ES2265928T3 - Moduladores de polisacaridos y utilizacion de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un péptido aislado consistente en una secuencia seleccionada entre: (a) GAHWQFNALTVR (SEC ID Nº: 1), (b) AAHWQFNALTVR, (c) GAAWQFNALTVR, (d) GAHWQFAALTVR y (e) GAHWQFNALTVA.
Description
Moduladores de polisacáridos y utilización de
los mismos.
La invención se relaciona con inhibidores
peptídicos de glicosaminoglicanos. Esta invención se relaciona
también con formulaciones, usos y métodos de identificación de
dichos inhibidores.
La matriz extracelular (MEC) es un ensamblaje
dinámico de moléculas interaccionantes que regulan las funciones e
interacciones celulares en respuesta a estimulación. Una clase de
macromoléculas de la matriz extracelular, los glicosaminoglicanos,
son moléculas que se sabe están implicadas en una amplia variedad de
procesos biológicos tanto normales como anormales, incluyendo la
migración, diferenciación y proliferación celular, la respuesta
inmune y la organización citoesquelética.
El glicosaminoglicano hialuronano (HA) es un
disacárido repetitivo de
[GlcNAc\beta1-4GlcUA\beta1-3]_{n}
que existe in vivo como un polisacárido lineal de alto peso
molecular. El HA se encuentra en mamíferos predominantemente en los
tejidos conectivos, en la piel, en el cartílago y en el fluido
sinovial y es también el principal constituyente del vítreo del ojo.
En el tejido conectivo, el agua de hidratación asociada con el HA
crea espacios entre tejidos, creando así un ambiente que conduce al
movimiento y la proliferación celular. El HA tiene un papel clave en
los fenómenos biológicos asociados a la motilidad celular,
incluyendo el rápido desarrollo, la regeneración, la reparación, la
embriogénesis, el desarrollo embriológico, la curación de heridas,
la angiogénesis y la tumorigénesis (Toole, Cell Biol. Extracell.
Matrix, Hay (ed.), Plenum Press, New York,
1384-1386 (1991); Bertrand y col., Int. J.
Cancer 52: 1-6 (1992); Knudson y col., FASEB
J. 7: 1233-1241 (1993)). Los niveles de HA han
mostrado correlacionarse con la agresividad tumoral (Ozello y col.,
Cancer Res. 20: 600-604 (1960); Takeuchi y
col., Cancer Res. 36: 2133-2139 (1976);
Kimata y col., Cancer Res. 43: 1347-1354
(1983)) y pueden ser indicativos de las propiedades invasivas de las
células tumorales. M.M. Knupfer y col, Anticancer Res. 18:
353-6 (1998).
El HA está también implicado en la respuesta
inmune y puede, por lo tanto, mediar en esta respuesta en reacciones
biológicas tanto normales como anormales. Se ha visto que una mayor
unión del HA a uno de sus receptores, CD44, media en la adhesión
primaria ("rodamiento") de los linfocitos a las células
endoteliales vasculares en condiciones de esfuerzo cortante
fisiológico y esta interacción media en la extravasación de células
T activadas a un sitio inflamado in vivo en ratones. H.C.
DeGrendele y col., J. Exp. Med. 183:
1119-1130 (1996); H.D. DeGrendele y col.,
Science 278: 672-675 (1997); H.C. DeGrendele
y col., J. Immunol. 159: 2549-2553 (1997).
También se han asociado las alteraciones en los niveles de HA y de
otros glicosaminoglicanos a respuestas inmunes no deseadas y pueden
estar implicados en enfermedades y trastornos tales como la artritis
reumatoide, la dermatitis atópica, la psoriasis, la esclerosis
múltiple y el rechazo de trasplantes. Por ejemplo, el HA y otros
glicosaminoglicanos están alterados en trastornos autoinmunes, tales
como la artritis, y se han visto niveles reducidos tanto de ácido
hialurónico como de 6-condroitinsulfato en el fluido
sinovial enfermo de adultos con artritis reumatoide (A. Bensouyad y
col., Ann. Rheum. Dis. 49: 301-7 (1990)) y de
niños con artritis reumatoide juvenil (P.F. Spelling y col.,
Clin. Exp. Rheumatol. 9: 195-9 (1991)).
Las células dendríticas (CD) tienen papeles
esenciales en la inducción de las respuestas inmunes celulares a una
variedad de antígenos relevantes. Se sabe que las CD tienen papeles
críticos en la inducción de respuestas inmunes celulares frente a
una amplia variedad de antígenos de relevancia, incluyendo haptenos
químicos, proteínas extrañas, microbios infecciosos y antígenos
asociados a tumores (Steinman, "The dendritic cell system and its
role in immunogenicity", Ann. Rev. Immunol. 9: 271 (1991);
Stingl y col., "The Epidermis: An Immunologic Microenvironment in
Dermatology in General Medicine", T.B. Fitzpatrick, ed. McGraw
Hill and Co., New York, p. 172 (1993)). Se cree que la interacción
entre el HA, expresado sobre las células endoteliales, y el CD44,
expresado sobre células dendríticas activadas, así como sobre
células T, y granulocitos, media en el viaje de dichos leucocitos a
sus sitios blanco.
También se sabe que los glicosaminoglicanos, y
particularmente el HA, median en otras interacciones celulares que
implican unión y entrada en una célula. Por ejemplo, el HA está
implicado en la infección de células de mamífero por el Virus de la
Inmunodeficiencia Humana (VIH), ya que se sabe que el VIH se une al
HA en la infección. Se vio que tanto el HA como los anticuerpos
monoclonales para su receptor CD44 inhibían la infección por VIH de
monocitos por el VIH monocitotrópico. M.C. Levesque y B.F. Haynes,
J. Immunol. 156: 1557-65 (1996). El HA está
también implicado en la formación del zigoto de mamíferos mediando
en la unión del oocito y el esperma. Los datos sugieren que el HA en
la matriz del cúmulo puede activar imprimando el esperma
fertilizante para la inducción de la reacción del acrosoma por los
constituyentes del cúmulo y/o de la zona pelúcida. Se piensa que el
HA media en esta interacción uniéndose a la proteína
PH-20 para aumentar los niveles basales de calcio
intracelular y así potenciar la reacción del acrosoma. K. Sabeur y
col., Zygote 6: 103-11 (1998). El HA media en
la motilidad del esperma aumentando la fosforilación de proteínas,
incluyendo la proteína de unión al HA. S. Ranganathan y col.,
Cell. Mol. Biol. Res. 41: 467-76 (1995).
El papel de los glicosaminoglicanos, y
particularmente del ácido hialurónico, en tales procesos
fisiológicos variables hace de ellos blancos atractivos para agentes
terapéuticos. Desafortunadamente, se ha visto que los
glicosaminoglicanos son casi no antigénicos y se han aislado muy
pocos anticuerpos que reconocen los glicosaminoglicanos. Debido a
esta falta de antigenicidad, ha resultado técnicamente difícil
desarrollar inhibidores o sondas de glicosaminoglicanos. Así, se
necesitan en la técnica inhibidores de procesos mediados por
glicosaminoglicanos, y en particular inhibidores de procesos
mediados por el ácido hialurónico. También se necesita un método de
identificación de inhibidores efectivos de los glicosaminoglicanos
de un modo sistemático y reproducible.
La presente invención proporciona péptidos con
una afinidad específica por las moléculas de glicosaminoglicanos.
Estos péptidos exhiben cualquier número de funciones, incluyendo,
aunque sin limitación, inhibidores de procesos mediados por
glicosaminoglicanos, aumentadores de procesos mediados por
glicosaminoglicanos y como sondas moleculares para identificar la
presencia de un glicosaminoglicano específico. Los péptidos de la
invención son administrados para inhibir, alterar la interacción de,
o de algún otro modo afectar a la actividad o función de, cualquier
glicosaminoglicano, incluyendo el ácido hialurónico, el
condroitinsulfato A, el condroitinsulfato C, el dermatán sulfato,
la heparina, el queratán sulfato, el queratosulfato, la quitina, el
quitosano 1 y el quitosano 2. Estos péptidos aislados son formulados
y administrados por inyección para el tratamiento o la prevención de
enfermedades que implican infección vírica, enfermedades
inflamatorias, cáncer, infecciones, etc. Más aún, estos péptidos son
formulados y administrados para la estimulación de las respuestas
biológicas normales, tales como la curación de heridas, la
angiogénesis, etc. Los péptidos de la invención pueden ser marcados
directa o indirectamente y, como tales, son útiles en sondas in
vitro o in vivo para determinar la presencia de un
glicosaminoglicano particular en una muestra biológica y/o
paciente.
paciente.
En una realización preferida, la invención
proporciona péptidos aislados y substancialmente purificados que se
unen específicamente, y como tal inhiben o afectan de algún otro
modo, a la actividad del HA. Los inhibidores peptídicos aislados se
caracterizan por residuos alifáticos o alifáticos polares en las
posiciones 4, 5 y 6 y/o 9, 10 y 11. En consecuencia, la invención
proporciona péptidos que tienen una secuencia seleccionada entre:
GAHWQFNALTVR, AAHWQFNALTVR, GAAWQFNALTVR, GAHWQFAALTVR y
GAHWQFNALTVA.
Se describen aquí composiciones consistentes en
un material de soporte y un ingrediente activo. El ingrediente
activo se caracteriza por todos o cualquiera de (1) unión específica
y selectiva a un glicosaminoglicano, que es preferiblemente ácido
hialurónico; (2) inhibición de la función normal de, o alteración de
las interacciones normales de, o efecto sobre la actividad normal
de, un glicosaminoglicano; (3) posesión de una secuencia de
aminoácidos correspondiente a cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 2, 3,
4 ó 5; o (4) posesión de suficiente homología con cualquiera de las
SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4 ó 5, para presentar una estructura
caracterizada por (1) o (2) anteriores.
La invención proporciona además composiciones
farmacéuticas y cosméticas que contienen un péptido de la invención.
Los péptidos en la composición farmacéutica son usados conjuntamente
con un soporte farmacéutico aceptable para preparar composiciones
medicinales para el tratamiento de trastornos mediados por
glicosaminoglicanos en animales y más preferiblemente en mamíferos,
incluidos los humanos. En una realización preferida, el
glicosaminoglicano modulado es HA. En una realización más preferida,
el péptido es un inhibidor de HA que tiene la secuencia de SEC ID
Nº: 1.
Los péptidos aislados descritos pueden ser
usados en composiciones cosméticas, v.g., una crema tópica para la
piel, con un soporte cosmético aceptable. Dichas cremas tópicas para
la piel pueden contener aditivos, tales como emolientes,
humectantes, fragancia y similares. El glicosaminoglicano modulado
es HA y el péptido usado para modular la actividad se caracteriza
por residuos alifáticos o alifáticos polares en las posiciones 4, 5
y 6 y/o 11. El péptido es un inhibidor de HA que tiene la secuencia
de SEC ID Nº: 1 o uno de los otros péptidos descritos en la
reivindicación 1.
Los péptidos de la invención pueden ser usados
en la fabricación de un medicamento para la prevención o el
tratamiento de la inflamación o del cáncer. Los péptidos pueden
actuar alterando la migración medicada por ácido hialurónico de
células inmunes, por ejemplo la infiltración leucocitaria.
