipton y Tauck (1987); y Aizenman et al. (1988). Las pipetas de pinzamiento zonal normalmente contenían 140 mM KCl (ó 120 mM CsCl y 20 mM TEA-Cl), 2 mM MgCl_{2}, 2,25 mM EGTA, 10 mM HEPES-NaOH (pH 7,2). Se administraron agentes redox mediante superfusión (3,5 ml/min), coaplicando siempre NMDA y glicina con una pipeta de inyección.

Puede comprobarse la utilidad de un compuesto en el método de la invención usando cualquier tipo de célula neuronal del sistema nervioso central, siempre que la célula pueda aislarse intacta mediante técnicas convencionales. A pesar de que anteriormente se han usado cultivos de neuronas corticales, también pueden usarse neuronas de células ganglionares retinales, neuronas de la médula espinal, neuronas granulares cerebrales, o cualquier neurona que contenga receptores NMDA (por ej., neuronas de otras regiones del córtex). Dichas neuronas pueden ser prenatales o postnatales.

Los siguientes ejemplos ilustran compuestos útiles en el método de la invención y su eficacia en la reducción de daños neuronales. Estos ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención.

A pesar de que los Ejemplos 1 a 4, 6 y 7 no usan compuestos que queden dentro del alcance de la invención, se proporcionan para ilustrar métodos que pueden usarse para evaluar los efectos clínicos de los compuestos nitrosos que sí caen dentro del alcance de la invención.

Ejemplos 1-4

NTG o SNP inhibe aumentos inducidos por NMDA de [Ca^{++}] en cultivos de neuronas corticales de ratón

En este experimento, el efecto del NTG en aumentos del [Ca^{++}] intracelular inducidos por NMDA fueron seguidos usando técnicas de toma de imágenes digital [Ca^{++}], a partir de la tinción Fura-2.

Específicamente, el modelo de la neurotoxicidad mediada por NMDA implica la exposición a NMDA de las neuronas corticales de rata cultivadas en presencia de glicina (un coagonista). NMDA (50 \muM) induce un aumento de [Ca^{++}]_{i}
(concentración de ión de calcio intracelular) mejorado tras la exposición al agente reductor fuerte, ditiotreitol (DTT). La reducción química del sitio modulador redox de NMDA del grupo(s) tiol con DTT aumenta el efecto neurotóxico de NMDA. Antagonismo de la neurotoxicidad mediada por el receptor NMDA por NTG se demuestra del siguiente modo.

Se derivaron cultivos corticales de ratas Sprague-Dawley embriónicas (día fetal 15 ó 16) según se ha descrito anteriormente (Dichter, 1978; Rosenberg y Aizenman, 1989). Sucintamente, tras la disociación en 0,027% de tripsina, se colocan en placas de cultivo células corticales cerebrales a una densidad de 4,5 x 10^{5} por 35 mm por placa con cubreobjetos de cristal recubierto de poli-L-lisina en medio Eagle modificado según Dulbecco con F12 de Ham y suero de ternero complementado con hierro e inactivado por calor a una relación de 8:1:1. Pasados 15 días en cultivo (cuando la capa de astrocitos se había vuelto confluente), los cultivos se trataron con citosina arabinosida durante 72 hr. El medio de cultivo se rellenó 3 veces por semana. Se incubaron los cultivos a 36ºC en 5% de CO_{2}, atmósfera de aire humidificado al 95%. Se usaron los cultivos para los experimentos a temperatura ambiente (21ºC-24ºC) aproximadamente 1 mes después de colocarlos en las placas. Las neuronas pudieron identificarse fiablemente mediante criterios morfológicos bajo óptica de contracción de fase, tal y como se confirma posteriormente mediante pinzamiento
zonal.

Para permitir los experimentos fisiológicos (imagen de Ca^{2+} o pinzamiento zonal) bajo condiciones de atmósfera normal, justo antes de una sesión, se intercambió el cultivo por una solución basada en las sales equilibradas de Hanks (tal y como se definió anteriormente con 1,25-2,5 mM de CaCl_{2}). Para mejorar las respuestas fisiológicas a NMDA, el salino estaba nominalmente libre de Mg^{2+} y contenía 1 \muM de glicina, un coagonista necesario para la activación del receptor NMDA (Johnson y Asher, 1987; Kleckner y Dingledine, 1988). Se añadió tetrodotoxina (1 \muM) para bloquear la acción potencial y asegurar la liberación de neurotransmisores desde otras neuronas a la célula de interés. La presencia de neurotransmisión intacta podría haber perturbado los resultados si, por ejemplo, K^{+} elevado, kainato, o NMDA hubiera provocado la liberación de una sustancia de una neurona que a su vez actuaba sobre la célula monitorizada.

