ES2266298T3

ES2266298T3 - Coniosetina y sus derivados, procedimiento de preparacion y su uso.

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Publication number: ES2266298T3
Application number: ES01989546T
Authority: ES
Inventors: Laszlo Vertesy; Martin Knauf; Astrid Markus; Luigi Toti; Mark-Cecile Raynal-Wetzel; Florence Fassy
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2001-11-30
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2021-11-30
Also published as: JP4057910B2; AR033685A1; DE10060810A1; JP2004515490A; WO2002046152A2; PT1341758E; CA2430827C; CY1105292T1; ATE331706T1; CA2430827A1; US20020137788A1; WO2002046152A3; EP1341758A2; AU2002227966B2; DK1341758T3; IL156162A; EP1341758B1; US6599930B2; DE50110363D1; MXPA03004849A

Abstract

Compuesto de la Fórmula general I (Ver fórmula) realizándose que R significa: 1. H, o 2. alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6 o alquinilo C2-C6, en que los alquilo, alquenilo y alquinilo son lineales o ramificados, y eventualmente están sustituidos una vez o dos veces con: 2.1 -OH, 2.2 =O, 2.3 -O-alquilo C1-C6, en que el alquilo es lineal o ramificado, 2.4 -O-alquenilo C2-C6, en que el alquenilo es lineal o ramificado, 2.5 -arilo, 2.6 -NH-alquilo C1-C6, en que el alquilo es lineal o ramificado, 2.7 -NH-alquenilo C2-C6, en que el alquenilo es lineal o ramificado, 2.8 -NH2, o 2.9 halógeno, en que los sustituyentes 2.1 hasta 2.9 pueden estar adicionalmente sustituidos con funciones de -CN, amida u oxima. X, X3 y X4, independientemente unos de otros, significan O, NH, N-alquilo C1-C6, N-alquenilo C2-C6, N-alquinilo C2-C6, N-acilo, N-arilo, N-O-R ó S, y/o una forma estereoisómera del compuesto de la Fórmula I y/o mezclas de esta forma en cualquier relación, y/o una sal fisiológicamente compatible delcompuesto de la Fórmula I.

Description

Coniosetina y sus derivados, procedimiento de preparación y su uso.

El presente invento se refiere a una nueva sustancia activa (coniosetina) del tipo de un ácido tetrámico, que es formada durante la fermentación por el microorganismo Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856), a derivados químicos que se derivan de la coniosetina, a un procedimiento para su preparación y a la utilización de los nuevos ácidos tetrámicos como medicamentos.

Ya se han descrito un gran número de antibióticos con una estructura fundamental de ácidos tetrámicos. El ácido tetrámico, es decir la 2,4-pirrolidina-diona es el compuesto original de diferentes sustancias naturales, que son formadas por algunos microorganismos y por invertebrados marinos. En 1994 se describió

\bullet: el ácido harziánico (R. Sawa y colaboradores J. Antibiotics, 47, 731-732, 1994), que es un antibiótico muy poco eficaz.

En un artículo compendiador de B.J.L. Royles se describen los derivados naturales de ácidos tetrámicos que se habían divulgado hasta 1994 (Chem. Rev. 95, páginas 1981-2001, 1995). Desde 1995 se describieron otros ácidos tetrámicos naturales, pero solamente unos pocos de ellos con propiedades antibacterianas:

\bullet: Reutericiclina (A. Höltzel y colaboradores, Angew. Chem. 112, 2886-2888, 2000), que es un compuesto débilmente activo como antibacteriano;

\bullet: Rubrósidos A-H, (N. Sata y colaboradores, J. Org. Chem. 64, 2331-2339, 1999)

\bullet: Aflastatina (M. Ono y colaboradores, J. Antibiotics, 51, 1019-1028, 1998)

\bullet: F-10778, (A. Tanaka y colaboradores, Annu. Rep. Sankyo Res. Lab. 49, 135-141, 1997)

\bullet: Ancorinósido A, (S. Ohta y colaboradores, J. Org. Chem. 62, 6452-6453, 1997)

\bullet: Acido fisarorrubínico, (A. Nowak y colaboradores, Liebigs Ann./Recl. 1997, 1817-1821)

\bullet: Ascosalipirrolidinona A, (C. Osterhage y colaboradores, J. Org. Chem. 65, 6412-6417, 2000)

\bullet: Talaroconvolutina, (S. Suzuki y colaboradores, J. Nat. Prod. 63, 768-772, 2000)

\bullet: Xantobaccina A, (Y. Hashidoko y colaboradores, Tetrahedron Lett. 40, 2957-2960 1999)

\bullet: Equisetina y fomasetina (S. S. Singh y colaboradores, Tetrahedron Lett. 39, 2243-2246, 1998), que son agentes inhibidores isómeros de la integrasa de HIV-1;

\bullet: Criptocina (J.Y. Li y colaboradores, Org. Lett. 2, 767-770, 2000), que es un compuesto antimicótico;

\bullet: Vancorresmicina (N.V.S. Ramakrishna y colaboradores, publicación de patente internacional Nº WO 0028064), que es un antibiótico.

