ES2266432T3 - Procedimiento para el diagnostico de la obesidad. - Google Patents
Procedimiento para el diagnostico de la obesidad. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2266432T3 ES2266432T3 ES02293085T ES02293085T ES2266432T3 ES 2266432 T3 ES2266432 T3 ES 2266432T3 ES 02293085 T ES02293085 T ES 02293085T ES 02293085 T ES02293085 T ES 02293085T ES 2266432 T3 ES2266432 T3 ES 2266432T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gad2
- baselineskip
- obesity
- gene
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 title claims abstract description 65
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 23
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims abstract description 17
- 208000012696 congenital leptin deficiency Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 208000001022 morbid obesity Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 26
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 26
- 102100035857 Glutamate decarboxylase 2 Human genes 0.000 claims description 25
- 101000873786 Homo sapiens Glutamate decarboxylase 2 Proteins 0.000 claims description 25
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 claims description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 102000017182 Ikaros Transcription Factor Human genes 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-Glutamic acid Natural products OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 3
- 108010013958 Ikaros Transcription Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 125000003338 L-glutaminyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 2
- 239000000883 anti-obesity agent Substances 0.000 claims 2
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 claims 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 27
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 12
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 230000004634 feeding behavior Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 206010013142 Disinhibition Diseases 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 235000019606 astringent taste Nutrition 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 4
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 4
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 3
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 3
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 3
- 230000001956 orexigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- 102100037799 DNA-binding protein Ikaros Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102400000921 Gastrin Human genes 0.000 description 1
- 108010052343 Gastrins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000599038 Homo sapiens DNA-binding protein Ikaros Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 1
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000005082 bioluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N chembl413654 Chemical compound C([C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AOXOCDRNSPFDPE-UKEONUMOSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001222 gaba-ergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010024780 glutamate decarboxylase 2 Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 haptens Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 206010022498 insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000891 luminescent agent Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 208000021255 pancreatic insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/172—Haplotypes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Procedimiento para el diagnóstico de una predisposición a la obesidad, y en particular a la obesidad mórbida, en un sujeto humano, que comprende determinar si existe una alteración en la línea germinal en la secuencia de la región 5¿ flanqueante del gen gad2, la secuencia codificante del cual se encuentra representada por la SEC ID nº 1, en la que dicha alteración es la presencia de por lo menos una de las mutaciones siguientes: -243 A>G en el
Description
Procedimiento para el diagnóstico de la
obesidad.
La invención se encuentra comprendida en el
campo de la genética humana y se refiere a nuevos procedimientos
para el diagnóstico y la terapia de la obesidad, en particular de la
obesidad mórbida, basados en la identificación de polimorfismos en
la región 5' del gen gad2.
La obesidad mórbida es un proceso patológico
grave, en el que la acumulación de tejido graso en el cuerpo se
convierte en excesiva, interfiere o daña los demás órganos
corporales, y crea (o creará previsiblemente) problemas de salud
graves y potencialmente letales, denominados comorbilidades.
Se dice que una persona es mórbidamente obesa
cuando su índice de masa corporal (IMC = altura (cm)/(masa
(kg))^{2}) es igual o superior a 40.
Numerosos estudios científicos han establecido
que existe una predisposición genética a la obesidad mórbida.
Se ha implicado en la obesidad una región del
cromosoma 10 (Hager et al., Nature Genetics
20:304-38, 1998), confirmada recientemente en una
cohorte de sujetos jóvenes obesos alemanes (Hinney et al.,
Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism
85(8):2962-5, 2000), así como en caucasianos
blancos y en afroamericanos (Price et al., 2001, Diabetologia
42:555-9, 1999) y en la vieja sociedad de los Amish
(Hsueh et al., The Journal of Clinical Endocrinology and
Metabolism 86(3):1199-1205, 2001).
Se han identificado tres nuevos polimorfismos de
nucleótidos (SNP) en el marco de la invención, localizados en esta
región, y más particularmente en la región 5' del gen gad2.
Estos SNP muestran una asociación positiva con la obesidad en los
sujetos mórbidamente obesos, mientras que otros SNP en esta región
no muestran esta asociación.
En el marco de la presente invención, la
expresión "gen gad2" pretende indicar un gen cuya
secuencia codificante se encuentra representada por la SEC ID nº
1.
La región 5' flanqueante del gen gad2
pretende indicar la región que comprende los nucleótidos
1-2.379 de la SEC ID nº 2, y especialmente la región
que consiste en los nucleótidos 1-2.379 de la SEC ID
nº 2. Los nucleótidos 2.380-2.382 de la SEC ID nº 2
representan el codón de inicio del gen gad2 (ATG).
De esta manera, en una primera forma de
realización, la invención se refiere a un procedimiento para el
diagnóstico de la predisposición a la obesidad, y en particular a la
obesidad mórbida, en un sujeto humano, que comprende determinar si
existe una alteración de la línea germinal en la secuencia de la
región 5' flanqueante del gen gad2, en el que dicha
alteración es la presencia de por lo menos una de la mutaciones
siguientes: -243 A>G en el nucleótido 2.137 de la SEC ID nº 2,
-1,6 kb G>A en el nucleótido 780 de la SEC ID nº 2, -2004 A>T
en el nucleótido 376 de la SEC ID nº 2, siendo dicha alteración
indicativa de una predisposición a la obesidad.
La región 5' flanqueante del gen gad2 se
encuentra representada por los nucleótidos 1 a 2.379 de la SEC ID nº
2, y los SNP de acuerdo con la invención se encuentran localizados
en los nucleótidos 376 (presencia de una T en pacientes
predispuestos, y una A en los pacientes no predispuestos), 780
(presencia de una A en pacientes predispuestos, y una G en pacientes
no predispuestos), y 2.137 (presencia de una G en pacientes
predispuestos, y de una A en pacientes no predispuestos) de la SEC
ID nº 2.
La invención se refiere de manera más general al
estudio de la región promotora 5' del gen gad2. En efecto,
los inventores han demostrado que la presencia de los SNP
específicos indicados en la presente solicitud conducen a una unión
incrementada de los factores nucleares a la región 5' del gen
gad2, conduciendo de esta manera a un incremento de la
transcripción.
De esta manera, resulta creíble especular que
otras modificaciones en la región promotora del gen gad2,
conduciendo a una expresión más elevada de la proteína GAD2
también conducirán a una predisposición a la obesidad, debido al
incremento en la reserva de GABA. Debido al efecto orexigénico de
GABA, esto puede alterar el comportamiento de alimentación.
De esta manera, en una forma de realización, la
invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de una
predisposición a la obesidad en un sujeto humano, en el que se
investiga el nivel de un producto de expresión del gen gad2
en dicha muestra.
Los productos de expresión de acuerdo con la
invención deben comprender ARN o proteína, o lo que podría llamarse
producto de expresión "secundario", tal como GABA. Este último
de hecho no es realmente un producto de expresión del gen
gad2, pero el incremento de la producción de la proteína
GAD2 conduce al incremento de la concentración de GABA.