La Fig. 1 muestra cuantificaciones de [Ca^{2+}]_{i} de representaciones digitales de imágenes de fura-2 a lo largo del tiempo de cinco neuronas corticales del campo objeto de la imagen. Se aplicó DTT, NTG, DTNB (ácido 5,5-ditio-bis-2-nitrobenzoico) (en ese orden) durante aproximadamente 2 minutos y se lavó antes de la recogida de datos de respuestas de [Ca^{2+}]_{i} evocadas por NMDA. Dichos datos se recogieron inmediatamente tras la exposición a 50 \muM de NMDA. En las Fig. 1 y 2, la respuesta [Ca^{2+}]_{i} inducida por NMDA tras el pretratamiento con DTT se estableció en el 100%. Antes del pretratamiento con DTT, la respuesta [Ca^{2+}]_{i} inducida por NMDA era de alrededor del 68%. Tras el DTT, el ulterior tratamiento con NTG ó SNP redujo la respuesta [Ca^{2+}]_{i} evocada por NMDA al 60% o menos. El fuerte agente oxidante DTNB también redujo las respuestas de [Ca^{2+}]_{i} evocadas por NMDA. El posterior tratamiento con DTT restableció la respuesta de [Ca^{2+}]_{i} evocada por NMDA a un 100%.

Ejemplo 2

Se prepararon los cultivos corticales según se describe en el Ejemplo 1 y se pretrataron con DTT, se lavaron, y se trataron con 100 \muM de NTG, seguido por 50 \muM de NMDA. En la Fig. 3, NTG redujo de forma persistente la respuesta de [Ca^{2+}]_{i} evocada por NMDA, y esta reducción persistió durante la readministración reiterada de NMDA. La readministración de DTT invirtió el efecto de NTG.

Ejemplo 3

Los cultivos corticales descritos anteriormente se prepararon según se describe en los Ejemplos 1 y 2, y se realizaron fijaciones de membrana en lugar de toma de imágenes digitales de Ca^{2+} Específicamente, se coaplicó NMDA
(50 \muM) con glicina (1 \muM) mediante una pipeta neumática. Dicha aplicación tuvo como resultado una corriente hacia el interior con el voltaje de la célula fijada en un potencial basal de -60 mV. Una incubación de 2 min en DTT (seguido de lavado) mejoró la corriente evocada por NMDA. Esta corriente se atenuó posteriormente tras una exposición de 2 min a NTG (y lavado). La reaplicación de DTT (seguido de lavado) aumentó la respuesta de corriente hasta su valor anterior.

La Fig. 4 ilustra la recopilación secuencial de las corrientes pico evocadas por NMDA de 18 células tras el tratamiento (y posterior lavado) de cada reactivo redox indicado en la abscisa. El orden temporal de adición de los reactivos redox se indica en la abscisa. Los valores son \pmSEM medios, normalizados a la respuesta de 50 \muM observada tras la exposición a DTT para permitir la comparación entre diversas células. Las respuestas a NMDA que son estadísticamente más pequeñas que las obtenidas previamente, directamente tras la exposición a DTT están marcadas con un asterisco (P<0,001, ANOVA seguido por la comparación múltiple de medias de Scheffé.

Una exposición de 2 min a DTT (2 mM, seguido de lavado) aumentó las corrientes activadas por NMDA, mientras que la adición de NTG (500 \muM, seguido de lavado) inhibió las respuestas. La posterior incubación en DTNB
(500 \muM durante 2 min seguido de lavado) redujo ligeramente las respuestas.

Ejemplo 4

El experimento del Ejemplo 3 se repitió usando 1-5 mM NEM, N-etilmalemida, un agente que se sabe alquila grupos sulfhidrilo (tiol) de proteínas. Tras la alquilación, ni el NTG ni el DTNB afectaron significativa la amplitud de la corriente evocada por NMDA, lo cual indica que el sitio modulador redox del receptor NMDA, el sitio que reacciona con el grupo NO, está formado por un grupo(s) tiol.

