ES2266309T3 - Procedimiento y medio de deteccion/identificacion de microorganismos con actividad esterasa y/u osidasa y/o peptidasa y/o sulfatasa y/o fosfatasa. - Google Patents
Procedimiento y medio de deteccion/identificacion de microorganismos con actividad esterasa y/u osidasa y/o peptidasa y/o sulfatasa y/o fosfatasa. Download PDFInfo
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Abstract
Medio de detección/identificación de microorganismos, y en particular de bacterias y/o de levaduras con actividad enzimática, seleccionada de entre las actividades de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, del tipo de los que comprenden especialmente un medio de reacción, y al menos un sustrato de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, cromógeno o fluorógeno, excluyendo los sustratos que comprenden un catión de 4-[2-(4-octanoiloxi-3, 5- dimetoxifenil)-vinil]-quinolinio-1-(ácido propan-3-il- carboxílico) y un anión, basándose esta detección/identificación sustancialmente en la revelación de la actividad esterasa y/o osidasa y/o peptidasa y/o sulfatasa y/o fosfatasa, dicho medio: * está en forma líquida o gel listo para uso y estable para la conservación, es decir, la intensidad de la coloración o la fluorescencia se mantiene a un nivel máximo al menos durante varias semanas; * comprende: - al menos un éster de sorbitán con ácido(s) grasos(s) (ESAG), o al menos un ácido graso (AG), o una mezcla de ESAG/AG, como agente estabilizador-emulsionante, - la concentración de [ESAG] en el medio se define según lo siguiente (% en peso): 0, 5 [ESAG] 5, preferentemente 1, 5 [ESAG] 3, 5; - y eventualmente al menos un disolvente (S).
Description
Procedimiento y medio de
detección/identificación de microorganismos con actividad esterasa
y/u osidasa y/o peptidasa y/o sulfatasa y/o fosfatasa.
El campo de la invención es el del análisis
microbiológico por vía bioquímica, y en particular de la detección
e identificación de cepas bacterianas mediante inoculación de medios
de reacción, en particular de los medios nutritivos. Estos últimos
comprenden sustratos cromógenos o fluorógenos susceptibles de
reaccionar con las enzimas específicas para las cepas buscadas,
produciendo una coloración o una fluorescencia de cada colonia
en
cuestión.
cuestión.
En el campo de la presente invención, es
particularmente ventajosa la detección/identificación de
microorganismos patógenos o indicadores de calidad, ya sea en un
entorno médico o industrial, y más particularmente microorganismos
con actividad enzimática de tipo esterasa, osidasa, peptidasa,
sulfatasa o fosfatasa, por ejemplo las bacterias o levaduras del
género Salmonella, Pseudomonas, Listeria, Staphylococcus,
Enterococcus, Candida y más particularmente aún a especies
Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,
Candida albicans.
Las cepas de Escherichia coli destacan
frecuentemente por la revelación de una actividad enzimática de tipo
osidasa tal como la actividad de
\beta-glucuronidasa o
\beta-galactosidasa.
De la misma manera, el género Listeria se
detecta destacando la actividad de
\beta-glucosidasa.
Se puede utilizar asimismo una actividad de
aminopeptidasa para destacar un grupo, un género o una especie de
microorganismos. La actividad de
alanina-aminopeptidasa, por ejemplo, permite
diferenciar las bacterias Gram-negativas de las
bacterias Gram-positivas.
El género Salmonella, responsable en el
ser humano de diversas infecciones (fiebre tifoidea, intoxicación
alimentaria), posee esterasas no específicas capaces de hidrolizar
sustratos sintéticos cromógenos, por ejemplo indigogénicos.
La detección/identificación de salmonellas, y
más generalmente de bacterias con actividad esterasa, se realiza
clásicamente sobre medios agar-agar o líquidos de
aislamiento, que permiten la detección/identificación de las
colonias de bacterias sospechosas con actividad de esterasa,
especialmente las salmonellas. La inoculación de tales medios se
realiza mediante baño de dicho medio en la muestra analizada, o
mediante contacto de la muestra con el
medio.
medio.
Las bacterias con actividad esterasas, osidasas,
peptidasas, sulfatasas o también fosfatasas, poseen en su genotipo
enzimático esterasas, osidasas, peptidasas, sulfatasas o fosfatasas
que rompen los enlaces diana de los sustratos presentes en el
medio, y liberan así la parte cromófora o fluorófora activada de
dichos sustratos. Esto da como resultado una coloración o
fluorescencia que revela la hidrólisis, y por lo tanto la presencia
de bacterias o de colonias de bacterias dianas.
Para poder realizar estos ensayos habituales a
gran escala, es necesario que los medios de detección/identificación
sean estables y permitan simplificar al máximo los procedimientos
de detección/identificación correspondientes, limitando las
manipulaciones. Además, es importante que los procedimientos
ofrezcan una alta sensibilidad (intensidad de coloración), así como
una especificidad de primer orden. La velocidad de revelación de las
colonias sospechosas es asimismo un parámetro fundamental de estos
tipos de medios y de procedimientos de detección/identificación de
bacterias que presentan las actividades enzimáticas susodichas.
Sin embargo, se sabe que los sustratos de
enzimas tales como las esterasas, osidasas, peptidasas, sulfatasas
o fosfatasas poseen problemas de compatibilidad con los medios de
cultivo para microorganismos, y en particular para las bacterias
que poseen estas actividades. Además, tales sustratos no son
estables en el tiempo, lo que induce a una disminución de la
sensibilidad frente a dicha actividad enzimática al prolongarse el
tiempo de conservación.
En este contexto, se conocen, a través del
artículo científico titulado "Synthèse de substrats
indigogéniques. Mise en évidence de l'activité estérasique des
salmonelles": A. Agban et al., Eur. J. Med. Chem.
(1990) 25, 697-699, medios de cultivo de
agar-agar que comprenden sustratos indigogénicos, a
saber, especialmente, el pelargonato (C9) de
bromo-5-indoxilo, y una sal biliar,
a saber el desoxicolato de sodio. Tales medios de cultivo sufren
los mismos inconvenientes que aquellos citados aquí abajo con
referencia al documento FR-2.697.028.
La patente FR-2.697.028 publica
un medio de cultivo para destacar la presencia de salmonellas que
comprende un sustrato de esterasa cromógena constituida de un éster
del ácido caprílico con un resto indol (caprilato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo),
así como un detergente elegido entre las sales biliares
(desoxicolato de sodio). Este cromógeno y esta sal biliar están
contenidos en un medio nutritivo que permite el crecimiento de las
salmonellas. Según la enseñanza del documento
FR-2.697.028, la sal biliar se añade directamente al
medio de selección en el que ya está incluido el sustrato de
esterasa.
Otro inconveniente relacionado con el uso de
sales biliares deriva del hecho de que son materias primas de
origen animal, lo que implica indirectamente una cierta variabilidad
de la calidad.
Además, se pueden perfeccionar los resultados en
términos de actividad biológica.
Este medio de cultivo no ofrece todas las
garantías deseadas en términos de estabilidad del sustrato de
esterasa. Además, se encuentra que este último no es completamente
miscible con el medio de cultivo. Está claro que esto perjudica a
la calidad de los resultados obtenidos desde el punto de vista de la
sensibilidad, de la rapidez y de la estabilidad.
