ES2265162T3 - Carbohidrato glucopeptido de antigeno multiple, vacuna que comprende el mismo y su utilizacion. - Google Patents

Carbohidrato glucopeptido de antigeno multiple, vacuna que comprende el mismo y su utilizacion. Download PDF

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Abstract

Un carbohidrato glucopeptídico conjugado que comprende: un soporte que contiene una polilisina dendrimérica, que permite la unión covalente de múltiples epitopos, al menos un péptido que comprenda un epitopo T o varios epitopos T, idénticos o diferentes, al menos una porción de carbohidrato o un derivado del mismo, que contenga epitopo B, que no sea un sialosido, o varios epitopos idénticos o diferentes. Utilización de este conjugado para inducir una respuesta inmunológica.

Description

Carbohidrato glucopéptido de antígeno múltiple, vacuna que comprende el mismo y su utilización.
Antecedentes técnicos 1. Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la inmunoterapia y más particularmente a un glucoconjugado, a una composición y a una vacuna que comprende la misma y a la utilización de la misma para potenciar la respuesta inmunitaria y de forma acusada en la terapia del cáncer y en la terapéutica de la infección causada por un agente patógeno contra el que es necesaria una respuesta inmunitaria humoral o celular. La invención se refiere también a un kit para diagnóstico y al diagnóstico del cáncer.
2. Técnica anterior/bibliografía aplicable
Como resultado de la glucosilación anormal, los antígenos de carbohidratos asociados al cáncer están expuestos en la superficie de las células tumorales mientras que están ocultos en las células normales (Ref. 1). Los avances recientes en inmunología y en la identificación de antígenos tumorales específicos han renovado el interés para el desarrollo de vacunas contra el cáncer, y estos epítopos glucosídicos de linfocitos B expuestos se han considerado dianas atractivas para la inmunoterapia denominada "inmunoterapia activa específica" (ASI) por Longenecker (Ref. 2). Este método implica la inmunización con un antígeno definido para provocar una respuesta inmunitaria específica a este antígeno y podría representar una alternativa a las terapias convencionales contra el cáncer.
Entre el gran número de marcadores tumorales conocidos, los antígenos Tn (a-GalNAc-Ser/Thr), el T* (b-Gal-
(1 \rightarrow 3)-a-GalNAc-Ser/Thr) y el sialosil-Tn (a-NeuAc-(2 \rightarrow 6)-a-GalNAc-Ser/Thr) se han estudiado extensamente ya que son expresados en glucoproteínas de tipo mucinas por la mayoría de los adenocarcinomas (Ref. 3). De hecho, varios estudios han demostrado alguna protección contra los tumores después de la inmunización con estos antígenos glucosídicos, en estudios experimentales o clínicos. Estos carbohidratos asociados al tumor son marcadores apropiados para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer (Ref. 34). Utilizando glóbulos rojos desialilados, que son ricos en determinantes T y Tn, Springer observó una protección eficaz de larga duración contra la recaída del carcinoma de mama humano (Ref. 3c, Ref. 4). Otro grupo investigó el potencial de ASI con mucina submaxilar bovina desialilada (d-OSM) que contiene gran densidad de epítopo Tn; sus estudios demostraron que este antígeno proporcionaba una buena protección y una supervivencia de larga duración en los ratones con carcinoma de mama (Ref. 5). Parcialmente d-OSM también proporcionó protección eficaz contra el carcinoma de colon humano (Ref. 6). Ratcliffe et al. fueron los primeros en utilizar un antígeno asociado al tumor sintético, un conjugado de antígeno T-proteína, para estimular una respuesta inmunitaria eficaz en conejos (Ref. 7). A continuación Longenecker estudió extensamente conjugados de hapteno carbohidrato sintéticos similares y observó que producen un aumento de supervivencia de los ratones injertados con células de carcinoma de mama (Ref. 8) y de pacientes con cánceres de ovario (Ref. 9). Estudios similares del mismo grupo han demostrado además un aumento de la protección de los pacientes que padecen de cáncer de mama (Ref. 10) o melanoma (Ref. 11) después de la administración respectiva de conjugados de proteína con sialosil Tn o con gangliósido GM2. Por otra parte, Toyokuni et al. generó una respuesta antitumoral del anticuerpo en ratones después de la inmunización con un antígeno Tn acoplado a OSA (albúmina de suero bovino) o a un lipopéptido sintético (Ref. 12). Este último resultado era interesante ya que era el primer ejemplo de un antígeno carbohidrato sintético pequeño que genera una respuesta inmunitaria contra un antígeno carbohidrato asociado al tumor, sin la utilización de un vehículo macromolecular o adyuvantes.
Estos estudios sugirieron que los antígenos carbohidratos son candidatos apropiados para el desarrollo de la vacuna antitumoral. Sin embargo, los antígenos de carbohidrato no poseen epítopo de linfocito T y por lo tanto provocan solamente una respuesta débil del anticuerpo independiente del linfocito T. Se han explorado varios métodos para aumentar la inmunogenicidad de dichos carbohidratos. La utilización de material biológico que expresa grupos de antígenos en un eje central proteico (como glóbulos rojos desialilados u OSM es una posibilidad). Pero el método más ampliamente utilizado consiste en conjugar el carbohidrato con una proteína portadora, tal como albúmina de suero bovina (BSA) o la hemocianina de la lapa californiana (KLH).
Aunque estos inmunógenos han demostrado ser algo prometedores, los vehículos proteicos presentan mayores inconvenientes. El epítopo injertado representa solamente una pequeña parte del conjugado total y está distribuido al azar en la superficie del vehículo. Por consiguiente, las respuestas inmunitarias a la molécula del vehículo pueden producir un nivel bajo de anticuerpos deseados en comparación con la cantidad total de anticuerpos producidos. Además, estos conjugados presentan ambigüedad tanto en la composición como en la estructura y no siempre producen respuesta inmunitaria reproducible. Los avances recientes en la síntesis total de los oligosacáridos expresados por las células tumorales (Ref. 35, Ref. 36) abren nuevas posibilidades para dicho logro. Sin embargo, las moléculas hapténicas tales como los carbohidratos requieren su asociación en estructuras más complejas para estimular las respuestas inmunitarias. La utilización de conjugados proteicos tradicionales aumenta el problema de la supresión específica del hapteno (Ref. 37, Ref. 38) y su composición química escasamente definida y la estructura puede limitar su
eficacia.
\newpage
Hasta ahora, como para las estructuras definidas químicamente, se han utilizado ampliamente ejes centrales de polilisina dendrimérica, que se describirán con más detalle después en la presente memoria, para presentar péptidos (Ref. 14). Sin embargo, según nuestros conocimientos, existe únicamente un intento preliminar de su utilización para presentar carbohidratos al sistema inmunitario (Ref. 16). Esta última referencia da a conocer la síntesis de tres péptidos de antígeno múltiple sialilados con epítopos de linfocito T toxina del tétanos. Sin embargo, se obtuvo únicamente una respuesta contra el epítopo de linfocito T, pero no contra el epítopo de linfocito B. Una estrategia similar también se publicó recientemente (Ref. 17) donde los autores acoplaron mezclas de polisacáridos naturales obtenidos de Streptococcus y Saccharomyces para un sistema peptídico antigénico múltiple.
Por lo tanto, existe todavía necesidad de un nuevo conjugado que solucione los inconvenientes mencionados anteriormente de las construcciones de la técnica anterior que presenta una estructura definida químicamente, que sea capaz de estimular tanto la respuesta del anticuerpo como la respuesta de T cuando se administra a un cuerpo humano o animal, incluyendo a la vez las respuestas inmunitarias indeseables.
Sumario de la invención/formas de realización preferidas
Por consiguiente, la presente invención se refiere generalmente a un conjugado de carbohidrato péptido que comprende:
un vehículo que comprende una poli-lisina dendrimérica que facilita epítopos múltiples que están unidos por enlaces covalentes a ésta,
por lo menos un péptido que comprende un epítopo T o varios epítopos T idénticos o diferentes,
por lo menos un epítopo B que contiene un grupo carbohidrato, con la condición de que no sea un sialósido, o varios epítopos B idénticos o diferentes.
El péptido que comprende el o los epítopo(s) T puede estar unido a una lisina de dicho vehículo, como el o los epítopo(s) B que contiene(n) el grupo carbohidrato.
Este método de presentación de epítopos se denomina en la presente memoria Glucopéptido Antígeno Múltiple (MAG). El conjugado de la presente invención es especialmente útil para potenciar la respuesta del anticuerpo en un cuerpo humano o animal al que se ha administrado y en particular como vacuna.