Ejemplo 5

SNOC reduce las respuestas de [Ca^{2}]_{i} evocadas por NMDA

La S-nitrosocisteína (SNOC) libera NO^{-} y participa en la nitrosación (equivales de NO^{+} que reaccionan con grupos tiol de proteínas). La Fig. 5A es una representación digital de imágenes fura-2 de calcio descritas anteriormente, de 10 neuronas corticales en un solo campo. Tras cada respuesta a NMDA, [Ca^{2+}]_{i} regresó al valor basal en 1 minuto (no se muestran los datos para mayor claridad). Los puntos de datos están conectados por líneas discontinuas para enfatizar el orden temporal de la adición. En cada caso, se aplicó 2 mM de DTT durante -2 min y a continuación se lavó antes de aplicar NMDA y de la recogida de datos. Los valores son \pmSEM medios, normalizados a la respuesta NMDA
(50 \muM) obtenida tras la exposición a DTT (respuesta máxima -750 nM [Ca^{2+}]_{i}).

Tras la reducción química maximal con DTT, la respuesta evocada por NMDA aumentó, pero se inhibió posteriormente con una exposición de 3 min a 100 \muM de S-nitrosocisteína (SNOC). Tras el lavado de la S-nitrosocisteína, la respuesta producida por NMDA se recuperó solo ligeramente. Una segunda exposición a DTT invirtió totalmente el efecto inhibidor de S-nitrosocisteína. Respuestas a NMDA que son estadísticamente más pequeñas que las obtenidas directamente tras la exposición a DTT están marcadas con un asterisco (P<0,01, ANOVA, seguido por la comparación múltiple de medias de Scheffé). La Fig. 5B muestra que el pretratamiento con NEM bloquea el efecto de SNOC alquilando grupo(s) tiol, evitando así la transnitrosación del grupo NO en el(los) tiol(es) del receptor NMDA.

Ejemplo 6

Nitroglicerina (NTG) o nitroprusida sódica (SNP) evitan la neurotoxicidad mediada por el receptor NMDA

Usando el ensayo de neurotoxicidad descrito anteriormente se comprobaron individualmente los compuestos de nitroprusida sódica y nitroglicerina para detectar su capacidad de aumentar la supervivencia de neuronas corticales neonatales. Las células neuronales se incubaron durante 16-24 horas a 37ºC en una atmósfera de aire humidificado al 95% con 5% de CO_{2}.

Como se muestra en las Fig. 6A-6D, las neuronas supervivientes se expresan como el porcentaje de neuronas viables en las placas de cultivo de control del mismo experimento. Las concentraciones de fármacos fueron las siguientes: APV (2 mM), NTG (100 \muM), SNP (400 \muM), DTT D (0,5-2 mM), Hb reducido (500 \muM). En experimentos con NTG, los cultivos se expusieron a 30 \muM de NMDA durante 30 min; en los experimentos con SNP, la exposición fue de
75 \muM de NMDA durante 5 min. En los experimentos con Hb, NTG o SNP, se preincubó con un preparado purificado reducido químicamente de Hb antes de su adición a los cultivos. Los valores son \pmSEM medios para experimentos ejecutados por triplicado en cultivos hermanos en días diferentes (total de 32 experimentos). Los asteriscos indican una diferencia significativa en comparación con el valor de la exposición DTT-NMDA, P<0,05 (ANOVA seguido por comparación múltiple de medias de Scheffé.