La alteración de la expresión de ARNm puede
detectarse mediante cualquier técnica conocida en la técnica. Entre
éstas pueden incluirse el análisis de transferencia northern, la
amplificación por PCR y la protección frente a ARNasas.
En una forma de realización, el ARNm de la
muestra se pone en contacto con una sonda de gen gad2 bajo
condiciones adecuadas para la hibridación de dicha sonda con un ARN
correspondiente a dicho gen gad2 y la hibridación de dicha
sonda se determina, y el nivel de señal tras la hibridación se
compara con una señal estándar (de referencia) (que se obtiene de un
paciente no obeso, o de un paciente obeso).
El complejo de hibridación emite una señal, que
puede deberse al marcaje de la sonda, o del ARNm. Los diferentes
marcajes que pueden utilizarse son bien conocidos por el experto en
la materia, y pueden indicarse ^{32}P, ^{33}P, ^{35}S, ^{3}H
o ^{125}I. Pueden seleccionarse marcajes no radioactivos de entre
los ligantes, tales como biotina, avidina, estreptavidina,
dioxigenina, haptenos, pigmentos, agentes luminiscentes, tales como
agentes radioluminiscentes, quimioluminiscentes, bioluminiscentes,
fluorescentes o fosforescentes.
Con el fin de identificar los SNP indicados en
la presente solicitud, resulta posible poner en contacto una sonda
de región 5' del gen gad2 con ADN genómico aislado de dicha
muestra bajo condiciones adecuadas para la hibridación de dicha
sonda con dicho gen y se determina la hibridación de dicha
sonda.
Dicha sonda de región 5' del gen gad2 es
un ADN de "tipo salvaje" (es decir, el SNP buscado no se
encuentra presente en la sonda, y la hibridación se produce cuando
no se encuentra presente ningún SNP de acuerdo con la invención en
el ADN en la muestra) o un ADN "mutante" (es decir, que porta
el SNP buscado, y la hibridación sólo se produce si el SNP se
encuentra presente en el ADN en la muestra).
El experto en la materia conoce las técnicas
para determinar las sondas específicas de alelo a utilizar en la
presente forma de realización, sus longitudes, o las condiciones de
hibridación. Resultan preferidas las condiciones de elevada
astringencia para evitar los falsos positivos, por ejemplo bajo las
condiciones de elevada astringencia siguientes: 0,2 x SSC y SDS al
0,1% a una temperatura comprendida entre 55ºC y 65ºC, o bajo
condiciones tales como las que se indican posteriormente.
Las condiciones astringentes de hibridación
pueden definirse tal como se describen en Sambrook et al.,
Molecular cloning: a laboratory manual, 2a edición, Cold Spring
Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1989), con las
condiciones siguientes: 5 x o 6 x SCC, 50ºC a 65ºC. Las condiciones
altamente astringentes que pueden asimismo utilizarse para la
hibridación se definen como las condiciones siguientes: 6 x SSC,
60ºC a 65ºC.
La hibridación ADN-ADN o
ADN-ARN puede llevarse a cabo en dos etapas: (1)
prehibridación a 42ºC durante 3 horas en tampón fosfato (20 mM, pH
7,5) que contiene 5 ó 6 x SSC (1 x SSC corresponde a una solución
0,15 M de NaCl + citrato sódico 0,015 M), formamida al 50%, dodecil
sulfato sódico (SDS) al 7%, 10 x solución de Denhardt, dextrán
sulfato al 5% y ADN de esperma de salmón al 1%; (2) hibridación
durante 20 minutos como máximo a una temperatura comprendida entre
50ºC y 65ºC, más preferentemente comprendida entre 60ºC y 65ºC,
seguido de diferentes lavados (aproximadamente 20 minutos en 2 x SSC
+ SDS al 2%, a continuación 0,1 x SSC + SDS al 0,1%). El último
lavado se lleva a cabo en 0,2 x SSC + SDS al 0,1% durante
aproximadamente 30 minutos a una temperatura comprendida entre
aproximadamente 50ºC y 65ºC, y/o en 0,1 x SSC + SDS al 0,1% a la
misma temperatura. Estas condiciones de hibridación de elevada
astringencia pueden ser adaptadas por un experto en la materia. En
efecto, el experto en la materia podrá determinar las mejores
condiciones de astringencia mediante la variación de las
concentraciones en SSC y SDS, y la temperatura de hibridación y los
lavados.
En otra forma de realización, dicho producto de
expresión es el polipéptido codificado por el gen gad2 en
dicha muestra. En particular, dicho polipéptido puede detectarse
mediante inmunotransferencia o mediante inmunocitoquímica.
Los anticuerpos específicos para GAD2
pueden utilizarse para detectar la expresión incrementada de
GAD2. Pueden llevarse a cabo ensayos inmunológicos en
cualquier formato conveniente conocido en la técnica. Entre éstos se
incluyen las transferencias western, los ensayos inmunohistoquímicos
y los ensayos ELISA.
De esta manera, los anticuerpos que reaccionan
con el polipéptido GAD2, así como los fragmentos reactivos de
estos anticuerpos, también se encuentran dentro del alcance de la
presente invención. Los anticuerpos pueden ser policlonales,
monoclonales, recombinantes, quiméricos, de cadena única y/o
biespecíficos. En la forma de realización preferida, el anticuerpo o
fragmento del mismo puede ser de origen humano, o "humanizado",
es decir, preparado para prevenir o minimizar una reacción
inmunológica contra el anticuerpo cuando se administran a un
paciente.
El fragmento de anticuerpo puede ser cualquier
fragmento que sea reactivo con los polipéptidos de la presente
invención. La invención comprende además los hibridomas generados
mediante la presentación del polipéptido de acuerdo con la
invención, o un fragmento del mismo, como antígeno a un mamífero
seleccionado, seguido de la fusión de células (por ejemplo células
de bazo) del mamífero con determinadas células de cáncer para crear
líneas celulares inmortalizadas mediante técnicas conocidas, tales
como la técnica de Köhler y Milstein (Nature 256:495, 1975).
Los anticuerpos de acuerdo con la invención son,
por ejemplo, los anticuerpos quiméricos, los anticuerpos humanizados
y los fragmentos Fab o F(ab')_{2}. Pueden ser
inmunoconjugados o anticuerpos marcados, con fines de detección.
En otra forma de realización, la invención se
lleva a cabo determinando si existe una alteración de la secuencia
de línea germinal en la región 5' del gen gad2 en dicha
muestra mediante la observación de los desplazamientos en la
movilidad electroforética del ADN de cadena única de dicha muestra
en geles de poliacrilamida desnaturalizantes o no desnaturalizantes.
Dichos ácidos nucleicos de cadena única pueden ser obtenidos tras
amplificación del ADN genómico, utilizando cebadores adecuados, y
desnaturalización (el gel y las condiciones de electroforesis
habitualmente son desnaturalizantes para este fin).
