ES2264419T3 - Vacunas y proteinas de streptococcus pneumoniae. - Google Patents
Vacunas y proteinas de streptococcus pneumoniae.Info
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Abstract
Vacuna que comprende como principio activo un polipéptido, o fragmentos inmunogénicos de la secuencia de SEQ ID NO: 8, en la que dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 65% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
Description
Vacunas y proteínas de Streptococcus
pneumoniae.
Esta solicitud reivindica prioridad sobre la
solicitud provisional de los EE.UU. 60/138.453, presentada el 10 de
junio de 1999.
Streptococcus pneumoniae es una bacteria
gram positiva que es un agente principal causante de infecciones
invasivas en animales y seres humanos, tales como septicemia,
meningitis, otitis media y neumonía lobar (Tuomanen, et al.
NEJM 322:1280-1284 (1995)). Como parte de un proceso
infeccioso, los neumococos se unen fácilmente a las células
epiteliales humanas no inflamadas de las vías respiratorias altas y
bajas mediante la unión a los hidratos de carbono eucarióticos de
manera similar a la lectina (Cundell et al., Micro. Match
17:361-374 (1994)). La conversión en infecciones por
neumococos invasivas para bacterias de unión puede implicar la
generación local de factores inflamatorios que pueden activar a las
células epiteliales para cambiar el número y tipo de receptores en
sus superficies (Cundell, et al., Nature,
377:435-438 (1995)). Aparentemente, uno de tales
receptores, el factor de activación plaquetaria (FAP) se aplica por
la bacteria neumocócica y en un periodo de tiempo muy corto
(minutos) a partir de la aparición de FAP, los neumococos muestran
adherencia fuertemente aumentada e invasión del tejido. Se ha
mostrado que ciertos análogos de receptores solubles evitan la
progresión de las infecciones por neumococos
(Idanpaan-Heikkila et al., J. Inf. Dis.,
176:704-712 (1997)). Se ha sugerido que varias
otras proteínas están implicadas en la patogenicidad de S.
pneumoniae pero solo algunas se han confirmado como factores
virulentos. A pesar del hecho de que hay conjugados de cápsula
actualmente en ensayo, existe todavía la necesidad de identificar
polipéptidos adicionales que tienen epítopos en común de diversas
cepas de S. pneumoniae con el fin de usar tales polipéptidos
como vacunas para proporcionar protección frente a una amplia
variedad de serotipos de S. pneumoniae. El documento WO
98/18930 describe vacunas para la prevención o atenuación de
infecciones mediante Streptococcus pneumoniae. Infection and
Inmuinity, 1998, pág 3744 a 3751 describe una vacuna frente a
salmonela oral avirulenta recombinante viva que expresa la proteína
A de superficie de neumococo que induce respuestas protectoras
frente a Streptococcus pneumoniae. El documento WO 00/06738
describe el uso de proteínas de Streptococcus pneumoniae en
vacunas y métodos de selección.
La invención dada a conocer en el presente
documento se refiere a vacunas derivadas a partir de polipéptidos
del organismo neumocócico Streptococcus pneumoniae. Según la
presente invención se dan a conocer en el presente documento varias
secuencias de proteínas, y fragmentos de las mismas y sus
correspondientes secuencias de nucleótidos usadas para la
preparación de manera recombinante de dichos polipéptidos.
Más específicamente, la presente invención da a
conocer un polipéptido grande, denominado Sp130, que contiene 773
residuos de aminoácidos (SEQ ID NO: 8). Se ha encontrado que Sp130
confiere propiedades protectoras en animales inmunizados con dichos
polipéptidos, o partes de los mismos.
La presente invención se refiere también al
campo de los antígenos bacterianos y su uso, por ejemplo, como
agentes inmunogénicos en seres humanos y animales para estimular una
respuesta inmunitaria. Más específicamente, se refiere a la
vacunación de especies de mamíferos con uno o más polipéptidos
producidos según la invención descrita en el presenta documento,
derivándose tales polipéptidos recombinantes a partir de
Streptococcus pneumoniae.
Según la presente invención, tales proteínas
sirven como un mecanismo para estimular la producción de anticuerpos
que protegen al receptor de la vacuna frente a la infección por un
intervalo amplio de serotipos capsulares de S. pneumoniae
patógena.
Además, la invención descrita en el presente
documento se refiere a antiserueros y anticuerpos frente a tales
polipéptidos útiles en el diagnostico y terapia inmunitaria pasiva
con respecto al diagnostico y tratamiento de tales infecciones por
neumococos. Igual que las vacunas descritas en el presente
documento, loa anticuerpos específicos para tales polipéptidos
antígenos, y fragmentos de los mismos, pueden prepararse de manera
recombinante transformando células con vectores que contienen las
secuencias genéticas apropiadas para producir el anticuerpo
tetramérico activo. Tales métodos se conocen bien en la técnica.
En un aspecto particular, la presente invención
se refiere a la prevención y tratamiento de infecciones por
neumococos, tales como infecciones del área del oído medio,
nasofaringea, del pulmón y bronquial, sangre, LCR y similares, que
están producidas por bacterias neumocócicas.
Además la presente invención se refiere a
vacunas preparadas a partir de polipéptidos y proteínas novedosas,
así como fragmentos y segmentos de las mismas, descritas en el
presente documento. Además, se describen de la misma manera ejemplos
del uso de tales proteínas y polipéptidos como vacunas para la
protección de mamíferos.
\newpage
La figura 1 muestra los resultados de 2
experimentos (figuras 1A y 1B, respectivamente), que utilizan la
misma preparación de polipéptidos Sp128 y Sp130. Sp128 no forma
parte de la presenta invención. Los resultados demuestran que la
inmunización activa con polipéptidos Sp128 o Sp130 recombinantes
derivados a partir de un serotipo 4 de Noruega de una cepa de
neumococo es capaz de proteger de la muerte a ratones en un modelo
de septicemia por neumococos usando la cepa heteróloga SJ2 (serotipo
6B). En estos 2 experimentos, sobrevivieron el 90% y el 100%
respectivamente, de los ratones inmunizados con Sp130 al periodo de
observación de 14 días tras la exposición con aproximadamente 400
UFC (unidades formadoras de colonias) de neumococos. A la inversa,
murieron el 100% de los ratones con inmunización simulada
(inyectados solo con PBS (solución salina tamponada con fosfato) más
adyuvante) durante el mismo periodo. Además, para ambos
experimentos, sobrevivieron el 90% de los ratones inmunizados con
Sp128 el mismo periodo de observación de 14 días.
La figura 2 muestra los resultados de la
administración pasiva de antisuero de conejo producido frente a
Sp130 derivado a partir del serotipo 4 de Noruega. Tal
administración pudo de proteger a ratones en el modelo de septicemia
por neumococos utilizando una cepa heteróloga. Más específicamente,
sobrevivieron el 70% de los ratones inmunizados con el antisuero de
Sp130 al periodo de observación de 10 días tras exposición con 1400
UFC de la cepa WO2 (serotipo 3).
Además, murieron el 100% de los ratones
inmunizados con un suero control (recogido antes de la inmunización)
en el día 4.