Se ha descubierto que ni NTG ni SNP mejoraron las lesiones neuronales producidas por la adición de NMDA tras la exposición a DTT (Figuras 6A y 6B). Se añadió el último compuesto para producir reducción química del sitio modulador redox para maximizar la corriente activada por NMDA, respuestas de [Ca^{2+}]_{i}, y neurotoxicidad (según se describe en la literatura). El hecho de que una concentración efectiva supramaximal del antagonista específico del receptor NMDA APV (2 mM) en combinación con NTG no evitara la muerte de las células neuronales en un mayor grado que solo con APV sugiere que los efectos letales se mediaron a través del receptor NMDA (Figura 6B). Además, la exposición a 500 \muM de hemoglobina reducida (Hb), que compleja NO, no afectó a su propia supervivencia neuronal bajo estas condiciones; sin embargo, Hb inhibió completamente el efecto de 100 \muM de NTG, lo cual significa que la acción protectora estaba mediada por NO (Figura 6C). Hb reducida (500 \muM) también inhibió por completo la acción protectora de 400 \muM de SNP, sugiriendo una vez más la implicación de NO (Figura 6D). Es probable que al menos una parte del efecto neuroprotector de NO se derive de la oxidación del sitio modulador redox, puesto que anteriormente se ha demostrado que esta acción atenúa la neurotoxicidad mediada por el receptor NMDA.

Ejemplo 7

Superóxido dismutasa (SOD) más catalasa pueden evitar la neurotoxicidad mediada por peroxinitrito (ONOO^{-}) formado a partir de la reacción de óxido nítrico (NO\bullet) con anión superóxido (O\bullet_{2}^{-})

Se añadió S-nitrosocisteína como fuente de NO\bullet a cultivos cerebrocorticales (Lei et al., (1992) Neuron 8:1087-1099; Stamler et al., (1992) Science 258:1898-1902). La incubación de este compuesto de S-nitrosotiol (RS-NO) produjo la eliminación dependiente de la dosis de las neuronas corticales. El efecto neurotóxico de concentraciones letales maximales de S-nitrosocisteína (200 \muM) puede evitarse mediante la adición simultánea de SOD y catalasa (50 U/ml cada uno) (Fig. 7A). Estos descubrimientos concuerdan con la rápida liberación de NO\bullet (t_{1/2 \ (pH \ 7,4)} de S-nitrosocisteína - 30 s) para la reacción con O_{2}\bullet^{-} endógeno para formar peroxinitrito (ONOO^{-}) con los posteriores daños neuronales.

Para comprobar si es en efecto el peroxinitrito (y/o sus productos de descomposición) lo que es neurotóxico, demostramos a continuación que OONO- purificado mata neuronas de forma dependiente de la dosis. El peroxinitrito conduce a la peroxidación de lípidos y a la oxidación masiva de sulfhidrilos (Radi et al., (1991) J. Biol. Chem. 266:4244-4250; Radi et al., (1991) Arch. Biochem. Biophys. 288:481-487). Además, como se predijo si OONO^{-} y/o sus productos de descomposición eran neurotóxicos, la reacción con SOD (Ischiropoulos et al., (1992) Arch. Biochem. Biophys. 298(2):431-436) y catalasa no evitó la acción letal del peroxinitrito en las neuronas (Fig. 7B). Estos experimentos indican que SOD y catalasa pueden ser útiles agentes neuroprotectores complementarios que pueden administrarse con los compuestos nitrosos, tales como NTG y SNP, para evitar la neurotoxicidad mediada por el receptor NMDA, puesto que SOD más catalasa evitarían la formación de ONOO^{-} neurotóxico a partir de cualquier NO. que pudiera formarse por la adición de compuestos nitrosos exógenos.

Los resultados de los experimentos anteriores según se muestran en la Fig. 7, ilustran el requisito de anión superóxido de neurotoxicidad inducida por S-nitrosocisteína (SNOC) pero no peroxinitrito (ONOO^{-} A, B, Superóxido dismutasa (SOD, 50 U/mi) más catalasa (cat, 50 U/mi) evitó la neurotoxicidad inducida por SNOC (200 \muM, B). La supervivencia neuronal no resultó significativamente afectada en presencia de SOD/catalasa solo comparada con la observada en cultivos de control hermanos. Como un control adicional, 200 \muM de SNOC incubado a temperatura ambiente durante varios días, para liberar todas las especies NO, no tuvo como resultado la neurotoxicidad (A, columnas de la izquierta, etiquetadas "SNOC antiguo". Los valores se expresan como +s.e.m. medios (n = 9). Se realizaron comparaciones estadísticas mediante un análisis de varianza seguido por una comparación múltiple de medias de Scheffé (*, P < 0,01 comparado con el control; **, P < 0,05 comparado con el control; \dagger, P < 0,01 en comparación con el compuesto nitroso + SOD/catalasa).

