ES2266245T3 - Gen de la calicreina. - Google Patents

Abstract

Proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 6, 7, 8 ó 9.

Description

Gen de la calicreína.

Campo de la invención

La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico, a proteínas codificadas por dichas moléculas de ácido nucleico; y a la utilización de las proteínas y de las moléculas de ácido nucleico.

Antecedentes de la invención

Las calicreínas son un grupo de serina proteasas que se encuentran en diversos tejidos y fluidos biológicos. El término "calicreína" fue introducido por primera vez por Werle y colegas que descubrió concentraciones elevadas de sus cepas originales en el páncreas (en griego, "kallikreas") (1, 2). Las calicreínas se dividen en dos grupos principales; la calicreína del plasma, que es un gen individual (3), y las calicreínas tisulares, que están codificadas por una gran familia de multigenes en roedores (4, 5). Hasta hace poco, la familia del gen de la calicreína humana se pensaba que estaba constituida únicamente por tres miembros (6). Sin embargo, se han identificado 11 nuevos miembros de la familia del gen de la calicreína (7 a 18). La evolución en esta área de investigación se ha estudiado recientemente (7).

El antígeno específico de la próstata (PSA), actualmente el marcador tumoral más útil para el diagnóstico y control del cáncer de próstata, es un miembro de la familia del gen de la calicreína humana de las serinas proteasas (19, 20). Además del PSA, la calicreína 2 glandular humana (hK2, codificada por el gen KLK2) se ha propuesto como un marcador adyuvante del diagnóstico para el cáncer de próstata (21, 22). Además, las pruebas acumuladas indican que otros miembros de la familia del gen de la calicreína ampliada pueden estar asociados con el cáncer (7). El gen 1 específico de las células epiteliales normal (NES1) (KLK10, según la nomenclatura del gen de la calicreína del tejido humano aprobado) se descubrió que era un nuevo supresor tumoral, que está regulado por disminución durante la evolución del cáncer de mama (23). Se descubrió asimismo que otros elementos de la familia del gen, incluyendo zima(KLK6), neuropsina (KLK8) y la enzima quimotríptica de la capa córnea humana (HSCCE; KLK7) se expresaban de forma diferenciada en determinados tipos de cánceres (24-26).

Sumario de la invención

Los presentes inventores identificaron una molécula de ácido nucleico que codifica una nueva calicreína. La molécula de ácido nucleico cartografía al cromosoma 19q13.3-q13.4 y está situado entre los genes klk1 y klk3. La nueva molécula de ácido nucleico denominada "klk15" presenta tres formas de corte y empalme alternativamente y se expresa principalmente en la glándula tiroides, y en menor extensión en la próstata, glándulas salivales y adrenales, colon, testículos y riñón. La expresión del ácido nucleico está regulada por incremento en el cáncer de próstata y está bajo regulación de la hormona esteroide en la línea celular LNCaP del cáncer de próstata. La elevada expresión de klk15 está asociada a los tumores de próstata más agresivos (etapa superior y grado superior).

La nueva proteína calicreína descrita en la presente memoria se denomina "Calicreína 15", "KLK15" o "proteína de KLK15". El gen que codifica la proteína se denomina "klk15".

La presente invención se refiere a una proteína aislada que está constituida por una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID nº: 6, 7, 8 ó 9.

La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica dicha proteína o a una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a ésta o a una molécula de ácido nucleico que presenta por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad con ésta.

La presente invención se refiere además a una molécula aislada de ácido nucleico que presenta una secuencia de ácidos nucleicos de la SEC. ID nº: 1, 2, 3, 4 ó 5 en la que T puede además ser U, o una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a ésta, o una molécula de ácido nucleico que presenta por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad con ésta.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Por consiguiente, pueden construirse vectores de expresión recombinante adaptados para la transformación de una célula huésped que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención y uno o más elementos de transcripción y traducción unidos a la molécula de ácido nucleico.

El vector de expresión recombinante puede utilizarse para preparar células huésped transformadas que expresan proteínas de KLK15. Por consiguiente, la invención proporciona además células huésped que contienen una molécula recombinante de la invención. La invención contempla asimismo mamíferos no humanos transgénicos cuyas células germinales y células somáticas contienen una molécula recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención, en particular la que codifica un análogo de la proteína de KLK15 o un truncamiento de la proteína de KLK15.

La invención proporciona además un método para preparar proteínas de KLK15 que utiliza las moléculas de ácido nucleico purificadas y aisladas de la invención. En una forma de realización se proporciona un método para la preparación de una proteína de KLK15 que comprende (a) transferir un vector de expresión recombinante de la invención a una célula huésped; (b) seleccionar las células huésped transformadas de entre las células huésped no transformadas; (c) cultivar una célula huésped transformada seleccionada en condiciones que permitan la expresión de la proteína de KLK15; y (d) aislar la proteína de KLK15.

Las proteínas de KLK15 de la invención pueden conjugarse con otras moléculas, tales como las proteínas, para preparar proteínas de fusión. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante la síntesis de proteínas de fusión N-terminales o C-terminales.

La invención contempla además anticuerpos que se unen específicamente a una proteína de KLK15 de la invención. Los anticuerpos pueden marcarse con una sustancia detectable y utilizarse para detectar las proteínas de la invención en tejidos y células. Los anticuerpos pueden presentar utilización particular en aplicaciones terapéuticas, por ejemplo para reaccionar con células tumorales y en conjugados e inmunotoxinas como portadores selectivos de la diana de varios agentes que presentan efectos antitumorales incluyendo fármacos quimioterapéuticos, toxinas, modificadores de la respuesta inmunológicas, enzimas y radioisótopos.

La invención permite además la construcción de sondas de nucleótido que son exclusivas para las moléculas de ácido nucleico de la invención y/o para las proteínas de la invención. Por consiguiente, la invención se refiere también a una sonda que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la invención o a una secuencia de ácidos nucleicos que codifican una proteína de la invención o una parte de ésta. La sonda puede marcarse, por ejemplo, con una sustancia detectable y puede utilizarse para seleccionar de entre una mezcla de secuencias de nucleótidos una molécula de ácido nucleico de la invención incluyendo las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que presenta una o más propiedades de una proteína de la invención. Puede utilizarse una sonda para marcar los tumores.

La invención proporciona también moléculas de ácido nucleico con cadena complementaria, p. ej. para la producción de una cadena de ARNm o de ADN en orientación inversa a una molécula de cadena complementaria. Una molécula de ácido nucleico con cadena complementaria puede utilizarse para suprimir el crecimiento de una célula (p. ej. cancerosa) que expresa KLK15. La invención proporciona además todavía un método para identificar una sustancia que se une a una proteína de la invención que comprende hacer reaccionar la proteína con al menos una sustancia que se une potencialmente con la proteína, en condiciones que permiten la formación de complejos entre la sustancia y la proteína y que detecta el enlace. El enlace puede detectarse analizando los complejos, la sustancia libre o la proteína no acomplejada. La invención contempla también los métodos de identificación de sustancias que se unen a otras proteínas intracelulares que interactúan con una proteína de KLK15. Pueden utilizarse también métodos para identificar los compuestos que se unen a secuencias reguladoras del gen KLK15 (p. ej. secuencias
activadoras).

Más aún la invención proporciona un método para evaluar la capacidad de un compuesto para modular la actividad biológica de una proteína de KLK15 de la invención. Por ejemplo puede evaluarse una sustancia que inhibe o aumenta la interacción de la proteína y una sustancia que se une a la proteína. En una forma de realización, el método comprende proporcionar una concentración conocida de una proteína de KLK15, con una sustancia que se une a la proteína y un compuesto de análisis en condiciones que permitan la formación de complejos entre la sustancia y la proteína y la eliminación y/o detección de complejos.

Los compuestos que modulan la actividad biológica de una proteína de la invención pueden identificarse también utilizando los métodos de la invención comparando el patrón y el nivel de expresión de la proteína de la invención en tejidos y células, en presencia y ausencia de los compuestos.

Las proteínas de la invención, los anticuerpos, las moléculas de ácido nucleico con cadena complementaria y las sustancias y compuestos identificados utilizando los métodos de la invención, y los péptidos de la invención pueden utilizarse para modular la actividad biológica de una proteína de KLK15 de la invención, y pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer (particularmente el cáncer de próstata, de colon, de riñón y testicular) y trastornos de tiroides en un paciente. Por consiguiente, las sustancias y compuestos pueden formularse en composiciones para la administración a individuos que padecen trastornos tales como el cáncer (particularmente el cáncer de próstata, colon, riñón y testicular) y trastornos del tiroides en un paciente. En particular, pueden utilizarse los anticuerpos, las moléculas de ácido nucleico con cadena complementaria, las sustancias y los compuestos para tratar pacientes que tienen una proteína de KLK15 en sus células cancerosas o sobre ellas.

Por consiguiente, la presente invención se refiere también a una composición que comprende una o más moléculas de ácido nucleico o a una proteína de la invención, y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se proporciona también la utilización de una molécula de ácido nucleico o proteína de la invención para la preparación de un medicamento destinado a su utilización en un método de tratamiento o prevención de un trastorno tal como el cáncer (particularmente el cáncer de próstata, de tiroides, de colon, de riñón y testicular) y trastornos del tiroides en un paciente.

Otro aspecto de la invención consiste en la utilización de una proteína de KLK15 o de su molécula de ácido nucleico codificadora en la preparación de vacunas para prevenir el cáncer y/o tratar el cáncer, en particular para prevenir y/o tratar el cáncer en pacientes que tienen una proteína de KLK15 detectada en sus células. Estas preparaciones de vacuna pueden utilizarse también para impedir que los pacientes presenten tumores antes de su aparición.

La invención contempla ampliamente las vacunas para estimular o potenciar la producción de anticuerpos dirigidos contra una proteína de KLK15 en un paciente al que se administra la vacuna.

La invención proporciona además la utilización de una proteína de la invención para la preparación de una vacuna para estimular o potenciar en un paciente la producción de anticuerpos dirigida contra una proteína de KLK15. El método comprende la administración a un paciente de una vacuna de la invención en una dosis eficaz para estimular o aumentar la producción de anticuerpos.

La vacuna puede utilizarse en métodos para el tratamiento, prevención o retardo de la aparición del cáncer. Los métodos comprenden administrar a un sujeto una vacuna de la invención en una dosis eficaz para tratar, prevenir o retardar la aparición del cáncer.

En otras formas de realización, la invención proporciona un método para identificar inhibidores de una interacción de la proteína de KLK15, que comprende

(a)

proporcionar una mezcla de reacción que incluye la proteína de KLK15 y una sustancia que se une a la proteína de KLK15, o por lo menos una parte de cada una que interactúa;

(b)

poner en contacto la mezcla de reacción con uno o más compuestos de análisis;

(c)

identificar los compuestos que inhiben la interacción de la proteína de KLK15 y la sustancia.

En determinadas formas de realización preferidas, la mezcla de reacción es una célula completa. En otras formas de realización, la mezcla de reacción es un lisado celular o una composición proteica purificada. El método del asunto puede realizarse utilizando bancos de compuestos de ensayo. Dichos agentes pueden ser bancos de proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, pequeñas moléculas orgánicas y extractos de productos naturales, tales como los aislados en animales, plantas, hongos y/o microbios. Otro aspecto aún de la presente invención proporciona un método para realizar el descubrimiento del fármaco que comprende:

(a)

proporcionar uno o más sistemas de ensayo para identificar los agentes por su capacidad para inhibir o potenciar la interacción de una proteína de KLK15 y una sustancia que se une a la proteína;

(b)

realizar el perfil terapéutico de los agentes identificados en la etapa (a) o más análogos de los mismos, la eficacia y toxicidad en animales; y

(c)

determinar una formulación para una preparación farmacéutica que incluye uno o más agentes identificados en la etapa (b) que presentan un perfil terapéutico aceptable.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos aunque indican formas de realización preferidas de la invención se proporcionan únicamente a título ilustrativo.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describe a continuación haciendo referencia a los dibujos en los que:

La Figura 1 presenta la organización genómica y la secuencia genómica parcial del gen KLK15. Las secuencias intrónicas no se presentan excepto para las áreas de unión de corte y empalme. Se presentan los intrones con letras minúsculas y los exones con letras mayúsculas. Los nucleótidos de codificación se presentan en negrita y la zona 3' no traducida sigue al codón de terminación TGA (rodeado por un círculo). Los aminoácidos traducidos de la zona de codificación se presentan bajo una sola letra de abreviatura. Los codones de iniciación y terminación están rodeados por un círculo y las uniones exón-intrón están subrayadas. Los restos catalíticos están encasillados. La supuesta señal de poliadenilación esta subrayada. El punto de partida exacto del primer exón de codificación no se
determinó.

La Figura 2 presenta una alineación de la secuencia deducida de aminoácidos de KLK15 con los miembros de la familia del multigén con calicreína (SEC. ID nº: 25 a 38). Los guiones representan huecos a los que llevar las secuencias para mejor alineación. Los restos de la triada catalítica (H, D, S) se presentan en cursiva. Los aminoácidos idénticos están destacados en negrita y las secuencias similares en gris. Los 29 restos de serina proteasa invariable están marcados por (\bullet) en la parte inferior y los restos de cisteína por (+) en la parte superior de cada bloque. Las secuencias de escisión previstas de los péptidos señal y de activación están indicadas con flechas. El área punteada representa la secuencia del bucle de calicreína. El modelo de escisión de tipo tripsina previsto por la presencia del resto "D" está indicado por (*). KLK15 presenta una "E" en esta posición. Una única secuencia de 8 aminoácidos, HNEPGTAG (SEC. ID nº: 10), está presente en las posiciones 148 a 155 del gen KLK15.

La Figura 3 es una representación de la hidrofobia y hidrofilia de la proteína de KLK15, en comparación con el antígeno específico de la próstata (PSA). Obsérvese la zona hidrófoba en el terminal amino, que sugiere la presencia de un péptido señal.

La Figura 4 es un dendograma del árbol filogenético previsto para 15 calicreínas y otras pocas serina proteasas. Se utilizó el método de unión próxima para alinear KLK15 con otras serinas proteasas y miembros de la familia del gen de la calicreína. El árbol agrupó las calicreínas clásicas (hK1, hK2 y PSA) y alineó KLK15 en un grupo con los genes TLSP y KLK-L3. Otras serina proteasas se alinearon en diferentes grupos, como se muestra. KLK representa calicreína; KLK-L representa pseudo calicreína; TLSP representa pseudotripsina serina proteasa; NES1 representa el gen normal específico de las células epiteliales; PSA representa el antígeno específico de la próstata; hK1 y hK2 representan la calicreína 1 y 2 glandular humana, respectivamente; y HSCCE representa la enzima quimotríptica de la capa córnea humana.

La Figura 5 es una presentación esquemática de las variantes de corte y empalme diferente de un gen con KLK15. Los exones se presentan encasillados y los intrones mediante líneas de conexión. Los números dentro de las casillas representan las longitudes del exón en pares de bases. La punta de flecha apunta al codón de iniciación común y comienza en las posiciones del codón de terminación. La longitud del producto del polipéptido previsto está indicada junto a cada variante en los aminoácidos (AA). El corte y empalme alternativo y/o las omisiones del exón crean un desplazamiento del marco, que conduce a una terminación prematura.

La Figura 6 presenta las posiciones relativas de los genes con KLK1, KLK15 y KLK3 en el cromosoma 19q13.3-q13.4. Los dos clones BAC solapantes se identifican y la zona de solapamiento está sombreada. Los genes están representados mediante flechas horizontales que indican la dirección de la secuencia de codificación. Las distancias entre los genes se mencionan en pares de bases. La Figura no está dibujada a escala.

