ES2265145T3

ES2265145T3 - Peptidos marcados con tecnecio-99m para el diagnostico mediante imagenes.

Info

Publication number: ES2265145T3
Application number: ES94912155T
Authority: ES
Inventors: Richard T. Dean
Original assignee: Diatide Inc
Current assignee: Diatide Inc
Priority date: 1993-02-19
Filing date: 1994-02-18
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2014-02-18
Also published as: EP0684843A1; EP0684843B1; KR960700758A; WO1994019024A2; AU696874B2; KR100341014B1; JPH08507295A; CA2156390A1; WO1994019024A3; AU6441994A; ATE325625T1; DE69434729D1; DK0684843T3; US5552525A; CA2156390C

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A REACTIVOS, REACTIVOS RADIOETIQUETADOS Y METODOS PARA LA PRODUCCION DE TALES REACTIVOS Y REACTIVOS RADIOETIQUETADOS. ESPECIFICAMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A PEPTIDOS ETIQUETADOS CON TECNECIO-99M (TC-99M) QUE ESPECIFICAMENTE SE UNEN A LOS LUGARES DE INFECCION, INFLAMACION, TROMBOSIS, ATEROSCLEROSIS Y CRECIMIENTO NEOPLASTICO IN VIVO, METODOS Y KITS PARA LA PRODUCCION DE TALES PEPTIDOS Y METODO PARA LA UTILIZACION DE TALES PEPTIDOS PARA TOMAR IMAGENES DE PARTES DEL CUERPO DE UN MAMIFERO.

Description

Péptidos marcados con tecnecio-99 m para el diagnóstico mediante imágenes.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención se relaciona con reactivos y péptidos para radiodiagnóstico, métodos para usar estos reactivos para radiodiagnóstico y métodos para producir dichos agentes para radiodiagnóstico marcados. Específicamente, la invención se relaciona con reactivos marcados con tecnecio 99 m (Tc-99m), métodos y juegos de reactivos para prepararlos, y el uso de dichos reactivos para la elaboración de preparaciones farmacéuticas para obtener imágenes de un sitio de infección o inflamación.

2. Descripción del estado anterior de la técnica

Existe una necesidad clínica de poder determinar la ubicación y/o la extensión de sitios donde hay un foco infeccioso o infección localizada. En una cantidad importante de casos, métodos convencionales de diagnóstico (como exploración física, radiografía, tomografía computada y ecografía) no logran identificar dichos sitios (por ejemplo, un absceso). Aunque se puede recurrir a la biopsia, es preferible evitar dichos procedimientos invasivos, al menos hasta que sea apropiado a los efectos diagnósticos identificar el patógeno responsable de un absceso en una ubicación conocida. Identificar el sitio de dicha infección "oculta" es importante porque es fundamental la localización e identificación rápidas del problema para una intervención terapéutica eficaz.

En el campo de la medicina nuclear, se pueden localizar ciertas patologías o determinar la extensión de dichas patologías obteniendo imágenes de la distribución interna de los compuestos trazadores marcados radiactivamente administrados (es decir radiotrazadores o radiofármacos) que se acumulan específicamente en el sitio patológico. Se conoce una diversidad de radionucleidos útiles para la obtención de imágenes radiológicas, que incluye ^{67}Ga, ^{99m}Tc (Tc-99m), ^{111}In, ^{123}I, ^{125}I, ^{169}Yb y ^{186}Re.

Sin embargo, un absceso puede ser causado por cualquiera de muchos posibles patógenos, de modo que un radiotrazador específico para un patógeno en particular tendría un alcance limitado. Por otra parte, la infección es casi invariablemente acompañada por inflamación, que es una respuesta general del organismo a la lesión tisular. Por consiguiente, se esperaría que un radiotrazador específico para los sitios de inflamación fuera útil en la localización de sitios de infección causada por cualquiera patógeno, así como útil para localizar otros sitios inflama-
torios.

Uno de los fenómenos principales asociados con la inflamación es la localización de leucocitos (glóbulos blancos), generalmente monocitos y neutrófilos, en el sitio de la inflamación. Un radiotrazador específico para los leucocitos sería útil para detectar leucocitos en el sitio de una infección localizada. Los procedimientos de medicina nuclear aprobados comúnmente para obtener imágenes de sitios de infección usan o bien leucocitos marcados con indio 111 (^{111}In-WBC) (consulte, por ejemplo, Peters, 1992, J. Nucl. Med. 33: 65-67) o citrato de galio-67 (^{67}GA) (consulte, por ejemplo, Ebright et al., 1982. Arch. Int. Med. 142: 246-254). Una desventaja muy importante de usar leucocitos marcados con ^{111}In es que la preparación del radiotrazador requiere varios pasos técnicos: extracción aséptica de sangre autóloga, aislamiento aséptico de los leucocitos de la sangre, marcado aséptico de los leucocitos utilizando condiciones que no dañen las células (dado que los leucocitos dañados son tomados por el sistema retículo endotelial cuando se los vuelve a inyectar) y devolución aséptica (reinyección) de los leucocitos (ahora marcados) al paciente. Además, puede ser necesaria una demora de 12 a 48 horas entre inyección y obtención de imágenes para una obtención óptima de imágenes. Aunque los leucocitos marcados con Tc 99 m han sido utilizados para acortar este período de demora (consulte por ejemplo, Vorne et al., 1989, J. Nucl. Med. 30: 1.332-1.336), todavía es necesario el marcado fuera del cuerpo. Un radiotrazador preferido sería uno que no requiriera extracción ni manipulación de componentes de sangre autóloga.

Alternativamente, se puede administrar citrato de ^{67}Ga por inyección intravenosa. Sin embargo, este compuesto no es específico para sitios de infección o inflamación. Por otra parte, a menudo es necesaria una demora de hasta 72 horas entre la inyección del radiotrazador y la obtención de imágenes. Además, las energías de emisión \gamma (gamma) de ^{67}Ga no son muy adecuadas para las cámaras gamma convencionales.

