ES2264198T3 - Composiciones y metodos para tratar infecciones utilizando peptidos cationicos a solas o en combinacion con antibioticos. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES, ESPECIALMENTE DE INFECCIONES BACTERIANAS. SE ADMINISTRAN A UN PACIENTE PEPTIDOS CATIONICOS COMBINADOS CON UN AGENTE ANTIBIOTICO PARA INTENSIFICAR LA ACTIVIDAD DEL AGENTE ANTIBIOTICO, SUPERAR LA TOLERANCIA, REMEDIAR LA RESISTENCIA ADQUIRIDA O LA RESISTENCIA INHERENTE.

Description

Composiciones y métodos para tratar infecciones utilizando péptidos catiónicos a solas o en combinación con antibióticos.

Campo técnico

El presente invento se refiere, en general, a métodos para tratar infecciones causadas por microorganismos usando péptidos catiónicos o una combinación de péptidos catiónicos y agentes antibióticos y, más particularmente, al uso de estos péptidos y agentes antibióticos para vencer la resistencia adquirida, la tolerancia y la resistencia inherente de un organismo infectivo al agente antibiótico.

Antecedentes del invento

Para la mayoría de los individuos sanos, las infecciones son molestas pero generalmente no amenazadoras para la vida. Muchas infecciones son exitosamente combatidas por el sistema inmune del individuo. El tratamiento es algo adyuvante y está fácilmente disponible en los países desarrollados. Sin embargo, las enfermedades infecciosas son un asunto grave en los países en desarrollo y en los individuos inmunocomprometidos.

En los países en desarrollo, la falta de un saneamiento adecuado y la consiguiente poca higiene proporcionan un ambiente que favorece las infecciones bacterianas, parasitarias, fúngicas y víricas. La poca higiene y las deficiencias alimentarias pueden disminuir la eficacia de las barreras naturales, tales como la piel y las membranas mucosas, a la invasión por agentes infecciosos o la capacidad del sistema inmune para eliminar los agentes. Además, un constante ataque de patógenos puede generar tensión en las defensas de producción de anticuerpos del sistema inmune y llevar las células fagocíticas (por ejemplo, neutrófilos polimórficos) a niveles subnormales. Puede tener también lugar un derrumbe de las defensas del huésped a causa de estados tales como alteraciones circulatorias, obstrucción mecánica, fatiga, hábito de fumar, exceso de bebida, defectos genéticos, sida, trasplante de médula ósea, cáncer y diabetes. Un problema cada vez más extendido en el mundo es el de las infecciones oportunistas en individuos que son positivos en cuanto al virus de la inmunodeficiencia humana.

Aunque se puede disponer de vacunas para proteger frente a algunos de estos organismos, las vacunaciones no son siempre posibles, a causa de factores tales como mecanismos de distribución inadecuados y escasez económica, o eficaces, a causa de factores tales como distribución demasiado tardía con respecto a la infección, incapacidad del paciente para generar una respuesta inmune a la vacuna y evolución del patógeno. Para otros agentes patógenos, no hay vacunas disponibles. Cuando la protección contra una infección no es posible, se aspira generalmente al tratamiento de la infección. Los antibióticos son el arma principal del arsenal de los tratamientos. Aunque los antibióticos han demostrado ser eficaces contra muchas bacterias y han salvado así innumerables vidas, no son una panacea. El uso excesivo de antibióticos en ciertas situaciones ha provocado la propagación de cepas bacterianas resistentes. Y es importante advertir que los agentes antibacterianos son inútiles contra infecciones virales.

Diversos organismos crean péptidos catiónicos (cargados positivamente), moléculas usadas como parte de un mecanismo de defensa inespecífico contra microorganismos. Cuando están aislados, estos péptidos son tóxicos para una gran variedad de microorganismos, incluyendo bacterias, hongos y ciertos virus con envoltura. Un péptido catiónico hallado en neutrófilos es la indolicidina. Aunque la indolicidina actúa contra muchos patógenos, existen notables excepciones y grados variables de toxicidad.

Además, ni la terapia con antibióticos sola ni la terapia con péptidos catiónicos sola pueden combatir eficazmente a todas las infecciones. Al ampliarse las categorías de microorganismos que responden a la terapia o vencerse la resistencia de un microorganismo a agentes antibióticos se mejorarán la salud y el bienestar. Además, la calidad de vida resultará mejorada a causa de, por ejemplo, una duración disminuida de la terapia y una permanencia reducida en el hospital, incluyendo las instalaciones de cuidados especiales, con el concomitante riesgo reducido de infecciones nosocomiales (adquiridas en el hospital) graves.

En el presente invento se describen péptidos catiónicos, incluyendo compuestos análogos de indolicidina y péptidos de fusión de cecropina/melitina, en combinación con antibióticos para que la combinación sea sinérgica, capaz de vencer la tolerancia del microorganismo o capaz de vencer la resistencia al tratamiento con antibióticos, o proporcione además otras ventajas relacionadas.

En los documentos WO-A-9708199, WO-A-9522338 y WO-A-9222308 se describen péptidos catiónicos. En los documentos WO-A-9638473, WO-A-9112815, Antibacterial Agents Chemother., 40(8), 1.801-5 (1996), y Clinical Infect. Disease, 24, Supl. 1, S148-50 (Enero de 1997), se describe la sinergia entre péptidos catiónicos y antibióticos.

Sumario del invento

La descripción presente proporciona, en general, la coadministración de péptidos catiónicos con un agente antibiótico y también proporciona compuestos análogos de indolicidina específicos. El invento se refiere a péptidos catiónicos como los definidos en la reivindicación 1.

En otras realizaciones, el compuesto análogo de péptido catiónico tiene uno o más aminoácidos alterados hacia un correspondiente D-aminoácido y, en ciertas realizaciones preferidas, el aminoácido N-terminal y/o el C-terminal es un D-aminoácido. Otras modificaciones preferidas incluyen compuestos análogos que están acetilados en el aminoácido N-terminal, amidados en el aminoácido C-terminal, esterificados en el aminoácido C-terminal, y modificados por incorporación de homoserina/lactona de homoserina en el aminoácido C-terminal. En otros aspectos, se proporciona una composición que comprende un compuesto análogo de indolicidina y un antibiótico.

Además, se proporciona un dispositivo, que puede ser un dispositivo médico, que está revestido con un péptido catiónico y un agente antibiótico.

En esta descripción también se proporcionan, en general, métodos para tratar infecciones causadas por un microorganismo usando una combinación de péptidos catiónicos y agentes antibióticos. En un aspecto, el método comprende administrar a un paciente una dosis terapéuticamente eficaz de una combinación de un agente antibiótico y un péptido catiónico, en el que la administración de un agente antibiótico solo es ineficaz. Se proporcionan antibióticos y péptidos preferidos.

En otro aspecto, se proporciona un método para potenciar la actividad de un agente antibiótico frente a una infección causada por un microorganismo en un paciente, que comprende administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz del agente antibiótico y un péptido catiónico. En aún otro aspecto, se proporciona un método para potenciar la actividad antibiótica de la lisozima o la nisina, que comprende administrar lisozima o nisina con un agente antibiótico.

En otros aspectos, se proporcionan métodos para tratar una infección, en un paciente, causada por una bacteria que es tolerante a un agente antibiótico, causada por un microorganismo que es inherentemente resistente a un agente antibiótico o causada por un microorganismo que tiene resistencia adquirida a un agente antibiótico, que comprenden administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz del agente antibiótico y un péptido catiónico, venciéndose de este modo la tolerancia o la resistencia inherente o adquirida al agente antibiótico.

En aún otros aspectos relacionados, se proporcionan métodos para matar a un microorganismo que es tolerante o inherentemente resistente, o tiene resistencia adquirida, a un agente antibiótico, que comprende poner el microorganismo en contacto con el agente antibiótico y un péptido catiónico, venciéndose de este modo la tolerancia, la resistencia inherente o la resistencia adquirida al agente antibiótico.

Estos y otros aspectos del presente invento se harán evidentes tras referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos. Además, más adelante se exponen diversas referencias que describen con mayor detalle ciertos procedimientos o composiciones y que, por lo tanto, se incorporan por referencia en su totalidad.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-E presentan resultados de ensayos de tiempo-muerte para MBI 11CN, MBI 11F3CN, MBI
11B7CN, MBI 11F4CN, y MBI 26 más vancomicina. Se representa gráficamente el número de unidades formadoras de colonias x 10^{-4} frente al tiempo.

La Figura 2 es un gráfico que muestra la estabilidad de MBI11B7CN en suero térmicamente inactivado de conejo.

La Figura 3 presenta registros de cromatografía de alta eficacia en fase líquida (HPLC; del inglés, high performance liquid chromatography) que muestran los efectos de amastatina y bestatina sobre la degradación peptídica.

La Figura 4 es un cromatograma que muestra la extracción de péptidos en plasma de conejo.

La Figura 5 es un gráfico que presenta el cambio en los niveles sanguíneos de MBI 11CN in vivo en varios momentos después de una inyección intraperitoneal.

Descripción detallada del invento

Antes de exponer el invento, puede ser útil para su comprensión exponer las definiciones de ciertos términos que aquí se usan.

Las presentes denominaciones de los aminoácidos se exponen como el código estándar de una o tres letras. Una letra mayúscula indica un aminoácido en forma L; una letra minúscula indica un aminoácido en forma D.

Como se usa aquí, un "agente antibiótico" se refiere a una molécula que sirve para prevenir, inhibir o destruir la vida. La expresión "agente antimicrobiano" se refiere a un agente antibiótico específicamente dirigido a un microorganismo.

Como se usa aquí, "péptido catiónico" se refiere a un péptido que tiene una carga neta positiva dentro del intervalo de pH de 4-10. Un péptido catiónico tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos y tiene al menos un aminoácido básico (por ejemplo, arginina, lisina, histidina). Preferiblemente, el péptido tiene actividad antimicrobiana mensurable cuando se administra solo.

Como se usa aquí, un "compuesto análogo peptídico", "compuesto análogo" o "variante" de un péptido catiónico, tal como indolicidina, tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos, tiene al menos un aminoácido básico (por ejemplo, arginina o lisina) y tiene actividad antimicrobiana. A menos que se indique otra cosa, un amino-ácido nombrado se refiere a la forma L. Los aminoácidos básicos incluyen arginina, lisina, histidina y derivados. Los restos hidrófobos incluyen triptófano, fenilalanina, isoleucina, leucina, valina y derivados.

Dentro del alcance del presente invento también se incluyen derivados de aminoácidos que han sido alterados por medios químicos, tales como metilación (por ejemplo, \alpha-metilvalina), amidación, especialmente del aminoácido C-terminal mediante una alquilamina (por ejemplo, etilamina, etanolamina o etilendiamina), y alteración de la cadena lateral de un aminoácido, tal como la acilación del grupo \varepsilon-amino de la lisina. Otros aminoácidos que pueden estar incorporados en el compuesto análogo incluyen cualesquiera de los D-aminoácidos que corresponden a los 20
L-aminoácidos comúnmente hallados en proteínas, imino-aminoácidos, aminoácidos raros, tal como hidroxilisina, y aminoácidos no proteicos, tales como homoserina y ornitina. Un compuesto análogo peptídico puede tener ninguno o uno o más de estos derivados, y D-aminoácidos. Además, un péptido puede ser también sintetizado como un retro-, inverto- o retro-inverto-péptido.

Como se usa aquí, la "resistencia inherente" de un microorganismo a un agente antibiótico se refiere a una resistencia natural a la acción del agente incluso en ausencia de una exposición previa al agente (R.C. Moellering, Jr., Principles of Anti-infective Therapy; en Principles and Practice of Infectious Diseases, 4ª edición, compilado por G.L. Mandell, J.E. Bennett y R. Dolin, Churchill Livingstone, New York, EE.UU., 1995, página 200).

Como se usa aquí, la "resistencia adquirida" de un microorganismo a un agente antibiótico se refiere a una resistencia que no es inhibida por las concentraciones séricas alcanzables normales de un agente antibiótico recomendado basadas en la dosificación recomendada [directrices del National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS)]

Como se usa aquí, la "tolerancia" de un microorganismo a un agente antibiótico se refiere a cuando hay un efecto microestático, en vez de microcida, del agente. La tolerancia se mide por una relación MBC:MIC (concentración bactericida mínima:concentración inhibitoria mínima) superior o igual a 32 (Textbook of Diagnostic Microbiology, compilado por C.R. Mahon y G. Manuselis, W.B. Saunders Company, Toronto, Canadá, 1995, página 92).

Como se indicó anteriormente, esta descripción proporciona métodos para tratar infecciones causadas por un microorganismo, métodos para matar un microorganismo y métodos para potenciar la actividad de un agente antibiótico. En particular, estos métodos son especialmente aplicables cuando un microorganismo es resistente a un agente antibiótico por un mecanismo tal como tolerancia, resistencia inherente o resistencia adquirida. En esta descripción, las infecciones se tratan administrando una dosis terapéuticamente eficaz de un péptido catiónico solo o en combinación con un agente antibiótico a un paciente con una infección. Similarmente, puede ponerse la combinación en contacto con un microorganismo para ocasionar su muerte.

I. Péptidos catiónicos

Como se indicó anteriormente, un péptido catiónico es un péptido que tiene una carga neta positiva dentro del intervalo de pH de 4-10. Un péptido tiene una longitud de al menos 5 aminoácidos y preferiblemente no más de 25, 27, 30, 35 ó 40 aminoácidos. Se prefieren péptidos de 12 a 30 restos. Los ejemplos de péptidos catiónicos nativos incluyen, pero no se limitan a, los péptidos representativos presentados en la Tabla siguiente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Además de los péptidos anteriormente enumerados, quimeras y compuestos análogos de estos péptidos son útiles dentro del contexto del presente invento. Para este invento, los compuestos análogos de péptidos catiónicos nativos deben conservar una carga neta positiva pero pueden contener D-aminoácidos, derivados de aminoácidos, inserciones, supresiones y similares, algunos de los cuales se discuten más adelante. Las quimeras incluyen fusiones de péptidos catiónicos, tales como los péptidos de fragmentos de los mismos anteriormente enumerados, y fusiones de péptidos catiónicos con péptidos no catiónicos.

Como aquí se describe, la modificación de cualquiera de los restos, incluyendo el extremo N o C, está dentro del alcance del invento. Una modificación preferida del extremo C es la amidación. Otras modificaciones del extremo C incluyen la esterificación y la formación de lactona. Las modificaciones N-terminales incluyen acetilación, acilación, alquilación, PEGilación, miristilación y similares. Además, el péptido puede ser modificado para formar un péptido modificado con polímero, como se describe más adelante. Los péptidos también pueden ser marcados, tal como con un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, una etiqueta para espectrometría de masas, biotina y similares.

A. Indolicidina y compuestos análogos

Como se usa aquí, "indolicidina" se refiere a un péptido catiónico antimicrobiano. Las indolicidinas pueden ser aisladas de diversos organismos. Una indolicidina es aislada de neutrófilos bovinos y es un péptido de 13 aminoácidos amidado por el extremo carboxílico en su forma nativa (Selsted et al., J. Biol. Chem. 267: 4.292, 1.992). En la SEQ ID NO: 1 se presenta una secuencia de aminoácidos de la indolicidina.

B. Péptidos de cecropina

Las cecropinas son péptidos catiónicos que tienen actividad antimicrobiana contra bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas. Se han aislado cecropinas tanto de invertebrados (por ejemplo, hemolinfa de insecto) como de vertebrados (por ejemplo, intestinos de cerdo). Estos péptidos tienen generalmente de 35 a 39 restos. Una cecropina ejemplar tiene la secuencia KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK (SEQ ID NO: 79). En la Tabla 1 se presentan algunas secuencias adicionales de cecropinas. Dentro del contexto de este invento, las cecropinas incluyen compuestos análogos que tienen una o más inserciones, supresiones, aminoácidos modificados, D-aminoácidos y similares.

C. Péptidos de melitina

La melitina es un péptido catiónico hallado en el veneno de abeja. La secuencia de aminoácidos de un péptido de melitina ejemplar es GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKKRQQ (SEQ ID NO: 80). Como las cecropinas, la melitina presenta actividad antimicrobiana contra bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas. En el contexto de este invento, la melitina incluye compuestos análogos que tienen una o más inserciones, supresiones, aminoácidos modificados, D-aminoácidos y similares.