Además, dado que un glucopéptido ligado al O antigénico múltiple (MAG), según la presente invención, que lleva por ejemplo el antígeno Tn del carbohidrato asociado a un epítopo de linfocito T CD4^{+} se demostró que era capaz de producir anticuerpos de IgG anti-Tn que reconocen líneas celulares tumorales humanas, según la presente invención también se refiere a una composición capaz de aumentar la supervivencia de un ser humano o animal con tumor. Un protocolo de inmunización terapéutico realizado con este inmunógeno completamente sintético aumentó la supervivencia de los ratones con tumor.
Más particularmente la presente invención se refiere a un conjugado de carbohidrato péptido que comprende:
-
por lo menos 3 restos de lisina unidos por enlaces covalentes entre sí,
-
por lo menos un péptido que comprende un epítopo T unido a un resto de lisina, y
-
por lo menos un epítopo B que contiene un grupo carbohidrato, opcionalmente sustituido, unido por enlace covalente al terminal de dicho péptido opuesto a la lisina, y con la condición de que dicho grupo carbohidrato no sea un radical sialósido.
Según otra forma de realización de la invención, el conjugado comprende:
-
por lo menos un péptido que comprende un epítopo T, o varios epítopos T idénticos o diferentes, y
-
por lo menos un grupo carbohidrato, o un derivado del mismo, que contiene el epítopo B, con la condición de que no sea sialósido o varios epítopos idénticos o diferentes.
Otro objeto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la presente invención.
Un objeto adicional de la presente invención es una vacuna que comprende el conjugado según la presente invención.
Un objetivo más todavía de la presente invención consiste en potenciar la respuesta inmunitaria de un cuerpo humano o animal, en particular las respuestas de linfocitos B y/o T, en la que el conjugado según la presente invención debe administrarse a dicho cuerpo humano o animal.
Otro objeto de la presente invención consiste en una utilización para provocar respuestas de los linfocitos B contra epítopos sacarídicos en un cuerpo humano o animal, en la que el conjugado según la invención debe administrarse a dicho cuerpo humano o animal.
Un objeto adicional todavía de la presente invención consiste en la utilización para la vacunación de un cuerpo humano o animal en la que el conjugado según la presente invención debe administrarse a dicho cuerpo humano o animal.
Otro objeto de la presente invención consiste en un kit de diagnóstico que comprende anticuerpos específicos contra el antígeno producidos mediante inmunización de un cuerpo humano o animal con una composición según la presente invención.
Un objeto adicional de la presente invención consiste en un diagnóstico del cáncer en el que una muestra biológica se pone en contacto con por lo menos uno de estos anticuerpos y en el que se determina la formación de complejos entre este anticuerpo y las moléculas comprendidas en dicha muestra.
Un objeto adicional todavía consiste en una composición inmunógena como la descrita anteriormente, capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra una infección vírica producida por un patógeno tal como el virus de la hepatitis, VIH o VMC.
La presente invención se describirá a continuación con detalle en la descripción siguiente con referencia a los dibujos siguientes.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una representación esquemática de compuestos MAG (B4-T4-M, B8-T8-M, B2-T2-M y B4-T4-M (con diferente organización de epítopos T y B) (a a d), tri-Tn(e) y hexa-Tn(f) según la presente invención.
La Figura 2 representa el antígeno Tn y sus derivados.
La Figura 3 presenta el reconocimiento de B4-T4-M por dos anticuerpos monoclonales anti-Tn.
La Figura 4a representa la antigenicidad T de B4-T4-M in vitro.
La Figura 4b ilustra la respuesta anti-T in vivo de B4-T4-M.
Las Figuras 5a, 5b y 5c presentan la producción en ratones BALB/c, SJL/J y DBA/1, respectivamente, de anticuerpo anti-Tn por el compuesto Tn-MAG.
La Figura 6 ilustra la producción en ratones BALB/c de respuestas del anticuerpo por el antígeno Tn que contiene el compuesto Tn-MAG y el epítopo T, CD4^{+} del poliovirus.
La Figura 7 ilustra los resultados de la protección producida con el compuesto Tn-MAG contra el adenocarcinoma TA3/Ha murino que expresa el antígeno Tn en ratones BALB/c inyectados para la prueba de provocación.
Las Figuras 8A y 8B ilustran los resultados de la inmunización de ratones Balb/C con el péptido TT1 o glucopéptido B-T-TT_{1}, respectivamente cebados con CFA (fig. 8A) y con alúmina (fig. 8B).
Descripción detallada Definiciones y abreviaturas Antígenos
Las expresiones antígeno B carbohidrato, epítopo B, antígeno de linfocito B, epítopo de linfocito B se utilizan en la presente memoria para designar en general antígenos glucosídicos capaces de provocar una respuesta del linfocito B, estando constituidos los antígenos por sialósidos que están excluidos.
Antígeno T o epítopo T, antígeno de linfocito T, epítopo de linfocito T significa un antígeno generalmente de naturaleza peptídica capaz de provocar una respuesta del linfocito T.
Los compuestos sintéticos B-T, M, B4-M, T4-M y B4-T4-M se utilizaron también como antígenos (véase la Tabla más adelante).
\newpage
La abreviatura M tal como se utiliza en la presente memoria es un ejemplo de MAP (péptido antígeno múltiple) y designa la estructura siguiente:
100
Cuando procedía, en la presente memoria se utilizó el código universal, de una letra para los aminoácidos (K para lisina, etc.).
Otras abreviaturas se utilizan también en la presente invención:
BSA, albúmina de suero bovino; OSA, albúmina de suero ovino; OVA, ovoalbúmina, OSM, mucina submaxilar ovina; d-OSM, mucina submaxilar ovina desialilada; ES MS, espectrometría de masas con electroatomización; Fmoc, fluoren-9-il-metoxicarbonilo; PBS, solución salina tamponada con fosfato.
La expresión "respuesta al anticuerpo", "respuesta a B o al linfocito B" se utilizan indistintamente en la presente memoria. Lo mismo se aplica a "respuesta celular", "respuesta a T o al linfocito T".
La presente invención se refiere en su aspecto principal a un conjugado de carbohidrato péptido que comprende:
un vehículo apropiado a base de poli-lisina dendrimérica que permite que los epítopos múltiples se unan por enlace covalente a ésta,
por lo menos un péptido que comprende un epítopo T o varios epítopo T idénticos o diferentes,
por lo menos un epítopo B que contiene un grupo carbohidrato, con la condición de que no sea un sialósido o varios epítopos B idénticos o diferentes.
Varios epítopos T o B idénticos significa entre dos y ocho del mismo epítopo.
Varios epítopos T diferentes significan entre dos y ocho epítopos T de diferentes orígenes.
Varios epítopos B diferentes significan entre dos y ocho epítopos B de diferentes orígenes.
El núcleo de poli-lisina del presente conjugado se denomina dendrímero porque puede estar representado (Figura 1) como una estrella con ramas múltiples todas sustancialmente idénticas.
Como se puso de manifiesto al principio, el sistema múltiple de péptido antígeno ha sido descrito en 1988 por Tam (Ref. 13) que está basado también en determinada estructura dendrimérica en la que el antígeno peptídico está conjugado covalentemente con las ramas de la última.
Ejemplos de vehículos adecuados comprenden los que presentan una estructura basada en un núcleo de poli-lisina que forma una estrella de ramas múltiples, tal como, por ejemplo una estrella de 8 ó 4 ramas.
Por lo tanto, la presente invención en una de sus formas de realización preferidas, se refiere a un conjugado que comprende una estructura dendrítica basada en un núcleo de polilisina que forma una estrella de 4 puntas, con un epítopo T unido por enlace covalente a cada una de las ramas y asociado a un grupo carbohidrato (con la condición de que no sea un radical sialósido) que contiene un epítopo B.
Según una forma de realización adicional preferida de la presente invención, el glucopéptido antígeno múltiple (MAG) que forma el conjugado según la presente invención comprende por lo menos 3 lisinas y hasta 15 restos de lisina unidos por enlace covalente entre sí. Más preferentemente el presente conjugado comprende 3 lisinas.
En una forma de realización preferida, al terminal NH_{2} de cada resto de lisina se une por lo menos un péptido que comprende un epítopo T unido a una lisina y por lo menos un resto de carbohidrato, que no es un sialósido, óptimamente sustituido, unido por enlace covalente al terminal de dicho péptido opuesto a la lisina y que forma un epítopo B.