Se desarrollaron anticuerpos monoclonales y policlonales radiomarcados generados contra los leucocitos humanos (incluidos monocitos, neutrófilos, granulocitos y otros tipos de células. Se probaron anticuerpos monoclonales antigranulocitos marcados con Tc 99 m (consulte, por ejemplo, Lind et al., 1990, J. Nucl. Med, 31: 417-473) e inmunoglobulina humana inespecífica marcada con ^{111}In (consulte, por ejemplo, LaMuraglia et al., 1989, J. Vasc. Surg. 10: 20-28) para la detección de inflamación secundaria a la infección. La IgG marcada con ^{111}In comparte las desventajas de los leucocitos marcados con ^{111}In, en que son necesarias de 24 a 48 horas entre la inyección y la obtención óptima de imágenes. Además, todos los anticuerpos radiomarcados son difíciles de producir y enfrentan procedimientos de aprobación prolongados, puesto que habitualmente los organismos reguladores los clasifican como productos biológicos.

Se prefieren como radiofármacos para usar rutinariamente moléculas pequeñas que se sinteticen fácilmente. Existe una clara necesidad de moléculas sintéticas pequeñas que se puedan inyectar directamente en un paciente y que permitan obtener imágenes de sitios de infección e inflamación al localizarse en los sitios donde se acumulan los leucocitos. Una clase de moléculas pequeñas, que se sintetizan fácilmente, útiles en dichas aplicaciones son los péptidos.

La sensibilidad de los métodos para obtener imágenes que usan péptidos marcados radiactivamente es mucho mayor que otras técnicas conocidas por los técnicos en la materia, dado que la unión específica del péptido radiactivo concentra la señal radiactiva sobre el área de interés, por ejemplo, un sitio inflamatorio. Además, los métodos para lograr una síntesis química de alto rendimiento de péptidos pequeños son bien conocidos por los técnicos en la materia.

Una clase de péptidos que se sabe que se unen a los leucocitos son los péptidos quimiotácticos que hacen que los leucocitos suban un gradiente de concentración de péptidos (consulte Wilkinson, 1988. Meth. Enzymol. 162: 127-132). Estos compuestos se unen a los receptores de la superficie de los leucocitos con una afinidad muy alta. Estos péptidos se derivan de una cantidad de fuentes, que incluyen factores del complemento, bacterias, tuftsina, elastina, fibrinopéptido B, fibrinógeno B\beta, factor plaquetario 4 y otros. Los péptidos sintéticos pequeños derivados de esos compuestos quimiotácticos y radiomarcados serían muy útiles como radiotrazadores para obtener imágenes de sitios de inflamación in vivo.

En el estado anterior de la técnica se había informado de péptidos radiomarcados.

Zoghbi et al., 1981, J. Nucl. Med. 22: 32 (Abst) divulgan factores quimiotácticos formilpéptidos (fMLF) derivados de bacterias acopladas a transferrina marcada con ^{111}In.

Jiang et al., 1982, Nuklearmedizin 21: 110-113 divulgan un péptido formilado quimiotáctico (fMLF) radiomarcado con ^{125}I.

Fischman et al., 1991, J. Nucl. Med. 32: 482-491 se relaciona con conjugados de formilpéptido quimiotáctico (fMLF) - DTPA marcado con ^{111}In.

EP 0398143 se relaciona con conjugados de formilpéptido quimiotáctico (fMLF) - DTPA marcado con ^{111}In.

La Patente de los Estados Unidos Nº 4,986,979 se relaciona con el uso de formilpéptidos (fMLF) quimiotácticos radiomarcados para radiomarcar leucocitos fuera del cuerpo a través de un marcador de fotoafinidad.

WO90/10463 se relaciona con el uso de formilpéptidos (fMLF) quiomiotácticos radiomarcados para radiomarcar leucocitos fuera del cuerpo a través de un marcador de fotoafinidad.

El uso de péptidos formil-metionil-leucil-fenilalanil (fMLF) marcados conocidos en la tecnología previa padece del grave inconveniente de que este péptido causa liberación de superóxido de los neutrófilos (Niedel y Cuatrecasas, 1980, Formyl Peptide Chemotactic Receptors and Macrophages, en Curr. Top Cell. Reg. 17: 137-170) y a dosis suficientes pueden causar leucocitopenia (Jiang et al, 1982. Nuklearmed. 21: 110-113).

El factor plaquetario 4 es un péptido quimiotáctico de origen natural, que consiste en 70 aminoácidos y que ya se sabía en el estado anterior de la técnica que se une a neutrófilos y monocitos, que son tipos de células que se sabe que están asociadas con sitios de inflamación e infección in vivo.

Thorbecke y Zucker, 1989, solicitud de Patente Europea Nº 88111962.2 divulgan preparaciones y métodos para modular respuestas inmunitarias que comprenden administrar una cantidad inmunomodulante del factor plaquetario 4 o péptidos derivados de éste.

Deuel et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 74: 2.256-2.258 divulgan la secuencia de aminoácidos del factor plaquetario humano 4.

Deuel et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 78: 4.584-4.587 divulgan que el factor plaquetario 4 es quimiotáctico para neutrófilos y monocitos in vitro.

Osterman et al., 1982, Biochem. Biophys. Res. Comm. 107: 130-135 divulgan que el tridecapéptido carboxilo terminal del factor plaquetario 4 tiene propiedades quimiotácticas.

Holt y Niewiarowski, 1985, Sem. Hematol. 22: 151-163 proporcionan una reseña de la bioquímica de las proteínas del gránulo alfa de las plaquetas, que incluye al factor plaquetario 4.

Goldman et al., 1985, Immunol. 54: 163-171 divulgan que la captación de fMLF mediada por el receptor es inhibida en los neutrófilos humanos por el factor plaquetario 4 y un dodecapéptido carboxilo terminal de éste.

Bebawy et al., 1986, J. Leukocyte Biol. 39: 423-434 describen la respuesta quimiotáctica de los neutrófilos in vitro mediada por el factor plaquetario 4.