Para el tratamiento de enfermedades infecciosas bacterianas se emplean terapéuticamente un gran número de antibióticos. Sin embargo, los agentes patógenos de enfermedades se están haciendo crecientemente resistentes contra los medicamentos utilizados, y amenaza incluso un gran peligro debido a los denominados gérmenes multirresistentes, que no solamente se han hecho capaces de resistir contra conjuntos individuales de antibióticos, tales como p.ej. antibióticos del tipo de \beta-lactamas, glicopéptidos o macrólidos, sino que al mismo tiempo son portadores de varias resistencias. Existen incluso agentes patógenos de enfermedades, que se han hecho resistentes contra todos los antibióticos obtenibles en el comercio. Las enfermedades infecciosas, que son provocadas por tales gérmenes, ya no pueden ser tratadas terapéuticamente. Por lo tanto, existe una gran necesidad de nuevos agentes, que se puedan emplear contra gérmenes resistentes. Ciertamente, se han descrito en la bibliografía muchos millares de antibióticos, que en su mayor parte son sin embargo demasiado tóxicos, para poder ser empleados como medicamen-
tos.

Se ha encontrado de manera sorprendente que la cepa Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) es capaz de formar por lo menos un nuevo antibiótico, p.ej. la coniosetina, que no solamente es muy eficaz como agente antibacteriano sino que también es perfectamente compatible.

Son objeto del invento, por consiguiente, las sustancias activas formadas por la cepa Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856), así como sus sales fisiológicamente compatibles.

\newpage

Son objeto del presente invento, de modo correspondiente, compuestos de la Fórmula I

1

en la que

R: significa:

\quad: 1. H, o

\quad: 2. alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6} o alquinilo C_{2}-C_{6}, en que los alquilo, alquenilo y alquinilo son lineales o ramificados, y eventualmente están sustituidos una vez o dos veces con:

\quad: 2.1 -OH,

\quad: 2.2 =O,

\quad: 2.3 -O-alquilo C_{1}-C_{6}, en que el alquilo es lineal o ramificado,

\quad: 2.4 -O-alquenilo C_{2}-C_{6}, en que el alquenilo es lineal o ramificado,

\quad: 2.5 -arilo,

\quad: 2.6 -NH-alquilo C_{1}-C_{6}, en que el alquilo es lineal o ramificado,

\quad: 2.7 -NH-alquenilo C_{2}-C_{6}, en que el alquenilo es lineal o ramificado,

\quad: 2.8 -NH_{2}, o

\quad: 2.9 halógeno,

\quad: en que los sustituyentes 2.1 hasta 2.9 pueden estar adicionalmente sustituidos con funciones de -CN, amida u oxima.

X, X_{3} y X_{4}, independientemente unos de otros, significan O, NH, N-alquilo C_{1}-C_{6}, N-alquenilo C_{2}-C_{6}, N-alquinilo C_{2}-C_{6}, N-acilo, N-arilo, N-O-R ó S.

Son objeto del invento, además, formas estereoisómeras del compuesto de la Fórmula I y/o mezclas de estas formas en cualquier relación, y/o sales fisiológicamente compatibles del compuesto de la Fórmula I.

En la Fórmula I

un alquilo C_{1}-C_{6} significa un alquilo lineal o ramificado con 1 a 6 átomos de C, de manera preferida con 1 a 4 átomos de C, tal como p.ej. metilo, etilo, i-propilo, terc.-butilo y hexilo,

un alquenilo C_{2}-C_{6} significa un alquenilo lineal o ramificado con 2 a 6 átomos de C, que está insaturado una vez, dos veces o tres veces, tal como p.ej. alilo, crotilo, 1-propenilo, penta-1,3-dienilo y pentenilo, y

un alquinilo C_{2}-C_{6} significa un alquinilo lineal o ramificado con 2 a 6 átomos de C, que está insaturado una vez o dos veces, tal como p.ej. propinilo, butinilo y pentinilo.

Un arilo puede representar p.ej. fenilo, bencilo o 1- ó 2-naftilo, que también puede estar todavía sustituido, por ejemplo con halógeno, tal como cloro, bromo, fluoro, con alquilo con 1-4 átomos de C, preferiblemente metilo, con hidroxi, con alcoxi con 1-4 átomos de C, en particular metoxi, y/o con trifluorometilo.

Un acilo puede representar radicales acilo alifáticos o aromáticos. Un acilo alifático tiene 1-7, preferiblemente 1-4 átomos de C, tal como p.ej. formilo, acetilo, propionilo, butirilo, hexanoílo, acriloílo, crotonoílo, propioloílo, que puede estar sustituido todavía adicionalmente, por ejemplo con halógeno, tal como cloro, bromo, fluoro, con amino y/o con alquilamino con 1-4 átomos de C, preferiblemente con grupos metil- o etil-amino. Un acilo aromático puede ser p.ej. benzoílo o naftoílo, que adicionalmente puede estar sustituido, por ejemplo con halógeno, tal como cloro, bromo, fluoro, con alquilo con 1-4 átomos de C, preferiblemente metilo, con grupos hidroxi, con grupos amino, tal como p.ej. grupos etilamino o con grupos alcoxi con 1-7, preferiblemente 1-4 átomos de C, en particular metoxi.