Se debe de observar asimismo que el medio de
cultivo según el documento FR-2.697.023 se presenta
en forma de polvo. Esto obliga al usuario a ejecutar una operación
de reconstitución previa del medio líquido o
agar-agar. Esta restricción resulta de la falta de
estabilidad de los sustratos de esterasa usados. Además, el medio
agar-agar preparado según la enseñanza del documento
FR-2.697.028 no es translúcido. Esto probablemente
compromete la lectura de las coloraciones asociadas con las
eventuales colonias de bacterias diana.
La solicitud de patente PCT
WO-92/17607 se refiere a un medio de detección para
salmonellas que contiene TERGITOL-4®
(hidrogenosulfato de
7-etil-2-metil-4-undecanoato,
o su sal sódica). Se supone que este aditivo mejora la selectividad
del medio de detección por salmonellas diana. La concentración de
TERGITOL-4® puede variar de 2 hasta 30 ml/l en el
medio de cultivo a base de agar gelosa/xilosa/lisina. Según este
documento, la detección de salmonellas se basa únicamente en un
principio de crecimiento selectivo por competición.
La solicitud PCT WO-99/41409 se
refiere a sustratos de esterasa cromógenos para la detección de
salmonellas. Esta solicitud PCT corresponde al documento COOKE
VENITIA M. ETAL; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 65,
nº 2 de febrero de 1999 (1990-02) páginas
807-812.
En este documento, se propone usar un compuesto
cromógeno que reacciona con una esterasa/lipasa específica para el
género Salmonella, y que tiene una afinidad por los ésteres
de ácidos grasos de C8. El compuesto cromógeno en cuestión
comprende un anión y un catión de la fórmula:
[4-[2-(4-octanoiloxi-3,5-dimetoxifenil)-vinil]-quinolinio-1-(propan-3-il)carboxilato]^{+}.^{-}[bromuro
o cloruro]. Más precisamente, los sustratos usados son, por
ejemplo, ésteres de C8 del catión carboxilato.
Además, el procedimiento según el documento
WO-99/41409 describe el uso de un éster de ácido
graso con sorbitan (particularmente: ácido monoláurico: TWEEN® 20).
Estos productos se usan como detergentes a razón de 2 g por litro
de medio.
Además, el sustrato específico según la
enseñanza de esta Solicitud PCT se puede introducir en el medio de
cultivo nutritivo en mezcla con metanol, etanol o
N,N-dimetilformamida (DMF). El detergente eventual
no se introduce junto con el sustrato y el disolvente, sino
separadamente.
Independientemente de cuál sea el caso, los
medios publicados en el documento WO-99/41409 no se
presentan con el objeto de proporcionar una mejora de la
estabilidad de los sustratos enzimáticos contenidos en el medio de
detección.
Se conocen asimismo, a través de distintos
documentos, medios de cultivos que contienen varios sustratos para
la detección de una sola actividad enzimática, así como también
medios de cultivo que contienen varios sustratos que permiten
detectar actividades enzimáticas distintas.
El documento WO-95/04157
describe, por ejemplo, medios de cultivo que contienen distintos
sustratos cromógenos de osidasas, tales como
5-bromo-4-cloro-3-indoxilgalactósido,
5-bromo-4-cloro-3-indoxilglucurónido,
5-bromo-4-cloro-3-indoxilglucósido
o también
6-cloro-3-indoxilgalactósido.
Tales medios se usan para diferenciar especialmente las bacterias
de la especie Escherichia coli de otras coliformes.
Este documento describe asimismo un medio que
contiene sustratos cromógenos específicos para distintas enzimas,
tales como osidasas y fosfatasas. Estos sustratos son, por ejemplo,
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil-glucosaminida
y fosfato de
5-bromo-6-cloro-3-indoxilo.
Tal medio permite especialmente diferenciar Candida albicans
de las demás levaduras del género Candida.
El documento WO-00/53799
describe un medio cromógeno de detección de bacterias
Staphylococcus aureus. Este medio contiene dos sustratos
cromógenos en combinación, especialmente
5-bromo-4-cloro-3-indoxilglucósido
y fosfato de
5-bromo-6-cloro-3-indoxilo.
El interés principal de tal medio es evitar los falsos positivos o
los falsos negativos, así como diferenciar las S. aureus de
las demás especies o de los demás géneros tales como los
Streptococcus.
Sin embargo, nada indica en los documentos
WO-95/04157 y WO-00/53799 que los
medios descritos hayan sido desarrollados a fin de mejorar la
estabilidad de los sustratos enzimáticos que estos contienen.
Los ésteres de sorbitan con ácidos grasos (ESAG)
son tensioactivos conocidos, ampliamente usados en las preparaciones
alimentarias y farmacéuticas especialmente. A título ilustrativo,
se puede citar el artículo de DICKINSON et al.:
"J Colloid interface Sci. 15 de abril de 1999; 212(2):
466-473", que se refiere a la estabilización
de emulsiones que contienen caseinato de sodio y monolaurato de
sorbitan polioxietilenado que contiene 20 unidades de óxido de
etileno (TWEEN 20). Las emulsiones en cuestión son emulsiones de
aceite en agua (30% en volumen de n-tetradecano a
pH 6,8). Este campo técnico está relativamente lejos del de la
detección de bacterias con actividad enzimática específica mediante
reacción coloreada en medio de cultivo selectivo.
En el artículo de GRAM et al. "Clin.
Chem. Oct. 1985; 31(10):1683-8", se
refiere al uso de monooleato de sorbitan polioxietilenado (TWEEN
80) en un medio de ensayo de la antitrombina-III,
conteniendo este medio asimismo polietilenglicol, una disolución de
trombina y sustratos peptídicos cromógenos sintéticos. Los aditivos
usados se presentan para permitir el aumento de la concentración de
trombina activa, a fin de garantizar el buen funcionamiento del
análisis. Nuevamente, hay que constatar que este tipo de
preocupaciones técnicas son muy distintas a las propias del medio
de detección de bacterias con actividad enzimática específica, con
la ayuda de medios de cultivo selectivos que contienen sustratos
cromógenos.
En tal ámbito técnico, uno de los objetivos
esenciales de la presente invención es suministrar un medio de
detección/identificación de bacterias con una actividad enzimática
elegida entre las actividades esterasas y/u osidasas y/o peptidasas
y/o sulfatasas y/o fosfatasas, que este constituido de tal manera
que se optimice la sensibilidad del análisis, es decir, que la
intensidad de la coloración o fluorescencia que revelan la
presencia de bacterias diana sea los más fuerte posible.
Otro objetivo esencial de la presente invención
es suministrar un medio de detección/identificación de
microorganismos, especialmente de bacterias o de levaduras, con
actividad enzimática elegida entre las actividades esterasas y/u
osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, que sea
perfectamente translúcido antes de la inoculación con la muestra a
analizar.
Otro objetivo esencial de la invención es
suministrar un medio de detección/identificación de microorganismos,
especialmente de bacterias o levaduras con actividad enzimática
elegida entre las actividades esterasas y/u osidasas y/o peptidasas
y/o sulfatasas y/o fosfatasas, que contenga al menos un sustrato
enzimático cromógeno o fluorógeno, elegido entre los sustratos de
esterasas y/o los sustratos de osidasas y/o los sustratos de
peptidasas y/o los sustratos de sulfatasas y/o los sustratos de
fosfatasas, y que sea estable durante el almacenamiento (intensidad
de la coloración o de la fluorescencia de revelación mantenida a un
nivel máximo al menos durante varias semanas).
