JPH08208511A

JPH08208511A - 抗運動ニューロン疾患剤

Info

Publication number: JPH08208511A
Application number: JP7036211A
Authority: JP
Inventors: Masao Kinoshita; 真男木下; Yasuo Iwasaki; 泰雄岩崎; Ken Ikeda; 憲池田; Toshiya Shiojima; 俊也塩島; Nozomi Tagaya; 望多賀谷; Tomoko Kobayashi; 朋子小林
Original assignee: SAMU KENKYUSHO KK
Current assignee: SAMU KENKYUSHO KK
Priority date: 1995-01-31
Filing date: 1995-01-31
Publication date: 1996-08-13
Also published as: CA2155043A1; US5762929A

Abstract

(57)【要約】【構成】次の一般式で示される化学的橋かけを介して
レシチンに結合したスーパーオキシドジスムターゼ（Ｐ
Ｃ−ＳＯＤ）を有効成分として含有する抗運動ニューロ
ン疾患剤。 SOD-[C(O)-(CH₂)_n-C(O)-X]_m 式中、ＳＯＤはスーパオキシドジスムターゼを、Ｘはグ
リセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンの、そ
の２位の水酸基の水素原子を除いた残基を示す。【効果】経口あるいは非経口投与によって筋萎縮性側
索硬化症等の抗運動ニューロン疾患を改善することがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、レシチン化スーパーオ
キシドジスムターゼの新規な医薬用途に関する。更に詳
細には、レシチン化スーパーオキシドジスムターゼを有
効成分とする抗運動ニューロン疾患剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】スーパーオキシドジスムターゼ（以下、
ＳＯＤと略記することもある。）は、動物、植物、微生
物などの生体内に広く分布し、反応性に富む活性酸素で
あるスーパーオキシドアニオンラジカルを分解する酵素
として知られている。薬物の面では、抗リウマチ剤、心
筋梗塞または臓器移植の際の使用、抗血栓剤の使用後に
生じるラジカルの除去など種々の炎症への適用が期待さ
れている。また、最近では胃粘膜障害への適用も検討さ
れ、その効果が期待されている（過酸化脂質研究、16
巻、74頁（1992年))。

【０００３】ＳＯＤを静脈内投与した場合、細胞親和性
が低く、かつその血中半減期は僅か４〜６分とされてお
り、ＳＯＤは速やかに尿中に排泄される。ＳＯＤの血中
半減期を増大させるために、ＳＯＤをフィコール、ポリ
エチレングリコール、ラットアルブミン、デキストラン
等で修飾し、巨大分子化させることが試みられてきた。
しかし、フィコールまたはポリエチレングリコールで修
飾されたＳＯＤはＳＯＤの酵素活性が大幅に低下しかつ
細胞親和性が低いこと、またラットアルブミンで修飾さ
れたＳＯＤには抗原性があることが報告されている。ま
た、デキストランによる修飾では、ＳＯＤの抗炎症作用
の増強が認められるが、免疫原性を抑制する効果は認め
られていない。近年、ＳＯＤのような生物活性蛋白をレ
シチン（ホスファチジルコリン。以下ＰＣと略記するこ
ともある。）で化学修飾した物質が報告されている。こ
のＰＣ結合修飾生物活性蛋白は、細胞親和性が著しく上
昇し、また生物体内分布も著しく異なることが記載され
ている。また、生物活性蛋白の薬理活性の強化、副作用
の低下、吸収促進が期待できると記載されている。また
ＰＣ化ＳＯＤ（以下ＰＣ−ＳＯＤと略記することもあ
る）が火傷による炎症の治療を促進する効果を示すこと
が記載されている（特開平3-163100号公報；特開平3-17
0438号公報；米国特許第5,109,118 号明細書) 。更に、
抗原性等の副作用もなく、抗炎症剤として有用であると
いわれている。特開平6-54681 号公報には、Forssman抗
血清による呼吸抵抗に対する効果が挙げられている。ま
た、ＰＣ−ＳＯＤの潰瘍性胃腸障害に対する効果も報告
されている。

【０００４】近年、銅及び亜鉛が配位したＳＯＤ（以
下、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤと略記することがある。）が、
フリーラジカルによって誘発される神経障害をin vitro
(Lipton S.A.ら、Nature, 364 巻, 626-632 頁 (1993
年))およびin vivo(Cadet J.L.ら、J. Neurochem. 62
巻, 380-383 頁 (1994年); Epstein C.J. ら、Springer
-Verlag, 106-117頁,(1992年); Muizelaar J.P. ら、J.
Neurosurg. 78 巻,375-382頁(1993年))で抑制すること
が報告されている。また、近年、家族性の筋萎縮性側索
硬化症（ルーゲィリック病。以下、筋萎縮性側索硬化症
をＡＬＳと略記することもある）患者でＣｕ／ＺｎＳ
ＯＤに変異が見つかった（Rosen D.R.ら、Nature, 362
巻, 59-62 頁 (1993年))。また、家族性もしくは散発性
のＡＬＳにおいては、過剰な酸化、Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ
活性の低下、酸化による蛋白質の障害がみられることも
報告されている（Bowling A.C.ら、J. Neurochem. 61
巻, 2322-2325 頁 (1993年); Robberecht W.ら、J.Neur
ochem.62巻, 384-387 頁 (1994年))。ＡＬＳは、運動ニ
ューロンの選択的変性が見られる、いわゆる運動ニュー
ロン疾患の代表的疾患である。