D. Péptidos quiméricos de cecropina-melitina

Como aquí se indica, los péptidos catiónicos incluyen péptidos de fusión de péptidos catiónicos nativos y compuestos análogos de péptidos de fusión. En particular, se proporcionan fusiones de cecropina y melitina. Una fusión ejemplar tiene la secuencia: cecropina A (restos 1-8)/melitina (restos 1-18). Mediante las fórmulas generales siguientes se describen otros péptidos de fusión útiles en el contexto de este invento:

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en que R_{1} es un resto de aminoácido hidrófobo, R_{2} es un resto de aminoácido hidrófilo y X es de aproximadamente 14 a 24 restos de aminoácido.

E. Drosocina y compuestos análogos

Como aquí se indica, los péptidos catiónicos incluyen drosocina y compuestos análogos de drosocina. Las drosocinas se aislan de Drosophila melanogaster. Una drosocina ejemplar es un péptido de 19 aminoácidos que tiene la secuencia: GKPRPYSPRPTSHPRPIRV (SEQ ID NO: 89; nº de acceso S35984 de GenBank). Los compuestos análogos de drosocina incluyen péptidos que tienen inserciones, supresiones, aminoácidos modificados, D-aminoácidos y similares.

F. Síntesis de péptidos

Los péptidos pueden ser sintetizados mediante métodos químicos estándares, incluyendo la síntesis por procedimiento automatizado. En general, los compuestos análogos peptídicos son sintetizados basándose en la estrategia estándar de protección con Fmoc en fase sólida, con HATU como agente de copulación. El péptido es escindido de la resina de la fase sólida con ácido trifluoracético que contiene apropiados agentes supresores, que también desprotege grupos funcionales de cadenas laterales. El péptido crudo es adicionalmente purificado usando cromatografía preparativa en fase inversa. Pueden usarse otros métodos de purificación, tales como cromatografía de reparto, filtración en gel, electroforesis en gel y cromatografía de intercambio iónico.

Para producir péptidos equivalentes pueden emplearse otras técnicas de síntesis conocidas en este campo técnico, tal como la estrategia de protección con tBoc, o usarse diferentes reactivos de copulación o similares. Los péptidos pueden ser sintetizados en forma de moléculas lineales o moléculas ramificadas. Los péptidos ramificados contienen típicamente un péptido central que proporciona diversos puntos de fijación para péptidos adicionales. La lisina es muy comúnmente usada para el péptido central porque tiene un grupo funcional carboxilo y dos grupos funcionales amina (alfa y épsilon). Pueden usarse también otros ácidos diamínicos. Para sintetizar estos péptidos multímeros, la resina de la fase sólida es derivatizada con la matriz central, y para la síntesis y la escisión de la resina subsiguientes se siguen procedimientos estándares. Los péptidos multímeros pueden ser usados dentro del contexto de este invento como cualquiera de los péptidos lineales.

G. Producción recombinante de péptidos

Los péptidos pueden ser alternativamente sintetizados por producción recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.593.866). Una diversidad de sistemas huésped son adecuados para la producción de los compuestos análogos peptídicos, incluyendo bacterias (por ejemplo, E. coli), levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) y células de insecto (por ejemplo, Sf9) y mamífero (por ejemplo, CHO, COS-7). Se han desarrollado muchos vectores de expresión que están disponibles para cada uno de estos huéspedes. En este invento se usan generalmente células bacterianas y vectores que son funcionales en bacterias. Sin embargo, a veces puede ser preferible tener vectores que sean funcionales en otros huéspedes. Aquí y en, por ejemplo, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU., 1987) y Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Company, 1995) se discuten vectores y procedimientos para la clonación y expresión en E. coli.

Una secuencia de DNA que codifica un péptido catiónico es introducida en un vector de expresión apropiado para el huésped. En realizaciones preferidas, el gen es clonado en un vector para crear una proteína de fusión. Se elige una pareja de fusión que contenga una región aniónica, para que el huésped bacteriano esté protegido del efecto tóxico del péptido. Esta región protectora neutraliza eficazmente los efectos antimicrobianos del péptido y puede también evitar la degradación del péptido por proteasas del huésped. La pareja de fusión (proteína portadora) del invento puede actuar además para transportar el péptido de fusión a cuerpos de inclusión, el periplasma, la membrana externa o el ambiente extracelular. Las proteínas portadoras adecuadas en el contexto de este invento incluyen específicamente, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa (GST), proteína A de Staphylococcus aureus, dos dominios (ZZ) sintéticos ligantes de IgG de la proteína A, proteína F de membrana externa, \beta-galactosidasa (lacZ) y diversos productos del bacteriófago \lambda y el bacteriófago T7. Además, no es necesario usar la proteína portadora entera con tal que esté presente la región aniónica protectora.

Para facilitar el aislamiento de la secuencia peptídica, se usan aminoácidos susceptibles de escisión química (por ejemplo, CNBr) o escisión enzimática (por ejemplo, proteasa V8, tripsina) para unir el péptido y la pareja de fusión. Para expresión en E. coli, la pareja de fusión es preferiblemente una proteína intracelular normal que dirige la expresión hacia la formación de cuerpos de inclusión. En tal caso, después de la escisión para liberar el producto final, no hay necesidad de renaturalización del péptido.

En el presente invento, el casete de DNA, que comprende el gen del péptido y la pareja de fusión, puede ser insertado en un vector de expresión, el cual puede ser un plásmido, virus u otro vehículo conocido en la técnica. Como mínimo, el vector de expresión debería contener una secuencia promotora. Sin embargo, pueden incluirse también otras secuencias reguladoras. Dichas secuencias incluyen un potenciador, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia señal de terminación de transcripción, una secuencia señal de secreción, un origen de replicación, un marcador seleccionable y similares. Las secuencias reguladoras están operativamente asociadas entre sí para permitir la transcripción y la subsiguiente traducción. Preferiblemente, el vector de expresión es un plásmido que contiene un promotor inducible o constitutivo para facilitar la transcripción eficaz de la insertada secuencia de DNA en el huésped. La transformación de la célula huésped con el DNA recombinante puede ser llevada a cabo mediante técnicas mediadas por Ca^{++}, mediante electroporación o mediante otros métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

El producto peptídico es aislado mediante técnicas estándares, tales como afinidad, exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, HPLC y similares. Un péptido aislado debería mostrar preferiblemente una banda principal, por electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico y tinción con azul de Coomassie, que fuera al menos el 90% del material.

II. Ensayo

Los péptidos catiónicos del presente invento son evaluados, solos o en combinación con un agente antibiótico u otro compuesto análogo, en cuanto a su potencial como agentes terapéuticos antibióticos usando una serie de ensayos. Preferiblemente, se evalúan inicialmente todos los péptidos in vitro, se seleccionan los candidatos más prometedores para una ulterior evaluación in vivo, y luego se seleccionan candidatos para estudios preclínicos. Los ensayos in vitro incluyen la medición de actividad antibiótica, toxicidad, solubilidad, farmacología, estructura secundaria, permeabilización de liposomas, y similares. Los ensayos in vivo incluyen la evaluación de la eficacia en modelos animales, antigenicidad, toxicidad y similares. En general, se llevan inicialmente a cabo los ensayos in vitro y a continuación los ensayos in vivo.

Se prefieren los péptidos que tienen cierta actividad antimicrobiana, aunque puede que dicha actividad no sea necesaria para potenciar la actividad de un agente antibiótico. Además, para uso in vivo, los péptidos deberían demostrar preferiblemente unos perfiles de toxicidad aceptables, según se miden por procedimientos estándares. Se prefiere toxicidad baja.

A. Ensayos in vitro

Los péptidos catiónicos, incluyendo los compuestos análogos de indolicidina, son analizados mediante, por ejemplo, un ensayo de MIC por dilución en agarosa, un ensayo de dilución en caldo, un ensayo de tiempo-muerte, o métodos equivalentes. La actividad antibiótica se mide como inhibición del crecimiento o muerte de un microorganismo (por ejemplo, bacterias, hongos).

En resumen, un candidato peptídico en caldo Mueller Hinton complementado con calcio y magnesio es mezclado con agarosa fundida. Pueden usarse otros caldos y agares con tal que el péptido pueda difundirse libremente por todo el medio. Se vierte la agarosa en pocillos o placas Petri y se deja solidificar, y se aplica una cepa de ensayo a la placa de agarosa. La cepa de ensayo se elige, en parte, en función de la prevista aplicación del péptido. De esta manera, a modo de ejemplo, si se desea un compuesto análogo de indolicidina con actividad sobre S. aureus, se usa una cepa de S. aureus. Puede que sea deseable ensayar el compuesto análogo sobre diversas cepas y/o sobre productos de aislamiento clínicos de la especie de ensayo. Las placas son incubadas durante la noche y son inspeccionadas visualmente en cuanto a crecimiento bacteriano. La concentración inhibitoria mínima (MIC; del inglés, minimun inhibitory concentration) de un péptido catiónico es la menor concentración de péptido que inhibe completamente el crecimiento del organismo. Los péptidos que presentan una buena actividad sobre la cepa de ensayo, o el grupo de cepas, que tienen típicamente una MIC inferior o igual a 16 \mug/ml, son seleccionados para un ulterior análisis.

Alternativamente, pueden usarse curvas de tiempo-muerte para determinar las diferencias de cuentas de colonias a lo largo de un periodo de tiempo establecido, típicamente 24 horas. En resumen, se prepara una suspensión de organismos de concentración conocida y se añade un candidato peptídico. Se extraen partes alícuotas de la suspensión en momentos establecidos, y se realizan una dilución, siembra en placas con medio, incubación y cuenta. Se mide la MIC como la menor concentración de péptido que inhibe completamente el crecimiento del organismo. En general, se prefieren valores de MIC bajos.

Los candidatos a péptido catiónico pueden ser adicionalmente analizados en cuanto a su toxicidad sobre células normales de mamífero. Un ensayo ejemplar es el ensayo de hemólisis de glóbulos rojos (RBC; del inglés, red blood cell) (eritrocitos). En resumen, en este ensayo, se aislan glóbulos rojos de sangre completa, típicamente por centrifugación, y se liberan de componentes plasmáticos por lavado. Una suspensión al 5% (volumen/volumen) de eritrocitos en disolución salina isotónica es incubada con el compuesto análogo peptídico en diferentes concentraciones. Generalmente, el péptido estará en un tampón de formulación adecuado. Después de una incubación de aproximadamente 1 hora a 37°C, se centrifugan las células y se determina la absorbancia del sobrenadante a 540 nm. Se determina una medida relativa de lisis por comparación con la absorbancia después de la lisis completa de los eritrocitos usando NH_{4}Cl o un equivalente (para la que se establece un valor de 100%). Un péptido con < 10% de lisis para 100 \mug/ml es adecuado. Preferiblemente, hay < 5% de lisis para 100 \mug/ml. Dichos péptidos que no son líticos o que sólo son moderadamente líticos son deseables y adecuados para una exploración ulterior. Para evaluar la toxicidad in vitro pueden usarse otros ensayos de toxicidad in vitro, tal como, por ejemplo, la medición de toxicidad sobre células de mamífero en cultivo.

La solubilidad del péptido en tampón de formulación es un parámetro adicional que puede ser examinado. Pueden usarse diversos ensayos diferentes, tal como el aspecto en tampón. En resumen, se suspende el péptido en una disolución, tal como caldo o tampón de formulación. El aspecto se evalúa de acuerdo con una escala que varía entre (a) claro, sin precipitado, (b) ligero, precipitado difuso, y (c), turbio, precipitado denso. Pueden usarse graduaciones más finas. En general, es más deseable menos precipitado. Sin embargo, puede ser aceptable cierto precipitado.

Pueden llevarse a cabo ensayos in vitro adicionales para evaluar el potencial del péptido como agente terapéutico, Dichos ensayos incluyen solubilidad del péptido en formulaciones, farmacología en sangre o plasma, unión a proteínas séricas, análisis de la estructura secundaria, tal como, por ejemplo, por dicroísmo circular, permeabilización de liposomas y permeabilización de la membrana bacteriana interna.

B. Ensayos in vivo

Los péptidos, incluyendo los compuestos análogos peptídicos, seleccionados sobre la base de los resultados de los ensayos in vitro, pueden ser analizados in vivo en cuanto a su eficacia, toxicidad y similares.

La actividad antibiótica de los péptidos seleccionados puede ser evaluada in vivo en cuanto a su capacidad para mejorar infecciones microbianas usando modelos animales. Se dispone de una diversidad de métodos y modelos animales. En estos ensayos, un péptido es útil como agente terapéutico si la inhibición del crecimiento del microorganismo es estadísticamente significativa en comparación con la inhibición con vehículo solo. Esta medición puede realizarse directamente a partir de cultivos aislados de fluidos o sitios corporales, o indirectamente evaluando los índices de supervivencia de animales infectados. Para la evaluación de la actividad antibacteriana se dispone de varios modelos animales, tales como modelos de infección aguda que incluyen aquellos en que (a) ratones normales reciben una dosis letal de microorganismos, (b) ratones neutropénicos reciben una dosis letal de microorganismos, o (c) conejos reciben un inóculo en el corazón, y modelos de infección crónica. El modelo seleccionado dependerá en parte de la prevista indicación clínica del compuesto análogo.

A modo de ejemplo, en un modelo de ratón normal, se inocula intraperitoneal o intravenosamente una dosis letal de bacterias a ratones. Típicamente, la dosis es tal que el 90-100% de los animales mueren en un periodo de 2 días. La elección de la cepa de microorganismo para este ensayo depende, en parte, de la prevista aplicación del compuesto análogo, y, en los ejemplos adjuntos, se llevan a cabo ensayos con tres cepas diferentes de Staphylococcus. En resumen, poco antes o después de la inoculación (generalmente en un periodo de 60 minutos), se inyecta el compuesto análogo en un tampón de formulación adecuado. Pueden administrarse múltiples inyecciones de compuesto análogo. Se observan los animales durante hasta 8 días después de la infección y se registra la supervivencia de animales. Un tratamiento exitoso salva a los animales de la muerte o retrasa la muerte en un nivel estadísticamente significativo, en comparación con animales testigo sin tratamiento.

La toxicidad in vivo de un péptido se mide por medio de la administración de una variedad de dosis a animales, típicamente ratones, por una vía definida en parte por el previsto uso clínico. Se registra la supervivencia de los animales y puede calcularse la dosis letal mediana (LD_{50}; del inglés, lethal dose), la LD_{90-100} y la dosis tolerada máxima (MTD; del inglés, maximum tolerated dose) para permitir la comparación de compuestos análogos.

Además, para uso in vivo, se prefiere una baja inmunogenicidad. Para medir la inmunogenicidad, se inyectan péptidos a animales normales, generalmente conejos. En diversos momentos después de una sola inyección o múltiples inyecciones, se obtiene suero y se analiza en cuanto a la reactividad de anticuerpos hacia el compuesto análogo peptídico. Los anticuerpos hacia los péptidos pueden ser identificados mediante ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked immunosorption assay), ensayos de inmunoprecipitación, transferencias Western y otros métodos (véase Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU., 1987). Se prefiere ninguna o mínima reactividad de anticuerpos. Además, puede determinarse la farmacocinética de los compuestos análogos en animales y la histopatología de los animales tratados con compuestos análogos.

La selección de péptidos catiónicos como posibles agentes terapéuticos se basa en los resultados de ensayos in vitro e in vivo. En general, los péptidos que presentan baja toxicidad a altos niveles de dosificación y alta eficacia a bajos niveles de dosificación son candidatos preferidos.

III. Agentes antibióticos

Un agente antibiótico incluye cualquier molécula que tiende a prevenir, inhibir o destruir la vida y, como tal, incluye agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes antivirales y agentes antiparasitarios. Estos agentes pueden ser aislados de un organismo que produzca el agente o ser obtenidos de una fuente comercial (por ejemplo, una compañía farmacéutica tal como Eli Lilly, Indianápolis, Indiana, EE.UU.; Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.).