En otra forma de realización preferida, al terminal NH_{2} de cada resto de lisina se une por lo menos un resto de carbohidrato, que no es un sialósido, opcionalmente sustituido y que forma un epítopo B unido a una lisina y por lo menos un péptido que comprende un epítopo T unido por enlace covalente al terminal de dicho carbohidrato opuesto a la lisina.
La estructura de MAG referida en la presente memoria se entenderá mejor por referencia a la Fig. 1.
En la Fig. 1 están representados esquemáticamente los ejemplos de una estrella de 4 a 8 ramas que comprende de 3 a 7 lisinas que llevan 4 a 8 grupos amino unidos a los epítopos deseados (epítopos B, opcionalmente sustituidos con un péptido y epítopos T). Esta estructura proporciona una gran densidad de los antígenos en la superficie del núcleo de lisina.
Además esta estructura ofrece varias ventajas. En primer lugar, el contenido en carbohidratos es mucho mayor en el sistema MAG (normalmente más del 90%) que en los conjugados proteicos tradicionales. Esta estructura de gran densidad de antígenos glucopéptidos producen respuestas del anticuerpo mayores confirmando la observación anterior que compara un sistema MAP con los mismos antígenos unidos por enlace covalente a una proteína portadora (Ref. 13b, Ref. 14).
Una ventaja adicional del MAG es que la matriz del núcleo, que representa una fracción del montaje total presenta baja inmunogenicidad, impidiendo de este modo respuestas inmunitarias indeseables (Ref. 13a). Otra ventaja del presente montaje es que el inmunógeno sintético resultante presenta una estructura química bien definida.
La presencia tanto de epítopos de carbohidrato B como de epítopos T en el glucoconjugado de la presente invención hace a este último un inmunógeno eficaz como se demostrará después en el apartado experimental.
El grupo carbohidrato, que contiene el epítopo B del conjugado según la presente invención, puede originarse, por ejemplo, a partir de antígenos glucosídicos del tumor (cáncer) de:
-
la clase de glucolípidos, incluyendo glucolípidos ácidos tales como, por ejemplo, gangliósidos GD2, GD3 y GM3 (melanoma) y glucolípidos neutros, tales como, por ejemplo, antígenos de Lewis^{y} (Le^{y}) (mama, próstata, ovario) y el Globo H (mama, próstata, ovario). Los derivados sialilados que pertenecen a esta clase están excluidos.
-
la clase de péptidos (o aminoácidos) de O-glucosilo tales como, por ejemplo, el antígeno Tn (\alphaGalNAc-Ser o \alphaGal NAc-Thr), antígeno T* (\beta-Gal-(1-3)-\alpha-GalNac-Ser o \betaGal(1-3)\alphaGal-NAc-Thr), dos marcadores tumorales frecuentemente presentes en carcinomas pero normalmente no en tejidos normales [Springer G. F. Science 224, 1198-1206 (1984)] (ovario, mama, pulmón) o di-Tn (\alpha GalNAc-Ser/Thr)_{2}, tri-Tn(\alpha GalNac-Ser/Thr)_{3} o hexa-Tn(\alphaGalNAc-Ser/Thr)_{6}.
El epítopo B del conjugado según la presente invención puede originarse también a partir de polisacáridos bacterianos capsulares de, por ejemplo, Neisseria meningitis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, y del grupo Streptococcus, a excepción de los polisacáridos sialilados.
Los polisacáridos son restos de carbohidrato obtenidos mediante procesos de síntesis.
El epítopo B del presente conjugado puede también ser de origen micótico, tal como por ejemplo, el aislado de la levadura Saccharomyces.
Los epítopos B del conjugado según la presente invención son preferentemente marcadores tumorales, tales como, por ejemplo, los antígenos Tn y T*.
El grupo carbohidrato preferido que forma el epítopo B del conjugado según la presente invención puede estar compuesto por un resto de galactosilo, o un derivado del mismo, que no esté sialilado.
Puede seleccionarse del grupo constituido por los antígenos Tn, di-Tn, tri-Tn, hexa-Tn o T*.
De este modo en una de sus formas de realización preferida la invención se refiere a un conjugado de carbohidrato péptido que comprende:
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por lo menos 3 restos de lisina unidos por enlace covalente entre sí,
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por lo menos un péptido que comprende un epítopo T unido a un resto de lisina, y
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por lo menos un resto de galactosilo, opcionalmente sustituido, unido por enlace covalente a dicho péptido y que forma el epítopo B con la condición de que dicho grupo carbohidrato no sea un radical sialó- sido.
En un aspecto relacionado de esta forma de realización el resto galactosilo está sustituido por otro resto glicosilo.
En un aspecto relacionado, el conjugado de la presente invención comprende 3 restos de lisina, por lo menos 4 epítopos de tipo T, que pueden ser iguales o diferentes unidos a los terminales NH_{2} de 2 de los restos de lisina y 4 restos \alpha-galactosil-N-acetil-serina.
El grupo carbohidrato del conjugado de la presente invención puede estar injertado además en la estructura dendrimérica en combinación con uno o más epítopos de las células CD3* peptídicos tumorales reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos para el tumor. Estos epítopos de linfocitos T CD3^{+} peptídicos reconocidos como marcadores tumorales pueden seleccionarse en el grupo constituido por:
Péptidos MUC-1 (páncreas, mama)
MAGE 1 y 3 (melanoma, pulmón) (T. Boon et al. (1995). Immunology Today, vol. 16 nº 7, págs. 334-336)
pme117/gp 100 (melanoma)
Tirosinasa (melanoma)
BAGE (melanoma)
GAGE (melanoma)
LB-33-B (melanoma)
CDK4
p185^{HER} (mama, ovario)
CEA
MART1/Melan-A (melanoma)
o seleccionarse en el grupo constituido por los antígenos tumorales descritos en A. Van Pel et al. (1995) Immunological Reviews nº 145, págs. 229-250 o en P. G. Coulie (1995), Stem Cells, 13, págs. 393-403.
Como se mencionó al principio, en el conjugado de la presente invención un epítopo T CD4^{+} está conjugado con un epítopo B de carbohidrato descrito anteriormente para provocar una respuesta inmunitaria eficaz.
Dicho epítopo puede comprender entre casi 5 y 50 aminoácidos.
Uno de tales epítopos T preferidos es el epítopo T, CD4^{+} que es el péptido sintético que corresponde a la secuencia 103 a 115 de la proteína VP1 del poliovirus tipo 1 o alternativamente puede ser un péptido que comprende el epítopo T, CD4^{+} seleccionado entre el grupo constituido por:
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fragmentos de la toxina del tétanos tales como, por ejemplo:
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la secuencia 830 a 844 de la toxina del tétanos (QYIKANSKFIGITEL)
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la secuencia 947 a 967 de la toxina del tétanos (FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)
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la secuencia 1273 a 1284 de la toxina del tétanos (GQIGNDPNRDIL)
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fragmentos del polisacárido 4 de tipo pneumocócico y conjugados toxoides oligosacáridos del tétanos como describe C. C. A. M. Peeters (1991) en el Journal of Immunology, 146, 4309-4314.
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liposacáridos meningocócicos como los descritos por A. F. M. Verheul (1991) en Detection and Immunity, vol. 59, nº 10, págs. 3566-3573.
Estos epítopos T peptídicos se unen típicamente a una multitud de MHC (complejo de histocompatibilidad principal) humanos y moléculas murinas de clase II que impiden en consecuencia los problemas de restricción encontrados en la respuesta celular a T, CD4^{+}, asociada al polimorfismo de las moléculas MHC que existen entre individuos. Además la utilización de los péptidos de la toxina del tétanos deberían aumentar la inmunogenicidad de los antígenos presentes en el conjugado de la presente invención, como resultado de la vacunación de numerosos individuos con la vacuna contra el tétanos.
Según otra forma de realización de la presente invención, el conjugado comprende: por lo menos un péptido que comprende un epítopo T, o varios epítopos T idénticos o diferentes, y
por lo menos un grupo carbohidrato, o un derivado del mismo, que contiene el epítopo B, con la condición de que no sea sialósido, o varios epítopos idénticos o diferentes.
Dicho conjugado puede ser Tn3-T, en el que T puede ser un poliovirus o el antígeno del tétanos. Puede ser también Tn6-T, en el que T es un antígeno de poliovirus con la secuencia siguiente: KFLAVWKITYKDT.