【０００５】運動ニューロン疾患は、随意運動神経系の
みが選択的に侵される疾患群の総称であり、知覚、感
覚、自律神経は健在で、他の内臓系統も侵されない。運
動ニューロン疾患は神経性の退行疾患で疾病により進行
度は異なるものの増悪する傾向が強く、運動ニューロン
疾患のいずれの疾患も現在のところ根治療法は見い出せ
ていない。代表的なＡＬＳは、中年以後に発病、四肢遠
位筋の筋萎縮に始まり、数年間で全身に及び球麻痺にま
で至る進行性疾患であるが、眼輪筋、尿道括約筋が最後
まで侵されないのが特徴とされている。予後は極めて不
良で、現在のところ治療法はなく５年以内に球麻痺症状
の悪化によって死亡する。現在では人工呼吸器による延
命が可能になってきてはいるものの根本的な治療法とは
言えず、この疾患に対する医薬品が望まれていた。ＷＯ
９４／０６４２８号公報およびＷＯ９４／１９４９３号
公報にはＳＯＤの、ＡＬＳ等の疾患への医薬用途に関す
る記載がある。ＷＯ９４／０６４２８号公報は、培養神
経細胞を用いた実験の結果に基づくものであり、またＷ
Ｏ９４／１９４９３号公報は、ＳＯＤの変異が家族性Ａ
ＬＳの原因であるとの結果に基づきＳＯＤポリペプチド
の使用が記載されているものである。しかし、いずれも
モデル動物等を用いた in vivo実験でのＳＯＤのＡＬＳ
等への薬理効果は確認されておらず、さらに実際に投与
した場合、半減期が短く、十分な薬理効果が期待できな
いことから、抗ＡＬＳ剤等の抗運動ニューロン疾患剤と
しての利用には大きな隔たりがあった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、ＰＣ−ＳＯＤを抗運動ニューロ
ン疾患剤として利用することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために、運動ニューロン疾患のモデル動物であ
る wobblerマウス(Ikeda K. ら、Ann. Neurol. 34 巻,3
04頁 (1993年); Mitsumoto H. ら、Ann. Neurol.36巻,
142-148 頁 (1994年); Mitsumoto H. ら、Science, 265
巻, 1107-1110 頁 (1994年))を用いてＰＣ−ＳＯＤの投
与を試み、その結果運動ニューロン疾患症状を改善する
ことを見いだし、本発明を完成した。

【０００８】すなわち本発明は、ＰＣ−ＳＯＤを有効成
分とする抗運動ニューロン疾患剤に関するものである。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。〈１〉本発明に用いるＰＣ−ＳＯＤ本明細書において、「レシチン」という用語には、リゾ
レシチンも包含される。本発明の薬剤の有効成分である
ＰＣ−ＳＯＤは、通常、リゾレシチンの残基に化学的橋
かけ剤を結合させたレシチン誘導体を、ＳＯＤに１個以
上結合させて得ることができる。このＰＣ−ＳＯＤは次
式（１）で示される。 SOD-[C(O)-(CH₂)_n-C(O)-X]_m ・・・（１）前記式（１）中のＸは、下記式（２）で表されるグリセ
ロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンの、その２
位の水酸基の水素原子を除いた残基である。 -O-CH(CH₂OR)[CH₂OP(O)(O^-)(OCH₂CH₂N⁺(CH₃)₃) ］・・・（２）

【００１０】上記式（２）において、Ｒは脂肪酸残基
（アシル基）であり、特に炭素数８〜３０の飽和または
不飽和の脂肪酸残基が好ましく、より好ましいＲはミリ
ストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、その他
の炭素数１４〜２２の飽和脂肪酸残基であり、特に好ま
しいのは炭素数１４の飽和脂肪酸残基であるパルミトイ
ル基である。

【００１１】前記式（１）中、 -C(O)-(CH₂)_n-C(O)-
は、化学的橋かけ剤の残基を表す。この化学的橋かけ剤
の残基は、 HO-C(O)-(CH₂)_n-C(O)-OHで表される直鎖状
ジカルボン酸、およびその無水物、そのエステル、その
ハロゲン化物、その他のそのジカルボン酸の反応性誘導
体からなる化学的橋かけ剤の両水酸基（反応性誘導体の
場合はジカルボン酸の水酸基に対応する部分）を除いた
残基である。これはＳＯＤとレシチンとを結合させてい
るもので、本明細書ではこのようなものを総称して化学
的橋かけという。前記式（１）中の化学的橋かけは、上
記リゾレシチン残基と一端でエステル結合で結合してい
る。またこの化学的橋かけの他端は、ＳＯＤのアミノ基
とアミド結合などにより直接結合していると考えられ
る。この式において-(CH₂)_n- は直鎖状アルカンの両端
の炭素原子から１個ずつ水素原子を除いてできる２価基
である。ｎは２以上の整数であり、好ましいｎは２〜１
０であり、特に好ましいｎは３である。また前記式
（１）中のｍは、化学的橋かけを介してＳＯＤ１分子に
結合したレシチンの平均個数を示している。ｍは１以上
の整数であり、ｍが平均１〜１６のものが好ましく、特
に好ましいのはｍが平均４のものである。