La Figura 7 presenta la expresión tisular del gen con KLK15, determinada por RT-PCR. KLK15 se expresa principalmente en la glándula tiroides y en menor extensión en la próstata, glándulas salivales y adrenales, en el colon, testículos y riñón. M = marcador de peso molecular. Para la explicación de las bandas múltiples de PCR (como alterna-
tivas formas de corte y empalme) véase el Ejemplo. Se realizó la PCR con los cebadores KLK15-F2 y KLK15-R1.

La Figura 8 presenta la regulación hormonal del gen con KLK15 en la línea celular LNCaP de cáncer de próstata. DHT = dihidrotestosterona. Se añadieron esteroides a una concentración final de 10^{-8} M. (-ve) = referencia negativa. Se utilizó actina como gen de referencia.

La Figura 9 es un diagrama esquemático que presenta la comparación de las zonas de codificación de los genes de la calicreína 15. Los exones están representados mediante barras negras y los intrones mediante las líneas de conexión. Las letras por encima de las casillas indican las posiciones relativas de la triada catalítica que se descubrió que se conservaba en todos los genes; H indica histidina, D ácido aspártico y S serina. Los números romanos indican las fases de intrón. La fase de intrón se refiere a la posición del intrón dentro del codón; I indica que el intrón aparece después del primer nucleótido del codón, II el intrón aparece después del segundo nucleótido, 0 que el intrón aparece entre los codones. Las fases de intrón se conservan en todos los genes. Los números dentro de las casillas indican longitudes del exón en pares de bases. Los nombres entre paréntesis representan la nomenclatura oficial aprobada por el comité de nomenclatura génica humana. Las zonas 3' y 5' no traducidas y los exones en 5' no traducidos no se presentan.

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención puede emplearse la biología molecular convencional, la microbiología y las técnicas de ADN recombinante dentro de los conocimientos en la materia. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization B.D. Hames y S. J. Higgins eds. (1985); Transcription and Translation B. D. Hames y S.I. Higgins eds (1984); Animal Cell Culture R. I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and enzymes IRL Press, (1986); y B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

1. Moléculas de ácido nucleico de la invención

Tal como se mencionó en la presente memoria anteriormente, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que presenta la secuencia que codifica una proteína de KLK15. El término "aislado" se refiere a un ácido nucleico sustancialmente exento de material celular o al medio de cultivo cuando se produce por técnicas de ADN recombinante o a reactivos químicos o a otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. Un ácido nucleico "aislado" puede también estar exento de las secuencias que flanquean de forma natural al ácido nucleico (es decir, las secuencias situadas en los extremos 5' y 3' de la molécula de ácido nucleico) de la que procede el ácido nucleico. La expresión "ácido nucleico" pretende incluir el ADN y ARN y puede ser de doble cadena o de una cadena. Las moléculas de ácido nucleico de la invención codifican una proteína que está constituida por una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID nº: 6, 7, 8 ó 9. Preferentemente las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden una secuencia de ácido nucleico de una o más de las SEC. ID nº: 1 a 5.

La invención incluye secuencias de ácido nucleico complementarias a un ácido nucleico que codifican una proteína que está constituida por una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID nº: 6, 7, 8 ó 9 preferentemente las secuencias de ácidos nucleicos complementarias a una secuencia de ácido nucleico completa de una o más de las SEC. ID nº: 1 a 5.

La invención incluye moléculas de ácido nucleico con identidad y homología de la secuencia sustancial de las secuencias de ácido nucleico de la invención o proteínas codificantes con identidad o similitud sustancial a la secuencia de aminoácidos de las SEC. ID nº: 6, 7, 8 ó 9. Preferentemente, los ácidos nucleicos presentan identidad sustancial de secuencia por ejemplo como mínimo del 80% o 85% de identidad del ácido nucleico; más preferentemente del 90% de identidad de ácido nucleico; y aún más preferentemente por lo menos del 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia. "Identidad" como se conoce en la técnica y se utiliza en la presente memoria, es una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos o dos o más secuencias de ácidos nucleicos, determinadas por comparación de las secuencias. Se refiere también al grado de relevancia entre las secuencias de aminoácido o ácido nucleico, como puede ser el caso, determinado por la compatibilidad entre las cadenas de cada secuencia. Identidad y similitud son términos bien conocidos por los expertos en la materia y pueden calcularse por métodos convencionales (por ejemplo véase Computational Molecular Biology, Lesk, A. M. ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. y Griffin, H. G. eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J. eds. M. Stockton Press, Nueva York, 1991, Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48: 1073, 1988). Se prefieren generalmente los métodos que están diseñados para proporcionar la mayor compatibilidad entre las dos secuencias. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos disponibles al público que incluyen el paquete del programa CGC (Devereux J. et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387, 1984); BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410, 1990). El programa BLAST X está disponible al público en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al. NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S. et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990).

Las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una proteína de KLK15 y las que presentan una secuencia que se diferencia de una secuencia de ácido nucleico de la invención debido a la degeneración del código genético están también comprendidas en el alcance de la invención. Dichos ácidos nucleicos codifican proteínas funcionalmente equivalentes (p. ej. una proteína de KLK15) pero se diferencian en la secuencia procedente de la secuencia de una proteína de KLK15 debido a la degeneración del código genético. Como ejemplo, los polimorfismos de la secuencia de ADN en la secuencia de nucleótidos de una proteína de KLK15 pueden producir mutaciones imperceptibles que no afectan a la secuencia de aminoácidos. Pueden existir variaciones en uno o más nucleótidos entre los individuos en una población debido a la variación alélica natural. Cualquiera y todas las variaciones de ácidos nucleicos están comprendidas dentro del alcance de la invención. Pueden producirse también polimorfismos de la secuencia de ADN los cuales conducen a cambios en la secuencia de aminoácidos de una proteína de KLK15. Estos polimorfismos de aminoácidos están también comprendidos dentro del alcance de la presente invención.

Una molécula aislada de ácido nucleico de la invención que comprende ADN puede aislarse preparando una sonda marcada de ácido nucleico basada en toda o parte de la secuencia de ácido nucleico de la invención. La sonda de ácido nucleico marcada se utiliza para identificar un banco de ADN apropiado (p. ej. un banco de ADNc o de ADN genómico). Por ejemplo, puede utilizarse un banco de ADNc para aislar un ADNc que codifica una proteína de KLK15 cribando el banco con la sonda marcada utilizando técnicas normalizadas. Como alternativa, puede cribarse asimismo un banco de ADN genómico para aislar un clon genómico que comprende un gen que codifica una proteína de KLK15. Los ácidos nucleicos aislados mediante cribado de un ADNc o de un banco de ADN genómico pueden secuenciarse por técnicas normalizadas. Una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que es ADN puede también aislarse ampliando de manera selectiva un ácido nucleico que codifica una proteína de KLK15 utilizando los métodos de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y ADNc o ADN genómico. Es posible diseñar cebadores de oligonucleótido sintéticos a partir de la secuencia de nucleótidos de la invención para su utilización en PCR. Un ácido nucleico puede ampliarse a partir del ADNc o del ADN genómico utilizando estos cebadores de oligonucleótido y técnicas de ampliación por PCR normalizadas. El ácido nucleico ampliado de este modo puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse mediante el análisis de la secuencia del ADN. El ADNc puede prepararse a partir del ARNm, aislando el ARNm celular completo mediante varias técnicas, por ejemplo, utilizando el procedimiento de extracción con tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979). El ADNc se sintetiza a continuación a partir del ARNm utilizando transcriptasa inversa (por ejemplo, la transcriptasa inversa MLV de Moloney de Gibco/BRL,
Bethesda, MD, o transcriptasa inversa AMV disponible en Seikagaku America, Inc., San Petersburgo, FL).

Puede aislarse una molécula aislada de ácido nucleico de la invención que es ARN clonando un ADNc que codifica una proteína de KLK15 en un vector apropiado que permite la trascripción del ADNc para producir una molécula de ARN que codifica una proteína de KLK15. Por ejemplo, un ADNc puede clonarse corriente abajo de un activador de bacteriófago (p. ej. un activador T7) en un vector, el ADNc puede transcribirse in vitro con T7 polimerasa y el ARN resultante puede aislarse por técnicas convencionales.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden sintetizarse químicamente utilizando las técnicas normalizadas. Son conocidos los métodos de síntesis química de polidesoxinucleótidos, que incluyen pero no se limitan a la síntesis en fase sólida que, como la síntesis de péptidos, se ha automatizado completamente en los sintetizadores de ADN disponibles en el mercado (véase p. ej., Itakura et al. patente US nº 4.598.049; Caruthers et al. patente US nº 4.458.066; e Itakura patentes US nº 4.401.796 y nº 4.373.071).

La determinación de si una molécula determinada de ácido nucleico codifica una proteína de KLK15 puede llevarse a cabo expresando el ADNc en una célula huésped apropiada por técnicas normalizadas y analizando la proteína expresada en los métodos descritos en la presente memoria. Un ADNc que codifica una proteína de KLK15 puede secuenciarse por técnicas normalizadas, tal como la terminación de la cadena de didesoxinucleótico o el secuenciado químico de Maxam-Gilbert, para determinar la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia de aminoácidos prevista de la proteína codificada.

El codón de iniciación y las secuencias no traducidas de una proteína de KLK15 pueden determinarse utilizando el programa informático diseñado para este fin, tal como PC/Gene (IntelliGenetics Inc., Calif.). La estructura intrón-exón y las secuencias reguladoras de la transcripción de un gen que codifica una proteína de KLK15 pueden confirmarse utilizando una molécula de ácido nucleico de la invención que codifica una proteína de KLK15 para sondar un banco de clones de ADN genómico. Pueden identificarse elementos reguladores utilizando técnicas normalizadas. La función de los elementos puede confirmarse utilizando estos elementos para expresar un gen indicador tal como el gen lacZ que está operativamente unido a los elementos. Estos montajes pueden introducirse en células cultivadas utilizando procedimientos convencionales o en modelos de animales transgénicos no humanos. Además de identificar elementos reguladores en el ADN, dichos montajes pueden utilizarse también para identificar proteínas nucleares que interactúan con los elementos, utilizando técnicas conocidas en la materia.

En una determinada forma de realización de la invención, las moléculas de ácido nucleico aisladas utilizando los métodos descritos en la presente memoria son alelos del gen con KLK15 mutante. Los alelos mutantes pueden aislarse de individuos ya sean conocidos o propuestos que presenten un genotipo que contribuya a los síntomas de un trastorno que involucra una proteína de KLK15. Los alelos mutantes y los productos de alelo mutante pueden utilizarse en métodos terapéuticos y de diagnóstico descritos en la presente memoria. Por ejemplo, un ADNc de un gen mutante con KLK15 puede aislarse utilizando PCR tal como se describe en la presente memoria, y la secuencia del ADN del alelo mutante puede compararse con la del alelo normal para determinar la(s) mutación(es) responsable(s) de la pérdida o alteración de la función del producto génico mutante. Asimismo puede construirse un banco genómico utilizando ADN de un individuo que se sospecha o se conoce que lleva un alelo mutante, o puede construirse un banco de ADNc utilizando ARN procedente del tejido que se conoce o se sospecha que expresa el alelo mutante. Un ácido nucleico que codifica un gen normal con KLK15 o cualquier fragmento adecuado del mismo, puede marcarse a continuación y utilizarse como sonda para identificar el alelo mutante correspondiente en dichos bancos. Los clones que contienen secuencias mutantes pueden purificarse y someterse a análisis de secuencia. Además, puede construirse un banco de expresión utilizando ADNc procedente del ARN aislado de un tejido de un individuo que se conoce o se sospecha para expresar un alelo mutante de KLK15. Los productos génicos preparados mediante el tejido supuestamente mutante pueden expresarse y cribarse, por ejemplo utilizando anticuerpos específicos para una proteína de KLK15 como se describe en la presente memoria. Los clones del banco identificados que utilizan los anticuerpos pueden purificarse y someterse al análisis de la secuencia.

La secuencia de una molécula de ácido nucleico de la invención, o un fragmento de la molécula, pueden invertirse con relación a su presentación normal para que la transcripción produzca una molécula de ácido nucleico con cadena complementaria. Puede construirse una molécula de ácido nucleico con cadena complementaria utilizando síntesis química o reacciones de ligadura enzimática que utilizan los procedimientos conocidos en la materia.

2. Proteínas de la invención

Una secuencia de aminoácidos de la proteína de KLK15 está constituida por una secuencia como se presenta en las SEC. ID nº: 6, 7, 8 ó 9. La proteína se expresa principalmente en la glándula tiroides y en menor medida en la próstata, glándulas salivales y suprarrenales, colon, testículos y riñón.

La invención contempla asimismo isoformas de las proteínas de la invención. Una isoforma contiene el mismo número y clase de aminoácidos que una proteína de la invención, pero la isoforma presenta una estructura molecular diferente. Las isoformas contempladas por la presente invención presentan preferentemente las mismas propiedades que una proteína de la invención descrita en la presente memoria.

La presente invención incluye también proteínas de KLK15 conjugadas con una proteína, o una proteína marcadora seleccionada (véase a continuación) para producir proteínas de fusión.

Una proteína de KLK15 de la invención puede prepararse utilizando métodos de ADN recombinante. Por consiguiente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que presentan una secuencia que codifica una proteína de KLK15 de la invención pueden incorporarse de forma conocida en un vector de expresión apropiado que asegura la expresión buena de una proteína. Los vectores de expresión posibles incluyen pero no se limitan a cósmidos, plásmidos o virus modificados (p. ej., retrovirus con defectos de replicación, adenovirus y virus adeno-asociados) siempre que el vector sea compatible con la célula huésped utilizada.

La invención contempla por lo tanto un vector de expresión recombinante de la invención que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención y las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y traducción de la secuencia de proteína insertada. Las secuencias reguladoras adecuadas pueden proceder de varias fuentes, incluyendo los genes bacterianos, fúngicos, víricos, de mamífero o de insecto [por ejemplo, véase las secuencias reguladoras descritas en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]. La selección de secuencias reguladoras apropiadas depende de la célula huésped seleccionada como se expone a continuación y un experto en la materia puede realizarla fácilmente. Las secuencias reguladoras necesarias pueden ser suministradas por la proteína de KLK15 natural y sus zonas flanqueantes.

La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación de cadena complementaria. Esto es, la molécula de ADN está unida a la secuencia reguladora de manera que permite la expresión, mediante transcripción de la molécula de ADN, de una molécula de ARN que es de cadena complementaria con respecto a la secuencia de ácido nucleico de una proteína de la invención o un fragmento de la misma. Pueden seleccionarse secuencias reguladoras unidas al ácido nucleico con cadena complementaria, las cuales dirigen la expresión continua de la molécula de ARN con cadena complementaria en varios tipos de célula, por ejemplo un activador y/o potenciador vírico, o pueden seleccionarse secuencias reguladoras, las cuales dirigen la expresión específica de tipo tisular o celular del ARN con cadena complementaria.

Los vectores con expresión recombinante de la invención pueden también contener un gen marcador que facilita la selección de las células huésped transformadas o transfectadas con una molécula recombinante de la invención. Ejemplos de genes marcadores son los genes que codifican una proteína tal como G418 e higromicina que confieren resistencia a determinados fármacos, \beta-galactosidasa, cloranfenicol acetiltranferasas, luciferasa de luciérnaga o una inmunoglobulina o fragmento de la misma tal como el fragmento Fc de una inmunoglobulina, preferentemente IgG. Los marcadores pueden introducirse en un vector separado del ácido nucleico de interés.

