ES2264283T3 - Polinucleotidos optimizados de plantas que codifican proteinas pesticidas de aproximadamente 15kda y aproximadamente 45kda. - Google Patents

Polinucleotidos optimizados de plantas que codifican proteinas pesticidas de aproximadamente 15kda y aproximadamente 45kda.

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Abstract

Un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO:5.

Description

Polinucleótidos optimizados de plantas que codifican proteínas pesticidas de aproximadamente 15 kDa y aproximadamente 45 kDa.
Fundamentos de la invención
Los insectos y otras plagas cuestan a los agricultores miles de millones de dólares anualmente en pérdidas de cultivos y en el gasto de mantenimiento de estas plagas bajo control. Las pérdidas causadas por las plagas de insectos en el medio ambiente de la producción agrícola incluyen la disminución del rendimiento de los cultivos, reducción de calidad de los cultivos, e incremento de los costes de recolección.
Los pesticidas químicos han proporcionado un procedimiento eficaz para el control de plagas; sin embargo, el público ha llegado a preocuparse sobre la cantidad de productos químicos residuales que podrían encontrarse en los alimentos, el agua subterránea, y el medio ambiente. Por ello, los pesticidas químicos sintéticos están siendo de manera creciente examinados, y por tanto corregidos, con respecto a sus consecuencias tóxicas potenciales para el medio ambiente. Los pesticidas químicos sintéticos pueden envenenar el suelo y los acuíferos subyacentes, polucionar las aguas superficiales como un resultado de la escorrentía, y destruir formas de vida no previstas. Los agentes de control químicos sintéticos tienen además el inconveniente de presentar riesgos de seguridad pública cuando se aplican en áreas en las que los animales domésticos, animales de granja, o niños pueden entrar en contacto con ellos. Igualmente, pueden proporcionar riesgos para la salud a los aplicadores, especialmente si no se siguen las técnicas de aplicación apropiadas. Los organismos reguladores alrededor del mundo están restringiendo y/o desterrando los usos de muchos pesticidas y, en particular, los pesticidas químicos sintéticos que son persistentes en el medio ambiente y entran en la cadena alimentaria. Los ejemplos de pesticidas químicos sintéticos ampliamente usados, incluyen los organoclorados, p. ej., DDT, mirex, kepona, lindano, aldrin, clordano, aldicarb, y dieldrin; los organofosfatos, p. ej., clorpirifos, paration, malation, y diazinon; y carbamatos. Las nuevas restricciones rigurosas sobre el uso de pesticidas y la eliminación de algunos pesticidas eficaces del mercado, podrían limitar opciones económicas y eficaces para el control de plagas costosas.
Dado los problemas asociados con el uso de pesticidas químicos sintéticos, existe una clara necesidad de limitar el uso de estos agentes y una necesidad de identificar agentes de control alternativos. La substitución de pesticidas químicos sintéticos, o la combinación de estos agentes con pesticidas biológicos, podría reducir los niveles de productos químicos tóxicos en el medio ambiente.
Un agente pesticida biológico que ha sido usado con creciente popularidad, el microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.). El microbio del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.), es una bacteria formadora de esporas, gram-positiva. La mayoría de las cepas de B.t. no muestran actividad pesticida. Algunas cepas de B.t. producen, y pueden ser caracterizadas por, inclusiones de proteína cristalina paraesporal. Estas "\delta-endotoxinas", las cuales típicamente tienen actividad pesticida específica, son diferentes de las exotoxinas, las cuales tienen una gama de huéspedes no específica. Frecuentemente, estas inclusiones aparecen microscópicamente como cristales claramente formados. Las proteínas pueden ser altamente tóxicas para las plagas y son específicas en su actividad tóxica.
Las preparaciones de las esporas y cristales de B. thuringiensis subespecie kusrtaki, han sido usadas durante muchos años como insecticidas comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo, el B. thuringiensis var. kusrtaki HD-1, produce una \delta-endotoxina que es tóxica para las larvas de un cierto número de insectos lepidópteros.