【００１２】前記式（１）で表されるＳＯＤは特に限定
されるものではないが、医薬品としてヒトに使用するこ
とから、抗原性の問題からみてヒト由来のものが好まし
く、ヒト由来のＣｕ／ＺｎＳＯＤ（以下、ヒトＣｕ／
ＺｎＳＯＤと略記することもある。）が最も好まし
い。ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤとしては、ヒト組織から製
造された天然のヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ、遺伝子工学的
手法により製造された、天然のヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ
と実質上同一のアミノ酸配列を有する組換えヒトＣｕ／
ＺｎＳＯＤなどがあり、いずれを用いてもよい。また
天然のヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤの１１１位のアミノ酸は
システインであるが、部位特異的変異法により１１１位
をセリンに変換したヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ（特開昭62
-130684 号公報）や、化学的に１１１位のシステインを
修飾したヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ（特開平6-199895号公
報）が報告されており、いずれを用いてもよいが、電荷
的及び分子量的に均一でかつＳＯＤ活性が安定である、
111位のシステインを化学修飾して、例えばＳ−（２−
ヒドロキシエチルチオ）システインとしたヒトＣｕ／Ｚ
ｎＳＯＤを用いることが好ましい。

【００１３】レシチン誘導体のＳＯＤへの結合は、具体
的には特開平６−５４６８１号公報に記載された方法に
基づいておこなうことができ、これによりＰＣ−ＳＯＤ
が製造される。詳細は製造例に記す。

【００１４】〈２〉本発明の薬剤上記のようなＰＣ−ＳＯＤは、抗運動ニューロン疾患剤
として広く利用できる。本発明の抗運動ニューロン疾患
剤の適応症としては、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、
脊髄性進行性筋萎縮症、家族性痙性麻痺、シャルコー・
マリー足、進行性球麻痺、若年性一側上肢筋萎縮症（平
山病）等を挙げることができ、特に好ましい適応症はＡ
ＬＳである。本発明の抗運動ニューロン疾患剤は、含有
するＰＣ−ＳＯＤの働きでこれらの疾患並びに症状に対
して改善作用を有する。

【００１５】本発明の薬剤は、注射（筋肉内、皮下、皮
内、静脈内等）、経口、吸入等、投与方法によって、経
口あるいは非経口的に投与することができる。薬剤は投
与方法に応じ適宜製剤化することができる。剤形として
は、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤
等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化
剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、坐剤等
が挙げられる。製剤調製に当たり、慣用の賦形剤、結合
剤、滑沢剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用い
られる成分を使用することができる。また本発明の薬剤
においては、ＰＣ−ＳＯＤと共に、ＰＣ−ＳＯＤの活性
に影響を与えない範囲でこれ以外の抗運動ニューロン疾
患成分等を併用することもできる。

【００１６】本発明の抗運動ニューロン疾患剤の有効投
与量は、本発明の実施例のwobblerマウスにおける有効
量から、臨床量として１００Ｕ／ｋｇ〜１００００Ｕ／
ｋｇが一つの目安となるだろうが、疾患の程度、患者の
体重などにより変化するためそれに限定されることはな
い。なお本明細書中で１Ｕ（ユニット）とは、ｐＨ7.8
、３０℃下でチトクロームｃ法（キサンチン−キサン
チンオキシダーゼ−チトクロームｃ系）により測定し
た、チトクロームｃの還元速度を５０％阻害するＰＣ−
ＳＯＤの酵素量を表す。

【００１７】以下に、本発明の薬剤の有効成分であるＰ
Ｃ−ＳＯＤの製造例および実施例により本発明を具体的
に説明する。しかし、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。

【００１８】

【製造例】

〈１〉ヒトＣｕ／ＺｎＳＯＤ誘導体（銅及び亜鉛が配
位した、111 位のアミノ酸がＳ−（２−ヒドロキシエチ
ルチオ）システインで示されるヒト型スーパーオキシド
ジスムターゼ）の調製該ＳＯＤは、特開平6-199895号公報に記載された方法で
調製した。具体的には次の通り行った。大腸菌５４５π
ＨＲ（ｐＨＴ３５１）（微工研菌寄第９４３５号）を培
養し、得られた培養菌体を破砕し、ヒトＳＯＤの粗抽出
液を得た。この粗抽出液を硫安沈澱、Ｑ−セファロース
ＦＦ（ファルマシア社製）カラム、硫安沈澱の順で精製
し、０．２μｍフィルターで濾過した濾液を凍結乾燥し
て無色の固体（組換えヒトアポＳＯＤ）を得た。この組
換えヒトアポＳＯＤを１０ｍＭトリエタノールアミン緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ビス（２−ヒドロキシエ
チル）ジスルフィドを加えて、ｐＨを７．０に再調整し
た後、４℃で２４時間攪拌した。これにＮａＣｌ、２Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）及び０．１ＭＣｕＣｌ₂水
溶液を加え、４℃で１３時間攪拌した。攪拌後ｐＨを
７．０に調整し、硫安沈澱（４℃、１００％飽和）で生
じた沈澱を集めた。この沈澱を１０ｍＭトリエタノール
アミン緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析して
脱塩した。この画分をＱ−セファロースＦＦ（ファルマ
シア社製）カラムに通し、ＮａＣｌ濃度を５ｍＭ、１０
ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭの順に段階的に上昇させて展
開し、ＳＯＤ画分を集めた。このＳＯＤ画分を硫安沈澱
（４℃、１００％飽和）し、生じた沈澱を集めた。この
沈澱を水溶液とし、０．５ＭＮａＣｌ水溶液に対して
透析し、次いで水に対して透析し、凍結乾燥してヒトＳ
ＯＤ誘導体を得た。このヒトＳＯＤ誘導体の111 位のア
ミノ酸はＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システイン
となっている。