Otro objetivo esencial de la invención es
suministrar un medio de detección/identificación de microorganismos,
especialmente de bacterias o levaduras con actividad enzimática
elegida entre las actividades esterasas y/u osidasas y/o peptidasas
y/o sulfatasas y/o fosfatasas, que no se esté en forma de polvo seco
que se ha de regenerar mediante un líquido o de
agar-agar, sino que exista directamente en formas
listas para su uso.
Otro objetivo esencial de la invención es
suministrar un medio de detección/identificación de microorganismos,
especialmente de bacterias o levaduras con actividad enzimática
elegida entre las actividades esterasas y/u osidasas y/o peptidasas
y/o sulfatasas y/o fosfatasas, que sea económico, especialmente por
el hecho de que comprende cantidades reducidas de
sustrato(s) enzimáticos cromógenos o fluorógenos, el o los
cuales tienen la particularidad de ser
caros.
caros.
Otro objetivo esencial de la invención es
suministrar un procedimiento de obtención de
detección/identificación susodicho que sea sencillo a usar y
económico.
Otro objetivo esencial de la presente invención
es suministrar un procedimiento de detección/identificación de
cepas con actividad enzimática elegida entre las actividades
esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o
fosfatasas, que sea fácil de lleva a cabo (ensayos rutinario), que
sea económico (cantidad de reactivo, manipulación, etiquetado,
velocidad, etc.), que sea fiable, sensible, específico y
reproducible.
Otro objetivo esencial de la presente invención
es proponer el uso de un nuevo aditivo estabilizador en medios de
detección/identificación de microorganismos, especialmente bacterias
o levaduras, con actividad enzimática elegida entre las actividades
esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas,
mediante revelación que resulta de una reacción de hidrólisis que
libera un colorante o un producto fluorescente.
Estos objetivos, entre otros, se alcanzan
mediante la presente invención, que se refiere en primer lugar a un
medio de detección/identificación de microorganismos según la
reivindicación 1.
Un medio de detección/identificación de
microorganismos, y especialmente de bacterias y/o levaduras con
actividad enzimática elegida entre las actividades esterasas y/u
osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, según la
invención, se puede obtener a partir de los medios presentados en
los documentos WO-95/04157 y
WO-00/53799, descritos anteriormente.
El medio según la invención tiene la ventaja de
ser un medio "listo para uso", que se presenta en forma líquida
o semilíquida (gel) sin que haya problemas en cuanto a su
estabilidad. En efecto, los sustratos de esterasas y/u osidasas y/o
peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, presentes en este medio y,
sin embargo, conocidos por su tendencia a degradarse relativamente
rápido, se estabilizan gracias a la presencia del aditivo
estabilizador-emulsionante ESAG, AG o ESAG/AG.
\newpage
Este aditivo, eventualmente asociado al
disolvente S, induce otra ventaja, que es la de permitir una
excelente disolución de los sustratos esterasas y/u osidasas y/o
peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, tradicionalmente
renuentes a disolverse. Esto permite obtener medios de
detección/identificación translúcidos antes de la inoculación. Así,
la lectura de los resultados coloreados o fluorescentes es más
fácil.
Este aditivo ESAG, AG o ESAG/AG es relativamente
barato, y permite una simplificación de realización y una
disminución de la cantidad de los sustratos utilizados
(estabilización). Da como resultado un ahorro económico
seguro.
seguro.
Finalmente, los medios según la invención dan
lugar a una mejor actividad biológica de los sustratos antes
citados, lo que se traduce en una coloración más intensa de las
colonias diana, y en una mejor especificidad.
Es meritorio haber seleccionado esta clase
particular de agentes estabilizadores-emulsionantes,
en particular para los ESAG, que proporciona de manera sorprendente
e inesperada propiedades de estabilidad, translucidez, actividad
biológica, sensibilidad, fiabilidad y especificidad, bien aceptadas
en el análisis microbiológico por vía bioquímica según la
invención.
Según una característica importante de la
invención, el medio de detección/identificación al que se refiere
se obtiene mezclando al menos una disolución madre del sustrato en
el disolvente S y ESAG o AG o una mezcla ESAG/AG, añadido en al
menos una parte de los constituyentes del medio de cultivo.
Conforme a la invención, parece importante
solubilizar el sustrato de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas
y/o sulfatasas y/o fosfatasas en el disolvente S, en presencia de
uno o varios ESAG, AG o mezcla de ESAG/AG que responde a la
definición dada anteriormente. Después, esta mezcla de sustrato
ESAG, AG, ESAG/AG y disolvente S se incorpora en al menos una parte
del medio de cultivo, que está presente, preferentemente, en forma
de agar-agar sobreenfriada. Se pudo constatar que
esta característica de operación permite una optimización de los
resultados ventajosos producidos por medios según la invención.
Preferentemente, el ESAG se selecciona de entre
el grupo constituido por:
- \bullet
- Monolaurato de sorbitán polietoxilado que comprende 20 unidades de óxido de etileno (O.E.), -TWEEN® 20-;
- \bullet
- Monopalmitato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), TWEEN® 40-;
- \bullet
- Monoestearato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), -TWEEN® 60-;
- \bullet
- Triestearato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), -TWEEN® 65-;
- \bullet
- Monooleato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), -TWEEN® 80-;
- \bullet
- Sesquioleato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), -TWEEN® 83-;
- \bullet
- Trioleato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), -TWEEN® 85-;
- \bullet
- y sus mezclas;
y el AG se selecciona de entre el
grupo constituido por ácidos grasos saturados o insaturados de
C4-C20, preferentemente ácidos grasos saturados o
insaturados de C6-C11, y más preferentemente ácidos
grasos de C8-C9, y sus
mezclas.
Los productos particularmente seleccionados,
según la invención, son ésteres de sorbitán ampliamente usados en
la industria alimentaria y en la industria cosmética como
emulsionantes no iónicos, pero hasta hoy en día nunca se utilizaron
en medios de detección/identificación microbiológicas, como
estabilizadores para sustratos de esterasas y/u osidasas y/o
peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas.
Los "balances
Hidrófilo-Lipófilo" (HLB) de los ESAG mencionados
son, respectivamente: 8,6; 6,7; 4,7; 2,1; 4,3; 3,7; 1,8.
Según una variante interesante de la invención,
el o los agentes estabilizadores-emulsionantes
descritos anteriormente, en particular el o los ESAG, se pueden
asociar con al menos un coagente sinérgico, preferentemente al menos
un tensioactivo aniónico, y preferentemente el hidrogenosulfato de
7-etil-2-metil-4-undecilo
o sus sales, y más particularmente sus sales de sodio
(TERGITOL-4®).
El uso de tal coagente sinérgico facilita
destacar la actividad enzimática en las bacterias diana. Se trata
de un excelente complemento del o de los agentes
estabilizadores-emulsionantes, y en particular ESAG.