La fórmula de Tn6-T es por lo tanto:
(Tn_{3}-G)_{2} – KFLAVWKITYKDT, en la que Tn_{3} es un trímero lineal de (\alpha GalNAc Ser) o (\alpha GalNAc Thr).
Éstos pueden obtenerse por síntesis peptídica; en la que se crea un enlace peptídico entre la serina glucosilada, o la treonina, y el péptido T.
Como se hizo constar al principio la invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un conjugado según la presente invención. Dicha composición comprende una cantidad eficaz del presente conjugado, por ejemplo, en un vehículo farmacéuticamente aceptable y puede ser de forma líquida o emulsión, en presencia o no de un adyuvante (incluyendo el hidróxido de aluminio y las citocinas). La vía de administración de dicha composición puede ser cualquiera de las vías utilizadas habitualmente (incluyendo la administración intratumoral tal como la inyección). Dicha composición inmunógena, que comprende por lo menos un conjugado de péptido carbohidrato, en la que dicho conjugado comprende varios antígenos de carbohidrato puede utilizarse para producir una inmunicidad antitumoral más eficaz contra los cánceres.
La cantidad de conjugado puede estar comprendida entre 10 \mug y 1 ng.
La presente invención se refiere también a una vacuna que comprende un conjugado según la presente invención.
Un objeto adicional de la presente invención consiste en una utilización para potenciar la respuesta inmunitaria de un cuerpo humano o animal, en particular la respuesta mediada por linfocitos T y/o B, en particular contra bacterias, en la que el conjugado según la presente invención debe administrarse a dicho cuerpo humano o animal.
Otro objeto adicional todavía de la presente invención se refiere a una utilización para provocar una respuesta de los linfocitos B en un cuerpo humano o animal, en la que debe administrarse por lo menos un conjugado según la invención.
La invención se refiere también a la utilización para provocar una respuesta de linfocitos B en un huésped caracterizada porque en dicho huésped debe administrarse por lo menos un conjugado de carbohidrato péptido que
comprende:
por lo menos 3 restos de lisina unidos por enlace covalente entre sí,
por lo menos un péptido que comprende un epítopo T unido a un resto de lisina, y
por lo menos un grupo carbohidrato opcionalmente sustituido, que no sea un sialósido.
Otro objeto de la presente invención se refiere a la vacunación de un cuerpo humano o animal en la que debe administrarse el conjugado según la presente invención a dicho cuerpo humano o animal.
Un objeto adicional aún de la presente invención consiste en un kit de diagnóstico que comprende anticuerpos específicos contra el antígeno producidos por inmunización de un cuerpo humano o animal con una composición según la presente invención.
Dichos anticuerpos se consideran también como materias de la presente invención. Pueden utilizarse en un método de diagnóstico del cáncer que comprende poner en contacto por lo menos uno de estos anticuerpos con una muestra biológica y determinar la formación de los complejos entre este anticuerpo y las moléculas comprendidas en esta muestra.
La presente invención se ilustrará a continuación con más detalle mediante los ejemplos siguientes.
Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis del glucoconjugado según la invención
La estrategia para la construcción del conjugado MAG supuso en primer lugar la síntesis del antígeno Tn que representa el epítopo del linfocito B. Este marcador tumoral glucosídico se conjugó a continuación con un núcleo de poli-lisina (M) junto con el epítopo del linfocito T, CD4^{+} peptídico, dando la construcción completa B4-T4-M. Además, se sintetizaron los compuestos de referencia que son necesarios para los ensayos inmunológicos (B, T, B-T, B4-M, T4-M, M).
La síntesis del antígeno 2 de Tn (Figura 2) se realizó por los métodos clásicos (Ref. 19, Ref. 20) partiendo del tri-O-acetil-D-galactal (Ref. 21). Se utilizó el éster terc-butílico de N-(fluorenilmetoxicarbonil)-L-serina (Ref. 22) para la reacción de Koenigs-Knorr con el cloruro de 3,4,6-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxi-b-D-galactopiranosilo (Ref. 23), proporcionando el derivado 1 protegido. La desprotección final del acetilo y del éster t-butílico proporcionó el antígeno Tn 2 protegido apropiadamente para la síntesis del péptido.
Se montó el B4-T4-M 4 por la metodología de péptido en fase sólida convencional (Ref. 40) utilizando la química del Fmoc que es compatible con la síntesis del glucopéptido. Después de la unión del espaciador \beta-alanil en la resina de Wang, se construyó el núcleo de lisina acoplando sucesivamente dos niveles de FmocLys(Fmoc)OH, proporcionando cuatro grupos amino (Ref. 13b). El núcleo de lisina se alargó más por los aminoácidos protegidos de forma apropiada de la secuencia del epítopo T (KLFAVWKITYKDT) del poliovirus, añadiéndose sucesivamente cuatro copias del mismo aminoácido. Por último se incorporó 2 al péptido dendrimérico como bloque de construcción.
Fue interesante la incorporación del derivado 2 del antígeno Tn que pudo conseguirse con el azúcar totalmente desprotegido. Esto presenta muchas ventajas ya que impide las reacciones laterales eventuales (racemización y/o b-eliminación) asociadas a la desacetilación final del resto de azúcar. Unos pocos ejemplos de la utilización de unidades glucosídicas no protegidas han sido ya publicados (Ref. 24). Una vez terminada la síntesis, se liberó el MAG 4 de la resina con ácido trifluoroacético acuoso (95%) y las cadenas laterales peptídicas se desprotegieron simultáneamente. No se observa normalmente ninguna escisión glucosídica durante un tiempo de reacción de 1,5 horas (Ref. 25). Se siguió un procedimiento similar para los compuestos de referencia. Todos los péptidos y glucopéptidos se caracterizaron por el análisis de aminoácidos y espectrometría de masas con electroatomización.
Métodos generales
Para la síntesis de 2, se adquirieron reactivos en Aldrich o Sigma. Todos los disolventes eran de alta calidad y anhidros. Se destiló CH_{2}Cl_{2} sobre CaH_{2} y tolueno sobre sodio con benzofenona, antes de su utilización. Para la síntesis de péptidos, se adquirieron derivados de aminoácidos protegidos con Fmoc y resina de Wang en Bachem o Novabiochem. La cadena lateral de aminoácidos se protegió mediante un grupo t-butilo excepto para los restos de triptófano y lisina del epítopo T que se protegieron mediante un grupo t-butiloxicarbonilo (Boc). La DMF y el acetonitrilo para la HPLC se adquirieron en Merck. Se purificaron los compuestos finales por cromatografía de alta resolución en fase inversa (HPLC) utilizando un sistema de bombeo de Perkin-Elmer con un detector UV (230 ó 280 nm). Se utilizó una columna (250 \times 10 mm) de Nucleosil C_{18} (5 mm, 300 \ring{A}) se eluyeron con un gradiente de MeCN/tampón de ácido trifluoroacético al 0,1% durante 20 min. (caudal 6 ml/min). Los espectros ^{1}H RMN (300,134 MHz, sal sódica del ácido 3-(trimetilsilil)propiónico como patrón para los espectros en D_{2}O) se registraron en un instrumento de Broker. Se midieron los espectros de masas mediante bombardeo con átomos rápidos o por electroatomización. Los análisis de aminoácidos se obtuvieron utilizando un analizador Beckman 6300, tras la hidrólisis de los péptidos con HCl 6 N (se añadió fenol al 0,2% cuando el péptido contiene un resto de tirosina) a 110ºC en tubos de vidrio sellados durante 20 h.
Procedimiento general de síntesis en fase sólida
La síntesis de péptidos y glucopéptidos en fase sólida se realizó en manual utilizando el protocolo de la química de Fmoc normalizado (Ref. 40) en una resina de poliestireno con grupos funcionales de alcohol p-benciloxibencílico (resina de Wang). A excepción del resto de b-alanina C-terminal, los aminoácidos N^{a}-Fmoc (que llevan grupos protectores de la cadena lateral estándar) y el bloque 2 de construcción glucosilado (3 equiv.) se incorporaron a la cadena peptídica utilizando TBTU como agente de activación y DMF como disolvente. Todos los acoplamientos se controlaron mediante la prueba de Kaiser (Ref. 29) y se completaron normalmente en 1 h. Todas las escisiones de Fmoc se realizaron mediante el tratamiento de la resina con piperidina al 20% en DMF. Después de cada desprotección, la resina se lavó sucesivamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y DMF. Al final de la síntesis, la resina se lavó extensamente con DMF y CH_{2}Cl_{2}, se secó y se trató con una solución acuosa de TFA durante 2 h. Tras la filtración de la resina, se concentró la solución y se precipitó el producto en bruto con éter dietílico. Se filtró el precipitado, se disolvió en agua y se liofilizó. Se purificaron los péptidos en HPLC de fase inversa (las condiciones de elución se indican a continuación, para cada compuesto) y se caracterizaron mediante análisis de aminoácidos y espectrometría de masas con electroatomización.