Los vectores con expresión recombinante pueden también contener genes que codifican un resto de fusión que proporciona aumento de expresión de la proteína recombinante; aumento de solubilidad de la proteína recombinante y ayudan a la purificación de la proteína recombinante diana actuando como ligando en la purificación por afinidad. Por ejemplo, puede añadirse una secuencia de escisión proteolítica a la proteína recombinante diana para que permita la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Los vectores de expresión de la fusión típicos incluyen pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan la glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante.

Pueden introducirse vectores con expresión recombinante en las células huésped para producir una célula huésped transformante. Las "células huésped transformantes" incluyen las células huésped que han sido transformadas o transfectas con un vector con expresión recombinante de la invención. Las expresiones "transformada con", "transfectada con", "transformación" y "transfección" comprenden la introducción de un ácido nucleico (p. ej. un vector) en una célula mediante una de las muchas técnicas normalizadas. Las células procarióticas pueden transformarse con un ácido nucleico, por ejemplo, por electroporación o transformación mediada por cloruro de calcio. Puede introducirse un ácido nucleico en células de mamífero por técnicas convencionales tales como coprecipitación con fosfato cálcico o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofectina, electroporación o microinyección. Los métodos adecuados para transformar y transfectar células huésped pueden encontrarse en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros libros de texto de laboratorio.

Las células huésped adecuadas incluyen una amplia variedad de células huésped procarióticas y eucarióticas. Por ejemplo, las proteínas de la invención pueden expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (utilizando baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Otras células huésped adecuadas pueden encontrarse en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991).

Puede seleccionarse también una célula huésped que module la expresión de una secuencia de ácido nucleico insertada o que modifique (p. ej. glucosilación o fosforilación) y procese (p. ej. escinda) la proteína de una manera deseada. Pueden seleccionarse sistemas huésped o líneas celulares para que tengan mecanismos específicos y característicos para el tratamiento después de la traducción y la modificación de las proteínas. Por ejemplo, pueden utilizarse las células huésped eucarióticas que incluyen CHO, VERO, BHK, HeLA, COS, MDCK, 293, 3T3 y WI38. Para la expresión de la proteína estable de alto rendimiento a largo plazo, pueden modificarse genéticamente líneas celulares y sistemas huésped que expresen de forma estable el producto génico.

Las células huésped y en particular las líneas celulares producidas utilizando los métodos descritos en la presente memoria pueden ser particularmente útiles en la identificación y evaluación de los compuestos que modulan la actividad de una proteína de KLK15.

Pueden expresarse también las proteínas de la invención en animales transgénicos no humanos incluyendo pero sin limitarse a ratones, ratas, conejos, cobayas, lechones, cabras, ovejas, cerdos, primates no humanos (p. ej. mandriles, monos y chimpancés) [véase Hammer et al. (Nature 315:680-683, 1985), Palmiter et al. (Science 222:809-814, 1983), Brinster et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985), Palmiter y Brinster (Cell 41:343-345, 1985) y patente US nº 4.736.866)]. Los procedimientos conocidos en la materia pueden utilizarse para introducir una molécula de ácido nucleico de la invención que codifica una proteína de KLK15 en animales para producir las líneas de base de animales transgénicos. Dichos procedimientos incluyen la microinyección pronuclear, la transferencia génica mediada por retrovirus en líneas germinales, el direccionamiento génico en células madre embrionarias, la electroporación del embrión y la transferencia génica mediada por espermatozoides.

La presente invención contempla un animal transgénico que lleva el gen KLK15 en todas sus células y los animales que llevan el transgén en algunas pero no en todas sus células. El transgén puede estar integrado como un único transgén o en concatámeros. El transgén puede introducirse de manera selectiva y activarse en tipos de células específicas (véase por ejemplo, Lasko et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6236). El transgén puede integrarse en la secuencia cromosómica del gen endógeno por direccionamiento génico. El transgén puede introducirse selectivamente en un tipo de célula determinado inactivando el gen endógeno en este tipo celular (véase Gu et al. Science
265: 103-106).

La expresión de una proteína de KLK15 recombinante en un animal transgénico puede analizarse utilizando técnicas normalizadas. La identificación inicial puede realizarse mediante análisis por transferencia Southern o por métodos PCR para analizar si se ha integrado el transgén. Puede evaluarse también el nivel de expresión de ARNm en los tejidos de animales transgénicos utilizando las técnicas que incluyen el análisis por transferencia Northern de muestras de tejido, la hibridación in situ y RT-PCR. El tejido puede evaluarse también por inmunocitoquímica utilizando anticuerpos contra la proteína de KLK15.

Pueden prepararse también proteínas de la invención mediante síntesis química utilizando técnicas bien conocidas en la química de las proteínas tales como la síntesis en fase sólida (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85:2149-2154) o la síntesis en solución homogénea (Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, ed. E. Wansch, vol. 15 I y II, Thieme, Stuttgart).

Las proteínas de fusión con terminal N o con terminal C que comprenden la proteína de KLK15 de la invención conjugada con otras moléculas, tales como proteínas, pueden prepararse fusionando, por técnicas recombinantes, el terminal N o el terminal C de una proteína de KLK15 y la secuencia de una proteína o proteína marcadora seleccionadas con una función biológica deseada. Las proteínas de fusión resultantes contienen una proteína de KLK15 fusionada a la proteína o proteína marcadora seleccionada como se describe en la presente memoria. Ejemplos de proteínas que pueden utilizarse para preparar las proteínas de fusión incluyen las inmunoglobulinas, glutatión-S-transferasa (GST), hemoglutinina (HA) y myc truncada.

3. Anticuerpos

Las proteínas de KLK15 de la invención pueden utilizarse para preparar anticuerpos específicos para las proteínas. Pueden prepararse anticuerpos que se unen a un epítopo distinto en una zona no conservada de la proteína. Una zona no conservada de la proteína es la que no presenta homología de secuencia sustancial con otras proteínas. Puede también utilizarse una zona de una zona conservada tal como un dominio bien caracterizado para preparar un anticuerpo contra una zona conservada de una proteína de KLK15. Pueden también producirse anticuerpos con especificidad para una proteína de KLK15 a partir de las proteínas de fusión creadas expresando proteínas de fusión en bacterias como se describe en la presente memoria.

La invención puede emplear anticuerpos íntegros monoclonales o policlonales y fragmentos inmunológicamente activos (p. ej. un fragmento Fab, (Fab)_{2} o fragmentos del banco de expresión de Fab y fragmentos que se unen al epítopo de los mismos), una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo, una molécula Fv de una sola cadena modificada genéticamente (Ladner et al., patente US nº 4.946.778), anticuerpo humanizado o un anticuerpo híbrido, por ejemplo, un anticuerpo que contiene la especificidad de un unión de un anticuerpo murino, pero en el que las partes restantes son de origen humano. Pueden prepararse anticuerpos que incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, fragmentos e híbridos, utilizando los métodos conocidos por los expertos en la materia.

4. Aplicaciones de las moléculas de ácido nucleico, proteínas de KLK15 y anticuerpos de la invención

Las moléculas de ácido nucleico, las proteínas de KLK15 y los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en la evaluación del pronóstico y del diagnóstico de trastornos que involucran una proteína de KLK15 (p. ej. cáncer o trastornos del tiroides) y en la identificación de pacientes con una predisposición a dichos trastornos (apartado 4.1.1 y 4.1.2).

La presente invención proporciona un kit de ensayo para diagnosticar una enfermedad asociada a una proteína de la invención determinando la presencia de una molécula de ácido nucleico o de una proteína de la invención.

El kit de ensayo puede ser utilizado por un método para detectar la expresión del marcador KLK15 de cáncer en un paciente que comprende:

(a)

tomar una muestra procedente de un paciente; y

(b)

detectar en la muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica KLK15 o un producto de la proteína codificado por una secuencia de ácido nucleico con KLK15.

Las moléculas de ácido nucleico, las proteínas de KLK15 y los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en el diagnóstico y estadificación del cáncer, en particular del cáncer de próstata. El aumento de las concentraciones de las proteínas de KLK15 se asocia con formas no agresivas del cáncer de próstata y puede ser un indicador de pronóstico escaso.

Los métodos para detectar las moléculas de ácido nucleico y las proteínas de KLK15 de la invención, pueden utilizarse para controlar los trastornos que involucran una proteína de KLK15 detectando las proteínas de KLK15 y las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de KLK15. Las aplicaciones de la presente invención incluyen también métodos para la identificación de compuestos que modulan la actividad biológica de las proteínas de KLK15 (apartado 4.2). Los compuestos, anticuerpos, etc. pueden utilizarse para el tratamiento de trastornos que involucran una proteína de KLK15 (sección 4.3). Sería asimismo evidente para un experto en la materia que los métodos descritos en la presente memoria puedan utilizarse para estudiar la expresión del desarrollo de las proteínas de KLK15 y, por consiguiente, proporcionará más comprensión en la función de las proteínas de KLK15.

4.1 Métodos de diagnóstico

Pueden emplearse varios métodos para la evaluación del diagnóstico y del pronóstico de trastornos que involucran una proteína de KLK15 y para la identificación de pacientes con una predisposición a dichos trastornos. Dichos métodos, por ejemplo, pueden utilizar moléculas de ácido nucleico de la invención y fragmentos de las mismas y anticuerpos dirigidos contra las proteínas de KLK15, incluyendo fragmentos peptídicos. En particular, pueden utilizarse ácidos nucleicos y anticuerpos, por ejemplo, para: (1) la detección de la presencia de mutaciones de KLK15 o para la detección de la sobreexpresión o infraexpresión del ARNm de KLK15 en comparación con un estado sin trastorno o para la detección cualitativa o cuantitativa de formas alternativamente cortadas y empalmadas de los transcritos de KLK15 que pueden correlacionarse con determinadas enfermedades o la susceptibilidad hacia dichas dolencias; y (2) la detección de una sobreabundancia o una infraabundancia de proteínas de KLK15 en comparación con un estado sin trastorno o la presencia de una proteína de KLK15 modificada (p. ej., menos de la longitud total) que se correlaciona con un estado del trastorno o una evolución hacia un estado del trastorno.

Los métodos descritos en la presente memoria pueden utilizarse para evaluar la probabilidad de la presencia de células malignas o premalignas, por ejemplo, en un grupo de células recién eliminadas de un huésped. Dichos métodos pueden utilizarse para detectar tumores, cuantificar su crecimiento y ayudar al diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. Los métodos pueden utilizarse para detectar la presencia de metástasis de cáncer, así como para confirmar la ausencia o eliminación de todo el tejido tumoral tras la cirugía, quimioterapia del cáncer y/o la terapia de radiación. Pueden además utilizarse para controlar la quimioterapia del cáncer y la reaparición del tumor.

Pueden realizarse los métodos descritos en la presente memoria utilizando kits de diagnóstico preenvasados que comprenden por lo menos un ácido nucleico o un anticuerpo específicos para KLK15 descritos en la presente memoria que pueden utilizarse convenientemente, p. ej., en instalaciones clínicas, para observar y diagnosticar pacientes y para observar e identificar aquellos individuos que presentan una predisposición a desarrollar un trastorno.

Las técnicas de detección basadas en ácidos nucleicos se describen, a continuación, en el apartado 4.1.1. Las técnicas de detección de péptidos se describen, a continuación, en el apartado 4.1.2. Las muestras que pueden analizarse utilizando los métodos de la invención incluyen las que son conocidas o se sospecha que expresan a KLK15 o contienen proteínas de KLK15. Las muestras pueden proceder de un paciente o de un cultivo celular e incluyen pero no se limitan a fluidos biológicos, extractos tisulares, células recién recogidas y lisados de células que han sido incubados en cultivos celulares.

Los oligonucleótidos o fragmentos mayores procedentes de algunos de los ácidos nucleicos de la invención pueden utilizarse como dianas en una micromatriz. La micromatriz pueden utilizarse para controlar simultáneamente los niveles de expresión de grandes cantidades de genes y para identificar variantes, mutaciones y polimorfismos genéticos. La información de la micromatriz puede utilizarse para determinar la función génica, para comprender las bases genéticas de una dolencia, para diagnosticar un trastorno y para desarrollar y controlar las actividades de agentes terapéuticos.

La preparación, utilización y análisis de micromatrices son bien conocidas por un experto en la materia. (Véase, por ejemplo, Brennan, T. M. et al. (1995) patente US nº 5.474.796; Schena, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619; Baldeschweiler et al. (1995), solicitud PCT WO 95/251116; Shalon, D. et al. (1995) solicitud PCT WO 95/35505; Heller, R. A. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155; y Heller M. J. et al. (1997) patente US nº 5.605.662).

4.1.1 Métodos para detectar moléculas de ácido nucleico de la invención

Las moléculas de ácido nucleico de la invención permiten a los expertos en la materia construir sondas de nucleótido para su utilización en la detección de secuencias de ácido nucleico de la invención en muestras. Las sondas adecuadas incluyen moléculas de ácido nucleico basadas en secuencias de ácido nucleico que codifican por lo menos 5 aminoácidos sucesivos de las zonas de la proteína de KLK15, preferentemente comprenden 15 a 30 nucleótidos (véanse las SEC. ID nº: 47 a 50). Una sonda de nucleótido puede estar marcada con una sustancia detectable tal como un marcador radioactivo que proporciona una señal adecuada y presenta suficiente vida media tal como ^{32}P, ^{3}H, ^{14}C o similares. Otras sustancias detectables que pueden utilizarse incluyen los antígenos que son reconocidos por un anticuerpo específico marcado, compuestos fluorescentes, enzimas, anticuerpos específicos para un antígeno marcado y compuestos luminiscentes. Un marcador apropiado puede seleccionarse con respecto a la velocidad de hibridación y a la unión de la sonda al nucleótido que debe detectarse y a la cantidad de nucleótido disponible para hibridación. Las sondas marcadas pueden hibridarse a ácidos nucleicos en soportes sólidos tales como fibras de nitrocelulosa o membranas de nilón como se describe generalmente en Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2ª ed.). Pueden utilizarse sondas de ácido nucleico para detectar genes, preferentemente en células humanas, que codifican proteínas de KLK15. Pueden utilizarse sondas de nucleótido también en el diagnóstico de trastornos que involucran una proteína de KLK15; en el control de la evolución de dichos trastornos; o en el control de un tratamiento terapéutico.

La sonda puede utilizarse en técnicas de hibridación para detectar los genes que codifican proteínas de KLK15. La técnica conlleva generalmente poner en contacto e incubar ácidos nucleicos (por ejemplo molécula de ADN recombinante, genes clonados) obtenidos de una muestra procedente de un paciente o de otra fuente celular con una sonda de la presente invención en condiciones favorables para la hibridación específica de las sondas con secuencias complementarias en los ácidos nucleicos. Después de la incubación, se eliminan los ácidos nucleicos no hibridados y se detecta la presencia de los ácidos nucleicos que se han hibridado con la sonda si existen.

La detección de las moléculas de ácido nucleico de la invención puede implicar la ampliación de secuencias génicas específicas que utilizan un método de ampliación tal como PCR, seguido del análisis de las moléculas ampliadas utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Los expertos en la materia pueden diseñar de forma rutinaria cebadores adecuados.

Puede utilizarse ADN genómico en ensayos de hibridación o ampliación de muestras biológicas para detectar anomalías que involucran a la estructura de KLK15, incluyendo mutaciones, inserciones, deleciones y transposiciones cromosómicas puntuales. Por ejemplo, puede utilizarse el secuenciado directo, análisis de polimorfismo conformacional de una sola cadena, análisis heterodoble, electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización, escisión química incompatible e hibridación de oligonucleótidos.