Los agentes antibióticos antibacterianos incluyen, pero no se limitan a, penicilinas, cefalosporinas, carbacefemas, cefamicinas, carbapenemas, monobactamas, aminoglicosidos, glicopéptidos, quinolonas, tetraciclinas, macrólidos y fluoroquinolonas. Los ejemplos de agentes antibióticos incluyen, pero no se limitan a, penicilina G [nº de registro del Chemical Abstracts Service (CAS): 61-33-6), meticilina (nº de registro del CAS: 61-32-5), nafcilina (nº de registro del CAS: 147-52-4), oxacilina (nº de registro del CAS: 66-79-5), cloxacilina (nº de registro del CAS: 61-72-3), dicloxacilina (nº de registro del CAS: 3116-76-5), ampicilina (nº de registro del CAS: 69-53-4), amoxicilina (nº de registro del CAS: 26787-78-0), ticarcilina (nº de registro del CAS: 34787-01-4), carbenicilina (nº de registro del CAS: 4697-36-3), mezlocilina (nº de registro del CAS: 51481-65-3), azlocilina (nº de registro del CAS: 37091-66-0), piperacilina (nº de registro del CAS: 61477-96-1), imipenem (nº de registro del CAS: 74431-23-5), aztreonam (nº de registro del CAS: 78110-38-0), cefalotina (nº de registro del CAS: 153-61-7), cefazolina (nº de registro del CAS: 25953-19-9), cefaclor (nº de registro del CAS: 70356-03-5), cefamandol-formiato sódico (nº de registro del CAS: 42540-40-9), cefoxitina (nº de registro del CAS: 35607-66-0), cefuroxima (nº de registro del CAS: 55268-75-2), cefonicid (nº de registro del CAS: 61270-58-4), cefmetazol (nº de registro del CAS: 56796-20-4), cefotetan (nº de registro del CAS: 69712-56-7), cefprozilo (nº de registro del CAS: 92665-29-7), loracarbef (nº de registro del CAS: 121961-22-6), cefetamet (nº de registro del CAS: 65052-63-3), cefoperazona (nº de registro del CAS: 62893-19-0), cefotaxima (nº de registro del CAS: 63527-52-6), ceftizoxima (nº de registro del CAS: 68401-81-0), ceftriaxona (nº de registro del CAS:
73384-59-5), ceftazidima (nº de registro del CAS: 72558-82-8), cefepima (nº de registro del CAS: 88040-23-7), cefixima (nº de registro del CAS: 79350-37-1), cefpodoxima (nº de registro del CAS: 80210-62-4), cefsulodina (nº de registro del CAS: 62587-73-9), fleroxacina (nº de registro del CAS: 79660-72-3), ácido nalidíxico (nº de registro del CAS: 389-08-2), norfloxacina (nº de registro del CAS: 70458-96-7), ciprofloxacina (nº de registro del CAS: 85721-33-1), ofloxacina (nº de registro del CAS: 82419-36-1), enoxacina (nº de registro del CAS: 74011-58-8), lomefloxacina (nº de registro del CAS: 98079-51-7), cinoxacina (nº de registro del CAS: 28657-80-9), doxiciclina (nº de registro del CAS: 564-25-0), minociclina (nº de registro del CAS: 10118-90-8), tetraciclina (nº de registro del CAS: 60-54-8), amikacina (nº de registro del CAS: 37517-28-5), gentamicina (nº de registro del CAS: 1403-66-3), kanamicina (nº de registro del CAS: 8063-07-8); netilmicina (nº de registro del CAS: 56391-56-1), tobramicina (nº de registro del CAS: 32986-56-4), estreptomicina (nº de registro del CAS: 57-92-1), azitromicina (nº de registro del CAS: 83905-01-5), claritromicina (nº de registro del CAS: 81103-11-9), eritromicina (nº de registro del CAS: 114-07-8), estolato de eritromicina (nº de registro del CAS: 3521-62-8), etilsuccinato de eritromicina (nº de registro del CAS: 41342-53-4), glucoheptonato de eritromicina (nº de registro del CAS: 23067-13-2), lactobionato de eritromicina (nº de registro del CAS: 3847-29-8), estearato de eritromicina (nº de registro del CAS: 643-22-1), vancomicina (nº de registro del CAS: 1404-90-6), teicoplanina (nº de registro del CAS: 61036-64-4), cloranfenicol (nº de registro del CAS: 56-75-7), clindamicina (nº de registro del CAS: 18323-44-9), trimetoprima (nº de registro del CAS: 738-70-5), sulfametoxazol (nº de registro del CAS: 723-46-6), nitrofurantoína (nº de registro del CAS: 67-20-9), rifampina (nº de registro del CAS: 13292-46-1), mupirocina (nº de registro del CAS: 12650-69-0), metronidazol (nº de registro del CAS: 443-48-1), cefalexina (nº de registro del CAS: 15686-71-2), roxitromicina (nº de registro del CAS: 80214-83-1), co-amoxiclavulanato, combinaciones de piperacilina y tazobactam; y sus diferentes sales, ácidos, bases y demás derivados.

En la Tabla 2 se presentan categorías de antibióticos, sus modos de acción y ejemplos de antibióticos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

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Los agentes antifúngicos incluyen, pero no se limitan a, hidrocloruro de terbinafina, nistatina, anfotericina B, griseofulvina, ketoconazol, nitrato de miconazol, flucitosina, fluconazol, itraconazol, clotrimazol, ácido benzoico, ácido salicílico y sulfuro de selenio.

Los agentes antivirales incluyen, pero no se limitan a, hidrocloruro de amantadina, rimantadina, aciclovir, famciclovir, foscarnet, ganciclovir sódico, idoxuridina, ribavirina, sorivudina, trifluridina, valaciclovir, vidarabina, didanosina, estavudina, zalcitabina, zidovudina, interferón alfa y edoxudina.

Los agentes antiparasitarios incluyen, pero no se limitan a, piretrinas/butóxido de piperonilo, permetrina, yodoquinol, metronidazol, citrato de dietilcarbamazina, piperazina, pamoato de pirantel, mebendazol, tiabendazol, prazicuantel, albendazol, proguanilo, inyección de gluconato de quinidina, sulfato de quinina, fosfato de cloroquina, hidrocloruro de mefloquina, fosfato de primaquina, atovacuona, cotrimoxazol (sulfametoxazol/trimetoprima) e isetionato de pentamidina.

IV. Actividad potenciada de combinaciones de péptidos catiónicos y agentes antibióticos

Se produce actividad potenciada cuando una combinación de péptido y agente antibiótico potencia la actividad más allá de los efectos individuales del péptido o el agente antibiótico solos o de los efectos aditivos del péptido más el agente antibiótico. La actividad potenciada es especialmente deseable en al menos cuatro situaciones: (1) el microorganismo es sensible al agente antibiótico pero la dosificación presenta problemas asociados; (2) el microorganismo es tolerante al agente antibiótico y su crecimiento es inhibido, pero no es matado; (3) el microorganismo es inherentemente resistente al agente antibiótico; y (4) el microorganismo ha adquirido resistencia al agente antibiótico. La eficacia potenciada que resulta de la administración del agente antibiótico en combinación con un péptido catiónico en las situaciones anteriores: (1) permite la administración de menores dosificaciones de agente antibiótico o péptido catiónico; (2) restablece un efecto citocida; (3) vence la resistencia inherente; y (4) vence la resistencia
adquirida.

A. Potenciación de la actividad del agente antibiótico o el péptido catiónico

Una combinación sinérgica de péptido catiónico y agente antibiótico puede permitir una reducción de la dosificación de uno o los dos agentes con objeto de que se alcance un efecto terapéutico similar. Esto permitiría que se usaran dosis más pequeñas, disminuyendo por ello la incidencia de toxicidad (por ejemplo, de aminoglicosidos) y reduciendo los costes de antibióticos costosos (por ejemplo, vancomicina). Se espera que la administración concurrente o sucesiva de péptido y agente antibiótico proporcione un tratamiento más eficaz de las infecciones causadas por microorganismos (bacterias, virus, hongos y parásitos). En particular, esto podría alcanzarse usando unas dosis que, en el caso del péptido o el agente antibiótico solos, no conducirían a un éxito terapéutico. Alternativamente, el agente antibiótico y el péptido pueden ser administrados en las dosis terapéuticas para cada uno, pero, en este caso, la combinación de los dos agentes proporciona efectos aún más potentes.

Como se usa aquí, "sinergia" se refiere al efecto in vitro de la administración de una combinación de un péptido catiónico y un agente antibiótico para que (1) la concentración inhibitoria fraccionaria (FIC; del inglés, fractional inhibitory concentration) sea menor o igual a 0,5 en el ensayo de FIC aquí descrito; o (2) haya al menos un aumento de 100 veces (2log_{10}) en la muerte a las 24 horas para la combinación en comparación con el agente antibiótico solo en el ensayo de curvas de tiempo-muerte aquí descrito.

Dicha sinergia es convenientemente medida en un ensayo in vitro, tal como estudios cinéticos de muerte o un ensayo de concentración inhibitoria fraccionaria (FIC) según se determina mediante un ensayo de dilución en agarosa o caldo. Se prefiere el ensayo de dilución en agarosa.

En resumen, en el ensayo de dilución, un conjunto de 8x8 de péptidos catiónicos y agentes antibióticos titulados en diluciones al doble es inoculado con un producto de aislamiento microbiano (por ejemplo, bacteriano). La FIC se determina observando el impacto de un agente antibiótico sobre la MIC (concentración inhibitoria mínima) del péptido catiónico y viceversa. La FIC se calcula mediante la fórmula siguiente:

FIC = \frac{\text{MIC (péptido en combinación)}}{\text{MIC (péptido solo)}} + \frac{\text{MIC (antibiótico en combinación)}}{\text{MIC (antibiótico solo)}}

Una FIC \leq 0,5 es evidencia de sinergia. Una respuesta aditiva tiene un valor de FIC > 0,5 y menor o igual a 1, mientras que una respuesta indiferente tiene un valor de FIC > 1 y \leq 2. Aunque se prefiere un efecto sinérgico, un efecto aditivo aún puede indicar que la combinación de agente antibiótico y péptido catiónico es terapéuticamente útil.

B. Superación de la tolerancia

La tolerancia está asociada con un defecto en enzimas autolíticas celulares bacterianas de modo que un agente antibacteriano demuestra actividad bacteriostática en vez de bactericida (Mahon y Manuselis, Textobook of Diagnostic Microbiology, W. B. Saunders Company, Toronto, Canadá, página 92, 1995). Para agentes antibióticos que sólo tienen actividad bacteriostática, la administración de péptidos catiónicos en combinación con agentes antibióticos puede restablecer la actividad bactericida. Alternativamente, la adición de un péptido a un agente antibiótico puede aumentar la velocidad del efecto bactericida de un antibiótico.

Los efectos bactericidas de los antibióticos pueden ser medidos in vitro mediante una diversidad de ensayos. Típicamente, el ensayo es una medición de la concentración bactericida mínima (MBC; del inglés, minimal bactericidal concentration), que es una extensión de la determinación de la MIC. Se adapta el ensayo de dilución en agarosa para obtener tanto la MBC como la MIC de un agente antimicrobiano solo y del agente en combinación con un péptido catiónico. Alternativamente, pueden usarse curvas cinéticas de tiempo-muerte (o crecimiento) para determinar la MIC y la MBC.

En resumen, después de la determinación de la MIC, se determina la MBC a partir de las placas de ensayo frotando los inóculos sobre placas que contienen agente antibiótico en una concentración igual y superior a la MIC, resuspendiendo la extensión en disolución salina o medio, y sembrando una parte alícuota en placas de agarosa. Si el número de colonias en estas placas de agarosa es inferior al 0,1% del inóculo inicial (según se determina mediante una cuenta de placas inmediatamente después de la inoculación en las placas del ensayo de MIC), entonces se ha producido
\geq 99,9% de muertes. El punto final de la MBC se define como la menor concentración de agente antimicrobiano que mata el 99,9% de las bacterias de ensayo.

De este modo, la tolerancia de un microorganismo a un agente antimicrobiano viene indicada cuando el número de colonias que crecen en placas de subcultivo sobrepasa el corte de 0,1% para diversas concentraciones sucesivas superiores a la MIC observada. Una combinación de agente antimicrobiano y péptido catiónico que rompe la tolerancia da lugar a una disminución de la relación MBC:MIC a < 32.

C. Superación de la resistencia inherente

La combinación de un péptido catiónico con un agente antibiótico al que un microorganismo es inherentemente resistente (es decir, nunca se ha visto que el antibiótico fuera terapéuticamente eficaz contra el organismo en cuestión) se usa para vencer la resistencia y conferir al microorganismo susceptibilidad al agente. La superación de la resistencia inherente es especialmente útil para infecciones en que el organismo causativo se está volviendo o se ha vuelto resistente a la mayoría de, si no a todos, los antibióticos actualmente prescritos. Además, la administración de una terapia de combinación proporciona más opciones cuando hay que considerar la toxicidad y/o el precio de un agente antibiótico.

La superación de la resistencia puede ser convenientemente medida in vitro. La resistencia está vencida cuando la MIC para un agente antibiótico concreto contra un microorganismo concreto disminuye del intervalo resistente al intervalo sensible [de acuerdo con el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS); véase también Moellering en Principles and Practice of Infectious Diseases, 4ª edición, compilado por Mandell et al., Churchill Livingstone, New York, EE.UU., 1995]. Las normas del NCCLS se basan en datos microbiológicos en relación con datos farmacocinéticos y estudios clínicos. Se determina resistencia cuando el organismo que causa la infección no es inhibido por las concentraciones séricas alcanzables normales del agente antibiótico, basadas en la dosificación recomendada. Se determina susceptibilidad cuando el organismo responde a la terapia con el agente antibiótico usado con la dosificación recomendada para el tipo de infección y el microorganismo.

D. Superación de la resistencia adquirida

La resistencia adquirida de un microorganismo que era previamente sensible a un agente antibiótico se debe generalmente a procesos mutacionales en el DNA cromosómico, la adquisición de un factor de resistencia transportado por plásmidos o fagos, o la transposición de un gen o genes de resistencia de un plásmido o fago al DNA cromosómico.

Cuando un microorganismo adquiere resistencia a un antibiótico, la combinación de un péptido y un agente antibiótico puede restablecer la actividad del agente antibiótico al vencer el mecanismo de resistencia del organismo. Esto es particularmente útil para organismos que son difíciles de tratar o cuando la terapia actual es costosa o tóxica. La capacidad para usar un agente antibiótico menos costoso o menos tóxico, que había sido eficaz en el pasado, es una mejora para ciertas terapias actuales. La reintroducción de un agente antibiótico permitiría que en su evaluación se usaran estudios clínicos y datos de prescripción previos. La actividad es medida in vitro mediante MICs o curvas cinéticas de muerte, e in vivo usando pruebas clínicas en animales y seres humanos.

E. Potenciación del efecto de la lisozima y la nisina

La combinación de lisozima o nisina con un antibiótico puede mejorar su eficacia antibacteriana y permitir su uso en situaciones en que el agente solo es inactivo o inapropiado.

Las lisozimas destruyen ciertas bacterias al escindir el enlace glicosídico entre la N-acetilglucosamina y el ácido N-acetilmurámico del componente polisacárido de las paredes celulares bacterianas. Sin embargo, la lisozima sólo presenta actividad antibacteriana débil con un corto espectro de actividad. La adición de un antibiótico puede mejorar la eficacia de esta actividad y ampliar el espectro de actividad.

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Las nisinas son lantibióticos peptídicos de 34 restos con una actividad esencialmente anti-bacterias Gram positivas. La nisina se usa en la industria del procesamiento de alimentos como un conservante, especialmente para el queso, frutas envasadas y vegetales. La nisina forma poros dependientes de potencial transitorios en las membranas citoplásmicas bacterianas, pero también presenta una actividad antibacteriana débil con un corto espectro de actividad. La adición de un antibiótico puede mejorar la eficacia de la nisina y ampliar el espectro de actividad.

F. Ensayos in vivo

El ensayo in vivo implica el uso de modelos animales de infección. Típica aunque no exclusivamente, se usan ratones. El organismo de ensayo se elige de acuerdo con la prevista combinación de péptido catiónico y antibiótico que se va a evaluar. Generalmente, el organismo de ensayo es inyectado intraperitoneal (ip) o intravenosamente (iv) en una concentración de 10 a 100 veces la dosis letal para el cincuenta por ciento (LD_{50}). La LD_{50} se calcula usando un método descrito por Reed y Muench (L. J. Reed y H. Muench, The American Journal of Hygiene, 27: 493-7). El agente antibiótico y el péptido catiónico son inyectados ip, iv o subcutáneamente (sc), individualmente así como en combinación, a diferentes grupos de ratones. Los agentes antimicrobianos pueden ser administrados en una o en múltiples dosis. Los animales se observan durante un periodo de 5 a 7 días. Pueden usarse también otros modelos de infección de acuerdo con la indicación clínica para la combinación de agentes antibióticos.

Después de un periodo de 5 a 7 días, se determina el número de ratones de cada grupo que sobrevive a la agresión infecciosa. Además, cuando los organismos de ensayo son bacterias, pueden usarse las cuentas de colonias bacterianas procedentes de sangre, fluido de lavado peritoneal, fluido de otros sitios corporales y/o tejido de diferentes sitios corporales, obtenidas a diversos intervalos de tiempo, para evaluar la eficacia. Las muestras son diluidas sucesivamente en disolución salina isotónica y son incubadas durante 20-24 horas, a 37°C, en un medio de crecimiento adecuado para la bacteria.