【００１９】〈２〉ＰＣ−ＳＯＤの調製ＰＣ−ＳＯＤは、特開平6-54681 号公報に記載された方
法により調製した。具体的には次の方法で調製した。（１）２−（４−ヒドロキシカルボニルブチロイル）リ
ゾレシチンの活性エステル体の合成（１−１）２−（４−ヒドロキシカルボニルブチロイ
ル）リゾレシチンの合成グリセロールの２位が水酸基であるリゾレシチンのクロ
ロホルム−ピリジン（８０ｍｌ／２０ｍｌ）懸濁液に、
ＤＭＡＰ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン）、無水グ
ルタル酸を加え、６０℃で１５時間撹拌した。その後反
応液を減圧濃縮し、残渣にクロロホルム：メタノール：
水＝４：５：１を加えて溶解し、同液にて平衡化したイ
オン交換カラム（Dowex 50W-X8, ダウケミカル社) に通
した。ＴＬＣにより目的化合物を分画し、溶媒を減圧濃
縮した後、残渣をＯＤＳ（オクタデシルシラン）を充填
したカラムにより精製して、標記化合物を得た。

【００２０】（１−２）２−（４−ヒドロキシカルボニ
ルブチロイル）リゾレシチンの活性エステル体の合成（１−１）で得られたカルボン酸をジクロロメタンに溶
解させて０℃に冷却し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、テトラゾールをこの順で加えた。次にＤＣＣ（１，
３−ジシクロヘキシルカルボジイミド）をジクロロメタ
ンに溶解した溶液をゆっくり滴下し、室温で１５時間攪
拌した。不溶物をセライトで濾過し、活性エステル体の
ジクロロメタン溶液を得た。

【００２１】（２）ＳＯＤ１分子あたりレシチン誘導体
が平均４個結合したＰＣ−ＳＯＤの合成５０ｍＭほう酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解させた製造
例〈１〉で製造したＳＯＤと、ＳＯＤの全アミノ基に対
して０．８倍モル量の上記（１）で合成した活性エステ
ル体とを次の方法により反応させた。活性エステル体溶
液のジクロロメタンを留去し、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド）に溶解させた。これを５０ｍＭほう酸
緩衝液（ｐＨ８．５）に添加し、不溶物を濾過後同一緩
衝液に溶解して０℃に冷却したＳＯＤ溶液に滴下した。
この時ＳＯＤ溶液にＤＭＦを５０％加えておいた。０℃
で１５時間攪拌後、反応液を濾過し、セファクリルＳ−
３００（ファルマシア社製）を担体としたゲル濾過カラ
ムに付し、反応緩衝液と同一の緩衝液で溶出し、ＰＣ−
ＳＯＤ溶出分画を集め、イオン交換クロマトグラフィー
により精製した。限外濾過により濃縮し、蛋白質濃度を
ローリー法(Lowry, O.h.ら、J. Biol. Chem., 193 巻,
265 頁 (1951年))、ＳＯＤの残存アミノ基をＴＮＢＳ法
（トリニトロベンゼンスルホン酸塩、Goodwin, J. F.
ら、Clin. Chem., 16 巻, 24頁 (1970年))で分析するこ
とにより、ＳＯＤ１分子あたりのレシチン誘導体の結合
数を求めたところ、平均４．０個であった。このＰＣ−
ＳＯＤの性状は青緑色〜緑色の澄明な水溶液であり、ｐ
Ｈは７〜８であった。また、分子量をＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法により調べたところ、ＰＣ−
ＳＯＤサブユニットのモノマー（ＰＣ−ＳＯＤはサブユ
ニットのホモダイマーである）あたり約１８０００であ
った。

【００２２】

【実施例１】前記製造例により調製したＰＣ−ＳＯＤ
（濃度３０ｍｇ／ｍｌ；比活性 3.07×10³Ｕ／蛋白 m
g)について毒性試験および薬効薬理試験を行った。ＰＣ
−ＳＯＤは５％マンニトール水溶液に終濃度５ｍｇ／ｍ
ｌになるように溶解した溶液（以下、ＰＣ−ＳＯＤ溶液
と略記することもある。）を使用した。このＰＣ−ＳＯ
Ｄ溶液の性状は、無色〜淡青緑色の澄明な溶液であり、
ｐＨは６〜８であった。また、生理食塩液に対する浸透
圧比は約１であった。

【００２３】〈急性毒性試験〉（１）ラットを用いた急性毒性試験ＰＣ−ＳＯＤ溶液をＳＤ系ラット雌雄各５匹に尾静脈か
ら１００ｍｇ／ｋｇ投与した。投与後１４日間、一般状
態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。１
５日目に剖検して主要臓器の肉眼的観察を行った。その
結果、死亡した動物は観察されず、一般状態、体重、剖
検所見のいずれにおいても変化は認められなかったこと
から、静脈内投与によるＰＣ−ＳＯＤの致死量は１００
ｍｇ／ｋｇ以上と推定される。