El invento se refiere además a un compuesto de la Fórmula II

2

(Coniosetina: Fórmula empírica: C_{25}H_{35}NO_{4}; PM 413,56), así como sus sales fisiológicamente compatibles.

Los centros de quiralidad en los compuestos de la Fórmula I ó II pueden presentarse, cuando no se indique otra cosa distinta, en la configuración R o en la S. El invento se refiere tanto a los compuestos ópticamente puros como también a las mezclas de estereoisómeros, tales como mezclas de enantiómeros y mezclas de diastereoisómeros, en cualquier relación.

Además, el invento se refiere a un compuesto de la fórmula empírica: C_{25}H_{35}NO_{4} (coniosetina) obtenible por fermentación de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856), hasta que el compuesto coniosetina se acumule en el caldo de cultivo, y por subsiguiente aislamiento del compuesto, así como a sus sales farmacológicamente compatibles.

El invento se refiere por añadidura a derivados químicos, que se derivan de un compuesto de la fórmula empírica: C_{25}H_{35}NO_{4} (coniosetina) obtenible por fermentación de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856), hasta que el compuesto coniosetina se acumule en el caldo de cultivo, por aislamiento del compuesto y por subsiguiente transformación en derivados químicos, así como a sus sales farmacológicamente compatibles.

Por las fórmulas estructurales indicadas, el antibiótico coniosetina se diferencia de sustancias conocidas en la bibliografía. Se han descrito ciertamente derivados de ácidos tetrámicos afines estructuralmente (véase arriba una selección de citas bibliográficas), todos éstos se diferencian, no obstante, de los compuestos conformes al invento o bien por la polaridad, por la estructura química, por la actividad antibacteriana o por otras propiedades físicas.

Además, el invento se refiere a un procedimiento para la preparación del compuesto de la Fórmula I, caracterizado porque el microorganismo Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) se cultiva en un medio nutritivo acuoso, un compuesto de la Fórmula I se aísla y purifica, y eventualmente se transforma en sus sales farmacológicamente compatibles.

La cepa Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) forma, en soluciones nutritivas que contienen glucosa, almidón, copos de avena o glicerol, la coniosetina, así como productos secundarios.

Un material aislado de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa se depositó el 17.11.2000 bajo el número DSM 13856 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares) (DSM), Mascheroder Weg 1 B, 38124 Braunschweig, Alemania, de acuerdo con las reglas del convenio de Budapest.

El hongo Coniochaeta posee un micelio de substrato de color blanco y muy poca cantidad de micelio aéreo. El cultivo no forma ningún cuerpo fructífero característico de Coniochaeta.

El mencionado procedimiento comprende la cultivación de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856), en condiciones aerobias en un medio de cultivo que contiene unas fuentes de carbono y nitrógeno, sales inorgánicas y eventualmente oligoelementos.

Preferiblemente, la cultivación se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 20 y 35ºC y a un pH comprendido entre 3 y 10.

Además, el invento se refiere a un procedimiento para la preparación de un compuesto de la fórmula I, caracterizado porque el compuesto coniosetina se hace reaccionar con un reactivo.

Por ejemplo, un ácido activado se puede hacer reaccionar con grupos hidroxi o con el nitrógeno de la coniosetina. Ácidos activados son, por ejemplo, cloruros de ácidos u otros derivados de ácidos, tal como han sido descritos por ejemplo por Jerry March en la monografía de Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4ª edición, de 1992. Con el fin de llevar a cabo selectivamente conversiones químicas, puede ser ventajoso introducir antes de la reacción grupos protectores apropiados, de una manera de por sí conocida. Los grupos protectores son separados después de la reacción, y a continuación el producto de la reacción es purificado.

Como fuentes preferidas de carbono para la fermentación son apropiados hidratos de carbono asimilables y alcoholes de azúcares, tales como glucosa, lactosa, sacarosa o D-manita, así como productos naturales que contienen hidratos de carbono, tales como p.ej. un extracto de malta o un extracto de levadura. Como sustancias nutritivas que contienen nitrógeno, entran en consideración: aminoácidos, péptidos y proteínas, así como sus productos de descomposición, tales como caseína, peptonas o triptonas, además extractos de carne, extractos de levadura, semillas molidas, por ejemplo de maíz, trigo, judías, soja o de la planta de algodón, residuos de destilación de la producción de alcohol, harinas de carne o extractos de levadura, así como también sales de amonio y nitratos, pero en particular también péptidos obtenidos por vía sintética o respectivamente biosintética. En cuanto a sales inorgánicas, la solución nutritiva puede contener por ejemplo cloruros, carbonatos, sulfatos o fosfatos de los metales alcalinos o alcalino-térreos, hierro, zinc, cobalto y manganeso.

La formación de las coniosetinas conformes al invento se desarrolla especialmente bien, p.ej. en una solución nutritiva, que contiene aproximadamente de 0,05 a 5%, de manera preferida de 1 a 2% de un extracto de malta, aproximadamente de 0,05 a 3%, de manera preferida de 0,05 a 1% de un extracto de levadura, y de 0,2 a 5 %, manera preferida de 0,5 a 2% de glucosa, así como de 0,5 a 3%, de manera preferida de 1,5 a 3% de copos de avena. Los datos en tantos por ciento se refieren en cada caso al peso de la solución nutritiva total.

