JPH10505236A - ネコ科の感染性腹膜炎用ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 エンハンスメントに関与する抗原性領域 A1 および A2 の少なくともいずれか一方に一時変異を有するFIPV S遺伝子またはこの遺伝子の断片を含むヌクレオチド配列と、変異蛋白質を発現させるためのこのヌクレオチド配列の利用と、組み換えウィルスまたは発現プラスミドを作製するための上記ヌクレオチド配列の利用と、ネコ科の感染性腹膜炎に対するワクチンとしての上記組み換えウィルスの利用と、発現プラスミドをネコに注射する上記プラスミドの免疫組成物としての利用と、上記変異蛋白質のワクチンとしての利用。

Description

【発明の詳細な説明】 ネコ科の感染性腹膜炎用ワクチン発明の分野 本発明はネコ科の感染性腹膜炎（ＦＩＰ：Faline Infectious Peritonitis） に対するワクチンに関するものである。 本発明のワクチンは、エンハンスメントを引き起こす主要なエピトープ(enhan cing epitopeまたはepitope facilitants)を突然変異誘発によって変異させたＦ ＩＰウィルスの SPIKE（S）グリコプロテインを用いて調製される。 本発明のワクチンを用いると病気の進行を加速させるエンハンスメント現象を 起こさずにネコのＦＩＰを予防することができる。従来技術 ネコ科の感染性腹膜炎ウィルス（FIPV）はエンベロープを有する陽性の一本鎖 ＲＮＡウィルスであり、コロナウィルス科に属し、ネコ科の腸のコロナウィルス (FECV)、イヌ科コロナウィルス(CCV)、ブタの伝播性胃腸炎ウィルス(TGEV)およ びブタの呼吸性コロナウィルス(RRCV)を含む抗原群に属する(Sanchez C達、Viro logy，1990，174，410-417)。このウィルスはネコ科の感染性腹膜炎(FIP)として 知られる複雑で常に死に至る病気を引き起こす。 ＦＩＰウィルスは、ウィルス感染をエンハンスメントして病気の進行を加速さ せる抗体の出現をネコに誘導する点でコロナウィルスの中では特異な存在である 。以前にこのウィルスに自 然感染して、抗体を受動転移したか、ワクチン接種によって抗FIPV中和抗体がで きているネコは、特異抗体を持たずに初めて感染したネコよりもはるかに重症で 、はるかに進行の速い病気にかかることが極めて多い(Pedersen N．とBoyle J. ，Am．J．Vet．Res．1980，41，868-876; Weiss R．達、Comp．Immunol．Microb ．Infect．Dis．1981，4，175-189；Weiss R.達、Am．J．Vet．Res.，1980，41 ，663-671)。 抗体−ウィルスの免疫複合体がマクロファージ表面に存在するFc受容体に結合 することがウィルスの細胞侵入を加速させ、体内でのウィルスの急速な拡散をエ ンハンスメントする機構を構成するものと考えられている(Porterfield，J．Adv ances in Virus research，1986，31，335-355；Weiss達、1981)。このエンハン スメント現象はコロナウィルスの中では FIPウィルスのみで観察されている。 FIP ウィルスは３つの構造蛋白質を有している。寸法が最大のものが“SPIKE ”またはスピキュール(S)蛋白質である。このＳ蛋白質はグリコシル化の程度が 高く、ネコの体内で中和抗体とエンハンシング抗体の両方を誘導する。FIP ウィ ルスに対する中和モノクロナル抗体を用いて試験管内で行われた研究の結果、主 要な中和エピトープは全てＳグリコプロテイン上に存在し、その中のかなりのも のがエンハンスメント現象に関与するエピトープに相当することが示されている (Corapi W．達、J．Virol．1992，66，6695-6705；Olsen C．達、J．Virol．199 2，66，956-965)。 ＦＩＰに対する効果的なワクチン処置は、エンハンシング抗体を誘導すること なく中和抗体を生成させるものでなければなない。これまでそのようなワクチン は開発されていない。Ｓグ リコプロテインを含まない組み換えワクチンが、おそらく今後のＦＩＰワクチン の最も優れた選択肢となり得るが、これらの抗原はＦＩＰウィルスに対する中和 応答の誘導に部分的に寄与するにすぎない。３種類の構造的ウィルス抗原のうち 、十分な中和応答を誘導することができるのはＳグリコプロテインだけである。 残念なことに、このグリコプロテインはエンハンシング抗体の生成を同時に誘導 する。優れた中和応答（従って、防御応答）の誘導が大きいにもかかわらず、天 然のＳグリコプロテインはＦＩＰエンハンスメント現象においても主要な役割を 果たすものと思われ、そのため現在のところ上記基準を満足するワクチンを製造 するためには使用することができない。 Ｓグリコプロテインをネコ用抗ＦＩＰワクチンを製造するための効果的な免疫 源として使用するために、Ｓグリコプロテイン（またはこの蛋白質をコードする 遺伝子）に対してどのような改良を行うべきかを決定するには、Ｓ上に存在する エピトープ、特に中和およびエンハンスメントに関与するエピトープの位置およ び性質を決定することが必要である。 