La figura 3 es una inmunotransferencia de tipo
western blot que muestra la reactividad de antisuero producido
frente a Sp130 recombinante (derivado a partir de la cepa de
serotipo 4 de Noruega) con los lisados de célula completa de cepas
heterólogas. Todas las cepas de S. pneumoniae probadas
mostraron una banda de peso molecular de aproximadamente 220 kD, la
masa esperada para un proteína que contiene tanto la secuencia de
Sp128 como la secuencia de Sp130, lo que indica que esta proteína
estaba presente en todas las cepas que se probaron. Las cepas
probadas incluyeron aislados de cada uno de los serotipos de
neumococo representados en el uso actual de la vacuna de
polisacárido 23-valente
La figura 4 es una inmunotransferencia de tipo
de western blot que muestra la reactividad del suero del paciente o
bien con Sp128 o bien con Sp130. La figura 4A muestra los resultados
para Sp128. La figura 4B muestra los resultados para Sp130. Se
determinaron las proteínas recombinantes mediante
SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. Se
recogieron los sueros de 5 pacientes (indicados por número en la
parte superior) en dos momentos diferentes. La primera recogida
(denominada "A" por "suero agudo") fue poco después de la
aparición de la enfermedad; la segunda recogida (denominada "C"
por "convaleciente") se realizó de 8 a 30 días más tarde. Se
utilizaron estos sueros para sondear las inmunotransferencias. Los
resultados muestran que para los pacientes 2, 3 y 5, el suero
convaleciente reaccionó de manera más fuerte con Sp128 y Sp130 de lo
que lo hizo el correspondiente de suero agudo. Tales hallazgos
constituyen una evidencia indirecta de que tanto Sp128 como Sp130 se
expresan por S. pneumoniae durante esta fase de
infección.
Según la presente invención en el presente
documento se describen polipéptidos recombinantes correspondientes a
Sp130 (SEQ ID NO: 8).
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar métodos de uso de estos polipéptidos recombinantes, y
fragmentos inmunológicamente activos de los mismos, como un medio de
inmunización de animales, especialmente mamíferos, lo más
especialmente seres humanos, frente a una variedad de infecciones
microbianas, especialmente infecciones por neumococo.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar polipéptidos, tal como se describe en el presente
documento, y fragmentos activos de los mismos, tanto si se derivan
de fuentes naturales como si se preparan por medio de tecnología
recombinante, para el uso en la inmunización de animales,
especialmente mamíferos, loa más especialmente seres humanos; frente
infección por neumococo.
Es todavía un objeto adicional de la presente
invención proporcionar vacunas que incluyen polipéptidos obtenidos a
partir de S. pneumoniae y/o variantes de dichos polipéptidos
y/o fragmentos activo de tales polipéptidos, que incluyen
polipéptidos preparados mediante medios recombinantes ( es decir,
proteínas y polipéptidos recombinantes).
Según la presente invención, también se
describen en el presente documento secuencias de ADN y ácidos
nucleicos y moléculas, y fragmentos de las mismas (y sus
correspondientes secuencias de ARN aisladas, y moléculas y
fragmentos de las mismas) que muestran homología de secuencia con, o
identidad a, o que pueden hibridarse con, las secuencias de ADN
identificadas en SEQ ID NO: 5 y 7. La presente invención se refiere
también a secuencias de ADN (o ARN) que codifican para el mismo
polipéptido tal como se codifica por la secuencia de SEQ ID NO: 7,
incluyendo también fragmentos y partes de la misma y, cuando se
derivan de fuentes naturales, incluyendo alelos de la misma, para
el fin expreso de facilitar la expresión recombinante de los
polipéptidos inmunogénicos, y fragmentos inmunogénicos de los
mismos, descritos en el presente documento.
Por tanto, una secuencia de ADN (o ARN) aislada
puede incluir solo la región codificante del gen expresado (o
fragmento o parte del mismo tal como se indicó anteriormente) o
puede incluir además todo o parte del ADN (o ARN) no codificante del
gen humano expresado.
Según la presente invención, el término
"identidad en porcentaje" o "idéntico en porcentaje",
cuando se refiere a una secuencia, significa que una secuencia se
compara a una secuencia descrita o reivindicada tras la alineación
de la secuencia que va a compararse (la "secuencia comparada")
con la secuencia reivindicada o descrita (la "secuencia de
referencia"). La identidad en porcentaje se determina entonces
según la fórmula siguiente:
Identidad en porcentaje = 100 [1 -
(C/R)]
en la que C es el número de
diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia
comparada en la longitud de la alineación entre la secuencia de
referencia y la secuencia comparada en la que (i) cada base o
aminoácido en la secuencia de referencia que no tiene una base o
aminoácido alineado correspondiente en la secuencia comparada y (ii)
cada hueco en la secuencia de referencia y (iii) cada base o
aminoácido alineado en la secuencia de referencia que es diferente
de una base o aminoácido alineado en la secuencia comparada,
constituyen una diferencia; y R es el número de bases o aminoácidos
en la secuencia de referencia en la longitud de la alineación con la
secuencia comparada contándose también cualquier hueco creado en la
secuencia de referencia como base o
aminoácido.
Si existe una alineación entre la secuencia
comparada y la secuencia de referencia para la que la identidad en
porcentaje tal como se calculó anteriormente es aproximadamente
igual o superior a una identidad en porcentaje mínima específica,
entonces la secuencia comparada tiene una identidad en porcentaje
mínima específica con respecto a la secuencia de referencia aun
cuando pueden existir alineaciones en las que la identidad en
porcentaje calculada anteriormente en el presente documento es
inferior a la identidad en porcentaje específica.
Según la presente invención, en el presente
documento se describen las secuencias de polinucleótidos que
codifican para las vacunas de polipéptidos de la invención de tal
modo que facilitan la expresión recombinante de dichos polipéptidos.
Tales polinucleótidos codifican para el polipéptido de SEQ ID NO: 8
y se describen como la secuencia de SEQ ID NO: 7.
Para fines de la expresión de manera
recombinante de las vacunas de polipéptidos de la invención, el
polinucleótido de SEQ ID NO: 7 puede tener también la secuencia
codificante unida en la estructura a una secuencia de marcador que
permite purificar el polipéptido de la presente invención. La
secuencia de marcador puede ser una etiqueta de
hexa-histidina (por ejemplo, tal como puede
suministrarse por un vector pQE-9) para proporcionar
la purificación del polipéptido maduro unido al marcador en el caso
de que se utilice un huésped bacteriano, o, por ejemplo, la
secuencia de marcador puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA)
cuando se utilice un huésped mamífero, por ejemplo las células
COS-7. La etiqueta de HA corresponde a un epítopo
derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza (Wilson, I.,
et al., Cell, 37:767 (1984)).
Para facilitar la generación de los
polinucleótidos descritos en el presente documento, se proporcionan
cebadores de PCR apropiados tal como SEQ ID NOS: 1 (cebador 5' para
Sp128), 2 (cebador 3' para Sp128), 3 (cebador 5' para Sp130), y 4
(cebador 3' para Sp130).
Los polipéptidos, y fragmentos de los mismos, de
las vacunas descritas como productos de expresión según la invención
puede estar en "forma enriquecida". Tal como se utiliza en el
presente documento, el término "enriquecida" significa que la
concentración del material es de al menos aproximadamente 2, 5, 10,
100, ó 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), de manera
ventajosa el 0,01% en peso, preferiblemente al menos aproximadamente
el 0,1% en peso. Se contemplan también las preparaciones
enriquecidas de aproximadamente el 0,5%, el 1%, el 5%, el 10%, y el
20% en peso. Las secuencias, los constructor, los vectores, los
clones, y otros materiales que comprenden la presente invención
pueden estar de manera ventajosa en forma enriquecida o en forma
aislada.