En otra forma de realización, la invención se
lleva a cabo mediante amplificación de la totalidad o parte de la
región 5' del gen gad2 de dicha muestra, y mediante la
determinación de la secuencia de dicho ADN amplificado, por ejemplo
mediante la extensión de la terminación de cadena.
En otra forma de realización, los cebadores
oligonucleótidos específicos de alelo se utilizan para determinar si
se encuentra presente un alelo mutante gad2 específico en
dicha muestra, produciéndose únicamente la amplificación en este
caso. Este procedimiento es bien conocido en la técnica.
En otra forma de realización, la totalidad o
parte de la región 5' del gen gad2 de dicha muestra se clona
para producir una secuencia clonada y se determina la secuencia de
dicha secuencia clonada. La clonación se lleva a cabo en vectores
conocidos en la técnica, tales como los vectores pUC o pBR.
En general, la invención se refiere a un
procedimiento para la determinación de una predisposición a la
obesidad, en particular a la obesidad mórbida, en un sujeto, a
partir de una muestra de dicho sujeto, que comprende determinar si
existe un desapareamiento entre (1) la región 5' del ADN genómico
del gen gad2 aislado de dicha muestra, y (2) una sonda de
ácidos nucleicos complementaria a la región 5' de tipo salvaje
humana del ADN del gen gad2, según representa la SEC ID nº 2,
cuando las moléculas (1) y (2) se hibridan entre sí para formar un
dúplex, siendo debido dicho desapareamiento a la presencia de por lo
menos uno de los 3 SNP identificados, presentando los nucleótidos
376, 780 ó 2.137 de la SEC ID nº 2.
En otra forma de realización, la invención se
refiere a un procedimiento en el que se lleva a cabo la
amplificación de las secuencias 5' flanqueantes del gen gad2
en dicha muestra y se determina la hibridación de las secuencias
amplificadas con una o más sondas de ácidos nucleicos producidas a
partir de la secuencia de la región 5' flanqueante del gen
gad2 de tipo salvaje (según representa la SEC ID nº 2) o una
secuencia mutante de región 5' flanqueante del gen gad2 (en
la que por lo menos uno de los tres SNP localizado en los
nucleótidos 376, 780 o 2.137 de la SEC ID nº 2 se encuentra
presente).
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento que comprende determinar la hibridación in situ
de la región 5' flanqueante del gen gad2 en dicha muestra con
una o más sondas de ácidos nucleicos producidas a partir de una
secuencia mutante o de tipo salvaje de la región 5' flanqueante del
gen gad2.
La invención abre un nuevo área en el
tratamiento y/o en la prevención de la obesidad, en particular de la
obesidad mórbida, especialmente para pacientes en familias en las
que se sospecha susceptibilidad genética.
En efecto, la presencia de los SNP en la región
5' del gen gad2, y los datos que muestran una unión
incrementada de factores nucleares a dicha región cuando se
encuentran presentes los polimorfismos identificados en el marco de
la invención, hacen probable y creíble que la presencia de estos
polimorfismos incrementa la expresión de gad2, probablemente
a través del incremento de la transcripción. Además, la actividad
incrementada del gen gad2 conduce a un incremento de la
reserva de GABA, del efecto orexigénico de GABA, que podría alterar
el comportamiento de alimentación y contribuir al desarrollo de la
obesidad mórbida en los portadores de las mutaciones
identificadas.
De esta manera, la invención se refiere asimismo
a un procedimiento para cribar para fármacos potenciales para la
obesidad que comprenden: combinar (i) un compuesto que se sospecha
que es un fármaco para la obesidad, (ii) un polipéptido GAD2,
y determinar la cantidad de unión del polipéptido GAD2 a
dicho compuesto. En efecto, los inhibidores del enzima GAD2
interfieren con la formación de GABA y pueden considerarse fármacos
útiles para tratar la obesidad, solos o asociados a otros
tratamientos.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento para el cribado de terapias potenciales para la
obesidad, que comprende: combinar (i) una pareja de unión a GABA,
(ii) un polipéptido GAD2, y (iii) un compuesto que se
sospecha que es un agente terapéutico de la obesidad, y determinar
la cantidad de unión del polipéptido GAD2 a su pareja de
unión.
En una forma de realización particular, dicha
pareja de unión es el ácido L-glutámico.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento para el cribado de compuestos terapéuticos potenciales
para la obesidad, que comprende: combinar (i) una pareja de unión al
gen gad2, (ii) un gen gad2, y (iii) un compuesto que
se sospecha que es un agente terapéutico para la obesidad, y
determinar la cantidad de unión del gen gad2 a su pareja de
unión. En la presente forma de realización, la expresión "gen
gad2" debe interpretarse que incluye la región 5'
flanqueante en el locus gad2, que comprende los polimorfismos
de la invención, especialmente -243 A>G.
En particular, dicha pareja de unión al gen
gad2 es IK2 (Ikaros 2), la secuencia de aminoácidos de la
cual se encuentra representada por la SEC ID nº 3.
Los procedimientos para la evaluación de la
unión de un compuesto a un ácido nucleico o a una proteína son bien
conocidos en la técnica, y se llevan a cabo preferentemente in
vitro. Un procedimiento para conseguir este objetivo podría ser
unir el ácido nucleico o la proteína a un soporte sólido sobre el
que se hace fluir el compuesto que se va a ensayar, y comprobar la
recuperación del compuesto tras el paso sobre el soporte. Mediante
el ajuste de los parámetros, resulta posible asimismo determinar la
afinidad de unión. Los compuestos pueden encontrarse asimismo
mediante otros procedimientos, incluyendo FRET, SPA, etc., cuando
los compuestos y el ácido nucleico o la proteína se marcan. El
ensayo puede llevarse a cabo asimismo en las células que contienen
el ácido nucleico de la invención, por ejemplo en un vector de
acuerdo con la invención y/o que expresa la proteína de acuerdo con
la invención. Esto también proporciona información sobre la
capacidad del compuesto de atravesar la membrana y de penetrar
dentro de las células. Estas células pueden ser células bacterianas,
o células de mamífero.
El procedimiento de la invención permite
asimismo el cribado, la detección y/o la identificación de
compuestos capaces de inhibir la actividad biológica de la proteína
GAD2, y en particular el incremento de la cantidad de GABA
producido.
La presente invención permite de esta manera la
detección, la identificación y/o el cribado de compuestos que pueden
resultar útiles para el tratamiento de enfermedades en las que se
encuentra implicada la recombinación de V(D)J y/o la
reparación del ADN. Sin embargo, los compuestos identificados
mediante el procedimiento de acuerdo con la invención, con el fin de
poder ser utilizados en un tratamiento terapéutico, podrían requerir
su optimización, con el fin de presentar una actividad superior y/o
una toxicidad menor.