En esta solución nutritiva, el Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) forma una mezcla de coniosetinas. Dependiendo de la composición de la solución nutritiva, puede variar la proporción cuantitativa de una o varias de las coniosetinas conformes al invento. Además, mediante la composición de los medios se puede regular la síntesis de coniosetinas individuales, de manera tal que una coniosetina no se prepare nada en absoluto o bien se prepare por el microorganismo en una cantidad situada por debajo del límite de detección.

La cultivación del microorganismo se efectúa de un modo aerobio, es decir por ejemplo sumergido, mediando sacudimiento o agitación en un matraz de sacudimiento o en fermentadores o sobre un medio sólido, eventualmente mediando introducción de aire o de oxígeno. Ésta se puede llevar a cabo en un intervalo de temperaturas de aproximadamente 15 a 35ºC, de manera preferida a aproximadamente 20 hasta 30ºC, en particular a 25 hasta 30ºC. El intervalo de pH debería estar situado entre 4 y 10, de manera preferida entre 6,5 y 7,5. Se cultiva el microorganismo en estas condiciones por lo general a lo largo de un período de tiempo de 48 a 720 horas, de manera preferida de 72 a 720 horas. Ventajosamente, se cultiva en varias etapas, es decir se preparan en primer lugar, en un medio nutritivo líquido, uno o varios cultivos preliminares, que luego se sobreinoculan en el medio de producción propiamente dicho, es decir el cultivo principal, por ejemplo en la relación en volumen de 1:10 a 1:100. El cultivo preliminar se obtiene p.ej. sobreinoculando el micelio en una solución nutritiva y dejándolo crecer durante aproximadamente 20 a 120 horas, de manera preferida durante 48 a 72 horas. El micelio se puede obtener por ejemplo dejando crecer la cepa durante aproximadamente 1 a 40 días, de manera preferida durante 21 a 35 días, en un medio nutritivo sólido o líquido, por ejemplo un agar de malta y levadura, un agar de copos de avena o un agar de dextrosa de
patata.

La evolución de la fermentación y la formación de los antibióticos conformes al invento se pueden vigilar de un modo correspondiente a métodos conocidos para un experto en la especialidad, tal como p.ej. mediante determinación de la actividad biológica en bioanálisis, o mediante métodos de cromatografía tales como los de cromatografía de capa fina (DC) o los de cromatografía en fase líquida de alto rendimiento (HPLC).

El hongo Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) puede formar el compuesto coniosetina mediante un cultivo superficial o estacionario sobre medios nutritivos sólidos. Los medios nutritivos sólidos se producen mediante adición, por ejemplo, de un agar o una gelatina a medios nutritivos acuosos. Sin embargo, también es posible obtener la coniosetina por fermentación del hongo Coniochaeta ellipsoidea Udagawa según el procedimiento sumergido, es decir en una suspensión acuosa. El antibiótico coniosetina se puede presentar tanto en el micelio como también en el material filtrado de cultivo, habitualmente la cantidad principal se encuentra en la masa celular. Por lo tanto, es conveniente separar la solución de fermentación mediante filtración o centrifugación. El material filtrado es extraído como una fase sólida con una resina adsorbente. El micelio, así como también el cultivo superficial, se extraen de una manera conveniente con metanol o 2-propanol, pero también se pueden utilizar otros disolventes.

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Las extracciones se pueden llevar a cabo en un amplio intervalo de pH, pero es conveniente trabajar en un medio neutro o débilmente ácido, de manera preferida entre pH 3 y pH 7. Los extractos se pueden concentrar y secar p.ej. en vacío.

Un método del aislamiento del antibiótico conforme al invento consiste en el reparto en soluciones de un modo de por sí conocido.

Otro método de la purificación consiste en la cromatografía en presencia de resinas adsorbentes, tal como p.ej. en presencia de Diaion® HP-20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokio, de Amberlite® XAD 7 (Rohm and Haas, EE.UU.), de Amberchrom® GC, (Toso Haas, Filadelfia, EE.UU.) o de resinas similares. Son apropiados además de ello numerosos soportes en fase inversa, p.ej. RP_{8} y RP_{18}, tal como se han conocido p.ej. de un modo general en el marco de la cromatografía en fase líquida de alta presión (HPLC).

Otra posibilidad de purificación para el antibiótico conforme al invento consiste en la utilización de los denominados soportes para cromatografía en fase normal, tales como p.ej. los de gel de sílice o Al_{2}O_{3} u otros, de una manera de por sí conocida.