N^{a}-(fluoren-9-ilmetoxicarbonil)-3-O-(2-acetamido-2-desoxi-a-D-galactopiranosil)-L-serina 2:
Se preparó el éster terc-butilico de N^{a}-(fluoren-9-ilmetoxicarbonil)-3-O-(2-acetamido-3,4,6-tri-O-acetil-2-desoxi-a-D-galactopiranosil)-L-serina 1 como se describió anteriormente (Ref. 23) por glucosilación del éster terc-butílico de N^{a}-(fluoren-9-ilmetoxicarbonil)-L-serina (Ref. 22) con cloruro de 3,4,6-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxi-b-D-galactopiranosilo (obtenido a partir del tri-O-acetil-D-galactal) (21) utilizando Ag_{2}CO_{3}/AgClO_{4} como catalizadores, seguido de reducción y acetilación de la posición 2 (Ref. 19). El éster t-butílico de 1 (2 g, 2,8 mmoles) se desprotegió a continuación en ácido fórmico (76 ml) (Ref. 20). Se agitó la solución durante 10 h. y se evaporó. Se disolvió el residuo en MeOH (200 ml) y los grupos acetilo del grupo azúcar se eliminaron añadiendo, gota a gota, una solución de MeONa al 1% (pH 11) (Ref. 46). Después de 15 h., se neutralizó el medio mediante una resina Dowex 50WX8 (H^{+}) y se purificó el producto final 2 en una columna (C_{18}) de fase inversa utilizando un gradiente de agua/MeCN: 1,27 g (rendimiento del 79%).
Compuestos de referencia
M: Las síntesis de MAG requieren una sustitución baja de la resina. Se hizo reaccionar el anhídrido simétrico preformado de N^{a}-Fmoc-bAla-OH (0,25 mmoles) (30) con la resina Wang (1 g, 0,96 mmoles/g) durante 1 h., proporcionando una funcionalización de aproximadamente 0,12 mmoles/g como se estimó por análisis UV de una muestra de resina (Ref. 31). Tras la acetilación de los grupos hidroxilo residuales por Ac_{2}O en DMF, se montó el núcleo de lisina por acoplamientos sucesivos de 0,48 y 0,96 mmoles de N^{a}-Fmoc-Lys-(Fmoc)-OH. La escisión del péptido de la resina se realizó mediante TFA/agua (95/5, 16 ml). La purificación del producto en bruto por HPLC (gradiente del 0% al 25%, tiempo de retención de 7,2 min.) proporcionó M (94 mg). ^{1}H-RMN (D_{2}O), d, 4,24, 4,03, 3,93 (3 CH a Lys), 3,54, 3,42 (CH_{2}-NH b-Ala), 3,22, 3 \cdot (CH_{2} e Lys), 2,62 (CH_{2}-COOH b-Ala), 1,97-1,85 (2 CH_{2} b Lys), 1,78-165 (2 CH_{2} d, CH_{2} b Lys), 1,58-1,3 (3 CH_{2} g, CH_{2} d Lys); ESMS: 473,2 (calc. 473,33).
T: La síntesis del epítopo T se ha realizado en 0,21 g de resina (0,15 mmoles) por el procedimiento general. La escisión del péptido fijado a la resina (TFA/agua/etanoditiol: 95/2,5/2,5, 45 ml) y purificación por HPLC (gradiente del 0% al 65%, tiempo de retención de 12,6 min.) proporcionó T (31 mg). FABMS: [M+H]^{+} 1613 (calc. 1611,9). Análisis de aminoácidos: Ala 1,16 (1), Asp 1,03 (1), Ile 0,96 (1), Leu 1,01 (1), Lys 2,92 (3), Phe 1 (1), Thr 1,84 (2), Tyr 0,99 (1), Val 0,94 (1).
B-T: El alargamiento adicional de la cadena del péptido T (0,22 g de resina, 0,14 mmoles, sintetizada como anteriormente) se consiguió con 2 como bloque de construcción. Se liberó el glucopéptido de la resina (TFA/agua/etanodi-
tiol: 92/2,5/2,5, 50 ml) y se purificó el producto en bruto por HPLC (gradiente del 10% al 60%, tiempo de retención 11,2 min.) proporcionando B-T (63 mg). ESMS: 1903 (calc. 1903,22). Análisis de aminoácidos: Ala 1 (1), Asp 1,05 (1), Ile 1,0 (1), Leu 1,05 (1), Lys 3,12 (3), Phe 1,05 (1), Ser 0,94 (1), Thr 1,97 (2), Tyr 1,06 (1), Val 1,0 (1).
B4-M: Se conjugó 2 con el núcleo (M) de polilisina sintetizado como se describió anteriormente (0,83 g de resina, 0,1 mmoles). Después de la escisión del glucopéptido de la resina (TFA/agua: 95/5, 25 ml) y purificación por HPLC (gradiente del 0% al 10%, tiempo de retención de 10,2 min.), se obtuvo B4-M (36 mg). ESMS: 1633,9 (calc. 1633,78). Análisis de aminoácidos: Lys 3 (3), Ser 4,06 (4).
T4-M: El núcleo M de lisina (0,25 g de resina, 0,03 mmoles, se sintetizó como anteriormente) se alargó más mediante la secuencia del epítopo T. La escisión del péptido de la resina (TFA/agua/etanoditiol: 95/2,5/2,5, 25 ml) y su purificación por HPLC (gradiente del 12% al 45%, tiempo de retención de 16,5 min) proporcionó T4-M (67 mg). ESMS: 6852,08 (calc. 6853,35). Análisis de aminoácidos: Ala 4 (4), Asp 4,4 (4), Ile 4 (4), Leu 4,1 (4), Lys 15,8 (15), Phe 4 (4), Thr 8,2 (8), Tyr 4,3 (4), Val 3,8 (4).
Glucopéptido B4-T4-M4 del antígeno múltiple
La síntesis de B4-T4-M se consiguió acoplando finalmente 2 a T4-M (0,25 g de resina, 0,03 mmoles) que se obtuvo como se describió anteriormente. La escisión del glucopéptido se realizó con TFA/agua/etanoditiol (95/2,5/2,5, 30 ml). Tras la purificación por HPLC (gradiente del 10% al 65%, 11,9 min. de tiempo de retención), se obtuvo el glucopéptido diana (25 mg). ES MS: 8014,09 (calc. 8014,45). Análisis de aminoácidos: Ala 4 (4), Asp 4,78 (4), Ile 4,09 (4), Leu 4,15 (4), Lys 16,31 (15), Phe 4 (4), Ser 3,81 (4), Thr 8,58 (8), Tyr 4,5 (4), Val 3,63 (4).
Ejemplo 2 Resultados inmunológicos: Antigenicidad e inmunogenicidad del epítopo T,CD4^{+} y del antígeno Tn en el glucoconjugado MAG según la invención Materiales y métodos Ratones
Se utilizaron ratones endogámicos hembra de seis a ocho semanas en todos los experimentos. Los ratones BALB/c eran de Iffa Credo (L'Abresle, Francia).
Ensayo de presentación del antígeno
Para los ensayos de respuesta a la dosis, se cultivaron 10^{5} hibridomas 45G10 de linfocitos T (específicos para el péptido 103 a 115 del poliovirus) por pocillo con 10^{5} células A20 (ATCC, TIB-208 Rockville, MD) con dosis de antígeno diferentes durante 24 h. en medio RPMI 1640 enriquecido con suero de ternero fetal al 10%, antibióticos, L-glutamina 2 mM, 2-mercaptoetanol 5 \times 10^{-5} M. Después de 24 h., se congelaron los sobrenadantes durante por lo menos 2 h. a -70ºC. Se cultivaron 10^{4} células/pocillo de la línea celular CTLL dependiente de IL-2 con 10 \mul de alícuota sobrenadante 0,2 ml de volumen final. Dos días después, se añadió [^{3}H] timidina (0,3 \muCi/pocillo: AS = 1 Ci/mmol) y se recogieron las células 18 h. después con un recogedor de células automático. La timidina incorporada se detectó por recuento de centelleo.