ＦＩＰウィルスのグリコプロテインのヌクレオチド配列および蛋白質配列は既 に決定されている(de Groot R．達、EP-A-264,979)。この特許ではＳ上の中和エ ピトープおよび／またはエンハンシングエピトープを同定しておらず、ＦＩＰを エンハンスメントしない効果的なワクチンを製造するためにＳ配列をどのように 利用するかも記載ささていない。 国際特許公開 WO-A-93/23,421 号には、先端を切って短くしたＳグリコプロテ インまたはＳの一部のみをコードした核酸配列の使用を請求している。特にＳの カルボキシ末端に位置する高度に保存された領域（最後の124 アミノ酸）がコロ ナウィス ルに対する「万能」ワクチンの製造のために請求されている。この特許は非常に 概説的なもので、ネコにおいてエンハンシング抗体を誘導しないＦＩＰワクチン の製造方法は開示されていない。 国際特許公開 WO-A-93/23,422 号も同様で、この特許には、FIPV Sの542-597 、594-1454あるいは651-1454断片を含むFECV-FIPV キメラ型Ｓグリコプロテイン の混合構成が開示されている。 国際特許公開 WO-A-92/08,487 号には、Ｓ蛋白質上で選択される各種ペプチド あるいは各種FIPVウィルス株のＳ遺伝子またはFECV S遣伝子配列によってコード される各種ペプチドを用いて、ネコにおけるＦＩＰの診断、治療または予防を行 う方法が請求されている。特に、FIPVウィルス79-1146 株のＳ蛋白質中のペプチ ド配列598-615 を、ガラクトキナーゼとの融合蛋白質として使用する方法が特許 請求されている。この場合、組み換え蛋白質はＦＩＰに感染したネコにおける抗 ＦＩＰ抗体の診断に利用するか、ネコのＦＩＰを予防するための組み換えワクチ ンとして使用することができる。この特許には特許請求されたペプチド配列の変 形が可能であることがは示唆されているが、提案した配列にいかなる変更を行う べきかの説明はなく、エンハンスメントを起こさないＦＩＰワクチンの製造方法 も、Ｓグリコプロテインのうちのいずれの領域がこの現象に関与するかについて も開示はない。 本出願の優先日以降に公開された英国特許GB-A-2,282,601号には、Ｓ蛋白質の Ｄ（496-524 アミノ酸に相当）、Ａ１（531-555 アミノ酸に相当）およびＡ２（ 584-604 アミノ酸に相当）とよばれる抗原部位の少なくとも一か所を変性または 欠失させ てその抗原性を失わせることによってエンハンスメント現象を防ぐように改質さ れたＳ蛋白を用いるワクチン製造方法が提案されている。 TGEVウィルス(Transmissible Gastro-Enteritis Virus)のＳ蛋白質上に存在す る主要な抗原性部位を同定するための研究は多数行われている（Correa I．達、 J．Gen．Virol．1990，71，271-279 ；Delmas B．達、J．Gen．Virol．1990，71 ，1313-1323）、BCV(Bovine CoronaVirus)(Yoo D.達、Virology 1991，183，91- 98)。また、MHV（Mouse Hepatitis Virus）に関する研究（Takase-Yoden S．達 、Virus Res．1990，18，99-108 ；Stuhler A.達、J．Gen．Virol．1991，72，1 655-1658）およびFIPV に関する研究（Corapi W．達、J．virol．1992，66，66 95-6705; Olsen C.達、J．Virol．1992，66，956-965; Olsen C.達、J．Gen．V irol．1993，74，745-749）も行われている。いずれの場合も重なった中和領域 が同定され、免疫優勢領域は一般に蛋白質のS1部分に局在している。 特に、ＦＩＰウィルスに関連した研究から、Ｓ蛋白質上に、FIPVの感染に関す る中和応答とエンハンスメント応答の両方を誘導するエピトープが存在すること が示された(Corapi W.達、J．Virol．1992，66，6695-6705 ； Olsen C．達、J ．Virol．1992，66，956-965 ；Olsen C.達、J．Gen．Virol．1993，74，745-74 9)。これらの著者達は、抗Ｓ特異性を有する中和およびエンハンシングモノクロ ナル抗体を各種ＦＩＰウィルス株および上記モノクロナル抗体による中和に対し て耐性を有する各種変異株（“mar”変異株(monoclonal antibody resistant)） を認識する能力によって主として６つの群に分類することが可能であることを示 している。しかし、FIPV S上の主な抗原領域に対 応するエピトープの特性は決定されていない。 上記の著者達によって報告(Olsen C．達、J．Virol．1992，66，956-965)され た非中和モノクロナル抗体は全て、試験管内でのエンハンスメント試験において エンハンスメントを起こさない。