Pueden utilizarse técnicas de genotipia conocidas por un experto en la materia para tipificar polimorfismos que están en proximidad íntima con las mutaciones en un gen klk15. Pueden utilizarse polimorfismos para identificar individuos en familias que es probable que lleven mutaciones. Si un polimorfismo presenta desequilibrio de enlace con las mutaciones en un gen con KLK15, puede utilizarse también la identificación para los individuos en una población general que es probable que lleve mutaciones. Los polimorfismos que pueden utilizarse incluyen polimorfismos con longitud del fragmento de restricción (RFLP), polimorfismos de una sola base y polimorfismos sencillos con repetición de la secuencia (SSLP).

Puede utilizarse una sonda de la invención para identificar directamente los RFPL. Puede utilizarse además una sonda o cebador de la invención para aislar clones genómicos tales como YAC, BAC, PAC, cósmidos, fago o plásmidos. El ADN en los clones puede identificarse para los SSLP utilizando procedimientos de hibridación o de
secuenciado.

Pueden utilizarse las técnicas de hibridación y ampliación descritas en la presencia memoria en aspectos de análisis cualitativo y cuantitativo de la expresión de klk15. Por ejemplo, puede aislarse ARN de un tipo de célula o tejido conocido para expresar klk15 y analizarse utilizando la hibridación (p. ej. análisis de Northern normalizado) o técnicas de PCR mencionadas en la presente memoria. Pueden utilizarse técnicas para detectar diferencias en el tamaño del transcrito que pueden ser debido a corte y empalme alternativo normal o anormal. Pueden utilizarse las técnicas para detectar diferencias cuantitativas entre niveles de transcritos completos y/o alternativamente de corte y empalme detectados en individuos normales en comparación con los individuos que presentan síntomas de un trastorno que involucra una proteína de KLK15.

Pueden utilizarse cebadores y sondas en los métodos in situ descritos anteriormente, es decir directamente en las secciones de tejido (fijadas y/o congeladas) del tejido del paciente extraído por biopsias y resecciones.

4.1.2 Métodos para detectar proteínas de KLK15

Pueden utilizarse anticuerpos específicamente reactivos con una proteína de KLK15, o derivados, tales como conjugados enzimáticos o derivados marcados, para detectar proteínas de KLK15 en varias muestras (por ejemplo, materiales biológicos). Pueden utilizarse como reactivos para diagnóstico o pronóstico y pueden utilizarse para detectar anomalías en el nivel de expresión de la proteína de KLK15, o anomalías en la estructura y/o posición temporal, del tejido, celular o subcelular de una proteína de KLK15. Pueden utilizarse anticuerpos para identificar in vitro compuestos potencialmente terapéuticos para determinar sus efectos sobre los trastornos que involucran una proteína de KLK15, y otras enfermedades. Puede utilizarse también inmunoanálisis in vitro para evaluar o controlar la eficacia de determinadas terapias. Pueden utilizarse también los anticuerpos de la invención in vitro para determinar el nivel de expresión de KLK15 en células modificadas genéticamente para producir la proteína de KLK15.

Pueden utilizarse anticuerpos en cualquier inmunoanálisis conocido que se base en la interacción del enlace entre un determinante antigénico de una proteína de KLK15 y los anticuerpos. Ejemplos de dichos análisis son el radioinmunoanálisis, el inmunoanálisis enzimático (p. ej. ELISA), la inmunofluorescencia, la inmunoprecipitación, la aglutinación en látex, la hemoaglutinación y las pruebas histoquímicas. Pueden utilizarse anticuerpos para detectar y cuantificar proteínas de KLK15 en una muestra a fin de determinar su función en determinados episodios celulares o estados patológicos y para diagnosticar y tratar dichos estados patológicos.

En particular, pueden utilizarse los anticuerpos de la invención en análisis inmunohistoquímicos, por ejemplo, en el nivel celular y subsubcelular, para detectar una proteína de KLK15, para localizarla en determinadas células y tejidos y para especificar posiciones subcelulares y para cuantificar el nivel de expresión.

Pueden utilizarse técnicas histoquímicas conocidas en la materia para localizar antígenos que utilizan microscopía óptica y electrónica para detectar una proteína de KLK15. Generalmente, puede marcarse un anticuerpo de la invención con una sustancia detectable y una proteína relacionada con KLK15 puede localizarse en los tejidos y células basándose en la presencia de la sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen, pero no se limitan a, los siguientes radioisótopos (p. ej., ^{3}H, ^{14}C, ^{35}S, ^{125}I, ^{131}I), marcadores fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, lantánidos fosforescentes), marcadores luminiscentes tal como luminol; marcadores enzimáticos (p. ej. peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa), grupos biotinilo (que pueden detectarse mediante avidina marcada p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o calorimétricos), epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej., secuencias par cremallera de leucina, secuencias de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace metálico, etiquetas de epítopo). En algunas formas de realización, los marcadores están unidos mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. Los anticuerpos pueden también acoplarse a sustancias de densidad electrónica, tal como ferritina u oro coloidal, que se observan fácilmente al microscopio electrónico.

El anticuerpo o la muestra pueden inmovilizarse sobre un portador o soporte sólido que sea capaz de inmovilizar las células, anticuerpos, etc. Por ejemplo, el portador o soporte puede ser nitrocelulosa, o vidrio, poliacrilamidas, gabbros y magnetita. El material del soporte puede presentar cualquier configuración posible incluyendo la esférica (p. ej. perlas), cilíndrica (p. ej. superficie interna de un tubo de ensayo o pocillos, o la superficie externa de una varilla) o plana (p. ej. lámina, tira de prueba). Pueden emplearse también métodos indirectos en los que la reacción antígeno-anticuerpo primaria se amplía mediante la introducción de un segundo anticuerpo, que presenta especificidad para el anticuerpo reactivo frente a la proteína de KLK15. A título de ejemplo, si el anticuerpo que presenta especificidad a la proteína de KLK15 es un anticuerpo de IgG de conejo, el segundo anticuerpo puede ser gamma-globulina anticonejo de cabra marcada con una sustancia detectable como se describe en la presente memoria.

Cuando se utiliza un marcador radioactivo como sustancia detectable, puede localizarse una proteína de KLK15 por radioautografía. Los resultados de la radioautografía pueden cuantificarse determinando la densidad de partículas en los radioautógrafos por varios métodos ópticos, o mediante recuento de los granos.

En una forma de realización, la invención contempla un kit de ensayo para controlar la evolución del cáncer (p. ej. cáncer de próstata) en un individuo, que comprende:

(a)

poner en contacto una cantidad de un anticuerpo que se une a la proteína de KLK15, con una muestra del individuo de modo que formen un complejo binario que comprende el anticuerpo y la proteína de KLK15 en la muestra;

(b)

determinar o detectar la presencia o cantidad de formación de complejo en la muestra;

(c)

repetir las etapas (a) y (b) en un punto posterior en el tiempo; y

(d)

comparar el resultado de la etapa (b) con el resultado de la etapa (c), en el que una diferencia en la cantidad de formación de complejo es indicativa de la evolución del cáncer en dicho individuo.

La cantidad de complejos puede compararse también con un valor representativo de la cantidad de complejos de un individuo no en riesgo de cáncer ni afectado por éste (p. ej. cáncer de próstata).

4.2 Métodos para identificar o evaluar sustancias/compuestos

Los métodos descritos en la presente memoria se diseñan para identificar sustancias que modulen la actividad biológica de una proteína de KLK15 incluyendo las sustancias que se unen a proteínas de KLK15, o unirse a otras proteínas que interactúan con una proteína de KLK15, a compuestos que interfieren con la interacción de una proteína de KLK15 o aumentan ésta y sustancias que se unen a la proteína de KLK15 u otras proteínas que interactúan con una proteína de KLK15. Los métodos se utilizan también para identificar compuestos que se unen a las secuencias reguladoras de KLK15.

Las sustancias y compuestos identificados utilizando los métodos de la invención incluyen pero no se limitan a los péptidos tales como los péptidos solubles que incluyen péptidos de fusión con cola de Ig, elementos de bancos de péptidos aleatorios y bancos moleculares derivados de la química combinatoria de aminoácidos en configuración D y/o L, fosfopéptidos (incluyendo los elementos de azar o parcialmente degenerados, bancos de fosfopéptidos dirigidos), anticuerpos [p. ej., policlonales, monoclonales, humanizados, antiidiotípico, híbrido, anticuerpos de una sola cadena, fragmentos (p. ej., Fab, F(ab)_{2} y fragmento del banco de expresión de Fab y fragmentos de estos de unión al epítopo)], y pequeñas moléculas orgánicas o inorgánicas. La sustancia o compuesto puede ser un compuesto fisiológico endógeno o puede ser un compuesto natural o sintético.

Las sustancias que modulan una proteína de KLK15 pueden identificarse basándose en su capacidad para unirse a una proteína de KLK15. Por consiguiente la invención también proporciona métodos para identificar sustancias que se unen a la proteína de KLK15. Las sustancias identificadas que utilizan los métodos de la invención pueden aislarse, clonarse y secuenciarse utilizando técnicas convencionales. Una sustancia que se asocia a un polipéptido de la invención puede ser un agonista o antagonista de la actividad biológica o inmunológica de un polipéptido de la invención.

El término "agonista", se refiere a una molécula que aumenta la cantidad de actividad de la proteína o prolonga su duración. El término "antagonista" se refiere a una molécula que disminuye la actividad biológica o inmunológica de la proteína. Pueden incluirse agonistas y antagonistas, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o pueden asociarse otras moléculas con una proteína de la invención.

Sustancias que se unen con una proteína de KLK15 pueden identificarse haciendo reaccionar una proteína de KLK15 con una sustancia de la prueba que se une potencialmente a una proteína de KLK15, en condiciones que permitan la formación de los complejos proteicos sustancia-KLK15 y eliminar y/o detectar los complejos. Los complejos pueden determinarse analizando la sustancia libre o la proteína de KLK15 no acomplejada en los complejos sustancia-proteína de KLK15. Las condiciones que permiten la formación de complejos sustancia-proteína de KLK15 pueden seleccionarse con respecto a factores tales como la naturaleza y cantidades de la sustancia y de la proteína.

El complejo sustancia-proteína, la sustancia libre o las proteínas no acomplejadas pueden aislarse mediante técnicas de aislamiento convencional, por ejemplo, precipitación por salado, cromatografía, electroforesis, filtración en gel, fraccionamiento, absorción, electroforesis en gel de poliacrilamida, aglutinación o combinaciones de los mismos. Para facilitar el análisis de los componentes, puede utilizarse el anticuerpo contra la proteína de KLK15 o la sustancia, o la proteína de KLK15 marcada, o una sustancia marcada. Los anticuerpos, proteínas o sustancias pueden marcarse con una sustancia detectable como se describió anteriormente.

Una proteína de KLK15 o la sustancia utilizada en el método de la invención pueden insolubilizarse. Por ejemplo, una proteína de KLK15 o la sustancia pueden estar unidas a un portador adecuado tal como agarosa, celulosa, dextrano, Sephadex, sepharosa, carboximetilcelulosa poliestireno, papel de filtro, resina de intercambio iónico, película de plástico, tubo de plástico, copolímero poliamina-éter metilvinílico-ácido maleico, copolímero de aminoácidos, copolímero de etileno-ácido maleico, nilón, seda, etc. El portador puede estar en forma, por ejemplo, de tubo, lámina de prueba, perlas, disco, esfera, etc. La proteína o sustancia insolubilizada puede prepararse haciendo reaccionar el material con un portador insoluble adecuado utilizando métodos químicos o físicos conocidos, por ejemplo, acoplamiento con bromuro de cianógeno.

La invención contempla también un método para evaluar un compuesto por su capacidad para modular la actividad biológica de una proteína de KLK15 de la invención, analizando un agonista o antagonista (es decir potenciador o inhibidor) del enlace de una proteína de KLK15 con una sustancia que se une con una proteína de KLK15. El método básico para evaluar si un compuesto es un agonista o antagonista del enlace de una proteína de KLK15 y una sustancia que se une a la proteína, consiste en preparar una mezcla de reacción que contiene la proteína de KLK15 y la sustancia en condiciones que permitan la formación de complejos sustancia-proteína de KLK15, en presencia de un compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo puede añadirse inicialmente a la mezcla, o puede añadirse después de la adición de la proteína de KLK15 y la sustancia. También se preparan mezclas de reacción de referencia sin el compuesto de ensayo o con un placebo. Se detecta la formación de complejos y la formación de complejos en la reacción de control pero no en la mezcla de reacción indica que el compuesto de la prueba interfiere con la interacción de la proteína de KLK15 y la sustancia. Las reacciones pueden realizarse en fase líquida o la proteína de KLK15, la sustancia o el compuesto de la prueba pueden estar inmovilizados como se describe en la presente memoria. La capacidad de un compuesto para modular la actividad biológica de una proteína de KLK15 de la invención puede analizarse determinando los efectos biológicos sobre las células.

Debe entenderse que los agonistas y antagonistas, es decir los inhibidores y los potenciadores que pueden analizarse utilizando los métodos de la invención pueden actuar en una o más de las secuencias de enlace sobre la proteína o la sustancia incluyendo las secuencias de enlace del agonista, las secuencias de enlace del antagonista competitivo, las secuencias de enlace del antagonista no competitivo o las secuencias alostéricas.

La invención también permite identificar antagonistas que inhiben los efectos de un agonista de la interacción de la proteína de KLK15 con una sustancia que es capaz de unirse a la proteína de KLK15. Por esta razón, la invención puede utilizarse para analizar un compuesto que compite por la misma secuencia de enlace de una proteína de KLK15.

La invención contempla también métodos para identificar compuestos que se unen a proteínas que interactúan con una proteína de KLK15. Las interacciones proteína-proteína pueden ser identificadas utilizando métodos convencionales tal como la coinmunoprecipitación, reticulación y purificación conjunta mediante gradientes o columnas cromatográficas. Pueden emplearse también métodos que produzcan la identificación simultánea de genes que codifican proteínas que interactúan con una proteína de KLK15. Estos métodos incluyen el sondado de bancos de expresión con la proteína de KLK15 marcada.

Pueden utilizarse también sistemas de dos híbridos para detectar interacciones de la proteína in vivo. Generalmente, se construyen plásmidos que codifican dos proteínas híbridas. Una primera proteína híbrida consta del dominio de enlace al ADN de una proteína activadora de transcripción fusionada a una proteína de KLK15 y la segunda proteína híbrida consta del dominio del activador de la proteína del activador de transcripción fusionado a una proteína desconocida codificada por un ADNc que se ha recombinado en el plásmido con la parte de un banco de ADNc. Los plásmidos se transforman en una cepa de levadura (p. ej. S. cerevisiae) que contiene un gen indicador (p. ej. lacZ, luciferasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) cuya zona reguladora contiene la secuencia de enlace del activador de transcripción. Las proteínas híbridas solas no pueden activar la transcripción del gen indicador. Sin embargo, la interacción de las dos proteínas híbridas reconstituye la proteína activadora operativa y produce la expresión del gen indicador, que se detecta mediante un análisis por el producto del gen indicador.

Debe apreciarse que las proteínas de fusión pueden utilizarse en los métodos descritos anteriormente. En particular, las proteínas de KLK15 fusionadas a una glutatión-S-transferasa pueden utilizarse en los métodos.

Un modulador de una proteína de KLK15 de la invención puede también identificarse basándose en su capacidad para inhibir o potenciar la actividad catalítica de la proteína.

Los reactivos adecuados para aplicar a los métodos de la invención destinados a evaluar los compuestos que modulan una proteína de KLK15 pueden estar empaquetados en kits convenientes proporcionando los materiales necesarios empaquetados en recipientes adecuados. Los kits pueden incluir también soportes adecuados útiles para realizar los métodos de la invención.