Un procedimiento alternativo de aislamiento consiste en la utilización de tamices moleculares, tales como p.ej. Fractogel® TSK-HW-40, Sephadex® G-25 y otros, de una manera de por sí conocida. Además de esto, también es posible obtener la coniosetina por cristalización a partir de un material enriquecido. Para esto son apropiados p.ej. disolventes orgánicos y sus mezclas, en estado anhidro o con adición de agua. Un procedimiento adicional para el aislamiento y la purificación de los antibióticos conformes al invento consiste en la utilización de intercambiadores de aniones, de manera preferida en el intervalo de pH de 4 a 10 y de intercambiadores de cationes, de manera preferida en el intervalo de pH de 2 a 5. Para esto es especialmente apropiada la utilización de soluciones tamponadoras, a las que se han añadido ciertas proporciones de disolventes orgánicos.

La coniosetina, y los derivados químicos mencionados de la misma, se pueden transformar en las correspondientes sales farmacológicamente compatibles de acuerdo con métodos conocidos por un experto en la especialidad.

Como sales farmacológicamente compatibles de los compuestos conformes al invento se entienden sales tanto inorgánicas como también orgánicas, tal como se describen en la obra Remingtons Pharmaceutical Sciences (17ª edición, página 1418, 1985). Como sales entran en cuestión, en particular, sales de metales alcalinos, amonio, metales alcalino-térreos, sales con aminas farmacológicamente compatibles, y sales con ácidos inorgánicos u orgánicos, tales como p.ej. HCl, HBr, H_{2}SO_{4}, ácido maleico y ácido fumárico.

Se encontró, de manera sorprendente, que los compuestos conformes al invento presentan fuertes efectos antibacterianos, y por lo tanto se adecuan para la terapia de enfermedades que son causadas por infecciones bacterianas. La Tabla 1 recopila a modo de ejemplo las concentraciones inhibidoras mínimas (MHK) de coniosetina.

TABLA 1 Actividad in vitro (valores de MHK (\mug/ml)) de la coniosetina contra bacterias gram-positivas en el ensayo de diluciones en serie

	Resistencia contra	Después de 18 h	24 h	38 h

Staphylococcus aureus	ery S	0,3	0,3	0,6
S. aureus	oxa S ery R	0,3	0,3	0,3
S. aureus	oxa R ery R	0,3	0,3	0,3
S. aureus	oxa S ery R	0,6	0,6	0,6
S. epidermidis	oxa S ery R	0,3	0,3	0,3
S. aureus	oxa R ery R tet R	0,3	0,3	0,3
S. aureus	ofl R oxa R ery R tet R	0,6	0,6	0,6
S. epidermidis	oxa R ery R	0,6	1,2	1,2
S. pyogenes	ery S	0,6	1,2	1,2
Enterococcus faecalis	ery S	2,5	2,5	2,5
Enterococcus faecalis	ery R	2,5	2,5	2,5
Enterococcus faecium	tei R van R ery R tet R	1,2	1,2	2,5
Streptococcus gr. G	ery S	1,2	1,2	1,2
S. mitis	ery S	1,2	2,5	2,5
S. pyogenes	ery R	1,2	1,2	1,2
S. agalactiae	ery R	2,5	2,5	2,5
Streptococcus gr. G	ery R	0,6	0,6	0,6

TABLA 1 (continuación)

	Resistencia contra	Después de 18 h	24 h	38 h

S. sanguis	ery R	1,2	1,2	2,5
S. mitis	ery R	2,5	2,5	2,5
S. pneumoniae	ery S	0,6	0,6	0,6
S. pneumoniae	ery S pen R	0,6	1,2	1,2
S. pneumoniae	ery R	0,6	0,6	0,6
S. pneumoniae	ery R pen R	0,6	0,6	0,6
S. pneumoniae	ery R pen R	0,6	0,6	0,6
S. pneumoniae	ery R	0,6	0,6	0,6
S. pneumoniae	ery R	0,6	0,6	1,2
Escherichia coli		> 40

\begin{minipage}[t]{155mm}S = sensible, R = resistente, ery = eritromicina, ofl = ofloxacina, oxa = oxacilina, pen = penicilina, tei = teicoplanina, van = vancomicina, tet = tetraciclina.\end{minipage}

Es especialmente digno de mencionarse el hecho de que el compuesto conforme al invento no presenta ningún tipo de resistencia cruzada con antibióticos habituales, tales como por ejemplo las \beta-lactamas (penicilinas, cefalosporinas), aminoglicósidos (estreptomicina), macrólidos (eritromicina), quinolonas (ciprofloxacina), sulfonamidas o glicopéptidos (vancomicina) y otros.

Ha de resaltarse, además de esto, un efecto inhibidor - si bien más débil - sobre levaduras, tales como por ejemplo Candida albicans y contra hongos, tales como Aspergillus niger, que pueden provocar enfermedades infecciosas muy tenaces, e incluso amenazadoras de la vida (Ejemplo 8). Para la terapia de tales enfermedades, la coniosetina es por lo tanto asimismo apropiada.

La coniosetina es bien compatible en la concentración eficaz y en concentraciones más altas.

El presente invento concierne, por consiguiente, también a la administración de los compuestos conformes al invento como medicamentos, así como a la utilización de los correspondientes compuestos para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento y/o a la profilaxis de infecciones y micosis bacterianas.

Además, el presente invento se refiere a medicamentos con un cierto contenido del compuesto conforme al invento.