このことはＦＩＰウィルスの場合、中和とエン ハンスメントとが密接に関係するという仮説を支持するものである。抗体による ウィルス感染の増進は、特異的受容体のエンドサイトーシス(endocytose)依存性 によって、単核細胞またはマクロファージへの免疫複合体による感染がウィルス 単独による感染よりも効果的に起こる時に発生する。抗体依存性エンハンスメン ト現象については多くの研究が行われてきたにもかかわらず、多くの疑問が未解 決のままである。特に、いずれの特異的なウィルス構成成分が各ウィルスのエン ハンスメントに関与するかは分かっていない。FIPVについてこれまで行われてき た研究より、エンハンスメントは主にＳ上に存在するエピトープに依存すること が示唆されている(Olsen C．達、1993; Vennema H．達、J．Virol．1990，64，1 407-1409)。 Hodatsu T．達(Arch．Virol．1991，120，207-217)は、抗FIPVM モノクロナル 抗体によって試験管内における感染がエンハンスメントされることを見出した。 このことは、ワクシニア／FIPV M組み換え体およびワクシニア／MIPV N組み換え 体を用いた生体内試験では確認されていない。これら２種類の組み換え体を用い てネコに免疫処置を行っても、上記２種類の蛋白質のいずれかによって誘導され るエンハンスメントは観察されなかった(Vennema H．達、1990)。ＭおよびＮが エンハンスメントに関与するならば、それはＳに比べてかなり低いレベルである ことは確実である。エンハンスメントが観察される各種のウ ィルスシステムを用いて行われた研究では、個々のエピトープか中和抗体とエン ハンシング抗体の両方を誘導することができるという、一定の事象が観察された 。この事象はFIPV（Corapi W．達、J．Virol．1992，66，6695-6705; Olsen C. 達、J．Virol．1992，66，956-965：Hohdatsu T．達、Arch．Virol．1991，120 ，207-217）、デングウィルス(Morens D.とHalstead S.，J．Gen．Virol.，1990 ，71，2909-2917)および HIV(Robinson W．Jr.，J．Virol．1991，65，4169-417 6)について示されている。 試験的なFIPワクチンを用いて行われた最近の試験結果は、試験管内で観察さ れるエンハンスメントとネコの生体内における疾病の増進との間の直接関係の存 在について、これまでで最も充実した論議を提供しているように思われる。FIPV 79-1146株のＳ蛋白質を発現するワクシニアウィルスの組み換え体をネコに接種 することによって、ネコが感作され、抗原投与後、ワクチン接種を行わない対照 のネコに比べてワクチン接種を行ったネコでは病気が増進する(Vennema H.達、J ．Virol，1990，64，1407-1409)。Ｍ蛋白質またはＮ蛋白質のいずれかを発現す るワクシニア組み換え体を接種しても、ネコの病気が増進されることはない。こ れらの生体内試験の結果は、エンハンシングエピトープが主にＳ上に局在するこ とを示した試験管内試験の結果(Corapi W．達、J．Virol．1992，66，6695-6705 ; Olsen C.達、J．Virol．1992，66，956-965)と平行して取り上げられるべきで ある。さらに、FIP ワクチンとしてのもう１つの候補の効果を調べるために行わ れた最近の試験によって、ネコの血清が試験管内でエンハンスメントを誘導する 能力と、同じネコにおいて病気が増進されることとの間に統計的に深い関連があ ることが示されている（Olsen C.，Vet．Microb．1993，36，1-37）。発明の開示 本発明の目的は FIPウィルス感染のエンハンスメントに関与するエピトープの 特性を決定することにある。エンハンスメント機構に関与する分子構造を正確に 知ることによってエンハンシング抗体の出現を誘導しない抗原を設計することが 可能になる。そうした抗原は効果的なFIP ワクチンの必須成分である。 驚くべきことに、中和およびエンハンシングモノクロナル抗体による中和に対 して耐性のFIPVウィルス変異株、あるいは中和作用のみを有してエンハンスメン ト作用を有しないモノクロナル抗体に対して耐性のFIPVウィルス変異株のＳ遺伝 子の配列を分析することによって、Ｓグリコプロテインによるエンハンスメント 誘導機構の輪郭を描くことができることが分かった。この研究に用いたモノクロ ナル抗体を用いて２つの主要な抗原部位A1およびA2の特性が決定された。これら の部位は、驚くベきことにいずれもＳ蛋白質上の同じ領域に位置している。強力 な中和およびエンハンシング抗体は両方の部位を同時に認識するものと思われる 。この情報は、２つのエピトープが同一の抗体によって同時に結合されることが 、エンハンスメントにおいて直接の役割を果たすことを示唆している。事実、上 記第１の発見と平行して、中和作用を有し（エンハンシング作用を持たない）抗 体がA2部位のみを認識することが分かった。