4.3. Composiciones y tratamientos

Las proteínas de la invención, las sustancias o los compuestos identificados mediante los métodos descritos en la presente memoria, los antibióticos y las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden utilizarse para modular la actividad biológica de una proteína de KLK15 y pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades tal como el cáncer (particularmente el cáncer de tiroides, de próstata, de colon, de riñón y testicular) y trastornos del tiroides en un paciente.

Por consiguiente, pueden formularse sustancias, anticuerpos, péptidos y compuestos en composiciones farmacéuticas para la administración a pacientes de forma biológicamente compatible adecuada para la administración in vivo. "Forma biológicamente compatible adecuada para su administración in vivo" significa una forma de la sustancia activa que debe administrarse en la que algunos efectos tóxicos están sobrevalorados por los efectos terapéuticos. Las sustancias activas pueden administrarse a organismos vivos incluyendo los seres humanos y los animales. La administración de una cantidad terapéuticamente activa de una composición farmacéutica de la presente invención está definida como una cantidad eficaz, a las dosis y durante periodos de tiempo necesarios para alcanzar todo resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de una sustancia puede variar según factores tales como la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse a diario varias dosis inhibidas o la dosis puede reducirse proporcionalmente como se indica por exigencias de la solución terapéutica.

La sustancia activa puede administrarse de manera conveniente tal como mediante inyección (subcutánea, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica o administración rectal. Dependiendo de la vía de administración, la sustancia activa puede estar recubierta de un material que proteja la sustancia de la acción de las enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar la sustancia.

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden prepararse por métodos conocidos por sí mismos para la preparación de composiciones farmacéuticamente aceptables que pueden administrarse a pacientes, de modo que una cantidad de la sustancia activa se combina en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). Basándose en esto, las composiciones incluyen, aunque no exclusivamente, soluciones de las sustancias activas junto con uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables y contenidos en soluciones tamponadas con un pH adecuado e isoosmóticas con los fluidos
fisiológicos.

Las composiciones están indicadas como agentes terapéuticos bien solos o junto con otros agentes terapéuticos u otras formas de tratamiento (p. ej. quimioterapia o radioterapia). Por ejemplo, pueden utilizarse composiciones en combinación con agentes antiproliferantes, agentes antimicrobianos, agentes inmunoestimulantes o antiinflamatorios. En particular, los compuestos pueden utilizarse en combinación con agentes antivíricos y/o antiproliferantes. Las composiciones de la invención pueden administrarse simultáneamente, por separado o sucesivamente con otros agentes terapéuticos o terapias.

Los vectores procedentes de retrovirus, adenovirus, herpes virus o vacunas o procedentes de varios plásmidos bacterianos, pueden utilizarse para administrar moléculas de ácido nucleico a un órgano, tejido o población celular objetivos. Pueden utilizarse métodos bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores recombinantes que expresen moléculas de ácido nucleico con cadena complementaria de la invención. (Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (supra) y Ausubel et al. (supra)).

Las moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias completas de ADNc y/o sus elementos reguladores permiten utilizar a un experto en la materia secuencias que codifican una proteína de la invención como herramienta de investigación en la regulación de la cadena transcrita (Youssoufian H. y H. F. Lodish 1993 Mol. Cell Biol. 13:98-104) o de la cadena complementaria (Eguchi et al. (1991) Annu. Rev. Biochem. 60:631-652) de la función génica. Dicha tecnología es bien conocida en la materia y los oligómeros de cadena transcrita o complementaria o fragmentos mayores, pueden diseñarse en varias posiciones a lo largo de las zonas de codificación o de referencia.

Los genes que codifican una proteína de la invención pueden desviarse transfectando una célula o tejido con vectores que expresan grandes niveles de un fragmento deseado de codificación de KLK15. Dichos montajes pueden inundar las células con secuencias de cadena transcrita o complementaria no traducibles. Aún en ausencia de integración en el ADN, dichos vectores pueden continuar para transcribir moléculas de ARN hasta que todas las copias estén deshabilitadas por nucleasas endógenas.

Pueden obtenerse modificaciones de la expresión génica diseñando moléculas de cadena complementaria, ADN, ARN o APN, en las zonas reguladoras de un gen que codifica una proteína de la invención, es decir, los activadores, potenciadores e intrones. Preferentemente, los oligonucleótidos proceden de la secuencia de iniciación de la transcripción, p. ej. Entre las zonas -10 y +10 de la secuencia principal. Pueden también diseñarse moléculas de cadena complementaria de modo que bloqueen la traducción del ARNm impidiendo la unión del transcrito a los ribosomas. La inhibición también puede conseguirse utilizando la metodología de emparejamiento de bases de "triple hélice". El emparejamiento de triple hélice compromete la capacidad de la doble hélice de abrir suficientemente la unión de las polimerasas, los factores de transcripción o las moléculas reguladoras. Los avances terapéuticos que utilizan ADN triple fueron estudiados por Gee J. E. et al. (en: Huber B. E. y B. I. Carr (1994) Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco N.Y.).

Los ribozimas son moléculas de ARN enzimático que catalizan la escisión específica del ARN. Los ribozimas actúan por hibridación específica de la secuencia de la molécula de ribozima al ARN diana complementario, seguido de escisión endonucleolítica. La invención contempla por lo tanto moléculas de ribozima con motivo de cabeza de martillo modificadas genéticamente que pueden catalizar de manera específica y eficaz la escisión endonucleolítica de las secuencias que codifican una proteína de la invención.

Las secuencias específicas para la escisión del ribozima en cualquier ARN potencial diana pueden identificarse inicialmente explorando las secuencias de adición del ribozima en la molécula diana que incluyen las secuencias siguientes, GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas las secuencias, las secuencias del ARN corto de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la zona del gen diana que contiene la secuencia de escisión pueden evaluarse las características estructurales secundarias que pueden hacer inoperable el oligonucleótido. La idoneidad de las dianas experimentales puede determinarse también probando la accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios que utilizan ensayos de protección de la ribonucleasa.

Los métodos para introducir vectores en células o tejidos incluyen aquellos métodos expuestos en la presente memoria y que son adecuados para la terapia in vivo, in vitro y ex vivo. En la terapia ex vivo, los vectores pueden introducirse en células madre extraídas de un paciente y propagadas clonalmente para el trasplante autólogo en el mismo paciente (véase las patente US nº 5.399.493 y nº 5.437.994). La administración por trasfección y por liposomas son bien conocidas en la materia.

Un anticuerpo contra una proteína de KLK15 puede estar conjugado con fármacos quimioterapéuticos, toxinas, modificadores de la respuesta inmunológica, agentes hematógenos, enzimas y radioisótopos y utilizarse para la prevención y tratamiento del cáncer (p. ej. cáncer de tiroides, próstata, colon, riñón y testicular). Por ejemplo, un anticuerpo contra una proteína de KLK15 puede conjugarse con restos tóxicos que incluyen pero no se limitan a ricino A, toxina de la difteria, abrina, modeccina, o toxinas bacterianas procedentes de Pseudomonas o Shigella. Se ha descrito que las toxinas y sus derivados forman conjugados con anticuerpos específicos para determinados tejidos diana, tales como células cancerosas o tumorales a fin de obtener toxicidad celular específicamente dirigida (Moolten F. L. et al., Immun. Rev. 62:47-72, 1982 y Bernhard, M. I. Cancer Res. 43:4420, 1983).

Pueden prepararse conjugados por los medios habituales conocidos en la materia. Un número de agentes de enlace bifuncionales (p. ej. enlazadores heterobifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato) están disponibles en el mercado en Pierce Chemical Company, Rockford, III.

La administración de anticuerpos o inmunotoxinas para uso terapéutico puede ser por vía intravenosa, si bien con formulación apropiada otras vías de administración tales como la administración intraperitoneal, oral o transdérmica también pueden utilizarse.

Una proteína de KLK15 puede conjugarse con fármacos quimioterapéuticos, toxinas, modificadores de respuesta inmunológica, enzimas y radioisótopos utilizando métodos conocidos en la materia.

La invención proporciona también métodos inmunoterapéuticos para prevenir o reducir la gravedad de un cáncer. Los signos o síntomas clínicos del cáncer en un paciente son indicativos de un efecto beneficioso en el paciente debido a la estimulación de la respuesta inmunitaria del paciente contra el cáncer. La estimulación de una respuesta inmunitaria se refiere a la producción de una respuesta inmunitaria o la potenciación de la actividad de células inmunoefectoras en respuesta a la administración de una preparación de vacuna de la invención. La prevención de un cáncer puede estar indicada por un aumento del tiempo antes de la aparición del cáncer en un paciente que está predispuesto a desarrollar el cáncer debido por ejemplo a una disposición genética o a la exposición a un agente cancerígeno. La reducción de la gravedad de un cáncer puede estar indicada por una disminución en el tamaño o en la velocidad de crecimiento de un tumor.

Las vacunas pueden proceder de una proteína KLK, de los péptidos derivados de la misma o de los péptidos sintéticos producidos químicamente o de cualquier combinación de estas moléculas, o de las proteínas de fusión o de los péptidos de las mismas. Las proteínas, péptidos, etc. pueden sintetizarse o prepararse de manera recombinante o si no biológicamente, para comprender una o más secuencias de aminoácido correspondientes a uno o más epítopos de un tumor asociado a la proteína. Los epítopos de un tumor asociado a la proteína puede entenderse que incluyen la posibilidad de que en algunos casos las variaciones de la secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido natural pueden ser antigénicas y conferir inmunidad protectora contra el cáncer o los efectos antitumorígenos. Las variaciones de la secuencia pueden incluir sin limitación, sustituciones de aminoácidos, ampliaciones, deleciones, truncamientos, interpolaciones y combinaciones de los mismos. Dichas variaciones están comprendidas dentro del alcance de la invención con la condición de que la proteína que las contiene sea inmunógena y los anticuerpos contra dicho polipéptido interreaccionen con la proteína de KLK15 natural en una medida suficiente para proporcionar inmunidad protectora y/o actividad antitumorígena cuando se administran en forma de vacuna.

Las proteínas, péptidos, etc. pueden incorporarse a vacunas capaces de producir una respuesta inmunitaria utilizando los métodos conocidos en la materia. Las técnicas para potenciar la antigenicidad de las proteínas, péptidos, etc. son conocidas en la materia e incluyen la incorporación a una estructura multimérica, la unión a un portador de la proteína muy inmunógeno, por ejemplo, la hemocianina de la lapa californiana (KLH) o la vacuna contra la difteria y la administración en combinación con adyuvantes o cualquier otro potenciador de respuesta inmunitaria.

Las vacunas pueden combinarse con medios fisiológicamente aceptables, incluyendo diluyentes y portadores inmunológicamente aceptables así como adyuvantes empleados habitualmente tales como el adyuvante completo de Freund, saponina, alúmina y similares.

Debe apreciarse además que los anticuerpos antiidiotipo contra los anticuerpos para las proteínas de KLK15 descritos en la presente memoria son también útiles como vacunas y pueden formularse igualmente.

La administración de una vacuna según la invención, es aplicable generalmente para la prevención o el tratamiento de cánceres incluyendo el cáncer de tiroides, próstata, colon, riñón y testicular.

La administración a un paciente de una vacuna según la invención para la prevención y/o tratamiento del cáncer puede tener lugar antes o después de un procedimiento quirúrgico para eliminar el cáncer, antes o después de un procedimiento terapéutico para el tratamiento del cáncer y antes o después de la terapia de radiación para el tratamiento del cáncer y cualquier combinación de los mismos. La inmunoterapia del cáncer según la invención sería el tratamiento preferido para la prevención y/o tratamiento del cáncer, ya que los efectos secundarios involucrados son sustancialmente mínimos en comparación con los demás tratamientos disponibles, p. ej. cirugía, quimioterapia, terapia de radiación. Las vacunas presentan el potencial o capacidad para prevenir el cáncer en pacientes sin cáncer pero que están en riesgo de desarrollar cáncer.

La actividad de las proteínas, sustancias, compuestos, anticuerpos, moléculas de ácido nucleico, agentes y composiciones de la invención pueden estar confirmadas en sistemas de modelo experimental. La eficacia terapéutica y la toxicidad pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos normalizados en cultivos celulares o con animales experimentales, tal como calculando la ED_{50} (dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) o la LD_{50} (dosis letal para el 50% de la población) estadísticas. El índice terapéutico es la relación de dosis de efecto terapéutico atóxico y puede expresarse como la relación ED_{50}/LD_{50}. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan efectos terapéuticos grandes.

4.4 Otras aplicaciones

Las moléculas de ácido nucleico dadas a conocer en la presente memoria pueden utilizarse también en técnicas de biología molecular que todavía no han sido desarrolladas, con la condición de que las nuevas técnicas basadas en las propiedades de secuencias de nucleótidos que son actualmente conocidas, incluyendo pero sin limitarse a dichas propiedades como el código genético del triplete y las interacciones de pares de bases específicas.

A fin de estudiar la función de un polipéptido de la invención, pueden desarrollarse células, tejidos y animales no humanos que carecen de la expresión o que carecen parcialmente de expresión de una molécula de ácido nucleico o gen de la invención utilizando vectores de expresión recombinantes de la invención con mutaciones específicas por deleción o infección en el gen. Puede utilizarse un vector de expresión recombinante para inactivar o alterar el gen endógeno por recombinación homóloga y crear de este modo una célula, tejido o animal defectuoso.

Ningún alelo puede generarse en células, tales como las células madre embrionarias por mutación con deleción. Un gen recombinante puede modificarse genéticamente también para que contenga una mutación por inserción que inactive el gen. Dicho montaje puede introducirse a continuación en una célula, tal como una célula madre embrionaria, mediante una técnica tal como la transfección, electroporación, inyección, etc. Las células que carecen de un gen íntegro pueden identificarse a continuación, por ejemplo mediante transferencia Southern, transferencia Northern o ensayando la expresión del polipéptido codificado que utiliza los métodos descritos en la presente memoria. Dichas células pueden fusionarse a continuación a células madre embrionarias para generar animales transgénicos no humanos carentes de un polipéptido de la invención. La transmisión por línea germinal de la mutación puede conseguirse, por ejemplo, agregando células madre embrionarias con embriones en etapa inicial, tal como embriones con linfocitos B, in vitro; transfiriendo los blastocitos resultantes a hembras receptoras y; generando la transmisión de la línea germinal de los híbridos de agregación resultantes. Dicho animal mutante puede utilizarse para definir poblaciones de células específicas, modelos de desarrollo y procesos in vivo, dependientes normalmente de la expresión génica.

Un mamífero transgénico no humano puede desarrollar todas las células germinales y células somáticas que contienen un vector de expresión recombinante que inactiva o altera un gen que codifica una proteína de KLK15. El mamífero transgénico no humano (del que todas las células germinales y las células somáticas contienen un vector de expresión recombinante que inactiva o altera un gen que codifica una proteína de KLK15) pueden producir una patología asociada a la proteína de KLK15. Un mamífero transgénico no humano que no expresa o ha alterado (p. ej. reducido) la expresión de una proteína de KLK15 de la invención puede producir una patología asociada a la proteína de KLK15. Una patología por la proteína de KLK15 se refiere a un fenotipo observado para un mutante homozigótico o heterozigótico de la proteína de KLK15.

Un animal transgénico no humano puede ser, por ejemplo, un ratón, rata, conejo, oveja, hámster, perro, gato, cabra o mono.

Un sistema de ensayo de animal transgénico no humano puede proporcionar un sistema de modelo para determinar un agente que reduce o inhibe una patología asociada a una proteína de KLK15, tal como una patología asociada a la proteína de KLK15, que comprende:

(a)

administrar el agente a un animal transgénico no humano; y

(b)

determinar si dicho agente reduce o inhibe la patología (p. ej. la patología asociada a la proteína de KLK15) en el animal transgénico no humano en comparación con un animal transgénico no humano de la etapa (a) al que no se ha administrado el agente.