El mencionado medicamento se prepara por mezcladura de por lo menos un compuesto de la Fórmula I con una sustancia fisiológica coadyuvante y/o de vehículo y/o se lleva a una forma apropiada de administración.

Los medicamentos conformes al invento se pueden administrar por vía enteral (oral), parenteral (intramuscular o intravenosa), rectal o local (tópica). Se pueden administrar en forma de soluciones, polvos, tabletas, cápsulas (inclusive microcápsulas), pomadas (cremas o geles), o supositorios. Como sustancias coadyuvantes para tales formulaciones entran en cuestión los materiales de carga líquidos o sólidos, y agentes extendedores, disolventes, emulsionantes, sustancias lubricantes, correctoras del sabor, colorantes y/o sustancias tamponadoras. Como una dosificación conveniente se administran de 0,1-1.000, de manera preferida de 0,2-100 mg/kg de peso corporal. Éstas se administran convenientemente en unas unidades de dosificación que contienen por lo menos la cantidad diaria eficaz de los compuestos conformes al invento, p.ej. de 30-3.000, de manera preferida 50-1.000 mg.

Los siguientes Ejemplos deben servir para la explicación adicional del invento, sin querer limitar de ninguna manera la amplitud del invento.

Ejemplo 1 Preparación de un cultivo en glicerol de Coniochaeta ellipsoidea (DSM 13856)

30 ml de una solución nutritiva (un extracto de malta 2,0%, un extracto de levadura 0,2%, glucosa 1,0%, (NH_{4})_{2}
HPO_{4} 0,05%, de pH 6,0) en un matraz Erlenmeyer estéril, con una capacidad de 100 ml, se inoculan con la cepa Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) y se incuban durante 6 días a 25ºC y 140 rpm (revoluciones por minuto) en una máquina sacudidora rotatoria. A continuación, 1,5 ml de este cultivo se diluyen con 2,5 ml de glicerol al 80% y se almacenan a -135ºC.

Ejemplo 2 Preparación de un cultivo preliminar en un matraz Erlenmeyer de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856)

100 ml de una solución nutritiva (un extracto de malta 2,0%, un extracto de levadura 0,2%, glucosa 1,0% (NH_{4})_{2}
HPO_{4} 0,05%, de pH 6,0) en un matraz Erlenmeyer estéril, con una capacidad de 300 ml, se inoculan con la cepa Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) y se incuban durante 4 días a 25ºC y 140 rpm en una máquina sacudidora rotatoria. 2 ml de este cultivo preliminar se inoculan a continuación para la preparación de los cultivos principales.

Ejemplo 3 Preparación de un cultivo principal de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) sobre placas de un medio sólido

Sobre 30 placas estériles de 25 x 25 ml se vierten 200 ml de una solución nutritiva que contiene 20 g/l de un extracto de malta, 20 g/l de copos de avena, 2% de un agar y con un valor del pH de 7,0. Estas placas se inoculan con 2 ml de un cultivo preliminar y se incuban a 25ºC. La producción máxima de uno o varios compuestos de la coniosetina conforme al invento, se alcanza después de aproximadamente 676 horas.

Ejemplo 4 Aislamiento del antibiótico con coniosetina

30 placas de agar, con un tamaño cada una de 25 x 25 cm, obtenidas de acuerdo con el Ejemplo 3, se liofilizan y se extraen con 2,5 litros de metanol. La fase líquida transparente se concentra por evaporación en vacío hasta 100 ml, se diluyen con agua y se aplican sobre una columna con una capacidad de 580 ml, llenada con la resina adsorbente. Dimensiones de la columna: anchura x altura 5 cm x 30 cm. Se eluye con un gradiente de disolventes de desde 5% de acetonitrilo en agua hasta 90% de acetonitrilo y la corriente saliente de la columna (40 ml/minuto) se recoge en fracciones cada una de 120 ml. Las fracciones que contienen coniosetina, las cuales se comprueban mediante análisis por HPLC, se reúnen y se concentran en vacío así como se liofilizan (0,3 g).

Ejemplo 5 Cromatografía en fase líquida de alta presión (HPLC) de la coniosetina

Columna:Superspher 100 RP-18e®, 250-4, con columna preliminar

Fase móvil: 75% de acetonitrilo en ácido fosfórico en 0,1%

Velocidad de flujo: 1 ml por minuto

Detección por adsorción de UV a 210 nm.

El período de tiempo de retención de la coniosetina es de 13,6 minutos.

Ejemplo 6 Purificación final de la coniosetina

El antibiótico coniosetina enriquecido (0,3 g), obtenido de acuerdo con el Ejemplo 4, es separado en una columna de HPLC LiChrospher® 100 RP-18e (anchura x altura = 2,5 cm x 25 cm) según el procedimiento de gradientes con 75% hasta 100% de acetonitrilo en ácido acético al 0,05%. Velocidad de flujo: 30 ml/min, tamaño de las fracciones: 60 ml. Las fracciones investigadas mediante HPLC analítica (véase el Ejemplo 5) se reúnen de un modo correspondiente a su contenido de coniosetina, se concentran por evaporación en vacío y se liofilizan. Ellas proporcionan 170 mg de coniosetina en una pureza de 98%.