従って、エンハンスメントは２つの エピトープA1およびA2が互いに近づくことによる構造変化に起因する可能性があ る。A2領域は、蛋白質Ｓの配列のうち637-662 のアミノ酸を含む（De Groot R． 達、J．Gen．Virol．1987，68，2639-2646）。この領域の親水性および試験で用 いた３種類のモノクロナル抗体が全てこの小さな領域を認識したという事実によ って、A2がＳ蛋白質の主要な中和エピトープであることが示唆された。さらに、 A1部位とTGEV S蛋白質上で同定されたAaサブサイト部分との間に見られる高い相 同性（Gebauer F.達、Virology 1991，183，225-238）によって、562-598 のア ミノ酸を含むA1はさらにFIPVウィルスにとっても重要な中和エピトープに違いな いことが示唆される。 抗体を介してエンハンスメントを誘導するためにはA1とA2部位が互いに近づく か、これらの部位に同一の抗体が同時に結合することが必要である。 本発明の目的は、遺伝子工学によって、FIPV S遺伝子のA1および／またはA2部 位の配列を変化させ、特に上記領域のうち少なくとも一方、好ましくはA1部位を 変化させて、エンハンシング抗体を誘導しなくなるように変化したエピトープを 有する蛋白質か発現されるようにする、および／またはA2部位を変化させること にある。A1領域は当業者に公知の方法を用いて様々に変化させることができる。 A1またはA2部位は互いに別々に、あるいは同時に変化させることができる。 A2部位の一時変異は、該部位の抗原性を消失させる完全な欠失であってもよい が、A1部位については変異によって蛋白質がエンハンシング抗体を誘導しなくな るように変化したエピトープが発現されるのが好ましい。 A1領域は上記英国特許第GB-A-2,282,601号（WO-A-95/07987）に記載のいわゆ る“A2”領域と共通部分を有するが、上記特許では本発明とは異なり一時変異ま たは欠失された領域の抗原性が消失するような突然変異（一時変異）を提案して いる。 本発明の対象は特にアミノ酸 637〜662 をコードする抗原性A2領域および／ま たはアミノ酸 562〜598 をコードする抗原性A1領域に少なくとも１つの一時変異 、好ましくは突然変異および／または限定的な欠失を有する（少なくともA1につ いては、完全な欠失または完全な欠失と同様の結果、例えば一時変異された領域 の抗原性の喪失を引き起こすような重大な突然変異あるいは欠失を除く）完全な FIPV S遺伝子を含むヌクレオチド配列である。 従って、本出願は、少なくともA1部位については抗原性を変化させずにエンハ ンシング抗体誘導の抑制を可能にする一時変異に関する部分のみに限定される。 完全なFIPV S遺伝子を含むヌクレオチド配列という表現は、１型および２型の FIPV株と変形体および二次的な変化すなわちＳ蛋白質の免疫源性に影響を与えな いような二次的な変化を有する配列を含み、二次的な変化にはさらに、A1および A2部位以外の二次的な突然変異および欠失が含まれる。配列の変化によってＳグ リコプロテインの機能に変化が生じてはならない。 従って、これは、遺伝子コードの縮重を考慮する場合を含めて上記の配列との 間に高い相同性を有する配列を含み、この相同性は、発現される蛋白質が効果的 なワクチン作用を誘導するために十分なだけ高いものである。 限定的な欠失とは好ましくは点欠失（アミノ酸１個に相当する）または微小欠 失（アミノ酸６個以下）を意味する。 一般に、A1およびA2上に位置するシステインをコードしたコドンについては突 然変異または欠失を行わない。 また、広範囲の突然変異や欠失よりも点突然変異が好ましく、次いで点欠失（ Cys を除く）が好ましい。 A1部位については、一時変異は少なくとも Asp568 とAsp591をコードするコド ンのうち少なくとも一方、好ましくは両方についての突然変異を含み、これらの 位置に他の任意のアミノ酸を有するようになっている。アミノ酸568 および591 がAsp でないという条件で、562-598 領域内の他の任意のアミノ酸を上記位置で 天然のアミノ酸と置き換えることができる。 A1部位の一時変異はさらにアミノ酸568 および／または591を含む領域の限定 的な欠失を含む。 A2部位については、一時変異は少なくとも１つ、好ましくはAsp643、Arg649お よびArg656をコードする３つのコドンについての突然変異を含み、これらの位置 に他の任意のアミノ酸を有するようになっている。A2部位の一時変異はさらに、 アミノ酸643 、649 および／または656 を含む領域の完全な欠失／部分欠失を含 む。 本発明のさらに他の目的は、このようにして一時変異されたFIPV遺伝子を用い て、組み換えFIPV S蛋白質を試験管内で発現させ、ネコにFIP に対するワクチン 処置を行うための精製サブユニットワクチンを調製することにある。 本発明のさらに他の目的は上記のようにして一時変異されたFIPV S遺伝子を用 いて、これら一時変異された遺伝子を発現する組み換えウィルスベクターを作る ことにある。