Permite mejorar la selectividad y la detección de las actividades
esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas
de los microorganismos diana, sin perjudicar la expresión de otras
actividades enzimáticas que podrían eventualmente ser usadas para
destacar microorganismos diana en cuestión. Sin querer estar unidos
a la teoría, se supone que el coagente sinérgico
TERGITOL-4® tiene una acción que favorece la
penetración de los sustratos esterasas y/u osidasas y/o peptidasas
y/o sulfatasas y/o fosfatasas cromógenos o fluorógenos, o la
excreción de las enzimas a través de las membranas de las células de
los microorganismos diana, optimizando así el acceso de estos
sustratos frente a enzimas de las cuales se busca la actividad. Esto
permite reducir la cantidad de sustrato usado, y proporciona una
ventaja económica segura.
De manera aún más preferida, la asociación
TWEEN® y TERGITOL-4® parece muy productiva en el
medio de detección/identificación según la invención.
El sustrato cromógeno o fluorógeno, constituido
de una parte diana para la enzima y de una parte cromófora o
fluorófora, se elige ventajosamente entre los sustratos cuya parte
diana se selecciona de entre el grupo que consta especialmente
de:
- -
- glicósidos, constituidos por unidades de mono-, di- y/o polisacáridos, unidos en \alpha o \beta a la función hidroxilo de la parte cromófora o fluorófora;
- -
- \alpha-aminoácidos o péptidos;
- -
- ácidos orgánicos, tales como –O-CO(CH_{2})_{n}-CH_{3}, en los que n está comprendido entre 0 y 20; y
- -
- un sulfato, fosfato, pirosulfato, pirofosfato o fosfodiéster;
y cuya parte cromófora o fluorófora se
selecciona de entre el grupo que consta especialmente de:
- -
- quinonas/antraquinonas y derivados, especialmente dihidroxiantraquinona (alizarina);
- -
- amino- o hidroxicumarinas y derivados;
- -
- fluoresceínas y derivados; e
- -
- indoxilos y derivados.
Como ejemplos de sustratos de esterasas, se
pueden citar los sustratos de ésteres cromógenos derivados de
indol, y especialmente nonanoato de
5-bromo-3-indolilo,
nonanoato de
6-cloro-3-indolilo o
decanoato de 5-bromo-3-
indolilo.
indolilo.
A título de ejemplo de sustrato de esterasas
cromógeno derivado de antraquinona, se puede citar el octanoato de
2-alizarina.
Como ejemplos de sustratos de osidasas, se
pueden citar los sustratos de osidasas cromógenos derivados de
indol, y especialmente
6-cloro-3-indol-\beta-galactósido,
5-bromo-4-cloro-3-indol-\beta-N-acetilglucosaminida,
o
5-bromo-6-cloro-\alpha-glucósido.
A título de ejemplo de sustrato de osidasas
cromógeno derivado de antraquinona, se puede citar el
2-alizarin-\beta-glucurónido.
Como sustratos de osidasas fluorógenos, se
pueden citar los sustratos derivados de hidroxicumarina, y
especialmente
4-metilumbeliferona-\beta-glucósido.
Como sustratos de petidasas cromógenas, se
pueden citar los sustratos derivados de indol.
Los sustratos de peptidasas fluorógenas son
especialmente los sustratos derivados de hidroxicumarina, tales
como el
alanil-amino-metilcumarina.
Como sustratos de sulfatasas, se pueden citar
los sustratos cromógenos derivados de indol, en particular sulfato
de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
Los sustratos de sulfatasas fluorógenas son, por ejemplo, sulfato de
4-metilumbelife-
rona.
rona.
De manera equivalente, entre los sustratos de
fosfatasas se pueden citar sustratos cromógenos derivados de indol
tales como fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo.
Los sustratos de fosfatasas fluorógenos son, por ejemplo, fosfato
de 4-metilumbeliferona.
El disolvente S es un auxiliar para solubilizar
el sustrato enzimático de interés, en particular un sustrato
cromógeno. Complementa asimismo la acción del agente estabilizador
emulsionante ESAG, AG o ESAG/AG. Por lo tanto, se trata,
preferentemente, de un constituyente del medio según la
invención.
\newpage
Según una disposición ventajosa de esta última,
el disolvente S se selecciona de entre el grupo constituido
por:
- -
- alcoholes, preferentemente metanol, etanol, metoxietanol,
- -
- amidas, preferentemente dimetilformamida (DMF),
- -
- disolventes azufrados, preferentemente dimetilsulfóxido (DMSO),
- -
- disolventes acuosos, preferentemente agua, agua tamponada,
- -
- y sus mezclas.
En la práctica, los disolventes preferidos
usados son metanol, DMF y DMSO.
En el plano ponderal, se encuentra muy
ventajosa, según la invención, que la proporción de éster de
sorbitán con ácido(s) grasos (ESAG): disolvente (D) esté
comprendida entre 20:80 y 80:20, preferentemente entre 30:70 y
70:30, y más preferentemente aún corresponde a 40:60 ó 60:40.
Desde el punto de vista del sustrato cromógeno o
fluorógeno, las cantidades usadas son tales que su concentración en
el medio se define según lo siguiente (en mg/l):
\vskip1.000000\baselineskip
| 1 \leq [sustrato] \leq 2000, | ||
| preferentemente | 5 \leq [sustrato] \leq 1500, | |
| aún más preferentemente | 25 \leq [sustrato] \leq 1000. |
\vskip1.000000\baselineskip
Refiriéndose al sustrato en la disolución ESAG y
del disolvente S, las cantidades usadas son tales que su
concentración en el medio se define según lo siguiente (en g/l):
\vskip1.000000\baselineskip
| 0,5 \leq [sustrato en la disolución madre] \leq 2000, | ||
| preferentemente | 1 \leq [sustrato en la disolución madre] \leq 1000, | |
| aún más preferentemente | 2 \leq [sustrato en la disolución madre] \leq 200, |
\vskip1.000000\baselineskip
Con respecto al medio de cultivo presente en el
medio detección/identificación, se puede especificar que se
selecciona de entre el grupo constituido por:
- -
- medios selectivos de tipo: Mac Conkey, Columbia ANC, PALCAM, y Sabouraud Gentamicina-cloranfenicol, preferentemente el medio Mac Conkey,
- -
- medios no selectivos de tipo Columbia +/- sangre, soja de Tripcasa, Gelosa nutritiva, Sabouraud, preferentemente el medio Columbia.
En la práctica, el experto en la materia elegirá
el medio de cultivo en función de las bacterias diana, según
criterios perfectamente conocidos y al alcance del experto en la
materia.
Sin que sea limitativo, parece que el medio
según la invención está particularmente adaptado para la
detección/identificación de microorganismos de interés médico o
industrial, y especialmente los del tipo Salmonella, Pseudomonas,
Listeria, Staphylococcus, Enterococcus o Candida.
En el caso de la detección de bacterias de tipo
Salmonella, se elegirá, por ejemplo, el medio de Mac Conkey
como medio de cultivo.
Por otra parte, el medio según la invención
puede contener otros aditivos eventuales, tales como, por ejemplo,
uno o varios otros sustratos enzimáticos, por ejemplo cromógenos o
fluorógenos, peptonas, uno o varios factores de crecimiento,
hidratos de carbono, uno o varios agentes selectivos, tampones, y
uno o varios agentes gelifican-
tes.
tes.
El medio según la invención se puede presentar
en forma de líquido o de gel "listo para uso", es decir, listo
para la inoculación en un tubo, matraz o en cápsulas de Petri.
El medio según la invención se puede conservar
varias semanas a 4ºC en recipientes, y en forma líquida o de
gel.
gel.