La clonación y expresión de un gen de proteína cristal de B.t. en Escherichia coli ha sido descrita en la literatura publicada hace más de 15 años (Schnepf, H.E., H.R. Whitely, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 78, págs. 2893-2897, (1981)). La Patente de EE.UU. No. 4.448.885 y la Patente de EE.UU. No. 4.467.036, describen ambas la expresión de proteína cristal de B.t. en E. coli. Los productos de B.t. basados en DNA recombinante han sido producidos y aprobados para su uso.
El uso comercial de pesticidas de B.t. estuvo originalmente restringido a una gama estrecha de plagas de lepidópteros (orugas). Sin embargo, más recientemente, los investigadores han descubierto pesticidas de B.t. con especificidades para una gama mucho más amplia de plagas. Por ejemplo, otras especies de B.t., fundamentalmente israelensis y morrisoni (a.k.a. tenebrionis, a.k.a. B.t. M-7), han sido usadas comercialmente para controlar insectos de los órdenes Dípteros y Coleópteros, respectivamente (Gaertner, F.H., "Sistemas de suministro celular para proteínas insecticidas: Microorganismos vivientes y no vivientes", en Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins, ed. Taylor y Francis, New York and London, págs. 245-255, (1990)).
Actualmente, se han identificado nuevas subespecies de B.t., y los genes responsables de las proteínas de \delta-endotoxina activa han sido aislados y secuenciados (Höfte, H., H.R. Whiteley, Microbiological Reviews, vol. 52, (no. 2), págs. 242-245, (1989)). Höfte y Whitley clasificaron genes de proteína cristal de B.t. en cuatro clases principales. Las clases fueron cryI (específica de Lepidópteros), cryII (específica de Lepidópteros y Dípteros), cryIII (específica de Coleópteros) y cryIV (específica de Dípteros). Se ha informado del descubrimiento de cepas específicamente tóxicas para otras plagas (Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim, Bio/Technology, vol. 10, págs. 271-275, (1992)). Por ejemplo, han sido propuestas las designaciones CryV y CryVI para dos nuevos grupos de toxinas nematodo-activas.
La nomenclatura y esquema de clasificación de 1989 de Höfte y Whitley se basó en la secuencia de aminoácidos deducida y la gama del huésped de la toxina. Dicho sistema se adaptó para cubrir 14 tipos diferentes de genes de toxinas, los cuales fueron divididos en cinco clases principales. El número de genes de proteínas cristal de Bacillus thuringiensis secuenciados usualmente se mantiene en más de 50. Ha sido propuesto un esquema de nomenclatura revisado, el cual está basado únicamente en la identidad del aminoácido (Crickmore, y otros, Society for Invertebrate Pathology, 29th Annual Meeting, IIIrd Internacional Colloquium on Bacillus thuringiensis, Universidad de Córdoba, Córdoba, España, 1-6 de Septiembre, (1996), resumen). El "cry" nemónico se ha mantenido para todos los genes de toxinas, excepto el cytA y cytB, los cuales permanecen como una clase separada. Los numerales romanos han sido cambiados por numerales árabes en la primera fila, y se han eliminado los paréntesis en la tercera fila. Se han mantenido muchos de los nombres originales, aunque un cierto número han sido reclasificados.
Con el uso de técnicas de ingeniería genética, se encuentran en desarrollo nuevas vías para el suministro de toxinas de B.t. a ambientes agrícolas, incluyendo el uso de plantas genéticamente manipuladas con genes de toxinas de B.t. para resistencia a insectos y el uso de células microbianas, estabilizadas, como vehículos de suministro de toxinas de B.t. (Gaertner, F.H., L. Kim, TIBTECH, vol. 6, págs. S4-S7, (1988)). De acuerdo con ello, los genes de endotoxinas de B.t. aislados han comenzado a ser comercialmente valiosos.
Se han logrado varias mejoras mediante la modificación de toxinas de B.t. y/o sus genes. Por ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nos. 5.380.831 y 5.567.862, se refieren a la producción de genes de proteínas cristal insecticidas sintéticos que tienen expresión mejorada en plantas.