これらウィルスベクターは複製型または非複製型の組み換えウィル スにすることができ、特にポックスウィルス（例：ワクシニアウィルスおよびそ の誘導体、カナリアポックスウィルス等）、ヘルペスウィルス（特にネコ科のヘ ルペスウィルス）あるいはアデノウィルスにすることができる。 本発明のさらに他の目的は、以上の組み換えウィルスを用い てFIP に対するワクチンを調製することにある。 本発明のさらに他の目的は、本発明に従って一時変異され、強力なプロモータ （例えばHCMV IE、SV40等）および転写・翻訳のための調節信号の制御下に置か れたFIPV S遺伝子を含むプラスミドを用いてネコにFIP に対して免疫処置を行う ことにある。プラスミドは、ネコに直接、特に筋肉を介して注射することのでき るベヒクル中に含まれる。これは国際特許公開WO 90/11,092号に記載のような裸 のプラスミドである。 本発明のさらに他の対象は、本発明によって一時変異された一種（またはそれ 以上）のFIPV S蛋白質を、好ましくは他のFIPVウィルスの蛋白質（例えばＭ蛋白 質）と組み合わせて含む、FIP に対するワクチンを調製することにある。 別のワクチン溶液は、本発明によるＳグリコプロテインを構造的に発現する（ 特にネコ科由来の）細胞を用いたものである。実施例 実施例１ FIPV S 遺伝子のクローニングおよび発現 中和およびエンハンスメントに関与するFIPV S遺伝子領域の位置を決定するた めに、FIPV S遺伝子の重なった断片のクローニングを行って、これらの断片をT7 ファージの遺伝子10の蛋白質との融合蛋白質として発現させた。各種断片の増幅 に用いるオリゴヌクレオチド配列は 1600 塩基対(bp)より成る３種類の大断片と それよりも小さい約 400〜500bp の12種類のサブ断片の形で、Ｓ遺伝子のコード 領域全体をカバーするように選択した。これらのオリゴヌクレオチドはクローニ ングを容易にするためにBam XI、XbaIまたは XhoI 制限部位を含む。RNA の逆転 写およびＰＣＲ法による相補的DNA の増幅は標準的な方法で行った(Sambrook J ．達、Molecular Cloning；a laboratory manual，2nd ed.，Cold Spring Harbo r Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。増幅したDNA を適当な制限酵素で 処理し、ベクターブルースクリプト pBluescript(Stratagene，LaJolla，Ca)に クローニングした。 FIPVウィルス79-1146 株のＳ遺伝子よりクローニングされた各種断片の範囲を 以下に示す（位置は全てDe Groot R.達J.Gen．Virol．1987，68，2639-2646 に 記載のFIPV 79-1146株のＳ遺伝子配列を参照した）： 断片F1：ヌクレオチド 70〜1736 断片F2：ヌクレオチド 1519〜3160 断片F3：ヌクレオチド 2773〜4428 断片S1：ヌクレオチド 70〜535 断片S2：ヌクレオチド 394 〜862 断片S3：ヌクレオチド 742 〜1221 断片S4：ヌクレオチド 1045〜1539 断片S5：ヌクレオチド 1339〜1734 断片S6：ヌクレオチド 1594〜2089 断片S7：ヌクレオチド 1963〜2443 断片S8：ヌクレオチド 2296〜2838 断片S9：ヌクレオチド 2743〜3004 断片S10 ：ヌクレオチド 2890〜3506 断片S11 ：ヌクレオチド 3352〜4063 断片S12 ：ヌクレオチド 3895〜4428 クローニングした各種のFIPV断片を NotI および XhoI で処理してブルースク リプトクローンから単離し、試験管内での転 写・翻訳段階を行うためにベクター pTOPE-SX に再度クローニングした。 pTOPE-SXの作製法を以下に説明する。 プラスミド pTOPE-1b(+)(Novagen)は、T7プロモータとT7ファージの遺伝子10 部分とを含み、その後にポリリンカーが続いている。制限酵素SacII および Xho I で処理してこのポリリンカーを完全に取り除き、ブルースクリプトに含まれる ポリリンカーから単離した 82bp の SacII-XhoI 断片で置き換える。この断片に 追加のヌクレオチドを添加し、ブルースクリプトにクローニングされたFIPV断片 の全てが遺伝子10フェーズを含むフェーズに配置されるようにする。新しいプラ スミドをpTOPE-SXと称する。T7ファージRNA ポリメラーゼを用いてpTOPE-SXに含 まれる挿入断片を試験管内で転写・翻訳することによって遺伝子10蛋白質の260 個のアミノ酸に続いてFIPV挿入断片にコードされたアミノ酸を含む融合蛋白質が 得られる。実施例２ モノクローナル抗体によるFIPV Sペプチドの認識 中和およびエンハンスメントに関与するFIPVウィルスＳ遺伝子の概略の領域を 決定するために、この遺伝子の重複断片を、３個の大断片（F1、F2およびF3：図 １）と、12個の小サブ断片（S1〜S12）にし、ＰＣＲ法でブルースクリプトベク ターにクローニングした。