ES2540281T3 - Antígenos de estreptococos del grupo B - Google Patents

Antígenos de estreptococos del grupo B Download PDF

Info

Publication number
ES2540281T3
ES2540281T3 ES10180962.2T ES10180962T ES2540281T3 ES 2540281 T3 ES2540281 T3 ES 2540281T3 ES 10180962 T ES10180962 T ES 10180962T ES 2540281 T3 ES2540281 T3 ES 2540281T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
gbs
seq
amino acid
antibody
mice
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES10180962.2T
Other languages
English (en)
Inventor
Bernard R. Brodeur
Clement Rioux
Martine Boyer
Isabelle Charlebois
Josée Hamel
Denis Martin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ID Biomedical Corp of Quebec
Original Assignee
ID Biomedical Corp of Quebec
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ID Biomedical Corp of Quebec filed Critical ID Biomedical Corp of Quebec
Application granted granted Critical
Publication of ES2540281T3 publication Critical patent/ES2540281T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende un fragmento antigénico de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 39 o en la SEC ID NO: 44, en la que el fragmento antigénico es capaz de inducir producción de un anticuerpo que es específico para estreptococo del grupo B.

Description

DESCRIPCIÓN
Antígenos de estreptococos del grupo B.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a antígenos, más en particular a antígenos proteicos del patógeno bacteriano estreptococo del grupo B (GBS) que son útiles como componentes de vacunas para terapia y/o profilaxis. 5
Antecedentes de la invención
Streptococcus son bacterias gram (+) que se diferencian por antígenos de carbohidratos específicos de grupos A a O encontrados sobre su superficie celular. Los grupos de estreptococos se distinguen adicionalmente por antígenos polisacarídicos capsulares específicos de tipo. Se han identificado varios serotipos para el estreptococo de grupo V (GBS): Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII y VIII. GBS también contiene proteínas antigénicas conocidas como "proteínas C" 10 (alfa, beta, gamma y delta), algunas de ellas se han clonado.
Aunque GBS es un componente común de la flora vaginal y colónica humana normal este patógeno se ha reconocido como una causa principal de sepsis neonatal y meningitis neonatal, meningitis de aparición tardía en infantes, endometritis post-parto así como mastitis en cabañas lecheras. Mujeres embarazadas expuestas a GBS están en riesgo de infección post-parto y pueden transferir la infección al bebé según en niño atraviesa el canal del parto. 15 Aunque el organismo es sensible a los antibióticos, la alta velocidad de ataque y la rápida aparición de sepsis en neonatos y de meningitis en infantes da como resultado alta morbilidad y mortalidad.
Para encontrar una vacuna que proteja individuos de infección por GBS, los investigadores han recurrido a los antígenos específicos de tipo. Desgraciadamente estos polisacáridos han demostrado ser pobremente inmunógenos en seres humanos y están restringidos al serotipo particular a partir del que se origina el polisacárido. Adicionalmente, 20 el polisacárido capsular facilita una respuesta de independiente células T es decir, sin producción de IgG. Consecuentemente los antígenos polisacarídicos capsulares son inadecuados como un componente de vacuna para protección contra infección por GBS.
Otros se han centrado en el antígeno beta de la proteína C que demostró propiedades inmunógenas en modelos de ratones y de conejos. Esta proteína se encontró que es inadecuada como una vacuna humana debido a su propiedad 25 indeseable de interacción con alta afinidad y de una manera no inmunógena con la región Fc de la IgA humana. El antígeno alfa de proteína C es raro en serotipos de tipo III de GBS que es el serotipo responsable de la mayoría de las afecciones mediadas por GBS y es por lo tanto de poco uso como un componente de vacunas.
Michel et al.: "Infection and Immunity" vol. 59, n.º 6, junio de 1996, páginas 2023-2028 describen antígenos de proteínas C de estreptococos del grupo B. 30
Por lo tanto sigue habiendo una necesidad no satisfecha de antígenos de GBS que se pueden usar como componentes de vacunas para la profilaxis y/o terapia de infección por GBS.
Sumario de la invención
De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende un fragmento antigénico de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 39 o en la SEC 35 ID NO: 44, en la que el fragmento antigénico es capaz de inducir producción de un anticuerpo que es específico para estreptococo del grupo B.
En otros aspectos, proporcionan la respectiva vacuna, el respectivo anticuerpo y el respectivo procedimiento de detección.
Breve descripción de los dibujos 40
La figura 1a es la secuencia de ADN de clon 1 (SEC ID NO :1) con secuencias de aminoácidos correspondientes para marcos de lectura abiertos;
la figura 1b es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 2;
la figura 1c es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 3;
la figura 1d es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 4; 45
la figura 1e es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 5;
la figura 1f es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 6;
La figura 2a es la secuencia de ADN de clon 2 (SEC ID NO :7) con secuencias de aminoácidos correspondientes para marcos de lectura abiertos;
la figura 2b es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 8; la figura 2c es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 9; 50
la figura 2d es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 10; la figura 2e es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 11; la figura 2f es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 12;
La figura 3a es la secuencia de ADN de clon 3 (SEC ID NO :13) con secuencias de aminoácidos correspondientes para marcos de lectura abiertos;
la figura 3b es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 14;
la figura 3c es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 15;
la figura 3d es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 16; 5
la figura 3e es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 17;
la figura 3f es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 18;
la figura 3g es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 19;
la figura 3h es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 20;
la figura 3i es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 21; 10
La figura 4a es la secuencia de ADN de clon 4 (SEC ID NO :22) con secuencias de aminoácidos correspondientes para marcos de lectura abiertos;
la figura 4b es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 23;
la figura 4c es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 24;
la figura 4d es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 25; 15
la figura 4e es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 26;
La figura 5a es la secuencia de ADN de clon 5 (SEC ID NO :27) con secuencias de aminoácidos correspondientes para marcos de lectura abiertos;
la figura 5b es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 28;
la figura 5c es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 29; 20
la figura 5d es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 30;
la figura 5e es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 31;
La figura 6a es la secuencia de ADN de clon 6 (SEC ID NO: 32);
la figura 6b es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 33;
la figura 6c es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 34; 25
la figura 6d es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 35;
la figura 6e es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 36;
La figura 7a es la secuencia de ADN de clon 7 (SEC ID NO: 37);
la figura 7b es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 38;
la figura 7c es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 39; 30
la figura 7d es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 40;
la figura 7e es la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 41;
La figura 8 es la secuencia de ADN de una parte de clon 7 que incluye una secuencia señal (SEC ID NO: 42);
La figura 9 es la secuencia de ADN de una parte de clon 7 sin una secuencia señal (SEC ID NO: 43);
la figura 9a es la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 44); 35
La figura 10 representa la distribución de títulos de ELISA en sueros a partir de ratones CD-1 inmunizados con proteína GBS recombinante correspondiente a la SEC ID NO: 39.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a la materia objeto de las reivindicaciones adjuntas.
Como se usa en el presente documento, "fragmentos", "derivados" o "análogos" de los polipéptidos de la invención 40 incluyen aquellos polipéptidos en los que uno o más de los residuos aminoacídicos están sustituidos por un residuo aminoacídico conservado o no conservado (preferentemente conservado) y que puede ser natural o artificial.
Los términos «fragmentos», «derivados» o «análogos» de polipéptidos de la presente invención incluyen también polipéptidos que están modificados por adición, deleción, sustitución de aminoácidos siempre que los polipéptidos retengan la capacidad para inducir una respuesta inmune. 45
Por la expresión «aminoácido conservado» se quiere decir una sustitución de uno o más aminoácidos por otros en los que el determinante antigénico (incluyendo su estructura secundaria y su naturaleza hidropática) de un antígeno dado está conservado completamente o parcialmente a pesar de la sustitución.
Por ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia pueden sustituirse por otro aminoácido de una polaridad similar, que actúa como un equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Los 50 sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia puede seleccionarse a partir de otros miembros de la clase a la que pertenece dicho aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido 55
glutámico.
Preferentemente, derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán aproximadamente identidad del 70 % con esas secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de los mismos. Es decir, el 70 % de los residuos son el mismo. Más preferentemente los polipéptidos tendrán homología mayor del 95 %. En otra forma de realización preferida, derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos de 20 sustituciones, modificaciones o 5 deleciones de residuos de aminoácidos y más preferentemente menos de 10. Las sustituciones preferidas son aquellas conocidas en la técnica como conservadas es decir los residuos sustituidos comparten propiedades físicas o químicas tales como hidrofobicidad, tamaño, carga o grupos funcionales.
Además, en aquellas situaciones donde las regiones de aminoácidos se encuentra que son polimórficas, puede ser deseable variar uno o más aminoácidos en particular para imitar de forma más efectiva los diferentes epítopos de las 10 diferentes cepas de GBS.
También están incluidos polipéptidos que han condensado a ellos otros compuestos que alteran las propiedades biológicas o farmacológicas es decir polietilenglicol (PEG) para incrementar semivida; secuencias líder o secuencias secretoras para facilidad de purificación; prepro-secuencias y pro-secuencias; y (poli)sacáridos.
Además, los polipéptidos de la presente invención pueden modificarse por acilación NH2-terminal (por ejemplo por 15 acetilación, o amidación de ácido tioglicólico, amidación carboxiterminal, por ejemplo con amoniaco o metilamina) para proporcionar estabilidad, hidrofobicidad incrementada para engarzar o unir a un soporte u otra molécula.