Loscalzo et al., 1985, Arch. Biochem. Biophys. 240: 446-455 describen la interacción bioquímica entre el factor plaquetario 4 y glicosaminoglicanos como la heparina.

Maione et al., 1989, Science 247: 77-79 divulgan que la angiogénesis es inhibida por el factor plaquetario 4 humano recombinante y fragmentos peptídicos de éste.

El uso de quelantes para radiomarcar polipéptidos y métodos para marcar péptidos y polipéptidos con Tc 99 m se conocían en el estado anterior de la técnica y se divulgan en las solicitudes de Patente de los Estados Unidos en trámite Nº de serie 07/653,012, 07/807,062, 07/851,074, 07/871,282, 07/886,752, 07/893,981, 07/902,935, 07/955,466, y 08/044,825.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona reactivos para gammagrafía que son péptidos marcados radiactivamente. Los reactivos de la invención están compuestos por péptidos que se unen específicamente a sitios in vivo, en particular, sitios de infección e inflamación, que están covalentemente unidos a un grupo complejante de un radioisótopo donde el grupo complejante se une a un radioisótopo.

La invención proporciona reactivos que se unen a dicha multiplicidad de sitios in vivo, complejos radiomarcados de dichos reactivos con tecnecio 99 m, métodos para preparar dichos complejos, métodos para usar dichos complejos radiomarcados para obtener imágenes de sitios de infección e inflamación dentro del organismo de un mamífero, y métodos para preparar los reactivos de la invención.

En un primer aspecto de la presente invención, se proporcionan reactivos capaces de obtener imágenes de sitios en el organismo de un mamífero, que comprenden un péptido de unión específico que comprende el factor plaquetario 4 o fragmentos peptídicos de éste que se unen a sitios de infección e inflamación dentro del organismo de un mamífero, unidos covalentemente a una porción de unión al radiomarcador de fórmula

\vskip1.000000\baselineskip

A-CZ(B)-[C(R^{1}R^{2})]_{n}-X

donde A es H, HOOC, H_{2}NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC o R^{4}; Z es H o R^{4}; B es H, SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(péptido) o R^{4}; X es H, SH o -NHR^{3}, -N(R^{3})-(péptido) o R^{4}; R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente H o alquilos inferiores de cadena lineal o ramificada o cíclicos; n es 0, 1 o 2; y: (1) cuando B es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(péptido), X es SH y n es 1 ó 2; (2) cuando X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(péptido), B es SH y n es 1 ó 2; (3) cuando B es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC, X es SH y n es 0 ó 1; (4) cuando A es H o R^{4}, entonces cuando B es SH, X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(péptido) y cuando X es SH, B es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(péptido); (5) cuando X es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC y B es SH; (6) cuando Z es metilo, X es metilo, A es HOOC, H_{2}NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC y B es SH y n es 0; (7) cuando Z es SH y X es SH, n no es 0; y donde la porción tiol está en la forma reducida.

La invención también comprende complejos de los péptidos de la invención con Tc 99 m, juegos de reactivos para preparar los péptidos de la invención radiomarcados con Tc 99 m, métodos para radiomarcar los péptidos de la invención con Tc 99 m y métodos para usar los péptidos radiomarcados de la invención para obtener imágenes de sitios de infección e inflamación dentro del organismo de un mamífero mediante gammagrafía.

La invención también comprende agentes para gammagrafía que son complejos de los reactivos peptídicos de la invención con Tc 99 m y métodos para radiomarcar los reactivos peptídicos de la invención con Tc 99 m. Los complejos radiomarcados proporcionados por la invención se forman haciendo reaccionar los reactivos peptídicos de la invención con Tc 99 m en presencia de un reductor. Los reductores preferidos incluyen pero no exclusivamente ion ditionito, ion estannoso y ion ferroso. Los complejos de la invención también se forman marcando los reactivos peptídicos de la invención con Tc 99 m por intercambio de ligandos de un complejo de Tc 99 m reducido previamente según lo estipulado aquí.

La invención también proporciona juegos de reactivos para preparar agentes para gammagrafía que son los reactivos peptídicos de la invención radiomarcados con Tc 99 m. Los juegos de reactivos para radiomarcar los reactivos peptídicos de la invención con Tc 99 m están compuestos por un vial sellado que contiene una cantidad predeterminada de un reactivo peptídico de la invención y una cantidad suficiente de reductor para marcar el reactivo con Tc 99 m.

Esta invención proporciona métodos para preparar los reactivos peptídicos de la invención mediante síntesis química in vitro. En una materialización preferida, los péptidos de unión específica se sintetizan mediante síntesis peptídica en fase sólida.

Esta invención proporciona el uso de agentes para gammagrafía para elaborar una preparación farmacéutica para obtener imágenes de sitios de inflamación e infección dentro del organismo de un mamífero mediante gammagrafía in vivo. Dichas preparaciones farmacéuticas se usan en métodos que comprenden la administración de una cantidad diagnóstica eficaz de los reactivos peptídicos de la invención marcados con Tc 99 m y la detección de la radiación gamma emitida por el marcador de Tc 99 m localizado en el sitio de inflamación dentro del organismo de un mamífero.

Además de localizarse en sitios de infección e inflamación, se sabe que los leucocitos también se localizan en sitios de trombosis (consulte, por ejemplo, Kwaan et al., 1989. "Pathogenesis of Thrombosis", en Clinical Thrombosis, Kwaan y Samama, eds. CRC Press: Boca Raton, La., p. 35). Por lo tanto, además de proporcionar radiotrazadores útiles para obtener imágenes de sitios de infección e inflamación, los radiotrazadores de la invención derivados de PF4 también proporcionan radiotrazadores útiles para obtener imágenes de sitios de trombosis de venas profundas y embolismo pulmonar.

Además, se sabe que el PF4 se une a la heparina y otros glicosaminoglicanos (consulte Loscalzo et al., 1985. ibid.). En la aterosclerosis, la proliferación celular excesiva, en particular la proliferación de células del músculo liso, produce una superabundancia de material derivado de la matriz extracelular, un componente principal de la cual son los glicosaminoglicanos. Por lo tanto, los péptidos radiomarcados de la invención derivados de PF4 también proporcionan radiotrazadores útiles para obtener imágenes de la aterosclerosis.