La presente invención se relaciona también con
un método de bloqueo de la migración celular usando péptidos con
afinidad específica por las moléculas de glicosaminoglicano. En una
realización, la invención proporciona, por ejemplo, un método para
prevenir la migración de CD desde la epidermis bloqueando la
interacción HA-CD44 con un inhibidor peptídico del
HA. El péptido usado para bloquear la interacción
HA-CD44 está constituido por la SEC ID Nº: 1 o uno
de los péptidos de la reivindicación 1.
La presente invención se relaciona también con
un método de prevención de la inducción de respuestas inmunes
alterando la interacción de glicosaminoglicanos y moléculas de
receptores celulares. Los péptidos específicos para un
glicosaminoglicano pueden inhibir la interacción con moléculas de la
superficie celular de células migratorias, inhibiendo así el proceso
de migración. Los péptidos específicos para HA pueden inhibir la
migración de células inmunes inhibiendo la interacción con CD44. Los
péptidos que son específicos para la heparina pueden inhibir la
migración de células, donde la migración es dependiente del receptor
del factor de crecimiento de los fibroblastos.
La presente invención se relaciona también con
un método de identificación de péptidos que se unen específicamente
a un carbohidrato, tal como un glicosaminoglicano, usando una
tecnología de exhibición de fagos. El método incluye una etapa de
selección de péptidos que se unen específicamente al carbohidrato de
interés recogiendo sólo los clones liberados de las placas
revestidas de carbohidrato después del tratamiento para neutralizar
la función del carbohidrato, v.g., por adición del mismo
carbohidrato o de uno similar en exceso, por digestión enzimática o
no enzimática del carbohidrato, usando un quelante y similares.
Una característica de la presente invención es
que los péptidos de la invención inhiben las interacciones
glicosaminoglicano-proteína uniéndose al
glicosaminoglicano más que a la proteína con la que
interacciona.
Otra característica de los péptidos de la
presente invención es que dan una mejor inhibición de la actividad
mediada por glicosaminoglicanos que inhibidores de
glicosaminoglicanos de mayor tamaño y menos específicos, tales como
anticuerpos para receptores, v.g., anticuerpos
anti-CD44.
Una ventaja de los moduladores peptídicos de la
presente invención es que son más específicos que los inhibidores
químicos de glicosaminoglicano, v.g., tunimicina y H7.
Otra ventaja de los moduladores peptídicos de la
invención es que son significativamente más pequeños que otros
inhibidores de la actividad mediada por glicosaminoglicanos, v.g.,
anticuerpos o glicosaminoglicano soluble. El menor tamaño del
péptido permite mejores formulaciones orales y tópicas.
Otra ventaja de la presente invención es que los
inhibidores peptídicos de la invención son más efectivos de producir
en cuanto a coste que los moduladores actualmente disponibles de las
interacciones glicosaminoglicano-proteína, v.g.,
inhibidores de CD44, tales como anticuerpos
anti-CD44.
Estos y otros objetos, ventajas y
características de la presente invención resultarán aparentes para
los expertos en la técnica tras la lectura de los detalles de la
invención aquí descrita.
La Figura 1 es un gráfico de barras que ilustra
la especificidad de unión de cada uno de los cuatro péptidos
aislados y de un péptido aleatorio ("RP") a perlas revestidas
de HA. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente
significativas (p < 0,01).
La Figura 2 es un gráfico de líneas que ilustra
la titulación del Péptido 1 con perlas revestidas de HA.
La Figura 3 es un gráfico de barras que ilustra
la unión relativa de cada Péptido 1 aislado a HA y CSA. Los
corchetes indican comparaciones evaluadas por la prueba t de
Student de 2 colas. Los asteriscos indican diferencias
estadísticamente significativas (p < 0,01).
La Figura 4 es un gráfico de líneas que
representa la inhibición del Péptido 1 radiomarcado por el Péptido 1
no marcado. Los datos mostrados son la media \pm SD (n=3) de la
DO_{405}.
La Figura 5 es un conjunto de histogramas que
ilustran la unión de los Péptidos 1-4 a la molécula
de HA nativa sobre células endoteliales. Los histogramas cerrados
representan la unión a 62 \muM a células endoteliales SVEC
10-40. Los histogramas abiertos representan células
incubadas con RP biotinilado.
La Figura 6 es un histograma que ilustra la
unión del Péptido 1 a células endoteliales tratadas con HAasa
(histograma cerrado) y tratadas en simulacro.
La Figura 7 es un gráfico de líneas que ilustra
la capacidad del Péptido 1 para inhibir la unión de HA.
Las Figuras 8a y 8b son histogramas que ilustran
la unión de FITC-HA a células BW5147 antes o después
del pretratamiento con Péptido 1 o con RP (500 \mug/ml).
La Figura 9 ilustra la unión del Péptido 1
(círculos cerrados) o de RP (círculos abiertos) a células BW5147.
Los datos mostrados son el MFI medido por FACS.
La Figura 10 es un gráfico de líneas que ilustra
la unión de BW5147 a las concentraciones indicadas de HA.
La Figura 11 es un gráfico de barras que ilustra
la unión de células BW5147 a las placas revestidas de HA después del
pretratamiento de las células con 70 \mug/ml de MAb
anti-CD44 o IgG control, o después del
pretratamiento del substrato con Péptido 1 o RP.
La Figura 12 es un gráfico de líneas que ilustra
la unión de células BW5147 a pocillos revestidos de HA pretratados
con las concentraciones indicadas de Péptido 1 (círculos cerrados) o
de RP (círculos abiertos).
La Figura 13 es una serie de gráficos de barras
que ilustran la capacidad del Péptido 1 para inhibir la unión de HA
a células T esplénicas murinas, a células T de sangre periférica
humana o a células de Langerhans de ratón.
La Figura 14 es un gráfico de barras que muestra
los aminoácidos individuales en la secuencia del Péptido 1
determinados como importantes por mutagénesis de barrido con
Ala.
La Figura 15 ilustra la estructura secundaria de
un tetrasacárido de HA.
La Figura 16 es un gráfico de barras que ilustra
el impacto del Péptido 1 sobre la migración de CL disparada por
haptenos.
La Figura 17 es un gráfico de líneas que ilustra
el efecto dependiente de concentración del Péptido 1 sobre la
emigración de CL.
La Figura 18 es un gráfico de barras que ilustra
el efecto sobre la densidad de CL con administración de Péptido 1 a
1, 2 ó 3 días antes de la aplicación de DNFB.
La Figura 19 es un conjunto de gráficos de
barras que ilustran la capacidad del Péptido 1 para reducir la
hinchazón de la oreja después de la administración de DNFB.
La Figura 20 es un conjunto de gráficos de
barras que ilustran el grosor de la oreja y la infiltración
leucocitaria después de la administración de DNFB y de Péptido
1.
La Figura 21 es un conjunto de gráficos de
líneas que ilustran los efectos profilácticos y terapéuticos del
Péptido 1 y de RP con administración de DNFB.
La Figura 22 es un gráfico de barras que ilustra
el impacto del Péptido 1 sobre la fase de sensibilización de las
respuestas de hipersensibilidad por contacto usando DNFB u oxazolona
(OX).
La Figura 23 es un gráfico de barras que ilustra
las diferencias en sensibilización entre una primera y una segunda
inoculación con administración de Péptido 1 o de RP.
La Figura 24 es un conjunto de gráficos de
líneas que ilustran la capacidad del isómero L y del isómero D del
Péptido 1 para reducir la hinchazón de la oreja en respuesta a la
aplicación de DNFB.
Habría que señalar que, tal como se usan aquí y
en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un",
"una", "el" y "la" incluyen los referentes plurales a
menos que el contexto dicte claramente en contrario. Así, por
ejemplo, la referencia a "una construcción" incluye una
pluralidad de dichas construcciones y la referencia a "el
inhibidor peptídico" incluye la referencia a uno o más
inhibidores peptídicos y sus equivalentes conocidos para los
expertos en la técnica, etc.
A menos que se defina en contrario, todos los
términos técnicos y científicos aquí empleados tiene el mismo
significado que el comúnmente entendido para alguien con
conocimientos ordinarios en la técnica a la que esta invención
pertenece. Aunque se pueden usar cualesquiera métodos, dispositivos
y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos en la
práctica o las pruebas de la invención, se describen ahora los
métodos, dispositivos y materiales preferidos.
Los términos "tratamiento", "tratar" y
similares son aquí usados para significar, en general, la obtención
de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede
ser profiláctico en términos de prevención completa o parcial de una
enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en
términos de curación parcial o completa para una enfermedad y/o
efecto adverso atribuible a la enfermedad. En una realización,
"tratamiento", tal como se utiliza aquí, cubre cualquier
tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un
humano, e incluye:
(a) prevención de que la enfermedad se produzca
en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero al
que aún no se ha diagnosticado que la tenga;
(b) inhibición de la enfermedad, es decir,
detención de su desarrollo, y
(c) alivio de la enfermedad, es decir, provocar
la regresión de la enfermedad. La invención se dirige hacia el
tratamiento de pacientes para procesos biológicos que implican la
migración celular, tales como la inflamación, y se dirige
particularmente hacia el tratamiento de la metástasis de células
cancerosas. En otra realización, el término "tratamiento", tal
como se utiliza aquí, cubre cualquier uso para la inhibición o el
aumento de un proceso biológico normal, tal como la fertilización de
oocitos.
El término "aminoácido", tal como se usa
aquí, incluye los veinte aminoácidos naturales, incluyendo tanto las
formas L-isoméricas como
D-isoméricas. El término incluye también residuos de
aminoácidos alternativos, tales como hidroxiprolina, ácido
\alpha-aminoisobutírico, sarcosina, citrulina,
ácido cisteico, t-butilglicina,
t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina,
\beta-alanina, ácido
4-aminobutírico, etc., que pueden ser también
incluidos en la secuencia peptídica de un modo completamente
análogo. También se pueden emplear, por supuesto, las formas D de
los aminoácidos codificados y de los aminoácidos alternativos. La
manera de determinar las constantes de velocidades relativas, de
conducir la síntesis y de conducir la selección y el análisis es
totalmente análoga a la descrita a continuación para los aminoácidos
naturales. En consecuencia, los resultados en términos del número de
constantes de velocidad requeridas, del número de péptidos
representativos en la mezcla, etc. son también directamente
aplicables a péptidos que incluyen como uno o más o todos de los
residuos estos aminoácidos no codificados.
El término "aislada" significa que la
proteína es retirada de ambiente natural. Sin embargo, algunos de
los componentes encontrados con ella pueden continuar estando con
una proteína "aislada". Así, una "proteína aislada" no es
como aparece en la naturaleza, sino que puede ser una proteína menos
de un 100% pura.
El término "librería de exhibición de
fagos", tal como se utiliza aquí, se refiere a una librería de
expresión de proteínas, construida en un virus o no virus, y expresa
una colección de secuencias proteicas clonadas, tales como fusiones
con una proteína de cubierta de fago.
El término "glicosaminoglicano", tal como
se usa aquí, se refiere a una macromolécula constituida por
carbohidrato. Los glicosaminoglicanos para uso en la presente
invención pueden variar en tamaño y estar sulfatados o no
sulfatados. Los glicosaminoglicanos que pueden ser abordados usando
los inhibidores y métodos de la invención incluyen, aunque sin
limitación, ácido hialurónico, los condroitín sulfatos, el queratán
sulfato, la quitina y la heparina.