次いで、これらの FIPV 挿入断片をベクターpTOPE-SX にサブクローニングし、試験管内で転写・翻訳を行った。 試験管内での転写および翻訳は“TNT Reticulocyte Lysate”システム(Promeg a，Madison，WT)を用い、製造業者の薦める方 法に従って、³⁵Ｓメチオニン(Amersham France)の存在下で行った。翻訳後の蛋 白質処理の影響を調べるために、さらにイヌの膵臓のミクロソーム膜(Promega) の存在下でも反応を行った。翻訳生成物はSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動 で分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。 ラジオイムノプレシピテーション試験(RIPA)は、ヒュージョン蛋白質を含む翻 訳混合物５μｌを、５μｌのネコ血清またはモノクロナル抗体を含む200 μｌの TNE Triton X-100バッファ（NaCl 150mM、トリス(pH8.0)50mM、EDTA 5mM、Trito n X1000.1 ％）と混合し、この混合物を＋４℃で１時間攪拌して行った。FIPVに 対して陽性および陰性なネコ血清とT7ファージの遺伝子10にコードされる蛋白質 の最初の10個のアミノ酸に対するモノクロナル抗体(T7 Tagモノクロナル抗体：N ovagen)を対照として用いた。アガロース／組換えＧ蛋白抱合体（Boehringer Ma nnheim，Mannheim，Germany）50μｌをモノクロナル抗体を含むサンプルに添加 するか、アガロース／組み換えＡ蛋白質抱合体（Boehringer Manheim）50μｌを ネコ血清を含むサンプルに添加することによって、免疫複合体を吸着させる。ア ガロースに結合した免疫複合体を30分間遠心分離し、RIPAバッファー（150 mM N aCl、50mM Tris(pH8.0)、１％Triton X-100、0.5％ナトリウムデオキシコレート 、0.1 ％SDS）を用いて２回洗浄し、Tris-Triton バッファ（10mM Tris(pH8.0) 、0.1 ％TritonX-100）で１回洗浄した。遠心分離したサンプルを電気泳動で分 離する。ゲルを固定し、増殖(Amplify)溶液（Amersham）で処理し、オートラジ オグラフィーで可視化する。 大きな断片F1、F2およびF3は約 62kDaの寸法を有し、この断片は約 90kD の融 合蛋白質になる。これは事実上観察される寸 法に相当する。小さい断片S1〜S12 の寸法は約 18kDaで、これは約 46kDaの融合 蛋白質になる。 FIPV S融合ペプチドをモノクロナル抗体で認識する時の条件を最適化するため に、融合蛋白質をさらにイヌの膵臓のミクロソーム膜の存在下で翻訳する。Ｓ（ 断片F1）のＮ末端のグリコシル化の結果、それぞれ８kDa および55kDa の増加に 対応して融合蛋白質F1の寸法は90kDa から98kDa または145 kDa へと変化する。 ８kDa の増加は、48kDa から54kDa に変化するサブ断片S1の寸法についても観察 される。その他のFIPV S断片の寸法はミクロソーム膜の存在で翻訳を行っても変 化しない。 特異的な抗FIPV Sモノクロナル抗体 23F4,5 、24H5.4および18A7.4（Corapi W ．達、J．Virol.，1992，66，6695-6705）は断片F2およびサブ断片S6を認識し、 これらは165 アミノ酸の共通配列を有している（79-1146 株のＳ蛋白質配列の50 9 〜673）(De Groot R．達、J．Gen．Virol．1987，68，2639-2646)。断片F2の 認識は、ミクロソーム膜の存在下で翻訳した蛋白質を用いても向上せず、これよ り、対象となるエピトープの認識にグリコシル化は必要でないことが示唆される 。実施例３ 抗FIPV Sモノクロナル抗体による中和に対して耐性を有する 突然変異ウィルス（“mar”突然変異）のシーケンシング 断片S6上に局在する抗原部位の位置を決定するために、数種類の mar FIPV 突 然変異体のS6領域をＰＣＲ法で増幅させ、ブルースクリプトベクターSK+ にクロ ーニングして、シーケンシングした。mar 突然変異体のシーケンスは同じモノク ロナル抗体と、同じmar 突然変異体を用いた個々のＰＣＲ増幅によって 得られたクローンを用いて、個々のmar 突然変異体上で決定された。各クローン のシーケンスは、シーケナーゼ（Sequenase）キット（Amersham）を用い、製造 業者の薦める方法に従って両方の塩基鎖について決定した。 得られたシーケンスを親ウィルス79-1146 の相同配列と比較した。分析したma r 突然変異体は、marF4.5、mar 18A7.4およびmar 24H5.4として識別される突然 変異体である。これらの突然変異体はそれぞれ C.Olsen（Olsen C.達、J．Virol ogy 1992，66，956-965）およびW．Corapi(Corapi W．