También se contemplan multímeros de hetero y homopolipéptidos de los fragmentos, análogos y derivados polipeptídicos. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o más polipéptidos que se han reticulado con agentes de reticulación tales como avidina/biotina, glutaraldehído o dimetil-superimidato. Tales formas poliméricas 20 incluyen también polipéptidos que contienen dos o más secuencias contiguas en tándem o invertidas, producidas a partir de ARN mulsicistrónicos generados por tecnología de ADN recombinante.
Preferentemente, un fragmento, análogo o derivado de un polipéptido de la invención comprenderá al menos una región antigénica es decir al menos un epítopo.
Con el fin de lograr la formación de polímeros antigénicos (es decir multímeros sintéticos), se pueden usar polipéptidos 25 que tienen grupos bishaloacetilo, haluros de nitroarilo, o similares, donde los reactivos estén siendo específicos para grupos tio. Por lo tanto, el engarce entre dos grupos mercapto de los diferentes péptidos puede ser un enlace individual o puede estar compuesto de un grupo de engarce de al menos dos, típicamente al menos cuatro y no más de 16, pero usualmente no más de aproximadamente 14 átomos de carbono.
En una forma de realización particular, los fragmentos, análogos y derivados de polipéptidos de la invención no 30 contienen un residuo iniciador de metionina (Met). Preferentemente, los polipéptidos no incorporarán una secuencia líder o secretora (secuencia señal). La parte de señal de un polipéptido de la invención puede estar determinada de acuerdo con las técnicas de biología molecular establecidas. En general, el polipéptido de interés puede estar aislado a partir de un cultivo de GBS y se puede secuenciar subsiguientemente para determinar el residuo inicial de la proteína madura y por lo tanto la secuencia de la proteína madura. 35
De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan composiciones de vacuna que comprenden uno o más polipéptidos de GBS de la invención en mezcla con un diluyente vehículo o coadyuvante farmacéuticamente aceptable.
Los adyuvantes adecuados incluyen aceites es decir coadyuvante completo o incompleto de Freund; sales es decir AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4)2, Al(OH)3, AlPO4, sílice, caolín; derivado de saponina; polinucleótidos de carbono es decir poli IC y poli AU y también toxina colérica detoxificada (CTB) y toxina lábil al calor de E. coli para inducción de 40 inmunidad mucosal. Los coadyuvantes adecuados incluyen QuilA™, Alhydrogel™ y Adjuphos™. Las vacunas de la invención se pueden administrar parenteralmente por inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea, dermoabsorción, o de forma bucal u oral.
Las composiciones de vacunas de la invención se usan para el tratamiento o profilaxis de infección por estreptococos y/o enfermedades y síntomas mediados por infección con estreptococos, en particular estreptococos del grupo A 45 (pyogenes), estreptotocos del grupo B (GBS o agalactiae), dysgalactiae, uberis, nocardia así como Staphylococcus aureus. Información general sobre Streptococcus está disponible en Manual of Clinical Microbiology por P.R.Murray et al. (1995, 6ª edición, ASM Press, Washington, D.C.). Más en particular estreptococo del grupo B, agalactiae. En una forma de realización en particular se administran vacunas a aquellos individuos en riesgo de infección de GBS tales como mujeres preñadas e infantes por sepsis, meningitis y neumonía así como individuos inmunocomprometidos tales 50 como aquellos con diabetes, enfermedad hepática o cáncer. Las vacunas pueden tener también aplicaciones veterinarias tales como para el tratamiento de mastitis en ganado que está mediada por las bacterias mencionadas anteriormente así como por E. coli.
La vacuna de la presente invención se puede usar también para la elaboración de un medicamento usado para el tratamiento o profilaxis de infección por estreptococos y/o enfermedades y síntomas mediados por infección con 55 estreptococos, en particular estreptococos del grupo A (pyogenes), estreptotocos del grupo B (GBS o agalactiae),
dysgalactiae, uberis, nocardia así como Staphylococcus aureus. Más en particular estreptococo del grupo B, agalactiae.
Las composiciones de vacunas están preferentemente en forma de dosificación unitaria de aproximadamente 0,001 a 100 µg/kg (antígeno/peso corporal) y más preferentemente 0,01 a 10 µg/kg y lo más preferentemente 0,1 a 1 µg/kg 1 a 3 veces con un intervalo de aproximadamente 1 a 12 semanas entre inmunizaciones y más preferentemente 1 a 6 5 semanas.
De acuerdo con un aspecto de referencia, hay proporcionados polinucleótidos que codifican polipéptidos de estreptococo de grupo B (GBS) caracterizados por la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, 10
SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10,
SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15,
SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19,
SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24,
SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 29, 15
SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34,
SEC ID NO: 35, SEC ID NO: 36, SEC ID NO: 38, SEC ID NO: 39,
SEC ID NO: 40, SEC ID NO: 41 y SEC ID NO: 44 o fragmentos, análogos o derivados de las mismas.
Los polinucleótidos preferidos son aquellos ilustrados en figuras 1a (SEC ID NO: 1), 2a (SEC ID NO: 7), 3a (SEC ID NO: 13), 4a (SEC ID NO: 22), 5a (SEC ID NO: 27), 6a (SEC ID NO: 32), 7a (SEC ID NO: 37), 8 (SEC ID NO: 42) y 9 20 (SEC ID NO: 43) que corresponden a los marcos de lectura abiertos.
Los polinucleótidos preferidos son aquellos ilustrados en figuras 1a (SEC ID NO: 1), 2a (SEC ID NO: 7), 3a (SEC ID NO: 13), 4a (SEC ID NO: 22), 5a (SEC ID NO: 27), 6a (SEC ID NO: 32), 7a (SEC ID NO: 37), 8 (SEC ID NO: 42) y 9 (SEC ID NO: 43) y fragmentos, análogos y derivados de las mismas.
Polinucleótidos más preferidos son aquellos ilustrados en las Figuras 7 (SEC ID NO: 37), 8 (SEC ID NO: 42) y 9 (SEC 25 ID NO: 43).
Los polinucleótidos más preferidos son aquellos ilustrados en las Figuras 8 (SEC ID NO: 42) y 9 (SEC ID NO: 43).
Se apreciará que las secuencias polinucleotídicas ilustradas en las figuras pueden estar alteradas con codones degenerados sin embargo todavía codifican los polipéptidos de la invención.
Debido a la degeneración de secuencias codificantes de nucleótidos, otras secuencias de polinucleótidos que 30 codifican para sustancialmente los mismos polipéptidos de la presente invención se pueden usar en la práctica de la presente invención. Estas incluyen pero no se limitan a secuencias nucleotídicas que se alteran por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo residuo aminoacídico dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso.
De acuerdo con ello la presente especificación proporciona adicionalmente polinucleótidos que hibridan con las 35 secuencias polinucleotídicas descritas anteriormente en el presente documento (o con las secuencias complementarias de las mismas) que tienen identidad del 50 % y preferentemente al menos del 70 % entre secuencias. Más preferentemente los polinucleótidos son hibridables en condiciones restrictivas es decir teniendo al menos el 95 % de identidad y lo más preferentemente más del 97 % de identidad.
Por capaz de hibridar en condiciones restrictivas se quiere decir apareamiento de una molécula de ácido nucleico a al 40 menos una segunda región de ácido nucleico (ya sea como ADNc, ARNm, o ADN genómico) o a su hebra complementaria en condiciones convencionales, por ejemplo temperatura elevada y/o contenido en sales bajo, que tienden a desfavorecer la hibridación de secuencias nucleotídicas no complementarias. Un protocolo adecuado se describe en Maniatis T. et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1982), que se incorpora en el presente documento por referencia. 45
En un aspecto adicional, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de la invención, o fragmentos, análogos o derivados de los mismos, se pueden usar en un procedimiento de inmunización de ADN.
Es decir, se pueden incorporar en un vector que es replicable y expresable tras la inyección produciendo de este modo el polipéptido antigénico in vivo. Por ejemplo los polinucleótidos se pueden incorporar en un vector plasmídico sometidos al control del promotor de CMV que es funcional en células eucariotas. Preferentemente el vector se inyecta 50 intramuscularmente.
De acuerdo con otro aspecto, hay proporcionado un procedimiento para producir polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes expresando un polinucleótido que codifica dicho polipéptido en una célula huésped y recuperando el producto polipeptídico expresado. Alternativamente, los polipéptidos se pueden producir de acuerdo
con técnicas químicas de síntesis establecidas, es decir síntesis en fase de solución o en fase sólida de oligopéptidos que se ligan para producir el polipéptido completo (ligamiento en bloque).