La sinergia entre el péptido catiónico y el agente antibiótico es evaluada usando un modelo de infección como el anteriormente descrito. Para una determinación de sinergia, debería producirse uno o más de los siguientes hechos: el grupo de la combinación debería mostrar mayores índices de supervivencia en comparación con los grupos tratados con un solo agente; el grupo de la combinación y el grupo del agente antibiótico tienen índices de supervivencia equivalentes, habiendo recibido el grupo de la combinación una menor concentración de agente antibiótico; el grupo de la combinación tiene una supervivencia equivalente o mejor en comparación con el grupo del agente antibiótico, con una menor carga de microoroganismos en diversos momentos.

La superación de la tolerancia puede ser demostrada por menores cuentas de colonias bacterianas en diversos momentos en el grupo de la combinación con respecto al grupo del agente antibiótico. Esto puede dar también lugar a mejores índices de supervivencia para el grupo de la combinación.

Pueden usarse modelos animales similares a los anteriormente descritos, para establecer cuando se vence una resistencia inherente o adquirida. La cepa de microorganismo usada es, por definición, resistente al agente antibiótico y, por lo tanto, el índice de supervivencia en el grupo del agente antibiótico será próximo, si no igual, a cero por ciento. Por consiguiente, la superación de la resistencia inherente del microorganismo al agente antibiótico viene demostrada por una supervivencia aumentada del grupo de la combinación. El ensayo para invertir la resistencia adquirida puede ser llevado a cabo de un modo similar.

V. Combinaciones de péptidos y agentes antibióticos

Como se discutió aquí, los péptidos catiónicos se administran en combinación con agentes antibióticos. La combinación potencia la actividad de los agentes antibióticos. Dichas combinaciones pueden ser usadas para obtener un resultado sinérgico, vencer la tolerancia, vencer la resistencia inherente o vencer la resistencia adquirida del microorganismo al agente antibiótico.

Para conseguir un efecto sinérgico, una combinación de agente antibiótico y péptido catiónico es administrada a un paciente o es administrada de tal modo que entre en contacto con el microorganismo. Cualquier combinación de agente antibiótico y péptido catiónico puede dar lugar a un efecto sinérgico y, por lo tanto, es útil dentro del contexto de este invento.

En particular, ciertos microorganismos son dianas preferidas. Conjuntamente con estos microorganismos, ciertos agentes antibióticos habitualmente utilizados son preferidos para ser potenciados. En la Tabla siguiente se exponen estos microorganismos y las combinaciones de agentes antibióticos y péptidos catiónicos que se prefieren.

TABLA 3

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Para vencer la tolerancia, una combinación de agente antibiótico y péptido catiónico es administrada a un paciente o es administrada de tal modo que entre en contacto con el microorganismo. Cualquier combinación de agente antibiótico y péptido catiónico que venza la tolerancia es útil dentro del contexto de este invento. En particular, ciertos microorganismos que presentan tolerancia a agentes antibióticos específicos son dianas preferidas. En la Tabla siguiente se exponen estos microorganismos y las combinaciones de agentes antibióticos y péptidos catiónicos que se prefieren.

TABLA 4

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Para vencer la resistencia inherente, una combinación de agente antibiótico y péptido catiónico es administrada a un paciente o es administrada de tal modo que entre en contacto con el microorganismo. Cualquier combinación de agente antibiótico y péptido catiónico que venza la resistencia es útil dentro del contexto de este invento. En particular, ciertos microorganismos que presentan resistencia inherente a agentes antibióticos específicos son dianas preferidas. En la tabla siguiente se exponen estos microorganismos y las combinaciones de agentes antibióticos y péptidos catiónicos que se prefieren.

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TABLA 5

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Para vencer la resistencia adquirida, una combinación de agente antibiótico y péptido catiónico es administrada a un paciente o es administrada de tal modo que entre en contacto con el microorganismo. Cualquier combinación de agente antibiótico y péptido catiónico que venza la resistencia es útil dentro del contexto de este invento. En particular, ciertos microorganismos que presentan resistencia adquirida a agentes antibióticos específicos son dianas preferidas. En la Tabla siguiente se exponen estos microorganismos y las combinaciones de agentes antibióticos y péptidos catiónicos que se prefieren.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6

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A continuación se enumeran combinaciones preferidas adicionales para compuestos análogos de indolicidina:

Antibiótico		Péptido
Ciprofloxacina		MBI 11A1CN
Vancomicina		MBI 11A1CN
Piperacilina		MBI 11B9CN
Gentamicina		MBI 11B16CN
Piperacilina		MBI 11D18CN
Tobramicina		MBI 11D18CN
Vancomicina		MBI 11D18CN
Piperacilina		MBI 11E3CN
Tobramicina		MBI 11F3CN
Piperacilina		MBI 11F4CN

VI. Formulaciones y administración

Como se indicó anteriormente, el presente invento proporciona métodos para tratar y prevenir infecciones al administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto análogo peptídico de indolicidina como el aquí descrito. Los pacientes adecuados para dicho tratamiento pueden ser identificados mediante rasgos bien establecidos de una infección, tales como fiebre, pus, cultivo de organismos, y similares. Las infecciones que pueden ser tratadas con compuestos peptídicos análogos incluyen las causadas por, o debidas a, microorganismos. Los ejemplos de microorganismos incluyen bacterias (por ejemplo, Gram positivas, Gram negativas), hongos (por ejemplo, levaduras y mohos), parásitos (por ejemplo, protozoos, nematodos, cestodos y trematodos), virus y priones. Los organismos específicos de estas clases son bien conocidos (véase, por ejemplo, Davis et al., Microbiology, 3ª edición, Harper and Row, 1980). Las infecciones incluyen, pero no se limitan a, síndrome de shock tóxico, difteria, cólera, tifus, meningitis, tos ferina, botulismo, tétanos, infecciones piógenas, disentería, gastroenteritis, ántrax, enfermedad de Lyme, sífilis, rubeola, septicemia y peste.

Más específicamente, las indicaciones clínicas incluyen, pero no se limitan a: 1/infecciones después de la inserción de dispositivos intravasculares o catéteres para diálisis peritoneal; 2/infección asociada con dispositivos médicos o prótesis; 3/infección durante hemodiálisis; 4/transporte nasal y extranasal de S. aureus; 5/infecciones por heridas por quemaduras; 6/heridas quirúrgicas; 7/acné, incluyendo acné vulgar grave; 8/neumonía nosocomial; 9/meningitis; 10/fibrosis quística; 11/endocarditis infecciosa; 12/osteomielitis; y 13/septicemia en un huésped inmunocomprometido.

1/infecciones después de la inserción de dispositivos intravasculares contaminados, tales como catéteres venosos centrales, o catéteres para diálisis peritoneal. Estos catéteres son con o sin manguito, aunque el índice de infecciones es mayor con catéteres sin manguito. Una infección tanto local como sistémica puede ser el resultado de dispositivos intravasculares contaminados; en EE.UU., más de 25.000 pacientes desarrollan bacteriemia relacionada con dispositivos cada año. Los principales organismos responsables son estafilococos coagulasa negativos (CoNS; del inglés, coagulase-negative staphylococci), Staphylococcus aureus, especies de Enterococcus, E. coli y especies de Candida.

El péptido y/o el antibiótico, preferiblemente en forma de ungüento o crema, puede ser aplicado al sitio del catéter antes de la inserción del catéter y luego cada vez que se cambie el vendaje. El péptido puede ser incorporado al ungüento o la crema en, preferiblemente, una concentración de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2% (peso/volumen).

2/Infección asociada con dispositivos médicos o prótesis, tales como, por ejemplo, catéteres, injertos, válvulas cardiacas protésicas, articulaciones artificiales, etc. Del uno al cinco por ciento de las prótesis residentes llegan a infectarse, lo que normalmente requiere la eliminación o sustitución de las prótesis. Los principales organismos responsables de estas infecciones son CoNS y S. aureus.

Preferiblemente, el dispositivo médico puede ser revestido con el péptido y/o el antibiótico, sea por enlace covalente o sea por cualquier otro medio, durante o después de la fabricación del dispositivo pero antes de la inserción del dispositivo. En dicha aplicación, el antibiótico peptídico es preferiblemente aplicado como una disolución con una concentración de 0,5 a 2%.

3/Infección durante hemodiálisis. La infección es la segunda causa principal de muerte de los pacientes en hemodiálisis crónica. Aproximadamente el 23% de las bacteriemias son debidas a infecciones en el punto de acceso. La mayoría de las infecciones por injertos son causadas por estafilococos coagulasa positivos (S. aureus) y coagulasa negativos. Para combatir la infección, el péptido solo o en combinación con un antibiótico puede ser aplicado en forma de ungüento o crema al punto de diálisis antes de cada proceso de diálisis.

4/Transporte nasal y extranasal de S. aureus. Una infección por este organismo puede originar lesiones relativas a impétigo o heridas infectadas. También está asociada con índices de infección aumentados después de cirugía cardiaca, hemodiálisis, cirugía ortopédica y neutropenia, enfermedad tanto inducida como iatrogénica. El transporte nasal y extranasal de estafilococos puede originar brotes hospitalarios de la misma cepa de estafilococos que está colonizando un paso nasal o lugar extranasal de un paciente o un trabajador del hospital. Se ha puesto mucha atención en la erradicación de la colonización nasal, pero los resultados del tratamiento han sido generalmente insatisfactorios. El uso de sustancias antimicrobianas tópicas, tales como bacitracina, tetraciclina y clorhexidina, da lugar a la supresión de la colonización nasal en vez de a su erradicación.

El péptido solo o en combinación con un antibiótico es preferiblemente aplicado intranasalmente, formulado para aplicación nasal como un ungüento, crema o disolución en una concentración de 0,5 a 2%. La aplicación puede tener lugar una vez o múltiples veces hasta que se reduzca o elimine la colonización de estafilococos.

5/Infecciones por heridas por quemaduras. Aunque la frecuencia de infecciones invasoras por heridas por quemaduras se ha reducido significativamente, la infección sigue siendo la causa más común de morbilidad y mortalidad en pacientes con grandes quemaduras. La infección es el factor determinante predominante de la cicatrización de heridas, la incidencia de complicaciones y el resultado en pacientes quemados. Los principales organismos responsables son Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, Streptococcus pyogenes y diversos organismos Gram negativos. Los desbridamientos frecuentes y el establecimiento de una epidermis, o un sucedáneo tal como un injerto o un sustituto de la piel, son esenciales para la prevención de la infección.

El péptido solo o en combinación con antibióticos puede ser aplicado a heridas por quemaduras en forma de ungüento o crema y/o ser administrado sistémicamente. La aplicación tópica puede prevenir una infección sistémica después de una colonización superficial o erradicar una infección superficial. El péptido es preferiblemente administrado en forma de crema o ungüento en una concentración de 0,5 a 2%. La aplicación a la piel podría realizarse una vez al día o con la frecuencia con que se cambiaran los vendajes. La administración sistémica podría ser mediante inyecciones intravenosas, intramusculares o subcutáneas o mediante infusiones. También podrían utilizarse otras vías de administración.

6/Heridas quirúrgicas, especialmente las asociadas con material extraño, tal como, por ejemplo, suturas. Tanto como el 71% de todas las infecciones nosocomiales se producen en pacientes quirúrgicos, el 40% de las cuales son infecciones en el lugar de operación. A pesar de los esfuerzos para prevenir la infección, se estima que entre 500.000 y 920.000 infecciones por heridas quirúrgicas complican los aproximadamente 23 millones de procesos quirúrgicos llevados anualmente a cabo en Estados Unidos. Los organismos infectivos son variados pero los estafilococos son organismos importantes en estas infecciones.

El péptido solo o con un antibiótico puede ser aplicado en forma de ungüento, crema o líquido al lugar de la herida o en forma de líquido a la herida antes y durante el cierre de la herida. Después del cierre, podría aplicarse el antibiótico peptídico en los cambios de vendaje. Para heridas que están infectadas, el antibiótico peptídico podría ser aplicado tópica y/o sistémicamente.

7/Acné, incluyendo acné vulgar grave. Este estado se debe a una colonización e infección de folículos pilosos y quistes sebáceos por Propionibacterium acne. La mayoría de los casos permanecen benignos y no conducen a la formación de cicatrices, aunque un subgrupo de pacientes desarrollan grandes nódulos y quistes inflamatorios que pueden drenar y dar lugar a una significativa formación de cicatrices.

El péptido solo o con un antibiótico puede ser incorporado a un jabón o ser aplicado tópicamente en forma de crema, loción o gel a las zonas afectadas, una vez al día o múltiples veces durante el día. El tratamiento puede mantenerse mientras estén presentes las lesiones o usarse para prevenir lesiones recurrentes. El antibiótico peptídico podría ser también administrado oral o sistémicamente para tratar o prevenir lesiones por acné.

8/Neumonía nosocomial. Las neumonías nosocomiales representan casi el 20% de todas las infecciones nosocomiales. Los pacientes con mayor riesgo de desarrollar una neumonía nosocomial son aquellos que están en una unidad de cuidados intensivos, pacientes con niveles alterados de conciencia, pacientes mayores, pacientes con enfermedad pulmonar crónica, pacientes ventilados, fumadores y pacientes en situación posoperatoria. En un paciente gravemente comprometido, es probable que la causa de la neumonía sean patógenos nosocomiales resistentes a múltiples antibióticos.

Los principales organismos responsables son P. aeruginosa, S. aureus, Klebsiella pneumoniae y especies de Enterobacter. El péptido solo o en combinación con otros antibióticos podría ser administrado oral o sistémicamente para tratar la neumonía. La administración podría ser una vez al día o múltiples veces al día. Los antibióticos peptídicos podrían ser administrados directamente al pulmón por medio de inhalación o por medio de la instalación de un tubo endotraqueal.

9/Meningitis. La meningitis bacteriana sigue siendo una enfermedad común en todo el mundo. Anualmente se producen aproximadamente 25.000 casos de los que el 70% tiene lugar en niños menores de 5 años. A pesar de una reciente reducción aparente de la incidencia de secuelas neurológicas graves entre los niños que sobreviven a la meningitis bacteriana, los problemas de salud pública que resultan de esta enfermedad son significativos en todo el mundo. Los principales organismos responsables son H. influenzae, Streptococcus pneumoniae y Neisseria meningitidis. En Estados Unidos están surgiendo S. pneumoniae resistentes a fármacos adquiridos por la comunidad, como un problema muy extendido. El péptido solo o en combinación con antibióticos conocidos podría ser administrado oral o sistémicamente para tratar la meningitis. La vía preferida sería la intravenosa una vez al día o con múltiples administraciones al día. El tratamiento duraría preferiblemente hasta 14 días.

10/Fibrosis quística. La fibrosis quística (CF; del inglés, cystic fibrosis) es el trastorno genético más común de la población caucásica. La enfermedad pulmonar es la causa más común de muerte prematura en los pacientes con fibrosis quística. No se conoce una terapia antimicrobiana óptima para la CF y, en general, se cree que la introducción de mejores antibióticos anti-seudomonas ha sido el principal factor que ha contribuido al aumento de la esperanza de vida para los pacientes con CF. Los organismos más comunes asociados con la enfermedad pulmonar en la CF son S. aureus, P. aeruginosa y H. influenzae.

El péptido solo o en combinación con otros antibióticos podría ser administrado oral o sistémicamente o mediante un aerosol para tratar la fibrosis quística. Preferiblemente, el tratamiento se efectúa durante hasta 3 semanas en la enfermedad pulmonar aguda y/o durante hasta 2 semanas cada 2-6 meses para prevenir exacerbaciones agudas.

11/Endocarditis infecciosa. La endocarditis infecciosa es el resultado de una infección de las cúspides de las válvulas cardiacas, aunque puede estar implicada cualquier parte del endocardio o cualquier material protésico insertado en el corazón. Resulta normalmente fatal si no se trata. La mayoría de las infecciones tienen origen nosocomial y son causadas por patógenos cada vez más resistentes a los fármacos disponibles. Los principales organismos responsables son estreptococos viridans, especies de Enterococcus, S. aureus y CoNS.

El péptido solo o en combinación con otros antibióticos podría ser administrado oral o sistémicamente para tratar la endocarditis, aunque se preferiría la administración sistémica. El tratamiento tiene preferiblemente una duración de 2-6 semanas y puede proporcionarse como una infusión continua o como múltiples administraciones durante el
día.