達、J．Virology 1992，6 6，6695-6705)によって報告されたモノクロナル抗体23F4.5、18A7.4および24H5. 4を用いて得られた。 モノクロナル抗体23F4.5の中和力価は20480（Corapi，1992）であり、試験管 内試験で感染のエンハンスメントを誘導し、感染は通常レベルの少なくとも100 倍になる(Olsen，1992)。突然変異体 mar 23F4.5 は1840と2014の位置に変異を 有し、それによってＳ蛋白質の591 番目の残基（Asp →Tyr）と649 番目の残基( Arg →Gly)に変化が誘導される。モノクロナル18A7.4は中和力価が5120で、試験 管内で感染のエンハンスメントを誘導し、感染は少なくとも通常の100 倍になる 。突然変異体 mar18A7.4は1772と2036の位置に変異を有し、それによって568 番 目の残基(Asp →Val)と656 番目の残基(Arg →Lys)に変化が誘導される。 モノクロナル抗体 24H5.4 は中和力価が96で、完全のエンハンスメントを誘導 しないという性質がある(Olsen，1992)。突然変異体 mar 24H5.4 は1996の位置 に唯一の変異を有し、それによって643 番目の残基(Asp →Tyr)に変化が誘導さ れる。実施例４ A1 部位の突然変異誘発 FIPV S遺伝子の1723 bp のHindIII-HindIII中央断片（ヌクレオチド1696〜341 8）を、ベクター pBS-SK+にクローニングして、プラスミド pFIPV-S2 を得る。A 1部位は、この断片のHindIII-SspIサブ断片（1696〜1845）上に位置する。A1部 位に、以下の方法でＰＣＲによって突然変異を誘発する。 下記のオリゴヌクレオチドを合成した： オリゴヌクレオチドA11 およびA12 を、23bpの共通な相補的配列を用いて互い にハイブリダイズさせる。得られたハイブリッドは3'末端側を延長した後U オリ ゴヌクレオチドA13 およびA14 を用いたＰＣＲ法の鋳型として使用する。このＰ ＣＲ増幅反応によって、159bp の断片が得られる。続いてこの断片を制 限酵素HindIII とSspIとで処理し、149bp のHindIII-SspI断片（断片Ａ）を作製 する。この断片は２箇所に一時変を有するA1部位を含む(568番目がAsp の代わり にVal になっており、591番目がAsp の代わりにTry である)。プラスミド pFIPV -S2 をHindIII で処理し、部分的に SspI で処理し、ゲネクリーン(Geneclean B I0101 Inc.，La Jolla，CA)を用いて 1569bp のSspI-HindIII断片（断片Ｂ）を 単離する。ベクターpBS-SK+ をHindIII で処理し、脱リン酸化し、断片Ｃを作る (2960bp)。次いで、断片Ａ、ＢおよびＣをリゲーションしてプラスミドpFIPSA1^* を作製する。このプラスミドは、A1部位の２つのアミノ酸に関して一時変異を有 するFIPV S遺伝子のHindIII-HindIII 断片を含む。 続いて単純なクローニングによって天然のHindIII-HindIII断片（1696〜3418 ）をプラスミド pFIPSA1^*に含まれるHindIII-HindIII 断片で置き換えて、FIPV S遺伝子を再構成する。発現プラスミドまたは組み換えウィルスを作るにはA1部 位に一時変異を有するFIPV S遺伝子全体を用いることができる。実施例５ A2 部位の突然変異誘発 下記オリゴヌクレオチドを合成した。 オリゴヌクレオチドA21 、A22 およびプラスミドpFIPV-S2を鋳型として用いて 、ＰＣＲ反応（ＰＣＲＡ）を行い、199bp のＰＣＲ断片を合成する（断片Ａ）。 オリゴヌクレオチドA23 、A24 およびプラスミドpFIPV-S2を鋳型として用いて 、ＰＣＲ反応（ＰＣＲＢ）を行い、273bp のＰＣＲ断片を合成する（断片Ｂ）。 断片ＰＣＲＡとＢを、46bpの相補的領域を介して互いにハイブリダイズさせ、 このハイブリダイゼーション生成物の 3' 末端を延長させた後、オリゴヌクレオ チドA21 とA24 とを用いてＰＣＲ反応（ＰＣＲＣ）によって増幅し、424bp のＰ ＣＲ断片を作製する。続いてこのＰＣＲ断片をSspIとDraIとで処理し、402bp の SspI-DraI 制限酵素断片を作製する（断片Ｃ）。 プラスミドpFIPV-S2をHindIII とSspIとで処理して149bp のHindIII-SspI断片 を単離する（断片Ｄ）。 プラスミド pFIPV-S2 をHindIII とDraIとで処理して1170bpの DraI-HindIII 断片を単離する（断片Ｅ）。pBS-SK+ ベクターをHindIIIで処理し、脱燐酸化し て断片Ｆ（2960bp）を作製する。 断片Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦをリゲーションしてプラスミドpFIPSA2*を作製する。