Para producción recombinante, las células huésped se transfectan con vectores que codifican el polipéptido y después se cultivan en medios de nutrientes modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes. Los vectores apropiados son aquellos que son viables y replicables en el 5 huésped elegido e incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, por ejemplo plásmidos bacterianos, ADN de fagos, baculovirus, plásmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos. La secuencia polipeptídica se puede incorporar en el vector en el sitio apropiado usando enzimas de restricción de tal forma que esté operativamente unida a una región de control de expresión que comprende un promotor, a sitio de unión a ribosomas (secuencia consenso o secuencia de Shine-Dalgarno) y opcionalmente a un 10 operador (elemento de control). Alguien puede seleccionar componentes individuales de la región de control de la expresión que son apropiados para un huésped y vector dados de acuerdo con principios de biología molecular establecidos (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 incorporado en el presente documento por referencia). Los promotores adecuados incluyen pero no se limitan a promotor LTR o SV40, promotores lac, tac o trp de E. coli y el promotor PL del fago lambda. Los vectores incorporarán 15 preferentemente un origen de replicación así como marcadores de selección es decir gen de resistencia a ampicilina. Vectores bacterianos adecuados incluyen pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pbs, pD10 phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRITS y vectores eucarióticos incluyen pBlueBacIII, pWL- NEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células huésped pueden ser bacterianas es decir E.coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; fúngicas es decir Aspergillus 20 niger, Aspergillus nidulins; de levaduras es decir Saccharomyces o eucariotas es decir CHO, COS.
Tras la expresión del polipéptido en cultivo, las células se recogen típicamente mediante centrifugación después se rompen por medios físicos o químicos (si el polipéptido expresado no se segrega dentro de los medios) y el extracto en bruto resultante se retiene para aislar el polipéptido de interés. La purificación del polipéptido a partir de medios de cultivo o de lisado se puede llevar a cabo por técnicas establecidas dependiendo de las propiedades del polipéptido es 25 decir usando sulfato de amonio o precipitación de etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. La purificación final puede lograrse usando HPLC.
El polipéptido puede expresarse con o sin una secuencia líder o una secuencia de secreción. En el caso anterior la secuencia líder puede retirarse usando procesamiento postraduccional (véanse documentos US 4.431.739; 30 4.425.437; y 4.338.397 incorporados en la presente memoria por referencia) o puede retirarse químicamente de forma subsiguiente para purificar el polipéptido expresado.
De acuerdo con un aspecto adicional, los polipéptidos de GBS de la invención se pueden usar en una prueba diagnóstica para infección de estreptococos en particular infección por GBS. Son posibles varios procedimientos diagnósticos, por ejemplo detectar organismo estreptocócico en una muestra biológica, se puede seguir el siguiente 35 procedimiento:
a) obtener una muestra biológica a partir de un paciente;
b) incubar un anticuerpo o fragmento del mismo reactivo con un polipéptido GBS de la invención con la muestra biológica para formar una mezcla; y
c) detectar anticuerpo específicamente unido o fragmento unido en la mezcla que indica la presencia de 40 estreptococo.
Alternativamente, un procedimiento para la detección de anticuerpo específico para un antígeno de estreptococos en una muestra biológica que contiene o que se sospecha que contiene dicho anticuerpo se puede llevar a cabo como sigue:
a) aislar una muestra biológica a partir de un paciente; 45
b) incubar uno o más polipéptidos de GBS de la invención o fragmentos de los mismos con la muestra biológica para formar una mezcla; y
c) detectar anticuerpo específicamente unido o fragmento unido en la mezcla que indica la presencia de anticuerpo específico para estreptococo.
Un experto en la materia reconocerá que esta prueba diagnóstica puede tomar varias formas, incluyendo un prueba 50 inmunológica tal como un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo o un ensayo de aglutinación en látex, esencialmente para determinar si anticuerpos específicos para la proteína están presentes en un organismo.
Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos de la invención se pueden usar también para diseñar sondas de ADN para su uso en detectar la presencia de estreptococo en una muestra biológica sospechosa de contener tales 55 bacterias. El procedimiento de detección de este aspecto comprende:
a) aislar la muestra biológica a partir de un paciente;
b) incubar una o más sondas de ADN que tienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la
invención o fragmentos del mismo con la muestra biológica para formar una mezcla; y
c) detectar sonda de ADN específicamente unida en la mezcla que indica la presencia de bacterias estreptocócicas.
Las sondas de ADN se pueden usar también para detectar estreptococo circulante es decir ácidos nucleicos de GBS en una muestra, usando por ejemplo una reacción en cadena de la polimerasa, como un procedimiento de diagnostico 5 de infecciones por estreptococos. La sonda se puede sintetizar usando técnicas convencionales y se puede inmovilizar en una fase sólida, o se puede marcar con una etiqueta detectable. Una sonda de ADN preferida para esta aplicación es un oligómero que tiene una secuencia complementaria de al menos aproximadamente 6 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de GBS de la invención.
Otro procedimiento diagnóstico para la detección de estreptococo en un paciente comprende: 10
a) marcar un reactivo de anticuerpo con un polipéptido de la invención o fragmento del mismo con una etiqueta detectable;
b) administrar el anticuerpo marcado o el fragmento marcado al paciente; y
c) detectar anticuerpo marcado específicamente unido o fragmento marcado unido en el paciente que indica la presencia de estreptococo. 15
Un aspecto adicional de la invención es el uso de los polipéptidos de GBS de la invención como inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para el diagnóstico y en particular el tratamiento de la infección por estreptococos. Los anticuerpos adecuados se pueden determinar usando procedimientos de rastreo apropiados, por ejemplo midiendo la capacidad de un anticuerpo en particular para proteger de forma pasiva contra infección de estreptococos en un modelo de prueba. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de ratón descrito en los 20 ejemplos en el presente documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo completo o un fragmento de unión a antígeno y puede pertenecer en general a cualquier clase de inmunoglobulinas. El anticuerpo o fragmento del mismo puede ser de origen animal, específicamente de origen mamífero y más específicamente de origen murino, de rata o humano. Puede ser un anticuerpo natural o un fragmento deI mismo o si se desea, un anticuerpo recombinante o un fragmento de anticuerpo. La expresión anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo recombinante quiere decir 25 anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se produce usando técnicas de biología molecular. El anticuerpo o los fragmentos de anticuerpo pueden ser policlonales o preferentemente monoclonales. Ello puede ser específico para un número de epítopos asociados con los polipéptidos de GBS pero preferentemente ello es específico para uno.
Ejemplo 1 Modelo murino de infección por Streptococcus de Grupo B (GBS) letal
El modelo de ratón de infección por GBS se describe en detalle en Lancefield et al. (J Exp Med 142: 165-179, 1975). 30 Cepa C388/90 de GBS (aislado clínico obtenido en 1990 a partir del fluido cefalorraquídeo de un paciente que sufre de meningitis, Children's Hospital of Eastern Ontario, Ottawa, Canadá) y cepa NCS246 de GBS (National Center for Streptococcus, Provincial Laboratory of Public Health for Northern Alberta, Edmonton, Canadá) se serotiparon respectivamente como tipo Ia/c y tipo II/R.
Para incrementar su virulencia, las cepas de GBS C388/90 (serotipo Ia/c) y NCS 246 (serotipo II/R) se hicieron pasar 35 de forma seriada por ratones como se describe anteriormente (Lancefield et al. J Exp Med 142: 165-179, 1975). Brevemente, el incremento de virulencia se sometió a seguimiento usando inoculaciones intraperitoneales de diluciones seriadas de un subcultivo en caldo Todd-Hewitt obtenido bien a partir de sangre o bien a partir de bazo de ratones infectados. Después del último paso, las muestras de sangre infectadas se usaron para inocular caldo Todd-Hewitt. Después de una incubación de 2 horas a 37 ºC con CO2 al 7 %, se añadió al cultivo glicerol a una 40 concentración final del 10 % (v/v). El cultivo después se alicuotó y se almacenó a -80 ºC para su uso en experimentos de exposición a GBS. Se determinó el número de unidades formadoras de colonia de GBS presentes en estas muestras congeladas. La concentración bacteriana necesaria para matar al 100 % (DL100) de los ratones de 18 semanas de edad se determinó que era 3,5 x 105 y 1,1 x 105 respectivamente para cepa C388/90 de GBS y para cepa NCS246 de GBS, que corresponden a un incremento significativo en virulencia para ambas cepas. De hecho, la DL100 45 registrada antes de los pasos para estas dos cepas fue más alta que 109 ufc.
En una exposición a bacterias, una alícuota recién descongelada de una cepa de GBS virulenta se ajustó a la concentración bacteriana apropiada usando caldo Todd-Hewitt y se inyectó 1 ml intraperitonealmente a cada ratón CD-1 hembra. Los ratones usados para los experimentos de protección pasiva fueron de 6 a 8 semanas de edad, mientras que los usados para experimentos de protección activa fueron aproximadamente de 18 semanas de edad en 50 el momento de la exposición. Todos los inóculos se verificaron por recuento de colonias. Se observaron los animales para cualquier signo de infección cuatro veces diariamente durante las primeras 48 horas después de la exposición y después diariamente durante los siguientes 12 días. Al final de es periodo, se obtuvieron muestras de sangre de los supervivientes y se congelaron a -20 ºC. El bazo obtenido de cada ratón que sobrevivió a la prueba se cultivó con el fin de identificar cualquier GBS remanente. 55
Ejemplo 2 Inmunización y protección en ratones con células de GBS completas muertas por formaldehído
Se prepararon células completas muertas por formaldehído de acuerdo con procedimientos descritos en Lancefield et al. (J Exp Med 142:165-179,1575). Brevemente, un cultivo durante toda la noche de placas de agar de sangre de oveja
(Quelab Laboratories, Montreal, Canadá) de una cepa de GBS se lavó dos veces en tampón de PBS (medio salino tamponado con fosfato, pH 7,2), ajustado a aproximadamente 3 x 109 ufc/ml y se incubó durante toda una noche en PBS conteniendo formaldehído al 0,3 % (v/v). La suspensión de GBS muertos se lavó con PBS y se mantuvo congelada a -80 ºC.
