ES2337181T3 - Haplotipo del gen enpp1 (pc-1) asociado con el riesgo de obesidad y diabetes de tipo 2, y sus aplicaciones. - Google Patents

Haplotipo del gen enpp1 (pc-1) asociado con el riesgo de obesidad y diabetes de tipo 2, y sus aplicaciones. Download PDF

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Abstract

Método para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad a partir de una muestra procedente de dicho sujeto que contiene ADN genómico o ARN, comprendiendo dicho método las etapas siguientes: a) determinar en por lo menos un alelo génico o secuencia de ARN que codifica la proteína ENPP1, si dicha secuencia, o fragmentos de la misma contiene el haplotipo que comprende los tres SNP siguientes: - K121Q, - IVS20 delT-11, y - un SNP localizado en la secuencia del dominio 3''UTR, y en el que la primera secuencia de tipo natural del dominio 3''UTR de 1170 pb (incluyendo el codón TGA) tiene la secuencia SEC ID nº 15; y b) observar si el sujeto tiene o no un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad mediante la observación de si dicha secuencia, o sus fragmentos, contiene dicho haplotipo, indicando la presencia de dicho haplotipo que dicho sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad.

Description

Haplotipo del gen ENPP1 (PC-1) asociado con el riesgo de obesidad y diabetes de tipo 2, y sus aplicaciones.
La presente invención se refiere a un método para determinar si un sujeto tiene un mayor riesgo de desarrollar obesidad o una patología relacionada con la obesidad, determinando la presencia de un haplotipo que comprende tres SNP específicos en una muestra de ADN o ARN de este sujeto, y/o una concentración elevada de proteína ENPP1 en el suero. La presente invención también se refiere a un kit y a una secuencia nucleica aislada, a un vector o a una célula recombinante que comprende dicho haplotipo del gen ENPP1. La invención comprende además un método para seleccionar un compuesto para el tratamiento o prevención de la obesidad o patología relacionada con la obesidad, y un método para determinar la eficacia de un fármaco para reducir el riesgo de obesidad o patología relacionada con la obesidad en un paciente.
La obesidad es una enfermedad devastadora. Además de dañar la salud física, la obesidad puede hacer estragos sobre la salud mental debido a que la obesidad afecta a la autoestima, que finalmente puede afectar a la capacidad de una persona para interactuar socialmente con los demás. Desafortunadamente, la obesidad no es bien entendida, y los estereotipos y suposiciones sociales con respecto a la obesidad sólo tienden a exacerbar los efectos psicológicos de la enfermedad. Debido al impacto de la obesidad sobre individuos y sobre la sociedad, se ha gastado mucho esfuerzo para encontrar vías para tratar la obesidad, pero se ha tenido poco éxito en un tratamiento a largo plazo y/o prevención de la obesidad.
La obesidad representa el trastorno más extendido del peso corporal, y es el trastorno nutricional más importante en el mundo occidental, cuya extensión se estima que oscila desde el 30% hasta el 50% en la población de mediana edad. La obesidad, definida como un exceso de grasa corporal con relación a la masa corporal magra, también contribuye a otras enfermedades. Por ejemplo, este trastorno es responsable del aumento de la incidencia de enfermedades tales como arteriopatía coronaria, hipertensión, apoplejía, diabetes, hiperlipidemia, y algunos cánceres. La obesidad no es simplemente un problema de comportamiento, es decir, el resultado de hiperfagia voluntaria. Más bien, la composición corporal diferencial observada entre sujetos obesos y normales resulta de las diferencias tanto en el metabolismo como en interacciones neurológicas/metabólicas. Estas diferencias parecen deberse, en cierto grado, a diferencias en la expresión génica, y/o al nivel de productos o actividad génicos. La epidemiología de la obesidad muestra de forma contundente que el trastorno presenta características heredadas.
En resumen, por lo tanto, la obesidad, que plantea un problema de salud importante a nivel mundial, representa un rasgo complejo, altamente heredable. Dada la gravedad, prevalencia, y heterogeneidad potencial de tales trastornos, existe una gran necesidad de identificar aquellos genes que participan en el control de la obesidad, particularmente para ser capaces de anticipar el riesgo de desarrollar esta patología o una patología relacionada con la obesidad, y/o para desarrollar mejores medicamentos selectivos. Este es el objeto de la presente invención.