En efecto, el desarrollo de nuevos fármacos con
frecuencia se lleva a cabo sobre la base siguiente:
- -
- cribado de compuestos con la actividad buscada, en un modelo relevante, mediante un procedimiento apropiado,
- -
- selección de los compuestos que presentan las propiedades requeridas del primer ensayo de cribado (en la presente invención, la modulación de GAD2 o la producción de GABA),
- -
- determinación de la estructura (en particular la secuencia (si resulta posible, la secuencia terciaria) si son péptidos, proteínas o ácidos nucleicos, la fórmula y el esqueleto si son compuestos químicos) de los compuestos seleccionados,
- -
- optimización de los compuestos seleccionados, mediante modificación de la estructura (por ejemplo mediante el cambio de la conformación estereoquímica, por ejemplo el paso de los aminoácidos en un péptido de L a D, la adición de sustituyentes en los esqueletos peptídicos o químicos, en particular mediante la injertación de grupos o radicales en el esqueleto, la modificación de los péptidos (ver, en particular, Gante, "Peptidomimetics", en Angewandte Chemie-International Edition Engl. 33:1699-1720, 1994),
- -
- ensayo y cribado de los compuestos "optimizados" en modelos apropiados que con frecuencia son modelos más cercanos a la patología estudiada. En esta etapa, con frecuencia se utilizan modelos animales, en particular roedores (ratas o ratones), o perros o primates no humanos, que son buenos modelos de obesidad, y se buscan cambios fenotípicos en dichos modelos tras la administración del compuesto.
La invención se refiere asimismo a una
composición farmacéutica que comprende un excipiente
farmacéuticamente aceptable y un compuesto según se define en la
reivindicación 10, y a la utilización de un compuesto identificado
mediante un procedimiento de acuerdo con la invención según se
define en la reivindicación 11 ó 12, para la preparación de un
fármaco destinado al tratamiento y/o a la prevención de la obesidad,
especialmente de la obesidad mórbida.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento para la terapia de la obesidad, en particular de la
obesidad mórbida, que comprende la administración de un compuesto o
de una composición farmacéutica de la invención.
Con el fin de reducir la actividad del gen
gad2 y la proteína, resulta posible utilizar una molécula
antisentido, en particular complementaria al ARNm de gad2, en
una composición farmacéutica para el tratamiento de la obesidad. La
invención se refiere a un procedimiento para la terapia de la
obesidad, que comprende la administración de una molécula
antisentido anti-gad2 o cualquier medio para reducir la
cantidad de la proteína GAD2. El experto en la materia conoce
medios para diseñar moléculas antisentido, y las modificaciones que
pueden inducirse en los esqueletos de las moléculas (fosforotioatos,
metilfosfonatos, etc.).
Las secuencias de polinucleótidos antisentido
resultan útiles en la prevención o en la reducción de la expresión
del gen gad2, tal como apreciarán los expertos en la materia.
Por ejemplo, los vectores polinucleótido que contienen la totalidad
o parte del gen gad2 (u otras secuencias del locus
gad2, especialmente la región 5' flanqueante), pueden
situarse bajo el control de un promotor en una orientación
antisentido e introducirse en una célula. La expresión de este
constructo antisentido dentro de una célula interferirá con la
transcripción y/o con la traducción de gad2.
Alternativamente, puede contemplarse una
estrategia "sentido", en la que un oligonucleótido o sonda de
ácidos nucleicos que comprende parte de la región 5' del gen
gad2 (especialmente que comprende la variante -243 A>G en
el nucleótido 2.137 de la SEC ID nº 2) se introduce dentro de las
células, con el fin de competir por la unión con los factores
nucleares que activan la transcripción. El tamaño del fragmento de
la región 5' flanqueante del gen gad2 que puede utilizarse en
la estrategia sentido es preferentemente de entre aproximadamente 50
y 150 bases.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de modelos animales para el estudio de la obesidad, en
la que se incrementa la expresión del gen gad2. En
particular, puede incrementarse la expresión de este gen sólo
condicionalmente, utilizando promotores que son específicos de sitio
o de tiempo, o promotores inducibles. De esta manera, resulta
posible incrementar la expresión de gad2 únicamente en el
páncreas de los animales de acuerdo con la invención, o en el
cerebro. Los procedimientos para obtener animales de acuerdo con la
invención son conocidos por los expertos en la materia, y resultan
útiles en particular para someter a ensayo algunos fármacos que
pueden identificarse de acuerdo con los procedimientos de la
invención.
La inserción de un constructo en un genoma de un
animal para obtener un animal transgénico puede llevarse a cabo
mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la materia,
y pueden ser aleatorios o dirigidos. En resumen, el experto en la
materia construye un vector que contiene la secuencia que se debe
insertar dentro del genoma, con un promotor apropiado, y un marcador
de selección (por ejemplo el gen que codifica la proteína que
proporciona resistencia a la neomicina) y puede provocar que entre
en las células madre embrionarias (ES) de un animal. A continuación,
se seleccionan las células con el marcador de selección, y se
incorporan a un embrión, por ejemplo mediante microinyección en un
blastocito, que puede recolectarse mediante perfusión del útero de
hembras embarazadas. El reimplante del embrión y la selección de los
animales transformados, seguido del retrocruzamiento permite obtener
este animal transgénico. Para obtener un animal "más limpio",
puede extraerse el gen del marcador de selección mediante la
utilización de una recombinasa específica de sitio, si se encuentra
flanqueada por las secuencias correctas.
De acuerdo con una forma de realización, el
mamífero no humano transgénico ha integrado en su genoma la
secuencia de ácidos nucleicos del gen gad2 o la secuencia
codificante del mismo, ligada funcionalmente a elementos
reguladores, en la que la expresión de dicha secuencia codificante
incrementa el nivel de la proteína GAD2 y/o la reserva de
GABA en dicho mamífero respecto a un animal no transgénico de la
misma especie. Los ratones transgénicos que presentan una expresión
incrementada de gad2 se describen en el documento
WO-A-98/37224 o en Geng et
al., PNAS vol. 95:10055-10060, 1995.
La secuencia gad2 prevista para la forma
de realización anterior puede ser una secuencia humana de gen
gad2 introducida dentro del genoma del animal de la
invención, o la secuencia endógena del gen gad2, el promotor
de la cual se ha modificado con el fin de que induzca la
sobreexpresión. Por ejemplo, la secuencia codificante gad2
para el ratón es conocida y puede encontrarse en GenBank bajo el
número NM_008078. Pueden identificarse otros genes endógenos
gad2 en otros animales utilizando las homologías entre
secuencias.
Alternativamente, un mamífero no humano
transgénico cuyo genoma comprende una alteración del gen endógeno
gad2 se utiliza como animal modelo para analizar la relación
entre GAD2 y la obesidad. En particular, la alteración
comprende la inserción de una secuencia de marcador seleccionable, y
dicha alteración resulta en que dicho mamífero no humano manifiesta
un defecto en el nivel de GABA en comparación con un mamífero no
humano de tipo salvaje.