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12/Osteomielitis. En la enfermedad aguda precoz, el suministro vascular al hueso está comprometido por una infección que se extiende al tejido circundante. Puede que dentro de este tejido necrótico e isquémico sea difícil erradicar las bacterias incluso después de una intensa respuesta del huésped, cirugía y/o terapia con antibióticos. Los principales organismos responsables son S. aureus, E. coli y P. aeruginosa.

El antibiótico peptídico podría ser administrado sistémicamente solo o en combinación con otros antibióticos. El tratamiento tendría una duración de 2-6 semanas. El antibiótico peptídico podría proporcionarse como una infusión continua o como múltiples administraciones durante el día. El antibiótico peptídico podría ser usado como un cemento impregnado de antibiótico o como glóbulos revestidos de antibiótico para procedimientos de reposición articular.

13/Septicemia en un huésped inmunocomprometido. El tratamiento de infecciones en pacientes que están inmunocomprometidos en virtud de granulocitopenia provocada por quimioterapia y de inmunosupresión relacionada con el trasplante de órganos o médula ósea siempre es un gran reto. El paciente neutropénico es especialmente susceptible a una infección bacteriana, por lo que la terapia con antibióticos debería iniciarse rápidamente para cubrir posibles patógenos si se sospecha una infección. Los organismos que probablemente causan infecciones en pacientes granulocitopénicos son: S. epidermidis, S. aureus, S. viridans, especies de Enterococcus, E. coli, especies de Klebsiella, P. aeruginosa y especies de Candida.

El péptido solo o con un antibiótico es preferiblemente administrado oral o sistémicamente durante 2-6 semanas. El antibiótico peptídico podría proporcionarse como una infusión continua o como múltiples administraciones durante el día.

El tratamiento eficaz de una infección puede ser examinado de diversas maneras diferentes. El paciente puede presentar fiebre reducida, número reducido de organismos, menor nivel de moléculas inflamatorias (por ejemplo, IFN-\gamma, IL-12, IL-1, TNF), y similar.

La eficacia terapéutica in vivo de la administración de un péptido catiónico y un agente antibiótico en combinación se basa en un resultado clínico exitoso y no requiere la eliminación del 100% de los organismos implicados en la infección. Basta alcanzar un nivel de actividad antimicrobiana en el lugar de la infección que permita la supervivencia del huésped o la erradicación del microorganismo. Cuando las defensas del huésped son máximamente eficaces, tal como en un individuo por lo demás sano, puede que baste sólo un efecto antimicrobiano mínimo. De esta manera, reducir la carga de organismos incluso por un log (un factor de 10) puede permitir que las defensas del huésped controlen la infección. Además, el éxito terapéutico clínico puede depender más de aumentar un efecto bactericida precoz que del efecto de larga duración. Estos sucesos precoces son una parte significativa y crítica del éxito terapéutico porque dan tiempo a que se activen los mecanismos de defensa del huésped. Esto es especialmente cierto para infecciones que amenazan la vida (por ejemplo, la meningitis) y otras infecciones crónicas graves (por ejemplo, la endocarditis infecciosa).

Los péptidos y agentes antibióticos del presente invento son preferiblemente administrados en forma de composición farmacéutica. En resumen, las composiciones farmacéuticas del presente invento pueden comprender uno o más de los compuestos análogos peptídicos aquí descritos, en combinación con uno o más vehículos, agentes diluyentes o excipientes fisiológicamente aceptables. Como aquí se indica, el tampón de formulación usado puede afectar a la eficacia o actividad del compuesto análogo peptídico.

El agente antibiótico puede ser una citoquina, un agente antivírico (por ejemplo, aciclovir, hidrocloruro de amantadina, didanosina, edoxudina, famciclovir, foscarnet, ganciclovir, idoxuridina, interferón, lamivudina, nevirapina, penciclovir, podofilotoxina, ribavirina, rimantadina, sorivudina, estavudina, trifluridina, vidarabina, zalcitabina y zidovudina), un agente antiparasitario (por ejemplo, derivados de 8-hidroxiquinoleína, alcaloides de cinchona, derivados de nitroimidazol, derivados de piperazina, derivados de pirimidina y derivados de quinoleína, albendazol, atovacuona, fosfato de cloroquina, citrato de dietilcarbamazina, eflornitina, halofantrina, yodoquinol, ivermectina, mebendazol, hidrocloruro de mefloquina, melarsoprol B, metronidazol, niclosamida, nifurtimox, paromomicina, isetionato de pentamidina, piperazina, prazicuantel, fosfato de primaquina, proguanilo, pamoato de pirantel, pirimetamina, pamoato de pirvinio, gluconato de quinidina, sulfato de quinina, estibogluconato sódico, suramina y tiabendazol), o un agente antifúngico (por ejemplo, alil-aminas, imidazoles, pirimidinas y triazoles, 5-fluorocitosina, anfotericina B, butoconazol, clorfenesina, ciclopirox, clioquinol, clotrimazol, econazol, fluconazol, flucitosina, griseofulvina, itraconazol, ketoconazol, miconazol, hidrocloruro de naftifina, nistatina, sulfuro de selenio, sulconazol, hidrocloruro de terbinafina, terconazol, tioconazol, tolnaftato y undecilenato).

Las composiciones pueden administrarse en un vehículo de distribución. Por ejemplo, la composición puede ser encapsulada en un liposoma (véanse, por ejemplo, los documentos WO 96/10585 y WO 95/35094), complejada con lípidos, encapsulada en vehículos para liberación lenta o liberación continua, tal como poligaláctido, y similar. En otras realizaciones, las composiciones pueden ser preparadas como productos de liofilización, usando excipientes apropiados para proporcionar estabilidad.

Las composiciones farmacéuticas del presente invento pueden ser administradas de diversas maneras. Por ejemplo, pueden administrarse péptidos catiónicos, con o sin agentes antibióticos, por inyección intravenosa, inyección o implantación intraperitoneal, inyección o implantación subcutánea, inyección intradérmica, lavado orgánico, inhalación, implantación, inyección o implantación intramuscular, inyección intratecal, lavado vesical, supositorios rectales, supositorios vaginales, aplicación tópica (por ejemplo, cremas, ungüentos, parches cutáneos, gotas oculares, gotas óticas y champués), vía entérica, vía oral o vía nasal. La combinación es preferiblemente administrada intravenosamente. Las vías sistémicas incluyen inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea (incluyendo un depósito para liberación de larga duración), intraocular o retrobulbar, intratecal, intraperitoneal (por ejemplo, por lavado intraperitoneal), transpulmonar usando el fármaco en aerosol o nebulizado, o transdérmica. Las vías tópicas incluyen la administración en forma de pomadas, gotas oftálmicas, gotas óticas o fluidos para irrigación (por ejemplo, para la irrigación de heridas). Las composiciones pueden ser aplicadas localmente en forma de inyección, gotas, composición pulverizable, comprimidos, crema, ungüento, gel, y similares. Pueden ser administradas en forma de bolo o de múltiples dosis a lo largo de un periodo de tiempo.

El nivel de péptido en el suero y otros tejidos después de la administración puede ser verificado mediante diversas técnicas bien establecidas, tales como ensayos basados en bacterias, cromatografía o anticuerpos, tal como un
ELISA.

Las composiciones farmacéuticas del presente invento son administradas de una manera apropiada para la infección o enfermedad que se va a tratar. La cantidad y la frecuencia de la administración vendrán determinadas por factores tales como el estado del paciente, la causa de la infección y la gravedad de la infección. Las dosificaciones apropiadas pueden ser determinadas mediante pruebas clínicas, pero variarán generalmente de aproximadamente 0,1 a 50 mg/kg. A continuación se presentan los intervalos generales de dosificación para los agentes antibióticos.

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TABLA 7

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Además, las composiciones del presente invento pueden ser usadas de igual forma que los desinfectantes comunes o en cualquier situación en que los microorganismos sean indeseables. Por ejemplo, estos péptidos pueden ser usados como desinfectantes de superficies, como revestimientos, incluyendo el enlace covalente, para dispositivos médicos, revestimientos para la ropa, tal como para inhibir el crecimiento de bacterias o repeler mosquitos, en filtros para la purificación de aire, tal como en un avión, en la purificación de agua, componentes de champúes y jabones, conservantes alimentarios, conservantes cosméticos, conservantes de medios, herbicidas o insecticidas, componentes de materiales de construcción, tal como en una composición selladora de silicona, y en el procesamiento de productos animales, tal como la curación de pieles de animales. Como se usa aquí, "dispositivo médico" se refiere a cualquier dispositivo para uso en un paciente, tal como una implantación o una prótesis. Dichos dispositivos incluyen cánulas intraluminales de arterias coronarias ("stent"), tubos, sondas, cánulas, catéteres, injertos vasculares sintéticos, dispositivos para control sanguíneo, válvulas cardiacas artificiales, agujas, y similares.

Para estos fines, los péptidos solos o junto con un antibiótico son incluidos típicamente en composiciones habitualmente empleadas o en un aplicador adecuado, tal como para aplicación a ropa. Pueden ser incorporados a, o impregnar, el material durante la fabricación, tal como para un filtro de aire, o, si no, aplicados a los dispositivos. Sólo se necesita que los péptidos y los antibióticos sean suspendidos en una disolución apropiada para el dispositivo o el artículo. Los polímeros son un tipo de vehículo que puede ser usado.

Los péptidos, especialmente los compuestos análogos marcados, pueden ser usados en análisis de imágenes y ensayos diagnósticos o para marcar sitios en organismos multicelulares y unicelulares eucarióticos y en procariontes. Como un sistema de marcación, los compuestos análogos pueden ser copulados con otros péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos y similares.

Los Ejemplos siguientes se presentan a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplos

Ejemplo 1

Síntesis, purificación y caracterización de péptidos catiónicos y compuestos análogos

La síntesis de péptidos se basa en la estrategia estándar de protección con Fmoc en fase sólida. El instrumento empleado es un sintetizador peptídico 9050 Plus (PerSeptive BioSystems Inc.). Como fase sólida, se emplean resinas injertadas de polietilenglicol-poliestireno (PEG-PS) derivatizadas con un conector aminoácido protegido con Fmoc, para síntesis amídica C-terminal. Como agente de copulación se utiliza HATU [hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio]. Durante la síntesis, se controlan continuamente las operaciones de copulación para asegurar que cada aminoácido se incorpora con alto rendimiento. El péptido es escindido de la resina de la fase sólida usando ácido trifluoracético y agentes supresores apropiados, y el péptido crudo es purificado usando cromatografía preparativa en fase inversa. Típicamente, el péptido es preparado en forma de sal de trifluoroacetato pero, mediante intercambio salino, pueden también prepararse otras sales, tales como acetato, cloruro y sulfato.

Todos los péptidos son analizados por espectrometría de masas para asegurar que el producto tiene la masa molecular esperada. El producto debería tener un único pico que correspondiera a > 95% del área total de picos cuando es sometido a HPLC analítica en fase inversa (RP; del inglés, reverse phase), un método de separación que depende de la hidrofobia del péptido. Además, el péptido debería mostrar una sola banda que correspondiera a > 90% de la intensidad total de bandas cuando es sometido a electroforesis en gel de ácido-urea, un método de separación basado en la relación carga a masa del péptido.

El contenido de péptido, la cantidad del producto que es péptido en vez de agua, sal o disolvente retenidos, se mide por análisis cuantitativo de aminoácidos, derivatización de aminas libres o cuantificación espectrofotométrica. El análisis de aminoácidos también proporciona información sobre la relación de aminoácidos presentes en el péptido, lo que ayuda a confirmar la autenticidad del péptido.

A continuación se enumeran compuestos análogos peptídicos y sus nombres. En esta lista, y en otras partes, los aminoácidos se indican mediante el código de aminoácidos de una letra, y las letras minúsculas representan la forma D del aminoácido.

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Ejemplo 2

Síntesis de péptidos modificados

Los péptidos catiónicos, tales como los compuestos análogos de indolicidina, son modificados para alterar las propiedades físicas del péptido original, sea mediante el uso, en la síntesis, de aminoácidos modificados o sea por modificación tras la síntesis. Dichas modificaciones incluyen: acetilación en el extremo N, extremo N derivatizado con Fmoc, polimetilación, peracetilación y derivados ramificados.

Acetilación \alpha-N-terminal. Antes de escindir el péptido de la resina y desprotegerlo, el péptido totalmente protegido es tratado con N-acetilimidazol en DMF durante 1 hora a temperatura ambiental, lo que da lugar a una reacción selectiva en el extremo \alpha-N. El péptido es luego desprotegido/escindido y es purificado como en el caso de un péptido no modificado.

Extremo \alpha-N derivatizado con Fmoc. Si no se lleva a cabo la operación final de desprotección del Fmoc, el grupo Fmoc del extremo \alpha-N permanece en el péptido. El péptido es luego desprotegido en las cadenas laterales/escindido y es purificado como en el caso de un péptido no modificado.

Polimetilación. El péptido purificado, en una disolución metanólica, es tratado con bicarbonato sódico en exceso y luego con yoduro de metilo en exceso. La mezcla de reacción es agitada durante la noche a temperatura ambiental, sometida a extracción con un disolvente orgánico, neutralizada y purificada como en el caso de un péptido no modificado. Usando este procedimiento, un péptido no resulta totalmente metilado; la metilación de MBI 11CN produjo una media de 6 grupos metilo. De esta manera, el péptido modificado es una mezcla de productos
metilados.

Peracetilación. Un péptido purificado, en una disolución en DMF, es tratado con N-acetilimidazol durante 1 hora a temperatura ambiental. El producto crudo es concentrado, disuelto en agua, liofilizado, redisuelto en agua y purificado como en el caso de un péptido no modificado. Se observa la acetilación completa de los grupos amina
primaria.

Derivados de cuatro/ocho ramas. Los péptidos ramificados se sintetizan sobre un núcleo de cuatro u ocho ramas unido a la resina. La síntesis y la desprotección/escisión tienen lugar como en el caso de un péptido no modificado. Estos péptidos son purificados por diálisis frente a hidrocloruro de guanidina 4 M y luego frente a agua y son analizados por espectrometría de masas.

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Ejemplo 3

Ensayos in vitro para medir la actividad de péptidos catiónicos

La actividad antimicrobiana de un péptido catiónico solo puede ser analizada antes de evaluar la potenciación de su actividad con agentes antibióticos. Preferiblemente, el péptido tiene actividad antimicrobiana mensurable.

Ensayo de dilución en agarosa

Mediante el ensayo de dilución en agarosa se mide la actividad antimicrobiana de péptidos y compuestos análogos peptídicos, que se expresa como la concentración inhibitoria mínima (MIC) de los péptidos.

Con objeto de remedar condiciones in vivo, se usa caldo Mueller Hinton complementado con calcio y magnesio en combinación con una agarosa de baja electroendósmosis (EEO) como medio para el crecimiento bacteriano. Se usa agarosa en vez de agar ya que los grupos cargados del agar impiden la difusión peptídica a través del medio. El medio es tratado en autoclave y es luego enfriado a 50-55°C en un baño de agua antes de la adición aséptica de disoluciones antimicrobianas. Se añade el mismo volumen de disolución de péptido en diferentes concentraciones a la agarosa fundida enfriada, que luego es vertida hasta un espesor de 3-4 mm.

El inóculo bacteriano es ajustado a un patrón de turbidez McFarland de 0,5 (PML Microbiological) y es luego diluido 1:10 antes de la aplicación a la placa de agarosa. El inóculo final aplicado a la agarosa es de aproximadamente 10^{4} unidades formadoras de colonias (CFU; del inglés, colony forming units) en una mancha de 5-8 mm de diámetro. Las placas de agarosa son incubadas a 35-37°C durante un periodo de 16 a 20 horas.

La MIC es registrada como la menor concentración de péptido que inhibe completamente el crecimiento del organismo, según se determina por inspección visual. En la Tabla 8 se muestran MICs representativas de diversos compuestos análogos de indolicidina contra bacterias y, más adelante, en la Tabla 9, se muestran MICs representativas contra Candida.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 8

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TABLA 9

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Ensayo de dilución en caldo

Típicamente, se añaden 100 \mul de caldo Mueller Hinton complementado con calcio y magnesio a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos y se preparan volúmenes de 100 \mul de diluciones sucesivas del péptido al doble por toda la placa. Una fila de pocillos no recibe péptido y se usa como testigo de crecimiento. Se inoculan aproximadamente 5 x 10^{5} CFU de bacterias en cada pocillo y se incuba la placa a 35-37°C durante 16-20 horas. La MIC es registrada como la menor concentración de péptido que inhibe completamente el crecimiento del organismo, según se determina por inspección visual.