Los obstáculos para el uso agrícola con éxito de toxinas de B.t. incluyen el desarrollo de resistencia a toxinas de B.t. por los insectos. Además, ciertos insectos pueden ser refractarios a los efectos del B.t. Estos últimos incluyen insectos tales como el gorgojo de la cápsula del algodón y la agrótida negra, así como insectos adultos de la mayoría de las especies, las cuales, hasta ahora, han no demostrado una sensibilidad significativamente aparente a las \delta-endotoxinas de B.t.
De acuerdo con ello, las estrategias de control de la resistencia en la tecnología de plantas al B.t. han llegado a ser de gran interés, y existe aún una gran necesidad de nuevos genes de toxinas. Por ejemplo, la Patente WO 97/40162, describe proteínas activas frente a los coleópteros de 15kDa y 45 kDa, obtenibles a partir de aislados de B.t. PS80JJ1 y PS149B1.
Como un resultado de las extensas inversiones en recursos e investigaciones, continúan concediéndose patentes para nuevos aislados, toxinas y genes de B.t., y para nuevos usos de aislados de B.t. Para un a revisión, véase Feitelson, y otros, más arriba. La Patente de EE.UU. 5.589.382 describe el aislado de B.t. PS80JJ1 como poseedor de actividad contra nematodos. La Patente de EE.UU. 5.632.987 describe el aislado de B.t. PS80JJ1 como poseedor de actividad contra el gusano de la raíz del maíz. Sin embargo, el descubrimiento de nuevos aislados de B.t. y de nuevos usos de aislados de B.t. conocidos, continúa siendo una técnica impredecible, empírica.
Resumen de la invención
Un nuevo polinucleótido de acuerdo con la presente invención tiene la secuencia de SEC ID NO:5. Esta secuencia de polinucleótido es para un gen designado como 149B1-15-PO, la cual está optimizada para expresión en Zea mays. Este gen codifica una proteína de aproximadamente 15 kDa obtenible a partir PS149B1 que está descrita en la Patente WO 97/40162.
La nueva secuencia de polinucleótido tiene ciertas modificaciones, comparada con las secuencias tipo salvaje, que la hace particularmente adecuada para la expresión optimizada en plantas. Usando esta secuencia de polinucleótido, puede llevarse a cabo la transformación de plantas, usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, con el fin de conferir resistencia a las plagas sobre las plantas.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, un huésped no humano recombinante expresa un polinucleótido de la invención. Puede usarse un huésped de este tipo, en un procedimiento de acuerdo con la invención, para poner en contacto una plaga de plantas y, de esta forma, controlar la plaga.
Descripción de la invención
En una realización preferida del procedimiento de la invención, la plaga se pone adicionalmente en contacto con una segunda proteína, codificada por la SEC ID NO:4 o la SEC ID NO:6.
La SEC ID NO:4 es una secuencia de polinucleótido para un gen designado como 80JJ1-45-PO, el cual está optimizado para expresión en maíz. Este gen codifica una proteína de aproximadamente 45 kDa. Este gen está descrito en la Patente WO 97/40162.
La SEC ID NO:6 es una secuencia de polinucleótido para un gen designado como 149B1-45-PO, el cual está optimizado para expresión en Zea mays. Este gen codifica una proteína de aproximadamente 45 kDa obtenible a partir del PS149B1, el cual está descrito igualmente en la Patente WO 97/40162.
Debería resultar obvio para una persona experta en esta técnica que, dadas las secuencias aquí establecidas, el gen de la invención sujeto puede obtenerse por varios medios. En realizaciones preferidas, el gen sujeto puede producirse sintéticamente mediante el uso, por ejemplo, de un sintetizador de gen. Los genes específicos aquí ejemplificados pueden igualmente obtenerse mediante modificación, de acuerdo con las directrices de la invención sujeto, de ciertos genes de tipo salvaje (por ejemplo, mediante técnicas de mutación puntual) a partir de ciertos aislados depositados en un depósito de cultivos tal como se expone más adelante.
Ciertos cultivos expuestos en esta solicitud han sido depositados en la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA. Las cepas depositadas enumeradas a continuación están descritas en las referencias de patentes tal como se ha expuesto anteriormente en la sección titulada "Fundamentos de la invención".