El agente puede ser útil en el tratamiento y profilaxis de enfermedades, tales como el cáncer, expuestas en la presente memoria. Los agentes pueden incorporarse también a una composición farmacéutica como se describe en la presente memoria. El ejemplo siguiente no limitativo es ilustrativo de la presente invención:

Ejemplo

Materiales y métodos Identificación del nuevo gen

Se construyó una cartografía contigua para el locus del gen de calicreína humano que se extiende desde el gen KLK1 (centrómeros) al gen KLK14 (telómero) (7, 8, 11, 12, 27). Se identificaron los clones del cromosoma artificial bacteriano (BAC) solapantes que se extienden por esta área mediante el cribado de un banco BAC humano que utiliza varias sondas específicas para el gen radiomarcadas. Se creó un área de \sim300 kb de secuencia genómica utilizando diferentes técnicas, como se describió anteriormente (11, 27). Realizando un análisis de restricción de EcoRI, se orientó el locus de calicreína a lo largo de la cartografía de restricción de EcoR1 del cromosoma 19q13 disponible en Lawrence Livermore National Laboratory (LLNL). Se identificó a continuación un clon BAC que se extiende más centroméricamente (BC 781134). Los cóntigos de las secuencias genómicas lineales de este clon están disponibles en el LLNL. Inicialmente, estas secuencias de cóntigo se utilizaban para prever la presencia de nuevos genes, utilizando métodos bioinformáticos, como se describió anteriormente (8, 12) y se identificó una nueva serina proteasa supuesta. La secuencia del supuesto gen se verificó a continuación por diferentes métodos incluyendo el secuenciado, la búsqueda en la base de datos EST, el cribado por PCR de tejidos, como se describe a continuación.

Investigación de la etiqueta de la secuencia expresada (EST)

Los exones previstos del supuesto nuevo gen se sometieron a búsqueda de la homología utilizando el algoritmo BLASTN (28) en el servidor de la red de información del National Center for Biotechnology (http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/BLAST/) frente a la base de datos EST humana (dbEST). Los clones con >95% de homología se obtuvieron del consorcio I.M.A.G.E. (29) a través del Research Genetics Inc, Huntsville, AL. Se propagaron los clones, se purificaron como se describió en otra parte (30) y se secuenciaron en ambas direcciones con un secuenciador automático, utilizando cebadores del vector que flanquea la inserción.

Línea celular de cáncer de próstata y experimentos de estimulación hormonal

La línea celular del cáncer de próstata LNCaP se adquirió en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD. Se cultivaron las células en medio RPMI (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) enriquecido con glutamina (200 mmoles/l), insulina bovina (10 mg/l), suero bovino fetal (10%), antibióticos y antimicóticos, en frascos de plástico, hasta casi la confluencia. Se tomaron alícuotas a continuación de las células en placas de cultivo tisular de 24 pocillos y se cultivaron a una confluencia de 50%. 24 horas antes de los experimentos, se cambiaron los medios de cultivo en medio exento de rojo de fenol que contenía suero bovino fetal agotado en carbón activo al 10%. Para los experimentos de estimulación, se añadieron en el medio de cultivo varias hormonas esteroides disueltas en etanol al 100% a una concentración final de 10^{-8}. Las células estimuladas con etanol al 100% se incluyeron como referencias. Se cultivaron las células durante 24 horas, a continuación se recogieron para la extracción del ARNm.

Reacción en cadena de polimera de transcriptasa inversa (RT-PCR) para el gen KLK15

Se extrajo el ARN total de la línea celular LNCaP de tejidos de la próstata utilizando el reactivo Trizol (Gibco BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se determinó la concentración de ARN por espectrofotometría. Se transcribieron a la inversa 2 \mug de ARN total en la primera cadena de ADNc utilizando el sistema de preampliación Superscript^{TM} (Gibco BRL). El volumen final fue de 20 \mul. Basándose en la información combinada obtenida de la estructura genómica prevista del nuevo gen y en las secuencias EST (véase a continuación), se diseñaron dos cebadores específicos para el gen (KLK15-F1 - SEC. ID nº: 47 y KLK15-R1 - SEC. ID nº: 48) (Tabla 1) y se realizó la PCR en una mezcla de reacción que contenía 1 \mul de ADNc, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP 200 \muM (trifosfatos de desoxinucleósido), 150 ng de cebadores y 2,5 unidades de HotStar^{TM} ADN polimerasa (Qiagen Inc., Valencia, CA) en un ciclador térmico 9600 de Perkin-Elmer. Las condiciones de ciclación fueron 95ºC durante 15 minutos para activar la Taq ADN polimerasa, seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 30 s., 64ºC durante 30 s., 72ºC durante 1 min. y una etapa de prolongación final a 72ºC durante 10 min. Cantidades iguales de productos de PCR se electroforizaron en geles de agarosa al 2% y se observaron mediante teñido con bromuro de etidio. Todos los cebadores para RT-PCR abarcaban por lo menos 2 exones para impedir la contaminación por el ADN genómico. Para verificar la identidad de los productos de PCR, se clonaron en el vector pCR 2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) según las instrucciones del fabricante. Se secuenciaron las inserciones en ambas direcciones utilizando los cebadores específicos para el vector, con un secuenciador automático de ADN.

Expresión del tejido

El ARN total aislado de 26 tejidos humanos diferentes se adquirió en Clontech, Palo Alto, CA. Se preparó ADNc como se describió anteriormente para los experimentos en cultivo de tejido y se utilizó para las reacciones por PCR. Se ampliaron los ADNc del tejido a varias diluciones utilizando dos cebadores específicos para el gen (KLK15-F2 - SEC. ID nº: 49 y KLK15-R1 - SEC. ID nº: 48) (Tabla 1). Debido al alto grado de homología entre las calicreínas y a excluir la ampliación no específica, los productos de PCR se clonaron y se secuenciaron.

Tejidos de cáncer de próstata

Se extrajeron muestras de tejido prostático de 29 pacientes que se habían sometido a prostatectomía retropúbica radical para el adenocarcinoma prostático en el Charite University Hospital, Berlín, Alemania. Los pacientes no recibieron ninguna terapia hormonal antes de la cirugía. La utilización de estos tejidos con fines de investigación fue aprobada por el Ethics Committee of the Charite Hospital. Se extrajeron muestras de tejido de próstata reciente de las partes cancerosas y no cancerosas de las mismas próstatas que se habían extraído. Algunas piezas de tejido se disecaron inmediatamente después de la eliminación de la próstata y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta el análisis. El análisis histológico de todas las piezas de tejido se realizó como se describió anteriormente (31), para asegurar que el tejido era maligno o benigno. Se pulverizaron los tejidos con un martillo bajo nitrógeno líquido y se extrajo el ARN como se describió anteriormente utilizando reactivo Trizol.

Análisis estadístico

Se realizó el análisis estadístico con el programa informático SAS (SAS Institute, Cary, NC). El análisis de las diferencias entre la expresión de KLK15 en tejidos no cancerosos frente a cancerosos del mismo paciente se realizó con el ensayo no paramétrico de McNemar. Se utilizó la distribución binómica para informatizar el nivel de significación. Los niveles del ARNm de KLK15 del tumor prostático se clasificaron cualitativamente en dos categorías (grupos bajo en KLK15 y alto en KLK15) y se analizaron las asociaciones entre el estado de KLK15 y otras variables utilizando la prueba exacta de Fisher.

Análisis estructural

Se realizó la alineación múltiple utilizando el paquete informático "Clustal X" y el programa de alineación múltiple disponible en el Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA. Se realizaron estudios filogenéticos utilizando el paquete informático "Phylip". Se realizó el análisis de la matriz de distancia utilizando el programa "Neighbor-Joining/UPGMA" y se realizó el análisis de parsimonia utilizando el programa "Protpars". Se realizó el estudio de hidrofobia utilizando la lanzadera de búsqueda del Baylor College of Medicine. Se predijo el péptido señal utilizando el servidor "SignalP". Se realizó el análisis estructural de la proteína mediante el programa "SAPS" (análisis estructural de la secuencia proteica).

Resultados Clonación del gen KLK15

Se creó previamente un mapa contiguo para el locus del gen de calicreína humana que se extiende desde el gen KLK1 (centrómero) al gen KLK14 (telómero) (7, 8, 11, 12, 27). A fin de investigar la presencia de otros genes de tipo calicreína centroméricos para KLK1, se obtuvo un clon de BAC (BC 781134) como se describe en materiales y métodos. Según la secuencia genómica publicada del antígeno específico de la próstata (PSA), y los genes de calicreína renal humana (KLK1), se diseñaron cebadores específicos para el gen para cada uno de estos genes (Tabla 1, SEC. ID nº: 47 a 50) y se desarrollaron protocolos de ampliación basados en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) lo que permitió la generación de productos de PCR específico con ADN genómico como plantilla. La identificación por PCR del clon BAC por estos cebadores específicos para el gen indicó que este clon es positivo para KLK1 pero negativo para PSA, confirmando, por lo tanto, qué suposición era centromérica con respecto
a PSA.

Se previó una nueva serina proteasa supuesta a partir de la secuencia de este clon mediante programas informáticos como se describió anteriormente (12). Se digirió este clon, se transfirió a una membrana y se hibridó con cebadores específicos para el gen KLK15 supuesto (según la secuencia prevista) y los fragmentos positivos se subclonaron y secuenciaron para verificar la estructura del gen supuesto. La secuencia supuesta del gen se arremetió a continuación contra la base de datos EST humana y se identificaron dos clones EST (nº de registro del GenBank AW274270 y nº AW205420). Estos dos clones eran 99% idénticos al último exón y la zona 3' no traducida del gen y a los segundos extremos EST con una prolongación de 17 nucleótidos de adenina (A) que no se encontraban en la secuencia genómica, verificando de este modo el extremo 3' del gen y la posición de la cola poli A.

Para identificar la estructura del ARNm completo del gen y para determinar los límites exón/intrón, se realizaron reacciones de PCR utilizando cebadores situados en diferentes exones predichos por ordenador, utilizando un panel de 26 ADNc de tejido humano como plantilla. Se secuenciaron los productos de PCR. Dos de estos cebadores (KLK15-F1 -
SEC. ID nº: 47 y KLK15-R1 - SEC. ID nº: 48)) (Tabla 1) fueron capaces de ampliar la zona de codificación completa del gen de diferentes tejidos. La comparación del ARNm con la estructura genómica indicó la presencia de un gen formado por cinco exones de codificación con 4 intrones de intervención. La traducción de la secuencia del ARNm en todos los posibles marcos de lectura puso de manifiesto la presencia de sólo un marco que da una cadena polipeptídica ininterrumpida, que también contiene los motivos estructurales muy conservados de las calicreínas, como se expone a continuación.

Caracterización estructural del gen KLK15

Como se muestra en la Figura 1, el gen KLK15 está formado por 5 exones de codificación y 4 intrones de intervención aunque, como con otros genes de la calicreína, la presencia de exón(es) adicional(es) no traducido(s) corriente arriba podría no estar regulada (17, 32, 33). Todas las secuencias de corte y empalme de exón/intrón conforman la secuencia de consenso para las secuencias de corte y empalme eucarióticas (34). El gen sigue además estrictamente las propiedades estructurales comunes de otros miembros de la familia multigén de calicreína humana, descrita más adelante. La zona de codificación de la proteína prevista del gen está formada por 771 bp, que codifican un polipéptido de 256 aminoácidos deducido con un peso molecular previsto de 28,1 kDa. El codón de iniciación de la traducción potencial es compatible con la secuencia de consenso Kozak (35), además, existe una purina en la posición (-3) que se produce en el 97% de los ARNm de vertebrado (36). Debe también observarse, que como la mayoría de otros genes de tipo calicreína, KLK15 no tiene el nucleótido G de consenso en la posición (+4).

Los nucleótidos 7764 a 7769 (ATTAAA) (SEC. ID nº: 40) se parecen estrechamente a una señal de consenso de poliadenilación (37) si son seguidos, después de 17 nucleótidos por la cola poli A. Ninguna otra señal de poliadenilación es discernible en la zona 3' no traducida, lo que sugiere que la secuencia anterior es la señal de poliadenilación existente. Aunque AATAAA (SEC. ID nº: 40), es muy conservada, se producen variantes naturales, y la secuencia ATAAA (SEC. ID nº: 40) se describe que tiene lugar como variante natural de poliadenilación en el 12% de las secuencias del ARNm del vertebrado (38). La presencia de ácido glutámico (E) en la posición 203 sugiere que KLK15 será probablemente una única especificidad de sustrato. PSA tiene un resto de serina (S) en la posición correspondiente y presenta actividad de tipo quimotríptica. Muchas otras calicreínas normalmente tienen aspartato (D) en esta posición lo que indica una actividad similar a la tripsina (Figura 2) (6).

Aunque la secuencia de la proteína de KLK15 es única, el análisis comparativo puso de manifiesto que presenta un grado considerable de homología con otros miembros de la familia del multigén calicreína. KLK15 presenta el 51% de identidad de la proteína y el 66% de similitud con la serina proteasa similar a la tripsina (TLSP) y el 49%, 48% de identidad con la neuropsina y las proteínas KLK-L3, respectivamente. El análisis de hidrofobia puso de manifiesto que la zona amino-terminal es completamente hidrófoba (Figura 3), acorde con la posibilidad de que esta zona pueda albergar una secuencia fenol, análoga a otras serina proteasas. El análisis informático de la secuencia de la proteína de KLK15 previó una secuencia de escisión entre los aminoácidos 16 y 17 (TAA-QD). La alineación de la secuencia (Figura 2) puso de manifiesto también otra secuencia de escisión potencial (Lys^{21}), en un sitio homólogo a la secuencia de activación de otras serina proteasas [lisina (K) o arginina (R) está presente en la mayoría de los casos] (39). Varias zonas hidrófobas uniformemente distribuidas en todo el polipéptido KLK15 son corrientes con una proteína globular, similar a otras calicreínas y serina proteasas. Por lo tanto, como es el caso con otras calicreínas, KLK15 se traslada supuestamente como un precursor inactivo de las preproenzima de 256 aminoácidos. Prepro-KLK15 tiene 21 restos adicionales que constituyen la pre-zona (péptido señal formado por 16 restos) y el propéptido (5 restos).

La zona punteada en la Figura 2 indica un bucle de 11 aminoácidos característico de las calicreínas clásicas (PSA, KLK1 y KLK2) pero no se encuentra en KLK15 y otros miembros de la familia del multigén con calicreína (10, 11, 13, 14). Sin embargo, KLK15 tiene un único bucle de 8 aminoácidos (HNEPGTAG) (SEC. ID nº: 10) en las posiciones 148 a 155, no hallado en ninguna otra calicreína (Figura 2). Se han descrito veintinueve aminoácidos "invariantes" que rodean la secuencia activa de las serina proteasas (40). De éstos, veintiocho se conservan en KLK15. Uno de los aminoácidos no conservados (Ser^{173} en lugar de Pro) se encuentra también en la prostasa, proteínas KLK-L2 y KLK-L5, y representa un cambio evolutivo conservado en una proteína del mismo grupo, según los estudios de evolución de la proteína (41). Doce restos de cisteína se presentan en la supuesta proteína de KLK15 madura; diez de ellos se conservan en todas las calicreínas y sería de esperar que formen puentes disulfuro. Los otros dos (C131 y C243) no se encuentran en PSA, KLK1, KLK2 o KLKK-L4, sin embargo, se encuentran en posiciones similares en todos los demás genes de calicreína y es de esperar que formen un enlace disulfuro adicional.