"Aislada" significa en el contexto de la
presente invención con respecto a los polipéptidos que el material
se elimina de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural
si se produce en la naturaleza). Por ejemplo, un polinucleótido o
polipéptido que se produce en la naturaleza presente en un organismo
vivo no está aislado, sino que el mismo polipéptido, separado de
algunos o de todos los materiales que co-existen en
el sistema natural, está aislado. Tales polipéptidos pueden ser
parte de una composición, y todavía estar aislado en el sentido en
que tal composición no es parte de su entorno natural. Se
proporcionan de manera preferible los polipéptidos de las vacunas
descritas en el presente documento en una forma aislada, y
preferiblemente se purifican hasta homogeneidad.
Los polipéptidos inmunogénicos o recombinantes
descritos según la presente invención también pueden estar en forma
"purificada". El término "purificada" no requiere pureza
absoluta; en vez de eso, se propone como una definición relativa, y
pueden incluir preparaciones que están altamente purificadas o
preparaciones que están solo parcialmente purificadas, tal como se
entienden aquellos términos por los expertos en la técnica
relevante. Por ejemplo, clones individuales aislados de una
biblioteca de ADNc se han purificado de manera convencional hasta
homogeneidad electroforética. Se contempla de manera expresa la
purificación del material de partida o el material natural hasta al
menos un grado de magnitud, preferiblemente dos o tres grados, y más
preferiblemente cuatro o cinco grados de magnitud. Además, se
contempla de manera expresa el polipéptido reivindicado que tiene
una pureza de preferiblemente el 0,001%, o de al menos el 0,01% o el
0,1%; e incluso deseablemente del 1% en peso o superior.
El término "región codificante" se refiere
a esa parte del gen que codifica o bien de manera natural o bien de
manera normal para el producto de expresión de ese gen en su entorno
genómico natural, es decir, la región que codifica in vivo
para el producto de expresión nativo del gen. La región codificante
puede ser de un gen normal, mutado o alterado, o puede ser incluso
de una secuencia de ADN, o gen, completamente sintetizados en el
laboratorio utilizando métodos bien conocidos por aquellos expertos
en la técnica de la síntesis de ADN.
El término "cebador" significa una
secuencia corta de ácidos nucleicos que está apareada con una cadena
de ADN y proporciona un extremo de OH en 3' libre en el que una ADN
polimerasa comienza la síntesis de una cadena de
desoxirribonucleótido.
En el nivel más simple, puede sintetizarse la
secuencia de aminoácidos correspondiente a todo o parte de los
polipéptidos según la presente invención utilizando sintetizadores
de péptidos disponibles comercialmente. Esto es particularmente útil
en la producción de péptidos pequeños y fragmentos de péptidos más
grandes. (Los fragmentos son útiles, por ejemplo, en la generación
de anticuerpos frente al polipéptido nativo).
Los términos "fragmento", "derivado" y
"análogo", cuando se refieren a los polipéptidos según la
presente invención, significan un polipéptido que retiene
esencialmente la misma función o actividad biológica que dicho
polipéptido. Por tanto, un análogo incluye una proproteína que puede
activarse mediante escisión de la parte de la proproteína para
producir un polipéptido maduro activo. Tales fragmentos, derivados y
análogos deben tener suficiente similitud con respecto a los
polipéptidos SEQ ID NO: 6 y 8, de manera que se mantenga la
actividad del polipéptido nativo.
Las vacunas de polipéptidos de la presente
invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos
naturales o polipéptidos sintéticos, preferiblemente polipéptidos
recombinantes.
"Recombinante", tal como se utiliza en el
presente documento, significa que una proteína se deriva de sistemas
de expresión recombinantes (por ejemplo, microbiano o mamífero).
"Microbiano" se refiere a proteínas recombinantes preparadas en
sistemas de expresión bacterianos o fúngicos (por ejemplo,
levadura). Como un producto, "microbiano recombinante" define
una proteína esencialmente libre de sustancias endógenas nativas y
no acompañadas por glicosilación nativa asociada. La proteína
expresada en la mayoría de los cultivos de bacterias, por ejemplo,
E. coli, estará libre de modificaciones de glicosilación que
normalmente podría tener lugar en sistemas de expresión de levaduras
o mamíferos. Por tanto, los patrones de tales modificaciones tras la
traducción diferirán con el sistema de expresión. Sin embargo, se
considera que todas las variantes de este tipo están en la
descripción de la presenta invención.
Una vacuna según la presenta invención
comprenderá un polipéptido, incluyendo fragmentos inmunogénicos del
mismo, que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos
el 65%, preferiblemente idéntica en el 80%, lo más preferiblemente
idéntica en al menos el 95%, e idealmente idéntica en el 100% a la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
La presente invención también se refiere a un
antisuero producido mediante la inmunización de un animal con un
polipéptido según la invención. La invención incluye también un
anticuerpo aislado que se une de manera específica a un polipéptido
de la invención. Un anticuerpo de este tipo puede ser un anticuerpo
monoclonal, producido posiblemente por una línea celular de
hibridoma, y que puede incluir también un anticuerpo producido de
manera recombinante formado mediante la introducción en una línea
celular adecuada de las secuencias genéticas requeridas para
producir un anticuerpo específico para las vacunas de polipéptidos
descritas en el presente documento.
La presente invención también se refiere a una
vacuna que comprende uno o más polipéptidos de S. pneumoniae
seleccionados de los polipéptidos y fragmentos inmunogénicos de los
mismos, descritos en el presente documento, suspendidos en un
diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable,
siempre que dicho polipéptido esté presente en una cantidad eficaz
para obtener anticuerpos protectores en un animal frente a un
organismo relacionado con el género Streptococcus,
preferiblemente un organismo del género Streptococcus, y los
más preferiblemente cuando el organismo es Streptococcus
pneumoniae.
La presente invención también proporciona un
método para la prevención o para el tratamiento de una infección
producida por un miembro del género Streptococcus en un
animal, que comprende administrar al animal, especialmente un
mamífero, y lo más especialmente un ser humano, un polipéptido o un
fragmento inmunogénico del mismo, tal como se describe en el
presente documento, y en el que dicho polipéptido, o fragmento
inmunogénico del mismo, se administra en una cantidad eficaz para
prevenir o atenuar dicha infección. En el uso de los métodos de la
invención, la enfermedad que va a prevenirse o tratarse será
preferiblemente una infección por neumococo, lo más preferiblemente
una infección por un organismo que es un miembro del género
Streptococcus, idealmente Streptococcus
pneumoniae.
Una vacuna descrita según la presente invención
puede incluir también una vacuna que comprende un organismo
microbiano transformado con polinucleótidos, y por tanto que expresa
los polipéptidos, o fragmentos de los mismos, de Sp130 (SEQ ID NO:
8). Por tanto. la presente invención abarca también un método de
prevención o atenuación de una infección producida por un miembro
del género Streptococcus en un animal, especialmente un
mamífero, lo más especialmente un ser humano, que comprende
administrar a dicho animal tal vacuna, en la que se administra dicha
vacuna en una cantidad eficaz para prevenir o atenuar dicha
infección. En la aplicación del método de la invención, el
microorganismo transformado se selecciona del grupo que consiste en
salmonela, micobacteria, estreptococos, virus de la viruela, y
adenovirus.