Por "se une específicamente", se quiere
decir unión de alta avidez y/o alta afinidad de un péptido a un
epitopo específico, es decir, el epitopo de un glicosaminoglicano.
La unión peptídica a un epitopo sobre su polisacárido específico es
preferiblemente más fuerte que la unión del mismo péptido a
cualquier otro epitopo, particularmente los que pueden estar
presentes en moléculas en asociación con, o en la misma muestra que,
el polisacárido específico de interés, v.g., se une más fuertemente
a HA que a otros restos celulares. Los péptidos que se unen
específicamente a un glicosaminoglicano de interés pueden ser
capaces de unirse a otro glicosaminoglicano en un nivel débil, pero
aún detectable (v.g., 10% o menos de la unión mostrada al
polipéptido de interés). Dicha unión débil, o unión de fondo, es
fácilmente discernible de la unión peptídica específica al
glicosaminoglicano de interés, v.g., mediante el uso de controles
apropiados. En general, los péptidos de la invención que se unen al
HA nativo con una afinidad de unión de 10^{7} litros/mol o más,
preferiblemente 10^{8} l/mol o más, incluso más preferiblemente
10^{9} l/mol o más, se dice que se unen específicamente al HA. En
general, un péptido con una afinidad de unión de 10^{4} l/mol o
menos no es útil, en el sentido de que no se unirá a un epitopo a un
nivel detectable usando la metodología convencional actualmente
utilizada.
Por "sustancialmente idéntico", se quiere
decir un polipéptido o ácido nucleico que exhibe al menos un 50%,
preferiblemente un 85%, más preferiblemente un 90% y más
preferiblemente un 95% de homología con una secuencia de aminoácidos
o de ácido nucleico de referencia. Para polipéptidos, la longitud de
las secuencias de comparación será generalmente de al menos 10
aminoácidos, preferiblemente de al menos 12 aminoácidos, más
preferiblemente de al menos 15 aminoácidos y más preferiblemente de
35 aminoácidos.
La identidad de secuencias es típicamente medida
usando un programa de análisis de secuencia (v.g., el Sequence
Analysis Software Package del Genetics Computer Group, University of
Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI
53705). Dicho programa empareja secuencias similares asignando
grados de homología a diversas substituciones, deleciones y otras
modificaciones. Las substituciones conservadoras incluyen
típicamente substituciones en los siguientes grupos: glicina,
alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido
glutámico, asparraguina, glutamina; serina, treonina; lisina,
arginina, y fenilalanina, tirosina.
El término "neutralizado", tal como se usa
aquí, se refiere al tratamiento de un glicosaminoglicano con un
agente de tal forma que ya no esté disponible para interacción con
un compañero de unión, v.g., tratamiento de un glicosaminoglicano
con una enzima digestiva. Por ejemplo, se puede neutralizar el HA
por tratamiento con una cantidad efectiva de hialuronidasa
HAasa.
Como los glicosaminoglicanos son prácticamente
no antigénicos, ha resultado técnicamente difícil desarrollar
inhibidores o sondas de glicosaminoglicanos. La presente invención
utilizó un método de exhibición de fagos modificado para identificar
pequeños péptidos que se unen selectivamente a glicosaminoglicanos,
v.g., para uso como sondas moleculares, y para identificar péptidos
que bloquean la función de los glicosaminoglicanos, v.g., para uso
como inhibidores. Concretamente, se ha usado la estrategia de
exhibición de fagos de la presente invención para identificar
péptidos que se unen selectivamente al HA e inhiben su
actividad.
Se sabe que muchos péptidos seleccionados por
protocolos convencionales de exhibición de fagos se unen no
selectivamente a superficies de poliestireno. Véase Adey y col.,
Gene 156: 27 (1995). El método de la presente invención salva
esta unión no específica seleccionando péptidos que se unen
específicamente al glicosaminoglicano de interés. El presente método
implica la recogida de sólo los clones liberados de las placas
revestidas de glicosaminoglicano después del tratamiento para
neutralizar el carbohidrato, permitiendo la identificación de
péptidos que se unen al substrato de glicosaminoglicano, pero no a
las superficies de poliestireno. Los restos de carbohidratos no
unidos pueden ser neutralizados por cualquier tratamiento conocido
para un experto en la técnica que interfiera con la unión y/o
actividad de carbohidratos, incluyendo el tratamiento de las lacas
con un exceso del mismo carbohidrato o de uno similar, el
tratamiento con un quelante que evite la unión al carbohidrato, o
preferiblemente el tratamiento con un compuesto enzimático o no
enzimático que digiera el carbohidrato no unido. Los péptidos que
han sido aislados usando el método de la presente invención dirigido
contra el HA eran todos específicos y ninguno contenía los restos
comúnmente encontrados en el péptido de unión a poliestireno.
Se pueden identificar y aislar los péptidos que
tienen capacidad de unirse a glicosaminoglicanos usando una librería
peptídica de exhibición de fagos. Las librerías para uso en el
método de la invención están constituidas por secuencias peptídicas
expresadas como fusiones con una proteína de cubierta de un
bacteriófago. La proteína fusionada se exhibe sobre la cubierta
proteica del virión, mientras que el ADN codificante de la fusión
permanece en el virión. Se pueden usar librerías peptídicas
aleatorias para rastrear péptidos que se unen a un epitopo de
interés exponiendo la librería de viriones a un glicosaminoglicano
"blanco" inmovilizado y aislando los fagos que se unen
específicamente a este glicosaminoglicano.
Scott y Smith (1990) presentaron un método de
definición de ligandos peptídicos usando inserciones peptídicas
sintetizadas aleatoriamente en bacteriófago. Se publicaron métodos
relacionados por Cwirla y col. (1990) y por Devlin y col. (1990).
Desde aquel momento, ha surgido una literatura en la que se han
usado tanto las inserciones hexapeptídicas originales como
inserciones mayores en la identificación de epitopos reconocidos por
entidades de unión.
El tamaño medio de los péptidos en las librerías
de exhibición de fagos puede variar, pero preferiblemente los
péptidos son al menos octapéptidos (8-meros), más
preferiblemente al menos decapéptidos (10-meros),
más preferiblemente al menos dodecapéptidos
(12-meros). Las librerías para uso en la presente
invención habrán sido preferiblemente construidas en un vector Fuse
5 (Scott y Smith 1990) por inserción de una mezcla de
oligonucleótidos sintéticos, con los péptidos aleatorios fusionados
a la proteína menor de la cubierta vírica pIII del bacteriófago. Se
pueden utilizar otros sistemas similares, como será aparente para un
experto en la técnica al leer esta descripción. Preferiblemente, la
complejidad de las librerías usadas son de al menos 10^{6}, más
preferiblemente de al menos 10^{8} e incluso más preferiblemente
de al menos 10^{9}. Como exhibiciones de fagos ejemplares, se
incluyen las descritas en Barbas y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 89: 4457-4461 (1992), y Garrard y
col., Gene 128: 103-109 (1993).
El protocolo de exhibición de fagos de la
presente invención puede ser modificado para obtener nuevos restos
peptídicos con mejor potencial de unión a HA. Por ejemplo, se puede
acortar el período de incubación en el procedimiento de
panoramización para seleccionar clones de fagos con velocidades
rápidas de instauración. Alternativamente, si el procedimiento de
panoramización inicial no produce un péptido con suficiente
estructura secundaria (v.g., enrollamiento aleatorio), que es
normalmente necesaria para una unión eficiente, se puede utilizar
una librería de fagos "con constricción de cistina" para
identificar nuevos restos peptídicos con estructura
"constreñida" y mejor unión. Véase, por ejemplo, S.E. Cwirla y
col., Science, 276: 1696 (1997). La caracterización
bioquímica del Péptido 1 proporcionará también una plataforma desde
la que poder diseñar un segundo conjunto de péptidos modificados con
mejor unión, estabilidad e incluso penetración.
Se puede practicar la técnica de exhibición de
fagos de la invención en solución o usando un soporte sólido. Por
ejemplo, si el carbohidrato que se ha de unir se asocia con un
anticuerpo, el ensayo puede tener lugar en solución y el complejo
carbohidrato-péptido puede ser purificado usando
técnicas de inmunoprecipitación. La técnica puede ser también
llevada a cabo usando una superficie de soporte con carbohidrato
asociado, que da lugar a que los péptidos que se asocian con el
carbohidrato estén inmovilizados sobre la superficie de soporte. La
superficie de soporte para uso en la técnica de exhibición de fagos
de la invención puede ser de cualquier material conocido en la
técnica, incluyendo soportes sólidos flexibles o rígidos. Por
flexible, se quiere decir que el soporte es capaz de ser doblado,
plegado o manipulado de forma similar sin ruptura. Como ejemplos de
materiales sólidos que son soportes sólidos flexibles con respecto a
la presente invención, se incluyen membranas, películas flexibles de
plástico y similares. Por rígido, se quiere decir que el soporte es
sólido y no se dobla fácilmente, es decir, que el soporte no es
flexible. Como tal, los substratos rígidos del método de la presente
invención son suficientes para proporcionar soporte físico y
estructura a los clones de fagos presentes sobre los mismos en las
condiciones de ensayo en las que se emplea la serie, particularmente
en condiciones de manipulación de alto rendimiento. Más aún, cuando
se doblan los soportes rígidos de la presente invención, son
proclives a ruptura. En una realización preferida, el soporte está
construido a partir de un plástico rígido y más preferiblemente el
soporte está construido a partir de poliestireno.
Varios grupos han identificado CD44 como un
receptor para HA (véase, v.g., Aruffo y col., Cell, 61: 1303
(1990); Lesley y col. Exp. Cell. Res., 187: 224 (1990);
Miyake y col., J. Exp. Med., 172: 69 (1990); Culty y col.,
J. Cell Biol., 111: 2765 (1990)). CD44 es una familia de
glicoproteínas de la superficie celular generadas por ayustamiento y
modificación post-traducción alternativos. Se
expresan varias isoformas de CD44 por muchos tipos celulares, tales
como las células T y las células B, los granulocitos, los monocitos,
los macrófagos y las CD, incluyendo las CL. En 1996, se describió
que la interacción HA-CD44 mediaba en el rodamiento
de los leucocitos sobre las células endoteliales, uno de los
numerosos procesos que tienen lugar en el viaje de los leucocitos
(véase, v.g., DeGrendele y col., J. Exp. Med., 111: 2765
(1996); Clark y col., J. Cell Biol., 134: 1075 (1996)). Se
sabe ahora que la interacción HA-CD44 media en
muchos sucesos fisiológicos y patológicos, incluyendo el viaje de
los leucocitos, la metástasis tumoral, el desarrollo de tejidos, la
hematopoyesis, la producción de citokinas, la activación de células
T y la apoptosis.
Los péptidos de la presente invención pueden ser
usados como agentes farmacológicos que o bien inhiben o bien
aumentan la interacción HA-CD44 y, por lo tanto, son
útiles para prevenir y/o tratar a pacientes con enfermedades
mediadas por esta interacción. Dichos péptidos son útiles en la
prevención de reacciones de hipersensibilidad de contacto e
hipersensibilidad de tipo retardado (véase, v.g., Camp y col., J.
Exp. Med., 178-497 (1993); Verdrengh y col.,
Scand. J. Immunol., 42: 353 (1995)) y para inhibir la
metástasis tumoral (véase, v.g., Bartolazzi y col., J. Exp.