【００２４】（２）サルを用いた急性毒性試験ＰＣ−ＳＯＤ溶液を雌のカニクイザル２頭に四肢の静脈
から１００ｍｇ／ｋｇ投与した。投与後１４日間、一般
状態及び生死についての観察と体重の測定とを行った。
その結果、死亡した動物は観察されず、一般状態、体重
のいずれにおいても変化は認められなかったことから、
静脈内投与によるＰＣ−ＳＯＤの致死量は１００ｍｇ／
ｋｇ以上と推定される。

【００２５】〈薬効薬理試験〉生後３〜４週間目の、運
動ニューロン疾患症状が認められた（前足の萎縮が認め
られた)wobblerマウスを用いて、ＰＣ−ＳＯＤ溶液を毎
日投与するマウス群及びＰＣ−ＳＯＤ溶液を投与しない
マウス群で以下の薬効薬理試験を行った。用いたマウス
群の詳細は以下の通りである。なおマウスは各群とも１
０匹であり、投与はブラインドで行った。 (A) ５％マンニトール水溶液を毎日腹腔内注射するマウ
ス群（以下、無処理群という） (B) ＰＣ−ＳＯＤ溶液を毎日１０⁴Ｕ／ｋｇ腹腔内注射
するマウス群（以下、Ｌ−ＳＯＤ群という） (C) ＰＣ−ＳＯＤ溶液を毎日１０⁵Ｕ／ｋｇ腹腔内注射
するマウス群（以下、Ｈ−ＳＯＤ群という）

【００２６】（１）前足の変形進行の抑制無処理群、Ｌ−ＳＯＤ群およびＨ−ＳＯＤ群のそれぞれ
について、ＰＣ−ＳＯＤ投与開始前、ＰＣ−ＳＯＤ投与
開始後２週間目、ＰＣ−ＳＯＤ投与開始後４週間目に前
足の変形の程度を観察し次の通り段階づけした。なお w
obblerマウスでは、変形は段階１から段階４に向かって
進行する。段階１：足の萎縮が認められる。段階２：足指のねじれが認められる。段階３：足首、足関節のねじれが認められる。段階４：前足が胸側に曲がる。なお、これらの段階の典型例を写真（図８）に示す。

【００２７】統計学的有意性は Wilcoxon rank-sum検定
により解析した。結果を図１に示す。ＰＣ−ＳＯＤ投与
前は、マウス群の間で変形の程度に差異は見られなかっ
たが、ＰＣ−ＳＯＤ投与したＬ−ＳＯＤ群およびＨ−Ｓ
ＯＤ群では、無処理群に比べて変形の進行が有意に抑制
された（２週間目において、Ｌ−ＳＯＤ群はＰ＜０．０
０６、Ｈ−ＳＯＤ群はＰ＜０．００６。４週間目におい
て、Ｌ−ＳＯＤ群はＰ＜０．００４、Ｈ−ＳＯＤ群はＰ
＜０．００３。）。また、Ｌ−ＳＯＤ群に比べてＨ−Ｓ
ＯＤ群の方が変形の進行が抑制されている傾向にあるこ
とから、ＰＣ−ＳＯＤが用量依存性に wobblerマウスの
変形の進行を抑制することが示唆された。

【００２８】（２）握力減少の抑制無処理群、Ｌ−ＳＯＤ群およびＨ−ＳＯＤ群のそれぞれ
について、ＰＣ−ＳＯＤ投与開始前、ＰＣ−ＳＯＤ投与
開始後１週間目、同２週間目、同３週間目、同４週間目
に、前足の最高筋力を測定した。測定は、力量計に接続
した水平ワイヤーゲージにマウスの両前足をつかませ、
マウスを空中に保持することによって行なった。また、
統計学的有意性はpaired Student's t- 検定により解析
した。結果を図２に示す。この結果、Ｌ−ＳＯＤ群およ
びＨ−ＳＯＤ群では無処理群に比べて握力の減少が有意
に抑制された（Ｌ−ＳＯＤ群の２週間目及び３週間目で
はＰ＜０．００２、４週間目ではＰ＜０．００１。Ｈ−
ＳＯＤ群の１週間目及び４週間目ではＰ＜０．００１、
２週間目及び３週間目ではＰ＜０．００３。）。また握
力の減少率（〔（ＰＣ−ＳＯＤ投与開始後４週間目の握
力／ＰＣ−ＳＯＤ投与開始前の握力）−１〕×１００
％）で見ても、無処理群が−78.0±1.8 ％（平均±標準
偏差(S.D.)％）であったのに対してＬ−ＳＯＤ群は−4
6.9±14.8％であり、non-parametric Wilcoxon signed
rank 検定の結果、Ｐ＜０．００６で有意に握力減少が
抑制されていた。またＨ−ＳＯＤ群は−35.6±7.7 ％で
あり同検定の結果Ｐ＜０．００３で有意に握力減少が抑
制されていた。また、ＰＣ−ＳＯＤ投与開始後１週間目
および４週間目においては、Ｌ−ＳＯＤ群に比べてＨ−
ＳＯＤ群の方が有意に握力減少が抑制されていることか
ら（paired Student's t- 検定。１週間目ではＰ＜０．
００７、４週間目ではＰ＜０．０４）、ＰＣ−ＳＯＤが
用量依存性にwobblerマウスの握力減少を抑制すること
が示唆された。