Pueden emplearse fragmentos o partes de los
polipéptidos de la presente invención para producir el
correspondiente polipéptido de longitud completa mediante la
síntesis de péptidos; por tanto, pueden utilizarse los fragmentos
como compuestos intermedios para producir los polipéptidos de
longitud completa. Pueden usarse los fragmentos o partes de los
polinucleótidos de la presente invención para sintetizar los
polinucleótidos de cadena completa de la presente invención.
Los fragmentos inmunogénicos de las vacunas de
polipéptidos descritas según la invención incluirán fragmentos
inmunogénicos de Sp130 (SEQ ID NO: 8), cuyos fragmentos pueden
seleccionarse fácilmente para detectar actividad inmunogénica. Por
ejemplo, en la secuencia de aminoácidos de Sp130, se sabe que el
fragmento correspondiente a los residuos 657 a 773 proporciona
aproximadamente el 40% de protección frente a la secuencia entera de
Sp130. Por tanto, el fragmento primero protege a aproximadamente 4
de los 10 ratones expuestos a Streptococcus pneumoniae frente
a 10 de los 10 para la secuencia entera de Sp130. Por tanto, el
fragmento específico puede incluir los fragmentos que tienen
secuencias de aminoácidos 650-773,
640-773, 630-773,
620-773, 610-773,
600-773, y fragmentos similares hasta la secuencia
entera de Sp130 (SEQ ID NO: 8).
Tales variaciones en la homología para las
vacunas supuestas se conocen bien en la técnica (véase por ejemplo,
Hansen et al., "Active and Passive Inmunity Against Borelia
bergdorferi Decorin Binding Protein A (DbpA)", "Infecction and
Inmunity", (mayo) 1998, páginas 2143-2153;
Roberts et al., "Heterogeneity Among Genes Including
Decorin Binding Proteins A and B of Borelia bergdorferi sensu
lato", Infecciton and Inmunity, (noviembre) 1998, páginas
5275-5285). Pueden aplicarse de manera similar tales
observaciones a partes de las proteínas descritas en el presente
documento.
Tales fragmentos o segmentos encuentran una
multitud de usos. Por ejemplo, tales segmentos de los polipéptidos
según la presente invención encuentran uso como compuestos
intermedios en la síntesis de estructuras de mayor peso molecular
también dentro de la presente invención.
El término "fragmento activo" o
"fragmento inmunogénico" significa un fragmento que genera una
respuesta inmunitaria (es decir, tiene actividad inmunogénica)
cuando se administra, solo u opcionalmente con un adyuvante
adecuado, a un animal, tal como un mamífero, por ejemplo, un conejo
o un ratón, y a también incluyendo un ser humano.
Tal como se observa, pueden usarse los
polipéptidos, fragmentos u otros derivados, o análogos de los
mismos, o células que los expresan, tal como un inmunógeno para
producir anticuerpos frente a los mismos. Estos anticuerpos pueden
ser por ejemplo, policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena
sencilla, fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de
expresión Fab. Pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la
técnica para la producción de anticuerpos policlonales,
especialmente si estos están en la forma de antisuero producido
frente a los polipéptidos, o fragmentos de los mismos, según la
presente invención. Tales antisueros encuentran uso en la
inmunización frente a la infección por neumococo.
Pueden obtenerse los anticuerpos generados
frente a una vacuna de polipéptidos correspondiente a la secuencia
de la presente invención mediante inyección directa del polipéptido
en el animal o mediante la administración del polipéptido al animal,
preferiblemente no un ser humano. El anticuerpo así obtenido, se
unirá entonces al propio polipéptido. De esta manera, puede usarse
incluso una secuencia que codifica solo para un fragmento del
polipéptido para generar anticuerpos que se unen al polipéptido
nativo completo.
Para la preparación de los anticuerpos
monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione
anticuerpos producidos mediante cultivos de líneas celulares
continuas. Ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y
Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica de
trioma, la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et
al., 1983, Inmunology Today 4:72), y la técnica de hibridoma EBV
para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole, et al.,
1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
Inc., pág. 77-96).
Por tanto, la presente invención también se
refiere al uso de polipéptidos novedosos descritos en el presente
documento, así como también a fragmentos inmunogénicos de los
mismos, para la producción de linfocitos, o células de hibridoma,
que producen anticuerpos monoclonales frente a tales polipéptidos, o
fragmentos inmunogénicos de los mismos. La presente invención
también se refiere a las células de hibridoma que producen tales
anticuerpos.
Las técnicas descritas para la producción de
anticuerpos de cadena sencilla (patente de los EE.UU. 4.946.778)
pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena sencilla frente
a productos de polipéptido inmunogénicos de esta invención.
Los anticuerpos pueden usarse en métodos
relacionados con la localización y la actividad de las secuencias de
proteínas de la invención, por ejemplo, para formar imágenes de
estas proteínas, medir los niveles de las mismas en muestras
fisiológicas apropiadas y similares, y para otras aplicaciones
diagnósticas.
Una vacuna según la presente invención puede
incluir uno o más de los polipéptidos descritos anteriormente en el
presente documento o fragmentos activos de los mismos. Cuando se
emplea más de un polipéptido o fragmento activo, tal como dos o más
polipéptidos y/o fragmentos activos pueden utilizarse como una
mezcla física o como una fusión de dos o más polipéptidos o
fragmentos activos. El fragmento de fusión o el polipéptido de
fusión pueden producirse, por ejemplo, mediante técnicas
recombinantes o mediante el uso de ligadores apropiados para
fusionar los polipéptidos o fragmentos activos preparados
previamente.
En muchos casos, una variación en el polipéptido
o fragmento activo es una sustitución de aminoácidos conservativa,
aunque otras sustituciones están dentro del alcance de la
invención.
Según la presente invención, una variante de
polipéptido incluye variantes en las que uno o más aminoácidos se
sustituyen y/o se delecionan y/o se insertan.
En otro aspecto, la invención se refiere a
vacunas de inmunidad pasivas formuladas a partir de anticuerpos
frente a un polipéptido o un fragmento activo de un polipéptido de
la presente invención. Tales vacunas de inmunidad pasivas pueden
utilizarse para prevenir y/o tratar las infecciones por neumococos
en pacientes. De esta manera, según un aspecto adicional de la
invención, puede producirse una vacuna a partir de un polipéptido
sintético o recombinante de la presente invención o un anticuerpo
frente a tal polipéptido.
Tal como ya se describió, otro aspecto de la
presente invención se refiere a un método para usar uno o más
anticuerpos (monoclonales, policlonales o sueros) frente a los
polipéptidos de la invención tal como se describió anteriormente
para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades que están
producidas por la bacteria neumocócica. En particular, la invención
se refiere a un método para la profilaxis y/o el tratamiento de
enfermedades infecciosas que están producidas por S.
pneumoniae. Todavía en un aspecto adicional preferido, la
invención se refiere a un método para la profilaxis y/o el
tratamiento de otitis media, infecciones nasofaríngeas y
bronquiales, y similares en seres humanos usando una vacuna de la
presente invención.
Generalmente, las vacunas se preparan como
productos inyectables, en la forma de suspensiones o disoluciones
acuosas. También se conocen bien vacunas en una base de aceite,
tales como para su inhalación. Las formas sólidas que se disuelven o
suspenden antes de su uso también pueden formularse. Se añaden
generalmente excipientes, diluyentes y vehículos farmacéuticos que
son compatibles con los principios activos y aceptables para el uso
farmacéutico. Ejemplos de tales vehículos incluyen, pero no se
limitan a, agua, soluciones salinas, dextrosa o glicerol. También
pueden utilizarse combinaciones de vehículos.