Según otro de sus aspectos, la presente
invención tiene asimismo como objetivo un procedimiento de obtención
del medio tal como se define anteriormente, caracterizado porque
consiste sustancialmente en:
- -
- preparar al menos una disolución madre del sustrato de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, cromógeno o fluorógeno, en el disolvente S, y al menos un ESAG, AG o mezcla ESAG/AG,
- -
- añadir esta disolución y eventualmente otros aditivos al medio de cultivo, y
- -
- homogeneizar el conjunto.
La preparación de la disolución madre se efectúa
de manera separada, incorporando sucesivamente el sustrato, el
disolvente S y el ESAG, AG o mezcla de ESAG/AG, eventualmente
coaditivos. Los productos y las cantidades usados son tales como se
definen anteriormente.
Después de homogeneizar, la disolución madre se
añade al medio de cultivo de agar-agar
sobreenfriado, que se ha regenerado previamente en agua. Se puede
tratar asimismo de un medio líquido no agar-agar,
como por ejemplo un caldo nutritivo.
Después de mezclar el medio de cultivo y la
disolución madre, se obtiene el medio de detección líquido o de
agar-agar, listo para la inoculación.
Según otro de sus aspectos, la invención tiene
asimismo por objeto un procedimiento de detección/identificación de
cepas con actividad esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o
sulfatasas y/o fosfatasas, que consiste en:
- -
- inocular el medio de detección/identificación tal como se define anteriormente, ya sea como un producto como tal o como un producto obtenido mediante el procedimiento descrito anteriormente, conteniendo la muestra las bacterias diana a analizar;
- -
- incubar el medio inoculado en condiciones apropiadas conocidas por el experto en la materia; y
- -
- leer/interpretar las coloraciones o fluorescencias de las colonias que se hayan desarrollado después de la incubación, por ejemplo, en un horno a 37ºC; destacando estas coloraciones la hidrólisis del sustrato de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, cromógeno o fluorógeno, por las bacterias diana.
Finalmente, la invención se refiere asimismo al
uso de éster(es) de sorbitán y de ácido(s)
graso(s) (ESAG), de ácidos grasos (AG) o de una mezcla de
ESAG/AG, como agente estabilizador-emulsionante de
medio (líquido o agar-agar) de
detección/identificación de microorganismos, especialmente de
bacterias o de levaduras, con actividad enzimática elegida entre
las actividades esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas
y/o fosfatasas, comprendiendo este medio especialmente un medio de
reacción y al menos un sustrato de esterasas y/u osidasas y/o
peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, cromógeno o fluorógeno,
salvo los sustratos que comprenden un carboxilato de
4-[2-(4-octanoiloxi-3,5-dimetoxifenil)-vinil]-quinolinio-1-(propan-3-ilo)
y un anión, eventualmente en asociación con al menos un disolvente
S del sustrato de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o
sulfatasas y/o fosfatasas, cromógeno o fluorógeno, presente en el
medio.
Los ejemplos siguientes permitirán comprender
mejor la invención, y permitirá evaluar todas las ventajas, así
como sus diversas variantes de realización y de utilización.
Ejemplo
1
Se preparan distintas disoluciones madre de
sustrato en metanol, en presencia de sales biliares nº3
(bioMérieux). Después, se añaden distintos volúmenes de estas
disoluciones en un medio de agar-agar sobreenfriado,
es decir, el medio Mac Conkey (regenerado en agua a una
concentración de 50 g/l).
El protocolo y la observación del aspecto de los
medios se dan en la tabla 1 siguiente.
Los medios más ópticamente homogéneos son los
medios 3, 4 y 5, medios en los que la concentración de metanol es
la más elevada. Sin embargo, el aspecto de estos medios es
"lechoso": por lo tanto, parece que el sustrato de esterasa
está en forma de emulsión.
Ejemplo
2
Se preparan dos disoluciones madre de sustrato
distintos en el disolvente S/metanol, una en presencia de sales
biliares nº3, y la otra en presencia de sales biliares nº3 y Tween
®20 [monolaurato de sorbitán polietoxilado, que comprende 20
unidades de óxido de etileno (O.E)]. Después, se añade un volumen
que corresponde a una concentración final de 500 mg/l de sustrato a
un medio de cultivo de agar-agar sobreenfriado: el
medio Mac Conkey. El protocolo y la observación del aspecto de los
medios se muestran en la tabla 2 siguiente.
| Medio | 1 | 2 |
| Concentración de sustrato de la disolución madre | 100 g/l | 40 g/l |
| Concentración final de sustrato del medio | 500 mg/l | 500 mg/l |
| Concentración de sales biliares de la disolución madre | 5 g/l | 5 g/l |
| Concentración total de sales biliares del medio | 6,5 g/l | 6,5 g/l |
| Concentración de Tween® 20 añadido a la disolución | 0% | 60% |
| madre de sustrato | ||
| Concentración de Tween® 20 añadido al medio | 0% | 2,5% |
| Observación del medio vertido en placas | Medio lechoso | Medio translúcido |
El medio 2 presenta una mejor homogeneidad
óptica que el medio 1. O bien el sustrato de esterasa está
completamente disuelto, o bien está en forma de una emulsión cuyas
partículas micelares ya no son visibles al ojo.
\newpage
Ejemplo
3
Se inocularon microorganismos, que proceden de
la colección del Solicitante, en cada uno de los dos medios
anteriormente descritos, por aislamiento en tres cuadrantes, a
partir de una suspensión de McFarland 0,5. Las placas se incubaron
a 37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas se examinaron
visualmente después de 24 y 48 horas de incubación. Se anotaron la
coloración de estas colonias así como la intensidad de esta
coloración. Los resultados se presentan en la tabla 3
siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo de incubación | medio 1 | medio 2 | |||
| Cepas | color | intensidad | color | intensidad | |
| Salmonella typhimurium 10 | 24 h | gris | 1,5 | gris | 3 |
| 48 h | gris | 1,5 | gris | 3,5 | |
| Salmonella paratyphi A 152 | 24 h | gris | 1 | gris | 3 |
| 48 h | gris | 1,5 | gris | 3,5 | |
| Proteus vulgaris 15 | 24 h | - | - | - | - |
| 48h | - | - | - | - | |
| Serratia marcescens 13 | 24 h | gris | 1,5 | gris | 3 |
| 48 h | gris | 1 | gris | 4 | |
| Intensidad de coloración: escala arbitraria; -: ausencia de coloración y de intensidad |
\vskip1.000000\baselineskip
El medio que contiene Tween® 20 permite por lo
tanto obtener coloraciones más intensas para las cepas de
microorganismos que presentan una actividad de esterasa. Por lo
tanto, el sustrato se usa más ampliamente, bien porque se disuelve
mejor o bien porque está más disponible. A la vista de la diferencia
de intensidad entre los dos medios, parece posible, en presencia de
Tween® 20, reducir la concentración de sustrato usado y por lo tanto
reducir el coste generado por el uso de este tipo de sustrato.
Ejemplo
4
Se preparó una disolución madre al 40 g/l de
octanoato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(sustrato de esterasa cromógeno) en una mezcla metanol (40%)
y Tween® 20 (60%). Después, se añadió un volumen que corresponde a
una concentración final de 500 mg/l de sustrato en un medio de
agar-agar sobreenfriado: un medio tipo Columbia.
Este medio se vertió en cápsulas de Petri.