Específicamente, los datos de la Fig. 7 se generaron usando cultivos neuronales mixtos y cultivos gliales corticales de ratas neonatales, según se ha descrito anteriormente (Lei, et al., (1992) Neuron 8:1087-1099). En al menos tres experimentos diferentes, se incubaron cultivos triplicados durante la noche en solución salina tamponada de Earle (EBSS) que contenía diversas concentraciones de SNOC, peroxinitrito, SOD, catalasa o glutamato. Sin embargo, se obtuvieron resultados similares con incubaciones de 20 min. en peroxinitrito, que concuerdan con los rápidos efectos conocidos de este potente agente oxidante. El fluido de cultivo se ensayó para detectar lactasa deshidrogenasa (LDH) como un indicador de la supervivencia neuronal midiendo la absorbancia a 450 nm (Koh et al., (1987) J. Neurosci. Meth. 20:83-90). También se puntuaron los cultivos según la viabilidad neuronal mediante recuento de células, generalmente con 0,2% de azul tripán, tras la fijación en 2,5% de glutaraldehído, tal y como se ha descrito anteriormente. Las neuronas de cultivos crecidos en placas de 15 mm diámetro se contaron de forma enmascarada en campos microscópicos de -30 a 200x. Los cultivos de control puntuados de este modo contenían típicamente, aproximadamente 1.000 neuronas viables. En el intervalo de valores aquí ilustrados, no se produjo una relación lineal entre los recuentos de células neuronales y los resultados de viabilidad de LDH, según determinó una curva estándar basada en experimentos con concentraciones diferentes de glutamato (0-1 mM). En los ensayos con LDH, la supervivencia neuronal se normalizó a la observada en cultivos de control hermanos (valor de viabilidad del 100%) y en presencia de 1 mM de glutamato (valor de viabilidad de 0%): se obtuvieron valores ligeramente inferiores a 0% por extrapolación, pero no fueron significativamente diferentes de 0%. Experimentos similares de astrocitos purificados (sin neuronas) no produjeron cambios en LDH.

Terapia

Para evitar daños neuronales, pueden administrarse compuestos de la invención en cualquier número de vías en una cantidad suficiente para atenuar una corriente fónica evocada por NMDA o un aumento de [Ca^{2+}]_{i}, o neurotoxicidad. El compuesto puede incluirse en un preparado farmacéutico, utilizando un vehículo farmacéutico (por ejemplo salino fisiológico); la formulación exacta de la mezcla terapéutica depende de la vía de administración. Preferiblemente, el compuesto se administra por vía oral o intravenosa, aunque también puede administrarse por vía sublingual, mediante spray nasal, con parche transdérmico, por vía subcutánea, intraventricularmente, intravitrealmente o mediante ungüento.

Los compuestos nitrosos usados en la invención, determinados como agentes neuroprotectores eficaces por los ensayos descritos en la presente memoria, deben administrarse como se ha indicado anteriormente, con una dosis adecuada para reducir los daños neuronales o corrientes iónicas evocadas por NMDA o mayor [Ca^{2+}]_{i}. Generalmente, dichos compuestos se administran en dosis que oscilan entre 0,01 mg y 60 mg/día, más preferiblemente en dosis de 0,1-5 mg/día.

Los expertos en la técnica comprenderán que existen otros factores que ayudan a determinar la posología óptima. Por ejemplo, en el caso de fármacos conjugados NO, la posología usada para el fármaco no conjugado (por ej., TPA una posología de 0,35-1,08 mg/kg y generalmente \leq 0,85 mg/kg) es predictivo de una posología conjugada con NO. Las dosis pueden dividirse. El tratamiento puede repetirse según sea necesario para prevenir o aliviar lesiones neurológicas. Es deseable mantener niveles de NO o de especies redox relacionadas en el cerebro de 1 nM a
500 \muM.

Para los propósitos protectores CNS descritos en la presente memoria, pueden administrarse de forma aguda compuestos nitrosos junto con agentes que aumentan la presión sanguínea (por ej., dopamina) para evitar una caída de la presión sanguínea sistémica.