Para predecir la relevancia filogenética de la proteína de KLK15 con otras serina proteasas, se alinearon las secuencias de aminoácidos conjuntamente utilizando el método del grupo de pares ponderados con la media aritmética (UPGMA) y los métodos Neighbor-Joining de la matriz de distancia, y el método de parsimonia "Protpars". Todos los árboles filogenéticos obtenidos coincidieron en que otras serinas proteasas (no calicreínas) pueden agruparse como un grupo independiente, indicando que las calicreínas representan una etapa independiente en la evolución de las serinas proteasas. KLK15 se agrupó con la KLK-L3 y TLSP (Figura 4) y las calicreínas clásica (hK1, hK2 y PSA) se agruparon en todos los árboles, lo que sugiere que la separación entre las calicreínas clásicas y los genes de tipo calicreína aparecieron al principio de la evolución, acorde con las sugerencias de los estudios anteriores (13).

Variantes de corte y empalme del gen KLK15

La identificación por PCR de los transcritos de KLK15 que utilizan cebadores específicos del gen (KLK15-F2 - SEC. ID nº: 49 y KLK15-R2 - SEC. ID nº: 50) (Tabla 1) puso de manifiesto la presencia de 3 bandas en la mayoría de los ADNc del tejido examinados (Figura 6). Estas bandas se purificaron en gel, se clonaron y se secuenciaron. La banda superior representa la forma clásica del gen y la banda inferior es la variante 3 de corte y empalme (Figura 7). La banda media representa otras dos variantes de corte y empalme. La digestión de la restricción del producto de la PCR de la banda media con Stu I, seguida de la separación en gel, purificación y secuenciado puso de manifiesto que está compuesta de las variantes 1 y 2 de corte y empalme que tienen aproximadamente la misma longitud (variante 1 de corte y empalme tiene el exón 4 (137 bp) pero está perdiendo 118 bp del exón 3, mientras que la variante de corte y empalme 2 tiene otros 118 bp del exón 3 pero está perdiendo el exón 4. Todas las variantes de corte y empalme es de esperar que codifiquen productos de proteína truncada (Figura 5).

Localización de cromosoma del gen KLK15

El estudio del análisis de restricción de numerosos clones BAC solapantes que abarcan el locus de calicreína humana seguido por comparación con la cartografía de restricción de EcoR1 del área (disponible en la secuencia de la red LLNL) permitió la identificación de un clon BAC (BC 25479) que es adyacente teloméricamente a BC 781134 (que alberga el gen KLK15). La explosión de las secuencias de los dos clones demostró que los extremos de estos clones son solapantes. Identificando la posición de los genes KLK1, KLK3 y KLK15 a lo largo de estos clones, la posición relativa y la dirección de la transcripción de estos tres genes se definió exactamente. KLK1 es el más centromérico y su dirección de transcripción es desde el telómero hasta el centrómero, seguido por KLK15, que es más telomérico y transcribe en la misma dirección. La distancia entre los dos genes es 1501 bp de longitud. El gen KLK3 es más telomérico, situado a una distancia de 23.335 del KLK15, y se transcribe en la dirección opuesta (Figura 6). Estos resultados son acordes con los informes previos donde la distancia entre KLK3 y KLK1 se estimó que era aproximadamente \sim 31 Kb (6,27).

Expresión del tejido y regulación hormonal del gen KLK15

Como se muestra en la Figura 7, el gen KLK15 se expresa a niveles mayores en la glándula tiroides. Los niveles menores de expresión se observan también en la próstata, glándulas salivales y suprarrenales, colon, testículos y riñón. A fin de verificar la especificidad de RT-PCR, se clonaron productos de PCR representativos y se secuenciaron. La Figura 8 demuestra que el gen KLK15 está regulado por incremento por hormonas estereoideas en la línea celular humana LNCaP del cáncer de próstata.

Expresión de KLK15 en el cáncer de próstata

La expresión del gen KLK15 en tejidos prostáticos normales y cancerosos se examinó por RT-PCR. Se incluyó actina como gen de referencia para asegurar la calidad y cantidad del ADNc utilizado. A fin de examinar la expresión relativa del gen KLK15 en tejidos normales comparados con malignos, se examinaron 29 pares de tejidos prostáticos. Cada par representaba el tejido normal y canceroso extraído del mismo paciente. Los resultados se resumen en la Tabla 2. Trece de cada 29 pacientes presentaban expresión de KLK15 significativamente mayor en el tejido canceroso y solamente tres presentaban la expresión de KLK15 mayor en los tejidos no cancerosos que en los cancerosos. El análisis mediante la prueba de McNemar indicaba que las diferencias entre los tejidos normales y cancerosos son estadísticamente significativas (P=0,021). Debido al pequeño número de casos, se utilizó la distribución binómico para informatizar el nivel de significación. Los pacientes de cáncer de próstata se clasificaron además en dos grupos: (a) positivos a la expresión de KLK15 (N=21) y (b) negativos a la expresión de KLK15 (o muy bajos) (N=8). Cuando la asociación de la expresión de KLK15 se comparaba con las variables del pronóstico clínicopatológico se halló la mayor expresión de KLK15 que era más frecuente en pacientes con enfermedad en la etapa terminal y tumores de mayor grado (Tabla 3).

Exposición

Las calicreínas son un subgrupo de serina proteasas. El término "calicreína" se utiliza normalmente para describir una enzima que actúa en una molécula precursora (cininógeno) para la liberación de un péptido bioactivo (cinina) (3, 42). Sin embargo, la expresión genérica "calicreína tisular" no se limita a la definición operativa de la enzima. Esta expresión se utiliza actualmente para describir un grupo de enzimas con estructura génica y proteica muy conservada que también se localiza conjuntamente en el mismo locus cromosómico. Entre los tres genes de la calicreína humana clásicos, solamente el KLK1 codifica una proteína con potente actividad de cininogenasa. Las enzimas codificadas por los genes KLK2 y KLK3 presentan actividad de cininogenasa muy débil. Los 14 miembros ya clonados de la familia del gen humano de la calicreína tienen numerosas similitudes (7, 11) como se muestra a
continuación:

\bullet

Todos los genes localizan la misma zona cromosómica (19q13.3-q13.4)

\bullet

Todos los genes codifican supuestas serina proteasas con una triada catalítica conservada en las posiciones apropiadas, es decir, histidina cerca del extremo del segundo exón de codificación, ácido aspártico en el medio del tercer exón y serina al comienzo del quinto (último exón).

\bullet

Todos los genes tienen cinco exones de codificación (algunos miembros contienen uno o más de 5 exones no traducidos).

\bullet

Los tamaños del exón de codificación son similares o idénticos.

\bullet

Las fases del intrón están completamente conservadas.

\bullet

Todos los genes tienen homologías de secuencia significativas en los niveles del ADN y de aminoácidos (30 al 80%).

\bullet

Muchos de estos genes están regulados por hormonas estereoideas.

Las Figuras 2 y 8 demuestran que los genes KLK15 recién identificados comparten todas las similitudes anteriores y es por lo tanto un nuevo miembro de la familia del multigén humano de calicreína. Este gen se denominó
KLK15.

Muchos genes de calicreína están relacionados con la patogénesis de las enfermedades humanas, dependiendo en el tejido de su expresión primaria. El gen KLK1 está involucrado en muchos procesos patológicos, incluyendo la inflamación (3), hipertensión (44), nefritis renal y renopatía diabética (45, 46). Las conexiones de HSCCE (KLK7) con las enfermedades cutáneas, incluyendo la queratinización patológica y la psoriasis, se han descrito ya (47, 48). Little et al. sugirieron que la zima (KLK6) puede ser amiloidogénica y puede desempeñar una función en desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (14). Existen otros informes que describen la relación de la expresión de la neuropsina (KLK8) con las enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo la epilepsia (49, 50). Al expresarse principalmente en el tiroides, KLK15 puede desempeñar una función importante en la fisiología y patofisiología normales de esta glándula. Entre todas las demás calicreínas descubiertas, muchas se expresan en el tiroides pero ninguna a los niveles más elevados en este tejido (7, 11).

El gen KLK15 está regulado por incremento, en el nivel del ARNm, en un subconjunto de cánceres de próstata. Las distribuciones del estado de la expresión cualitativa de KLK15 (alto o bajo) entre subgrupos de pacientes que se diferencian en la etapa de la enfermedad, grado del tumor y puntuación de Gleason indicaron que la expresión elevada de KLK15 se encontraba más frecuentemente en los tumores de grado 3 así como en la etapa III y puntuación de Gleason >6 pacientes. Estos descubrimientos indican que la sobreexpresión de KLK15 está relacionada con las formas más agresivas de la enfermedad y puede ser un indicador de pronóstico escaso (Tabla 3).

Existen actualmente pruebas crecientes de que muchas calicreínas y genes de tipo calicreína están relacionados con el cáncer. PSA es el mejor marcador para el cáncer de próstata hasta ahora (20). Los informes recientes sugieren que hK2 (codificado por el gen KLK2) puede ser otro marcador de diagnóstico útil para el cáncer de próstata (21, 51). NES1 (KLK10) parece ser un nuevo gen supresor tumoral (23). El gen de la zima (KLK6) se demostró que se expresaba de forma diferenciada en los tumores de mama y de ovario primarios (24) y la enzima quimocríptica de la capa córnea humana (HSCCE, KLK7) se ha demostrado que se expresa a niveles anormalmente elevados en el cáncer de ovario (25). Otro gen de tipo calicreína identificado recientemente, denominado provisionalmente el gen 14 expresado de forma diferenciada asociado al tumor (TADG-14)/neuropsina (KLK8) se descubrió que se sobreexpresaba aproximadamente en el 60% de los tejidos de cáncer de ovario (26). Pprostasa/KLK-L1/ (KLK4), otro gen de tipo calicreína descubierto recientemente, se especula que está relacionado con el cáncer de próstata (13). Dos calicreínas recién descubiertas, KLK-L4 (KLK13) y KLK-L5 (KLK12), se ha descubierto también que están reguladas por disminución en el cáncer de mama (10). Por lo tanto, la nueva extensa bibliografía sugiere múltiples relaciones de varios genes de calicreína con muchas formas de cáncer humano.

La existencia de múltiples formas de ARNm cortadas y empalmadas alternativamente es frecuente entre las calicreínas. Distintas especies de ARN se transcriben en el gen PSA, además del transcrito principal de 1,6 kb (19, 52, 53). Asimismo, Reigman et al. describieron la identificación de dos formas cortadas y empalmadas alternativamente del gen de calicreína 2 (KLK2) glandular humana (54). Un nuevo transcrito del gen de la calicreína tisular (KLK1) se aisló también del colon (55). La neuropsina, un gen de tipo calicreína identificado recientemente, se descubrió que presenta dos formas cortadas y empalmadas alternativamente, además de la forma principal (26, 56). Se descubrió también que KLK-L4 presenta diferentes formas cortadas y empalmadas alternativamente (10). Debido a que las variantes de corte y empalme de KLK15 tienen una secuencia 5' idéntica requerida para la traducción, secreción y activación, es posible suponer que codifican una proteína segregada (53).

En conclusión, un nuevo elemento de la familia de genes de la calicreína humana, KLK15, se ha caracterizado porque cartografía el locus de calicreína humana (cromosoma 19q13.3-q13.4). Este gen presenta tres formas de corte y empalme relacionadas además de la forma clásica. KLK15 se expresa en una variedad de tejidos pero principalmente en el tiroides, parece estar regulada por incremento en las formas más agresivas del cáncer de próstata y su expresión está influenciada por las hormonas esteroides. Dado que unas pocas calicreínas se utilizan ya como marcadores tumorales valiosos, KLK15 puede también encontrar aplicaciones clínicas similares.

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TABLA 1 Cebadores utilizados para la ampliación por PCR genómica

1

*Todos los cebadores se presentan en la dirección 5' \rightarrow 3'.

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TABLA 2 Expresión de KLK15 en 29 pares de tejidos prostáticos cancerosos y no cancerosos

Expresión de KLK15	Número de pacientes	Valor P*
Más alta en el cáncer frente a normal	13
Más baja en el cáncer frente a normal	3
Expresión alta pero aprox. igual en ambos tejidos	8
Expresión baja (o no) pero aprox. igual en ambos tejidos
	5	0,021
*El valor P se calculó por la prueba de McNemar utilizando la distribución binómica.

TABLA 3 Relación entre la expresión de KLK15 y otras variables clínicopatológicas en 29 pacientes con cáncer de próstata primario

		Número de pacientes (%)
Variable	Pacientes	Negativos a KLK15	Positivos a KLK15	Valor P*
Etapa
\hskip0,1cm I/II	20	8 (40)	12 (60)
\hskip0,1cm III	9	0 (0)	9 (100)	0,033
Grado
\hskip0,1cm G1/2	23	8 (34,8)	15 (65,2)
\hskip0,1cm G3	6	0 (0)	6 (100)	0,15
Puntuación de Gleason
\hskip0,1cm\leq6	22	7 (31,8)	15 (62,2)
\hskip0,1cm >6	6	0 (0)	6 (100)	0,14
\hskip0,1cm desconocida	1
*Prueba exacta de Fisher.

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Citas completas de las referencias citadas en memoria

1. Kraut, H., K., F. E., y Werle, E. (1930) Physiol. Chem. 189,97-106

2. Werle, E. (1934) Biochem. Z 269, 415-434

3. Clements, J. (1997) in The Kinin System (Farmer, S., ed), pp. 71-97, Academic Press, New York

4. Evans, B. A., Drinkwater, C. C., y Richards, R. 1. (1987) J. BioL Chem. 262, 8027-34

5. Ashley, P. L., y MacDonald, R. J. (1985) Biochemistry 24, 4520-7

6. Riegman, P. H., Vlietstra, R. J., Suurmeijer, L., Cleutjens, C. B., y Trapman, J. (1992) Genomics 14,6-11

7. Diamandis, E. P., Yousef, G. M., Luo, L. Y., Magklara, A., y Obiezu, C. V. (2000) Trends Endocrinol. Metab. 11, 54-60

8. Yousef, G. M., Obiezu, C. V., Luo, L. Y., Black, M. H., y Diamandis, E. P. (1999) Cancer Res. 59, 4252-6

9. Yousef, G. M., y Diamandis, E. P. (1999) J. Biol. Chem. 274, 37511-6

10. Yousef, G. M., Chang, A., y Diamandis, E. P. (2000) J Biol Chem 275, 11891-8.

11. Yousef, G. M., y Diamandis, E. P. (2000) Genomics 65, 184-194

12. Yousef, G. M., Luo, L. Y., y Diamandis, E.P. (1999) Anticancer Res. 19, 2843-52

13. Nelson, P. S., Gan, L., Ferguson, C., Moss, P., Gelinas, R., Hood, L., y Wang, K. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96,3114-9

14. Little, S. P., Dixon, E. P., Norris, F., Buckley, W., Becker, G. W., Johnson, M., Dobbins, J. R., Wyrick, T., Miller, J. R., MacKellar, W., Hepburn, D., Corvalan, J., McClure, D., Liu, X., Stephenson, D., Clemens, J., y Johnstone, E. M. (1997) J. Biol. Chem. 272, 25135-42

15. Liu, X. L., Wazer, D. E., Watanabe, K., y Band, V. (1996) Cancer Res. 56, 3371-9

16. Hansson, L., Stromqvist, M., Backman, A., Wallbrandt, P., Carlstein, A., y Egelrud, T. (1994) J. Biol. Chem. 269, 19420-6