Med., 180: 53 (1994); Guo y col., Cancer Res., 54: 1561
(1994); Zahalka y col., J. Immunol., 154: 5345 (1995)). Más
aún, los péptidos de la invención son útiles como moduladores de las
respuestas mediadas por HA-CD44, tales como las
documentadas en los modelos de artritis autoinmune inducida por
colágeno (véase, v.g., Verdrengh y col., Scand. J. Immunol.,
42: 353 (1995); Mikecz y col., Nat. Med., 1: 558 (1995);
Zeidler y col., Autoimmunity, 21: 245 (1995)).
Se pueden usar inhibidores peptídicos aislados
de HA para prevenir la inducción de reacciones inmunes en la fase de
sensibilización para inhibir las reacciones inflamatorias en la fase
de estimulación. Esto se basa, en parte, en las siguientes
observaciones: los queratinocitos expresan cantidades relativamente
grandes de hialuronano (HA) de la superficie celular y la línea de
células de Langerhans (CL) a largo plazo XS106 exhibe un rodamiento
significativo sobre placas revestidas de HA, así como sobre
monocapas confluentes de queratinocitos en condiciones de flujo
fisiológicas; el rodamiento de las células XS106 es bloqueado por HA
soluble y la inyección local de HA soluble en la piel de ratón
inhibe casi por completo la emigración de CL disparada por
aplicación tópica de DNFB (véase, v.g., Mohamadzadeh y col., J.
Invest. Dermatol., en imprenta: (resumen) (1999)). Los péptidos
aislados usando el método de la invención son así útiles para
inhibir un mecanismo de migración de CD, v.g., una interacción entre
HA (sobre queratinocitos) y CD44 (sobre CL activadas).
CD44 es sólo uno de los varios receptores para
HA y HA es sólo uno de los varios ligandos de CD44. Otras moléculas,
incluyendo, aunque sin limitación, RHAMM, agrecano, versicano,
proteína de unión, el receptor de HA LEC, hialuronectión, proteínas
relacionadas con el inhibidor de
inter-\alpha-tripsina, BEHAB,
CD38, CD54 y hialuronidasa (HAasa), también se unen a HA (véase,
v.g., Kahn y col., J. Orthop. Res., 12: 612 (1994); Knudson y
col., FASEB J., 7: 1233 (1993)). Los péptidos aislados pueden
potenciar o inhibir también la actividad mediada por HA a través de
estas moléculas, como será aparente para un experto en la técnica
tras la lectura de la presente descripción.
Los péptidos aislados de la invención pueden ser
usados en una variedad de aplicaciones, incluyendo terapias humanas
y veterinarias, solos o en combinación con otros agentes
terapéuticos. La administración de los inhibidores o incrementadores
peptídicos puede ser ventajoso sobre la administración de otros
agentes terapéuticos debido a su menor peso molecular, que puede
permitir al péptido entrar en las células más fácilmente que los
otros agentes terapéuticos de mayor peso molecular, tales como
anticuerpos. Por lo tanto, los moduladores peptídicos de la
actividad de los glicosaminoglicanos tendrán una mejor
biodisponibilidad que los agentes terapéuticos que tienen mayores
pesos moleculares.
Los péptidos que inhiben la actividad HA pueden
ser usados en el tratamiento de enfermedades asociadas a un exceso
de hialurón y/o como agentes anticancerosos solos o en combinación
con agentes quimioterapéuticos. Es de particular interés la
administración de péptidos anti-HA a pacientes que
sufren de ictus o de infarto de miocardio (v.g., por infusión)
(véase, v.g., Maclean y col., 1976, Science 194:
199-200; Opie 1980, Am. Heart J. 100:
531-52). La administración de inhibidores peptídicos
de HA a pacientes que sufren de infarto de miocardio puede facilitar
una reducción en la presión sobre los tejidos miocárdicos, prevenir
la necrosis tisular y aliviar el edema. El uso de inhibidores
peptídicos de la actividad HA en el tratamiento de pacientes con
infarto de miocardio es ventajoso sobre el uso de agentes
terapéuticos tales como la hialuronidasa (HAasa), ya que la
actividad del péptido es específica para el HA y, por lo tanto, no
será inhibida por la heparina. La heparina es frecuentemente
administrada durante los ataques de corazón y es un inhibidor muy
potente de la actividad HAasa de otras HA- asas que contienen esta
unidad de EGF. Como los inhibidores peptídicos del HA no están
sujetos a regulación por la heparina, el clínico no tiene que
preocuparse de la coadministración de heparina con el péptido
anti-HA.
Los péptidos que inhiben la actividad HA pueden
ser también usados en el tratamiento del edema asociado a tumores
cerebrales, particularmente el asociado al glioblastoma multiforme.
El edema asociado a tumores cerebrales resulta de la acumulación de
HA en las porciones no cancerosas del cerebro adyacentes al tumor.
La administración del inhibidor peptídico específico de HA a los
sitios de acumulación de hialuronano (v.g., por inyección
intravenosa o por un shunt) puede aliviar el edema asociado con
dichas malignidades uniéndose al, y evitando la actividad del,
exceso de HA en estos sitios. Así, los inhibidores del HA pueden ser
eficaces en el tratamiento de tumores cerebrales, no sólo en la
reducción de la masa tumoral y la inhibición del crecimiento y/o la
metástasis del tumor, sino que también son útiles para aliviar el
edema asociado a la malignidad.
Es de particular interés el uso de inhibidores
peptídicos específicos de HA en el tratamiento del cáncer. Los
péptidos anti-HA aislados pueden ser usados como
agente quimioterapéutico (solos o en combinación con otros
quimioterápicos) en el tratamiento de cualquiera de una variedad de
cánceres, particularmente tumores invasivos. Por ejemplo, los
péptidos de la invención pueden ser usados en el tratamiento del
carcinoma de células pulmonares pequeñas y del carcinoma de células
pulmonares escamosas, así como de cánceres de mama, ovarios o de
cualquier otro cáncer asociado a niveles aumentados de HA. Los
péptidos anti-HA pueden ser también usados para
aumentar la sensibilidad de tumores que son resistentes a la
quimioterapia convencional.
Los inhibidores peptídicos específicos de HA
pueden ser también usados en el tratamiento, el mejoramiento y/o la
prevención de enfermedades infecciosas, tales como la infección por
el VIH. Por ejemplo, se sabe que el VIH y otros organismos
infecciosos se unen al HA en la infección de células. Los péptidos
de la invención pueden ser usados para inhibir esta interacción o la
actividad mediada por HA que surge de la interacción del HA con un
organismo infeccioso.
Dado que se sabe que el HA está implicado en la
migración de células tales como leucocitos, los péptidos que inhiben
la actividad del HA pueden ser también útiles en el tratamiento y/o
la prevención de la inflamación. Por ejemplo, se puede tratar a un
paciente con una enfermedad autoinmune, v.g., lupus o artritis
reumatoide, con una composición de la invención, sistémica o
localmente, v.g., por inyección en una articulación para disminuir
la inflamación causada por la artritis. Además, los péptidos de la
invención pueden ser útiles para prevenir problemas autoinmunes que
surgen de procedimientos tales como trasplantes de médula ósea,
v.g., supresión de la enfermedad del
injerto-contra-el-huésped.
Los péptidos de la invención pueden ser también
útiles como forma de contracepción, ya que se sabe que el HA media
en la unión del esperma al oocito. Los péptidos que inhiben el HA
pueden inhibir la unión entre el esperma y el oocito, ya que dicha
unión requiere unión mediada por HA, y prevenir así de forma
efectiva la fertilización, evitando de este modo eficazmente la
formación del zigoto.
En algunas aplicaciones terapéuticas del péptido
de la invención, puede ser deseable modificar los péptidos para
disponer de una o más características deseables. Se conocen en la
técnica diversos métodos de aumento de la vida media de una proteína
e incluyen, por ejemplo, la conjugación de la proteína a restos de
polietilenglicol, es decir, PEGilación (véase, por ejemplo, USPN
4.179.337; USPN 5.166.322; USPN 5.206.344; Nucci y col., Adv.
Drug Delivery Rev. 4: 133-151 (1991); Zalipsky y
col., "Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems", ACS (1991)),
conjugación de la proteína a dextrano (Mak-simenko,
Bull. Exp. Biol. Med. (Russian) 52: 567-569
(1986)) y la desglicosilación de la proteína por tratamiento con
endoglicosidasa F (Lace y col., Carbohydrate (1990)).
Cuando se usa en el tratamiento terapéutico de
la enfermedad, se puede determinar una dosificación apropiada de un
anti-glicosaminoglicano, o mezcla de ellos, por
cualquiera de varias metodologías bien establecidas. Por ejemplo, se
usan comúnmente estudios con animales para determinar la dosis
máxima tolerable, o DMT, de agente bioactivo por kilogramo de peso.
En general, al menos una de la especie animal estudiada es mamífera.
Los expertos en la técnica extrapolan de manera regular las dosis
para la eficacia y evitando la toxicidad para otras especies,
incluida la humana. Adicionalmente, también se pueden alterar las
dosificaciones terapéuticas dependiendo de factores tales como la
gravedad de la infección y el tamaño o especie del hospedador.
Cuando se contempla el uso terapéutico de los
péptidos aquí descritos, los péptidos son preferiblemente
administrados en un soporte farmacéuticamente aceptable, por métodos
orales, intranasales, rectales, tópicos, intraperitoneales,
intravaginales, intravenosos, intramusculares, subcutáneos,
intracraneales, subdérmicos, transdérmicos o intratraqueales o
similares.
Típicamente, aunque no necesariamente, la
formulación preferida para un péptido
anti-glicosamino-glicano dado
depende de la localización en un hospedador donde se esperaría que
un organismo infeccioso dado invadiera inicialmente, o donde se
esperaría que un organismo infeccioso dado colonizara o se
concentrara. Por ejemplo, las infecciones tópicas son
preferiblemente tratadas o prevenidas por formulaciones diseñadas
para aplicación tópica. Por ejemplo, en una realización preferida,
el péptido es formulado en una base de agua, etanol y propilenglicol
para administración tópica. Alternativamente, cuando la región de
inflamación objeto es interna, se puede disponer de preparaciones de
péptidos por dosificación oral. Adicionalmente, se puede tratar la
inflamación pulmonar tanto parenteralmente como por aplicación
directa de formas adecuadamente formuladas de los péptidos al pulmón
por terapia de inhalación o administración intranasal.
Preferiblemente, como hospedadores animales que
pueden ser tratados usando los péptidos de la presente invención, se
incluyen, aunque sin limitación, invertebrados, vertebrados, aves y
mamíferos, tales como cerdos, cabras, ovejas, vacas, perros, gatos y
particularmente humanos.
Los péptidos aquí descritos pueden ser
formulados con una variedad de moléculas de soporte fisiológicas.