En particular, dicha alteración es una
alteración homocigótica, y dicha alteración homocigótica resulta en
una mutación nula del gen endógeno que codifica GAD2.
La patente US nº 6.087.555 describe una manera
de obtener un ratón knockout, y la enseñanza general de esta patente
se incorpora a la presente memoria como referencia (columna 5, línea
54 a columna 10, línea 13). En esta patente, se describe un ratón
knockout OPG, pero el mismo procedimiento se aplica a un ratón
knockout GAD2. El experto en la materia también encontrará
información en Hogan et al. (Manipulating the Mouse Embryo: a
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1986).
El mamífero de la invención preferentemente es
un roedor, especialmente una rata o un ratón. Los ratones knockout
GAD65 (gad2) se describen en Fagiolini y Hensch, Nature vol.
404:183-186, 2000.
Figura 1: representación esquemática del gen
gad2, y de la frecuencia de los SNP identificados en el marco
de la invención.
Figura 2: ensayo de desplazamiento en gel,
ensayo de la unión de proteína nuclear en la región 5' del gen
gad2, dependiente de la naturaleza del nucleótido en la
posición nº -243. mt = mutante (G); wt = tipo salvaje (A).
Figura 3: efecto de la variante -243 A>G de
gad2 sobre la actividad transcripcional en las células
\betaTC3. Las unidades relativas de luciferasa se expresan como
medias \pm S.D.
El gen gad2 codifica una isoforma de la
ácido glutámico descarboxilasa (GAD65), que cataliza la formación de
ácido gamma-aminobutírico (GABA) a partir del ácido
L-glutámico, y se expresa en células tanto del
cerebro como de los islotes pancreáticos. GABA es uno de los
neurotransmisores inhibitorios más potentes del sistema nervioso
central (SNC). GABA modula la secreción de gastrina y de
somatostatina y puede estimular la incorporación de glucosa a varios
tejidos (Erdo y Wolff, J. Neurochem.
54(2):363-72, 1990).
Tres SNP (variante -243 A>G (5' UTRI); -1,6
kb G>A (SNP 668); -2004 A>T (SNP 669)), situados en la región
5' flanqueante del gen gad2 revelaron una asociación positiva
con la obesidad en los sujetos mórbidamente obesos.
Los fragmentos de ADN que portaban estos
polimorfismos pueden amplificarse con los conjuntos siguientes de
cebadores.
Los polimorfismos del gen gad2 se
genotiparon mediante secuenciación directa o mediante la
tecnología
LightCycler^{TM} (Roche, Manheim, Alemania). El ensayo LightCycler se basa en sondas de hibridación marcadas con pigmentos fluorescentes que permiten la transferencia de energía de resonancia fluorescente (Blomeke et al., Anal. Biochem. 275:93-7, 1999). El genotipado del SNP se llevó a cabo utilizando análisis de curvas de fusión. Se llevó a cabo PCR en un aparato 9700 (Applied Biosystems, Foster city, USA) antes del análisis en el LightCycler. Las secuencias de los cebadores utilizados para el PCR y para los ensayos del LightCycler se describen en la tabla siguiente.
LightCycler^{TM} (Roche, Manheim, Alemania). El ensayo LightCycler se basa en sondas de hibridación marcadas con pigmentos fluorescentes que permiten la transferencia de energía de resonancia fluorescente (Blomeke et al., Anal. Biochem. 275:93-7, 1999). El genotipado del SNP se llevó a cabo utilizando análisis de curvas de fusión. Se llevó a cabo PCR en un aparato 9700 (Applied Biosystems, Foster city, USA) antes del análisis en el LightCycler. Las secuencias de los cebadores utilizados para el PCR y para los ensayos del LightCycler se describen en la tabla siguiente.
| SNP | cebadores de PCR | cebadores para el ensayo |
| del Light cycler | ||
| -243 A>G | F: 5'cctcaaatgctctggggctc3' | Red640-gtctcttttaaagctccccggct |
| R: 5'ggtgtcacgcaggaacagaa3' | cgggctccgaggacccttaggtagtccc-F | |
| -1600 G>A | F 5'ctgaggcgtattaggag | Red640-ggaaagcagccgcctc |
| R: 5'ctcctaatacgcctcag | tggaaatgacaggcgctctggccaggcgcg-F | |
| -2004 A>T | F: 5'tgttttcaaccactcatccat | Red640-acagcctggtacagactt |
| R: 5'agggacagttatgctcg | tgagttttcgaccacccgggctc-F | |
| (F representa la etiqueta de fluoresceína) |
Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo
en un volumen final de reacción de 20 \mul de tampón para PCR, que
contenía 50 ng de ADN genómico humano, 10 pmoles de cada cebador,
2,5 mmoles/l de MgCl_{2}, 2,5 mmoles/l de dNTP y 0,2 U de
polimerasa Taq Gold. Las condiciones de ciclado térmico para el
producto de PCR eran: 1 ciclo de 95ºC durante 12 minutos; 35 ciclos
de 95ºC durante 15 segundos; 55ºC, 15 segundos; 72ºC, 30 segundos; 1
ciclo, 72ºC, 10 minutos; 1 ciclo, 15ºC, 15 minutos.
Además, con el fin de estudiar la contención de
la alimentación y la "obesidad latente", la contención
cognitiva en la alimentación, se analizaron la desinhibición y el
hambre de acuerdo con el "Cuestionario de alimentación de tres
factores, o TFEQ" (Stunkard, A.J. y Messick, S., J. Psychosom.
Res. 29(1):71-83, 1985).
Se llevaron a cabo estudios de asociación en 369
pacientes mórbidamente obesos no relacionados (media de IMC: 47,3
\pm 7,4 kg/m^{2}; media de edad: 46 \pm 12 años;
mujeres/hombres: 294/75).