Ensayo de proliferación de linfocitos T
Se inmunizaron por vía subcutánea ratones con 10 \mug de compuestos T, B-T, T4-MAP, B4-MAO o B4-T4-MAP emulsionados en adyuvante completo de Freund. Diez días después, se eliminaron las células de ganglio linfático (LN) y se prepararon suspensiones de células aisladas y se cultivaron en medio HL-1 (Hycor) enriquecido con L-glutamina 2 mM. 10^{6} células LN/pocillo se colocaron en placas de microvaloración de 96 pocillos (TPP, Trasadingen, Suiza) con 10 \mug/ml del antígeno indicado o medio solo. Después de 3 días a 37ºC, se pulsaron las células durante 18 h. con ^{3}H-TdR (NEN, Boston, MA) y a continuación se recogieron en filtros de fibra de vidrio (Wallac Oy, Turku, Finlandia) con un recogedor de células automático. Se inhibió la radioactividad incorporada mediante recuento de centelleo. Los resultados se expresaron en media de cpm de los pocillos del cultivo por duplicado o triplicado. Las desviaciones estándar eran inferiores al 15% de la media.
Análisis ELISA
Se preparó OSM desialilado como se describe en una publicación anterior (Ref. 32) y fue proporcionado gentilmente por el Dr. A. Babino.
El a-GalNAc-Ser (denominado 3 anteriormente en el apartado de síntesis) se unió por enlace covalente a la ovoalbúmina (Sigma, St. Louis, MO) utilizando glutaraldehído (Sigma) según un procedimiento conocido (Ref. 33).
Se cubrieron placas de microvaloración de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 10 \mug por ml de diferente antígenos en tampón de carbonato 50 mM pH 9,6 y se incubaron toda la noche a 4ºC para d-OSM, ovoalbúmina y glucoconjugado Ova-Tn, o a 37ºC para péptidos y montajes de MAG. Después del lavado con PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, la 83D4 (IgM) o los mAb anti-Tn de MLS128 (IgG) se diluyeron en tampón (PBS más Tween 20 al 0,1%, BSA al 1%) y se colocaron en placas respectivamente a razón de 2,5 \mug/ml y 40 \mug/ml durante 1 hora a 37ºC. Después de tres lavados, los pocillos se trataron durante 1 hora a 37ºC con IgM anti-ratón de cabra o conjugado de peroxidasa anti-IgG (Sigma, St. Louis, Mo) y se añadió a continuación O-fenilendiamina/H_{2}O_{2} como sustrato. Se leyeron las placas fotométricamente a 492 nm en un autolector ELISA (Dynatech, Marnes la Coquette, Francia).
Análisis de respuesta del anticuerpo
Se inmunizaron por vía intraperitoneal ratones BALB/c (5 por grupo) con 20 \mug de compuesto T, B-T, T4-MAP, B4-MAP o B4-T4-MAP en hidróxido de aluminio (alúmina) los días 0, 20, 42 y 63. Se extrajo sangre a los ratones 10 días después de cada inmunización y se analizó en cada uno de los sueros recogidos por ELISA los anticuerpos anti-Tn como se describió anteriormente utilizando placas recubiertas con d-OSM. Se diluyeron los sueros en serie y se analizó el contenido en IgM anti-Tn e IgG. La referencia negativa consiste en suero de mosca natural diluido 100 veces. Se determinaron los títulos de anticuerpo del ELISA por análisis de regresión lineal representando la dilución frente a la absorbancia a 492 nm. Se calcularon los títulos que resultaron ser el log10 de la dilución mayor que proporcionó el doble de la absorbancia del suero normal diluido 1/100. Se proporcionaron los títulos como la media aritmética \pm S.D. del log10 de los títulos. El análisis estadístico se realizó por la prueba t de Student. Los valores P menores de 0,05 se consideraron significativos.
1) Antigenicidad in vitro de B4-T4-M
El reconocimiento in vitro del B4-T4-M por un hibridoma T específico para el epítopo T 103 a 115 del poliovirus se ensayó en presencia de linfoma B, A20, como célula presentadora del antígeno.
La Figura 4a ilustra la estimulación de un hibridoma T específico para el péptido T 103 a 115 del poliovirus con diferentes compuestos que contienen este péptido:
Se incubaron 10^{5} células de linfoma B,A20 (H-2^{d}) a 37ºC, en presencia de diferentes concentraciones de B, T, B-T, B4-MAP, T4-MAP y B4-T4-MAP se utilizaron para la estimulación de 10^{5} células de hibridoma T,45G10 (R. Lo-Man et al. (1994), 152: 5660-5669) específico para el péptido 103 a 115 del poliovirus y se restringieron por moléculas I-A^{d}. Después de 24 h., se tomaron muestras de los sobrenadantes del cultivo a continuación se analizó la IL-2 mediante la medición de la proliferación de la línea CTLL dependiente de IL-2. Después de tres días de cultivo, se midió la proliferación de las células CTLL mediante incorporación de timidina tritiada. Los resultados se expresan en cpm.
Como puede apreciarse en la Figura 4a, el compuesto B4-T4-MAP estimula en gran medida la producción de IL-2 por el hibridoma T específico para el epítopo T. En comparación con los demás compuestos T, B-T, T4-MAP que contienen también el epítopo T, la antigenicidad del conjugado de la presente invención, compuesto B4-T4-MAP, es 100 a 1.000 veces mayor. Los compuestos B y B4-MAP que están exentos de epítopo T del poliovirus no estimulan el hibridoma T.
A continuación se ensayó la inmunogenicidad T in vivo del epítopo T del conjugado de la presente invención, B4-T4-MAP, en ratones BALB/c. Después de la inmunización de los ratones con el B4-T4-MAP, o con un compuesto de referencia (T, B-T, B4-MAP, T4-MAP), la proliferación de las células del ganglio linfático se midió in vitro después de la reestimulación con compuestos que contienen el epítopo T solo o en combinación con el epítopo B (compuestos T y B-T).
La Figura 4b ilustra la producción de una respuesta proliferante específica para el péptido 103 a 115 (compuesto T) tras la inmunización de ratones BALB/c con el compuesto B4-T4-MAP según la presente invención. Se inmunizaron por vía subcutánea ratones BALB/c (H-2^{d}) con 10 \mug de T, B-T, B4-MAP, T4-MAP y B4-T4-MAP en presencia de adyuvante completo de Freund. Diez días después, las células escurridas del ganglio linfático se cultivaron en presencia de medio solo o se volvieron a estimular in vitro con 10 \mug/ml de un compuesto que contenía el epítopo 103 a 115 (compuesto T o B-T). Cuatro días después, se midió la proliferación de las células LN mediante la incorporación de timidina tritiada. Los resultados se expresaron en cpm.
Como puede apreciarse en la Figura 4b, los compuestos MAP, B4-T4-MAP y T4-MAP, así como los compuestos T y B-T que contienen el epítopo T, provocan in vivo una respuesta T proliferante específica para este epítopo T. La especificidad de la respuesta T observada se demuestra por la ausencia de proliferación de los linfocitos T que se originan en los ratones inmunizados con el compuesto B4-MAP que está exento del epítopo T, volviendo a estimular después con los compuestos T o B-T.
Por lo tanto, fue posible demostar mediante los análisis de inmunogenicidad T del conjugado según la presente invención (el compuesto B4-T4-MAP) que el epítopo T del poliovirus presente en este compuesto es capaz de estimular tanto in vitro como in vivo los linfocitos T específicos para este epítopo T. Además se observa un gran aumento en la antigenicidad del epítopo T cuando este último se combina con el epítopo carbohidrato en la estructura del B4-T4-MAP.
2) Antigenicidad de la estructura de MAG
2.1 Para evaluar la antigenicidad del antígeno Tn en el sistema MAG glicoconjugado según la invención, los solicitantes han utilizado dos anticuerpos monoclonales diferentes bien caracterizados (mAbs) que reconocen el antígeno Tn. La Figura 3 presenta la capacidad de fijación de los anticuerpos monoclonales anti-Tn 83 D4 (IgM) (Ref. 26) y MLS 128 (IgG) (Ref. 27) contra los montajes MAG diferentes utilizando un análisis ELISA. Esta fijación se compara a la fijación obtenida con el antígeno Tn conjugado 3 con un vehículo proteico (ovoalbúmina).