Los ratones CD-1 hembras, de 6 a 8 semanas de edad (Charles River, St-Constant, Quebec, Canadá), se inyectaron 5 subcutáneamente tres veces a intervalos de dos semanas con 0,1 ml de células muertas por formaldehído de la capa de GBS C388/90 (~ 6 x 107 GBS), o 0,1 ml de PBS para el grupo control. En el día antes de la inmunización, Alhydrogel™ (Superfos Binsector, Frederikssund, Dinamarca) a una concentración final de 0,14 mg o 0,21 mg de A1, se añadió a estas preparaciones y se incubó durante toda una noche a 4 ºC con agitación. Las muestras de suero se obtuvieron a partir de cada ratón antes del comienzo del protocolo de inmunización y dos semanas después de la 10 última inyección. Los sueros se congelaron a -20 ºC.
Ocho ratones en cada grupo control inyectado con PBS y el grupo inmunizado con células completas de GBS muertas por formaldehído de cepa C388/90 (Ia/c) se expusieron a 1,5 x 104 ufc de cepa C388/90 (Ia/c) de GBS una semana después de la tercera inyección. Todos los ratones inmunizados con células completas de GBS muertas por formaldehído sobrevivieron a la exposición homóloga mientras que, en el plazo de 5 días después de la exposición, 15 solo 4 de 8 ratones inyectados con PBS sobrevivieron a partir de la infección. Con el fin de incrementar la tasa de mortalidad en los grupos control, la suspensión bacteriana hubo de ajustarse de acuerdo con la edad de los ratones al tiempo de la exposición bacteriana. En experimentos de exposición subsiguientes, cuando los ratones fueron mayores de 15 semanas, el inóculo bacteriano se incrementó a concentraciones entre 3,0 x 105 y 2,5 x 106 ufc.
Tabla 1 Inmunización de ratones CD1 con células completas muertas por formaldehído de GBS y subsiguientes 20 exposición homóloga [cepa C388/90 (Ia/c)] y exposición heteróloga [cepa NCS246 (II/R)].
Preparaciones antigénicas usadas por inmunización1
número de ratones vivos 14 días después de la exposición bacteriana (% de supervivencia)
Exposición homóloga: cepa C388/90 (la/c)
Exposición heteróloga: cepa NCS246 (II/R)
1ª infección
células muertas por formaldehído de cepa C388/90 (Ia/c)2 GBS
8/8 (100)3 n.h.5
PBS control
4/8 (50) n.h.
2ª infección
células muertas por formaldehído de cepa C388/90 (Ia/c)2 GBS
6/6 (100)4 0/6 (0)6
PBS control
2/6 (33) 0/6 (0)
1 alhidrogel™ a un concentración final de 0,14 mg o 0,21 mg de Al se usó; 2 aproximadamente 6 x 107 ufc; 3 exposición intraperitoneal con 1 ml de medio de cultivo Todd-Hewitt conteniendo suspensión de C388/90 (Ia/c) de GBS ajustada a 1,5 x 104 ufc; 4 exposición intraperitoneal con 1 ml de medio de cultivo Todd-Hewitt conteniendo suspensión de C388/90 (Ia/c) de GBS ajustada a 2,1 x 106 ufc; 5 no hecho; 6 exposición intraperitoneal con 1 ml de medio de cultivo Todd-Hewitt conteniendo suspensión de NCS246 (II/R) de GBS ajustada a 1,2 x 105 ufc.
En otro experimento, un grupo de 12 ratones que corresponden a un grupo control se inyectó con PBS, mientras que un segundo grupo de 12 ratones se inmunizó con células completas muertas por formaldehído de cepa C386/90 (Ia/c) de GBS. Seis ratones de cada uno de estos dos grupos se expusieron a 2,1 x 106 ufc de la cepa C388/90 (Ia/c) de GBS (Tabla I). En el primer experimento de exposición, todos los ratones inmunizados con la cepa C388/90 (Ia/c) de GBS 25 sobrevivieron a la exposición homóloga. Solo dos de los 6 ratones inyectados con PBS sobrevivieron a la infección.
Los 6 ratones que quedan en ambos grupos se usaron después una semana más tarde para verificar si esta preparación antigénica podría conferir protección cruzada contra la cepa NCS246 (II/R) que produce una cápsula distinta serológicamente. Ninguno de los ratones infectados con esta segunda cepa de GBS sobrevivió a la infección. El último resultado sugirió que la mayoría de la respuesta inmune protectora inducida por la cepa C388/90 muerta por 30
formaldehído está dirigida contra el polisacárido capsular y que podría restringirse a cepas de ese serotipo particular. Estas imágenes indicaron claramente que este modelo particular de infección puede usarse eficientemente para estudiar la protección conferida por la vacunación.
Ejemplo 3 Inmunización de conejo con células de GBS completas muertas por formaldehído y protección pasiva en ratones 5
Un conejo Nueva Zelanda (2,5 kg, Charles River, St-Constant, Quebec, Canadá) se inmunizó con células muertas por formaldehído de cepa C388/90 (Ia/c) de GBS para obtener suero hiperinmune. Este conejo se inyectó subcutáneamente tres veces a intervalos de tres semanas con aproximadamente 1,5 x 109 ufc de células completas muertas por formaldehído de cepa C388/90 (Ia/c) de GBS. El coadyuvante completo de Freund (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, Nueva York) se usó como el coadyuvante para la primera inmunización, mientras que el 10 coadyuvante incompleto de Freund (Gibco BRL) se usó para las siguientes dos inyecciones. Las muestras de suero se obtuvieron antes del comienzo del protocolo de inmunización y dos semanas después de la última inyección. Los sueros se congelaron a -20 ºC.
La capacidad de este suero hiperinmune de conejo particular para proteger pasivamente a ratones contra una infección letal con GBS se evaluó también. La inyección intraperitoneal de ratones bien con 15 o bien con 25 ml de 15 suero de conejo hiperinmune 18 horas antes de la exposición protegió 4 de 5 ratones (80 %) contra la infección. Comparativamente, las tasas de supervivencia más bajas del 20 % se registraron para ratones en el grupo control inyectados con PBS o suero obtenido a partir de un conejo inmunizado con preparación de membrana exterior meningocócica. Este resultado indica claramente que la inmunización de otras especies animales con células de GBS muertas puede inducir la producción de anticuerpos que pueden proteger ratones pasivamente. Este reactivo se usará 20 también para caracterizar clones.
Tabla 2 Protección pasiva de ratones CD-1 conferida por suero de conejo obtenido después de inmunización con preparación antigénica de estreptococos enteros de grupo B muertos por formaldehído (cepa C388/90 (Ia/c)).
grupos
número de ratones vivos 14 días después de la exposición bacteriana con cepa C388/90 de GBS (Ia/c) % de supervivencia
suero hiperinmune de conejo2
- 25 μl
4/5 80
suero hiperinmune de conejo2
- 15 μl
4/5 80
suero hiperinmune de conejo2
- 25 μl
1/5 20
PBS control
1/10 10
1 Se usó coadyuvante completo de Freund para primera inmunización y coadyuvante incompleto de Freund para las siguientes dos inyecciones; 2 exposición intraperitoneal con medio de cultivo Todd-Hewitt conteniendo suspensión de GBS C388/90 (Ia/c) ajustada a 2 x 104 ufc.
Ejemplo 4 Producción recombinante de proteína de fusión de CBS de etiqueta de His
La región codificante de un gen de GBS se amplificó por PCR (sistema DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR 2400 25 Perkin Elmer, San José, CA) a partir del ADN genómico de cepa de GBS C386/90 (Ia/c) usando los oligos que contenían extensiones de base para la adición de los sitios de restricción BglII (AGATCT) y HindIII (AAGCTT), respectivamente. El producto de PCR se purificó a partir de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel de Qiaex 11 a partir de Qiagen (Chatsworth, CA), se digirió con las enzimas de restricción BglII y HindIII (Pharmacia Canada Inc Baie d'Urfe, Canadá) y se extrajo con fenol:cloroformo antes de precipitación de etanol. El vector pET-32b(+) 30 (Novagen, Madison, WI) conteniendo la secuencia de tiorredoxina-etiqueta de His se digirió con las enzimas de restricción BglII y HindIII, se extrajo con fenol:cloroformo y después se precipitó por etanol. El fragmento de ADN genómico Bgl I I-HindIII estaba ligado al vector Bgl I I-HindIII pET-32b(+) para crear la secuencia codificante para proteína de fusión de GBS de tiorredoxina-etiqueta de His cuyo gen estaba sometido al control del promotor T7. Los productos ligados se transformaron en cepa XLI Blue MRF'(A(mcrA)183A (mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 35 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F'proAB lacIqZAM15Tn10 (Tetr)]c) de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed.), páginas 109-135). El plásmido pET
recombinante se purificó usando un kit de Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA) y la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN se verificó por secuenciación del ADN (kit Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA). El plásmido pET recombinante se transformó por electroporación (aparato Gene Pulser II, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canadá) en cepa AD494 (DE3) (Aara~ leu7697 AlacX74 AphoA PvuII phoR AmalF3 F' [lac+(lacIq) pro] trxB::Kan (DE3)) de E. coli (Novagen, Madison, WI). En esta cepa de E. coli, la expresión de control del promotor T7 de 5 la proteína de fusión, está reconocida específicamente por la polimerasa de ARN T7 (presente en el profago XDE3) cuyo gen está sometido al control del promotor lac que es inducible por isopropil-ß-D-tio-galactopiranósido (IPTG).