Un trabajo previo identificó un locus de la obesidad en la niñez en el cromosoma 6q16.3-q24.2 (puntuación lod = 4,06)^{1} que incluye una región de 2,4 Mb relacionada con la diabetes de tipo 2/obesidad, común a los ocho barridos genómicos publicados que dan a conocer una relación en esta región^{1-8}.
El documento de patente US 6.465.185 B1 describe el uso de anticuerpos para la determinación de la proteína PC-1 y un par de cebadores para amplificar el exón 4 de la proteína PC-1.
Se han llevado a cabo estudios de asociación de genotipo-fenotipo en una región ENPP1 de 580 kb, y estudios de expresión de ARNm de ENPP1, en 3.147 caucásicos franceses y en más de 6.000 individuos europeos.
El gen ENPP1 codifica la ecto-nucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa 1 (ENPP1), que es un miembro de la familia de ecto-nucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa (ENPP). La proteína codificada es una glicoproteína transmembránica de tipo II que comprende dos subunidades idénticas enlazadas por disulfuro. Esta proteína tiene una amplia especificidad y escinde una variedad de sustratos, incluyendo enlaces de fosfodiéster de nucleótidos y azúcares de nucleótidos, y enlaces de pirofosfato de nucleótidos y azúcares de nucleótidos. Esta proteína puede funcionar para hidrolizar 5'-trifosfatos de nucleósidos en sus monofosfatos correspondientes, y también puede hidrolizar polifosfatos de diadenosina. Las mutaciones en este gen, particularmente, se han asociado con calcificación arterial infantil "idiopática" (GLU893TER, ARG774CYS o LEU579PHE), osificación del ligamento longitudinal posterior de la columna vertebral (OPLL) (IVS20AS, 1-BP DEL,T,-11), y resistencia a insulina (LYS121 GLN, la mutación "K121 Q").
Se ha demostrado que existe una fuerte asociación entre la variante de este gen ENPP1, particularmente un haplotipo de riesgo de tres alelos (K121Q; IVS20 delT-11 y un SNP localizado en la secuencia del dominio 3'UTR (principalmente A>G +1044 TGA, QdeITG), y la obesidad de la niñez y adultos con obesidad mórbida. También se ha demostrado que la presencia de por lo menos un alelo del haplotipo de riesgo estaba asociada con aumento de niveles séricos de la proteína ENPP1 soluble en niños, sugiriendo una expresión adicional elevada de ENPP1. Además, se encontró que la expresión de una isoforma larga de ARNm de ENPP1, que comprende el SNP A>G +1044 TGA, asociado con la obesidad, era específica de tres tejidos de principal importancia para la homeostasis de la glucosa: las células D pancreáticas de los islotes, los adipositos y el hígado. Estos hallazgos demuestran por primera vez un papel principal para varias variantes de ENPP1 en la mediación de la resistencia a insulina, tanto en el desarrollo de la obesidad como de diabetes de tipo 2 (T2D), proporcionando un mecanismo molecular común de ambas aflicciones extendidas ampliamente.
También se han proporcionado ensayos de detección que se pueden usar para diagnosticar el riesgo de desarrollar obesidad y/o patología relacionada con la obesidad, y para identificar moléculas para el tratamiento terapéutico.
La presente invención describe un método para determinar si un sujeto tiene mayor riesgo de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad a partir de una muestra biológica procedente de dicho sujeto que contiene ADN genómico o ARN, comprendiendo dicho método las etapas de:
a)
determinar en por lo menos un alelo génico o secuencia de ARN que codifica la proteína ENPP1, si dicha secuencia nucleica, o sus fragmentos, contiene por lo menos un SNP seleccionado del grupo de los SNP que consiste en los SNP indicados en la tabla 3 y en los que la frecuencia alélicas variante es superior a 5%; y
b)
observar si el sujeto tiene o no un aumento del riesgo de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad mediante la observación de si dicha frecuencia, o sus fragmentos, contiene dicho por lo menos un SNP, indicando la presencia de dicho SNP que dicho sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad.