Los péptidos aislados pueden también formar complejos con moléculas
que aumentan su capacidad para entrar en las células blanco. Como
ejemplos de tales moléculas, se incluyen, aunque sin limitación,
carbohidratos, poli-aminas, aminoácidos, péptidos,
lípidos y moléculas vitales para el crecimiento bacteriano. Por
ejemplo, los péptidos pueden combinarse con un lípido, un lípido
catiónico o un lípido aniónico. La emulsión péptido/lípido
resultante, o la suspensión liposómica, puede aumentar, entre otros,
de manera efectiva la vida media in vivo del péptido. Como
ejemplos de lípidos aniónicos adecuados para uso con péptidos
terapéuticos, se incluyen, aunque sin limitación, cardiolipina,
dimiristoílo, dipalmitoílo o
di-oleoilfosfatidilcolina o fosfatidilglicerol,
palmitoil-oleoilfosfatidilcolina o
fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, ácido lisofosfatídico,
fosfatidilserina, fosfatidilinositol y formas aniónicas de
colesterol. El uso de composiciones o liposomas de lípidos
catiónicos, aniónicos y/o neutros está generalmente descrito en las
Publicaciones Internacionales Nº WO 90/14074, WO 91/16024, WO
91/17424 y Patente EE.UU. Nº 4.897.355. Montando los péptidos
moduladores de glicosaminoglicanos en estructuras asociadas a
lípidos, los péptidos pueden dirigirse a tipos específicos de
células bacterianas por incorporación de agentes de abordaje
adecuados (es decir, anticuerpos o receptores específicos) en el
complejo péptido/lípido.
Se pueden preparar composiciones farmacéuticas
que contienen los péptidos de la invención en mezcla con un soporte
farmacéutico según técnicas de composición farmacéuticas
convencionales. El soporte puede adoptar una amplia variedad de
formas dependiendo de la forma de preparación deseada para
administración, v.g., intravenosa, oral, tópica, aerosol (para
administración tópica o pulmonar), supositorio, parenteral o
inyección espinal.
Al preparar las composiciones en forma de
dosificación oral, se puede emplear cualquiera de los medios
farmacéuticos habituales, tales como, por ejemplo, agua, glicoles,
aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservantes, agentes
colorantes y similares en el caso de preparaciones líquidas orales
(tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones),
soportes tales como almidones, azúcares, diluyentes, agentes
granulantes, lubricantes, ligantes, agentes desintegrantes y
similares en el caso de preparaciones sólidas orales (tales como,
por ejemplo, polvos, cápsulas y tabletas). Debido a su facilidad de
administración, las tabletas y las cápsulas representan la forma
unitaria de dosificación oral más ventajosa, en cuyo caso obviamente
se emplean soportes farmacéuticos sólidos. Si se desea, las tabletas
pueden ser revestidas de azúcar o con un revestimiento entérico por
técnicas estándar.
Para aplicación parenteral por inyección, las
preparaciones pueden consistir en una solución acuosa de una forma
soluble, o solubilizada, en agua y farmacéuticamente aceptable del
péptido en una solución salina apropiada. También se pueden preparar
suspensiones inyectables usando soportes líquidos, agentes
suspensores, agentes para el ajuste de la isotonicidad, agentes
conservantes y similares apropiados. Los métodos reales para la
preparación de composiciones parenteralmente administrables y los
ajustes necesarios para administración a sujetos serán conocidos o
aparentes para los expertos en la técnica y se describen con más
detalle, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Science,
15ª Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1980). Los péptidos
aquí descritos deben ser administrados parenteralmente a
concentraciones por debajo de la dosis máxima tolerable (DMT)
establecida para el péptido particular que se haya de
administrar.
Para administración tópica, el soporte puede
adoptar una amplia variedad de formas dependiendo de la preparación,
que puede ser una crema, un apósito, un gel, una loción, un ungüento
o un líquido.
Los aerosoles pueden ser preparados disolviendo
o suspendiendo la preparación de proteína aislada en un propulsor,
tal como alcohol etílico, o en fases de propulsor y solvente. Las
composiciones farmacéuticas para forma tópica o de aerosol
contendrán generalmente de aproximadamente un 0,01% en peso (del
péptido) a aproximadamente un 40% en peso, preferiblemente de
aproximadamente un 0,02% a aproximadamente un 10% en peso y más
preferiblemente de aproximadamente un 0,05% a aproximadamente un 5%
en peso, dependiendo de la forma particular empleada.
Los supositorios son preparados mezclando el
péptido con un vehículo lipídico, tal como aceite de teobroma,
manteca de cacao, glicerina, gelatina o polioxi- etilenglicoles.
Los péptidos aislados aquí descritos pueden ser
administrados al organismo virtualmente por cualquier medio usado
para administrar antibióticos convencionales. Una variedad de
sistemas de administración son bien conocidos en la técnica para
administrar compuestos bioactivos a un mamífero. Estos sistemas
incluyen, aunque sin limitación, la inyección intravenosa o
intramuscular o intratraqueal, la pulverización nasal, aerosoles
para inhalación y la administración oral o por supositorio. El
sistema de administración específico usado depende de la
localización del área que se ha de tratar y está dentro del
conocimiento de un experto en la técnica determinar la localización
y seleccionar un sistema de administración apropiado.
Como ejemplos adecuados de preparaciones de
liberación mantenida, se incluyen matrices semipermeables de
polímeros hidrofóbicos que contienen el péptido, cuyas matrices
están en forma de artículos dotados de forma, v.g., películas o
microcápsulas. Como ejemplos de matrices de liberación mantenida, se
incluyen poliésteres, hidrogeles (v.g., poli(metacrilato de
2-hidroxietilo), como se describe por Langer y col.
(1981), J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, y Langer
(1982), Chem. Tech. 12: 98-105, o
poli(alcohol vinílico), polilactidas (Patente EE.UU. Nº
3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido
L-glutámico y
gamma-L-glutamato de etilo (Sidman y
col. (1983), Biopolymers 22: 547-556),
etileno-acetato de vinilo no degradable (Langer y
col. (1981), antes citado), copolímeros de ácido láctico-ácido
glicólico degradables, tales como Lupron Depot™ (microesferas
inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido
glicólico y acetato de leuprolida) y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico
(EP 133.988).
Las composiciones que inhiben la actividad
glicosaminoglicano pueden también estar atrapadas en microcápsulas
preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por
polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o
microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato
de metilo), respectivamente) en sistemas de administración de
fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de
albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en
macroemulsiones. Dichas técnicas están descritas en Remington's
Pharmaceutical Sciences, antes citado.
Aunque polímeros tales como
etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido
glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100
días, ciertos hidrogeles liberan moléculas durante períodos de
tiempo más cortos. Cuando las moléculas encapsuladas permanecen en
el organismo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o
agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando
lugar a una pérdida de actividad biológica y a posibles cambios en
la inmunogenicidad. Se pueden contemplar estrategias racionales para
estabilización dependiendo del mecanismo implicado, v.g., usando
aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz
polimérica específicas.
Las composiciones de liberación mantenida
incluyen también péptidos atrapados liposomalmente. Los liposomas
que contienen composiciones de la invención son preparados por
métodos conocidos per se: DE 3.218.121; Epstein y col.
(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692;
Hwang y col. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:
4030-4034; EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP
143.949; EP 142.641; JP 60-7934 (solicitud de
patente Japonesa 83-118008); Patentes EE.UU. Nº
4.485.045 y 4.544.545, y EP 102.324. Ordinariamente, los liposomas
son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente
200-800 Angstroms), en donde el contenido en lípido
es mayor de aproximadamente el 30% molar de colesterol, siendo
ajustada la proporción seleccionada para la terapia óptima. Un
ejemplo específico de una formulación de liberación mantenida
adecuada está en EP 647.449.
Una cantidad efectiva de la composición para
empleo terapéutico dependerá, por ejemplo, de los objetivos
terapéuticos, de la vía de administración y de la condición del
paciente. En consecuencia, será necesario que el clínico titule la
dosificación y modifique la vía de administración según sea
necesario para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una
dosificación diaria típica de una molécula usada sola podría variar
de aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal del
paciente o más al día, dependiendo de los factores antes
mencionados, preferiblemente de aproximadamente 10 \mug/kg/día a
50 mg/kg/día.
Se pueden administrar terapéuticamente
secuencias nucleotídicas, incluyendo secuencias antisentido, por
diversas técnicas conocidas para los expertos en la técnica. La
administración de secuencias nucleotídicas codificantes de
moduladores de la actividad de carbohidratos puede ser conseguida
usando polinucleótido libre o un vector de expresión recombinante,
tal como un virus quimérico, o un sistema de dispersión coloidal. Es
especialmente preferido para administración terapéutica de
secuencias nucleotídicas el uso de liposomas dirigidos.
Es deseable dirigir el reactivo terapéutico a
tejidos específicos para aumentar la eficiencia de la
administración. Se puede conseguir el abordaje por mecanismos
pasivos a través de la vía de administración. También se puede
emplear el abordaje activo de tejidos específicos. El uso de
liposomas, suspensiones coloidales y vectores víricos permite el
abordaje de tejidos específicos cambiando la composición de la
formulación que contiene el reactivo terapéutico, por ejemplo,
incluyendo moléculas que actúan como receptores para componentes de
los tejidos blanco. Como ejemplos, se incluyen azúcares,
glicolípidos, polinucleótidos o proteínas. Estas moléculas pueden
ser incluidas con el reactivo terapéutico. Alternativamente, estas
moléculas pueden ser incluidas por métodos indirectos, por ejemplo,
por inclusión de un polinucleótido que codifica la molécula, o
mediante el uso de sistemas de empaquetamiento que proporcionan
moléculas de abordaje. Los expertos en la técnica sabrán, o
determinarán con el uso de la enseñanza aquí aportada, qué moléculas
y procedimientos serán útiles para la administración del reactivo
terapéutico a tejidos específicos.
Los péptidos aislados de la invención pueden ser
usados en productos cosméticos, tales como lociones, cremas o
soluciones tópicas. Por ejemplo, los péptidos de la invención pueden
ser usados en lociones tópicas como agente antiinflamatorio para
reducir la hinchazón epidérmica. Así, los péptidos de la invención
pueden ser usados con cualquier preparación cosmética conocida donde
dicho uso pueda ser beneficioso, incluyendo, aunque sin limitación,
lociones, fundaciones, cremas, geles, jabones y similares. Los
péptidos están presentes en una cantidad suficiente para tener un
efecto antibacteriano y preferiblemente entre un 0,25% en peso y un
10,0% en peso, más preferiblemente entre un 0,5% en peso y un 5,0%
en peso.
La composición cosmética de la invención puede
contener cualquiera de una serie de aditivos que son en sí mismos
ingredientes activos, tales como ácido glicólico o
\alpha-hidroxiácidos, palmitato de vitamina A
(palmitato de retinilo) y/o acetato de vitamina E (acetato de
tocoferilo). Cada uno de éstos está preferiblemente presente en una
cantidad de aproximadamente el 0,5% en peso a aproximadamente el 5%
en peso. Además, se puede usar un absorbente UV o un material
bloqueante, tal como el PABA.
También se pueden añadir otros compuestos para
tener efectos humectantes adicionales y para mejorar la consistencia
de la composición. Como ejemplos de tales compuestos, se incluyen,
aunque sin limitación: cera de ésteres de certilo, alcohol
estearílico, alcohol cetílico, glicerina, metilparabén,
propilparabén, quaternium-15, humectantes, fluidos
de metilsiloxano volátiles y
polidiorganosiloxano-polioxialquileno. Véanse, v.g.,
las Patentes EE.UU. Nº 5.153.230 y 4.421.769. Es deseable que la
composición tenga efectos limpiadores adicionales; se pueden añadir
agentes químicos, tales como laurilsulfato de sodio o una sal
metálica de un ácido carboxílico.