Se utilizó un conjunto de 381 sujetos no
diabéticos no obesos no relacionados (IMC media: 22,8 \pm 2,44
kg/m^{2}; media de edad: 58,3 \pm 14,1 años; mujeres/hombres:
228/152) como grupo de control. La Tabla 1 muestra la distribución
de genotipos y las frecuencias de alelos de los 3 SNP (variante -243
A>G (5'UTRI); -1,6 kb G>A (SNP 668); -2004 A>T (SNP
669)).
| Modelo de codominancia | Obesos mórbidos | Controles | Valor de p | |||
| IMC>40 | ||||||
| SNP | Genotipo | Número de | Frec. de | Número de | Frec. de | |
| genotipos | los alelos | genotipos | los alelos | |||
| 5'UTR: | AA | 233 | A: 79,9% | 270 | A: 84,5% | p=0,05 |
| -243 A>G | AG | 117 | G: 20,1% | 92 | G: 15,5% | |
| GG | 15 | 12 | ||||
| SNP668: | GG | 229 | G: 802% | 255 | G: 84,8% | p=0,06 |
| -1,6kb G>A | GA | 113 | A: 19,8% | 87 | A: 15,2% | |
| AA | 14 | 10 | ||||
| SNP669: | AA | 221 | A: 80,4% | 254 | A: 83,8% | p=0,19 |
| -2004 A>T | AT | 105 | T: 19,6% | 89 | T: 16,2% | |
| AA | 14 | 13 | ||||
| Modelo de dominancia | Obesos mórbidos | Controles | Valor de p | |||
| IMC>40 | ||||||
| SNP | Genotipo | Número de | Frec. de | Número de | Frec. de | |
| genotipos | los alelos | genotipos | los alelos | |||
| 5'UTR: | AA | 233 | A: 79,9% | 270 | A: 84,5% | p=0,004 |
| - 243 A>G | AG/GG | 132 | G: 20,1% | 104 | G: 15,5% | |
| SNP668: | GG | 229 | G: 80,2% | 255 | G: 84,8% | p=0,02 |
| - 1,6kb G>A | GA/AA | 127 | A: 19,8% | 97 | A: 15,2% | |
| SNP669: | AA | 221 | A: 80,4% | 254 | A: 83,8% | p=0,07 |
| - 2004 A>T | AT/AA | 119 | T: 19,6% | 102 | T: 16,2% |
Bajo los modelos de codominancia y de
dominancia, los SNP -243 A>G y -1,6 kb G>A se encontraban
asociados a la obesidad mórbida (valores respectivos de p de 0,004 y
0,2 bajo un modelo de dominancia). Se observó una tendencia hacia la
asociación para la variante -2004 A>T.
El riesgo relativo de estos 3 SNP se estimó en:
R.R.=1,55 (IC al 95% de 1,14 a 2,12) (UTR5I; -243); R.R.=1,45 (IC al
95% de 1,06 a 2) (SNP668; -1,6 kb); R.R.=1,34 (IC al 95% de 0,97 a
1,84) (SNP669; -2004).
Con el fin de replicar estos resultados, se
genotiparon los 3 SNP en otro conjunto de 316 sujetos mórbidamente
obesos no relacionados. Se obtuvo un resultado similar para la
variante -243 A>G (bajo el modelo de dominancia, p=0,009) y se
obtuvo una tendencia para el SNP -1,6 kb G>A (bajo el modelo de
dominancia, p=0,06).
Se llevó a cabo un análisis de la varianza para
los fenotipos relacionados con la obesidad (IMC, leptina, porcentaje
de masa grasa, insulinemia, etc.) y se encontró una asociación
significativa entre los 3 SNP y los tres factores de comportamiento
de alimentación.
Para someter a ensayo el comportamiento de
alimentación humano, los sujetos cumplimentaron el cuestionario TFEQ
(cuestionario de alimentación de tres factores) establecido por
Stunkard et al. (op. cit.). El análisis de la varianza
para los tres factores estables medidos por TFEQ: contención
cognitiva de la alimentación (Qres), desinhibición (Qdis) y hambre
(Qhun) se muestra en la Tabla 2. El desequilibrio de ligamiento
entre los 3 SNP era significativo (X^{2} = 174,
p<10^{-10}).
El desequilibrio de ligamiento entre cada SNP se
estimó mediante un programa de estimación de haplotipos (EH). D' =
0,84 (SNP -243 A>G y -1,6 kb G>T), D' = 0,84 (SNP -243 A>G
y -2004 kb G>A), D' = 0,87 (SNP -1,6 kb G>T y -2004 kb
G>A).
La Tabla 2 muestra los resultados obtenidos para
la variante -243 A>G (5'UTR). Se obtuvieron resultados similares
para las variantes -1,6 kb G>A (SNP 668) y -2004 A>T (SNP
669).
| -243 A>G (5'UTRI) | ||||
| AA | AG | GG | P | |
| N | 233 | 117 | 15 | |
| Edad | 46,02 \pm 0,78 | 47,82 \pm 1,1 | 39,9 \pm 3,1 | 0,04 |
| Edad-Pmax | 43,5 \pm 0,79 | 44,3 \pm 1,1 | 35,76 \pm 3,1 | 0,03 |
| Qres | 9,53 \pm 0,31 | 9 \pm 0,45 | 6,53 \pm 1,28 | 0,06 |
| Qdis | 8,38 \pm 0,24 | 8,71 \pm 0,34 | 10,9 \pm 0,96 | 0,03 |
| Qhun | 5,29 \pm 0,24 | 6,49 \pm 0,35 | 7,95 \pm 0,95 | 0,001 |
Mediante la utilización de un modelo
codominante, se descubrió que los portadores de GG presentaban una
puntuación más baja de contención que los sujetos heterocigóticos y
de tipo salvaje (valor de p = 0,06). También presentaban una
desinhibición más alta (valor de p = 0,03) y puntuaciones de hambre
más elevadas (valor de p = 0,001) que los sujetos heterocigóticos y
de tipo salvaje. Además, se observó que los portadores de GG eran
más jóvenes (valor de p = 0,04) y alcanzaban aparentemente el peso
máximo en edades más tempranas que los portadores de AG y de AA
(valor de p = 0,03). Estos datos sugieren que las alteraciones del
comportamiento de alimentación de las variantes de gad2
pueden contribuir al desarrollo de una aparición más temprana de la
obesidad mórbida.
Los estudios de haplotipos se llevaron a cabo
con las variantes -243 A>G, -1,6 kb G>A y -2004 A>T
(programa EHplus). Se observó una diferencia significativa en las
frecuencia de los haplotipos de sujetos obesos y no obesos
(p<10^{-10}). El haplotipo ATG se demostró que era más
frecuente en los obesos (16,9%) comparado con los controles (8%)
(figura 1).
Para buscar sitios potenciales de unión, se
envió la región 5' flanqueante del gen gad2 al servidor
transfac: http://transfac.gbf.de/cgi-bin/mat.
Los análisis in silico demostraron que
-243 A>G (localizado en el nucleótido 2.137 de la SEC ID nº 2) y
-1,6 kb G>A (localizado en el nucleótido 780 de la SEC ID nº 2)
se encontraban situados cerca de un sitio de elemento de respuesta
previsto, Ikaros 2 (IK2). IK2 es un factor de transcripción que se
encuentra altamente expresado en los linfocitos humanos, y su
secuencia de aminoácidos se encuentra representada por la SEC ID nº
3.
Con el fin de someter a ensayo que la variante
-243 A>G altera la unión de proteínas nucleares al ADN, se llevó
a cabo un ensayo de desplazamiento en gel utilizando cebadores con
secuencias del tipo salvaje y del sitio mutado y un extracto nuclear
de células MIN6 (figura 2).
Los resultados del ensayo de desplazamiento en
gel demostraron que se produce la unión in vitro de las
proteínas nucleares al sitio del elemento sensible IK2.