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También se describe un método para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad a partir de una muestra biológica procedente de dicho sujeto que contiene ADN genómico o ARN, comprendiendo dicho método las etapas de:
a)
determinar en por lo menos un alelo génico o secuencia de ARN que codifica la proteína ENPP1, si dicha secuencia nucleica, o sus fragmentos, contiene por lo menos un SNP seleccionado del grupo de los SNP que consiste en IVS2 deIG +8, K121Q, IVS8 T>G +27, IVS20 delT -11, A>G +1044 TGA y T>G +5954 TGA; y
b)
observar si el sujeto tiene o no un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad mediante la observación de si dicha secuencia, o sus fragmentos, contiene dicho por lo menos un SNP, indicando la presencia de dicho SNP que dicho sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad.
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En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad a partir de una muestra biológica procedente de dicho sujeto que contiene ADN genómico o ARN, comprendiendo dicho método las etapas de:
a)
determinar en por lo menos un alelo génico o secuencia de ARN que codifica la proteína ENPP1, si dicha secuencia nucleica, o sus fragmentos, contiene el haplotipo que comprende los tres SNP siguientes:
-
K121Q (rs1044498),
-
IVS20 delT-11, y
-
un SNP localizado en la secuencia del dominio 3'UTR, y en el que la primera secuencia de tipo natural del dominio 3'UTR de 1170 pb (incluyendo el codón TGA) tiene la secuencia SEC ID nº 15; y
b)
observar si el sujeto tiene o no un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad mediante la observación de si dicha secuencia, o sus fragmentos, contiene dicho haplotipo, indicando la presencia de dicho haplotipo que dicho sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad.
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En la presente descripción, el término "rs", por ejemplo en la palabra "rs 1044498", corresponde a la nomenclatura del SNP en el banco de datos dbSNP.
El SNP "K121Q (rs1044498)" pretende designar el SNP rs1044498 que corresponde a la variante "K121Q" de ENPP1 (121 es la posición de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de ENPP1 que tiene número de acceso (A:N.) NP 006199 (SEC ID nº 14), que corresponde a la posición 173 en la secuencia de aminoácidos de ENPP1 que tiene número de acceso AAH59375. El número de acceso BC059375 corresponde a la secuencia nucleotídica de ARNm que codifica la proteína ENPP humana que tiene la secuencia representada bajo A.N. AAH59375).
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El SNP "IVS20 delT-11" corresponde a la posición -11 antes del exón 21 de ENPP1 como se muestra a continuación:
1
El término "haplotipo" se refiere a una combinación de alelos presente en un individuo o una muestra. En el contexto de la presente invención, un haplotipo se refiere preferentemente a una combinación de alelos polimórficos encontrados en un individuo dado y que pueden estar asociados con un fenotipo.
El término "polimorfismo", como se usa aquí, se refiere a la aparición de dos o más secuencias genómicas alternativas o alelos entre diferentes genomas o individuos. "Polimórfico" se refiere a la condición en la que dos o más variantes de una secuencia genómica específica se pueden encontrar en una población. Un "sitio polimórfico" es el locus en el que se produce una variación. Un "polimorfismo de un solo nucleótido" (SNP) es un cambio de un solo par de bases. Típicamente, un polimorfismo de un solo nucleótido es la sustitución de un nucleótido por otro nucleótido en el sitio polimórfico. La supresión de un nucleótido individual, o la inserción de un nucleótido individual, también da lugar a polimorfismos de un solo nucleótido.
Variante nucleica se entenderá que significa todas las secuencias nucleicas alternativas que pueden existir de forma natural, en particular en seres humanos, y que corresponden en particular a supresiones, sustituciones y/o adiciones de nucleótidos. En el caso presente, la secuencia nucleica variante estará en particular asociada parcialmente con el aumento de riesgo de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad.
Como se usa aquí de forma intercambiable, las expresiones "oligonucleótidos", "ácidos nucleicos" y "polinucleótidos" incluyen secuencias de ARN, ADN, o secuencias híbridas de ARN/ADN de más de un nucleótido en forma de cadena sencilla o de dúplex.