El AD494(DE3)/rpET transformante se hizo crecer a 37 ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB (10g/l de peptona, 5 g/l de extracto de levaduras, 10g/l de NaCl) conteniendo 100 mg de ampicilina (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canadá) por ml hasta que el A600 alcanzó un valor de 0,6. Con el fin de inducir la producción de la proteína de fusión 10 de GBS con tiorredoxina-etiqueta de His, las células se incubaron durante 2 horas adicionales en la presencia de IPTG a una concentración final de 1 mM. Se cosecharon las células bacterianas por centrifugación.
La proteína de fusión recombinante producida por AD494(DE3)/rpET32 tras inducción de IPTG durante 2 horas se obtuvo parcialmente como cuerpos de inclusión insolubles que estaban purificados a partir de proteínas de E. coli endógenas por el aislamiento de agregados insolubles (Gerlach, G.F. et al 1992, Infect. Immun. 60: 832). Células 15 inducidas a partir de un cultivo de 500 ml se resuspendieron en 20 ml de sacarosa al 25 %-tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y se congelaron a -70 ºC. La lisis de células en suspensión se logró por la adición de 5 ml de una solución de lisozima (10 mg/ml) en tampón de Tris-HCl 250 mM (pH 8,0) seguida por una incubación de 10 a 15 minutos en hielo y la adición de 150 ml de mezcla detergente (5 partes de tampón Tris-HCl 20 mM [NaCl 300 mM pH 7,41-ácido desoxicólico al 2 %-Nonidet P-40 y 4 partes de tampón Tris-HCl 100 mM [pH8] 100 mM-EDTA 50 mM-Tritón-X-100) 20 seguido por 5 minutos de incubación sobre hielo. Tras la sonicación, los agregados de proteínas se recogieron por centrifugación durante 30 minutos a 35.000 x g y se guardó una muestra de fracción celular soluble. Las proteínas agregadas se solubilizaron en clorhidrato de guanidina 6 M. La presencia de la proteína de fusión tanto en las fracciones solubles como en como en las fracciones insolubles se mostró por análisis de bandas de Western usando el suero de un ratón inyectado con células muertas por formaldehído de cepa c388/90 (Ia/c) de GBS que sobrevivió a 25 exposición bacteriana con la cepa de GBS correspondiente.
La purificación de la proteína de fusión de la fracción soluble de AD494(DE3)/rpET inducida por IPTG se hizo por cromatografía de afinidad en base a las propiedades de la secuencia de etiqueta de His (6 residuos de histidina consecutivos) para unión a cationes divalentes (Ni2+) inmovilizada en la resina de quelación de metales de unión a His (Novagen, Madison, WI). El procedimiento de purificación usado son los descritos en el pET system Manual, 6ª edición 30 (Novagen, Madison, WI). Brevemente, las células centrifugadas obtenidas a partir de un cultivo de 100 ml inducido con IPTG se resuspendieron en 4 ml de tampón de unión (imidazol 5 mM-NaCl 500 mM-Tris-HCl 20 mM pH 7,9), se sonicaron y se centrifugaron a 39.000 x g durante 20 minutos para eliminar restos. El sobrenadante se filtró (membrana de tamaño de poro de 0,45 mm) y se depositó sobre una columna de resina de unión a His equilibrada en tampón de unión. La columna se lavó después con 10 volúmenes de columna de tampón de unión seguidos por 6 volúmenes de 35 columna de tampón de lavado (imidazol 20 mM-NaCl 500 mM-Tris-HCl 20 mM pH 7,9). La proteína de fusión de GBS tiorredoxina-etiqueta de His se eluyó con tampón de elución (imidazol 1 M-NaCl 500 mM-Tris-HCl 20 mM pH 7,9). La eliminación de la sal y el imidazol a partir de la muestra se hizo por diálisis contra 3 x 1 litro de PBS a 4 ºC.
Las cantidades de proteínas de fusión obtenidas bien a partir de las fracciones citoplásmicas solubles o bien a partir de las fracciones citoplásmicas insolubles de E. coli se estimaron por tinción de Coomassie de un gel de dodecil sulfato de 40 sodio (SDS)-poliacrilamida con diluciones seriadas de estas proteínas y un estándar de seroalbúmina bovina (Pierce Chemical Co. Rockford, Ill.).
Ejemplo 5 Producción recombinante de proteína de GBS sometida al control del promotor PL lambda
La región codificante de ADN de una proteína de GBS se insertó corriente abajo del promotor λPL dentro del vector de traducción pURV22. Este plásmido se derivó de p629 (George et al., 1987, Bio/Technology 5: 600) a partir del que se 45 retiró la región codificante para una porción de la glucoproteína (gD-1) del virus herpes simplex de tipo I (HSV-I) y el gen de resistencia a amplicilina se reemplazó por una casete de kanamicina obtenida a partir del vector plasmídico pUC4K (Pharmacia Biotech Canada Inc., Baie D'Urfe, Canadá). El vector contenía una casete del gen represor de cI857 sensible a temperatura del bacteriófago λ del que se había borrado el promotor PR funcional. La inactivación del represor de cI857 por incremento de temperatura a partir de los intervalos de 30-37 ºC hasta 37-42 ºC dio como 50 resultado la inducción del gen sometido al control de λ PL. La traducción del gen estaba controlada por el sitio de unión a ribosoma cro seguido corriente abajo por un sitio de restricción de BglII (AGATCT) y el ATG: ACTAAGGAGGTTAGATCTATG.
Las enzimas de restricción y la ligasa de ADN T4 se usaron de acuerdo con los suministradores (Pharmacia Biotech Canada Inc., Baie D'Urfe, Canadá; y New England Biolabs Ltd., Mississauga, Canadá). La electroforesis en gel de 55 agarosa de los fragmentos de ADN se llevó a cabo como de describe por Sambrook et al. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y). El ADN cromosómico de la bacteria GBS se preparó de acuerdo con procedimientos descritos en Jayarao et al. (J. Clin. Microbiol., 1991, 29: 2774). Las reacciones de amplificación de ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se hibridaron usando sistema DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR 2400 (Perkin Elmer, San José, CA). Los plásmidos usados para secuenciación de ADN se 60
purificaron usando kits de plásmidos de Qiagen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN se purificaron a partir de geles de agarosa usando kits de extracción de gel Qiaex II de Qiagen (Chatsworth, CA). Las transformaciones de plásmidos se llevaron a cabo por el procedimiento descrito por Hanahan (DNA Cloning, Glover (ed.) páginas 109-135, 1985). La secuenciación de los insertos de ADN genómico en plásmidos se hizo usando oligonucleótidos sintéticos que se sintetizaron por sintetizador de oligonucleótidos modelo 394 (la Corp. Perkin-Elmer., Applied Biosystems Div. 5 (ABI), Foster City, CA). Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo por PCR usando el kit Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing (ABI, Foster City, CA) y se llevó a cabo electroforesis de ADN en secuenciador de ADN automatizado 373A (ABI, Foster City, CA). El ensamblaje de la secuencia de ADN se llevó a cabo usando el programa Sequencer 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). El análisis de las secuencias de ADN y sus polipéptidos predichos se llevó a cabo con el programa Gene Works versión 2.45 (Intelligenetics, Inc., Mountain View CA). 10
La región codificante del gen GBS se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de cepa C388/90 (Ia/c) de GBS usando oligos que contenían extensiones de base para la adición de sitios de restricción BglII (AGATCT) y XbaI (TCTAGA), respectivamente. El producto de PCR se purificó a partir de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel Qiaex II de Qiagen (Chatsworth, CA), digerido con las enzimas de restricción BglII y XbaI y extraído con fenol:cloroformo antes de precipitación de etanol. El vector de pURV22 se digirió con las enzimas de restricción BglII y 15 XbaI, se extrajo con fenol:cloroformo y se precipitó con etanol. El fragmento de ADN genómico BglII-XbaI estaba ligado al vector BglII-XbaI pURV22 en el que el gen GBS estaba sometido al control del promotor λPL. Los productos ligados se transforman en cepa XLI Blue MRF' (Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endAl supE44 thi-1 recAl gyrA96 relA1 lac [F' proAB lac1qZΔM15 Tn10 (Tetr)]c) de E. coli (Stratagene, La Jolla CA) de acuerdo con los procedimientos descritos en Hanahan, supra. Los transformantes que albergan plásmidos con el inserto se identificaron por análisis de 20 células lisadas sometidas a electroforesis en gel de agarosa (Sambrook et al., supra). El plásmido pURV22 recombinante se purificó usando un kit de Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA) y la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN se verificó por secuenciación de ADN.