Se inocularon microorganismos, que proceden de
la colección del Solicitante, mediante aislamiento en tres
cuadrantes, a partir de una suspensión de McFarland 0,5. Después,
las cápsulas se incubaron a 37ºC durante 48 horas. Las colonias
formadas se examinaron visualmente después de 24 y 48 horas de
incubación. Se anotó la coloración de estas colonias, así como la
intensidad de esta coloración. Los resultados se presentan en la
tabla 4
siguiente.
siguiente.
| Tiempo de incubación | Medio 1 | |||
| cepas | color | intensidad | ||
| Listeria monocytogenes | 24 h | turquesa | 2,5 | |
| 023 | 48 h | turquesa | 2,5 | |
| Listeria innocua | 24 h | - | - | |
| 029 | 48 h | turquesa | 0,5 | |
| Staphylococcus aureus | 24 h | turquesa | 2,5 | |
| 276 | 48 h | turquesa | 3 | |
| Candida albicans | 24 h | turquesa | 0,5 | |
| 033 | 48 h | turquesa | 3 | |
| Staphylococcus epidermidis | 24 h | turquesa | 2 | |
| 009 | 48 h | turquesa | 2 | |
| Salmonella spp. | 24 h | turquesa | 2 | |
| 017 | 48 h | turquesa | 3 | |
| Proteus vulgaris | 24 h | - | - | |
| 015 | 48 h | - | - | |
| Intensidad de coloración: escala arbitraria; -: ausencia de coloración y de intensidad |
Por lo tanto, en presencia de Tween 20, es
posible destacar la expresión de una actividad de esterasa en todos
los microorganismos que la poseen, independientemente del grupo al
que pertenecen. Por otra parte, este modo de uso es independiente
del derivado de indoxilo (sustrato de esterasa cromógeno)
estudiado.
Ejemplo
5
Se sustituyó el metanol usado en los ejemplos
anteriores por dos otros disolventes, dimetilsulfóxido (DMSO) y
dimetilformamida (DMF). Se ensayaron los tres disolventes en
presencia de Tween 20, y en presencia o en ausencia de sales
biliares a una concentración final en el medio de 6,5 g/l. La tabla
5 siguiente muestra la composición de los seis medios
ensayados.
La actividad del sustrato se verificó de la
misma manera que en el ejemplo anterior, es decir, en presencia de
microorganismos inoculados en un medio de agar-agar
Mac Conkey que contiene el sustrato de esterasa disuelto en uno de
los disolventes citados anteriormente. Los resultados se presentan
en la tabla 6 siguiente.
Por lo tanto, es posible usar disolventes
distintos para disolver el sustrato de esterasa cuando el Tween 20
está presente. Por otra parte, la adición de sales biliares no
aporta nada, ya sea en términos de solubilidad o en términos de
resultados biológicos, independientemente del disolvente ensayado.
Conclusión, el modo de disolución más sencillo es la mezcla de un
disolvente y de Tween® 20 sin aportación suplementaria de sales
biliares.
Ejemplo
6
Se prepararon distintas disoluciones madre de
sustrato en DMSO en presencia de Tween ® 20. Cada disolución madre
corresponde a una relación DMSO/Tween ® 20 distinta. Después, se
añade un volumen correspondiente a una concentración final de 500
mg/l de sustrato en un medio de agar-agar
sobreenfriado: el medio Mac Conkey. La tabla 7 siguiente muestra la
composición de los seis medios ensayados.
| Medio | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| % de DMSO en la disolución madre | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% | 60% |
| % de Tween ® 20 añadido a la disolución madre de sustrato | 90% | 80% | 70% | 60% | 50% | 40% |
Se inocularon microorganismos, que proceden de
la colección del Solicitante, sobre cada uno de los seis medios
descritos anteriormente, por aislamiento en tres cuadrantes, a
partir de una suspensión McFarland 0,5. Se incubaron las cápsulas a
37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas se examinaron
visualmente después de 24 y 48 horas de incubación. Se anotó la
coloración de estas colonias, así como la intensidad de esta
coloración. Los resultados se presentan en la tabla 8
siguiente.
Las seis relaciones ensayadas permiten obtener
una buena solubilidad de los sustratos, y destacar la hidrólisis
del sustrato con intensidades de coloración muy buenas. Las
intensidades de coloración máximas se obtienen entre las relaciones
40% de DMSO/60% de Tween® 20 y 60% de DMSO/40% de Tween® 20.
Ejemplo
7
El sustrato ensayado es el octanoato
1,2-dihidroxiantraquinona (octanoato de
2-alizarina). Se preparan distintas disoluciones
madre de sustrato usando como disolvente DMF o DMSO o metanol o
metoxietanol, y, en todos los casos, en presencia de Tween® 20. La
tabla 9 siguiente muestra el aspecto de las disoluciones madre en
función de su composición.
Después, se añade un volumen que corresponde a
una concentración final de 100 mg/l de sustrato en un medio de
agar-agar sobreenfriado: el medio Mac Conkey. Se
añade asimismo citrato de hierro a una concentración final de 50
mg/l al medio, a fin de permitir la revelación de la actividad de
esterasa en presencia de un sustrato a base de alizarina. Sólo se
ensayó una de las disoluciones madre que presenta una disolución
total del sustrato (disolución madre en DMF). Se inocularon
microorganismos, que proceden de la colección del Solicitante, sobre
cada uno de los dos medios anteriormente descritos, mediante
aislamiento en tres cuadrantes, a partir de una suspensión
McFarland 0,5. Las cápsulas se incubaron a 37ºC durante 48 horas.
Las colonias formadas se examinaron visualmente después de 24 y 48
horas de incubación. Se anotaron la coloración de estas colonias,
así como la intensidad de esta coloración. Los resultados se
presentan en la tabla 10.
| Tiempo de incubación | Medio con DMF | |||
| Cepas | color | intensidad | ||
| Salmonella typhimurium | 24 h | malva | 1 | |
| 10 | 48 h | malva | 2 | |
| Salmonella enteritidis | 24 h | malva | 1 | |
| 036 | 48 h | malva | 3 | |
| Salmonella arizonae | 24 h | malva | 1 | |
| 018 | 48 h | malva | 2 | |
| Escherichia coli | 24 h | - | - | |
| 002 | 48 h | - | - | |
| Serratia marcescens | 24 h | malva | 3,5 | |
| 045 | 48 h | malva | 3,5 | |
| Staphylococcus aureus | 24 h | malva | 3 | |
| 033 | 48 h | malva | 4 | |
| Pseudomonas aeruginosa | 24 h | malva | 2 | |
| 165 | 48 h | malva | 2 |
| Tiempo de incubación | Medio con DMF | |||
| Cepas | color | intensidad | ||
| Salmonella gallinarum | 24 h | malva | 0,5 | |
| 500 | 48 h | malva | 3 | |
| I: Intensidad de coloración: escala arbitraria; -: ausencia de coloración y de intensidad |
Por lo tanto, este modo de disolución no es
específico de los ésteres de indoxilo, pero se puede usar
especialmente con otras familias de sustratos enzimáticos.