Los compuestos usados en la invención pueden utilizarse como protección contra una serie de alteraciones neurotóxicas asociadas con niveles elevados o efectos de glutamato o compuestos relacionados. Dichas alteraciones están mediadas por la estimulación de receptores NMDA o por efectos aguas abajo de la sobreestimulación del receptor NMDA. Dichas alteraciones incluyen isquemia, hipoxia, hipoglicemia, trauma en el sistema nervioso, epilepsia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedad de Parkingson y otras enfermedades neurodegenerativas. También pueden tratarse alteraciones químicas congénitas o adquiridas mediadas al menos en parte por la activación del receptor NMDA. Estas incluyen hiperamonemia, encefalopatía hepática, hiperglicinemia y otras. Véase las Tablas 1 y 2. Estas incluyen hiperamonemia, encefalopatía hepática, hiperglicinemia y otras (véanse Tablas 1 y 2). Síndromes de dolor neuropático tales como causalgia también pueden mediarse de este modo y pueden ser tratadas con compuestos de la invención. Los compuestos usados en la invención se prefieren especialmente para el tratamiento del complejo de demencia del SIDA (complejo cognitivo/motor asociado al VIH más formas incipientes de déficits cognitivos, motores y sensoriales que no cumplen los estrictos criterios de dichos complejos) y otras manifestaciones neurológicas del virus del SIDA (VIH-1 o VIH-2). Los compuestos también pueden usarse para la reducción de daños neuronales que son resultado de la infección de otros virus, tales como sarampión, que provocan daños al sistema nervioso. Pueden tratarse otras enfermedades indicadas anteriormente.

Un aspecto de la invención incorpora el uso de los compuestos descritos anteriormente en la fabricación de un medicamento para la administración prolongada de dosis progresivas de compuestos generadores de NO para establecer tolerancia de los efectos vasculares (dilatación de arterias coronarias, caída de la presión sanguínea, etc.) permitiendo dosis más elevadas de los compuestos para la neuroprotección. Una forma particular de lograr este objetivo es administrar transdérmicamente el compuesto generador de NO usando una técnica de parche transdérmico bien establecida. Los parches transdérmicos de nitroglicerina actuales proporcionan alrededor de 0,2-0,8 mg/hr. Poseen un área superficial típica de 10-30 cm^{2}. El protocolo estándar para usar dichos parches limita su uso a alrededor de 12 horas continuadas para evitar la tolerancia sistémica.

Para establecer tolerancia sistémica y aumentar así los niveles generadores de NO disponibles para neuroprotección, el paciente se inicia en un régimen de terapia simiar al usado actualmente para enfermedades cardíacas (por ej., parche cargado con alrededor de 2-4 mg de nitroglicerina que debe usarse durante alrededor de 10 horas, o alrededor de 0,2-0,4 mg/hr). Este régimen se sigue de forma continuada, sin que se produzcan interrupciones sustanciales (no más de 4-6 horas) Gradualmente, (por ej., pasado un día) se aumenta la dosis, y se monitoriza la presión sanguínea para comprobar que se ha logrado la tolerancia sistémica. La tasa de aumento dependerá del paciente, pero generalmente implica duplicar la dosis cada 24 horas durante un periodo de 2-3 días. Normalmente, se alcanzan niveles de alrededor de 3-4 mg/hr, aunque la posología puede ser tan elevada como 2,5 mg/hr. Puede aumentarse la posología aumentando la carga de los parches existentes, aumentando el área superficial de parches cargados de forma similar, o aumentando la eficiencia de la permeabilidad y la frecuencia de readministración de los parches. Los expertos en la técnica apreciarán que existen muchas formas diferentes para conseguir el objetivo de tolerancia sistémica. En un método específico, pueden usarse parches codificados por colores para reducir la posibilidad de error (por ej., rojo, luego blanco, luego azul). Los colores significan la secuencia de uso de los parches respectivos.