Las composiciones de vacuna pueden incorporar
además sustancias adicionales para estabilizar el pH, o para
funcionar como adyuvantes, agentes humectantes, o agentes
emulsionantes, que pueden servir para mejorar la eficacia de la
vacuna.
Las vacunas generalmente se formulan para su
administración parenteral y se inyectan o bien por vía subcutánea o
bien por vía intramuscular. Las vacunas de este tipo pueden
formularse también como supositorios o para su administración oral,
utilizando métodos conocidos en la técnica, o para su administración
a través de las vías nasal o respiratoria.
La cantidad de vacuna suficiente para conferir
inmunidad frente a bacterias patógenas se determina mediante métodos
bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Esta cantidad se
determinará basándose en las características del receptor de la
vacuna y el nivel de inmunidad requerido. Normalmente, la cantidad
de vacuna que va a administrarse se determinará basándose en el
criterio de un médico experto. Cuando se administren las vacunas
mediante una inyección subcutánea o intramuscular, puede
administrarse un intervalo de 5 a 500 \mug de proteína
purificada.
La presente invención también se refiere a una
vacuna en la que se suministra o administra un polipéptido o
fragmento activo de la presente invención en la forma de un
polinucleótido que codifica para el polipéptido o fragmento activo,
mediante lo cual se produce el polipéptido o fragmento activo in
vivo. Puede incluirse el polinucleótido en un vector de
expresión adecuado y combinarse con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Además, los polipéptidos de la presente
invención pueden utilizarse como inmunógenos para estimular la
producción de anticuerpos para su uso en inmunoterapia pasiva, para
su uso como reactivos diagnósticos, y para su uso como reactivos en
otros procedimientos tales como cromatografía de afinidad.
En otro aspecto la presente invención
proporciona polinucleótidos que codifican para los polipéptidos y
fragmentos activos de la invención descritos anteriormente en el
presente documento. El polinucleótido de la presente invención puede
estar en la forma de ARN o en la forma de ADN, ADN que incluye ADNc,
ADN genómico, y ADN sintético. El ADN puede ser de cadena doble o de
cadena sencilla, y si es de cadena sencilla puede ser la cadena
codificante o la cadena no codificante (antisentido).
Las células huésped se obtienen por ingeniería
genética (se transducen o se transforman o se transfectan) con los
vectores que comprenden un polinucleótido que codifica para un
polipéptido de la invención. El vector puede estar, por ejemplo, en
la forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las
células huésped obtenidas por ingeniería genética pueden cultivarse
en medios nutritivos convencionales modificados según sea necesario
para activar los promotores, seleccionar los transformantes o
amplificar los polinucleótidos que codifican para tales
polipéptidos. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH
y similares, son aquellas utilizadas previamente con la célula
huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el
experto ordinario en la técnica.
Los vectores incluyen secuencias de ADN
cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo, derivados
de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos
de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN
de fago; ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de la
viruela de aves y pseudorrabia. Sin embargo, puede utilizarse
cualquier otro vector siempre que sea replicable y viable en el
huésped.
La secuencia de ADN apropiada puede insertarse
en el vector mediante una variedad de procedimientos. En general, la
secuencia de ADN se inserta en un(os) sitio(s) de
endonucleasa de restricción apropiado(s) mediante
procedimientos conocidos en la técnica. Tales procedimientos y otros
se considera que están dentro del alcance de aquellos expertos en la
técnica.
La secuencia de ADN en el vector de expresión
está unida de manera operativa a una(s) secuencia(s)
control de expresión apropiada(s) (promotor) para dirigir la
síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores,
pueden mencionarse: promotor de SV40 o LTR, el lac o trp de E.
coli, el promotor P_{L} lambda de fago y otros promotores que
se sabe que controlan la expresión genética en las células
procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión también
contiene un sitio de unión a ribosomas para la iniciación de la
traducción y un terminador de la transcripción. El vector puede
incluir también secuencias apropiadas para amplificar la
expresión.
Además, los vectores de expresión contienen
preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables para
proporcionar un carácter fenotípico para la selección de células
huésped transformadas tal como dihidrofolato reductasa o resistencia
a la neomicina para un cultivo de células eucariotas, o tal como
resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E. coli.
El vector que contiene la secuencia de ADN
apropiada tal como se describió anteriormente en el presente
documento, así como una secuencia control o promotora apropiada,
puede emplearse para transformar un huésped apropiado para permitir
que el huésped exprese las proteínas.
Como ejemplos representativos de huéspedes
apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas, tales como
E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células
fúngicas, tales como levadura; células de insecto tales como
Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales
como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células vegetales,
etc. Se considera que la selección de un huésped apropiado está
dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de
las enseñanzas en el presente documento.
Más particularmente, la presente invención
también incluye constructos recombinantes que comprenden una o más
de las secuencias tal como se describieron con detalle
anteriormente. Los constructos comprenden un vector, tal como un
vector viral o de plásmido, en el que se ha insertado una secuencia
de la invención, en una orientación directa o inversa. En un aspecto
preferido de esta realización, el constructo comprende
adicionalmente secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un
promotor, unido de manera operativa a la secuencia. Se conoce un
gran número de promotores y vectores adecuados por parte de aquellos
expertos en la técnica, y están disponibles comercialmente. Se
proporcionan los vectores siguientes a modo de ejemplo. Bacterianos:
pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen, Inc.), pBS, pD10,
phagescript, psiX174, pbluescript SK, pBS, pNH8A, pNH16a, pNH18A,
pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucariotas:
pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG,
pSVL (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro
plásmido o vector siempre que sean replicables y viables en el
huésped.
Las regiones promotoras pueden seleccionarse de
cualquier gen deseado utilizando vectores CAT (cloranfenicol
transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos
vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Promotores
bacterianos mencionados particularmente incluyen lacI, lacZ, T3, T7,
gpt, landa P_{X}, P_{L} y TRP. Los promotores eucariotas
incluyen CMV inmediato temprano, timidina cinasa de HSV, SV40
temprano y tardío, LTR de retrovirus, y
metalotioneína-I de ratón. La selección del promotor
y vector apropiado está dentro del nivel del experto ordinario en la
técnica.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a células huésped que contienen los constructos
mencionados anteriormente. La célula huésped puede ser una célula
eucariota superior; tal como una célula mamífera, o una célula
eucariota inferior; tal como una célula de levadura, o la célula
huésped puede ser una célula procariota, tal como una célula
bacteriana. La introducción del constructo en la célula huésped
puede efectuarse mediante la transfección de fosfato de calcio,
transfección mediada por DEAE-dextrano, o
electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in
Molecular Biology, (1986)).
Los constructos en las células huésped puede
utilizarse de una manera convencional para producir el producto
genético codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente,
los polipéptidos de la invención pueden producirse sintéticamente
mediante sintetizadores de péptido convencionales.
Las proteínas maduras pueden expresarse en
células mamíferas, levaduras, bacterias, u otras células bajo el
control de promotores apropiados. Los sistemas de traducción libres
de células pueden emplearse también para producir tales proteínas
utilizando ARN derivados de los constructos de ADN de la presente
invención. Los vectores de clonación y expresión adecuados para su
uso con huéspedes procariotas y eucariotas se describen por
Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989).