Ensayo de tiempo-muerte

Se usan curvas de tiempo-muerte para determinar la actividad antimicrobiana de los péptidos catiónicos a lo largo de un intervalo de tiempo. En resumen, en este ensayo se prepara una suspensión de microorganismos, equivalente a un patrón McFarland de 0,5, en disolución salina al 0,9%. Esta suspensión es luego diluida de tal modo que, cuando se añada a un volumen total de 9 ml de caldo Mueller Hinton catiónicamente ajustado, el tamaño del inóculo sea 1 x 10^{6} CFU/ml. Se toma una parte alícuota de 0,1 ml de cada tubo a intervalos predeterminados durante hasta 24 horas, se diluye en disolución salina al 0,9% y se siembra por triplicado para determinar las cuentas de colonias viables. Se representa gráficamente el número de bacterias que quedan en cada muestra frente al tiempo para determinar el índice de muerte por el péptido catiónico. Generalmente, una reducción de tres o más log_{10} de las cuentas bacterianas en la suspensión antimicrobiana en comparación con los testigos de crecimiento indica una respuesta bactericida adecuada.

Como se muestra en las Figuras 1A-D, la mayoría de los péptidos presentan una reducción de tres o más log_{10} de las cuentas bacterianas en la suspensión antimicrobiana en comparación con los testigos de crecimiento, lo que indica que estos péptidos han cumplido los criterios para una respuesta bactericida.

Ejemplo 4

Ensayos para medir la actividad potenciada de combinaciones de agente antibiótico y péptido catiónico Curvas de muerte

Las curvas de tiempo-muerte que resultan de la combinación de un péptido catiónico y un agente antibiótico son comparadas con las que resultan del agente solo.

El ensayo se lleva a cabo del modo anteriormente descrito salvo porque se disponen tubos duplicados para cada concentración del agente antibiótico solo y de la combinación de agente antibiótico y péptido catiónico. La sinergia viene demostrada por un aumento de muerte de al menos 100 veces (2 log_{10}) a las 24 horas por la combinación del agente antibiótico y el péptido catiónico en comparación con el agente antibiótico solo. En la Figura 1E se muestra un ensayo de tiempo-muerte para MBI 26 en combinación con vancomicina frente a una cepa bacteriana. La combinación de péptido y agente antibiótico proporcionó mayor muerte que el péptido o el agente antibiótico solos.

Mediciones de FIC

En este método, la sinergia es determinada usando la técnica de dilución en agarosa. Se inoculan productos de aislamiento bacterianos a un conjunto de placas o tubos cada uno de los cuales contiene una combinación de péptido y antibiótico en una mezcla de concentración única. Cuando se llevan a cabo ensayos en fase sólida, se usa caldo Mueller Hinton complementado con calcio y magnesio en combinación con una agarosa de baja EEO como medio para el crecimiento bacteriano. Los ensayos de dilución en caldo pueden ser también usados para determinar la sinergia. La sinergia es determinada para péptidos catiónicos en combinación con diversos agentes antibióticos convencionales tales como, por ejemplo, penicilinas, cefalosporinas, carbapenemas, monobactamas, aminoglicosidos, macrólidos, fluoroquinolonas, nisina y lisozima.

La sinergia es expresada como una concentración inhibitoria fraccionaria (FIC), que se calcula de acuerdo con la ecuación siguiente. Una FIC \leq 0,5 es evidencia de sinergia. Una respuesta aditiva tiene un valor de FIC > 0,5 y \leq 1, mientras que una respuesta indiferente tiene un valor de FIC > 1 y \leq 2.

FIC = \frac{\text{MIC (péptido en combinación)}}{\text{MIC (péptido solo)}} + \frac{\text{MIC (antibiótico en combinación)}}{\text{MIC (antibiótico solo)}}

En las Tablas 10, 11 y 12 se presentan combinaciones de péptidos catiónicos y agentes antibióticos que muestran un valor de FIC inferior o igual a 1. Aunque la FIC se mide in vitro y la sinergia se define como una FIC inferior o igual a 0,5, un efecto aditivo puede ser terapéuticamente útil. Como se muestra a continuación, aunque todos los microorganismos son susceptibles (definiciones críticas del NCCLS) a los agentes antibióticos probados, la adición del péptido catiónico mejora la eficacia del agente antibiótico.

TABLA 10

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TABLA 11

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TABLA 12

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Ejemplo 5

Superación de la tolerancia mediante la administración de una combinación de agente antibiótico y péptido catiónico

La tolerancia a un agente antibiótico está asociada con un defecto en enzimas autolíticas celulares bacterianas de manera que un agente antimicrobiano es bacteriostático en vez de bactericida. La tolerancia viene indicada cuando la relación de concentración bactericida mínima (MBC) a concentración inhibitoria mínima (MIC), MBC:MIC,
es \geq 32.

Se adapta el ensayo de dilución en agarosa para obtener tanto la MBC como la MIC de un agente antimicrobiano sólo y de un agente en combinación con un péptido. Después de la determinación de la MIC, se determina la MBC a partir de las placas del ensayo de dilución en agarosa frotando los inóculos sobre las placas en una concentración igual y superior a la MIC y resuspendiendo la extensión en 1,0 ml de disolución salina. Se siembra una parte alícuota de 0,01 ml en medio de agarosa (placas de subcultivo) y se cuentan las colonias resultantes. Si el número de colonias es inferior al 0,1% del inóculo inicial (según se determina mediante una cuenta de placas inmediatamente después de la inoculación en las placas del ensayo de MIC), entonces se ha producido \geq 99,9% de muertes. El punto final de la MBC se define como la menor concentración de agente antimicrobiano que mata el 99,9% de las bacterias de
ensayo.

De este modo, tiene lugar tolerancia de un microorganismo a un agente antimicrobiano cuando el número de colonias que crecen en placas de subcultivo sobrepasa el corte de 0,1% para diversas concentraciones sucesivas superiores a la MIC observada. Una combinación de agente antimicrobiano y péptido catiónico que rompe la tolerancia da lugar a una disminución de la relación MBC:MIC a < 32. En la Tabla 13 se muestra que la combinación de vancomicina y MBI 26 vence la tolerancia de los organismos enumerados.

TABLA 13

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Ejemplo 6

Superación de la resistencia inherente mediante la administración de una combinación de agente antibiótico y péptido catiónico

Los péptidos son analizados en cuanto a su capacidad para vencer la resistencia antimicrobiana inherente de microorganismos, incluyendo los encontrados en establecimientos hospitalarios, a agentes antimicrobianos específicos. Se demuestra superación de la resistencia cuando el agente antibiótico solo presenta mínima o ninguna actividad contra el microorganismo pero, cuando se usa en combinación con un péptido catiónico, aparece susceptibilidad del microorganismo.

Se usa el ensayo de dilución en agarosa anteriormente descrito para determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC) de los agentes antimicrobianos y los péptidos catiónicos, solos y en combinación. Alternativamente, puede usarse el ensayo de dilución en caldo o curvas de tiempo-muerte para determinar las MICs. En las Tablas 14-17 se presentan valores de MIC para agentes antibióticos solos y en combinación con péptido en la concentración mostrada. En todos los casos, el microorganismo es inherentemente resistente a su modo de acción, por lo que el agente antibiótico no es eficaz contra el microorganismo de ensayo. Además, el agente antibiótico no es clínicamente prescrito contra el microorganismo de ensayo.

En los datos presentados a continuación, los valores de MIC de los agentes antibióticos cuando se administran en combinación con un péptido están disminuidos, desde igual o superior al punto de cambio de la resistencia hasta por debajo de él.

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TABLA 14

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TABLA 15

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TABLA 16

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TABLA 17

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Ejemplo 7

Superación de la resistencia adquirida mediante la administración de una combinación de agente antibiótico y péptido catiónico

Un agente antibiótico puede volverse ineficaz contra un microorganismo previamente susceptible si el microorganismo adquiere resistencia al agente. Sin embargo, puede vencerse la resistencia adquirida cuando el agente es administrado en combinación con un péptido catiónico. Por ejemplo, los enterococos resistentes a vancomicina (VRE; del inglés, vancomycin resistant enterococci) se vuelven susceptibles a vancomicina cuando ésta se usa en combinación con un péptido catiónico tal como MBI 26. Es probable que esta combinación sea eficaz contra otros organismos que han adquirido resistencia a la vancomicina, incluyendo, pero sin limitarse a, cepas de S. aureus resistente a meticilina (MRSA; del inglés, methicillin resistant S. aureus).

Similarmente, enterococos resistentes a teicoplanina se vuelven susceptibles a teicoplanina cuando ésta se usa en combinación con péptidos catiónicos, tal como MBI 26.

Como se describió previamente, se usa el ensayo de dilución en agarosa para determinar la MIC de agentes antibióticos administrados solos y en combinación con un péptido catiónico. Alternativamente, puede emplearse el ensayo de dilución en caldo o curvas de tiempo-muerte. En las Tablas 18 y 19 se presentan resultados que muestran que la administración de un péptido catiónico en combinación con un agente antibiótico vence la resistencia adquirida. En la Tabla 20 se presentan resultados que muestran la administración de MBI 26 en combinación con teicoplanina contra enterococos resistentes a teicoplanina.

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TABLA 18

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43

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TABLA 19

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TABLA 20

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51

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Estos datos muestran que se puede vencer la resistencia adquirida. Por ejemplo, la resistencia adquirida de S. aureus, un organismo Gram positivo, a la piperacilina es vencida cuando ésta se combina con MBI 27, y la resistencia adquirida a la ciprofloxacina es vencida con el péptido MBI 21A1 o MBI 21A2. Contra enterococos resistentes, se obtienen resultados similares con los péptidos MBI 26 y MBI 31 en combinación con meticilina y eritromicina, y con el péptido MBI 26 en combinación con vancomicina o teicoplanina.

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Ejemplo 8

Sinergia de péptidos catiónicos y lisozima o nisina

La eficacia de la lisozima o la nisina resulta mejorada cuando uno u otro agente se administra en combinación con un agente antibiótico. La mejora se demuestra mediante la medición de las MICs de la lisozima o la nisina solas y en combinación con el antibiótico, siendo la MIC de la lisozima o la nisina, o del antibiótico, menor cuando está en combinación que cuando está sola. Las MICs pueden ser medidas mediante el ensayo de dilución en agarosa, el ensayo de dilución en caldo o curvas de tiempo-muerte.

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Ejemplo 9

Hemólisis de eritrocitos por péptidos catiónicos

Se usa un ensayo de lisis de glóbulos rojos (RBC) para agrupar péptidos de acuerdo con su capacidad para lisar RBC bajo condiciones normalizadas, en comparación con MBI 11CN y gramicidina S. Se preparan muestras peptídicas y RBC lavados de oveja en disolución salina isotónica, ajustándose el pH final a un valor de entre 6 y 7. Se mezclan las muestras peptídicas y la suspensión de RBC para obtener disoluciones que tienen RBC al 1% (volumen/volumen) y 5, 50 ó 500 \mug/ml de péptido. El ensayo se lleva a cabo del modo anteriormente descrito. Cada grupo de ensayos incluye también MBI 11CN (500 \mug/ml) y gramicidina S (5 \mug/ml) como testigos de "pequeña lisis" y "gran lisis", respectivamente.

Se analizan MBI 11B7CN, MBI 11F3CN y MBI 11F4CN usando este procedimiento y se presentan los resultados en la Tabla 21 siguiente.

TABLA 21

52

Se considera que los péptidos que, a 5 \mug/ml, lisan RBC en un grado igual o mayor que la gramicidina S, el testigo de "gran lisis", son muy líticos. Se considera que los péptidos que, a 500 \mug/ml, lisan RBC en un grado igual o menor que MBI 11CN, el testigo de "pequeña lisis", no son líticos. Los tres compuestos análogos analizados son "moderadamente líticos" ya que causan más lisis que MBI 11CN y menos que la gramicidina S. Además, uno de los compuestos análogos, MBI 11F3CN, es significativamente menos lítico que las otras dos variantes en las tres concentraciones analizadas.

Se analiza una combinación de péptido catiónico y agente antibiótico en cuanto a su toxicidad hacia células eucarióticas midiendo el grado de lisis de glóbulos rojos de mamífero. En resumen, se separan glóbulos rojos de sangre completa por centrifugación, se eliminan los componentes plasmáticos por lavado y se resuspenden los glóbulos rojos en disolución salina isotónica hasta una suspensión al 5% (volumen/volumen). Se premezclan el péptido y el agente antibiótico en disolución salina isotónica o en otra disolución aceptable y se añade una parte alícuota de esta disolución a la suspensión de glóbulos rojos. Después de una incubación con agitación constante a 37°C durante 1 hora, se centrifuga la disolución y se mide la absorbancia del sobrenadante a 540 nm, lo que permite detectar la hemoglobina liberada. La comparación de esta absorbancia con la A_{540} de un patrón lisado al 100% proporciona una medida relativa de liberación de hemoglobina de glóbulos rojos, lo que indica la capacidad lítica de la combinación del péptido catiónico y el agente antibiótico.

Ejemplo 10

Farmacología de péptidos catiónicos en plasma y sangre

La duración in vitro de péptidos libres en plasma y en sangre es determinada midiendo la cantidad de péptido presente después de tiempos de incubación establecidos. Se recoge sangre de oveja, se trata con un anticoagulante (no heparina) y, para la obtención del plasma, se centrifuga para separar las células. Se añade el péptido formulado a la fracción plasmática o a la sangre completa y se realiza una incubación. Después de la incubación, el péptido es identificado y es cuantificado directamente mediante HPLC en fase inversa o un ensayo basado en anticuerpos. El agente antibiótico es cuantificado mediante un ensayo adecuado, seleccionado en función de su estructura. Las condiciones cromatográficas son como las anteriormente descritas. No se requiere extracción ya que el pico del péptido libre no se solapa con picos de sangre ni plasma.

Se añade una disolución de 1 mg/ml de MBI 11B7CN en disolución salina isotónica a suero recién preparado y térmicamente inactivado de conejo, para obtener una concentración final de péptido de 100 \mug/ml, y se realiza una incubación a 32°C. En la Figura 2 se muestran los niveles peptídicos detectados en diversos momentos de la incubación.

Se lleva a cabo una serie de estudios de estabilidad peptídica para investigar la acción de inhibidores de proteasas sobre la degradación peptídica. Se añade el péptido a suero o plasma de conejo, con o sin inhibidores de proteasas, y luego se realiza una incubación a 22°C durante 3 horas. Los inhibidores de proteasas analizados incluyen amastatina, bestatina, cóctel COMPLETE de inhibidores de proteasas, leupeptina, pepstatina A y EDTA. La amastatina y la bestatina en concentración 100 \muM evitan la degradación de MBI 11B7CN en plasma durante 3 horas. Para estos experimentos, se preparan disoluciones concentradas 10 mM de amastatina y bestatina en dimetilsulfóxido. Estas disoluciones son diluidas 1:100 en suero térmicamente inactivado de conejo y son incubadas a 22°C durante 15 minutos antes de la adición del péptido. Se añade MBI 11B7CN al suero en una concentración final de 100 \mug/ml y se realiza una incubación a 22°C durante 3 horas. Después del periodo de incubación, las muestras de suero son analizadas en una columna C_{8} analítica (Waters Nova Pak C_{8}, 3,9 x 170 mm) con detección a 280 nm. En la Figura 3 se muestra que MBI 11B7CN es eluido a los 25 minutos y presenta diferentes grados de degradación.

El péptido es extraído del plasma usando cartuchos C_{8} Sep Pak en concentraciones peptídicas de entre 0 y 50 \mug/ml. Cada extracción también contiene MBI 11CN en una concentración de 10 \mug/ml como patrón interno. Inmediatamente después de la adición de los péptidos a plasma fresco de conejo, las muestras son mezcladas y son luego diluidas 1:10 con una disolución acuosa de ácido trifluoroacético (TFA; del inglés, trifluoroacetic acid) al 1%, para obtener una concentración final de TFA de 0,1%. Se cargan inmediatamente quinientos \mul de esta disolución en un cartucho C_{8} Sep Pak y se realiza la elución con TFA al 0,1% en acetonitrilo al 40%/H_{2}O al 60%. Se cargan veinte \mul de este producto de elución en una columna analítica C_{18} de 4,6 x 45 mm y se realiza la elución con un gradiente de acetonitrilo de 25% a 65% a lo largo de 8 volúmenes de columna. Los péptidos son detectados a 280 nm. Como se muestra en la Figura 4, MBI 11B7CN y MBI 11CN son eluidos a 5 y 3 minutos, respectivamente. Además, se detecta MBI 11B7CN sobre el fondo en concentraciones de 5 \mug/ml y mayores.