Ejemplo
8
Se preparan distintas disoluciones madre de
sustrato en DMSO, en presencia de Tween® 20 o Tween® 80 (monooleato
de sorbitán polietoxilado), o Tween® 60 (monoestearato de sorbitán
polietoxilado), o Tween® 65 (triestearato de sorbitán
polietoxilado). Después, se añade un volumen que corresponde a una
concentración final de 500 mg/l de sustrato en un medio de
agar-agar sobreenfriado: el medio Mac Conkey. La
tabla 11 muestra la composición de los medios ensayados.
| Medio | 1 | 2 | 3 | 4 |
| % de DMSO en la disolución madre | 40% | 40% | 40% | 40% |
| % de Tween 20 añadido a la disolución madre de sustrato | 60% | - | - | - |
| % de Tween 60 añadido a la disolución madre de sustrato | - | 60% | - | - |
| % de Tween 65 añadido a la disolución madre de sustrato | - | - | 60% | - |
| % de Tween 80 añadido a la disolución madre de sustrato | - | - | - | 60% |
Se inocularon microorganismos, que proceden de
la colección del Solicitante, en cada uno de los seis medios
descritos anteriormente, mediante aislamiento en tres cuadrantes, a
partir de una suspensión Mc Farland 0,5. Se incubaron las cápsulas
a 37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas se examinaron
visualmente después de 24 y 48 horas de incubación. Se anotó la
coloración de estas colonias, así como la intensidad de esta
coloración. Los resultados se presentan en la tabla 12.
Nota: se prepararon distintas relaciones de
Tween®/disolvente para cada Tween® ensayado. Sin embargo, se da
sólo una relación en este ejemplo, porque los resultados eran muy
similares independientemente de la relación estudiada.
El Tween® 20, Tween® 80 y Tween® 60 permiten
obtener una buena solubilidad de los sustratos, y destacar la
hidrólisis del sustrato con intensidades muy satisfactoria.
Ejemplo
9
Se prepararon dos disoluciones madre: una con 40
g/l en metanol en presencia de 6,5 g/l de sales biliares nº3, la
otra con 40 g/l en una mezcla de DMSO (40%) y Tween® 20 (60%).
Después, se añadió un volumen que corresponde a una concentración
final de 500 mg/l de sustrato en un medio de
agar-agar sobreenfriado, el medio Mac Conkey. Se
vertieron estos dos medios en cápsulas de Petri de un diámetro de 90
mm, y se almacenaron a +4ºC durante 8 semanas. Después de una
semana, dos semanas, cuatro semanas y ocho semanas, se prepararon
extemporáneamente dos medios iguales a los descritos
anteriormente.
Se inocularon microorganismos, que proceden de
la colección del Solicitante, por aislamiento en tres cuadrantes, a
partir de una suspensión McFarland 0,5, sobre los dos medios
preparados extemporáneamente, y sobre los dos medios conservados a
+4ºC. Se incubaron las cápsulas a 37ºC durante 48 horas. Las
colonias formadas se examinaron visualmente después de 24 y 48
horas de incubación. Se anotaron la coloración de estas colonias,
así como la intensidad de esta coloración. Los resultados se
presentan en las tablas siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El medio que contiene el sustrato disuelto en
una mezcla de metanol u sales biliares presenta una caída muy
importante de la expresión de la actividad de esterasa después de 2
semanas de conservación. Esta caída se amplifica con el tiempo. El
medio que contiene el sustrato disuelto en la mezcla de DMSO y Tween
20 presenta una expresión de la actividad de esterasa constante en
el tiempo, hasta por lo menos seis semanas. Después de ocho
semanas, hay una ligera caída de la expresión de la actividad de
esterasa, pero que no es prohibitiva. El Tween 20 permite por lo
tanto estabilizar el sustrato de esterasa, y facilita la
conservación y el uso de medios de cultivo que contienen este tipo
de sustrato.
Nota: En los ejemplos anteriormente, los números
siguientes a las cepas corresponden al número de cada cepa
referenciada en la colección del Solicitante. La intensidad de
coloración corresponde a una escala arbitraria cuya significado es
la siguiente:
| 0 | ninguna actividad | |
| 0,1 | traza de coloración | |
| 0,5 | coloración muy pálida | |
| 1 | coloración neta de baja intensidad | |
| 2 | clara coloración de intensidad media | |
| 3 | coloración intensa | |
| 4 | coloración muy intensa |
Ejemplo
10
Se preparan dos disoluciones madre de sustrato:
una con 50 g/l en DMF, la otra con 50 g/l en una mezcla de DMF
(40%) y Tween® 20 (60%). Después, se añade un volumen que
corresponde a una concentración final de 175 mg/l de sustrato en un
medio de agar-agar sobreenfriado, el medio Columbia
sin sangre. Estos dos medios se vertieron en cápsulas de Petri de
un diámetro de 90 mm, y se almacenaron a +4ºC durante 8 semanas.
Después de tres semanas, seis semanas, nueve semanas y doce
semanas, se prepararon dos medios extemporáneamente iguales a los
descritos anteriormente.
Se inocularon microorganismos, que proceden de
la colección del Solicitante, por aislamiento en tres cuadrantes, a
partir de una suspensión McFarland 0,5, sobre los dos medios
preparados extemporáneamente, y sobre los dos medios se conservaron
a +4ºC. Las cápsulas se incubaron a 37ºC durante 48 horas. Las
colonias formadas se examinaron visualmente después de 24 y 48
horas de incubación. Se anotaron la coloración de estas colonias,
así como la intensidad de esta coloración. Los resultados se
presentan en las tablas siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El medio que contiene el sustrato disuelto en
DMF solo presenta una caída muy importante de expresión de la
actividad de
\beta-N-acetilglucosaminidasa
después de tres semanas de conservación. Esta caída se amplifica
con el tiempo. Ya no es posible detectar una actividad después de
doce semanas. El medio que contiene el sustrato disuelto en la
mezcla de DMF y Tween 20 presenta una expresión de la actividad de
\beta-N-acetilglucosaminidasa
constante en el tiempo, hasta al menos seis semanas. Después de
nueve y doce semanas, existe una ligera caída de la expresión de la
actividad de
\beta-N-acetilglucosaminidasa,
pero que no es prohibitiva. El Tween 20 permite por lo tanto
estabilizar el sustrato de
\beta-N-acetilglucosaminidasa, y
facilita la conservación y el uso de medios de cultivo que
contienen este tipo de sustratos.
\newpage
En los ejemplos anteriormente, los números
siguientes a las cepas corresponden a los números de cada cepa
referenciada en la colección del Solicitante. La intensidad de
coloración corresponde a una escala arbitraria cuya significación
es la siguiente:
| 0 | ninguna actividad | |
| 0,1 | traza de coloración | |
| 0,5 | coloración muy pálida | |
| 1 | coloración neta de baja intensidad | |
| 2 | clara coloración de intensidad media | |
| 3 | coloración intensa | |
| 4 | coloración muy intensa |
Claims (14)
1. Medio de detección/identificación de
microorganismos, y en particular de bacterias y/o de levaduras con
actividad enzimática, seleccionada de entre las actividades de
esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o
fosfatasas, del tipo de los que comprenden especialmente un medio de
reacción, y al menos un sustrato de esterasas y/u osidasas y/o
peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, cromógeno o fluorógeno,
excluyendo los sustratos que comprenden un catión de
4-[2-(4-octanoiloxi-3,5-dimetoxifenil)-vinil]-quinolinio-1-(ácido
propan-3-il-carboxílico)
y un anión, basándose esta detección/identificación sustancialmente
en la revelación de la actividad esterasa y/o osidasa y/o peptidasa
y/o sulfatasa y/o fosfatasa, dicho medio:
- \text{*}
- está en forma líquida o gel listo para uso y estable para la conservación, es decir, la intensidad de la coloración o la fluorescencia se mantiene a un nivel máximo al menos durante varias semanas;
- \text{*}
- comprende:
- -
- al menos un éster de sorbitán con ácido(s) grasos(s) (ESAG), o al menos un ácido graso (AG), o una mezcla de ESAG/AG, como agente estabilizador-emulsionante,
- -
- la concentración de [ESAG] en el medio se define según lo siguiente (% en peso): 0,5 \leq [ESAG] \leq 5, preferentemente 1,5 \leq [ESAG] \leq 3,5;
- -
- y eventualmente al menos un disolvente (S).