pFIP SA2^*に含まれるFIPV S遺伝子の1723bpの中 央HindIII-HindIII 断片は、３個のアミノ酸に一時変異を有する A2 部位を有す る（643 番目がAsp でなくTyr 、649 番目がArg でなくGly 、656 番目がArg で なくLys）。 続いて、単純なクローニングによって天然のHindIII-HindIII断片（1696〜341 8）をプラスミドpFIPSA2^*に含まれるHindIII-HindIII断片で置き換えて、FIPV S 遺伝子を再構成する。発現プラスミドまたは組み換えウィルスはA2部位に一時変 異を有するFIPV S遺伝子全体を用いて作製することができる。実施例６ A1 およびA2部位の突然変異誘発 予めHindIII で処理して脱リン酸化したプラスミドpBS-SK+を用いて断片Ａ（ 実施例４）、Ｃ、Ｅ（実施例５）のリゲーションを行い、プラスミドpFIPSA1^*A2^* を作製する。プラスミドpFIPSA1^*A2^*に含まれるFIPV S遺伝子の1723bpの中央Hi ndIII-HindIII断片はA1部位に２つのアミノ酸の変化を有し（実施例４参照）、A 2部位に３つのアミノ酸の変化を有する（実施例５参照）。 続いて単純なクローニングによって天然のHindIII-HindIII断片をプラスミドp FIPSA1^*A2^*に含まれるHindIII-HindIII断片で置き換えることによってFIPV S遺 伝子を再構成する。発現プラスミドまたは組み換えウィルスはA1およびA2部位に 一時変異を有するFIPV S遺伝子全体を用いて作製することができる。実施例７ A1 およびA2部位での欠失の作製 上記のクローニング方法（ＰＣＲ反応を用いた突然変異誘発 法）に従ってA1および／またはA2部位にFIPV S遺伝子のリーディングフレームを 保存した欠失を導入することができる。上記と同様なスキーム（実施例６参照） で、A1部位および／またはA2部位に欠失を有するFIPV S遺伝子の中央HindIII-Hi ndIII 断片を作ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 オドネ，ジャン−クリストフ フランス国 69006 リヨン リュ ドゥ グスラン 130 フランシ (72)発明者 シャピュイ，ジル−エミユ フランス国 69006 リヨン リュ ロー ラン−ヴィベル ３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の変異を有する FIPV S 遺伝子を含むことを特徴とするヌクレオチド配 列： 1) アミノ酸 562〜598 をコードする抗原性領域 A1 に少なくとも１つの一時変 異が存在し、それによってエンハンシング抗体を誘導しないように変化したエピ トープを有する蛋白質が発現され、および／または、 2) アミノ酸 637〜662 をコードする抗原性領域 A2 に少なくとも１つの一時変 異が存在し、それによってエンハンシング抗体を誘導しない蛋白質が発現される 。 ２．抗原性領域 A2 の一時変異が、エンハンシング抗体を誘導しないように変化 したエピトープを有する蛋白質が発現される変異である請求項１に記載のヌクレ オチド配列。 ３．Asp568 および Asp591 をコードするコドンの少なくとも一方に突然変異が 存在する請求項１に記載のヌクレオチド配列。 ４．アミノ酸 568および591 をコードするコドンの少なくとも一方に欠失が存在 する請求項１に記載のヌクレオチド配列。 ５．アミノ酸568 および591 をコードするコドンのうち少なくとも一方を含む欠 失が存在する請求項１に記載のヌクレオチド配列。 ６．Asp643、Arg649 および Arg656 をコードするコドンの少 なくとも１つに突然変異が存在する請求項１または２に記載のヌクレオチド配列 。 ７．アミノ酸 643、649 および656 をコードするコドンの少なくとも１つが欠失 した請求項１または２に記載のヌクレオチド配列。 ８．アミノ酸 643、649 および656 をコードするコドンの少なくとも１つを含む 欠失を有する請求項７に記載のヌクレオチド配列。 ９．請求項１〜８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によって発現される ポリペプチド。 10．請求項１〜８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列の組み換えウィルス または発現プラスミドの製造での利用。 11．請求項１〜８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を発現する組み換え ウィルスを含む、ネコ科の感染性腹膜炎の予防用ワクチン。 12．請求項１〜８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む発現プラスミ ドの調製物と、このプラスミドをネコに注射するためのベヒクルとを含むネコ科 の感染性腹膜炎の予防用ワクチン。 13．請求項９に記載のポリペプチドの形で少なくとも一種の一 時変異を有するFIPV S蛋白質を含有するワクチン。