La duración in vivo de la combinación de péptido catiónico y agente antibiótico se determina mediante la administración, típicamente por inyección intravenosa o intraperitoneal, del 80-100% de la dosis tolerable máxima de la combinación en un modelo animal adecuado, típicamente un ratón. En momentos establecidos posteriores a la inyección, se anestesia cada grupo de animales, se extrae sangre y se obtiene el plasma por centrifugación. La cantidad de péptido o agente en el sobrenadante plasmático se analiza de igual modo que para la determinación in vitro (Figura 5).

Ejemplo 11

Toxicidad de péptidos catiónicos in vivo

Se analiza la toxicidad aguda, por dosis única, de diversos compuestos análogos de indolicidina en ratones Swiss CD1 usando varias vías de administración. Con objeto de determinar las toxicidades inherentes de los compuestos análogos peptídicos en ausencia de todo efecto de formulación/vehículo de distribución, todos los péptidos se administran en disolución salina isotónica con un pH final de entre 6 y 7.

Vía intraperitoneal. Se inyectan dosis de péptido de entre 80 y 5 mg/kg en volúmenes de dosis de 500 \mul, a grupos de 6 ratones. Después de la administración del péptido, se observan los ratones durante un periodo de 5 días, momento en que se determinan los niveles de la dosis que causa un 50% de mortalidad (LD_{50}), la dosis que causa un 90-100% de mortalidad (LD_{90-100}) y la dosis tolerada máxima (MTD). Los valores de LD_{50} se calculan usando el método de Reed y Muench (J. of Amer. Hyg. 27: 493-497, 1.938). Los resultados presentados en la Tabla 22 muestran que los valores de LD_{50} para MBI 11CN y los compuestos análogos varían de 21 a 52 mg/kg.

TABLA 22

53

La toxicidad, por dosis única, de una combinación de un péptido catiónico y un agente antibiótico es examinada en ratones ICR híbridos. Se realiza una inyección intraperitoneal de la combinación en disolución salina isotónica, con niveles de dosis crecientes. Se controla la supervivencia de los animales durante 7 días. El número de animales que sobreviven con cada nivel de dosis es usado para determinar la dosis tolerada máxima (MTD). Además, la MTD puede ser determinada después de la administración del péptido y el agente por diferentes vías, en diferentes momentos y en diferentes formulaciones.

\newpage

Vía intravenosa. Se inyectan dosis de péptido de aproximadamente 20, 16, 12, 8, 4 y 0 mg/kg en volúmenes de 100 \mul (4 ml/kg), a grupos de 6 ratones. Después de la administración, se observan los ratones durante un periodo de 5 días, momento en que se determinan los niveles de LD_{50}, LD_{90-100} y MTD. En la Tabla 23 se muestran los resultados del IV ensayo de toxicidad de MBI 11CN y tres compuestos análogos. Los valores de LD_{50}, LD_{90-100} y MTD varían de 5,8 a 15 mg/kg, 8 a 20 mg/kg y <4 a 12 mg/kg, respectivamente.

TABLA 23

54

Además, se inyecta múltiplemente MBI 11CN a ratones por vía intravenosa. En un experimento representativo, el péptido administrado en 10 inyecciones de 0,84 mg/kg en intervalos de 5 minutos no es tóxico. Sin embargo, dos inyecciones de péptido a 4,1 mg/kg administradas con un intervalo de 10 minutos dan lugar a una toxicidad de 60%.

Vía subcutánea. También se determina la toxicidad de MBI 11CN después de una administración subcutánea (sc). Para el ensayo de toxicidad sc, se inyectan dosis de péptido de 128, 96, 64, 32 y 0 mg/kg en volúmenes de dosis de 300 \mul (12 ml/kg), a grupos de 6 ratones. Después de la administración, se observan los ratones durante un periodo de 5 días. Ninguno de los animales murió con alguno de los niveles de dosis en el periodo de observación de 5 días. Por lo tanto, se considera que la LD_{50}, la LD_{90-100} y la MTD son superiores a 128 mg/kg. Los ratones que recibieron niveles de dosis mayores mostraron síntomas similares a los vistos después de la IV inyección, lo que sugiere que el péptido entró en la circulación sistémica. Estos síntomas son reversibles, desapareciendo en todos los ratones al segundo día de observación.

Para evaluar el impacto de administrar un compuesto análogo peptídico a ratones, puede llevarse a cabo una serie de investigaciones histopatológicas. Se administra el compuesto análogo en niveles de dosis que son iguales, inferiores a la MTD, o superiores a la MTD, una dosis letal, a grupos de ratones. Pueden usarse múltiples inyecciones para remedar posibles regímenes de tratamiento. Grupos de ratones testigo no reciben inyección o sólo reciben inyección de tampón.

Después de la inyección, se sacrifican los ratones en momentos especificados y se colocan inmediatamente sus órganos en una disolución equilibrada de formaldehído al 10%. También se conservan inmediatamente los órganos de los ratones que mueren como resultado de los efectos tóxicos del compuesto análogo. Se toman muestras tisulares y se preparan como microcortes teñidos en portaobjetos que son luego examinados microscópicamente. Se evalúa el daño en los tejidos, y esta información puede ser usada para desarrollar compuestos análogos mejorados, métodos de administración mejorados o regímenes de dosificación mejorados.

Los ratones que reciben una dosis no letal son siempre letárgicos, con los pelos de punta y evidencia de edema e hipertensión, pero recuperan la normalidad en dos horas. Los tejidos de estos animales indican que hay cierto daño en los vasos sanguíneos, particularmente en el hígado y el pulmón en ambos momentos de observación, pero otras anormalidades iniciales volvieron a la normalidad en el periodo de observación de 150 minutos. Es probable que el daño en los vasos sanguíneos sea una consecuencia de la exposición continua a elevados niveles de péptido circulante.

Por contraste, los ratones que reciben una dosis letal tienen tejidos y órganos completamente normales salvo el hígado y el corazón de los ratones que reciben administración ip e iv, respectivamente. En general, este daño se identifica como una alteración de las células que revisten los vasos sanguíneos. Parece como si la rápida muerte de los ratones se debiera a este daño y que el péptido no penetrara más allá de ese punto. Se observa un amplio daño en las venas portales hepáticas del hígado y en las arteriolas coronarias del corazón.

Ejemplo 12

Eficacia in vivo de péptidos catiónicos

Se analizan los péptidos catiónicos en cuanto a su capacidad para salvar a ratones de infecciones bacterianas letales. El modelo animal usado es una inoculación intraperitoneal (ip) de 10^{6}-10^{8} organismos Gram positivos a ratones, con la subsiguiente administración del péptido. Se inyectan ip los tres patógenos investigados, S. aureus sensible a meticilina (MSSA; del inglés, methicillin-sensitive S. aureus), S. aureus resistente a meticilina (MRSA) y S. epidermidis, a ratones. En los ratones no tratados, la muerte tiene lugar en 12-18 horas con MSSA y S. epidermidis, y en 6-10 horas con MRSA.

El péptido se administra por dos vías: intraperitonealmente, una hora después de la infección, o intravenosamente, en una sola dosis o múltiples dosis administradas en diversos momentos antes y después de la infección.

Infección de MSSA. En un protocolo típico, se infectan intraperitonealmente grupos de 10 ratones con una dosis LD_{90-100} (5,2 x 10^{6} CFU/ratón) de MSSA (Smith, ATCC nº 19640) inyectada en una infusión cerebral-cardiaca que contiene mucina al 5%. Esta cepa de S. aureus no es resistente a ningún antibiótico habitual. 60 minutos después de la infección, se inyecta intraperitonealmente MBI 10CN o MBI 11CN formulado, en diversos niveles de dosis. Una inyección de formulación sola sirve como testigo negativo, y la administración de ampicilina sirve como testigo positivo. Se controla la supervivencia de los ratones a las 1, 2, 3 y 4 horas después de la infección y luego dos veces al día hasta un total de 8 días.

MBI 10CN es máximamente activo contra MSSA (70-80% de supervivencia) en dosis de 15 a 38 mg/kg, aunque no se alcanza el 100% de supervivencia. Por debajo de 15 mg/kg hay una clara supervivencia dependiente de la dosis. Parece que, con estos menores niveles de dosis, hay un umbral dependiente del animal ya que los ratones o mueren en el día 2 o sobreviven al periodo completo de ocho días. Por otra parte, MBI 11CN salvó al 100% de los ratones de la infección por MSSA en un nivel de dosis de 36 mg/kg y, por lo tanto, fue tan eficaz como la ampicilina. Hubo poca o ninguna actividad con cualquiera de los niveles de dosis menores, lo que indica que debe alcanzarse un mínimo nivel de péptido en la corriente sanguínea durante el tiempo en que las bacterias son un peligro para el huésped.

Infección de S. epidermidis. Los compuestos análogos peptídicos tienen generalmente menores valores de MIC frente a S. epidermidis in vitro; por lo tanto, menores niveles de péptido en sangre podrían ser más eficaces contra la infección.

En un protocolo típico, se inyecta intraperitonealmente una LD_{90-100} (2,0 x 10^{8} CFU/ratón) de S. epidermidis (ATCC nº 12228) en un caldo para infusión cerebral-cardiaca que contiene mucina al 5% a grupos de 10 ratones. La cepa de S. epidermidis es 90% letal después de 5 días. A los minutos 15 y 60 después de la infección, se inyectan intravenosamente, en la vena de la cola, diversas dosis de MBI 11CN formulado. Una inyección de formulación sola sirve como testigo negativo, y la inyección de gentamicina sirve como testigo positivo; ambas se inyectan 60 minutos después de la infección. Se controla la supervivencia de los ratones a las 1, 2, 3, 4, 6 y 8 horas después de la infección y luego dos veces al día hasta un total de 8 días.

MBI 11CN prolonga la supervivencia de los ratones. Se observa eficacia en los tres niveles de dosis con el tratamiento 15 minutos después de la infección; sin embargo, hay poca actividad a los 30 minutos después de la infección y ningún efecto significativo a los 60 minutos después de la infección. Parece que el momento de la administración es importante en este sistema modelo, proporcionando el mejor índice de supervivencia una sola inyección de 6 mg/kg 15 minutos después de la infección.

Infección de MRSA. La infección de MRSA, aunque letal en un corto periodo de tiempo, requiere una carga bacteriana mucho mayor que la infección de MSSA. En un protocolo típico, se inyecta intraperitonealmente una dosis LD_{90-100} (4,2 x 10^{7} CFU/ratón) de MRSA (ATCC nº 33591) en una infusión cerebral-cardiaca que contiene mucina al 5% a grupos de 10 ratones. Los protocolos del tratamiento con MBI 11CN son los siguientes, siendo los tiempos de tratamiento relativos al momento de la infección:

\bullet 0 mg/kg

Formulación sola (testigo negativo), inyectada a 0 min

\bullet 5 mg/kg

Tres inyecciones de 5,5 mg/kg a -5, +55 y + 115 min

\bullet 1 mg/kg (2 h)

Cinco inyecciones de 1,1 mg/kg a -5, +55, + 115, + 175 y + 235 min

\bullet 1 mg/kg (20 min)

Cinco inyecciones de 1,1 mg/kg a -10, -5, 0, + 5 y + 10 min

\bullet Vancomicina

(Testigo positivo) inyectada a 0 min

Se registra la supervivencia de los ratones a las 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 20, 24 y 30 horas después de la infección y luego dos veces al día hasta un total de 8 días. No hubo cambio en el número de ratones supervivientes después de 24 horas. El protocolo de tratamiento con 1 mg/kg (20 min), con inyecciones separadas por 5 minutos y centradas en el momento de la infección, retrasó la muerte de los ratones en un grado significativo, quedando un superviviente al final del estudio.

<110> Micrologix Biotech Inc.

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<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA TRATAR INFECCIONES USANDO PÉPTIDOS CATIÓNICOS SOLOS O EN COMBINACIÓN CON ANTIBIÓTICOS

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<130> 20343/2202355-EPO

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<140> 98907779.7

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<141> 1998-03-10

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<160> 110

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 1

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 1

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\sa{Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg}

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<210> 2

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<211> 34

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<212> PRT

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<213> Apis mellifera

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<400> 2

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\sa{Tyr Val Pro Leu Pro Asn Val Pro Gln Pro Gly Arg Arg Pro Phe Pro}

\sac{Thr Phe Pro Gly Gln Gly Pro Phe Asn Pro Lys Ile Lys Trp Pro Gln}

\sac{Gly Tyr}

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<210> 3

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<211> 34

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster

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<400> 3

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\sa{Val Phe Ile Asp Ile Leu Asp Lys Val Glu Asn Ala Ile His Asn Ala}

\sac{Ala Gln Val Gly Ile Gly Phe Ala Lys Pro Phe Glu Lys Leu Ile Asn}

\sac{Pro Lys}

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<210> 4

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Apis mellifera

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<400> 4

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\sa{Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro}

\sac{Arg Ile}

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<210> 5

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Apis mellifera

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<400> 5

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\sa{Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro}

\sac{Arg Leu}

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<210> 6

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Apis mellifera

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<400> 6

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\sa{Gly Asn Asn Arg Pro Ile Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro}

\sac{Arg Leu}

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<210> 7

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> bovino

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<400> 7

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\sa{Arg Leu Cys Arg Ile Val Val Ile Arg Val Cys Arg}

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<210> 8

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<211> 42

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 8

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\sa{Arg Phe Arg Pro Pro Ile Arg Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Tyr}

\sac{Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Ile Phe Pro Pro Ile Arg}

\sac{Pro Pro Phe Arg Pro Pro Leu Arg Phe Pro}

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<210> 9

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<211> 58

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 9

56

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<210> 10

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<211> 37

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<212> PRT

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<213> Manduca sexta

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<400> 10

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\sa{Trp Asn Pro Phe Lys Glu Leu Glu Arg Ala Gly Gln Arg Val Arg Asp}

\sac{Ala Val Ile Ser Ala Ala Pro Ala Val Ala Thr Val Gly Gln Ala Ala}

\sac{Ala Ile Ala Arg Gly}

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<210> 11

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<211> 37

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<212> PRT

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<213> Manduca sexta

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<400> 11

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\sa{Trp Asn Pro Phe Lys Glu Leu Glu Arg Ala Gly Gln Arg Val Arg Asp}

\sac{Ala Ile Ile Ser Ala Gly Pro Ala Val Ala Thr Val Gly Gln Ala Ala}

\sac{Ala Ile Ala Arg Gly}

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<210> 12

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<211> 37

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<212> PRT

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<213> Manduca sexta

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<400> 12

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\sa{Trp Asn Pro Phe Lys Glu Leu Glu Arg Ala Gly Gln Arg Val Arg Asp}

\sac{Ala Ile Ile Ser Ala Ala Pro Ala Val Ala Thr Val Gly Gln Ala Ala}

\sac{Ala Ile Ala Arg Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Manduca sexta

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Asn Pro Phe Lys Glu Leu Glu Arg Ala Gly Gln Arg Val Arg Asp}

\sac{Ala Val Ile Ser Ala Ala Ala Val Ala Thr Val Gly Gln Ala Ala Ala}

\sac{Ile Ala Arg Gly Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bombina variegata

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Gly Ala Leu Ser Ala Lys Gly Ala Leu Lys Gly Leu Ala Lys}

\sac{Gly Leu Ala Glx His Phe Ala Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bombina orientalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Gly Ala Ser Ile Leu Ser Ala Gly Lys Ser Ala Leu Lys Gly}

\sac{Leu Ala Lys Gly Leu Ala Glu His Phe Ala Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bombina orientalis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Gly Ser Ala Ile Leu Ser Ala Gly Lys Ser Ala Leu Lys Gly}

\sac{Leu Ala Lys Gly Leu Ala Glu His Phe Ala Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Megabombus pennsylvanicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Lys Ile Thr Thr Met Leu Ala Lys Leu Gly Lys Val Leu Ala His}

\sac{Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Megabombus pennsylvanicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Lys Ile Thr Asp Ile Leu Ala Lys Leu Gly Lys Val Leu Ala His}

\sac{Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rana esculenta

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Leu Pro Leu Leu Ala Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Pro Lys Ile }

\sac{Phe Cys Lys Ile Thr Arg Lys Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rana esculenta

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Met Asp Thr Leu Lys Asn Leu Ala Lys Thr Ala Gly Lys Gly}

\sac{Ala Leu Gln Ser Leu Leu Asn Lys Ala Ser Cys Lys Leu Ser Gly Gln}

\sac{Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hyalophora cecropia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg}

\sac{Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala}

\sac{Thr Gln Ile Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hyalophora cecropia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg}