【００２９】（３）二頭筋の重量減少の抑制ＰＣ−ＳＯＤ投与開始後４週間目に、各群１０匹（合計
３０匹）の wobblerマウスおよび５匹の正常な同腹仔を
エーテルで麻酔し、右側の二頭筋を解剖顕微鏡下で摘出
した。摘出した二頭筋は重量を測定し（平均±標準偏差
(S.D.)ｍｇ）、凍結させた。重量の測定結果を図３に示
す。なお、正常な同腹仔の平均二頭筋重量は15.8±0.6
mgである。この結果に基づくpaired Student's t- 検定
の結果、無処理群に比べ、ＰＣ−ＳＯＤ投与により筋重
量が有意に増加すると結論された（Ｌ−ＳＯＤ群ではＰ
＜０．０３、Ｈ−ＳＯＤ群ではＰ＜０．００１）。ま
た、Ｌ−ＳＯＤ群よりもＨ−ＳＯＤ群の方が有意に筋重
量が多かったことから（Ｐ＜０．００６）、ＰＣ−ＳＯ
Ｄが用量依存性に二頭筋重量減少を抑制することが示唆
された。

【００３０】（４）二頭筋の筋線維直径減少の抑制上述の通り凍結させた二頭筋から厚さ１０μｍの連続切
片を得た後、ATPase染色した。正確にATPase繊維のタイ
プを確認するため、ヒラメ筋および長指伸筋も同様に染
色した。二頭筋の全筋線維数は約２０００であり、大部
分はtypeII繊維である。ショートヘッドとロングヘッド
から任意の２領域を選び組織観察に用いた。無処理群と
Ｈ−ＳＯＤ群の５０倍の拡大像を図４に示す。この図か
ら、Ｈ−ＳＯＤ群では無処理群に比較して脱神経的変化
が弱いことが分かる。筋線維の直径はmorphometric sys
tem, Nikon Cosmozone 1S で測定し、平均直径を算出し
た（平均±標準偏差(S.D.)μｍ）。統計学的有意性は、
paired Student's t- 検定により解析した。結果を図５
に示す。なお、正常な同腹仔の平均二頭筋繊維直径は3
7.6±0.9 μｍである。この結果から、無処理群に比べ
てＬ−ＳＯＤ群およびＨ−ＳＯＤ群では有意に筋線維直
径が大きく（いずれもＰ＜０．００１）、またＬ−ＳＯ
Ｄ群に比べてＨ−ＳＯＤ群の方が有意に筋線維直径が大
きかった（Ｐ＜０．０３）。このことから、ＰＣ−ＳＯ
Ｄが用量依存的に筋線維直径減少を抑制することが示唆
された。

【００３１】（５）脊髄の運動ニューロン数計測ＰＣ−ＳＯＤ投与開始後４週間目に、各群１０匹（合計
３０匹）の wobblerマウスおよび５匹の正常な同腹仔を
エーテルで麻酔し、心臓内カテーテルを通してＰＢＳ
（リン酸緩衝溶液）、次いで４％パラホルムアルデヒ
ド、１％グルタルアルデヒド、０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．４）の混合溶液の順で灌流した。椎
弓切除術を行い、解剖顕微鏡下で頸椎脊髄を摘出した。
運動ニューロン数計測のためには、二頭筋の神経支配を
しているＣ₅−₆分節を解析に用いた。これは、 wobbl
erマウスではこの部分で顕著な退縮が起こるからであ
る。この脊髄分節はパラフィン包埋し、厚さ１０μｍの
連続切片を作製し、クレシル−バイオレット(cresyl-vi
olet) で染色した。無処理群とＨ−ＳＯＤ群の５０倍の
拡大像を図６に示す。この図より、無処理群に比べてＨ
−ＳＯＤ群では、運動ニューロンの退化が遅れているの
が分かる。次に、小さなインターニューロンを計測しな
いために、顕著な核小体（仁）を持つ大きな運動ニュー
ロン（２０μｍ以上）の数を、倍率２００倍の顕微鏡下
で５切片ごとに２人の研究者（処理に関してはブライン
ド）が計測し、大きな運動ニューロンの数を決定した
（平均±標準偏差(S.D.)個）。統計学的有意性は、pair
ed Student's t- 検定により解析した。結果を図７に示
す。なお、正常な同腹仔の平均運動ニューロン数は120
1.3±113.8 個である。この結果から、無処理群に比べ
てＬ−ＳＯＤ群およびＨ−ＳＯＤ群の方が有意に運動ニ
ューロン数が多かった（Ｌ−ＳＯＤ群ではＰ＜０．００
１。Ｈ−ＳＯＤ群ではＰ＜０．０００１）。また、Ｌ−
ＳＯＤ群に比べてＨ−ＳＯＤ群の方が有意に運動ニュー
ロン数が多く（Ｐ＜０．０２）、運動ニューロン数はＰ
Ｃ−ＳＯＤの用量に依存して増加することが示唆され
た。このことから、ＰＣ−ＳＯＤが、用量依存的に脊髄
の運動ニューロン数減少を抑制することが示唆された。