Ejemplo 7 Caracterización por espectrometría de masas de la coniosetina

Determinación del máximo (del inglés peak) molecular.

: A la molécula buscada se le asigna la masa de 413 basándose en los siguientes hallazgos: El espectro de ESI^{+} así como los espectros de FAB^{+} muestran unos máximos a 414 amu (M+H)^{+}. El espectro de ESI^{-} muestra, entre otros, un máximo a 412 amu (M-H)^{-}.

: Alta resolución del ion quasi-molecular.

: En condiciones FAB con una matriz de alcohol nitro-bencílico se observa, entre otros, un máximo a 414,2645 amu. La exactitud de las masas, que se presenta al realizar la medición, es de aproximadamente 5 ppm. El valor medido coincide bien con la composición elemental calculada para C_{25}H_{36}NO_{4} = 414,2644 amu. En el caso de esta composición elemental se presentan 9 equivalentes de dobles enlaces.

Experimentos por EM/EM (espectros de masas) con un espectrómetro de masas con trampa de iones conducen a las siguientes fragmentaciones en la modalidad ESI^{+}:

: de 414 amu a 396 amu (-H_{2}O), 386 amu (-CO), 370 amu (-C_{2}H_{4}O), 346 amu (-C_{5}H_{8}), 278 amu, 271 amu, 245 amu, 215 amu, 196 amu y otros fragmentos de menor intensidad.

: de 396 amu a 378 amu (-H_{2}O), 352 amu (-C_{2}H_{4}O), 253 amu, 241 amu, 227 amu, de 386 amu a 368 amu (-H_{2}O), 243 amu.

Las propiedades físicas y químicas así como espectroscópicas del antibiótico conforme al invento, se pueden recopilar de la siguiente manera:

Coniosetina:

Aspecto:

Sustancia desde incolora hasta de color amarillo claro, soluble en disolventes orgánicos medianamente polares y polares, poco soluble en agua. Estable en un medio neutro y en un medio débilmente ácido, pero inestable en una solución fuertemente ácida y una fuertemente alcalina.

Fórmula empírica: C_{5}H_{35}NO_{4}

Peso molecular: 413,56

^{1}H- y ^{13}C-RMN: véanse las Tablas 2 y 3

Máximos en UV: 233 nm, 288 nm.

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TABLA 2 Desplazamientos químicos en ^{1}H y ^{13}C de coniosetina en DMSO-d_{6} y metanol-d_{4} a 300K

	DMSO-d_{6}	Metanol-d_{4}
Posición	^{13}C	^{1}H	^{13}C	^{1}H
	\delta (ppm)	\delta (ppm)	\delta (ppm)	\delta (ppm)
1	48,94	-	51,18	-
1-Me	13,34	1,33 s	14,31	1,42 s, br
2	48,45	3,19	50,59	3,28 br
3	130,99	-	133,15	-
3-Me	22,04	1,53 t	22,67	1,58 t
4	125,88	5,19 s, br	127,31	5,20 s
5	38,61	1,80	40,68	1,86 m
6	42,06	1,78, 0,82	44,10	1,83 d, br, 0,87 m
7	32,90	1,49	35,00	1,52 m, br
7-Me	22,40	0,89 d	23,07	0,94 d
8	35,44	1,72, 1,01	37,20	1,77 d, br, 1,10 m

TABLA 2 (continuación)

	DMSO-d_{6}	Metanol-d_{4}
Posición	^{13}C	^{1}H	^{13}C	^{1}H
	\delta (ppm)	\delta (ppm)	\delta (ppm)	\delta (ppm)
9	27,59	1,94 d, 1,00	29,47	2,01 d, br, 1,06 m
10	39,28	1,57	41,39	1,66 m
11	130,42	5,18 m	132,05	5,19
12	131,96	5,72 t	134,03	5,78 t
13	131,31	5,91 t	132,71	5,90 t
13a	127,83	5,52 m	129,12	5,51 m
13b	17,73	1,65 d	18,23	1,67 d
14	198,23	-	201,30	-
14-OH	-	17,49 s, br	-	-
15	99,46	-	101,50	-
16	179,52	-	181,53	-
17	-	9,22 s, br	-	-
18	66,57	3,62	68,19	3,62 br
19	191,09	-	193,51	-
20	65,66	3,91	68,11	4,06 br
20-OH	-	4,76 d	-	-
21	20,67	1,17 d	20,65	1,29 d, br

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TABLA 3 Desplazamientos químicos en ^{1}H y ^{13}C de coniosetina en CDCl_{3} a 300K

Posición	^{13}C \delta (ppm)	^{1}H \delta (ppm)
1	49,84	-
1-Me	13,76	1,44
2	49,25	3,22
3	131,50	-
3-Me	22,23	1,61
4	126,01	5,20
5	39,13	1,85
6	42,54	1,82, 0,90

TABLA 3 (continuación)