El transformante XLI Blue MRF'/rpURV22 se cultivó a 34 ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB conteniendo 50 mg de kanamicina por ml hasta que la A600 alcanzó un valor de 0,6. Con el fin de inducir la producción de la proteína de fusión, 25 las células se incubaron durante 4 horas adicionales a 39 ºC. Las células bacterianas se cultivaron por centrifugación, se resuspendieron en tampón de muestras, se hirvieron durante 10 minutos y se guardaron a -20 ºC.
Ejemplo 6 Subclonar gen de proteína de GBS en plásmido de CMV pCMV-GH
La región codificante de ADN de una proteína de GBS se insertó en fase cadena abajo del gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) que estaba sometido al control transcripcional del promotor de citomegalovirus (CMV) en el 30 vector plasmídico pCMV-GH (Tang et al., Nature, 1992, 356:152). El promotor CMV no es funcional en células de E. coli pero es activo tras la administración del plásmido en células eucariotas. El vector incorporaba también el gen de resistencia a ampicilina.
La región codificante del gen se amplificó por PCR a partir de ADN genómico de cepa C388/90 (Ia/c) de GBS usando los oligos que contenían extensiones de base para la adición de sitios de restricción BglII (AGATCT) y HindIII 35 (AAGCTT). El producto de PCR se purificó a partir de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel Qiaex II de Qiagen (Chatsworth, CA), se digirió con las enzimas de restricción BglII y HindIII y se extrajo con fenol:cloroformo antes de precipitación por etanol. El vector pCMV-GH (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Tejas) conteniendo la hormona de crecimiento humano para crear proteínas de fusión se digirió con las enzimas de restricción BamHI y HindIII, se extrajo con fenol:cloroformo y se 40 precipitó por etanol. El fragmento de ADN genómico BglII-HindIII de 1,3 kb estaba ligado al vector BamHI-HindIII pCMV-GH para crear la proteína de fusión hGH-GBS sometida al control del promotor de CMV. Los productos ligados se transformaron en cepa DH5α[Φ80 lacZ ΔM15 endA1 recAl hsdR17 (rK-thK+) supE44 thi-1λ" gyrA96 relA1 Δ(lacZYA-argF)U169] de E. coli (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con los procedimientos descritos por Hanahan, supra. Los transformantes que albergan plásmidos con el inserto se identificaron por análisis de células 45 lisadas sometidas a electroforesis en gel de agarosa (Sambrook, J. et al., supra). El plásmido pCMV recombinante se purificó usando un kit de Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA) y la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN se verificó por secuenciación de ADN.
Ejemplo 7 Actividad inmunológica de proteína de GBS frente a exposición a GBS
Se inyectaron cuatro grupos de 12 ratones CD-1 hembra (Charles River, St-Constant, Quebec, Canadá) de 6 a 8 50 semanas subcutáneamente tres veces a intervalos de tres semanas con 0,1 ml de las siguientes preparaciones antigénicas: células muertas por formaldehído de cepa C388/90 de GBS C388/90 (-6 X 107 ufc), 20 µg de proteína de fusión de GBS de tiorredoxina-etiqueta de His obtenida a partir de la parte insoluble (cuerpos de inclusión) o 20 µg de la proteína de fusión, purificada por afinidad (columna de níquel), a partir de la fracción citoplásmica soluble en E. coli, o 20 µg de polipéptido de control de tiorredoxina-etiqueta de His purificado por afinidad (columna de níquel). 20 mg de 55 QuilA™ (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá) se añadieron a cada preparación antigénica como el coadyuvante. Las muestras se suero se obtuvieron a partir de cada ratón antes de la inmunización (PE) y/o en los días 20 (TB1), 41 (TB2) y 54 (TB3) durante los protocolos de inmunización. Los sueros se congelaron a -20 ºC.
Se registró un incremento de los títulos de ELISA después de cada inyección de proteína de fusión indicando una
buena respuesta primaria y un refuerzo de la respuesta inmune humoral específica después de cada una de las administraciones segunda y tercera. Al final del periodo de inmunización, las medias de títulos de ELISA recíprocos fueron 456.145 para el grupo inmunizado con 20 µg de proteínas de fusión obtenidas a partir de cuerpos de inclusión comparada con 290.133 para el grupo de ratones inmunizados con la proteína de la fracción soluble en E. coli. El último resultado sugiere que la proteína obtenida a partir de cuerpos de inclusión podría ser más inmunógena que la 5 proteína soluble. En análisis de sueros de ratones en ELISA el uso de la tiorredoxina-etiqueta de His purificada por afinidad para revestir placas mostró que se han hecho títulos de anticuerpos insignificantes contra la parte de tiorredoxina-etiqueta de His de la proteína de fusión. La reactividad de sueros de ratones inyectados con la proteína de fusión recombinante se puso a prueba también por ELISA contra células completas muertas por formaldehído de la cepa C388/90 de GBS. Los anticuerpos inducidos por inmunización con proteína de fusión recombinante reconocieron 10 también sus epítopos específicos en células de GBS indicando que su conformación está suficientemente cerca de la proteína estreptocócica para inducir anticuerpos de reactividad cruzada.
Para verificar si la respuesta inmune inducida por inmunización podría proteger contra infección por GBS, los ratones se pusieron a prueba con 3,5 x 105 ufc de cepas C33/90(Ia/c) y 1,2 x 105 ufc de cepa NCS226 (IIR) de GBS los resultados de lo cual se ilustran en las tablas 3 y 4 respectivamente. Los ratones inmunizados con péptido de 15 tiorredoxina-etiqueta de His de control no estaban protegidos contra exposición con cualquier cepa de GBS mientras que aquellos inmunizados con células completas de C38/90 muertas por formaldehído solo proporcionaron protección contra exposición homóloga. La proteína de fusión de GBS de tiorredoxina-etiqueta de His de la invención protegió a ratones de exposición con ambas cepas de GBS. Cultivo de sangre y bazo de estos ratones no reveló la presencia de cualquier GBS. 20
Tabla 3. Supervivencia a partir de exposición 1 a cepa C388/90 (Ia/c) de CBS1
agente inmunizante
n.º de ratones que sobreviven a la exposición % de supervivencia
tiorredoxina-etiqueta de His2
1/6 17
células C38890 muertas por formaldehído3
6/6 100
fusión de GBS de tiorredoxina-etiqueta de His (preparación de cuerpos de inclusión)4
6/6 100
fusión de GBS de tiorredoxina-etiqueta de His (fracción citoplásmica)4
6/6 100
1 administración intraperitoneal con 1 ml de medio de cultivo de Todd-Hewitt ajustado a 3,5 x 105 ufc; 2 20 µg administrados; patas posteriores paralizadas en el ratón superviviente; GBS detectados en sangre y bazo; 3 6 x 107 ufc administradas; 4 20 µg administrados.
Tabla 4. Supervivencia a partir de exposición1 a cepa NCS246 (II/R) de GBS
agente inmunizante
n.º de ratones que sobreviven a la exposición % de supervivencia
tiorredoxina-etiqueta de His2
0/6 0
células C38890 muertas por formaldehído3
2/6 34
fusión de GBS de tiorredoxina-etiqueta de His (preparación de cuerpos de inclusión)2
5/54 100
fusión de GBS de tiorredoxina-etiqueta de His (fracción citoplásmica)2
6/6 100
(continuación)
1 administración intraperitoneal con 1 ml de medio de cultivo de Todd-Hewitt que contiene suspensión de GBS NCS246(IIR) ajustado a 1,2 x 105 ufc. 2 20 µg administrados; 3 6 x 107 ufc administradas; 4 un ratón murió durante la inmunización.
Ejemplo 8 Inmunización con proteína de GBS recombinante confiere protección contra infección por GBS experimental
Este ejemplo ilustra la protección de ratones contra infección por GBS letal por inmunización con la proteína 5 recombinante correspondiente a la SEC ID NO: 39.
Grupos de 10 ratones CD-1 hembra (Charles River) se inmunizaron subcutáneamente tres veces a intervalos de tres semanas con 20 pg de proteína recombinante purificada a partir de la cepa BLR de E. coli (Novagen) albergando el vector plasmídico recombinante pURV22 que contiene el gen de GBS que corresponde a la SEC ID NO: 42 en presencia de 20 µg de coadyuvante QuilA™ (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá) o, como control, con 10 coadyuvante de QuilA™ solo en PBS. Las muestras de sangre se recogieron a partir del seno orbital en el día 1, 22 y 43 antes de cada inmunización y catorce días (día 57) tras la tercera inyección. Una semana más tarde los ratones expusieron a aproximadamente 104 a 106 ufc de diversas cepas de GBS virulentas. Muestras del inóculo de prueba de GBS se plaquearon en placas de agar de TSA/sangre de oveja al 5 % para determinar las ufc y para verificar la dosis de exposición. Las muertes se registraron durante un periodo de 14 días y en el día 14 tras la exposición, los ratones 15 supervivientes se sacrificaron y se pusieron a prueba la sangre y el bazo para la presencia de organismos de GBS. Los datos de supervivencia se muestran en la tabla 5.
Los sueros pre-exposición se analizaron para la presencia de anticuerpos reactivos con GBS por inmunoensayos estándar. Los análisis de ELISA e inmunotransferencia indicaron que la inmunización con proteínas GBS recombinantes producida en E. coli produjo como respuesta anticuerpos reactivos tanto con proteína GBS 20 recombinante como con proteína GBS nativa. Las respuestas de anticuerpos a GBS se describen en el Ejemplo 9.