Subcultivo Número de registro Fecha de depósito
B.t. PS80JJ1 NRRL B-18679 17 de Julio de 1990
E. coli (NM522) (pMYC2421) NRRL B-21555 28 de Marzo de 1996
(PS80JJ1 14kDa y 45 kDa)
E. coli (NM522) (pMYC2426) NRRL B-21671 26 de Marzo de 1997
(PS80JJ1 14kDa y 45 kDa)
B.t. PS149B1 NRRL B-21553 28 de Marzo de 1996
E. coli (NM522) (pMYC2429) NRRL B-21673 26 de Marzo de 1997
(PS149B1 15kDa y 45 kDa)
Debería darse por entendido que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para llevar a la práctica la invención sujeto, en derogación de los derechos de patente garantizados por la acción gubernamental.
Genes y toxinas. La invención sujeto incluye, en realizaciones preferidas, secuencias de polinucleótidos optimizadas para expresión en plantas, en las que dichas secuencias están seleccionadas entre la SEC ID NO:5 y opcionalmente también la SEC ID NO:6.
Los polinucleótidos de la invención sujeto pueden usarse para formar "genes" completos para codificar proteínas o péptidos en una célula huésped deseada. Por ejemplo, tal como un técnico experto fácilmente reconocería, la SEC ID NO:5 y SEC ID NO:6 se muestran sin codones de parada. La SEC ID NO:5 y/o SEC ID NO:6 pueden colocarse de manera apropiada bajo el control de un promotor en un huésped de interés, tal como es fácilmente conocido en la técnica.
Tal como el técnico experto fácilmente reconocerá, el DNA puede existir en una forma de hebra doble. En esta disposición, una hebra es complementaria de la otra hebra y vive versa. La "hebra de codificación" se usa frecuentemente en la técnica para referirse a la hebra que tiene una serie de codones (un codón son los tres nucleótidos que pueden leerse los tres al mismo tiempo para proporcionar un aminoácido particular) que pueden leerse como un marco de lectura abierto (OPR) para formar una proteína o péptido de interés. Con el fin de expresar una proteína in vivo, una hebra de DNA se traduce típicamente dentro de una hebra complementaria de RNA, el cual se usa como el molde para la proteína. Puesto que el DNA está replicado en una planta (por ejemplo), se producen hebras complementarias, adicionales, de DNA. De acuerdo con ello, la invención sujeto incluye el uso o de los polinucleótidos ejemplificados mostrados en el listado de secuencias adjunto, o de las hebras complementarias. El RNA y PNA (ácidos nucléicos de péptidos) que son funcionalmente equivalentes a las moléculas de DNA nuevas, específicamente ejemplificadas, se encuentran incluidos en la invención sujeto.
Ciertas secuencias de DNA de la invención sujeto han sido específicamente ejemplificadas aquí. Estas secuencias son ejemplos de la invención sujeto. Debería ser fácilmente obvio que la invención sujeto incluye no solamente los genes y secuencias específicamente ejemplificados aquí, sino, además, los equivalentes y variantes de las mismos (tales como mutantes, fusiones, quiméricos, truncaciones, fragmentos, y genes más pequeños) que muestran la misma o similares características relativas a la expresión de toxinas en las plantas, comparadas con las específicamente descritas aquí. Tal como se usa aquí, "variantes" y "equivalentes" se refiere a secuencias que tienen substituciones de nucleótidos (o aminoácidos), deleciones (internas y/o terminales), adiciones, o inserciones que no afectan materialmente la expresión de los genes sujeto, y la actividad pesticida resultante, en plantas. Los fragmentos de proteínas de polinucleótidos que retienen la actividad pesticida, y las "porciones pesticidas" de proteínas de longitud completa, se encuentran igualmente incluidas en esta definición.
Usando técnicas estándar, pueden modificarse genes, y pueden construirse fácilmente variaciones de genes. Por ejemplo, las técnicas para la realización de mutaciones puntuales son bien conocidas en la técnica. Además, pueden usarse exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles de acuerdo con procedimientos estándar, y enzimas tal como Bal31 o puede usarse mutagénesis dirigida al sitio para cortar sistemáticamente nucleótidos procedentes de los extremos de estos genes. Igualmente, pueden obtenerse genes útiles usando una diversidad de enzimas de restricción.