La transcripción del ADN que codifica para los
polipéptidos de la presente invención por parte de eucariotas
superiores se aumenta insertando una secuencia potenciadora en el
vector. Son potenciadores los elementos de ADN que actúan en cis,
normalmente de manera aproximada desde 10 hasta 300 pb que actúan
sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos
incluyen el potenciador de SV40 en la parte tardía del origen de
replicación de 100 a 270 pb, un potenciador de promotor temprano del
citomegalovirus, el potenciador de polioma en la parte tardía del
origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.
Generalmente, los vectores de expresión
recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores
seleccionables que permiten la transformación de la célula huésped,
por ejemplo el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli
y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un
gen sumamente expresado para dirigir la transcripción de una
secuencia estructural en el sentido de 3'. Tales promotores pueden
derivarse de operones que codifican para enzimas glicolíticas tales
como 3-fosfoglicerato cinasa (PGK); factor \alpha,
fosfatasa ácida, o proteínas de choque térmico, entre otras. La
secuencia estructural heteróloga se ensambla en una fase apropiada
con secuencias de iniciación y terminación de la traducción.
Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar para una
proteína de fusión que incluye un péptido de identificación
N-terminal que confiere las características
deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada
del producto recombinantes expresado.
Los vectores de expresión útiles para su uso
bacteriano se construyen insertando una secuencia de ADN estructural
que codifica para una proteína deseada junto con señales de
iniciación y terminación de la traducción adecuadas en una fase de
lectura que puede funcionar con un promotor funcional. El vector
comprenderá uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un
origen de replicación para garantizar el mantenimiento del vector y
para, si se desea, proporcionar la amplificación dentro del huésped.
Huéspedes procariotas adecuados para la transformación incluyen
E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas
especies dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y
Staphylococcus, aunque pueden emplearse también otros por
elección, incluyendo especies de estreptococos, especialmente S.
pneumoniae.
En una realización adicional, pueden utilizarse
los propios organismos microbianos transformados genéticamente con
polinucleótidos que expresan Sp128 o Sp130, o ambos, como vehículos
de administración de vacunas vivos. Los ejemplos incluyen, pero no
se limitan de ninguna manera a, especies de salmonela, especies de
micobacterias, especies de estreptococos, virus de la viruela,
adenovirus, y similares. Además, las plantas transgénicas
comestibles también pueden ser candidatos para la administración de
vacunas.
Como un ejemplo representativo pero no
limitante, los vectores de expresión útiles para su uso bacteriano
pueden comprender un marcador seleccionable y un origen bacteriano
de replicación derivado de plásmidos disponibles comercialmente que
comprenden elementos genéticos del vector de clonación bien conocido
pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por
ejemplo, pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ, EE.UU.) y pGEM1 (Promega, Madison, WI, EE.UU.).
Estas secciones "de esqueleto" de pBR322 se combinan con un
promotor apropiado y la secuencia estructural que va a
expresarse.
Tras la transformación de una cepa huésped
adecuada y el crecimiento de la cepa huésped hasta una densidad de
células apropiada, se induce el promotor seleccionado mediante
medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción
química) y se cultivan las células durante un periodo adicional.
Las células se recogen normalmente mediante
centrifugación, se rompen mediante medios físicos o químicos, y se
retiene el extracto bruto resultante para una purificación
adicional.
Las células microbianas empleadas en la
expresión de proteínas pueden romperse mediante cualquier método
conveniente, incluyendo ciclo de
congelación-descongelación, sonicación, una prensa
francesa, rotura mecánica, o el uso de agentes de lisis celular, los
métodos de este tipo son muy conocidos para aquellos expertos en la
técnica. Sin embargo, se prefieren células huésped que secretan el
polipéptido de la invención y permiten la recuperación del
polipéptido de los medios de cultivo.
También pueden emplearse diversos sistemas de
cultivo de células mamíferas para expresar la proteína recombinante.
Ejemplos de sistemas de expresión mamíferos incluyen las líneas de
COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas
por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otras líneas celulares que
pueden expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas
celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión
mamíferos comprenderán un origen de replicación, un promotor y
potenciador adecuados, y también cualquier sitio de unión a ribosoma
necesario, sitio de poliadenilación, sitios aceptores y donadores de
corte y empalme, secuencias de terminación transcripcional, y
secuencias no transcritas flanqueantes en 5'. Las secuencias de ADN
derivadas del corte y empalme SV40, y los sitios de poliadenilación
pueden utilizarse para proporcionar los elementos genéticos no
transcritos
requeridos.
requeridos.
Los polipéptidos pueden recuperarse y/o
purificarse a partir de cultivos de células recombinantes mediante
métodos de recuperación y purificación de proteínas bien conocidos.
La metodología de este tipo puede incluir precipitación con sulfato
de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio
aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía
de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía
de hidroxilapatita y cromatografía sobre lectina. Pueden utilizarse
etapas de repliegue de proteínas, según sea necesario, para
completar la configuración de la proteína madura. Con respecto a
esto, pueden usarse chaperonas en un procedimiento de plegado de
este tipo. Finalmente, puede emplearse una cromatografía de líquidos
de alta resolución (HPLC) para las etapas de purificación final.
Los polipéptidos que son útiles como inmunógenos
en la presente invención pueden ser un producto purificado de manera
natural, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o
producido mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped
procariota o eucariota (por ejemplo, mediante células bacterianas,
de levaduras, de plantas superiores, de insecto y de mamífero en
cultivo). Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de
producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención
pueden estar glicosilados o no glicosilados.
Los procedimientos para el aislamiento de los
polipéptidos expresados individualmente pueden aislarse mediante
métodos de expresión recombinante/aislamiento que son muy conocidos
en la técnica. Ejemplos típicos para tal aislamiento pueden utilizar
un anticuerpo frente a un área conservada de la proteína o frente a
una etiqueta His o cola o líder que puede escindirse que se expresa
como parte de la estructura de la proteína.
Ahora se describirán adicionalmente
realizaciones específicas de la invención con más detalle en los
siguientes ejemplos no limitantes y se apreciará que las
realizaciones adicionales y diferentes de las enseñanzas de la
presente invención se sugerirán por sí mismas sin lugar a duda para
aquellos expertos en la técnica y se considera que tales otras
realizaciones se han deducido a partir de la descripción en el
presente documento.
Se aisló el ADN genómico utilizado como diana
para la amplificación utilizando la reacción en cadena de la
polimerasa de Streptococcus pneumoniae (cepa Noruega -
serotipo 4), se utilizó la misma cepa para la secuenciación
genómica. Se proporcionan la secuencia de nucleótidos de los
fragmentos de gen que codifican para Sp128 (SEQ ID NO: 5) y Sp130
(SEQ ID NO: 7) con la secuencia de aminoácidos correspondiente para
los polipéptidos Sp128 (SEQ ID NO: 6) y Sp130 (SEQ ID NO: 8) en la
lista de secuencias.
Se diseñaron cebadores (SEQ ID NO:
1-4) de modo que se amplificaran los fragmentos de
gen o bien Sp128 o bien Sp130 y se permitiera su clonación en el
vector de expresión de E. coli pQE10 con, por ejemplo, la
expresión posterior de un producto de proteína marcado con histidina
para la purificación mediante cromatografía de afinidad con
níquel.
Por tanto, la clonación de los fragmentos
amplificados mediante los cebadores de las SEQ ID NOS: 1 y 2 da como
resultado el polipéptido de la SEQ ID NO: 6 (denominado Sp128),
mientras que la clonación del fragmento amplificado utilizando los
cebadores descritos en las SEQ ID NOS: 3 y 4 da como resultado el
polipéptido de la SEQ ID NO: 8 (denominado Sp130).