Posición	^{13}C \delta (ppm)	^{1}H \delta (ppm)
7	33,54	1,54
7-Me	22,46	0,94
8	35,78	1,79, 1,13
9	28,30	1,99, 1,08
10	39,73	1,68
11	130,19	5,23
12	132,62	5,83
13	131,39	5,89
13a	128,19	5,52
13b	18,02	1,70
14	200,23	-
14-OH	-	-
15	100,28	-
16	179,33	-
17	-	6,19
18	65,43	3,71
19	190,95	-
20	67,80	4,05
20-OH	-	-
21	19,56	1,34

Ejemplo 8 Efecto inhibidor de la coniosetina en el ensayo de difusión en agar

Se preparan placas de agar con 2 ml de una siembra de Staphylococcus aureus en 200 ml de una solución de agar, 2 ml de una siembra de Escherichia coli en 200 ml de un agar, 2 ml de una siembra de Candida albicans en 200 ml de una solución de agar; 1 ml de una siembra de Aspergillus niger en 200 ml de una solución de agar y 3 ml de una siembra de Streptomyces murinus en 200 ml de una solución de agar. La coniosetina se aplica en una solución 10 mM sobre hojitas con un diámetro de 6 mm y se coloca sobre la placa de agar. Las placas inoculadas de Staphylococcus, E. coli y Candida se incuban durante 16 horas a 37ºC, las placas de A. niger se incuban durante 40 horas a 28ºC, y la placas de Streptomyces se incuban durante 16 horas a 28ºC. Luego se observan unos halos de inhibición con los siguientes diámetros (mm).

Cantidad	S. aureus	E. coli	C. albicans	A. niger	S. murinus
10 \mul	13	0	9	0	0
20 \mul	14,5	0	10	0	9
40 \mul	15,5	0	10,5	8	10

Claims

1. Compuesto de la Fórmula general I

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3

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realizándose que

R: significa:

\quad: 1. H, o

\quad: 2. alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6} o alquinilo C_{2}-C_{6}, en que los alquilo, alquenilo y alquinilo son lineales o {}\hskip0,3cm ramificados, y eventualmente están sustituidos una vez o dos veces con:

\quad: 2.1 -OH,

\quad: 2.2 =O,

\quad: 2.5 -arilo,

\quad: 2.8 -NH_{2}, o

\quad: 2.9 halógeno,

X, X_{3} y X_{4}, independientemente unos de otros, significan O, NH, N-alquilo C_{1}-C_{6}, N-alquenilo C_{2}-C_{6}, N-alquinilo C_{2}-C_{6}, N-acilo, N-arilo, N-O-R ó S,

y/o una forma estereoisómera del compuesto de la Fórmula I y/o mezclas de esta forma en cualquier relación, y/o una sal fisiológicamente compatible del compuesto de la Fórmula I.

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2. Compuesto de la Fórmula II de acuerdo con la reivindicación 1

4

y/o una forma estereoisómera del compuesto de la Fórmula II y/o mezclas de esta forma en cualquier relación, y/o una sal fisiológicamente compatible del compuesto de la Fórmula II.

3. Compuesto de la fórmula empírica: C_{25}H_{35}NO_{4} (coniosetina) obtenible por fermentación de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856), hasta que el compuesto coniosetina se acumule en el caldo de cultivo y por subsiguiente aislamiento del compuesto así como de sus sales farmacológicamente compatibles.

4. Derivados químicos, que se derivan de un compuesto de la fórmula empírica C_{25}H_{35}NO_{4} (coniosetina), obtenibles por fermentación de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) hasta que el compuesto coniosetina se acumule en el caldo de cultivo, aislamiento del compuesto y subsiguiente transformación en derivados químicos, así como de sus sales farmacológicamente compatibles.

5. Procedimiento para la preparación de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la coniosetina se hace reaccionar con un derivado de un ácido carboxílico y eventualmente se transforma en una sal farmacológicamente compatible.

6. Procedimiento para la preparación de un compuesto de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el microorganismo Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) se fermenta en un cultivo, un compuesto de la Fórmula I se aísla y eventualmente se transforma en sus sales farmacológicamente compatibles.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque se fermenta Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) en medios de cultivo que contienen unas fuentes de carbono y nitrógeno así como las usuales sales inorgánicas y los usuales oligoelementos, en condiciones aerobias.

8. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo en un medio nutritivo, que como fuente de carbono contiene de 0,5 a 5% de un extracto de malta y de 0,5 a 5% de copos de avena.

9. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque la fermentación se lleva a cabo en condiciones aerobias a una temperatura comprendida entre 20 y 35ºC y a un pH comprendido entre 4 y 10.

10. Compuesto de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 4 para su utilización como medicamento.

11. Utilización de un compuesto de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y a la profilaxis de enfermedades infecciosas bacterianas.

12. Utilización de un compuesto de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y a la profilaxis de micosis.

13. Medicamento con un cierto contenido de por lo menos un compuesto de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 4 y de uno o varios vehículos fisiológicamente aceptables así como eventualmente apropiadas sustancias coadyuvantes.

14. Procedimiento para la preparación de un medicamento de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque por lo menos un compuesto de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 4 se lleva a una forma apropiada de administración con una sustancia fisiológica coadyuvante y/o de vehículo.

15. Utilización de Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856) para la obtención de antibióticos.

16. Coniochaeta ellipsoidea Udagawa (DSM 13856).