Debería indicarse que genes equivalentes codificarán toxinas que tienen alta identidad u homología de aminoácidos con las toxinas codificadas por los genes sujeto. La homología de aminoácidos será la más alta en regiones críticas de la toxina que responden a la actividad biológica o que están implicadas en la determinación de la configuración tridimensional que finalmente es la responsable de la actividad biológica. A este respecto, son aceptables y pueden ser esperadas ciertas substituciones, si estas substituciones son en regiones que no son críticas para la actividad o son substituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan a la configuración tridimensional de la molécula. Por ejemplo, pueden introducirse aminoácidos de las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos y ácidos. Las substituciones conservadoras, mediante las cuales un aminoácido de una clase es reemplazado con otro aminoácido del mismo tipo, entran dentro del alcance de la invención sujeto, siempre y cuando que la substitución no altere materialmente la actividad biológica del compuesto. La Tabla 1 proporciona un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.
TABLA 1
Clase de aminoácido Ejemplos de aminoácidos
No polar Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
Polar no cargado Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
Ácido Asp, Glu
Básico Lys, Arg, His
En algunos casos, pueden igualmente hacerse substituciones no conservadoras. El factor crítico es que estas substituciones no deben disminuir de manera significativa la capacidad de las plantas para expresar las secuencias del DNA sujeto o la actividad biológica de la toxina.
Tal como se usa aquí, la referencia a polinucleótidos "aislados" y/o toxinas "purificadas", se refiere a esas moléculas cuando no están asociadas con las otras moléculas con las cuales se encontrarían en la naturaleza e incluiría su uso en plantas. De acuerdo con ello, la referencia a "aislado" y/o "purificada" significa la implicación de la "mano del hombre" tal como se describe aquí.
Huéspedes recombinantes. Los genes que codifican la toxina de la invención sujeto, pueden introducirse dentro de una amplia variedad de huéspedes microbianos o plantas. En algunas realizaciones de la invención sujeto, los huéspedes microbianos transformados pueden usarse en etapas preliminares para la preparación de precursores, por ejemplo, los cuales eventualmente se usarán para transformar, en realizaciones preferidas, células de plantas y plantas de manera tal que expresen las toxinas codificadas por los genes de la invención sujeto. Los microbios transformados y usados de esta manera, están dentro del alcance de la invención sujeto. Los microbios recombinantes pueden ser, por ejemplo, un B.t., E. coli, o Pseudomonas. Las transformaciones pueden realizarse por los expertos en la técnica usando técnicas estándar. Los materiales necesarios para estas transformaciones se describen aquí o bien se encuentran fácilmente disponibles para el técnico experto.
De acuerdo con ello, en realizaciones preferidas, la expresión de un gen de esta invención da como resultado, directamente o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento de la proteína de interés. Cuando las plantas transformadas son ingeridas por la plaga, las plagas ingerirán la toxina. El resultado es un control de la plaga.
El gen de la toxina de B.t. puede introducirse mediante un vector adecuado dentro de un huésped, preferiblemente un huésped de planta. Existen muchos cultivos de interés, tales como maíz, trigo, arroz, algodón, sojas y girasoles. Los genes de la invención sujeto son particularmente adecuados para proporcionar mantenimiento y expresión estable, en la planta transformada, del gen que expresa el pesticida polipéptido, y, de manera deseable, proporciona protección mejorada del pesticida de la degradación e inactivación del medio ambiente.
De acuerdo con ello, la invención sujeto incluye huéspedes recombinantes que comprenden la SEC ID NO:5. El huésped recombinante puede ser, por ejemplo, una célula de planta. Las plantas completas que comprenden los polinucleótidos sujeto entran igualmente dentro del alcance de la invención sujeto. En realizaciones particularmente preferidas, una planta puede hacerse resistente al daño por el gusano de la raíz del maíz mediante transformación para expresar un segundo polinucleótido, tal la SEC ID NO:4, que codifica una proteína de 45 kDa. Igualmente, las SEC ID NO:5 y SEC ID NO:6 pueden usarse conjuntamente, bajo un promotor o promotores separados, tal como el promotor ubiquitina. Para tal fin, pueden usarse, por ejemplo, los polinucleótidos de la SEC ID NO:4 y la SEC ID NO:5.