En cada uno de los experimentos mostrados en la
figura 1, se inmunizaron ratones C3H/HeJ (10 por grupo) por vía
intraperitoneal (i.p.) con proteína o bien Sp128 o bien Sp130 (15
\mug en 50 \mul de PBS (phosphate buffered saline/solución
salina tamponada con fosfato) emulsionada en 50 \mul de adyuvante
completo de Freund (ACF)). Se inmunizó de manera simulada un grupo
de 10 ratones sólo con PBS y ACF.
Se administró una segunda inmunización de 15
\mug de proteína con adyuvante incompleto de Freund (AIF) 3
semanas más tarde (recibiendo el grupo inmunizado de manera simulada
PBS y AIF).
Se extrajo sangre (sangrado retroorbital) en la
semana 7. Se combinó suero de cada grupo para el análisis de
anticuerpo anti-Sp128 y anti-Sp130
mediante ELISA. Se expusieron los ratones en la semana 8 mediante la
inyección intraperitoneal de aproximadamente 400 UFC (unidades
formadoras de colonias) de la cepa SJ2 de S. pneumoniae
(serotipo capsular 6B). Se determinó en los experimentos
preliminares, que la dosis de infección media (DL_{50}) de esta
cepa era de aproximadamente 10 UFC. Se monitorizaron los ratones
durante 14 días de supervivencia.
Ambos experimentos mostrados en la figura 1
utilizaron las mismas preparaciones de Sp128 y Sp130
recombinantes.
En el experimento mostrado en la figura 1A, el
suero de 7 semanas recogido de los 10 ratones inmunizados con o bien
Sp128 o bien Sp130 tenían cada uno un título de ELISA final de
1:2.048.000 y 1:1.024.000, respectivamente. No se detectó ningún
anticuerpo anti-Sp128 ni anti-Sp130
en los sueros de los ratones inmunizados de manera simulada. El
noventa por ciento de los ratones inmunizados con proteína o bien
Sp128 o bien Sp130 sobrevivieron a la exposición (406 UFC de
neumococos) durante la duración del estudio (14 días). El cien por
cien de los ratones inmunizados de manera simulada estaban muertos
en el día 7.
En el experimento mostrado en la figura 1B, los
sueros de 7 semanas recogidos de los 10 ratones inmunizados con o
bien Sp128 o bien Sp130 cada uno tenían un título de ELISA final de
1:1.024.000 y 1:512.000, respectivamente. No se detectó ningún
anticuerpo anti-Sp128 ni anti-Sp130
en los sueros de los ratones inmunizados de manera simulada. El
noventa y uno por ciento de los ratones inmunizados con proteína o
bien Sp128 o bien Sp130, respectivamente, sobrevivió a la exposición
(404 UFC de neumococos) durante la duración del estudio (14 días).
El cien por cien de los ratones inmunizados de manera simulada
estaban muertos en el día 5.
Estos datos indican que la inmunización de los
ratones con proteínas recombinantes o bien Sp128 o bien Sp130
provoca una respuesta que puede proteger frente a la infección
sistémica por neumococos y la muerte posterior. Se demuestra la
protección cruzada mediante el hecho de que la proteína recombinante
de neumococo se generaba partiendo de la base de una secuencia de
ADN de serotipo capsular 4, mientras que la exposición era con la
cepa heteróloga SJ2 (serotipo capsular 6B).
Tras la recogida de suero preinmunitario, se
inmunizó un conejo blanco de Nueva Zelanda con 250 \mug de Sp130
(SEQ ID NO: 8) en adyuvante completo de Freund. Se le administraron
al conejo 2 inmunizaciones de refuerzo de 125 \mug de Sp130 en
adyuvante incompleto de Freund en los días 21 y 52, y se sangraron
en los días 31 y 62.
Se inmunizaron de manera pasiva ratones
BALB/cByJ (10 por grupo) mediante 2 inyecciones i.p. de 100 \mul
de suero de conejo. Se administró la primera inyección 24 horas
antes de la exposición con 1.400 UFC de la cepa WU2 de S.
pneumoniae, y se administró la segunda inyección 4 horas tras la
exposición. La figura 2 muestra la supervivencia de los ratones tras
la infección con la cepa WU2 (serotipo capsular 3). En experimentos
preliminares, se determinó que la DL_{50} de esta cepa era de
aproximadamente 100 UFC.
La figura 2 muestra la supervivencia de los
ratones inyectados con 1.400 UFC de la cepa WU2. Tal como se muestra
en la misma, el 70% de los ratones inmunizados con suero inmunitario
de conejo producido frente a la proteína Sp130 sobrevivieron al
periodo de observación de 10 días. De los ratones inmunizados con el
suero control (recogido de un conejo antes de la inmunización), el
100% murió en el día 4.
Estos datos sugieren que la protección frente a
la infección por neumococos que resulta de la inmunización con Sp130
está mediada por anticuerpos, ya que se protegieron los ratones
mediante la transferencia pasiva de suero desde un conejo
hiperinmunizado. Tal como se observó en los experimentos de
exposición activa de ratones descritos previamente, el suero
dirigido contra la proteína recombinante Sp130 clonado a partir de
una cepa de serotipo 4 era protector frente a la exposición con una
cepa heteróloga, WU2 (serotipo capsular 3).
Se obtuvieron las cepas de neumococo utilizadas
en este experimento a partir de la Colección Americana de Cultivos
Tipo (Rockville, MD) e incluyen un aislado de cada uno de los
serotipos en la vacuna antineumocócica multivalente utilizada
actualmente.
Para todos los lisados celulares, se hicieron
crecer neumococos hasta la fase semilogarítmica (la absorbancia a
620 nm era de 0,4 a 0,6) en 2 ml de caldo de
Todd-Hewitt con un extracto de levadura al 5% (de
Difco, Detroit, MI) a 37ºC. Se recogieron las bacterias mediante
centrifugación y se lavaron dos veces con agua. Se resuspendieron
los sedimentos (que consistían en células sedimentadas) en 200
\mul de tampón de lisis (dodecilsulfato de sodio al 0,01%, citrato
de sodio 0,15 M, y desoxicolato de sodio al 0,1%) y se incubaron a
37ºC durante 30 min, después se diluyeron en un volumen igual de 2X
SSC (NaCl 0,3 M, citrato de sodio 0,03 M). Se determinaron los
polipéptidos en los lisados en SDS-PAGE
(electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio),
se transfirieron a membranas de nitrocelulosa
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se sometieron
a estudios con sonda con anticuerpo mediante procedimientos de
inmunotransferencia de tipo western blot convencionales. Se
utilizaron sueros de un conejo blanco de Nueva Zelanda inmunizado
con Sp130 (tal como para el ejemplo 2, anteriormente) con una
dilución de 1:3.000. Se detectó anticuerpo fijado con IgG
anti-conejo de oveja conjugada con peroxidasa
utilizando un kit de quimioluminiscencia de Amersham Inc.
(Cambridge, MA).
Los sueros anti-Sp130 de conejo
revelaron 2 bandas principales con pesos moleculares aparentes de
110 kD y 220 kD en los 23 lisados de neumococos sometidos a prueba
(tal como se muestra en la figura 3).