Tabla 5. Capacidad de proteína GBS recombinante correspondiente a SEC ID NO: 39 para producir como respuesta protección contra 8 cepas de exposición de GBS diversas
Cepa de exposición
Inmunógeno
Designación Tipo N.º de vivos: N.º de muertos1
Proteína de rGBS Ninguna
C388/90 Ia/c 8:2 0:10 (P < 0,001)
Proteína de rGBS Ninguna
NCS 246 II/R 10:0 3:7 (P = 0,0012)
Proteína de rGBS Ninguna
ATCC12401 Ib 10:0 5:5 (P = 0,001)
Proteína de rGBS Ninguna
NCS 535 V 10:0 0:10 (P = 0,01)
Proteína de rGBS Ninguna
NCS 9842 IV 7:3 1:9 4:6 (P < 0,00001)
Proteína de Rgbs NCS 915-F3 Ninguna
NCS 915 III 7:3 4:6 1:9 (P = 0,0007)2
(continuación)
Cepa de exposición
Inmunógeno
Designación Tipo N.º de vivos: N.º de muertos1
Proteína de rGBS NCS 954-F Ninguna
NCS 954 III/R 7:3 1:9 0:10 (P = 0,002)
Proteína de rGBS COH1-F Ninguna
COH1 III 4:6 3:7 0:10 (P = 0,0004)
1 Se usaron grupos de 10 ratones por grupo, se indica el número de ratones que sobrevivieron y el número de ratones muertos. Se compararon las curvas de supervivencia que corresponden a animales inmunizados con proteínas de GBS recombinantes con las curvas de supervivencia que corresponden a animales inmunizados en falso usando la prueba de rango logarítmico para análisis no paramétricos. 2 Análisis de comparación a NCS915-F-animales inmunizados 3 Los animales se inmunizaron con GBS muertas con formaldehido en presencia de QuiIA™.
Todos los hemocultivos de los ratones supervivientes fueron negativos en el día 14 después de la inmunización. Los cultivos de bazo de ratones supervivientes fueron negativos salvo para unos pocos ratones del experimento MB-11.
Ejemplo 9 Vacunación con la proteína GBS recombinante facilita una respuesta inmune a GBS 5
Grupos de 10 ratones CD-1 hembra se inmunizaron subcutáneamente con proteína GBS recombinante correspondiente a SEC ID NO: 39 como se describe en el Ejemplo 8. Con el fin de valorar la respuesta del anticuerpo a proteína GBS nativa, los sueros de muestras de sangre recogidos antes de cada inmunización y catorce días después de la tercera inmunización se pusieron a prueba por reactivo de anticuerpo con células GBS por ELISA usando placas revestidas con células de GBS muertas por formaldehído de cepa 954 de tipo III, cepa ATCC12401 de 10 tipo Ib, cepa NCS 535 de tipo V o cepa NCS 9842 de tipo VI. La especificidad de los anticuerpos incrementados por la proteína de GBS se confirmó por análisis de bandas de Western para extractos de células de GBS y antígenos recombinantes purificados. Los resultados mostrados en la Figura 10 demuestran claramente que los animales responden fuertemente a proteína GBS recombinante usada como inmunógenos con títulos de anticuerpos recíprocos medios que varían entre 12000 y 128000, para sueros recogidos después de la tercera inmunización, dependiendo del 15 antígeno de revestimiento. Todos los sueros preinmunes fueron negativos cuando se pusieron a prueba a una dilución de 1: 100. Los anticuerpos GBS-reactivos eran detectables en los sueros de cada animal después de una inyección individual de proteína GBS recombinante.
Ejemplo 10 Conservación antigénica de la proteína de GBS de la presente invención
Anticuerpos monoclonales (MAb) específicos de la proteína de GBS de la presente invención se usaron para 20 demostrar que este antígeno de superficie se produce por todas las GBS y que también está altamente conservado antigénicamente.
Una colección de 68 aislados de GBS se usó para evaluar la reactividad de los MAb específicos de GBS. Estas cepas se obtuvieron del National Center for Streptococcus, Provincial Laboratory of Public Health for Northern Alberta, Canadá; Centre Hospitalier Universitaire de Quebec, Pavillon CHUL, Quebec, Canadá; American Type Culture 25 Collection, EE.UU.; Laboratoire de Sante Publique du Quebec, Canadá; y Dept. of Infectious Disease, Children's Hospital y
Medical Center, Seattle, EE.UU. Todos los ocho MAb se pusieron a prueba frente al siguiente panel de cepas: 6 aislados de serotipo Ia o Ia/c, 3 aislados de serotipo Ib, 4 aislados de serotipo II, 14 aislados de serotipo III, 2 aislados de serotipo IV, 2 aislados de serotipo V, 2 aislados de serotipo VI, 2 aislados de serotipo VII, 1 aislado de serotipo VIII, 30 10 aislados que no se serotiparon y 3 cepas de S. agalactiae bovina. El anticuerpo M 3A2 se hizo reaccionar también con GBS adicional: 9 aislados de serotipo Ia/c y 10 aislados de serotipo V. Las cepas se cultivaron durante toda una noche en placas de agar de sangre a 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5 %. Los cultivos se almacenaron a -70 ºC en caldo de infusión cardíaca con glicerol al 20 % (v/v).
Para obtener los MAb específicos de proteínas de GBS, los ratones se inmunizaron tres veces a intervalos de tres 35 semanas con 20 mg de proteína de GBS recombinante purificada (SEC ID NO: 44) en presencia de coadyuvante de QuilA™. Las líneas celulares de hibridoma se generaron por fusión de células del bazo recuperadas de ratones inmunizados con la línea celular de mieloma SP2/O no secretora como se describe anteriormente (Hamel, J. et al.

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un polipéptido aislado que comprende un fragmento antigénico de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 39 o en la SEC ID NO: 44, en la que el fragmento antigénico es capaz de inducir producción de un anticuerpo que es específico para estreptococo del grupo B.
  2. 2. Una composición de vacunas que comprende el polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 y un 5 vehículo, diluyente o coadyuvante farmacéuticamente aceptable.
  3. 3. La composición de vacunas de 2 para su uso en tratamiento terapéutico o profiláctico de infección bacteriana estreptocócica en un animal susceptible a infección estreptocócica.
  4. 4. La composición de vacunas de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicho animal es seleccionado de una res vacuna o un ser humano. 10
  5. 5. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 39 o en la SEC ID NO: 44.
  6. 6. El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 5 para su uso en el tratamiento de una infección estreptocócica.
  7. 7. Un procedimiento para detectar estreptococo de grupo B en una muestra biológica, comprendiendo dicho 15 procedimiento:
    (a) incubar el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 5 con la muestra biológica para formar una mezcla; y
    (b) detectar anticuerpo específicamente unido o fragmento de unión a antígeno unido en la mezcla, que indica la presencia de estreptococo de grupo B. 20
ES10180962.2T 1998-02-20 1999-02-17 Antígenos de estreptococos del grupo B Expired - Lifetime ES2540281T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7542598P 1998-02-20 1998-02-20
US75425P 1998-02-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2540281T3 true ES2540281T3 (es) 2015-07-09

Family

ID=22125658

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10180962.2T Expired - Lifetime ES2540281T3 (es) 1998-02-20 1999-02-17 Antígenos de estreptococos del grupo B
ES99904646T Expired - Lifetime ES2278436T3 (es) 1998-02-20 1999-02-17 Antigenos de estreptococos del grupo b.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES99904646T Expired - Lifetime ES2278436T3 (es) 1998-02-20 1999-02-17 Antigenos de estreptococos del grupo b.

Country Status (22)

Country Link
US (4) US20030031682A1 (es)
EP (3) EP1054971B1 (es)
JP (2) JP4637350B2 (es)
KR (1) KR100771148B1 (es)
CN (2) CN1944652A (es)
AP (1) AP2000001886A0 (es)
AT (1) ATE347600T1 (es)
AU (1) AU2505999A (es)
CA (1) CA2321106C (es)
CZ (1) CZ301056B6 (es)
DE (1) DE69934299T2 (es)
EA (1) EA200000860A1 (es)
ES (2) ES2540281T3 (es)
HU (1) HU228497B1 (es)
ID (1) ID27482A (es)
IL (3) IL137921A0 (es)
NO (2) NO330491B1 (es)
NZ (1) NZ529854A (es)
OA (1) OA11686A (es)
TR (1) TR200002437T2 (es)
WO (1) WO1999042588A2 (es)
ZA (1) ZA991325B (es)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2321106C (en) 1998-02-20 2013-07-23 Biochem Pharma Inc. Group b streptococcus antigens
US7098182B2 (en) 1998-07-27 2006-08-29 Microbial Technics Limited Nucleic acids and proteins from group B streptococcus
WO2000006736A2 (en) * 1998-07-27 2000-02-10 Microbial Technics Limited Nucleic acids and proteins from group b streptococcus
GB0105922D0 (en) * 2001-03-09 2001-04-25 Microscience Ltd Genes and proteins, and their use
US6890539B2 (en) 1998-12-22 2005-05-10 Microscience, Ltd. Genes and proteins, and their use
CN101066447A (zh) 1998-12-22 2007-11-07 微科学有限公司 基因和蛋白质,及它们的用途
US7128918B1 (en) 1998-12-23 2006-10-31 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
US6833356B1 (en) 1999-08-25 2004-12-21 Medimmune, Inc. Pneumococcal protein homologs and fragments for vaccines
AU7076100A (en) * 1999-08-25 2001-03-19 Med Immune, Inc. Homologs of a pneumococcal protein and fragments for vaccines
US6866855B2 (en) 2000-06-12 2005-03-15 University Of Saskatchewan Immunization of dairy cattle with GapC protein against Streptococcus infection
US6833134B2 (en) 2000-06-12 2004-12-21 University Of Saskacthewan Immunization of dairy cattle with GapC protein against Streptococcus infection
DK1294771T3 (da) 2000-06-12 2008-12-15 Univ Saskatchewan Kimært GapC-protein fra Streptococcus og anvendelse deraf til vaccinering og diagnosticering
EP1734050A3 (en) * 2000-06-12 2012-12-05 University Of Saskatchewan Immunization of dairy cattle with GapC protein against streptococcus infection
ES2273861T3 (es) * 2000-06-12 2007-05-16 University Of Saskatchewan Inmunizacion de ganado vacuno lechero con proteina gapc frente a infecciones por streptococcus.