2. Medio según la reivindicación 1,
caracterizado porque se obtiene mezclando al menos una
disolución madre de sustrato en el disolvente S y ESAG, AG o mezcla
de ESAG/AG, con al menos una parte de los constituyentes del medio
de cultivo.
3. Medio según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el ESAG se selecciona de entre el grupo
constituido por:
- \bullet
- Monolaurato de sorbitán polietoxilado que comprende 20 unidades de óxido de etileno (O.E.), -TWEEN® 20-;
- \bullet
- Monopalmitato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), TWEEN® 40-;
- \bullet
- Monoestearato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), -TWEEN® 60-;
- \bullet
- Triestearato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), -TWEEN® 65-;
- \bullet
- Monooleato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), -TWEEN® 80-;
- \bullet
- Sesquioleato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), -TWEEN® 83-;
- \bullet
- Trioleato de sorbitán polietoxilado (20 O.E.), -TWEEN® 85-;
- \bullet
- y sus mezclas;
4. Medio según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el AG se selecciona de entre el grupo
constituido por ácidos grasos saturados o insaturados de
C4-C20, preferentemente ácidos grasos saturados o
insaturados de C6-C11 y más preferentemente ácidos
grasos de C8-C9; y sus mezclas.
5. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende
asimismo al menos un tensioactivo aniónico, preferentemente
hidrogenosulfato de
7-etil-2-metil-4-undecilo
o sus sales, y más particularmente sus sales de sodio
(TERG1TOL-4®).
6. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el sustrato
cromógeno o fluorógeno está constituido de una parte diana de la
enzima, y de una parte cromófora o fluorófora, siendo la parte diana
seleccionada de entre el grupo constituido en particular por:
- -
- glicósidos, constituidos por unidades de mono-, di- y/o polisacaridos, unidos en \alpha o en \beta a la función hidroxilo de la parte fluorófora o cromófora;
- -
- los ácidos \alpha-aminados o péptidos;
- -
- ácidos orgánicos, tales como –O-CO(CH_{2})_{n}-CH_{3}, con n comprendido entre 0 y 20;
- -
- sulfato, fosfato, pirosulfato, pirofosfato o fosfodiéster;
siendo la parte cromófora o fluorófora
seleccionada de entre el grupo constituido en particular por:
- -
- quinonas/antraquinonas y derivados, especialmente dihidroxiantraquinona (alizarina);
- -
- amino- o hidroxicumarinas y derivados;
- -
- fluoresceínas y derivados;
- -
- indoxilos y derivados.
7. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el disolvente S
se selecciona de entre el grupo constituido por:
- -
- alcoholes, preferentemente metanol, etanol, metoxietanol;
- -
- amidas, preferentemente dimetilformamida (DMF);
- -
- disolventes azufrados, preferentemente dimetilsulfóxido (DMSO);
- -
- disolventes acuosos, preferentemente agua, agua tamponada;
- -
- y sus mezclas.
8. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la proporción
ponderal de éster de sorbitán con ácido(s) graso(s)
(ESAG): disolvente(s) está comprendida entre 20:80 y 80:20,
preferentemente está comprendida entre 30:70 y 70:30, y más
preferentemente aún corresponde a 40:60 ó 60:40.
9. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la concentración
en [sustrato] en el medio se define según lo siguiente (en
mg/l):
10. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el medio de
cultivo que comprende se selecciona de entre el grupo constituido
por:
- -
- los medios selectivos de tipo: Mac Conkey, Columbia ANC, PALCAM, Sabouraud Gentamicina-cloranfenicol, preferentemente el medio Mac Conkey,
- -
- los medios no selectivos de tipo Columbia +/- sangre, soja de Tripcasa, Gelosa nutritiva, Sabouraud, preferentemente el medio Columbia.
11. Medio según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los
microorganismos a detectar/identificar son parte de los
microorganismos de interés médico o industrial, y especialmente los
del género Salmonella, Pseudomonas, Listeria, Staphylacoccus,
Enterococcus o Candida.
12. Procedimiento de obtención del medio según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado
porque consiste sustancialmente en:
- -
- preparar al menos una disolución madre de sustrato de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, cromógeno o fluorógeno, en el disolvente S, y al menos un ESAG, AG o mezcla de ESAG/AG,
- -
- añadir esta disolución y eventualmente otros aditivos al medio de cultivo, y
- -
- homogeneizar el conjunto.
13. Procedimiento de detección/identificación de
cepas con actividad esterasa y/o osidasa y/o peptidasa y/o
sulfatasa y/o fosfatasa, caracterizado porque consiste
en:
- -
- inocular el medio según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o el medio obtenido mediante el procedimiento de la reivindicación 12, con las bacterias a analizar;
- -
- incubar el medio inoculado en condiciones apropiadas; y
- -
- leer e interpretar las coloraciones alrededor de las colonias, coloraciones las cuales revelan la hidrólisis del sustrato por las bacterias.
14. Uso de éster(es) de sorbitán con
ácido(s) graso(s), de ácido(s) graso(s)
(AG) o de ESAG/AG, como agente
estabilizador-emulsionante de medio (líquido o de
gel) de detección/identificación de microorganismos, especialmente
de bacterias o de levaduras, con actividad enzimática elegida entre
las actividades esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o
sulfatasas y/o fosfatasas, comprendiendo este medio especialmente un
medio de cultivo y al menos un sustrato de esterasas y/u osidasas
y/o peptidasas y/o sulfatasas y/o fosfatasas, cromógeno o
fluorógeno, excluyendo los sustratos que comprenden un carboxilato
de
4-[2-(4-octanoiloxi-3,5-dimetoxifenil)-vinil]-quinolinio-1-(propan-3-il)o
y un anión, eventualmente en asociación con al menos un disolvente
S del sustrato de esterasas y/u osidasas y/o peptidasas y/o
sulfatasas y/o fosfatasas, cromógeno o fluorógeno, presente en el
medio; estando la concentración de [ESAG] en el medio definida
según lo siguiente (% en peso): 0,5 \leq [ESAG] \leq 5,
preferentemente 1,5 \leq [ESAG] \leq 3,5.
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Family Cites Families (17)
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|---|---|---|---|---|
| US3878050A (en) * | 1974-04-01 | 1975-04-15 | Coors Co Adolph | Multi-differential agar culture medium |
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| US4994376A (en) * | 1987-05-27 | 1991-02-19 | The Research Foundation Of State University Of Ny | Detection of bacteroides gingivalis |
| US4906573A (en) * | 1987-07-28 | 1990-03-06 | Miller Brewing Company | Culture medium for detection of beer spoilage microorganisms |
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