【００３２】

【比較例】上記ＰＣ−ＳＯＤの代わりに、製造例〈１〉
により製造したレシチン化していないヒトＣｕ／Ｚｎ
ＳＯＤ誘導体（以下、「フリーのＳＯＤ」と略記す
る。）を用いて、下記（１）〜（４）の項目について、
前記実施例の〈薬効薬理試験〉中の（１）〜（３）及び
（５）に記載されている方法と全く同じ方法で実験を行
った。フリーのＳＯＤは５％マンニトール水溶液に終濃
度５ｍｇ／ｍｌになるように溶解したものを使用し、腹
腔内投与量も前記実施例と同じく、１０⁴Ｕ／ｋｇ投与
群（以下、ＬＦ−ＳＯＤ群と略記する。）および１０⁵
Ｕ／ｋｇ投与群（以下、ＨＦ−ＳＯＤ群と略記する。）
の２群で行った。

【００３３】（１）前足の変形進行フリーのＳＯＤの投与開始後４週間目の、 wobblerマウ
スの前足の変形の程度を段階づけした結果を次に示す。
なおｎはマウスの匹数を表し、数値は各変形段階のマウ
スの匹数の割合を表す。ＬＦ−ＳＯＤ群（ｎ＝１０）：段階１２０％段階２４０％段階３２０％段階４２０％ＨＦ−ＳＯＤ群（ｎ＝８）：段階１１２．５％段階２２５％段階３３７．５％段階４２５％上記の結果から分かるように、ＬＦ−ＳＯＤ群およびＨ
Ｆ−ＳＯＤ群のいずれも、ＰＣ−ＳＯＤ投与でみられる
ような変形の進行に対する抑制効果はみられなかった。

【００３４】（２）握力減少フリーのＳＯＤの投与開始後４週間目の握力を測定した
結果を次に示す。なおｎはマウスの匹数を表し、握力は
平均値±標準偏差(S.D.)で表す。ＬＦ−ＳＯＤ群（ｎ＝１０）：４．８±４．９ｇＨＦ−ＳＯＤ群（ｎ＝１０）：６．７±６．３ｇ上記の結果から分かるように、ＬＦ−ＳＯＤ群およびＨ
Ｆ−ＳＯＤ群のいずれも、ＰＣ−ＳＯＤ投与でみられる
ような握力減少に対する抑制効果はみられなかった。

【００３５】（３）二頭筋の重量減少フリーのＳＯＤの投与開始後４週間目の二頭筋の重量を
測定した結果を次に示す。なお、ｎはマウスの匹数を表
し、二頭筋重量は平均値±標準偏差(S.D.)で表す。ＬＦ−ＳＯＤ群（ｎ＝１０）：４．９３±０．８２ｍｇＨＦ−ＳＯＤ群（ｎ＝１０）：４．９３±０．９３ｍｇ上記の結果から分かるように、ＬＦ−ＳＯＤ群およびＨ
Ｆ−ＳＯＤ群のいずれも、ＰＣ−ＳＯＤ投与でみられる
ような二頭筋重量減少に対する抑制効果はみられなかっ
た。

【００３６】（４）脊髄の運動ニューロン数計測フリーのＳＯＤの投与開始後４週間目の脊髄の運動ニュ
ーロン数を計測した結果を次に示す。なお、ｎはマウス
の匹数を表し、運動ニューロン数は平均値±標準偏差
(S.D.)で表す。ＬＦ−ＳＯＤ群（ｎ＝３）：３０６．６±１５．３個ＨＦ−ＳＯＤ群（ｎ＝８）：２９８．０±１３１．９個上記の結果から分かるように、ＬＦ−ＳＯＤ群およびＨ
Ｆ−ＳＯＤ群のいずれも、ＰＣ−ＳＯＤ投与でみられる
ような脊髄の運動ニューロン数減少に対する抑制効果は
みられなかった。前記実施例の結果及び比較例の結果か
ら、ＰＣ−ＳＯＤにはフリ−のＳＯＤにはみられない運
動ニューロン疾患に対する改善作用があることが確認さ
れた。

【００３７】

【実施例２】製剤例（１）注射剤前記製造例により調製したＰＣ−ＳＯＤ（３０ｍｇ／ｍ
ｌ）を、終濃度５ｍｇ／ｍｌになるように５％マンニト
ール水溶液で溶解し、これを無菌濾過した後、２ｍｌづ
つアンプルに分注し密封した。

【００３８】（２）錠剤前記製造例により製造したＰＣ−ＳＯＤの凍結乾燥物１
００ｍｇ、乳糖６７０ｍｇ、バレイショデンプン１５０
ｍｇ、結晶セルロース６０ｍｇ、及び軽質無水ケイ酸５
０ｍｇを混合し、これにヒドロキシプロピルセルロース
３０ｍｇをメタノールに溶解した溶液（ヒドロキシプロ
ピルセルロース１０重量％）を加えて混練したのち、造
粒した。次にこれを径０．８ｍｍのスクリーンで押出し
て顆粒状にし、乾燥した後、ステアリン酸マグネシウム
１５ｍｇを加え、２００ｍｇづつ打錠した。

【００３９】（３）カプセル剤前記製造例により製造したＰＣ−ＳＯＤの凍結乾燥物１
００ｍｇ、バレイショデンプン１５０ｍｇ、軽質無水ケ
イ酸５０ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム１０ｍｇ、及
び乳糖７６５ｍｇを均一に混合し、この２００ｍｇを分
取して硬カプセルに充填した。