Los glucopéptidos antigénicos múltiples completamente sintéticos permiten un determinado grado de rechazo de un tumor implantado que lleva glucosilaciones anómalas. Sin embargo, para producir inmunidad antitumoral más eficaz contra los cánceres, el desarrollo contra dichos inmunógenos no debería centrarse en el antígeno carbohidrato individual sino que debería combinar varios carbohidratos dianas para los anticuerpos. La utilización de un epítopo de células Tn dado juntamente con carbohidratos es un prerrequisito para provocar respuestas fuertes del anticuerpo, pero puede limitar su eficacia considerando el polimorfismo de MHC observado en la población humana. Para evitar este inconveniente, las estructuras de MAG han de incluir varios epítopos de linfocito T con un determinado foco en las secuencias de fijación del MHC promiscuas, tales como las descritas para la toxina del tétanos (Ref. 41, Ref. 42) para las que los individuos humanos están ya cebados (Ref. 43). La integración de los epítopos de CTL en las estructuras de MAG, tal como los péptidos derivados de MUC-1 (Ref. 44) para los cánceres epiteliales, puede conseguirse también fácilmente al ensanchar el espectro de la respuesta inmunitaria antitumoral. Aquí, los solicitantes han primado la utilización de un adyuvante suave, la alúmina, que está autorizada en las poblaciones humanas sanas, demostrando que no se requieren adyuvantes fuertes para producir respuestas inmunitarias específicas anti-carbohidrato mediante la estrategia MAG. Este último punto puede ser de mayor importancia en la extensión de la utilización de esta estrategia a los oligosacáridos bacterianos (Ref. 45) para vacunar una población sana.
Puede apreciarse que el sistema B4-T4-M de la invención así como el OSM desialilado o el conjugado ovoalbúmina-Tn (Ova-Tn) fueron reconocidos eficazmente por ambos de los mAbs, 83 D4 y MLS 128, mientras que M, B4-M, T4-M, B-T (en el último caso, solamente se probó un mAb) y la propia ovoalbúmina no. El fragmento d-OSM reconocido por el anticuerpo monoclonal MLS 128 demostró contener tres restos a-GalNAc-Ser/Thr consecutivos (Ref. 28) que pueden indicar que B4-T4-M pero no B4-M es capaz de simular la unidad de serina glucosilada repetida.
Estos resultados demuestran que el montaje B4-T4-M según la invención puede presentar correctamente el antígeno Tn.
2.2 Otro estudio de inmunogenicidad en ratones de los conjugados Tn-MAG de la invención se realizó en primer lugar en ratones BALB/c que fueron inmunizados varias veces con dichos conjugados Tn-MAG o con los compuestos de referencia B-T, B4-MAP o T4-MAP, en presencia de hidróxido de aluminio (alúmina). La detección de los anticuerpos IgM (fig. 5a) e IgG (fig. 5b) específicos para el antígeno Tn se realizó por ELISA, midiendo el reconocimiento del d-OSM.
Como puede apreciarse en las Figuras 5a y 5b, después de dos inmunizaciones con el compuesto B4-T4-MAP según la invención, los anticuerpos IgM específicos para el antígeno Tn se produjeron en ratones BALB/c, a diferencia de los compuestos B-T, B4-MAP o T4-MAP que fueron incapaces de producir anticuerpos anti-Tn. La cantidad de IgM anti-Tn con B4-T4-MAP permaneció inalterada después de una tercera y una cuarta inmunización. Con los ratones BALB/c parecía que la respuesta del anticuerpo a Tn producida por B4-T4-MAP se caracterizaba por la presencia de anticuerpos IgM y la ausencia de anticuerpos IgG.
2.3 Un estudio adicional de producción de anticuerpos anti-Tn en las mismas condiciones se realizó en otra cepa de ratones de haplotipo H2^{5} (que responden al epítopo T) es decir ratones SLJ/J, y dio como resultado la producción de ambos anticuerpos de clase IgM e IgG contra Tn (Fig. 5b). Por lo tanto el compuesto B4-T4-MAP (Tn-MAG) de la presente invención fue capaz de producir anticuerpos contra Tn que pertenecen a diferentes isotipos, razón por la cual existen diferencias en la clase de anticuerpo anti-Tn dependiendo de la cepa de ratón analizada está todavía en estudio.
Se estudió también la dependencia del linfocito T CD4^{+} de la inmunogenicidad del compuesto B Tn-MAG. Como se dijo anteriormente, los ratones BALB/c son sensibles al epítopo T del poliovirus y generan anticuerpos contra Tn. A fin de determinar la dependencia de T de la producción de anticuerpos anti-Tn, los solicitantes ensayaron su capacidad para producir anticuerpos contra Tn otra cepa de ratón sensible al epítopo T del poliovirus, a saber la cepa SLJ/J, y una no sensible a la cepa del epítopo T del poliovirus, es decir la cepa DBA/1.
Las Figuras 5b y 5c demuestran que la inmunización con el compuesto Tn-MAG, según la presente invención, de ratones SLJ/J (5b) y DBA/1 (5c) dio como resultado la producción de anticuerpos anti-Tn en la cepa SLJ/J únicamente, que es sensible al epítopo T de poliovirus. Estos datos demuestran que el epítopo T, CD4^{+} presente en el compuesto Tn-MAG de la presente invención es necesario para la producción de anticuerpos contra Tn.
2.4 Los solicitantes estudiaron además la producción de anticuerpos anti-péptido utilizando el compuesto Tn-MAG de la presente invención.
Como se expresó anteriormente el conjugado de la presente invención (compuesto Tn-MAG) contiene cuatro copias de la secuencia 103 a 115 de la proteína VP1 del tipo 1 de poliovirus (péptido T), unido al antígeno Tn del carbohidrato. Los solicitantes han determinado en ratones la capacidad del compuesto Tn-MAG para producir anticuerpos específicos para el péptido T. Como se presenta en la Figura 6, la inmunización de ratones BALB/c con el Tn-MAG de la presente invención produjo una respuesta de IgG fuerte específica para el péptido T (103 a 115), mientras que el compuesto T4-M, que carece del antígeno Tn carbohidrato, así como el compuesto B4-M que contiene únicamente el antígeno Tn, fueron incapaces de provocar una respuesta del anticuerpo del péptido anti-T. Por consiguiente, la presencia del grupo carbohidrato en el conjugado Tn-MAG de la presente invención, produce un efecto potenciador fuerte en la producción de anticuerpos anti-péptido contra el poliovirus peptídico contenido en el compuesto MAG. Estos datos sugieren que dicho conjugado del péptido carbohidrato puede utilizarse para activar la respuesta del anti-péptido generalmente en compuestos sintéticos MAP que contienen las secuencias peptídicas del patógeno.
Ejemplo 3 Protección producida con el conjugado de la presente invención (compuesto Tn-MAG) contra el adenocarcinoma TA3/Ha murino que expresa el antígeno Tn en la prueba de provocación de ratones BALB/c inyectados
A fin de determinar la eficacia de la respuesta de anti-Tn B producida en ratones con el compuesto MAG, se realizó una prueba de provocación por inyección en los ratones vacunados. 1.000 células por ratón de célula de adenocarcinoma murino, TA3/Ha (P.Y.S. Fung et al. (1990) Cancer Research, 50: 4308-4314), que expresan el antígeno Tn, se administraron por vía intraperitoneal a ratones BALB/c que han recibido 4 inyecciones de los compuestos B4-M o Tn-MAG. La Figura 7 es un gráfico que ilustra la mortalidad frente al número de días después de la prueba de provocación en el tumor. Se inmunizaron ratones BALB/c los días 0, 21, 42 y 100 con 20 \mug de compuesto B4-M o Tn-MAG en presencia de alúmina. 15 días después, los ratones recibieron una inyección de provocación de 1.000 células TA3/Ha de adenocarcinoma. Se hizo el seguimiento de la mortalidad durante un periodo de 50 días. Como puede apreciarse en la Figura 7, solamente el 70% de los ratones sobrevivió cuando éstos fueron inmunizados con el compuesto B4-M que no permite producir un anticuerpo contra Tn. Por el contrario, el 100% de los ratones que han recibido cuatro inyecciones del conjugado de la presente invención sobrevivieron a D50 después de la prueba de provocación en el tumor. Estos datos demuestran que los anticuerpos producidos con el compuesto Tn de la presente invención dan como resultado la mejora de la supervivencia de los ratones después de una prueba de provocación en el tumor que produce una letalidad moderada.