JP4102186B2 (ja) 2000-10-13 2008-06-18 アイディー バイオメディカル コーポレイション グループｂストレプトコッカスのｂｖｈ−ａ２及びｂｖｈ−ａ３抗原
CA2881568C (en) 2000-10-27 2019-09-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
AU2002216863B8 (en) * 2000-12-21 2008-03-20 Id Biomedical Corporation Streptococcus pyogenes antigens and corresponding DNA fragments
FR2824074A1 (fr) * 2001-04-26 2002-10-31 Pasteur Institut Sequence du genome streptococcus agalactiae, application au developpement de vaccins, d'outils de diagnostic, et a l'identification de cibles therapeutiques
ES2381967T3 (es) * 2002-02-11 2012-06-04 Id Biomedical Corporation Antígeno de streptococcus del grupo B
GB0210128D0 (en) * 2002-05-02 2002-06-12 Chiron Spa Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B
ES2505695T3 (es) 2003-07-31 2014-10-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Composiciones inmunógenas para Streptococcus pyogenes
US8945589B2 (en) 2003-09-15 2015-02-03 Novartis Vaccines And Diagnostics, Srl Immunogenic compositions for Streptococcus agalactiae
JP2008508320A (ja) 2004-07-29 2008-03-21 カイロン コーポレイション Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅのようなグラム陽性細菌に対する免疫原性組成物
US7838010B2 (en) 2004-10-08 2010-11-23 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Immunogenic and therapeutic compositions for Streptococcus pyogenes
EP1845944A4 (en) * 2005-02-08 2011-07-27 Id Biomedical Corp Of Quebec C O B As Glaxosmithkline Biolog North America PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS
GB0605247D0 (en) * 2006-03-15 2006-04-26 Chiron Srl Compositions and methods for immunisation
KR101621837B1 (ko) 2007-09-12 2016-05-17 노파르티스 아게 Ｇａｓ57 돌연변이 항원 및 ｇａｓ57 항체
EP2537857B1 (en) 2007-12-21 2017-01-18 GlaxoSmithKline Biologicals SA Mutant forms of streptolysin O
CN102304185A (zh) * 2011-09-02 2012-01-04 黑龙江八一农垦大学 预防奶牛乳房炎的融合蛋白sip-trap及制备方法和应用
EP2949340A1 (en) * 2014-05-30 2015-12-02 IDT Biologika GmbH Vaccine composition against Streptococcus suis infection
CN115057944B (zh) * 2022-06-24 2025-06-24 南京农业大学 一种针对所有gbs血清型的多表位亚单位疫苗

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4431739A (en) 1979-11-05 1984-02-14 Genentech, Inc. Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein
US4425437A (en) 1979-11-05 1984-01-10 Genentech, Inc. Microbial polypeptide expression vehicle
US5302386A (en) * 1986-04-16 1994-04-12 Brigham And Women's Hospital, Inc. Bacterial antigens, antibodies, vaccines and methods of manufacture
US5472696A (en) * 1988-02-26 1995-12-05 Univ. Of Florida Research Foundation, Inc. Antigen of group B streptococci
US5648241A (en) * 1989-09-15 1997-07-15 The General Hospital Corporation Conjugate vaccine against group B streptococcus
US5679768A (en) * 1991-02-15 1997-10-21 Uab Research Foundation Epitopic regions of pneumococcal surface protein A
US5225331A (en) * 1991-04-25 1993-07-06 National Research Council Of Canada Immunoassay for detecting group b streptococcus
HU217582B (hu) * 1993-03-19 2000-02-28 Gunnar Lindahl Streptococcus B csoportba tartozó törzsek elleni immunitást biztosító, Rib fehérjenevű felületi protein, eljárás a protein tisztítására, reagenskészlet és gyógyszerkészítmény
US5595740A (en) * 1994-05-16 1997-01-21 University Of Florida Cloning of non-IgA FC binding forms of the group B streptococcal beta antigens
TW448184B (en) * 1994-11-01 2001-08-01 Kirin Brewery Peptide sequence that forms muscous glycoprotein chain and technique for producing thereof
JP4469026B2 (ja) * 1996-10-31 2010-05-26 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原およびワクチン
CA2321106C (en) * 1998-02-20 2013-07-23 Biochem Pharma Inc. Group b streptococcus antigens
US6248329B1 (en) * 1998-06-01 2001-06-19 Ramaswamy Chandrashekar Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof
WO2000006736A2 (en) 1998-07-27 2000-02-10 Microbial Technics Limited Nucleic acids and proteins from group b streptococcus
EP1140157B1 (en) 1998-12-21 2009-02-18 MedImmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
KR100802198B1 (ko) 1998-12-23 2008-02-11 샤이어 바이오켐 인코포레이티드 신규한 스트렙토코커스 항원
US7128918B1 (en) 1998-12-23 2006-10-31 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
GB9921125D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Microbial Technics Limited Proteins
ES2381967T3 (es) * 2002-02-11 2012-06-04 Id Biomedical Corporation Antígeno de streptococcus del grupo B

Also Published As

Publication number Publication date
CN1944652A (zh) 2007-04-11
ID27482A (id) 2001-04-12
NO20101682L (no) 2000-10-19
EA200000860A1 (ru) 2001-10-22
NO330491B1 (no) 2011-05-02
DE69934299T2 (de) 2007-07-05
JP4637350B2 (ja) 2011-02-23
EP1054971A2 (en) 2000-11-29
IL190018A (en) 2011-07-31
IL190018A0 (en) 2008-08-07
CA2321106A1 (en) 1999-08-26
WO1999042588A3 (en) 2000-03-23
KR20010034518A (ko) 2001-04-25
AP2000001886A0 (en) 2000-09-30
EP2280072B1 (en) 2015-03-25
CN1297482A (zh) 2001-05-30
IL137921A (en) 2008-06-05
WO1999042588A2 (en) 1999-08-26
HU228497B1 (en) 2013-03-28
US20110182923A1 (en) 2011-07-28
CN1268745C (zh) 2006-08-09
EP2280072A3 (en) 2012-06-06
TR200002437T2 (tr) 2000-11-21
DE69934299D1 (de) 2007-01-18
US20030031682A1 (en) 2003-02-13
NO20004161D0 (no) 2000-08-18
IL137921A0 (en) 2001-10-31
HUP0102304A1 (hu) 2001-10-28
JP2009242403A (ja) 2009-10-22
OA11686A (en) 2005-01-12
ES2278436T3 (es) 2007-08-01
EP1054971B1 (en) 2006-12-06
US8580262B2 (en) 2013-11-12
KR100771148B1 (ko) 2007-10-29
NO20004161L (no) 2000-10-19
US8226953B2 (en) 2012-07-24
EP2280072A2 (en) 2011-02-02
CA2321106C (en) 2013-07-23
HUP0102304A3 (en) 2008-03-28
AU2505999A (en) 1999-09-06
US7914794B2 (en) 2011-03-29
NZ529854A (en) 2005-08-26
ATE347600T1 (de) 2006-12-15
JP2002507396A (ja) 2002-03-12
CZ301056B6 (cs) 2009-10-29
EP1757697A2 (en) 2007-02-28
EP1757697A3 (en) 2007-05-30
CZ20003054A3 (cs) 2001-03-14
US20130095498A1 (en) 2013-04-18
US20030228323A1 (en) 2003-12-11
ZA991325B (en) 1999-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2540281T3 (es) Antígenos de estreptococos del grupo B
ES2400280T3 (es) Antígenos de estreptococos
US7074415B2 (en) Streptococcus antigens
ES2382893T3 (es) Antígenos BVH-A2 y BVH-3 de streptococcus del grupo B
AU2010227084B2 (en) Group B Streptococcus Antigens
AU2007200130B2 (en) Group B Streptococcus Antigens
EP1950302B1 (en) Streptococcus antigens
HK1100752A (en) Group b streptococcus antigens
HK1118575B (en) Streptococcus antigens
MXPA00008111A (es) Antigenos de estreptococo grupo b