\sac{Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly Glu Ala}

\sac{Lys Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Trp Leu Lys Lys Leu Gly Lys Arg Ile Glu Arg Ile Gly Gln His}

\sac{Thr Arg Asp Ala Thr Ile Gln Gly Leu Gly Ile Ala Gln Gln Ala Ala}

\sac{Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hyalophora cecropia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Asn Pro Phe Lys Glu Leu Glu Lys Val Gly Gln Arg Val Arg Asp}

\sac{Ala Val Ile Ser Ala Gly Pro Ala Val Ala Thr Val Ala Gln Ala Thr}

\sac{Ala Leu Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asn Ser Ala Lys Lys}

\sac{Arg Ile Ser Glu Gly Ile Ala Ile Ala Ile Gln Gly Gly Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leiurus quinquestriatus hebraeus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glx Phe Thr Asn Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val}

\sac{Cys Gln Arg Leu His Asn Thr Ser Arg Gly Lys Cys Met Asn Lys Lys}

\sac{Cys Arg Cys Tyr Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Vespa crabro

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Leu Pro Leu Ile Leu Arg Lys Ile Val Thr Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Asp Leu Val Cys Tyr Cys Arg Ser Arg Gly Cys Lys Gly Arg}

\sac{Glu Arg Met Asn Gly Thr Cys Arg Lys Gly His Leu Leu Tyr Thr Leu}

\sac{Cys Cys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Asp Leu Val Cys Tyr Cys Arg Thr Arg Gly Cys Lys Arg Arg}

\sac{Glu Arg Met Asn Gly Thr Cys Arg Lys Gly His Leu Met Tyr Thr Leu}

\sac{Cys Cys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryctolagus cuniculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Val Cys Ala Cys Arg Arg Ala Leu Cys Leu Pro Arg Glu Arg Arg}

\sac{Ala Gly Phe Cys Arg Ile Arg Gly Arg Ile His Pro Leu Cys Cys Arg}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryctolagus cuniculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Val Cys Ala Cys Arg Arg Ala Leu Cys Leu Pro Leu Glu Arg Arg}

\sac{Ala Gly Phe Cys Arg Ile Arg Gly Arg Ile His Pro Leu Cys Cys Arg}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cavia cutleri

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Cys Ile Cys Thr Thr Arg Thr Cys Arg Phe Pro Tyr Arg Arg}

\sac{Leu Gly Thr Cys Ile Phe Gln Asn Arg Val Tyr Thr Phe Cys Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cavia cutleri

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Cys Ile Cys Thr Thr Arg Thr Cys Arg Phe Pro Tyr Arg Arg}

\sac{Leu Gly Thr Cys Leu Phe Gln Asn Arg Val Tyr Thr Phe Cys Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr}

\sac{Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr Gly}

\sac{Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryctolagus cuniculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Val Cys Ala Cys Arg Arg Ala Leu Cys Leu Pro Arg Glu Arg Arg}

\sac{Ala Gly Phe Cys Arg Ile Arg Gly Arg Ile His Pro Leu Cys Cys Arg}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryctolagus cuniculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Val Cys Ala Cys Arg Arg Ala Leu Cys Leu Pro Leu Glu Arg Arg}

\sac{Ala Gly Phe Cys Arg Ile Arg Gly Arg Ile His Pro Leu Cys Cys Arg}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Thr Cys Tyr Cys Arg Arg Thr Arg Cys Gly Phe Arg Glu Arg Leu}

\sac{Ser Gly Ala Cys Gly Tyr Arg Gly Arg Ile Tyr Arg Leu Cys Cys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Thr Cys Tyr Cys Arg Ser Thr Arg Cys Gly Phe Arg Glu Arg Leu}

\sac{Ser Gly Ala Cys Gly Tyr Arg Gly Arg Ile Tyr Arg Leu Cys Cys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Phe Ala Ser Cys His Thr Asn Gly Gly Ile Cys Leu Pro Asn Arg}

\sac{Cys Pro Gly His Met Ile Gln Ile Gly Ile Cys Phe Arg Pro Arg Val}

\sac{Lys Cys Cys Arg Ser Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Arg Asn His Val Thr Cys Arg Ile Asn Arg Gly Phe Cys Val Pro}

\sac{Ile Arg Cys Pro Gly Arg Thr Arg Gln Ile Gly Thr Cys Phe Gly Pro}

\sac{Arg Ile Lys Cys Cys Arg Ser Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> bovino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Pro Val Ser Cys Val Arg Asn Lys Gly Ile Cys Val Pro Ile Arg}

\sac{Cys Pro Gly Ser Met Lys Gln Ile Gly Thr Cys Val Gly Arg Ala Val}

\sac{Lys Cys Cys Arg Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sacrophaga peregrina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Thr Cys Asp Leu Leu Ser Gly Thr Gly Ile Asn His Ser Ala Cys}

\sac{Ala Ala His Cys Leu Leu Arg Gly Asn Arg Gly Gly Tyr Cys Asn Gly}

\sac{Lys Ala Val Cys Val Cys Arg Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Aeschna cyanea

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Phe Gly Cys Pro Leu Asp Gln Met Gln Cys His Arg His Cys Gln}

\sac{Thr Ile Thr Gly Arg Ser Gly Gly Tyr Cys Ser Gly Pro Leu Lys Leu}

\sac{Thr Cys Thr Cys Tyr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leiurus quinquestriatus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Phe Gly Cys Pro Leu Asn Gln Gly Ala Cys His Arg His Cys Arg}

\sac{Ser Ile Arg Arg Arg Gly Gly Tyr Cys Ala Gly Phe Phe Lys Gln Thr}

\sac{Cys Thr Cys Tyr Arg Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Phyllomedusa sauvagii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Trp Lys Thr Met Leu Lys Lys Leu Gly Thr Met Ala Leu His}

\sac{Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Ala Asp Thr Ile Ser Gln Thr Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Thr Ser His Pro Arg Pro}

\sac{Ile Arg Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rana esculenta

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Phe Ser Lys Leu Gly Arg Lys Lys Ile Lys Asn Leu Leu Ile}

\sac{Ser Gly Leu Lys Asn Val Gly Lys Glu Val Gly Met Asp Val Val Arg}

\sac{Thr Gly Ile Asp Ile Ala Gly Cys Lys Ile Lys Gly Glu Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro}

\sac{Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lactococcus lactis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu}

\sac{Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys His Cys Ser Ile His Val}

\sac{Ser Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Staphylococcus epidermidis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ala Gly Pro Ala Ile Arg Ala Ser Val Lys Gln Cys Gln Lys Thr}

\sac{Leu Lys Ala Thr Arg Leu Phe Thr Val Ser Cys Lys Gly Lys Asn Gly}

\sac{Cys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus subtilis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Leuconostoc gelidum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val His Cys Thr Lys Ser Gly Cys Ser Val}

\sac{Asn Trp Gly Glu Ala Phe Ser Ala Gly Val His Arg Leu Ala Asn Gly}

\sac{Gly Asn Gly Phe Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Gly Lys Phe Gly Lys Ala Phe}

\sac{Val Gly Glu Ile Met Lys Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe}

\sac{Val Gly Glu Ile Met Asn Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Met Ala Ser Lys Ala Gly Ala Ile Ala Gly Lys Ile Ala Lys Val}

\sac{Ala Leu Lys Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Val Leu Ser Asn Val Ile Gly Tyr Leu Lys Lys Leu Gly Thr Gly}

\sac{Ala Leu Asn Ala Val Leu Lys Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Xenopus laevis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Trp Ala Ser Lys Ile Gly Gln Thr Leu Gly Lys Ile Ala Lys Val}

\sac{Gly Leu Lys Glu Leu Ile Gln Pro Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Vespula lewisii

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Apis mellifera

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu}

\sac{Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Phormia terranovae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Thr Cys Asp Leu Leu Ser Gly Thr Gly Ile Asn His Ser Ala Cys}

\sac{Ala Ala His Cys Leu Leu Arg Gly Asn Arg Gly Gly Tyr Cys Asn Gly}

\sac{Lys Gly Val Cys Val Cys Arg Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Phormia terranovae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Thr Cys Asp Leu Leu Ser Gly Thr Gly Ile Asn His Ser Ala Cys}

\sac{Ala Ala His Cys Leu Leu Arg Gly Asn Arg Gly Gly Tyr Cys Asn Arg}

\sac{Lys Gly Val Cys Val Arg Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Limulus polyphemus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly Phe Cys Tyr Arg Lys}

\sac{Cys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Limulus polyphemus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Lys Gly Phe Cys Tyr Arg Lys}

\sac{Cys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val}

\sac{Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Ile Cys Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sus scrofa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Gly Gly Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val}

\sac{Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Apis mellifera

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sacrophaga peregrina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln His}

\sac{Thr Arg Asp Ala Thr Ile Gln Gly Leu Gly Ile Ala Gln Gln Ala Ala}

\sac{Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sacrophaga peregrina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln His}

\sac{Thr Arg Asp Ala Thr Ile Gln Val Ile Gly Val Ala Gln Gln Ala Ala}

\sac{Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asp Glu Lys Ala Ser Pro Asp Lys His His Arg Phe Ser Leu Ser}

\sac{Arg Tyr Ala Lys Leu Ala Asn Arg Leu Ala Asn Pro Lys Leu Leu Glu}

\sac{Thr Phe Leu Ser Lys Trp Ile Gly Asp Arg Gly Asn Arg Ser Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Tachypleus tridentatus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Arg Cys}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Tachypleus tridentatus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Lys Cys}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Cys Cys Lys Asp Thr Leu Ala Arg Asn Cys Tyr Asn Thr Cys}

\sac{Arg Phe Ala Gly Gly Ser Arg Pro Val Cys Ala Gly Ala Cys Arg Cys}

\sac{Lys Ile Ile Ser Gly Pro Lys Cys Pro Ser Asp Tyr Pro Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Trimeresurus wagleri

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Lys Pro Asp Leu Arg Pro Cys Ile Ile Pro Pro Cys His Tyr}

\sac{Ile Pro Arg Pro Lys Pro Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Androctonus australis Hector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cecropina ejemplar

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg}

\sac{Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala}

\sac{Thr Gln Ile Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> melitina ejemplar

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu}

\sac{Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Lys Arg Gln Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido de fusión

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Trp Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val}

\sac{Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido de fusión

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Trp Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val}

\sac{Val Thr Thr Ala Lys Pro Leu Ile Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido de fusión

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Trp Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile}

\sac{Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido de fusión

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Trp Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly}

\sac{Gly Leu Leu Ser Asn Ile Val Thr Ser Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido de fusión

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Trp Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly}

\sac{Pro Ile Leu Ala Asn Leu Val Ser Ile Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido de fusión

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier aminoácido hidrófilo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Trp Trp Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Ala}

\sac{Leu Ser Asn Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido de fusión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier cadena de aminoácidos de 14-24 restos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Trp Trp Arg Arg Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido de fusión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es cualquier cadena de aminoácidos de 14-24 restos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Trp Trp Lys Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Drosophila melanogaster

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Thr Ser His Pro Arg Pro}

\sac{Ile Arg Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Trp Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Arg Trp Pro Trp Arg Arg Trp Pro Trp Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Met Ile Leu Arg}

\sac{Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Met Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Arg Arg Trp Val Trp Trp Val Trp Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Arg Trp Trp Val Trp Trp Val Trp Trp Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Trp Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Trp Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Arg Ile Trp Lys Pro Lys Trp Arg Leu Pro Lys Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> compuesto análogo de péptido catiónico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Arg Trp Trp Lys Pro Lys Trp Arg Trp Pro Lys Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Compuesto análogo de indolicidina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Lys Lys Phe Pro Phe Phe Pro Phe Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Compuesto análogo de indolicidina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Compuesto análogo de indolicidina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys Ile Met Ile Leu}

\sac{Lys Lys Ala Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Compuesto análogo de indolicidina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Arg Ile Trp Lys Pro Lys Trp Arg Leu Pro Lys Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Compuesto análogo de indolicidina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es D-isoleucina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICAS VARIAS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)..(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es D-lisina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Compuesto análogo de indolicidina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Lys Lys Trp Val Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Compuesto análogo de indolicidina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Arg Trp Val Trp Trp Val Trp Arg Arg Lys}

Claims (29)

1. Un compuesto análogo de indolicidina, seleccionado entre:

55

2. Un compuesto análogo de indolicidina de acuerdo con la reivindicación 1, en que el compuesto análogo tiene al menos un aminoácido alterado hasta un correspondiente D-aminoácido.

3. Un compuesto análogo de indolicidina de acuerdo con la reivindicación 1, en que el aminoácido N-terminal y/o C-terminal es un D-aminoácido.

4. Un compuesto análogo de indolicidina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en que el compuesto análogo está acetilado en el aminoácido N-terminal.

5. Un compuesto análogo de indolicidina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en que el compuesto análogo está amidado en el aminoácido C-terminal.

6. Un compuesto análogo de indolicidina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en que el compuesto análogo está esterificado en el aminoácido C-terminal.

7. Un compuesto análogo de indolicidina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en que el compuesto análogo está modificado por incorporación de homoserina o lactona de homoserina en el aminoácido C-terminal.

8. Una molécula de ácido nucleico aislada cuya secuencia comprende una o más secuencias de codificación de un compuesto análogo de indolicidina de acuerdo con la reivindicación 1.

9. Un vector de expresión que comprende un promotor en unión operativa con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.

10. Una célula huésped transfectada o transformada con el vector de expresión de la reivindicación 9.

11. Una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto análogo de indolicidina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehículo, agente diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable.

12. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además un agente antibiótico.

13. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en que el antibiótico es seleccionado entre penicilinas, cefalosporinas, carbacefemas, cefamicinas, carbapenemas, monobactamas, quinolonas, tetraciclinas, aminoglicosidos, macrólidos, glicopéptidos, cloranfenicoles, glicilciclinas, licosamidas o fluoroquinolonas.

14. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en que la composición está incorporada a un liposoma.

15. Una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en que la composición está incorporada a un vehículo de liberación lenta.

16. Un dispositivo revestido con una composición que comprende un compuesto análogo de indolicidina de acuerdo con las reivindicaciones 1-7.

17. El dispositivo de la reivindicación 16, en que la composición comprende además un agente antibiótico.

18. Un dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 y 17, en que el dispositivo es un dispositivo médico.

19. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 18, en que el dispositivo médico es seleccionado entre un catéter, una válvula cardiaca artificial, una cánula y un stent.

20. Un compuesto análogo de indolicidina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-15, para uso terapéutico.

21. Uso de un compuesto análogo de indolicidina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o de una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-15, para la fabricación de un medicamento para tratar infecciones.

22. Un uso de acuerdo con la reivindicación 21, en que dicha infección es debida a un microorganismo.

23. Un uso de acuerdo con la reivindicación 22, en que el microorganismo es seleccionado entre una bacteria, un hongo, un parásito y un virus.

24. Un uso de acuerdo con la reivindicación 23, en que el hongo es una levadura y/o un moho.

25. Un uso de acuerdo con la reivindicación 23, en que la bacteria es una bacteria Gram negativa.

26. Un uso de acuerdo con la reivindicación 25, en que la bacteria Gram negativa es seleccionada entre especies de Acinetobacter, especies de Bacteroides, especies de Borrelia, especies de Chlamydia, especies de Rickettsia, especies de Treponema, especies de Ureaplasma, Bordetella pertussis, especies de Brucella, especies de Campylobacter, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, especies de Legionella, Moraxella catarrhalis, especies de Mycoplasma, especies de Neisseria, especies de Salmonella, especies de Shigella, especies de Yersinia, especies de Enterobacter, E. coli, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. marcescens y S. maltophilia.

27. Un uso de acuerdo con la reivindicación 23, en que la bacteria es una bacteria Gram positiva.

28. Un uso de acuerdo con la reivindicación 27, en que la bacteria Gram positiva es seleccionada entre especies de Bacillus, especies de Corynebacterium, Difteroides, especies de Listeria, especies de Mycobacterium, especies de Peptostreptococcus, Propionibacterium acne, especies de Clostridium, estreptococos viridans, E. faecalis, S. aureus, E. faecium, S. pyogenes, S. pneumoniae y estafilococos coagulasa negativos.

29. Un uso de acuerdo con la reivindicación 21, en que el compuesto análogo de indolicidina es administrado mediante inyección intravenosa, inyección o implantación intraperitoneal, inyección o implantación intramuscular, inyección intratecal, inyección o implantación subcutánea, inyección intradérmica, lavado orgánico, lavado vesical, supositorios rectales, supositorios vaginales, ingestión oral, aplicación tópica, aplicación entérica, inhalación, aplicación en aerosol, o pulverización o gotas nasales.