Asimismo, se ha demostrado que PF4 y los fragmentos de PF4 pueden inhibir la angiogénesis relacionada con tumores (consulte Sharpe et al. 1990. J. Natl. Cancer Inst 82: 848-853 y Maione et al., 1990. ibid.). Por lo tanto, los péptidos radiomarcados de la invención derivados de PF4 también son útiles para obtener imágenes de emplazamientos de tumores.

Los péptidos de unión específica de la invención también se pueden unir covalentemente a una porción ligadora polivalente. Las porciones ligadoras polivalentes de la invención están compuestas por al menos 2 grupos funcionales ligadores capaces de unirse covalentemente a los péptidos de unión específica o a las porciones de unión al Tc 99 m. Los grupos funcionales ligadores preferidos son aminas primarias o secundarias, grupos hidroxilo, grupos ácido carboxílico o grupos reactivos tiol como los grupos 2-haloacetilo y maleimido. En materializaciones preferidas, las porciones ligadoras polivalentes están compuestas por bis-succinimidilmetiléter (BSME), ácido 4-(2,2-dimetilacetil)benzoico (DMAB), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), tris(succinimidiletil)amina (TSEA), tris-acetamidoetilamina y 1,10-bisacetamido-4,7-dioxa-decano, o un derivado de cualquiera de los compuestos prece-
dentes.

Las materializaciones específicas preferidas de la presente invención se tornarán evidentes a partir de la descripción más detallada siguiente de ciertas materializaciones preferidas y las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona reactivos peptídicos marcados con Tc 99 m para obtener imágenes de sitios blanco dentro del organismo de un mamífero que se unen específicamente a sitios de infección e inflamación dentro del organismo de un mamífero, estando los péptidos de unión específica unidos covalentemente a una porción de unión al radiomarcador donde la porción de unión al radiomarcador se une a un radioisótopo.

Los reactivos peptídicos de esta invención se unen específicamente a sitios de infección e inflamación dentro del organismo de un mamífero. Estos reactivos también se pueden unir a leucocitos, preferentemente monocitos y neutrófilos y muy preferentemente a neutrófilos. A los fines de esta invención, la expresión "se unen a leucocitos" está destinada a dar a entender que los péptidos de unión específica y los reactivos peptídicos de la presente invención son capaces de acumularse en los sitios de infección o inflamación en el organismo de un mamífero en cantidad suficiente para permitir la detección de la acumulación de los complejos radiomarcados preparados a partir de los reactivos de la invención según se divulgó aquí en los sitios de infección o inflamación mediante gamma-
grafía.

Los péptidos preferidos de esta invención incluyen el factor plaquetario 4 y péptidos derivados de éste. A los fines de esta invención, el término "péptidos derivados de éste" pretende abarcar los péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos homóloga a toda la secuencia de aminoácidos del factor plaquetario 4 o a una porción de ella. También se pretende circunscribir con este término los fragmentos peptídicos del factor plaquetario 4, ya hayan sido generados por degradación proteolítica de la proteína nativa factor plaquetario 4 o por síntesis química de una porción de la secuencia de aminoácidos del factor plaquetario 4. Los fragmentos peptídicos útiles en la práctica de esta invención incluyen los fragmentos capaces de unirse específicamente a sitios de infección e inflamación en el organismo de un mamífero. Aquí se presentan ejemplos de dichos péptidos en los Ejemplos.

Donde la porción de unión al radiomarcador es

Cp(aa)Cp,

Cp es un residuo de cisteína protegido y (aa) representa un aminoácido, y la porción de unión al radiomarcador está unida covalentemente a los péptidos de unión específica. En una materialización preferida, el aminoácido es glicina. En otra materialización preferida, la porción de unión al radiomarcador está unida al péptido específico a través de uno o más aminoácidos.

En los péptidos que contienen Cp(aa)Cp, Cp es una cisteína protegida donde los grupos que protegen el S son iguales o diferentes y pueden ser pero no están limitados a:

: -CH_{2}-arilo (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);

: -CH-(arilo)_{2}, (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);

: -C-(arilo)_{3}, (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);

: -CH_{2}-(4-metoxifenilo);

: -CH-(4-piridil)(fenilo)_{2};

: -C(CH_{3})_{3}

: -9-fenilfluorenilo;

: -CH_{2}NHCOR (R es alquilo o arilo sustituidos o sin sustituir);

: -CH_{2}-NHCOOR (R es alquilo o arilo sustituidos o sin sustituir);

: -CONHR (R es alquilo o arilo sustituidos o sin sustituir);

: -CH_{2}-S-CH_{2}-fenilo.

Las porciones de unión al radiomarcador que comprenden grupos protectores del azufre de la cisteína designados "(pgp)^{S}", como las porciones bisamino bistiol de la invención, también son descritas por la lista antedicha de grupos protectores.

El grupo protector preferido tiene la fórmula -CH_{2}-NHCOR donde R es un alquilo inferior que tiene 1 y 8 átomos de carbono, fenilo o fenilo sustituido con alquilo inferior, hidroxilo, alcoxi inferior, carboxi, o alcoxicarbonilo inferior.

El marcado con Tc 99 m es una ventaja de la presente invención porque las propiedades nucleares y radiactivas de este isótopo lo convierten en un agente ideal para gammagrafía. Este isótopo tiene energía de un único fotón de 140 keV y un período de semidesintegración radiactiva de aproximadamente 6 horas, y se obtiene fácilmente con un generador de ^{99}Mo-^{99m}Tc. Otros radionucleidos conocidos en el estado anterior de la técnica tienen períodos de semidesintegración efectivos mucho más largos (por ejemplo, ^{111}In, que tiene un período de semidesintegración de 67,4 h) o son tóxicos (por ejemplo, ^{125}I).