【００４０】

【発明の効果】本発明のＰＣ−ＳＯＤを有効成分とする
薬剤は、筋萎縮性側索硬化症をはじめとする運動ニュー
ロン疾患症状を改善する作用を持つため、抗運動ニュー
ロン疾患剤として利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣ−ＳＯＤ投与開始前（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ＰＣ
−ＳＯＤ投与開始後２週間目（Ｄ、Ｅ、Ｆ）、ＰＣ−Ｓ
ＯＤ投与開始後４週間目（Ｇ、Ｈ、Ｉ）の wobblerマウ
スの前足の変形の進行を示す。Ａ、Ｄ、Ｇは無処理群、
Ｂ、Ｅ、ＨはＬ−ＳＯＤ群、Ｃ、Ｆ、ＩはＨ−ＳＯＤ群
についての結果である。横軸は変形の段階、縦軸はマウ
スの匹数（全体に対する割合（％））を表す。また、図
中のＰ＜で表される数値は、無処理群に対する有意差の
危険率を示す。

【図２】無処理群、Ｌ−ＳＯＤ群およびＨ−ＳＯＤ群に
ついての、ＰＣ−ＳＯＤ投与開始後１〜４週間目の握力
を示す。横軸はＰＣ−ＳＯＤ投与開始後の週、縦軸は握
力（ｇ）を表す。また、図中の＊、＊＊、＊＊＊＊はそ
れぞれ無処理群に対してＰ＜０．００３、Ｐ＜０．００
２、Ｐ＜０．００１の危険率で有意差があることを示
す。また、図中の＃、＃＃はそれぞれＬ−ＳＯＤ群に対
してＰ＜０．０４、Ｐ＜０．００７の危険率で有意差が
あることを示す。

【図３】無処理群、Ｌ−ＳＯＤ群およびＨ−ＳＯＤ群に
ついての、ＰＣ−ＳＯＤ投与開始後４週間目の二頭筋の
重量（ｍｇ）を示す。図中の＊、＊＊はそれぞれ無処理
群に対してＰ＜０．０３、Ｐ＜０．００１の危険率で有
意差があることを示す。また、＃はＬ−ＳＯＤに対して
Ｐ＜０．００６の危険率で有意差があることを示す。

【図４】無処理群およびＨ−ＳＯＤ群の、二頭筋切片の
ATPase染色像を示す。拡大倍率は５０倍である（生物組
織の顕微鏡写真）。

【図５】無処理群、Ｌ−ＳＯＤ群およびＨ−ＳＯＤ群に
ついての、ＰＣ−ＳＯＤ投与開始後４週間目の二頭筋の
筋線維直径（μｍ）を示す。図中の＊は無処理群に対し
てＰ＜０．００１の危険率で有意差があることを示す。
また、＃はＬ−ＳＯＤに対してＰ＜０．０３の危険率で
有意差があることを示す。

【図６】無処理群およびＨ−ＳＯＤ群の、Ｃ_5-6脊髄分
節切片のクレシル−バイオレット染色像を示す。拡大倍
率は５０倍である（生物組織の顕微鏡写真）。

【図７】無処理群、Ｌ−ＳＯＤ群およびＨ−ＳＯＤ群に
ついての、ＰＣ−ＳＯＤ投与開始後４週間目の脊髄の運
動ニューロン数（個）を示す。図中の＊、＊＊はそれぞ
れ無処理群に対してＰ＜０．００１、Ｐ＜０．０００１
の危険率で有意差があることを示す。また、＃はＬ−Ｓ
ＯＤに対してＰ＜０．０２の危険率で有意差があること
を示す。

【図８】wobbler マウスの前足の変形の段階を示す (生
物の形態の写真) 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者塩島俊也東京都世田谷区砧２−４−10 テラスＫ 203 (72)発明者多賀谷望東京都世田谷区桜３−26−15 (72)発明者小林朋子東京都武蔵野市西久保３−26−７

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】化学的橋かけを介してレシチンに結合し
たスーパーオキシドジスムターゼを有効成分として含む
抗運動ニューロン疾患剤。
【請求項２】化学的橋かけを介してレシチンに結合し
たスーパーオキシドジスムターゼが下記一般式（１）で
表される請求項１記載の剤。 SOD-[C(O)-(CH₂)_n-C(O)-X]_m ・・・（１）ただし、 SOD ：スーパーオキシドジスムターゼＸ：グリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチン
の、その２位の水酸基の水素原子を除いた残基ｍ：１以上の整数ｎ：２以上の整数をそれぞれ表す。
【請求項３】 SOD が、銅及び亜鉛が配位した、111 位
のアミノ酸がＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システ
インで示されるヒト型スーパーオキシドジスムターゼで
ある請求項２記載の剤。
【請求項４】ｎが２〜１０の整数である請求項２また
は３記載の剤。
【請求項５】ｎが３である請求項４記載の剤。
【請求項６】ｍが平均１〜１６である請求項２〜５の
いずれかに記載の剤。
【請求項７】ｍが平均４である請求項６記載の剤。
【請求項８】運動ニューロン疾患が筋萎縮性側索硬化
症である請求項１〜７のいずれかに記載の剤。