Aunque la invención sujeto proporciona realizaciones específicas de genes sintéticos, pueden usarse igualmente otros genes que sean funcionalmente equivalentes a los genes ejemplificados aquí para transformar huéspedes, preferiblemente huéspedes de plantas. Las directrices adicionales para la producción de genes sintéticos pueden encontrarse, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. No. 5.380.831.
Lo que sigue a continuación, es un ejemplo que ilustra los procedimientos para la puesta en práctica de la invención. Este ejemplo no debería considerarse como limitativo.
Ejemplo 1 Inserción de genes de toxinas dentro de plantas
Un aspecto de la invención sujeto es la transformación de plantas con las secuencias de polinucleótidos sujeto que codifican toxinas insecticidas. Las plantas transformadas son resistentes al ataque por la plaga prevista. Los genes de la invención sujeto están optimizados para uso en plantas.
Obviamente, es necesaria una región promotora capaz de expresar el gen en una planta. De acuerdo con ello, para la expresión in planta, el DNA de la invención sujeto está bajo el control de una región promotora apropiada. Las técnicas para la obtención de la expresión in planta mediante el uso de dichos constructos son conocidas en la técnica. Una región promotora preferida usada para la expresión de transgenes de 15 kDa y 45 kDa es el promotor ubiquitina de Zea mays más el exón 1 de Z. mays y el intrón 1 de Z. mays (Christensen, A.H., y otros, Plant Mol. Biol., vol. 18, págs. 675-689, (1992)). Un terminador de transcripción preferido para ambos transgenes es el terminador inhibidor II de proteínasa de patata (PinII) (An, G., y otros, Plant Cell, vol. 1, págs. 115-22, (1989)).
Los genes que codifican toxinas pesticidas, tal como se describen aquí, pueden insertarse dentro de células de plantas usando una diversidad de técnicas que son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, en realizaciones preferidas, se obtuvieron plantas de maíz que contenían transgenes de 14 kDa y 44 kDa mediante bombardeo con microproyectiles usando la pistola de partículas Biolistics® Ò PDS-100He fabricada por Bio-Rad, esencialmente tal como ha sido descrito por Klein, y otros, (1987).
Para la preparación para la inserción de genes extraños dentro de plantas superiores, existen disponibles un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, las series pUC, las series M13mp, pACYC184, etc. De acuerdo con ello, la secuencia que codifica la toxina de B.t. puede insertarse dentro del vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se usa para transformación dentro de E. coli. Las células de E. coli son cultivadas en un medio nutriente adecuado y, a continuación, recolectadas y lisadas. El plásmido se recupera. Como procedimientos de análisis, generalmente se llevan a cabo análisis de secuencias, análisis de restricción, electroforesis, y otros procedimientos bioquímicos-biológicos moleculares. Después de cada manipulación, la secuencia de DNA usada puede escindirse y unirse a la secuencia de DNA siguiente. Cada secuencia de plásmido puede clonarse en el mismo o en otros plásmidos.
Dependiendo del procedimiento de inserción de los genes deseados dentro de la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de DNA. Por ejemplo, si se usa el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula de la planta, en ese caso, ha de unirse a la región flanqueante de los genes a insertar al menos el límite izquierdo, aunque frecuentemente el borde derecho y el izquierdo del T-DNA del plásmido Ti o Ri. El uso de T-DNA para la transformación de células de plantas ha sido intensamente investigado y suficientemente descrito en la Patente EP 120.516; por Hoekema, en The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblassardam, (1985), Capítulo 5; por Fraley, y otros, en Crit. Rev. Plant Sci., vol. 4, págs. 1-46; y por An, y otros, en EMBO J., vol. 4, págs. 277-287, (1985).
Una vez que el DNA insertado ha sido integrado en el genoma, es relativamente estable en él, y, como norma, no sale nuevamente. Normalmente, contiene un marcador de selección que confiere a las células de plantas transformadas resistencia a un biocida o un antibiótico, tal como kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina, o cloranfenicol, entre otros. Los marcadores usados individualmente deberían de acuerdo con ello permitir la selección de células transformadas en vez de células que no contienen el DNA insertado.