Es útil aquí una amplia variedad de emolientes
no volátiles, ejemplos no limitativos de los cuales están enumerados
en McCutcheon's, Vol. 2, Functional Materials, North
American Edition (1992), pp. 137-168, y en CTFA
Cosmetic Ingredient Handbook, Segunda Edición (1992), que
enumera Agentes Acondicionantes Cutáneos en las pp.
572-575 y Protectores Cutáneos en la p. 580.
Entre los materiales emolientes no volátiles
útiles aquí se prefieren especialmente siliconas, hidrocarburos,
ésteres y sus mezclas.
Como ejemplos de emolientes de silicona se
incluyen polialquilsiloxanos, polialquilsiloxanos cíclicos y
polialquilarilsiloxanos. Los polialquilsiloxanos útiles aquí
incluyen, por ejemplo, polialquilsiloxanos con viscosidades de
aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100.000 centistokes a 25ºC.
Dichos polialquilsiloxanos corresponden a la fórmula química general
R_{3}SiO[R_{2}SiO]_{x}SiR_{3}, donde R es un
grupo alquilo (preferiblemente R es metilo o etilo, más
preferiblemente metilo) y x es un número entero de 0 a
aproximadamente 500, seleccionado para conseguir el peso molecular
deseado. Como polialquilsiloxanos comerciales, se incluyen los
polidimetilsiloxanos, que son también conocidos como dimeticonas,
como ejemplos no limitativos de los cuales se incluyen la serie
Vicasil® vendida por General Electric Company y la serie Dow
Corning® 200 vendida por Dow Corning Corporation. Como ejemplos
específicos de polidimetilsiloxanos útiles aquí como emolientes, se
incluyen el fluido Dow Corning® 200, con una viscosidad de 0,65
centistokes y un punto de ebullición de 100ºC; el fluido Dow
Corning® 225, con una viscosidad de 10 centistokes y un punto de
ebullición de más de 200ºC, y los fluidos Dow Corning® 200, con
viscosidades de 50, 350 y 12.500 centistokes, respectivamente, y
puntos de ebullición mayores de 200ºC. Los polialquilsiloxanos
cíclicos útiles aquí incluyen los correspondientes a la fórmula
química general [SiR_{2}O]_{n}, donde R es un grupo
alquilo (preferiblemente r es metilo o etilo, más preferiblemente
metilo) y n es un número entero de aproximadamente 3 a
aproximadamente 8; más preferiblemente n es un número entero de
aproximadamente 3 a aproximadamente 7 y más preferiblemente n
es un número entero de aproximadamente 4 a aproximadamente 6. Cuando
R es metilo, se hace típicamente referencia a estos materiales como
ciclometiconas. Como ciclometiconas comerciales, se incluyen el
fluido Dow Corning® 244, que tiene una viscosidad de 2,5 centistokes
y un punto de ebullición de 172ºC, que contiene primariamente el
tetrámero de ciclometicona (es decir, n=4); el fluido Dow
Corning® 344, que tiene una viscosidad de 2,5 centistokes y un punto
de ebullición de 178ºC, que contiene primariamente el pentámero de
ciclometicona (es decir, n=5); el fluido Dow Corning® 245,
que tiene una viscosidad de 4,2 centistokes y un punto de ebullición
de 205ºC, que contiene primariamente una mezcla del tetrámero y del
pentámero (es decir, n=4 y 5) de ciclometicona, y el fluido
Dow Corning® 345, que tiene una viscosidad de 4,5 centistokes y un
punto de ebullición de 217ºC, que contiene primariamente una mezcla
del tetrámero, pentámero y hexámero de ciclometicona (es decir,
n=4, 5 y 6). También son útiles materiales tales como el
trimetilsiloxisilicato, que es un material polimérico
correspondiente a la fórmula química general
[(CH_{2})_{3}SiO_{1/2}]_{x}[SiO_{2}]_{y},
donde x es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente
500 e y es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente
500. Se vende un trimetilsiloxisilicato comercial como una mezcla
con dimeticona como fluido Dow Corning® 593. También son útiles aquí
los dimeticonoles, que son dimetilsiliconas acabadas en hidroxi.
Estos materiales pueden ser representados por las fórmulas generales
R_{3}SiO[R_{2}SiO]_{x}SiR_{2}OH y
HOR_{2}SiO[R_{2}SiO]_{x}SiR_{2}OH, donde R es
un grupo alquilo (preferiblemente R es metilo o etilo y más
preferiblemente metilo) y x es un número entero de 0 a
aproximadamente 500, seleccionado para conseguir el peso molecular
deseado. Se venden típicamente dimeticonoles comerciales como
mezclas con dimeticona o ciclometicona (v.g., fluidos Dow Corning®
1401, 1402 y 1403). También son útiles aquí los
polialquilarilsiloxanos, siendo preferidos los
polimetilfenilsiloxanos que tienen viscosidades de aproximadamente
15 a aproximadamente 65 centistokes a 25ºC. Estos materiales están
disponibles, por ejemplo, como fluido metilfenílico SF 1075 (vendido
por General Electric Company) y fluido de feniltrimeticona de Grado
Cosmético 556 (vendido por Dow Corning Corporation).
Los hidrocarburos aquí útiles incluyen
hidrocarburos de cadena lineal y ramificada que tienen de
aproximadamente 10 a aproximadamente 30 átomos de carbono, más
preferiblemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 átomos de
carbono y más preferiblemente de aproximadamente 16 a
aproximadamente 22 átomos de carbono. Como ejemplos no limitativos
de estos materiales hidrocarbonados, se incluyen dodecano,
escualano, colesterol, poliisobutileno hidrogenado, docosano (es
decir, un hidrocarburo C_{22}), hexadecano e isohexadecano (un
hidrocarburo comercial vendido como Permethyl® 101A por Presperse,
South Plainsfield, N.J.). Otros materiales hidrocarbonados útiles
aquí incluyen parafinas y aceites minerales, tales como aceite
mineral ligero USP (v.g., Kearol®, de Witco Corp., Melrose Park,
Ill.) y aceite mineral pesado USP (v.g., Klearol®, de Witco Corp.
Melrose Park, Ill.).
También son útiles como emolientes no volátiles
los ésteres, incluyendo los ésteres de ácidos grasos monofuncionales
y difuncionales que han sido esterificados con alcoholes y polioles
(es decir, alcoholes que tienen dos o más grupos hidroxi). Son
útiles aquí una amplia variedad de ésteres, siendo preferidos los
ésteres de cadena larga de ácidos grasos de cadena larga (es decir,
ácidos grasos C_{10-40} esterificados con
alcoholes grasos C_{10-40}). Como ejemplos no
imitativos de ésteres útiles aquí, se incluyen los seleccionados
entre el grupo consistente en adipato de diisopropilo, miristato de
isopropilo, palmitato de isopropilo, propionato de miristilo,
diestearato de etilenglicol, palmitato de
2-etilhexilo, neopentanoato de isodecilo, benzoato
de alcoholes C_{12-15}, maleato de
di-2-etilhexilo, palmitato de
cetilo, miristato de miristilo, estearato de estearilo, estearato de
cetilo, behenato de behenilo y sus mezclas.
Los siguientes ejemplos son expuestos para
proporcionar a quienes tienen un conocimiento ordinario en la
técnica una exposición y descripción completa de cómo hacer y usar
la invención en cuestión. Se han hecho esfuerzos por asegurar la
precisión con respecto a los números usados (v.g., cantidades,
temperatura, concentraciones, etc.), pero se habrán de permitir
algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se
indique en contrario, las partes son partes en peso, el peso
molecular es peso molecular medio, la temperatura está en grados
centígrados y la presión es la atmosférica o próxima a ella.
Se construyó una librería de fagos consistente
en péptidos 12-meros aleatorios fusionados a una
proteína menor de la envuelta (pIII) del fago M13. Se determinó que
la complejidad estimada de la librería era de aproximadamente
10^{9}. Se incubaron entonces clones de fago (10^{11} ufp) sobre
placas de cultivo de tejidos de poliestireno que habían sido
revestidas con HA y contra-revestidas con BSA.
Se revistieron las placas de cultivo de tejidos
de 35 mm durante la noche a 4ºC con 2,5 mg/ml de HA en PBS y se
lavaron entonces tres veces con PBS (2 min./lavado). Para bloquear
los sitios de unión no específica, se
contra-revistió luego la placa con BSA
desnaturalizada por calor al 1% en PBS durante 30 min. a temperatura
ambiente. Después de tres lavados adicionales con PBS, se añadió el
fago (10^{11} ufp) suspendido en PBS a la placa revestida de
HA/contra-revestida de BSA. Después de 60 min. de
incubación a temperatura ambiente, se eliminaron los clones de fago
no unidos por lavado extenso: 10 veces con PBS solo y 10 veces más
con Tween 20 al 0,1% en PBS durante 30 segundos cada lavado. Se
trataron entonces las placas durante 60 minutos a 37ºC con 30
unidades/ml de hialuronidasa (derivada de testículo bovino) en
fosfato de sodio (pH 6,0) con un 0,1% de BSA. Esto eluyó con
efectividad sólo aquellos clones de fago que se habían unido
específicamente al substrato de HA y no a las superficies de
poliestireno o a la BSA.
Se recogieron los clones de fago que se habían
liberado mediante este tratamiento con una pipeta y se amplificaron
para la siguiente ronda de panoramización. Se expandieron los clones
de fago en E. coli y se incubaron en placas de cultivo de
tejidos que habían sido revestidas con condroitín sulfato (CSA), un
glicosaminoglicano de control que también se une a CD44. Los clones
que no se unían al substrato de CSA fueron sometidos a un segundo
ciclo de selección sobre el substrato de HA. La eficacia del
procedimiento depende en gran medida del tratamiento con HAasa en la
etapa de elución.
Después de cuatro ciclos de selección, se
aislaron y secuenciaron 19 clones de fagos independientes que se
habían unido al substrato de HA. 13 de los 19 clones expresaban una
unidad peptídica idéntica de GAHWQFNALTVR (designada como Péptido 1,
SEC ID Nº: 1). Se identificaron dos unidades (Péptidos 2 y 3, SEC ID
Nº: 2 y SEC ID Nº: 3) que eran expresadas por múltiples clones de
fagos y dos (Péptidos 4 y 5, SEC ID Nº: 4 y SEC ID Nº: 5) que eran
expresadas por clones simples. En resumen, a pesar de una
complejidad teórica de 10^{9}, la mayoría (13/19) de los clones de
fagos seleccionaron una unidad peptídica idéntica (es decir, el
Péptido 1).
Ninguno de los péptidos aislados contenía
secuencias "diagnósticas" comúnmente encontradas en péptidos
que se unen no específicamente a la superficie de poliestireno.
Además, ninguno de los péptidos identificados mostró identidades de
secuencia significativas (>25%) con las secuencias del dominio de
unión a HA conocidas de CD44, RHAMM y la proteína de unión. B. Yang
y col., EMBO J. 13: 286 (1994). Aunque se detectó una unidad
de consenso conservada entre los tres receptores de HA antes
mencionados - B(X)_{7}B, donde B representa un
residuo de aminoácido básico y X representa un residuo de aminoácido
no ácido - en los Péptidos 1, 3 y 4, parecía que esta unidad no era
un factor en la capacidad de estos péptidos para unirse a HA. Los
residuos que eran aparentemente críticos para la unión eran
residuos alifáticos o alifáticos polares en las posiciones 4, 5 y 6
y de nuevo en 9, 10 y 11, definiendo así una unidad de unión
peptídica de ZZZXZZZ a partir de los residuos 4-11
del péptido. Por el contrario, los aminoácidos en las posiciones 3,
7 y 12 parecen ser dispensables y la posición 1 parece ser menos
importante que las otras 6.