Los péptidos de la presente invención se pueden sintetizar químicamente in vitro. Los péptidos de la presente invención se pueden preparar en general de manera ventajosa en un sintetizador de péptidos. Los péptidos de esta invención pueden ser sintetizados donde la porción de unión al radiomarcador se une covalentemente al péptido durante la síntesis química in vitro, utilizando técnicas bien conocidas por los técnicos con experiencia en el tema. Dichos péptidos unidos covalentemente a la porción de unión al radiomarcador durante la síntesis son ventajosos porque se pueden determinar en ellos lugares específicos de enlace covalente.

Las porciones de unión al radiomarcador de la invención se pueden introducir en el péptido blanco específico durante la síntesis peptídica. Para las materializaciones [por ejemplo, Pic-Gly-Cys(grupo protector)-] que comprenden ácido picolínico (Pic-), la porción de unión al radiomarcador se puede sintetizar como el último residuo (es decir, amino-terminal) de la síntesis. Además, la porción de unión al radiomarcador que contiene ácido picolínico se puede unir covalentemente al grupo \epsilon-amino de la lisina para dar, por ejemplo, \alphaN(Fmoc)-Lys-\epsilonN[Pic-Gly-Cys(grupo protector)], que se puede incorporar en cualquier posición en la cadena del péptido. Esta secuencia es particularmente ventajosa porque ofrece una modalidad fácil de incorporación en el péptido de unión que es el blanco.

De manera semejante, la porción de unión al radiomarcador que contiene picolilamina (Pica) [-Cys(grupo protector)-Gly-Pica] se puede preparar durante la síntesis peptídica incluyendo la secuencia [-Cys(grupo protector)-Gly-] en el carboxilo terminal de la cadena peptídica. A continuación de la separación del péptido de la resina el carboxilo terminal del péptido se activa y se acopla a la picolilamina. Esta vía sintética requiere que las funcionalidades de la cadena lateral reactivas permanezcan enmascaradas (protegidas) y no reaccionen durante la conjugación de la picolilamina.

En los ejemplos siguientes se proporcionan ejemplos de péptidos sintéticos pequeños que contienen el Pic-Gly-Cys-quelante. Esta invención divulga la incorporación de estos quelantes en virtualmente cualquier péptido derivado del factor plaquetario 4, lo que da como resultado un péptido radiomarcado con Tc 99 m.

Esta invención también divulga péptidos sintéticos pequeños que incorporan quelantes bisamino bistiol (BAT) que se pueden marcar con Tc 99 m.

Al formar un complejo de tecnecio radiactivo con los reactivos peptídicos de esta invención, el complejo de tecnecio, preferentemente una sal de pertecnectato de Tc 99 m, se hace reaccionar con los reactivos peptídicos de esta invención en presencia de un reductor: en una materialización preferida, el reductor es cloruro estannoso. Se provee de complejos y medios para preparar convenientemente dichos complejos en forma de un juego de reactivos que comprende un vial sellado que contiene una cantidad predeterminada del reactivo peptídico de la invención que va a ser marcado y una cantidad suficiente de reductor para marcar el reactivo con Tc 99 m. Alternativamente, se puede formar el complejo haciendo reaccionar los reactivos peptídicos de esta invención con un complejo lábil preformado de tecnecio y otro compuesto conocido como un ligando de transferencia. Este proceso se conoce como intercambio de ligandos y es bien conocido por los técnicos con experiencia en el tema. El complejo lábil se puede formar usando dichos ligandos de transferencia como tartrato, citrato, gluconato o manitol, por ejemplo. Entre las sales de pertecnetato de Tc 99 m útiles con la presente invención se incluyen las sales de metales alcalinos como las sales de sodio, las sales de amonio o de alquilamonio inferiores. La reacción de los reactivos peptídicos de esta invención con pertecnetato de Tc 99 m o complejo lábil de Tc 99 m preformado se puede llevar a cabo en un medio acuoso a temperatura ambiente. Cuando se forma un complejo aniónico en un medio acuoso, el complejo radiomarcado está en la forma de una sal con un catión adecuado como catión sodio, catión amonio, catión mono, di- o tri-alquilamina inferior, o cualquier catión aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

En una materialización preferida de la invención, se proporciona un juego de reactivos para preparar péptidos marcados con tecnecio. Los reactivos peptídicos de la invención se pueden sintetizar químicamente utilizando métodos y medios bien conocidos por los técnicos con experiencia en el tema y se describen a continuación. Los péptidos están covalentemente unidos a una porción de unión al radiomarcador donde la porción de unión al radiomarcador se une a un radioisótopo. Una cantidad apropiada del reactivo peptídico se introduce en un vial que contiene un reductor, como cloruro estannoso o un reductor en fase sólida, en una cantidad suficiente para marcar el reactivo con Tc 99 m. También puede estar incluida una cantidad apropiada de un ligando de transferencia como los descritos (como tartrato, citrato, gluconato o manitol, por ejemplo). Los péptidos marcados con tecnecio de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante el agregado de una cantidad apropiada de Tc 99 m o del complejo de Tc 99 m en los viales y haciéndolos reaccionar en las condiciones que se describen en el Ejemplo 2 a continuación.

Los reactivos peptídicos marcados radiactivamente provistos por la presente invención se proporcionan con una cantidad adecuada de radiactividad. Al formar complejos radiactivos de Tc 99 m, en general se prefiere formar complejos radiactivos en soluciones que contienen radiactividad a concentraciones entre aproximadamente 0,01 mili Curie (mCi) y 100 mCi por ml.

Los reactivos peptídicos marcados con tecnecio provistos por la presente invención se pueden usar para visualizar sitios de inflamación, incluidos abscesos y sitios de infección "oculta". Los péptidos marcados con Tc 99 m provistos por la presente invención también se pueden usar para visualizar sitios de inflamación causados por isquemia tisular, incluidos desórdenes como enfermedad inflamatoria intestinal y artritis.