Otros modos de aplicación

Los compuestos usados en la invención son útiles para reducir las lesiones neuronales en mamíferos con receptores NMDA. El tratamiento de lesiones neuronales en humanos es la utilidad preferida; aunque los compuestos también puede emplearse con éxito con objetivos veterinarios. El compuesto generador de NO puede coadministrarse con otros compuestos redox para controlar los daños relacionados con superóxido (O_{2}\bullet^{-}). Se sabe que el óxido nítrico (NO\bullet) reacciona con O_{2}\bullet^{-} para formar peroxinitrito (ONOO^{-}) que hemos demostrado es tóxico para las neuronas (véase Fig. 7, anterior). El superóxido dismutasa (SOD) más catalasa disminuye el O_{2}\bullet^{-} disponible para esta reacción y por lo tanto pueden mejorar la neuroprotección permitiendo que predomine la reacción de nitrosación de NO (transferencia de equivalentes NO+ a grupos tiol) para proporcionar protección regulando el sitio modulador redox del receptor NMDA. SOD más catalasa, o compuestos de acción similar, puede administrarse con polietilenglicol para mejorar su absorción en el CNS y su eficacia (Liu et al.,(1989) Am. J. Physiol. 256:589-593. Un símil de SOD, el polisacárido unido a proteína del Coriolus versicolor QUEL, llamado "PS-K", también puede ser eficaz por la vía de administración parenteral u oral, especialmente con PEG para mejorar la absorción de CNS. PQQ (pirroloquinolina quinona - - véase patente estadounidense 5.091.391.

Los ésteres derivados de PQQ u otras quinonas tales como ubiquinona) también pueden ser útiles para aceptar un electrón de NO\bullet o de de O_{2}\bullet^{-} para iniciar la reacción hacia la nitrosación con especies equivalentes de NO+ y así hacia la neuroprotección.

De forma similar, otros agentes útiles ya sea por sí solos o como agentes complementarios (que deben administrarse con compuestos nitrosos) limitarían la producción de NO\bullet (por ej., inhibidores del óxido nítrico sintasa (NOS)). Dicho tratamiento evitaría la formación de peroxinitrito (ONOO^{-}) y por lo tanto las lesiones neuronales, por ej., contribución al complejo de demencia del SIDA y otras manifestaciones neurológicas del SIDA. Dichos agentes se enumeran en la Tabla 3 (adjunta).

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TABLA 1 Enfermedades neurológicas agudas con daños neuronales que se consideran mediadas al menos en parte por aminoácidos excitatorios*

1

TABLA 2 Enfermedades neurodegenerativas crónicas con daños neuronales consideradas o propuestas como mediadas al menos en parte por aminoácidos excitatorios*

3

TABLA 3 Inhibidores de óxido nítrico sintasa

4

Claims

1. El uso de un compuesto nitroso que genera óxido nítrico o una especie redox relacionada de óxido nítrico, o una sal fisiológicamente aceptable de dicho compuesto, en una concentración eficaz para provocar neuroprotección, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de los daños neuronales mediados por el complejo receptor NMDA en mamíferos, siempre que dicho compuesto no sea nitroglicerina, nitroprusida o derivados de nitroglicerina seleccionados del grupo formado por mononitrato de isosorbida, dinitrato de isosorbida, nitroglicerina sublingual, NT-1, Nitrocor, Nitroderm, Nitrodisc, Nitro-dur, Nitro-Dur II, Nitrofilm, Nitrogard, Nitroglin, Nitropen, Tridil y 6-cloro-2-piridilmetil nitrato.

2. El uso según se especifica en la Reivindicación 1, en donde dicho medicamento sirve para el tratamiento de un humano infectado con un virus, preferiblemente sarampión o el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que infecta el sistema nervioso.

3. El uso según se especifica en la Reivindicación 2, en donde dicho humano manifiesta síntomas del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), o complejo asociado con el SIDA.

4. El uso según se especifica en la Reivindicación 1, en donde dicho medicamento sirve para el tratamiento de un mamífero que sufre un trastorno agudo consistente en hipoxia, anoxia, envenenamiento por monóxido de carbono, isquemia, trauma CNS, hipoglicemia, convulsiones, apoplejía, envenenamiento por ácido domoico, o envenenamiento por plomo.

5. El uso según se especifica en la Reivindicación 1, en donde dicho medicamento sirve para el tratamiento de un mamífero que sufre una enfermedad neurodegenerativa.

6. El uso según se especifica en la Reivindicación 5, en donde dicha enfermedad neurodegenerativa puede ser enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS o enfermedad de las neuronas motoras), enfermedad de Parkinson, neurolatirismo, enfermedad de Guam, atrofia olivopontocerebelar, encefalopatía hepática, síndrome de Tourette, síndrome MELAS (miopatía mitocondrial, encefalopatía, acidosis láctica, y episodios similares a apoplejía), síndrome de Rett, homocisteinuria, hiperprolinemia, hiperglicinemia, aminoaciduria hidroxibutírica y deficiencia de sulfito oxidasa.