Estos datos muestran que el Sp130 se expresa y
comparte epítopos antígenos comunes con las cepas de los 23
serotipos capsulares de neumococos representadas en la vacuna de
polisacáridos utilizada actualmente.
Se utilizaron sueros de pacientes con
bacteriemia neumocócica comprobada mediante cultivo, en
inmunotransferencias de tipo western blot que contenían proteína
recombinante Sp128 o Sp130. En el experimento mostrado en la figura
4, se diluyeron sueros de 5 pacientes (indicados mediante los
números 1 a 5) a 1:3.000 y se utilizaron para someter a estudios de
inmunotransferencia con sonda que contenían Sp128 (SEQ ID NO: 6) o
Sp130 (SEQ ID NO: 8).
Se sometieron a estudios con sonda los carriles
etiquetados con "A" (para "agudo") con suero recogido poco
después del diagnóstico de infección por neumococos; los carriles
denominados "C" (para "convaleciente") se sometieron a
estudios con sonda con suero recogido o bien 1 mes más tarde
(pacientes 1, 2 y 3) o bien 8 días tras la primera recogida de suero
(pacientes 4 y 5). Para los pacientes 2, 3 y 5, la reactividad del
suero convaleciente con Sp128 y Sp130 era más fuerte que la del
suero agudo correspondiente.
Otros experimentos (no representados en la
figura) mostraron que los sueros convalecientes de 17 pacientes con
infecciones por neumococos se sometieron a prueba individualmente
para determinar la reactividad con o bien Sp128 o bien Sp130. Así,
se encontró que 10 y 15 de los 23 sueros se fijaban (en una
inmunotransferencia de tipo western blot) a Sp128 y Sp130,
respectivamente.
Estos experimentos indican que Sp128 y Sp130 (el
último en una mayor medida), son reconocidos por el sistema
inmunitario humano y sugieren que pueden producirse anticuerpos que
pueden fijar la proteína Sp128-Sp130 durante la
infección natural por S. pneumoniae en seres humanos. Además,
esto proporciona una evidencia indirecta de que se expresan Sp128 y
Sp130 in vivo por S. pneumoniae durante esta fase de
la infección, y por tanto pueden estar disponibles como dianas para
inmunoprofilaxis, inmunoterapia, o para proporcionar respuestas
inmunitarias anamnésticas en sujetos vacunados con estas proteínas.
Puesto que se infectaron los pacientes con una variedad de cepas de
neumococos, estos datos también apoyan la idea de que Sp130 se
conserva más antigénicamente que Sp128.
<110> Adamou, John
\hskip1cmChoi, Gil
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacunas y proteínas de
Streptococcus pneumoniae
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 469201-475
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<140>
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<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> U.S. 60/138.453
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<151>
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<160> 8
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador directo para la amplificación por PCR de secuencias
genómicas de Sp128
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacccggtag tcttagcaga c
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador inverso para la amplificación por PCR de secuencias
genómicas de Sp128
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagccataa gttgatttgc catta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador directo para la amplificación por PCR de secuencias
genómicas de Sp130
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipaagcttggcg agattgcaga a
\hfill21
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<210> 4
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador inverso para la amplificación por PCR de secuencias
genómicas de Sp130
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttattagga ttgttagtag ttgattt
\hfill27
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<210> 5
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<211> 1992
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
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<211> 664
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<212> PRT
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<213> Streptococcus pneumoniae
\newpage
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<400> 6
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 2319
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<212> ADN
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<213> Streptococcus pneumoniae
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 773
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Streptococcus pneumoniae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
Claims (23)
1. Vacuna que comprende como principio activo un
polipéptido, o fragmentos inmunogénicos de la secuencia de SEQ ID
NO: 8, en la que dicho polipéptido tiene una secuencia de
aminoácidos idéntica en al menos el 65% a la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
2. Vacuna según la reivindicación 1, en la que
dicho principio activo es un polipéptido cuya secuencia de
aminoácidos es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
3. Vacuna según la reivindicación 1, en la que
dicho principio activo es un polipéptido cuya secuencia de
aminoácidos es idéntica en al menos el 95% a la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
4. Vacuna según la reivindicación 1, en la que
dicho principio activo es un polipéptido cuya secuencia de
aminoácidos es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
8.
5. Antisuero producido por inmunización de un
animal con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los
polipéptidos según las reivindicaciones 1, 2, 3, y 4.
6. Anticuerpo aislado que se une específicamente
a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los
polipéptidos según las reivindicaciones 1, 2, 3, y 4.
7. Anticuerpo según la reivindicación 6, en el
que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
8. Célula obtenida por ingeniería genética que
produce un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 7.
9. Antisuero según la reivindicación 5, en el
que dicho polipéptido es el polipéptido según la reivindicación
1.
10. Antisuero según la reivindicación 5, en el
que dicho polipéptido es el polipéptido según la reivindicación
2.
11. Anticuerpo recombinante aislado que se une
específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que
consiste en los polipéptidos según las reivindicaciones 1, 2, 3, y
4.
12. Composición de vacuna que comprende:
- a.
- uno o más polipéptidos de S. pneumoniae seleccionados del grupo que consiste en los polipéptidos según las reivindicaciones 1, 2, 3, y 4; y
- b.
- un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que dicho polipéptido está presente en una cantidad eficaz para obtener anticuerpos en un animal frente a un organismo del género Streptococcus.
13. Uso de un polipéptido seleccionado del grupo
que consiste en los polipéptidos según las reivindicaciones 1, 2, 3,
y 4 para la fabricación de una preparación farmacéutica para
prevenir una infección producida por un miembro del género
Streptococcus en un animal.
14. Uso según la reivindicación 13, en el que
dicho polipéptido es el polipéptido según la reivindicación 4.
15. Uso de un anticuerpo según la reivindicación
6 para la fabricación de una preparación farmacéutica para prevenir
una infección producida por un miembro del género
Streptococcus en un animal.
16. Vacuna que comprende un organismo microbiano
transformado con polinucleótidos, y que expresan de ese modo el
polipéptido de SEQ ID NO: 8 o fragmentos inmunogénicos del mismo
como principio activo de dicha vacuna.
17. Uso de una vacuna según la reivindicación 16
para la fabricación de una preparación farmacéutica para prevenir
una infección producida por un miembro del género
Streptococcus en un animal.
18. Vacuna según la reivindicación 16, en la que
dicho microorganismo transformado se selecciona del grupo que
consiste en salmonela, micobacteria, estreptococo, virus de la
viruela, y adenovirus.
19. Uso de un polipéptido seleccionado del grupo
que consiste en los polipéptidos según las reivindicaciones 1, 2, 3,
y 4 para la fabricación de una preparación farmacéutica para atenuar
una infección producida por un miembro del género
Streptococcus en un animal.
20. Uso de la composición de vacuna según la
reivindicación 12 para la fabricación de una preparación
farmacéutica para atenuar la infección por neumococos.
21. Uso de un anticuerpo según la reivindicación
6 para la fabricación de una preparación farmacéutica para atenuar
una infección producida por un miembro del género
Streptococcus en un animal.
22. Uso de una vacuna según la reivindicación 16
para la fabricación de una preparación farmacéutica para atenuar una
infección producida por un miembro del género Streptococcus
en un animal.
23. Vacuna según la reivindicación 1, en la que
dicho principio activo es uno o más de los fragmentos que tienen
secuencias de aminoácidos 650-773,
640-773, 630-773,
620-773, 610-773,
600-773 de SEQ ID NO: 8.
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