De conformidad con esta invención, los péptidos o complejos marcados con tecnecio ya sea como complejo o como una sal con un contraión aceptable desde el punto de vista farmacéutico se administran en una única dosis inyectable. Cualquiera de los vehículos comunes conocidos por los técnicos con experiencia en el tema, como solución salina estéril o plasma, se pueden utilizar después del radiomarcado en la preparación de la solución inyectable para diagnosticar mediante imágenes diversos órganos, tumores y similares de conformidad con esta invención. En general, la unidad de dosificación a administrar tiene una radiactividad de aproximadamente 0,01 mCi a 100 mCi, preferentemente de 1 mCi a 20 mCi. La unidad de dosificación de la solución a inyectar es de aproximadamente 0,01 mL a 10 mL. Después de la administración intravenosa, la obtención de imágenes del órgano o tumor in vivo puede tener lugar en unos pocos minutos. Sin embargo, la obtención de imágenes puede tener lugar, si se desea, en horas o incluso más tiempo, después de haberla inyectado en los pacientes. En la mayoría de los casos, una cantidad suficiente de la dosis administrada se acumulará en el área de la que se van a obtener imágenes en aproximadamente 0,1 de hora para permitir la toma de gammagramas. Cualquier método convencional de gammagrafía con fines diagnósticos se puede utilizar de conformidad con esta invención.

Los péptidos y complejos marcados con tecnecio provistos por la invención se pueden administrar por vía intravenosa en cualquier medio convencional para inyección intravenosa como un medio salino acuoso, o en plasma sanguíneo. Dichos medios también pueden contener adyuvantes farmacéuticos convencionales como, por ejemplo, sales aceptables desde el punto de vista farmacéutico para ajustar la presión osmótica, tampones, conservantes y similares. Entre los medios preferidos se encuentran la solución salina isotónica y el plasma.

Los métodos para preparar y marcar estos compuestos se ilustran en mayor profundidad en los ejemplos siguientes. Estos ejemplos ilustran ciertos aspectos del método descrito precedentemente y resultados ventajosos. Estos ejemplos se muestran a título ilustrativo y no con carácter limitante.

Ejemplo 1 Síntesis peptídica en fase sólida

La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) se llevó a cabo a una escala de 0,25 mili mol (mmol) usando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems Modelo 431A y usando 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) como protección del amino terminal, acoplando con diciclohexilcarbodiimida/hidroxibenzotriazol o 2-(1H-benzo-triazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluroniohexafluorofosfato/hidroxibenzotriazol (HBTU/HOBT) y usando resina p-hidroximetilfenoxi-metilpoliestireno (HMP) para los ácidos carboxilo terminal o resina Rink amida para las amidas carboxilo terminal. Cuando se introdujeron los grupos N-\alpha-acetilo apropiados tratando el péptido unido a la resina con anhídrido acético en N-metilpirrolidinona (NMP). Los productos unidos a la resina se cortaron rutinariamente usando una solución compuesta por ácido trifluoroacético, agua, tioanisol, etanoditiol, y trietilsilano, preparada en las proporciones de 100:5:5:2,5:2 durante 1,5 a 3 h a temperatura ambiente. Se purificaron los péptidos crudos por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) preparativa utilizando una columna Waters Delta Pak C18 y gradiente de elución usando ácido trufluoroacético (TFA) al 0,1% en agua modificado con acetonitrilo. Se evaporó el acetonitrilo de las fracciones eluidas que después se liofilizaron. La identidad de cada producto se confirmó por espectroscopía de masa de bombardeo atómico rápido (FABMS).

Ejemplo 2 Un método general para radiomarcado con Tc 99 m

Los péptidos (0,1 mg) preparados según el Ejemplo 1 se disolvieron en 0,1 mL de solvente como se describe en las notas a pie de página de la Tabla I. El gluceptato de Tc 99 m se preparó reconstituyendo un vial de Glucoscan (E.I. DuPont de Nemours, Inc.) con 1,0 mL de pertecnetato sódico de Tc 99 m que contenía hasta 200 mCi y se dejó reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después se agregaron 25 \mul de gluceptato de Tc 99 m al péptido y se dejó proceder la reacción a 100ºC o a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum.

La pureza del reactivo peptídico marcado con Tc 99 m se determinó por HPLC usando una columna analítica Vydak 218TP54 (RP-18, 5 micras, 220 x 4,6 mm) o una columna analítica Waters Delta Pak (C18, 5 micras, 39 mm x 50 mm) y se eluyó como se describe en las notas a pie de página de la Tabla I. Los componentes radiactivos se detectaron mediante un detector radiométrico en línea unido a un registrador de integración. El gluceptato de Tc 99 m y el pertecnetato sódico de Tc 99 m eluyeron a los 1 a 4 minutos en esas condiciones, mientras que el péptido marcado con Tc 99 m eluyó mucho tiempo después.

La tabla siguiente ilustra el exitoso marcado de péptidos con Tc 99 m preparados de acuerdo con el Ejemplo 1 usando el método descrito aquí.

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TABLA I

1

TABLA I (continuación)

2

* Las condiciones de marcado siguientes se usaron con los péptidos apropiados:

1.: El péptido se disuelve en agua y se marca a 100ºC.

2.: El péptido se disuelve en agua y se marca a temperatura ambiente.

3.: El péptido se disuelve en mezcla 1:1 de etanol:agua y se marca a 100ºC.

4.: El péptido se disuelve en mezcla 1:1 de etanol:agua y se marca a temperatura ambiente.