Para la inserción de DNA dentro de una célula huésped de una planta existen disponibles un gran número de técnicas. Dichas técnicas incluyen transformación con T-DNA usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, fusión, inyección, biolísticos (bombardeo de micropartículas), o electroporación, así como otros procedimientos posibles. Si se usan Agrobacterias para la transformación, el DNA a insertar ha de ser clonado dentro de plásmidos especiales, fundamentalmente o bien dentro de un vector intermedio, o bien dentro de vector binario. Los vectores intermedios pueden integrarse dentro del plásmido Ti o Ri mediante recombinación de homólogos debido a secuencias que son homólogas a las secuencias en el T-DNA. Igualmente, el plásmido Ti o Ri comprende la región vir necesaria para la transferencia del T-DNA. Los vectores intermedios no pueden replicarse por sí mismos en Agrobacterias. El vector intermedio puede ser transferido dentro de Agrobacterium tumefaciens mediante un plásmido ayudante (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse por sí mismos en E. coli y en Agrobacterias. Estos comprenden un gen marcador de selección y un ligador o poliligador que están enmarcados por las regiones límites derecha e izquierda de T-DNA. Pueden transformarse directamente dentro de Agrobacterias (Holsters, y otros, Mol. Gen. Genet., vol. 163, págs. 181-187, (1978)). El Agrobacterium usado como célula huésped es para comprender un plásmido que porta una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del T-DNA dentro de la célula de la planta. Pueden estar contenidos T-DNA adicionales. El bacterio así transformado se usa para la transformación de células de plantas. Los explantes de plantas pueden cultivarse de manera ventajosa con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del DNA dentro de la célula de la planta. A continuación, pueden regenerarse plantas completas a partir del material de planta infectado (por ejemplo, piezas de hojas, segmentos de tallos, raíces, e igualmente protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, el cual puede contener antibióticos o biocidas para selección. A continuación, las plantas así obtenidas pueden ensayarse para determinar la presencia del DNA insertado. No se producen especiales demandas de los plásmidos en el caso de inyección o electroporación. Es posible usar plásmidos ordinarios, tales como, por ejemplo, derivados de pUC.
Las células transformadas se desarrollan dentro de las plantas de la manera usual. Pueden formar células gérmenes y transmitir el rasgo(s) transformado a las plantas progenie. Dichas plantas pueden desarrollarse de la manera normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios u otros factores hereditarios transformados. Los individuos híbridos resultantes tienen las propiedades fenotípicas correspondientes.
<110> Mycogen Corporation
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<120> Polinucleótidos optimizados de plantas que codifican proteínas pesticidas de aproximadamente 15 kDa y aproximadamente 45 kDa
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<130> MA723/4X
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<140>
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<141>
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<150> 60/105,408
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<150> 60/105,359
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<151> 1998-10-23
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<160> 6
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 357
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Gen de toxina de Bacillus thuringiensis sintético
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Gen de toxina de Bacillus thuringiensis sintético
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<212> PRT
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Toxina codificada por el gen de Bacillus thuringiensis sintético
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<212> DNA
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Gen de toxina de Bacillus thuringiensis sintético
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<212> DNA
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Gen de toxina de Bacillus thuringiensis sintético
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Gen de toxina de Bacillus thuringiensis sintético
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<400> 6
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8

Claims (9)

1. Un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO:5.
2. Un huésped no humano recombinante que expresa un polinucleótido de acuerdo con la Reivindicación 1.
3. Un huésped de acuerdo con la Reivindicación 2, que es una célula de planta.
4. Un huésped de acuerdo con la Reivindicación 2, que es una planta.
5. Un huésped de acuerdo con la Reivindicación 2, que es maíz.
6. Un procedimiento para el control de una plaga en una planta, que comprende el contacto de la plaga con un huésped de acuerdo con la Reivindicación 2.
7. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 6, en el que el huésped es una planta.
8. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 6, en el que el huésped es una planta de Zea mays.
9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 6 a 8, el cual comprende adicionalmente el contacto de la plaga con una segunda proteína, codificada por la SEC ID NO:4 o la SEC ID NO:6.
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