Cada uno de los cuatro péptidos de unión a HA
aislados (Péptidos 1 a 4) y un péptido de control "aleatorio"
(seleccionado entre los clones de fagos que no pudieron unirse a HA)
fueron sintetizados para examinar su especificidad para el HA. La
secuencia del péptido aleatorio era SATPASAPYPLAGGGS (SEC ID Nº: 6).
Los péptidos estudiados tenían también una secuencia espaciadora de
GGGS en el extremo carboxi del péptido.
Se incubaron clones de fagos que expresaban cada
uno de los péptidos de unión a HA durante dos horas en placas de
poliestireno revestidas de HA. Después de un extenso lavado, se
eluyeron los fagos que estaban aún unidos al substrato de HA por
tratamiento con HAasa y se titularon los fagos aislados para
determinar el grado de la unión de cada péptido a HA. El Péptido 1
mostró la unión más significativa tanto a placas revestidas de HA
como a moléculas de HA nativas expresadas sobre queratinocitos.
Cada uno de los péptidos
12-meros indicados fue marcado con ^{125}I y
estudiado a 50 \mug/ml en cuanto a la unión a perlas revestidas de
HA. Se radiomarcaron los péptidos en el extremo N usando el reactivo
de Bolton-Hunter y se incubaron durante 2 horas a
4ºC. Después de la incubación, se lavaron las perlas tres veces y se
detectaron los niveles de unión. De nuevo, se vio que el Péptido 1
exhibía unión específica a las perlas revestidas de HA (Figura
1).
Se estudió entonces el Péptido I marcado con
^{125}I a diferentes concentraciones en cuanto a la unión a perlas
revestidas de HA. Se vio que la unión específica del péptido a las
perlas aumentaba con la concentración de péptido utilizada (Figura
2). Se determinó la especificidad del Péptido 1 para HA, más que
para cualquier glicosaminoglicano, incubando el Péptido 1 marcado
con ^{125}I con perlas revestidas de HA o revestidas de CSA en
presencia o ausencia de pretratamiento con HAasa. El Péptido 1
mostró un nivel mucho menor de unión a CSA, tanto con como sin
pretratamiento con HAasa (Figura 3). Los niveles de unión eran
ciertamente los mismos entre las perlas revestidas de CSA tratadas
con HAasa y las perlas de CSA no tratadas. La unión del Péptido 1 a
las perlas revestidas de HA aumentaba significativamente con
respecto a las perlas revestidas de HA pretratadas con HAasa,
indicando que la presencia de HA intacto es necesaria para la unión
específica.
Se estudió el Péptido 1 no marcado en cuanto a
su capacidad para inhibir la unión del Péptido 1 marcado con
^{125}I. Se incubaron primeramente perlas revestidas de HA con las
concentraciones indicadas de Péptido 1 no marcado (de 0 a 1.780
\muM). Una hora después, se añadió Péptido 1 marcado con ^{125}I
(50 \mug/ml) a las perlas y se estudió en cuanto a la unión. El
Péptido 1 no marcado inhibía con efectividad la capacidad del
péptido marcado de un modo dependiente de la concentración (Figura
4).
Se estudiaron el Péptido 1 al Péptido 4
biotinilados a 62 \muM en cuanto a la unión a células endoteliales
SVEC 10-40. Como control, se incubaron las células
con RP biotinilado. Después de lavar para eliminar los péptidos no
unidos, se incubaron las células con
estreptavidina-FITC y se sometieron a análisis FACS
(Figura 5). El Péptido 1 exhibía una afinidad mucho mayor por las
células endoteliales que RP o que los Péptidos
2-4.
Se trataron entonces las células SVEC con
hialuronidasa (330 U/mol) o se hizo un simulacro de tratamiento
(histograma abierto con líneas discontinuas) antes de la incubación
con Péptido 1 biotinilado (62 \muM) o RP biotinilado. La
eficiencia de unión del Péptido se redujo dramáticamente en las
células tratadas con HAasa en comparación con las células tratadas
en simulacro (Figura 6).
Para examinar la capacidad de unión competitiva
del Péptido 1, se incubaron diversas concentraciones de HA conjugado
a FITC a las concentraciones indicadas con células de timoma BW5147
como se muestra en la Figura 7. Las células fueron incubadas con
Péptido 1 durante una hora sobre hielo. Después de la incubación,
las células fueron lavadas tres veces con PBS de Dulbecco (Sigma)
con un 5% de suero de ternera fetal para eliminar el HA conjugado a
FITC no unido. Las células fueron analizadas por FACS para
determinar las intensidades fluorescentes medias (IFM). Los datos
fueron representados linealmente y evaluados con un ajuste
hiperbólico. Se determinó la saturación como a 1,40 \mug/ml y la
saturación era de 279,40 \mug/ml.
Se estudió el HA marcado con FITC en cuanto a la
unión a células BW5147 antes (Figura 8, histograma abierto) o
después (Figura 8, histograma sombreado) del pretratamiento con
Péptido 1. Se incubó 1 \mug/ml de FITC-HA con
células BW5147 y o bien Péptido 1 (Figura 8a) o bien RP (Figura 8b),
ambos a 500 \mug/ml. Los histogramas con líneas discontinuas
representan el nivel de autofluorescencia tras incubación con PBS
solo. La unión de HA a células pretratadas con Péptido 1 disminuyó
significativamente en comparación con células tratadas con Péptido 1
después de la unión del HA (Figura 8a). Por el contrario, las
células tratadas con RP no mostraron diferencia entre el
pretratamiento y el tratamiento después de la unión de HA (Figura
8b).
También se estudió la capacidad del Péptido 1 o
de RP para inhibir la unión de HA subsiguiente a células BW5147 con
diferentes concentraciones de Péptido 1 (Figura 9). Las células
tratadas con RP no mostraron diferencia en la unión de HA con una
mayor unión de RP, mientras que el tratamiento con Péptido 1 produjo
una disminución en la unión de HA de un modo dependiente de la
concentración.
Se estudió entonces el Péptido 1 en cuanto a su
capacidad para bloquear la adhesión de leucocitos dependiente de
CD44 de células BW5147 a substratos revestidos de HA. Se incubaron
células BW5147 marcadas con ^{35}S durante 30 minutos a
temperatura ambiente en pocillos de cultivo que habían sido
revestidos con diversas concentraciones de HA (véase la Figura 10).
Después de tres lavados en PBS de Dulbecco (Sigma) para eliminar las
células no unidas, se lisaron las células unidas en SDS al 1% y se
midió la radiactividad de cada pocillo para determinar el número de
células adheridas a cada pocillo. Los datos mostrados en la Figura
10 son las medias \pm S.D. del % de unión de muestras por
triplicado. La cantidad de radiactividad detectada aumentaba con el
aumento en la concentración de HA.
Se estudió entonces la unión de células BW5147
marcadas con ^{35}S a los pocillos revestidos de HA (0,1
\mug/ml) después del pretratamiento de las células con 1) 70
\mug/ml de mAb anti-CD44 (KM81) o IgG control o 2)
después del pretratamiento del substrato con Péptido 1 o RP, cada
uno a 250 \mug/ml (Figura 11). Las células incubadas con el
anticuerpo CD-44 o con Péptido 1 exhibían una unión
reducida en comparación con los controles de IgG y RP,
respectivamente.
Se marcaron células T esplénicas murinas,
células T de sangre periférica humana o la línea de células de
Langerhans murina XS106 con ^{35}S y se estudiaron en cuanto a la
adhesión a las placas revestidas de HA en presencia o ausencia del
pretratamiento indicado (Figura 13). Como se muestra, las células
pretratadas con Péptido 1 exhibían un nivel significativamente menor
de unión en los tres tipos celulares. Todos los datos de cada panel
representan al menos dos experimentos independientes, mostrando las
medias \pm S.D. del % de unión de muestras por triplicado. Los
corchetes indican grupos comparados por la prueba t de Student de
dos colas. Todas las comparaciones fueron hechas por la prueba
t de Student de 2 colas en relación a la adhesión celular sin
inhibidor.
Para determinar los residuos críticos para la
unión del Péptido 1 a HA, se substituyeron aminoácidos individuales
en la secuencia del Péptido 1 con alanina por mutagénesis de
barrido. Se estudiaron el Péptido 1 de tipo salvaje o cada uno de
los mutantes de Alanina del Péptido 1 a 250 \mug/ml en cuanto al
impacto sobre la adhesión de células BW5147 marcadas con ^{35}S
sobre pocillos revestidos de HA (Figura 14). Los resultados de la
mutagénesis de barrido de Ala indican que se requieren residuos
alifáticos polares y no polares para la unión del Péptido 1 a HA.
Todos los datos de cada panel representan al menos dos experimentos
independientes, mostrando las medias \pm S.D. del % de unión de
muestras por triplicado. Los corchetes indican grupos comparados por
la prueba t de Student de dos colas. Todas las comparaciones fueron
realizadas por la prueba t de Student de dos colas en
relación a la adhesión celular sin inhibidor. Es interesante el
hecho de que una cara de la molécula de HA es relativamente no polar
(como se indica por los grupos -CH numerados), mientras que la otra
cara es relativamente polar (Figura 14). Por lo tanto, el Péptido 1
puede interaccionar con las caras polar y no polar del HA.
Se ha observado previamente que la inyección
local de HA soluble en piel de ratón inhibe la emigración disparada
por haptenos de la célula de Langerhans (CL) desde la epidermis
(Mohamadzadeh y col., J. Invest. Dermatol., en imprenta:
(resumen) (1999)). Así, era de particular interés determinar si el
Péptido 1 bloquearía la migración de CL.
Se vio que el Péptido 1 inhibía la función
biológica del HA en su papel de mediador en la migración de las
células de Langerhans. Ratones BALB/c (5 ratones/grupo) recibieron
dos inyecciones subcutáneas (40 \mul/inyección) de la preparación
de péptido indicada (1 mg/ml en DMSO al 2%). Se inyectaron cinco
ratones por grupo y cada grupo de ratones recibió dos inyecciones en
ambas orejas, una 24 horas antes y una 1 hora antes de la aplicación
tópica de
1-fluoro-2,4-dinitrobenceno
(DNFB, Sigma Chem. Corp.) al 0,5%. Se aplicó el DNFB en la oreja
derecha de cada ratón y se aplicó el soporte vehículo, consistente
en aceite de oliva y acetona, en la oreja izquierda como control
negativo.
Los ratones fueron sacrificados 24 horas después
de la aplicación del DNFB y se recogieron las muestras de piel de
las orejas. Se prepararon láminas epidérmicas de cada muestra de
piel de la oreja, se tiñeron con anticuerpo monoclonal
anti-Ia conjugado a FITC y se examinaron en cuanto
al número de CL (Figura 16).
En los grupos control inyectados con PBS, la
aplicación de DNFB redujo el número de CL substancialmente y provocó
cambios morfológicos en comparación con el grupo control de PBS sin
aplicación de DNFB. Por el contrario, la aplicación de DNFB en los
sujetos a los que se inyectó el Péptido 1 indujo cambios
morfológicos sin afectar significativamente al número de CL.