Aparentemente, las proteínas nucleares presentan una mayor afinidad
por la variante del elemento de respuesta G (línea 6 frente a 1). Se
obtuvo un resultado similar con la competición entre los alelos A y
G (línea 2 frente a 3; 6 frente a 8; 7 frente a 9).
Con el fin de investigar si la variante alélica
en la posición -243 influye sobre el nivel de transcripción de
GAD2, se llevaron a cabo cotransfecciones transitorias
utilizando constructo de informador de luciferasa de luciérnaga para
medir la actividad proximal del promotor de tipo salvaje y de los
promotores variantes en células \betaTC3 (línea celular del
insulinoma murino). Se utilizó el vector Renilla para normalizar la
eficiencia de transfección. La actividad transcripcional del
constructo mutante -243 A>G era 8,61 veces más elevada comparado
con el constructo de tipo salvaje (n=8, p<0,0001) (figura 3).
El incremento observado de la actividad
transcripcional inducido por el alelo G de -243 A>G concuerda con
los resultados genéticos:
- -
- asociación de la variante -243 A>G con la obesidad (p=0,004; R.R.=1,55 (IC al 95% de 1,14 a 2,12).
- -
- los portadores de GG presentaban una puntuación más baja de contención en la alimentación (p=0,06), una puntuación más elevada de desinhibición (p=0,03) y un parámetro de puntuación de hambre más elevado (p=0,001).
Estos resultados indican que la unión de
proteínas nucleares (potencialmente el factor de transcripción IK2)
en presencia de alelo variante se encontraba incrementada y podría
transactivar el gen gad2, y de esta manera la reserva de
GABA. Por lo tanto, el efecto orexigénico de GABA podría encontrarse
incrementado y podría alterar el comportamiento de alimentación y
contribuir al desarrollo de la obesidad mórbida en los portadores de
G de la variante -243 A>G.
El resultado podría generalizarse a los demás
SNP, que también se encuentran próximos al elemento de respuesta
IK2.
La evidencia presentada en la presente solicitud
apunta a la implicación de la ruta de GABA en la obesidad en el ser
humano. Esto constituye una etapa importante hacia una mejor
comprensión de los mecanismos moleculares que conducen a las formas
comunes de obesidad. Aparentemente resulta claro que las neuronas
GABAérgicas se encuentran implicadas en la integración de la señales
que modulan la ingesta de alimento. La identificación de los SNP en
la región 5' del gen gad2 y la demostración de que su
presencia modula la expresión de un enzima clave (GAD2), que
a su vez modifica la reserva de GABA abre nuevas perspectivas para
fármacos contra la obesidad.
<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE (CNRS)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNÓSTICO DE
LA OBESIDAD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 64 808 - EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1758
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> gen gad2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2382
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región 5' flanqueante de los
nucleótidos del gen gad2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> R = G o A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Y = T o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> M = A o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> W = A o T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> S = G o C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 519
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína Ikaros de unión a ADN
(factor de transcripción linfoide LyF-1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP -243
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcaaatgc tctggggctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP - 243
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgtcacgc aggaacagaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP -243
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctctttta aagctccccg gct
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP -243
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggctccga ggacccttag gtagtccc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP -1,6 kb
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgaggcgta ttaggag
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP -1,6 kb
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcctaatac gcctcag
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP -1,6 kb
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaagcagc cgcctc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP -1,6 kb
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggaaatgac aggcgctctg gccaggcgcg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP - 2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttttcaac cactcatcca t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP - 2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggacagtt atgctcg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP - 2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacagcctggt acagactt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador para amplificar SNP - 2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgagttttcg accacccggg ctc
\hfill23
Claims (15)
1. Procedimiento para el diagnóstico de una
predisposición a la obesidad, y en particular a la obesidad mórbida,
en un sujeto humano, que comprende determinar si existe una
alteración en la línea germinal en la secuencia de la región 5'
flanqueante del gen gad2, la secuencia codificante del cual
se encuentra representada por la SEC ID nº 1, en la que dicha
alteración es la presencia de por lo menos una de las mutaciones
siguientes: -243 A>G en el nucleótido 2.137 de la SEC ID nº 2,
-1,6 kb G>A en el nucleótido 780 de la SEC ID nº 2, -2004 A>T
en el nucleótido 376 de la SEC ID nº 2, siendo indicativa dicha
alteración de una predisposición a la obesidad.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha obesidad es la obesidad mórbida.
3. Procedimiento para el diagnóstico de una
predisposición a la obesidad en un sujeto humano, a partir de una
muestra de dicho sujeto, en la que se investiga el nivel de un
producto de expresión del gen gad2 en dicha muestra.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que dicho producto de expresión es ARN o proteína, o GABA.
5. Procedimiento para el cribado de fármacos
potenciales para la obesidad, que comprende: combinar (i) un
compuesto que se sospecha que es un fármaco para la obesidad, (ii)
un polipéptido GAD2, y determinar la cantidad de unión del
polipéptido GAD2 a dicho compuesto.
6. Procedimiento para el cribado de agentes
terapéuticos potenciales para la obesidad, que comprende: combinar
(i) una pareja de unión a GAD2, (ii) un polipéptido
GAD2, y (iii) un compuesto que se sospecha que es un agente
terapéutico para la obesidad, y determinar la cantidad de unión del
polipéptido GAD2 a su pareja de unión.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que dicha pareja de unión a GAD2 es el ácido
L-glutámico.
8. Procedimiento para el cribado de agentes
terapéuticos potenciales para la obesidad, que comprende: combinar
(i) una pareja de unión al gen gad2, (ii) un gen gad2,
y (iii) un compuesto que se sospecha que es un agente terapéutico
para la obesidad, y determinar la cantidad de unión del gen
gad2 a su pareja de unión.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que dicha pareja de unión al gen gad2 es IK2 (Ikaros
2).
10. Composición farmacéutica que comprende una
molécula sentido que comprende un fragmento de la región 5'
flanqueante del gen gad2, que comprende especialmente la
variante -243 A>G (en el nucleótido 2.137 de la SEC ID nº 2)
dentro de dicha región, y un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
11. Utilización de una molécula antisentido
complementaria al ARNm de gad2, para la preparación de un
fármaco destinado al tratamiento de la obesidad, en particular de la
obesidad mórbida.
12. Utilización de una molécula sentido que
comprende un fragmento de la región 5' flanqueante del gen
gad2, que comprende especialmente la variante -243 A>G (en
el nucleótido 2.137 de la SEC ID nº 2) dentro de dicha región, para
la preparación de un fármaco destinado al tratamiento de la
obesidad.
13. Utilización de un mamífero no humano
transgénico en el que se ha integrado en su genoma la secuencia de
ácidos nucleicos de gad2, o secuencia codificante del mismo,
ligada funcionalmente a elementos reguladores, en el que la
expresión de dicha secuencia incrementa el nivel de la proteína
GAD2 y/o de la reserva de GABA, en dicho mamífero respecto a
un mamífero no transgénico de la misma especie, como modelo para el
estudio de la obesidad, o para el ensayo de fármacos potenciales
antiobesidad.