Ejemplo 4 Reconocimiento de un adenocarcinoma humano por los anticuerpos que se originan a partir de un suero de un ratón inmunizado con el conjugado de la presente invención (compuesto Tn-MAG)
A fin de evaluar las posibles aplicaciones humanas del conjugado de la presente invención, se determinó la capacidad de los sueros de los ratones que han recibido este último para reconocer una célula tumoral humana. Con este fin, los solicitantes utilizaron la célula LS180 (ATCC CL-187) que procedía de un adenocarcinoma de un paciente que ha desarrollado un cáncer de colon. Un análisis de citometría de flujo del reconocimiento de la células LS180 mediante un suero que se origina en un ratón SLJ/J que ha recibido tres inyecciones del presente conjugado (Tn-MAG) demuestra que los anticuerpos anti-Tn producidos son capaces de reconocer el antígeno Tn en la superficie de las células LS180.
Ejemplo 5 Síntesis de linfocito T CD4^{+} asociado al antígeno sacarídico para producir anticuerpos anti-sacarídicos
El compuesto básico para producir anticuerpos anti-sacarídicos es una secuencia peptídico lineal que contiene un epítopo de linfocito T CD4^{+} unido a una cadena sacarídica. El compuesto BT se compone de la secuencia KLFAVWKITYDKDT procedente del tipo 1 de poliovirus (epítopo de linfocito T CD4^{+}) unido en el terminal N a tres restos GalNac-Ser/Thr (antígeno Tn sacarídico asociado al tumor). El compuesto BT o el péptido PV de referencia, secuencia KLFAVWKITYKDT) se inyectó a ratones BALB/c mezclado con el adyuvante completo de Freund o con alúmina de la forma siguiente.
Se inmunizaron ratones BALB/c (5 por grupo) en CFA o alúmina con el B-T-PV o el péptido PV de referencia los días 0, 21, 42 y 63. Se recogieron los sueros 10 días después de la última inyección y se analizó en ELISA el título de anticuerpo frente al glucopéptido B-T-TT1 o el péptido TT1. Los resultados se expresan en la Figura 8 en título medio obtenido para cinco ratones en cada grupo.
Para detectar por ELISA los anticuerpos anti-sacarídicos (anti-Tn), se utilizó una secuencia peptídico irrelevante QYIKANSKFIIGITEL unida en el terminal N a tres restos GalNac-Ser/Thr (BT-TT1) o la secuencia YIKANSKFIIGITEL (péptido TT1) no glucosilada como referencia negativa. Como se muestra en la Figura 8, el glucopéptido B-T-PV produce anticuerpos anti-Tn, pero no el péptido PV que presenta la especificidad de la respuesta del anticuerpo.
Estos resultados demuestran que un glucopéptido lineal sintético que contiene un epítopo del linfocito B sacarídico y un epítopo de linfocito T CD4^{+} es capaz de producir anticuerpos anti-sacarídicos.
Aunque solamente se ilustran y se describen las formas de realización preferidas de manera específica en la presente memoria, debe apreciarse que son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de lo que se ha dado a conocer anteriormente y dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas siguientes sin apartarse por ello del espíritu y del alcance pretendido de la invención.
TABLA Compuestos sintéticos y glucoproteínas
Antígeno Número de copias por molécula
Denominación \alphaGalNac-Ser Péptido 103 a 115
(antígeno Tn) (epítopo T)
T 0 1
B 1 0
B-T 1 1
M o MAP 0 0
B4-M 4 0
T4-M 0 4
B4-T4-M o 4 4
Tn-MAG
Ovoalbúmina 0 0
Ovoalbúmina-Tn ++* 0
d-OSM ++* 0
* varias copias, pero número de copias no determinado.
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Claims (27)

1. Conjugado de carbohidrato péptido, que comprende:
un vehículo que comprende una polilisina dendrimérica que facilita epítopos múltiples que están unidos por enlaces covalentes a ésta,
por lo menos un péptido que comprende un epítopo T o varios epítopos T idénticos o diferentes,
por lo menos un grupo carbohidrato, o un derivado del mismo, que contiene un epítopo B, con la condición de que no sea un sialósido, o varios epítopos B idénticos o diferentes.
2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que dicha polilisina dendrimérica forma una estrella de 4 ramas, con un epítopo T unido por enlace covalente a cada lisina de las ramas de dicho vehículo.
3. Conjugado según la reivindicación 1 ó 2, que comprende por lo menos 3 lisinas y hasta 15 lisinas unidas por enlaces covalentes entre si.
4. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el terminal NH_{2} de por lo menos dos restos de lisina está unido a por lo menos un péptido que comprende un epítopo T y en el que el grupo de carbohidrato está unido por enlace covalente al terminal de dicho péptido opuesto a la lisina.
5. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el terminal NH_{2} de por lo menos dos restos de lisina está unido a por lo menos un resto de carbohidrato que no es un sialósido, óptimamente sustituido y que forma un epítopo B y en el que el péptido que comprende un epítopo T está unido por enlace covalente al terminal de dicho carbohidrato.
6. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el grupo de carbohidrato es el galactosilo.
7. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 4, que comprende 3 restos de lisina, por lo menos 4 epítopos de tipo T, que pueden ser iguales o diferentes, unidos a los terminales NH_{2} de 2 de los restos de lisina y 4 restos de \alpha-galactosil-N-acetil-serina.
8. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 7, en el que el grupo de carbohidrato es un resto galactosilo y está sustituido por otro resto glucosilo.
9. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 8, en el que el carbohidrato es un antígeno tumoral.
10. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 9, en el que el epítopo T es el péptido 103 a 115 de la proteína VP-1 o del tipo 1 de poliovirus.
11. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 10, en el que el carbohidrato está injertado en combinación con el epítopo peptídico tumoral de linfocitos T CD8^{+}.
12. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 8 u 11, en el que el carbohidrato es de origen bacteriano o micótico.
13. Conjugado según la reivindicación 12, en el que el carbohidrato es de polisacáridos bacterianos capsulares seleccionados de entre el grupo constituido por Neisseria meningitis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, y otras especies de Streptococcus, a excepción de los polisacáridos sialilados.
14. Conjugado según la reivindicación 1, en el que el carbohidrato se selecciona de entre el grupo constituido por antígeno Tn, antígeno di-Tn, antígeno tri-Tn, antígeno T* y antígeno hexa-Tn.
15. Conjugado de péptido carbohidrato, que comprende:
por lo menos un péptido que comprende un epítopo T, o varios epítopos T idénticos o diferentes, y
por lo menos un grupo carbohidrato, o un derivado del mismo, que contiene el epítopo B, con la condición de que no sea sialósido o varios epítopos idénticos o diferentes.
16. Conjugado de péptido carbohidrato según la reivindicación 15, en el que el grupo carbohidrato se selecciona de entre el grupo constituido por antígeno Tn, antígeno di-Tn, antígeno tri-Tn, antígeno hexa-Tn y antígeno T*.
17. Composición farmacéutica que comprende el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un vehículo y adyuvante adecuados.
18. Vacuna que comprende el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
19. Composición inmunógena que comprende por lo menos un conjugado de péptido carbohidrato según las reivindicaciones 1 a 16, capaz de seleccionar una respuesta inmunitaria contra una infección vírica producida por un patógeno tal como el virus de la hepatitis, VIH o CMV.
20. Composición inmunógena que comprende por lo menos un conjugado de péptido carbohidrato según las reivindicaciones 1 a 16, en la que dicha composición es capaz de aumentar la supervivencia del ser humano o del animal que lleva el tumor.
21. Composición inmunógena que comprende por lo menos un conjugado de péptido carbohidrato según la reivindicación 20, en la que dicho conjugado comprende varios antígenos de carbohidrato destinados a producir más inmunidad antitumoral eficaz contra los cánceres.
22. Conjugado según las reivindicaciones 1 a 16, para su utilización como inmunógeno.
23. Utilización de un conjugado según las reivindicaciones 1 a 16, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a potenciar la respuesta inmunitaria de un ser humano o de un animal contra las bacterias.
24. Utilización de un conjugado según las reivindicaciones 1 a 16, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a provocar una respuesta al anticuerpo en un cuerpo humano o animal contra por lo menos un grupo carbohidrato comprendido en la misma.
25. Anticuerpo purificado procedente de fluido purificado o de células de organismos administrado con un conjugado según las reivindicaciones 1 a 16.
26. Kit para diagnóstico que comprende anticuerpos específicos para el antígeno producidos por inmunización de un cuerpo humano o animal con un conjugado según las reivindicaciones 1 a 16.
27. Método para el diagnóstico del cáncer, en el que se pone en contacto una muestra biológica por lo menos con un anticuerpo según la reivindicación 25 y en el que se determina la formación de complejos entre este anticuerpo y las moléculas comprendidas en dicha muestra.
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