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Métodos de HPLC

general:: solvente A = CF_{3}COOH al 0,1%/H_{2}0

\quad: solvente B_{90} = CF_{3}COOH al 0,1%/CH_{3}CN al 90%/H_{2}O

\quad: velocidad de flujo del solvente = 1 ml/min

Columna Vydak =: columna analítica Vydak 218TP54 RP-18. 5 \mu. 220 mm x 4,6 mm con columna de protección

Columna Waters =: Waters DeltaPak C18, 5 \mu, 39 mm x 150 mm

Método:: columna Vydak o Waters 100% de A a 100% B_{90} en 10 - 20 min

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Ejemplo 3 Gammagrafía y biodistribución de péptidos marcados con Tc 99 m

Para demostrar la eficacia de los reactivos peptídicos marcados con Tc 99 m según lo estipulado antes, se inocularon intramuscularmente conejos blancos de Nueva Zelandia en la pantorrilla izquierda con una cepa potente de E. coli. Después de 24 h, los animales se sedaron con una inyección i.m. de ketamina y xilazina, y después se les inyectó i.v. péptido marcado con Tc 99 m (\leq150 \mug, 2 a 10 mCi). Los animales se colocaron en posición supina en el campo de visión de una cámara gamma (colimador LEAP/centrado en el fotopico para Tc 99 m) y se les tomaron imágenes en el transcurso de la primera hora post inyección, y después a intervalos de aproximadamente 1 h en el transcurso de las siguientes 3 horas post inyección. Se dejó que los animales se recuperaran entre las adquisiciones de imágenes y se los volvió a anestesiar según fue necesario.

Una vez finalizada la última toma de imagen, se sacrificaron todos los animales con sobredosis de fenobarbital i.v. y se disecaron para obtener muestras de sangre y del tejido muscular infectado y de control. Las muestras de tejido se pesaron, y junto con una cantidad estándar de la dosis inyectada, se contaron usando un contador gamma y se determinó el porcentaje de dosis inyectada (por gramo de tejido) remanente en los tejidos. Se calcularon relaciones entre el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido muscular infectado y no infectado y entre el tejido muscular infectado y la sangre, para cada péptido. Estos resultados se presentan en la tabla siguiente. Gammagramas de todo el cuerpo e imágenes de la pata de un conejo inyectado con un reactivo marcado con Tc 99 m de la invención, que tiene la fórmula

acetilKKKKKC_{Acm}GC_{Acm}GGPLYKKIIKKLLES

se presentan en la Figura 1.

Las relaciones entre músculo infectado/músculo de control que se ven en la tabla demuestran claramente la localización específica y preferencial de los péptidos radiomarcados de la invención en sitios de infección, en comparación con tejidos normales. Las imágenes que se muestran en la Figura 1 también muestran claramente la mucha mayor extensión de la localización de la radiactividad en la pata que tiene el sitio experimentalmente infectado en comparación con la pata no infectada opuesta.

TABLA II

3

Ejemplo 4 Obtención de imágenes in vivo de trombosis de venas profundas en un modelo canino utilizando compuestos marcados con Tc 99 m como agentes para gammagrafía de trombos

Se sedan perros Mongrel (de 25 a 35 lb., en ayuno de toda la noche) con una combinación de ketamina y aceprozamina intramuscularmente y después se anestesian con pentobarbital sódico por vía intravenosa. Se introduce un angiocatéter de calibre 18 en la mitad distal de la vena femoral derecha y se coloca una espiral de acero inoxidable Dacron® de 8 mm enroscada para embolización (Cook Co., Bloomington IN) en la vena femoral aproximadamente en la mitad del fémur de cada animal. Se retira el catéter, se sutura la herida y se documenta la ubicación de la espiral por radiografía. Después se deja que los animales se recuperen durante toda la noche.

Al día siguiente de la colocación del espiral, se vuelve a anestesiar a cada animal, se le coloca goteo de solución salina intravenoso en cada pata delantera y se introduce un catéter vesical urinario para recoger la orina. El animal se coloca en posición supina bajo una cámara gamma equipada con un colimador de baja energía, para todo propósito y centrado en el fotopico para Tc 99 m. Las imágenes se adquieren en un sistema de computadora de medicina nuclear.

El reactivo marcado con Tc 99 m [185 - 370 mBq (5-10 mCi) Tc 99 m y 0,2 - 0,4 mg de reactivo] se inyecta en una línea intravenosa de una pata delantera en su punto de inserción. La segunda línea se mantiene para la recolección de sangre. Se adquieren imágenes anteriores de las piernas durante 500.000 cuentas o 20 minutos (lo que sea más corto), aproximadamente 10 a 20 min y aproximadamente 1, 2, 3 y 4 h después de la inyección. Después de la obtención de la imagen final, cada animal se anestesia profundamente con pentobarbital. Se extraen dos muestras de sangre en una punción cardíaca usando una jeringa heparinizada seguido de la dosis de sacrificio de una solución saturada de cloruro de potasio administrada por inyección intercardíaca o intravenosa en bolo. Se disecan cuidadosamente la vena femoral que contiene el trombo y muestras del músculo del muslo. Después se diseca el trombo fuera del vaso y se coloca en un tubo de ensayo previamente pesado. Después se pesan las muestras del trombo y se cuentan en un contador de pocillos gamma en el canal del Tc 99 m. También se cuentan las fracciones conocidas de las dosis inyectadas.

Se determinan el peso del trombo fresco, el porcentaje de dosis inyectada (% de DI)/g en el trombo y la sangre obtenida apenas antes del sacrificio y las relaciones trombo/sangre y trombo/músculo. Se determinan las relaciones trombo/fondo mediante el análisis de las cuentas/píxel medidos en regiones de interés (ROI) extraídos sobre el trombo y el músculo adyacente de las imágenes almacenadas en la computadora. Estos resultados se usan para demostrar la localización de la radioactividad específica del trombo y la eficacia de la gammagrafía para localizar sitios de formación de trombos in vivo.

Ejemplo 5 Localización y obtención de imágenes in vivo de la placa aterosclerótica usando el modelo de ratón con hipercolesterolemia

Se dividen conejos blancos de Nueva Zelandia (NZW) de ambos sexos que pesan entre 2 y 3 kg en dos grupos. El grupo de control de los conejos se aloja y se alimenta con comida comercial para conejos (Purina). Al grupo HC se lo alimenta con una dieta estándar rica en colesterol (comida para conejo mezclada con una concentración de 1% p/p de colesterol) desde la semana 7 hasta la semana 28 de vida. A todos los animales se les da agua a voluntad.