7. El uso según se especifica en la Reivindicación 1, en donde dicho medicamento sirve para el tratamiento de un mamífero que sufre un síndrome de dolor de origen nervioso, preferiblemente síndromes de dolor neuropático, causalgia o formas dolorosas de neuropatía periférica.

8. El uso según se especifica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho compuesto se selecciona de:

a.: S-nitrosocaptoprilo (Snocap);

b.: Albúmina de suero acoplada a óxido nítrico ("SA-NO");

c.: Catepsina acoplada a óxido nítrico (catepsina - NO);

d.: Activador del plasminógeno de los tejidos acoplados a NO (TPA-NO);

e.: SIN-1 (o molsidomina);

f.: complejos de catión nitrosilo, preferiblemente complejos Fe^{2+} -nitrosilo;

g.: Nicorandilo; y

h.: S-nitrosoglutatión.

9. El uso según se especifica en la Reivindicación 1, en donde dicho compuesto es NO acoplado a un derivado adamantino, preferiblemente memantina; un S-nitrosotiol, preferiblemente S-nitrosocisteína; o una sidnonimina o un nonoato con la fórmula

X ---

\delm{N}{\delm{\para}{\delm{N}{\delm{\dpara}{O \cdot }}}}

--- O^{-},

donde X es cualquier nucleófilo, preferiblemente una amina.

10. El uso según se especifica en la Reivindicación 1, en donde dicho compuesto nitroso se selecciona de dichos compuestos que ejercen una reducción de la presión sanguínea tras su administración inicial a un mamífero, y en donde dicho tratamiento implica la administración con el tiempo de dosis incrementadas, reduciendo el efecto de dicho compuesto sobre la presión sanguínea.

11. El uso según se especifica en la Reivindicación 1, en donde dicho medicamento comprende dicho compuesto nitroso en combinación con un fármaco, preferiblemente dopamina, que aumenta la presión sanguínea sistémica.

12. El uso según se especifica en la Reivindicación 1, mediante administración continuada de dicho compuesto nitroso durante un periodo prolongado, preferiblemente superior a 12 horas y prefiriéndose aún más superior a 24 horas, escalando gradualmente la dosis para establecer tolerancia sistémica de dicho compuesto comenzando en un primer nivel de dosis que no reduce sustancialmente la presión sanguínea del paciente y aumentando hasta un nivel final, siendo dicho nivel final lo suficientemente elevado como para reducir sustancialmente la presión sanguínea de dicho paciente si se administra a un paciente sin tratamiento previo, pero que no es adecuada para reducir sustancialmente la presión sanguínea de dicho paciente tras recibir dicha administración continuada durante un periodo prolongado.

13. El uso según se especifica en la Reivindicación 12, en donde dicho compuesto se administra en múltiples dosis progresivamente más elevadas hasta que se logra la dosis final, y a continuación dicho compuesto se administra en dosis múltiples en dicho nivel de dosis final.

14. El uso según se especifica en la Reivindicación 12, en donde dicho compuesto se administra oralmente o con parche transdérmico.

15. El uso según se especifica en cualquiera de las Reivindicaciones 1-7, en donde dicho medicamento comprende además un componente seleccionado de superóxido dismutasa (SOD); un símil de SOD incluido PS-K; catalasa; y combinaciones de al menos dos ingredientes, siendo dicho primer ingrediente SOD o siendo dicho símil y dicho segundo ingrediente catalasa.

16. El uso según se especifica en la Reivindicación 15, donde dicho componente se ha formulado en polietilenglicol o liposomas para mejorar la absorción y eficacia del sistema nervioso central (SNC).

17. El uso según se especifica en cualquiera de las Reivindicaciones 1-7, en donde dicho medicamento comprende además un inhibidor de óxido nitrico sintasa.

18. El uso según se especifica en cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 13, 15, 16 ó 17, en donde dicho medicamento se ha formulado para ser administrado intravitrealmente.

19. El uso según se especifica en la Reivindicación 18, en donde dicho medicamento sirve para el tratamiento de glaucoma o isquemia retinal.