17. Yoshida, S., Taniguchi, M., Hirata, A., y Shiosaka, S. (1998) Gene 213(1-2), 9-16

18. Stephenson, S. A., Verity, K., Ashworth, L. K., y Clements, J. A. (1999) J. Biol. Chem. 274,23210-4

19. Riegman, P. H., Vlietstra, R. J., van der Korput, J. A., Romijn, J. C., y Trapman, J. (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 159, 95-102

20. Diamandis, E. P. (1998) Trends Endocrinol. Metab. 9, 310-316

21. Stenman, U. H. (1999) Clin. Chem. 45, 753-4.

22. Partin, A. W., Catalona, W. J., Finlay, J. A., Darte, C., Tindall, D. J., Young, C. Y., Klee, G. G., Chan, D. W., Rittenhouse, H. G., Wolfert, R. L., y Woodrum, D. L. (1999) Urology 54, 839-45

23. Goyal, J., Smith, K. M., Cowan, J. M., Wazer, D. E., Lee, S. W., y Band, V. (1998) Cancer Res. 58, 4782-6

24. Anisowicz, A., Sotiropoulou, G., Stenman, G., Mok, S. C., y Sager, R. (1996) Mol. Med. 2, 624-36

25. Tanimoto, H., Underwood, L. J., Shigemasa, K., Yan Yan, M. S., Clarke, J., Parmley, T. H., y O'Brien, T. J. (1999) Cancer 86, 2074-82

26. Underwood, L. J., Tanimoto, H., Wang, Y., Shigemasa, K., Parmley, T. H., y O'Brien, T. J. (1999) Cancer Res. 59(17), 4435-9

27. Yousef, G. M., Chang, A., y Diamandis, E. P. (2000) submitted

28. Altschul, S. F., Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., y Lipman, D. J. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17), 3389-402

29. Lennon, G., Auffray, C., Polymeropoulos, M., y Soares, M. B. (1996) Genomics 33, 151-2

30. Sambrook, J., Fritsch. E. F., y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition Ed.. Cold Sping Harbor Laboratory, NY

31. Meyer, A., Jung. K., Lein, M., Rudolph, B., Schnorr, D., y Loening, S. A. (1997) Int. J. Cancer 74, 630-6

32. Luo, L., Herbrick. J. A. Scherer. S. W., Beatty, B., Squire, J., y Diamandis, E. P. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 247(3), 580-6

33. Yousef, G. M., Luo. L Y., Scherer, S. W., Sotiropoulou, G., y Diamandis, E. P. (1999) Genomics 62(2),
251-9

34. Iida, Y. (1990) J. Theor. Biol. 145(4), 523-33

35. Kozak, M. (1991) J. Cell Biol. 115(4), 887-903

36. Kozak, M. (1987) Nucleic Acids Res. 15(20), 8125-48

37. Proudfoot, N. J., y Brownlee, G. G. (1976) Nature 263, 211-4

38. Sheets, M. D., Ogg, S. C., y Wickens, M. P. (1990) Nucleic Acids Res. 18(19), 5799-805

39. Keil, B. (1971) in The enzymes (P.D. Boyer, E., ed) Vol. 3, 3rd Ed., pp. 249-275, Academic Press, New York

40. Dayhoff, M. O. (1978) Natl. Biomed. Res. Found. 5, 79-81

41. Miyata, T., Miyazawa, S., y Yasunaga, T. (1979) J. Mol. Evol. 12(3), 219-36

42. Bhoola, K. D., Figueroa, C. D., y Worthy, K. (1992) Pharmacol. Rev. 44(1), 1-80

43. Diamandis, E. P., Yousef, G., Clements, J. et al., (2000) Clin. Chem. In press

44. Margolius, H. S., Horwitz, D., Pisano, J. J., y Keiser, H. R. (1974) Circ. Res. 35(6), 820-5

45. Jaffa, A. A., Chai, K. X., Chao, J., Chao, L., y Mayfield, R. K. (1992) Kidney Int. 41(4), 789-95

46. Cumming, A. D., Walsh, T., Wojtacha, D., Fleming, S., Thomson, D., y Jenkins, D. A. (1994) Clin. Sci. 87(1), 5-11

47. Sondell, B., Dyberg, P., Anneroth, G. K., Ostman, P. O., y Egelrud, T. (1996) Acta. Derm. Venereol. 76(3), 177-81

48. Ekholm, E., y Egelrud, T. (1999) Arch. Dermatol. Res. 291(4), 195-200

49. Momota, Y., Yoshida, S., Ito, J., Shibata, M., Kato, K., Sakurai, K., Matsumoto, K., y Shiosaka, S. (1998) Eur. J. Neurosci. 10(2), 760-4

50. Kishi, T., Kato, M., Shimizu, T., Kato, K., Matsumoto, K., Yoshida, S., Shiosaka, S., y Hakoshima, T. (1999) J. Biol. Chem. 274, 4220-4

51. Black, M. H., Magldara, A., Obiezu, C. V., Melegos, D. N., y Diamandis, E. P. (1999) Clin. Chem. 45(6 Pt 1), 790-9

52. Riegman, P. H., Klaassen, P., van der Korput, J. A., Romijn, J. C., y Trapman, J. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155(1), 181-8

53. Heuze, N., Olayat, S., Gutman, N., Zani, M. L., y Courty, Y. (1999) Cancer Res. 59, 2820-4

54. Riegman, P. H., Vlietstra, R. J., van der Korput, H. A., Romijn, J. C., y Trapman, J. (1991) Mol. Cell Endocrinol. 76(1-3), 181-90

55. Chen, L. M., Murray, S. R., Chai, K. X., Chao, L., y Chao, J. (1994) Braz. J. Med. Biol. Res. 27(8), 1829-38

56. Mitsui, S., Tsuruoka, N., Yamashiro, K., Nakazato, H., y Yamaguchi, N. (1999) Eur. J. Biochem. 260(3), 627-34.

SEC. ID nº: 1

Estructura genómica completa de KLK15

2

3

4

\newpage

SEC. ID nº: 2

ARNm clásico (1581..1623, 5259..5412, 5913..6196, 6317, 6453)

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 3

\begin{minipage}[t]{155mm}Estructura de la VARIANTE 1 DE CORTE Y EMPALME DE ARNm de KLK 15 (1581..1623, 5259..5412, 5913..6078, 6317..6453)\end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 4

\begin{minipage}[t]{155mm}Estructura 2 de CORTE Y EMPALME del ARNm de KLK 15 (1581..1623, 5259..5412, 5913..6196, 7127.. 7786)\end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

7

\newpage

SEC. ID nº: 5

\begin{minipage}[t]{155mm}Estructura 3 de CORTE Y EMPALME del ARNm de KLK 15 (1581..1623, 5259..5412, 5913..6078, 7127.. 7786)\end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 6

Proteína de KLK15

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 7

Variante 1 de corte y empalme de KLK15

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 8

Variante 2 de corte y empalme de KLK15

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 9

Variante 3 de corte y empalme de KLK15

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

HNEPGTAG

\hfill

\newpage

SEC. ID nº: 11

5' no traducida

13

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 12

Exón 1

1581-1623

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTGGCTTCTCCTCACTCTCTCCTTCCTGCTGGCATCCACAG

\hfill

\newpage

SEC. ID nº: 13

Intrón 1

14

SEC. ID nº: 14

Exón 2

15

SEC. ID nº: 15

Intrón 2

16

\newpage

SEC. ID nº: 16

Exón 3 (variante 2 clásica y de corte y empalme)

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 17

Intrón 3 - Variante 2 clásica y de corte y empalme

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 18

Exón 3 - (variante de corte y empalme 1 y 3)

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 19

Intrón 3 - (variante de corte y empalme 1 y 3)

20

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 20

Exón 4

6317-6453 (variante 1 clásica y de corte y empalme)

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 21

Intrón 4 (variante 1 clásica y de corte y empalme)

\vskip1.000000\baselineskip

22

\newpage

SEC. ID nº: 22

Intrón 4 (variantes 2 y 3 de corte y empalme)

23

SEC. ID nº: 23

Exón 5

24

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID nº: 24

25

SEC. ID nº: 25

Zyma

\vskip1.000000\baselineskip

26

SEC. ID nº: 26

27

SEC. ID nº: 27

28

\newpage

SEC. ID nº: 28

29

SEC. ID nº: 29

30

SEC. ID nº: 30

31

SEC. ID nº: 31

32

SEC. ID nº: 32

Neuropsina

33

SEC. ID nº: 33

34

SEC. ID nº: 34

35

SEC. ID nº: 35

36

\newpage

SEC. ID nº: 36

37

SEC. ID nº: 37

Prostasa

38

SEC. ID nº: 38

39

SEC ID nº: 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACAACGAGCCTGGGACCGCTGGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº: 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTAAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº: 41

Tabla 1 KLK1-A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCCCTCCATTCCCATCTTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº: 42

Tabla 1 KLK1-B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACATACAATTCTCTGGTTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº: 43

Tabla 1 KLK2-A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTGACACTGTCTCAGAATT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº: 44

Tabla 1 KLK2-B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCAATCTCACGAGTGCAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº: 45

Tabla 1 E5-A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGGCTCTGGAGACATTTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº: 46

Tabla 1 E5-B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACTGGGGAGGCTTGAGTC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº: 47

Tabla 1 KLK15-F1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCTTCCTGCTGOCATCCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº: 48

Tabla 1 KLK15-R1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCACACGGGTGGTCATGTG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº: 49

Tabla 1 KLK15-F2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAGTGGCTCTCTACGAGCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID nº: 50

Tabla 1 KLK15-R2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACACCAGGCTTGGTGGTGT

\hfill

<110> Mount Sinai Hospital

\hskip1cm Yousef, George, M.

\hskip1cm Diamandis, Eleftherios, P.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Nuevo gen de la calicreína

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 3153-256

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/CA01/01141

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-08-10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/224,853

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-08-11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Patente en version 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8735

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

40

41

42

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1278

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 987

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos péptidos/aminoácido procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asn Glu Pro Gly Thr Ala Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1580

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtggcttc tcctcactct ctccttcctg ctggcatcca cag

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3635

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 500

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 673

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1046

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 660

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

69

70

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

71

72

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

73

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

75

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

77

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

79

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

81

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

85

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

87

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

89

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

91

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

95

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacaacgagc ctgggaccgc tggg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attaaa

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atccctccat tcccatcttt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacatacaat tctctggttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtgacactg tctcagaatt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccccaatctc acgagtgcac

\hfill

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcggctctg gagacatttc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactggggag gcttgagtc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccttcctg ctggcatcca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcacacggg tggtcatgtg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagtggctc tctacgagcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmentos/péptidos procedentes de secuencia humana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacaccaggc ttggtggtgt

\hfill

20

Claims (24)

1. Proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. nº: 6, 7, 8 ó 9.

2. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína según la reivindicación 1, o una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a ésta, o una molécula de ácido nucleico que presenta por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad con ésta.

3. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 2, que presenta una secuencia de ácidos nucleicos de la SEC. ID nº: 1, 2, 3, 4 ó 5 en la que T puede ser además U, o una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a ésta, o una molécula de ácido nucleico que presenta por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad con
ésta.

4. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 ó 3.

5. Célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 ó 3.

6. Método para la preparación de una proteína según la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes:

(a)

transferir un vector de expresión según la reivindicación 4 a una célula huésped;

(b)

seleccionar las células huésped transformadas de entre las células huésped no transformadas;

(c)

cultivar una célula huésped transformada seleccionada en condiciones que permitan la expresión de la proteína; y

(d)

aislar la proteína.

7. Anticuerpo que presenta especificidad contra un epítopo de una proteína según la reivindicación 1.

8. Anticuerpo según la reivindicación 7, marcado con una sustancia detectable y utilizado para detectar el polipéptido en muestras biológicas, tejidos y células.

9. Sonda que comprende una secuencia que codifica una proteína según la reivindicación 1.

10. Kit de ensayo para el diagnóstico de una enfermedad asociado a una proteína según la reivindicación 1, mediante la determinación de la presencia de una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores o una proteína según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

11. Kit de ensayo según la reivindicación 10, en el que la enfermedad es el cáncer.

12. Kit de ensayo según la reivindicación 11, en el que el cáncer es el cáncer de próstata.

13. Método para identificar una sustancia que se asocia con una proteína según la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes:

(a)

hacer reaccionar la proteína con al menos una sustancia que puede asociarse potencialmente con la proteína, en condiciones que permiten la asociación entre la sustancia y la proteína, y

(b)

eliminar o detectar la proteína asociada con la sustancia, en el que la detección de la proteína y la sustancia asociadas indica que la sustancia se asocia con la proteína.

14. Método para evaluar un compuesto por su capacidad para modular la actividad biológica de una proteína según la reivindicación 1, que comprende proporcionar la proteína con una sustancia que se asocia con la proteína y un compuesto de ensayo en condiciones que permitan la formación de complejos entre la sustancia y la proteína, y eliminar y/o detectar los complejos.

15. Método para identificar los inhibidores de la interacción de una proteína según la reivindicación 1 y una sustancia que interactúa con la proteína que comprende las etapas siguientes:

(a)

proporcionar una mezcla de reacción que comprende la proteína y una sustancia que se une a la proteína, o por lo menos una parte de cada una que interactúa;

(b)

poner en contacto la mezcla de reacción con uno o más compuestos de ensayo;

(c)

identificar los compuestos que inhiben la interacción de la proteína y la sustancia.

16. Método para la detección de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína según la reivindicación 1 en una muestra biológica que comprende las etapas siguientes:

(a)

hibridar una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 ó 3 con ácidos nucleicos de la muestra biológica, formando de esta manera un complejo de hibridación; y

(b)

detectar el complejo de hibridación en el que la presencia del complejo de hibridación está correlacionada con la presencia de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína en la muestra biológica.

17. Método según la reivindicación 16, en el que los ácidos nucleicos de la muestra biológica se amplían mediante la reacción en cadena de la polimerasa antes de la etapa de hibridación.

18. Método in vivo para controlar la evolución del cáncer de próstata en un individuo, que comprende las etapas siguientes:

(a)

poner en contacto una cantidad de un anticuerpo que se une a una proteína, según la reivindicación 1, con una muestra del individuo de manera que formen un complejo binario que comprende el anticuerpo y la proteína en la muestra;

(b)

determinar o detectar la presencia o cantidad de formación de complejo en la muestra;

(c)

repetir las etapas (a) y (b) en un punto posterior en el tiempo; y

(d)

comparar el resultado de la etapa (b) con el resultado de la etapa (c), en el que una diferencia en la cantidad de formación de complejo es indicativa de la evolución del cáncer en dicho individuo.

19. Utilización de una proteína según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer de próstata.

20. Composición farmacéutica que comprende una o más moléculas de ácido nucleico o proteínas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

21. Utilización de una o más moléculas de ácido nucleico o proteínas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del cáncer de próstata.

22. Método para realizar el descubrimiento del fármaco que comprende:

(a)

proporcionar los agentes identificados por su capacidad para inhibir o potenciar la interacción de una proteína según la reivindicación 1 y una sustancia que se une a la proteína;

(b)

realizar el perfil terapéutico de los agentes identificados en la etapa (a) o análogos adicionales de los mismos, para la eficacia y la toxicidad en animales; y

(c)

determinar una formulación para una preparación farmacéutica que comprende uno o más agentes identificados en la etapa (b) que presentan un perfil terapéutico aceptable.

23. Vacuna para estimular o potenciar en un sujeto para el que la vacuna es la producción de anticuerpos administrada dirigida contra una proteína tal como en la reivindicación 1.

24. Utilización de una proteína según la reivindicación 1, para la preparación de una vacuna destinada a estimular o potenciar en un sujeto la producción de anticuerpos dirigida contra la proteína.