Estas observaciones fueron confirmadas por
recuento del número de CL positivas a Ia usando microscopía de
fluorescencia. Como se muestra en la Figura 16, la pintura con DNFB
en ratones no tratados indujo un 50% de reducción en las densidades
de CL en superficie. La inyección de Péptido 1 y de HA soluble
inhibió casi por completo la reducción de CL mediada por DNFB,
mientras que ninguno produjo un efecto en los ratones no
tratados.
El examen histológico de muestras de orejas
recogidas de estos animales reveló que el grado de infiltración
leucocitaria inducida por DNFB estaba marcadamente disminuido en los
sitios inyectados con Péptido 1. Es importante el hecho de que el
Péptido 1 inhibiera la migración dirigida a la piel de neutrófilos y
de células T, con la implicación de que el Péptido 1 puede ser usado
para bloquear la emigración de leucocitos residentes en tejidos
(v.g., CL en piel), así como la inmigración de leucocitos
inflamatorios al tejido inflamado. Estos resultados sugieren que los
inhibidores del HA pueden ser usados para inhibir las reacciones
inmunes cutáneas en la fase de estimulación.
Para determinar el efecto del Péptido 1 sobre la
emigración de CL, un grupo de 5 ratones BALB/c recibió una sola
inyección subcutánea de 40 \mul de Péptido 1 a diversas
concentraciones 24 horas antes de la aplicación de DNFB. El
porcentaje de emigración de CL disminuyó dramáticamente con una
mayor concentración de Péptido 1, como puede verse en la Figura 17).
Los datos mostrados en la Figura 17 son las densidades superficiales
de células de Langerhans epidérmicas determinadas a las 24 horas de
la pintura con DNFB. Los datos mostrados son las medias \pm S.E.M.
de 5 muestras y las diferencias estadísticamente significativas en
comparación con el grupo control que no recibió Péptido 1 están
indicadas con asteriscos (*p < 0,05, **p < 0,01), según se
evaluaron por la prueba t de Student de dos colas.
Se inyectó entonces Péptido 1 (40 \mug/oreja)
subcutáneamente en ambas orejas de ratones BALB/c 3, 2 ó 1 días
antes de la aplicación tópica de DNFB al 0,5% (orejas izquierdas) o
de vehículo solo (orejas derechas). A las 24 horas de pintar con
DNFB, los ratones fueron sacrificados y examinados en cuanto a las
densidades de células de Langerhans (Figura 18). Los ratones a los
que se había inyectado el Péptido 1 3 días antes de la aplicación de
DNFB exhibían una menor densidad de CL.
Los datos mostrados son las medias \pm S.E.M.
de 5 muestras. Las orejas tratadas con DNFB fueron comparadas por
ANOVA y las diferencias estadísticamente significativas se indican
con asteriscos (**p < 0,01).
Este resultado apoya la hipótesis de que el HA
expresado sobre queratinocitos epidérmicos sirve como ligando
fisiológico de CD44 expresado sobre CL activadas, mediando así en la
emigración de CL desde la epidermis. El Péptido 1 parece bloquear el
ligando HA, como se muestra en los estudios de emigración de CL y de
densi-
dad.
dad.
Como etapa inicial en el estudio del potencial
"terapéutico" de nuestros inhibidores peptídicos, se examinaron
las respuestas de hinchazón de la oreja al DNFB (en animales
sensibilizados).
Se sensibilizaron ratones BALB/c por aplicación
tópica de DNFB al 0,5% sobre la piel abdominal afeitada y se les
inoculó 5 días después por aplicación de DNFB al 0,2% sobre las
orejas derechas. Se pintaron las orejas izquierdas con vehículo
solo. Cinco ratones de cada grupo recibieron inyecciones subcutáneas
(40 \mul/inyección) de Péptido 1 ó 2, Péptido control aleatorio
(500 \muM) o HA soluble (1 mg/ml) en ambas orejas 24 y 1 hora
antes de la inoculación. Se midió la hinchazón 48 horas después de
la inoculación.
Las respuestas de hinchazón de las orejas
resultaron significativamente inhibidas por inyección de Péptido 1
(o HA soluble). Véase la Figura 19. No se observó actividad
inhibitoria con el Péptido 2, el control de péptido aleatorio o el
PBS solo. Se midió la hinchazón como el cambio de grosor entre las
orejas izquierda y derecha. Los valores fueron comparados por ANOVA.
Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas
(**p < 0,01).
Las muestras histológicas recogidas de los
anteriores experimentos fueron remitidas para tinción con H y E y
examinadas por un tercer individuo en cuanto al grosor de la oreja y
al número de leucocitos infiltrantes en la piel al microscopio. Los
ratones tratados con Péptido 1 exhibían un grosor de la oreja
significativamente reducido y una velocidad mucho menor de
infiltración leucocitaria que los ratones tratados con Péptido 2, RP
o PBS (Figura 20). Los corchetes indican grupos comparados por la
prueba t de Student de dos colas (**p < 0,01).
La diferencia en la respuesta profiláctica y
terapéutica de los ratones a DNFB con Péptido 1 o RP fue también
medida. Se pintaron ratones BALB/c en ambas orejas con DNFB al 0,5%
el día 0 y con DNFB al 0,2% los días 2, 4 y 6 (Figura 21, según
indican las flechas abiertas). Se inyectó Péptido 1 (círculos
cerrados) o RP (círculos abiertos) subcutáneamente en las orejas
izquierda y derecha, respectivamente, en los puntos de tiempo
indicados específicos. Como puede verse en la Figura 21, los ratones
tratados con Péptido 1 exhibían una reducción significativa en la
respuesta de hinchazón en comparación con los ratones tratados con
RP en los experimentos que simulaban usos profilácticos y
terapéuticos.
Los datos mostrados son representativos de dos
experimentos independientes, mostrando las medias \pm S.E.M. de
las respuestas de hinchazón de la oreja (en comparación con el
grosor basal antes de la aplicación de DNFB). Las diferencias
estadísticamente significativas entre el grupo del Péptido 1 y el
grupo del RP son mostradas con asteriscos (*p < 0,05, **p <
0,01).
Se examinó la actividad del Péptido 1 en la fase
de sensibilización de la hipersensibilidad de contacto.
Ratones BALB/c (10 ratones/grupo) recibieron
inyecciones subcutáneas de Péptido 1 o de RP (40
\mug/oreja/inyec-
ción) 24 h y 1 h antes de la sensibilización en la oreja izquierda. Se sensibilizaron a continuación los mismos ratones por aplicación tópica de DNFB al 0,5% y oxazolona al 1,25% (OX) sobre los sitios cutáneos indicados, bien la oreja izquierda o bien en la piel abdominal rasurada.
ción) 24 h y 1 h antes de la sensibilización en la oreja izquierda. Se sensibilizaron a continuación los mismos ratones por aplicación tópica de DNFB al 0,5% y oxazolona al 1,25% (OX) sobre los sitios cutáneos indicados, bien la oreja izquierda o bien en la piel abdominal rasurada.
Los ratones fueron inoculados 7 días después
sobre la oreja derecha con DNFB al 0,2% u OX al 0,5% como se indica
y se midió la hinchazón de la oreja (Figura 22). La sensibilización
de DNFB o de OX sobre el tronco parecía tener poco efecto sobre el
nivel de sensibilidad de los ratones a una inoculación en la oreja.
La sensibilización de la oreja, sin embargo, disminuyó la hinchazón
de la oreja después de una posterior inoculación tanto para DNFB
como para OX. Así, el uso del Péptido 1 parece reducir la
sensibilidad a la inoculación de un modo localizado.
Los ratones que habían recibido inyección de
Péptido 1 o de RP y sensibilización de DNFB en las orejas izquierdas
fueron resensibilizados por aplicación tópica de DNFB al 0,5% en el
tronco el día 7 y reinoculados con DNFB al 0,2% el día 14. El
Péptido 1 exhibía un grosor de la oreja significativamente reducido
en comparación con los ratones tratados con RP en la primera
sensibilización, pero en la segunda inoculación exhibían niveles
similares de grosor aumentado (Figura 23). Así, la aplicación de
Péptido 1 con el DNFB exhibía un mejor grosor en la primera
sensibilización y también daba lugar a la misma sensibilización con
una posterior inoculación de DNFB solo.
Los corchetes indican grupos comparados por la
prueba t de Student de dos colas. Las diferencias
estadísticamente significativas están indicadas con asteriscos (*p
< 0,05, **p < 0,01).
Se estudiaron ambas formas isoméricas D y L del
Péptido 1 en cuanto a su capacidad para reducir la hinchazón de la
oreja en respuesta a la aplicación de DNFB. Se sensibilizaron
ratones BALB/c con DNFB al 0,5% como se describe en el Ejemplo 8
(Figura 19) anterior y recibieron inyección subcutánea de 40
\mug/oreja de la forma isomérica D o L del Péptido 1 (círculos
cerrados) o de RP (círculos abiertos) 24 h y 1 h antes de la
provocación con DNFB al 0,2%. Los datos mostrados son las respuestas
de hinchazón de la oreja (en comparación con el grosor basal antes
de la aplicación de DNFB) a lo largo de un período de 3 días. Como
se muestra, tanto el isómero L como el isómero D redujeron la
hinchazón de la oreja en respuesta a la aplicación de DNFB en
comparación con los ratones que recibieron el RP (Figura 24).
<110> Takashima, Akira
\hskip1cmMummert, Mark E.
\hskip1cmMohamadzadeh, Mansour
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<120> Moduladores de polisacáridos y sus
usos
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<130> SWMC-001
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<160> 6
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<170> FastSEQ para Windows Versión
3.0
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<210> 1
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<400> 1
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\sa{Gly Ala His Trp Gln Phe Asn Ala Leu Thr Val
Arg}
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\sa{Thr Ser Tyr Gly Arg Pro Ala Leu Leu Pro Ala
Ala}
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<400> 3
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\sa{Met Asp His Leu Ala Thr Phe Arg Pro Ala
Ile}
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<400> 4
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\sa{Thr Leu Arg Ala Ile Trp Pro Met Trp Met Ser
Ser}
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\sa{Ile Pro Leu Thr Ala Asn Tyr Gln Gly Asp Phe
Thr}
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<400> 6
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\sa{Ser Ala Thr Pro Ala Ala Pro Tyr Pro Leu Ala
Gly Gly Gly}
\sac{Ser}
Claims (6)
1. Un péptido aislado consistente en una
secuencia seleccionada entre:
- (a)
- GAHWQFNALTVR (SEC ID Nº: 1),
- (b)
- AAHWQFNALTVR,
- (c)
- GAAWQFNALTVR,
- (d)
- GAHWQFAALTVR y
- (e)
- GAHWQFNALTVA.
2. Una composición consistente en un péptido
según la reivindicación 1 y un soporte farmacéuticamente
aceptable.
3. El uso de un péptido según la reivindicación
1 en la fabricación de un medicamento para la prevención o el
tratamiento de la inflamación.
4. El uso según la reivindicación 3, donde dicho
péptido altera la migración mediada por ácido hialurónico de las
células inmunes.
5. Uso según la reivindicación 4, donde dicha
migración por el ácido hialurónico de las células inmunes es una
infiltración leucocitaria.
6. Uso de un péptido según la reivindicación 1
en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del
cáncer.
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