14. Utilización de un mamífero no humano
transgénico cuyo genoma comprende una ruptura del gen endógeno
gad2, en el que dicha ruptura comprende la inserción de una
secuencia de marcador seleccionable, y en el que dicha ruptura
resulta en que dicho mamífero no humano muestre un defecto en el
nivel de GABA en comparación con un mamífero no humano de tipo
salvaje, como modelo para el estudio de la obesidad, o para el
ensayo de fármacos potenciales antiobesidad.
15. Utilización según la reivindicación 13 ó 14,
en el que el mamífero es un ratón.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02293085A EP1428875B1 (en) | 2002-12-13 | 2002-12-13 | Method of diagnosis of obesity |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2266432T3 true ES2266432T3 (es) | 2007-03-01 |
Family
ID=32319694
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02293085T Expired - Lifetime ES2266432T3 (es) | 2002-12-13 | 2002-12-13 | Procedimiento para el diagnostico de la obesidad. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060269919A1 (es) |
| EP (2) | EP1428875B1 (es) |
| JP (1) | JP2006509519A (es) |
| AT (1) | ATE331784T1 (es) |
| AU (1) | AU2003276616A1 (es) |
| CA (1) | CA2509831A1 (es) |
| DE (1) | DE60212861T2 (es) |
| ES (1) | ES2266432T3 (es) |
| WO (1) | WO2004055180A1 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2087789A1 (en) | 2008-02-06 | 2009-08-12 | Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf | Fto-modified non-human mammal |
| WO2010131491A1 (ja) | 2009-05-15 | 2010-11-18 | 国立大学法人東京大学 | 肥満素因の評価方法及びキット、並びに、抗肥満薬及びそのスクリーニング方法、非ヒト動物、脂肪組織、脂肪細胞、トランスジェニックマウス作成方法、抗原、抗体 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0973934A4 (en) * | 1997-02-25 | 2003-02-05 | Genzyme Transgenics Corp | TRANSGEN PRODUCED NON-SECRETED PROTEINS. |
| ATE409487T1 (de) * | 1998-11-05 | 2008-10-15 | Univ Jefferson | Behandlung von morbus parkinson mit oligonukleotiden |
| JP4219617B2 (ja) * | 2001-06-15 | 2009-02-04 | 独立行政法人科学技術振興機構 | グリーン蛍光タンパク質遺伝子により形質転換されたトランスジェニック動物 |
-
2002
- 2002-12-13 ES ES02293085T patent/ES2266432T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-13 DE DE60212861T patent/DE60212861T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-13 EP EP02293085A patent/EP1428875B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-12-13 AT AT02293085T patent/ATE331784T1/de not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-10-31 CA CA002509831A patent/CA2509831A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-31 WO PCT/IB2003/005282 patent/WO2004055180A1/en not_active Ceased
- 2003-10-31 US US10/538,922 patent/US20060269919A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-31 JP JP2004559999A patent/JP2006509519A/ja active Pending
- 2003-10-31 AU AU2003276616A patent/AU2003276616A1/en not_active Abandoned
- 2003-10-31 EP EP03813219A patent/EP1572999A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1428875A1 (en) | 2004-06-16 |
| US20060269919A1 (en) | 2006-11-30 |
| EP1428875B1 (en) | 2006-06-28 |
| JP2006509519A (ja) | 2006-03-23 |
| EP1572999A1 (en) | 2005-09-14 |
| WO2004055180A1 (en) | 2004-07-01 |
| DE60212861D1 (de) | 2006-08-10 |
| CA2509831A1 (en) | 2004-07-01 |
| AU2003276616A1 (en) | 2004-07-09 |
| ATE331784T1 (de) | 2006-07-15 |
| DE60212861T2 (de) | 2007-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dragich et al. | Differential distribution of the MeCP2 splice variants in the postnatal mouse brain | |
| Mellersh et al. | Identification of mutations in HSF4 in dogs of three different breeds with hereditary cataracts | |
| Hiraoka et al. | Insertion and deletion mutations in the dinucleotide repeat region of the Norrie disease gene in patients with advanced retinopathy of prematurity | |
| Van Der Werf et al. | CLMP is required for intestinal development, and loss-of-function mutations cause congenital short-bowel syndrome | |
| US10260100B2 (en) | FIG4 gene mutations in neurodegeneration | |
| ES2337181T3 (es) | Haplotipo del gen enpp1 (pc-1) asociado con el riesgo de obesidad y diabetes de tipo 2, y sus aplicaciones. | |
| ES2445099T3 (es) | Una prueba de marcador genético para braquispina y fertilidad en ganado vacuno | |
| US20190029238A1 (en) | Transgenic mice | |
| US5679635A (en) | Aspartoacylase gene, protein, and methods of screening for mutatons associated with canavan disease | |
| JP5854423B2 (ja) | モヤモヤ病関連遺伝子及びその利用 | |
| Xu et al. | A polymorphic glucocorticoid receptor in a mouse population may explain inherited altered stress response and increased anxiety‐type behaviors | |
| EP1428875B1 (en) | Method of diagnosis of obesity | |
| ES2311853T3 (es) | Procedimiento de diagnostico de la obesidad. | |
| ES2314206T3 (es) | Gen humano de predisposicion a la obesidad y usos del mismo. | |
| US20060223063A1 (en) | Method of diagnosis of type 2 diabetes and early onset thereof | |
| ES2375260T3 (es) | Procedimiento de detección de colapso canino inducido por el ejercicio. | |
| US7351534B2 (en) | Gene mutation associated with age-related macular degeneration | |
| GB2411403A (en) | Transgenic animals with altered NCS-1 expression | |
| US20070124828A1 (en) | Allelic form of the HMGA2 gene predisposing women to the formation of Leiomyomas | |
| Schürmann | Endogenous opioid peptides in drug addiction | |
| GB2383044A (en) | ALMS1 gene | |
| Zauber et al. | The Gene Variant MLH1* D132H is not associated with an increased risk for colorectal adenomas in a suburban United States jewish population | |
| NAMDEO | ANIMAL GENETICS AND BREEDING | |
| Lee | Identification and expression patterns of Prader-Willi syndrome candidate genes: implications for mouse models and human phenotypes | |
| Shepherd et al. | Christine S. van der Werf1, Tara D Wabbersen2, Nai-Hua Hsiao3, Joana Paredes4, Heather C. Etchevers�. Peter M. Kroisel6, Dick Tibboel7, Candice Babarit5, Richard A. Schreiber-!\Edward J. Hoffenbergl, Michel Vekemans�, Sirkka L. Zeder10, Isabella Ceccherini1, Stanislas Lyonnet!>, Ana S. R1be1ro1 |