Aproximadamente 250 - 400 \mug de un péptido como los descritos antes se marca con 140 a 160 mCi de Tc 99 m y se prepara en dosis unitarias de 7 a 8 mCi (12,5 – 20,0 \mug/conejo; 6 - 7 \mug/kg) en dosis de 0,2 mL de volumen. Los conejos adultos se dosifican con péptido marcado con Tc 99 m por vía intravenosa en una vena lateral de la oreja mediante infusión lenta en bolo (aproximadamente 0,1 mL/min). Se usa una cámara gamma equipada con un colimador de abertura diminuta (abertura de 5 mm) y ventana de energía fijada para Tc 99 m y programada para acumular 500.000 cuentas o explorar durante un tiempo deseado. Poco antes de la obtención de imágenes, se anestesia a los animales con una mezcla de ketamina y xilazina (5:1,1 mL/kg intramuscularmente).

Las imágenes de la cámara gamma se obtienen a 40º-45º apenas por encima del corazón (vista izquierda anterior oblicua [LAO]) para delinear el arco aórtico y visualizar la aorta descendente. Las imágenes se adquieren 1 y 2 h y ocasionalmente 3 y 5 h después de la inyección. Se inyecta anestesia complementaria según sea necesario antes de cada obtención de imágenes.

A las 2,5 h (después de 2 h de exploración), los animales se sacrifican con una dosis intravenosa de pentobarbital sódico. Después de la autopsia, la aorta se retira y los vasos ramificados se disecan separados de la válvula aórtica hacia la región abdominal media. Usando un colimador de orificio paralelo, también se toman imágenes de la aorta ex corpora. A continuación, las aortas se abren longitudinalmente y se tiñen con Sudán IV, quedando de ese modo la placa aterosclerótica de un color rojo ladrillo intenso. El endotelio aórtico exento de lípidos y sin lesionar retiene su aspecto normal, blanco-rosado brillante en esas condiciones.

La captación en la región con placa de la aorta frente a la aorta sin placa vista en las imágenes in vivo o ex corpora congruente con la localización de la placa observada por tinción de las aortas se usa para demostrar la utilidad de los péptidos radiomarcados de la invención para proporcionar imágenes de aterosclerosis.

Claims

1. Un reactivo que comprende un péptido del factor plaquetario 4 o fragmentos peptídicos de éste, unidos covalentemente a una porción de unión al radiomarcador de fórmula:

A-CZ(B)-[C(R_{1}R_{2})]n-X

donde

A es H, HOOC, H_{2}NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC o R^{4};

B es H, SH, -NHR^{3}, -N(R^{3})-(péptido), o R^{4};

X es H, SH, -NHR^{3}, -N(R^{3})-(péptido), o R^{4};

Z es H o R^{4};

R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son independientemente H o un alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o cíclico;

n es 0, 1 ó 2; y

cuando B es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(péptido), X es SH, y n es 1 ó 2;

cuando X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(péptido), B es SH, y n es 1 ó 2;

cuando B es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC,

X es SH, y n es 0 ó 1;

cuando A es H o R^{4}, entonces cuando B es SH, X es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(péptido) y

cuando X es SH, B es -NHR^{3} o -N(R^{3})-(péptido);

cuando X es H o R^{4}, A es HOOC, H_{2}NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC, y

B e SH;

cuando Z es metilo, X es metilo, A es HOOC, H_{2}NOC, (péptido)-NHOC, (péptido)-OOC y B es SH y n es 0;

cuando B es SH y X es SH, n no es O;

y donde la porción tiol está en la forma reducida.

2. El reactivo de la reivindicación 1, donde el péptido se selecciona del grupo que consiste en PLYKKIIKKLLES, PLY.Orn.Orn.II.Orn.Orn.LLES, QAPLYKKIIKKLLES y KKIIKKLLES.

3. Un reactivo que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 20.000 Dalton, que comprende un ligador polivalente ligado covalentemente a una multiplicidad de péptidos del factor plaquetario 4 o fragmentos de éste para formar un multímero, estando también dicho ligador unido covalentemente a una multiplicidad de porciones de unión al radiomarcador.

4. El reactivo de la reivindicación 3 donde el ligador se selecciona del grupo que consiste en bis-succinimidilmetil-
éter, ácido 4-(2,2-dimetilacetil)benzoico, ácido dietilentriaminopentaacético, tris(succinimidiletil)amina, tris-acetami-
doetilamina y 1,10-bisacetamido-4,7-dioxa-decano, un derivado de bis-succinimidilmetiléter, un derivado del ácido 4-(2,2-dimetilacetil)benzoico, un derivado del ácido dietilentriaminopentaacético, un derivado de tris(succinimidiletil)amina, un derivado de tris-acetamidoetilamina y un derivado de l,10-bisacetamido-4,7-dioxa-decano.

5. El reactivo de la reivindicación 3, que tiene la fórmula seleccionada del grupo que consiste en:

: (acetil.CC_{Acm}GC_{Acm}PLYKKIIKKLLES)_{2}-BSME; y

: (acetil.CKKC_{Acm}GC_{Acm}PLYKKIIKKLLES)_{2}-BSME.

6. Un complejo formado haciendo reaccionar el reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con tecnecio 99 m en presencia de un reductor.

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7. El complejo de la reivindicación 6, donde el reductor se selecciona del grupo que consiste en un ion ditionito, un ion estannoso o un ion ferroso.

8. Un complejo formado marcando el reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con tecnecio 99 m por intercambio de ligandos de un complejo de tecnecio 99 m reducido previamente.

9. Un juego de reactivos para elaborar una preparación radiofarmacéutica, donde dicho juego de reactivos comprende un vial sellado que contiene una cantidad predeterminada del reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y una cantidad suficiente de un reductor para marcar el reactivo con tecnecio 99 m.

10. El uso de un reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para elaborar una preparación farmacéutica para obtener imágenes de un sitio de infección o inflamación dentro del organismo de un mamífero.

11. Un proceso de preparación del reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 mediante síntesis química in vitro.

12. Un método de marcado del reactivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende el paso de hacer reaccionar el reactivo con Tc 99 m en presencia de un reductor.

13. El método de la reivindicación 12, donde el reductor se selecciona del grupo que consiste en un ion ditionito, un ion estannoso y un ion ferroso.