Como se usa aquí, la expresión "ácidos nucleicos" y "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados usando análogos nucleotídicos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario. En toda la presente memoria descriptiva, la expresión "secuencia nucleotídica" se puede emplear para designar indiferentemente un polinucleótido o un ácido nucleico. Más precisamente, la expresión "secuencia nucleotídica" engloba el propio material nucleico, y de este modo no está restringida a la información de secuencia (es decir, la sucesión de letras escogidas entre las cuatro letras de las bases) que caracteriza bioquímicamente una molécula de ADN o ARN específica. También, aquí se usan de forma intercambiable las expresiones "ácidos nucleicos", "oligonucleótidos" y "polinucleótidos".
En una forma de realización preferida, dicha patología relacionada con la obesidad se selecciona del grupo que consiste en diabetes de tipo 2, cardiopatía, arteriopatía coronaria, infarto de miocardio, hipertensión y trastorno metabólico relacionado con lípidos, tales como hipercolesterolemia e hiperlipidemia.
En una forma de realización más preferida, dicha patología relacionada con la obesidad es diabetes de tipo 2 (T2D).
Con respecto a dicho SNP que está localizado en la secuencia del dominio 3'UTR, se prefiere que este SNP se seleccione del grupo de los SNP que consiste en A>G +1044 TGA (rs7754561), A>C +1092 TGA (rs7754586), C>T +1157 TGA (rs7754859), G>T +1101 TGA, T>C +1137 TGA C>T +1157 TGA, G>T +1236 TGA, T>C +1348 TGA, G>A +1350 TGA, A>G +1539 TGA y T>C +1670 TGA. Se prefiere más un SNP seleccionado del grupo que consiste en A>G +1044 TGA, A>C +1092 TGA y C>T +1157 TGA, y el más preferido es el SNP A>G +1044 TGA localizado en el dominio 3'UTR.
También se prefiere un método para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad, caracterizado porque dicho método comprende la etapa a) y b) del método anterior según la invención, en el que:
-
en la etapa a), se determina si el sujeto es o no homocigótico para dicho haplotipo que comprende dichos tres SNP; y
-
en la etapa b), se observa si el sujeto tiene un riesgo elevado o no de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad mediante la observación de si el sujeto es homocigótico para dicho haplotipo, indicando la homocigosidad si dicho sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad.
Los métodos que permiten la detección de la variación en un gen comparado con el gen natural son, por supuesto, muy numerosos. Se pueden dividir esencialmente en dos grandes categorías. El primer tipo de método es aquel en el que se detecta la presencia de una variación comparando la secuencia alternativa con la secuencia o secuencias normales correspondientes, y el segundo tipo es aquel en el que se detecta indirectamente la presencia de la variación, por ejemplo mediante signos de los desemparejamientos debidos a la presencia de la variación.
Entre los métodos para la determinación de una variabilidad alélica, se prefieren los métodos que comprenden por lo menos una etapa para la denominada amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) o similar a PCR de la secuencia diana que comprende el haplotipo de riesgo de tres alelos según la invención, con la ayuda de un par de cebadores de secuencias nucleotídicas según la invención. Los productos amplificados se pueden tratar con la ayuda de una enzima de restricción apropiada antes de llevar a cabo la detección o ensayo del producto perseguido.
Similar a PCR se entenderá que significa todos los métodos que usan reproducciones directas o indirectas de secuencias de ácidos nucleicos, o, como alternativa, en los que se han amplificado sistemas de marcaje. Estas técnicas son por supuesto conocidas, en general implican la amplificación de ADN mediante una polimerasa; cuando la muestra original es un ARN, es aconsejable llevar a cabo de antemano una transcripción inversa. Actualmente hay un gran número de métodos que permiten esta amplificación; por ejemplo, la denominada NASBA "Amplificación a Base de Secuencia de Ácido Nucleico", TAS "Sistema de Amplificación a Base de Transcripción", LCR "Reacción en Cadena de la Ligasa", "Amplificación Endógena" (ERA), "Reacción de Sonda de Ciclación" (CPR), y SDA "Amplificación de Desplazamiento de Hebra", métodos bien conocidos por las personas expertas en la técnica.
Así, también forma parte de la presente invención un método para determinar si un sujeto tiene un riesgo (elevado) de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad según la invención, en el que la etapa a) de determinación de la presencia o ausencia de dichos haplotipos de riesgo de tres alelos se lleva a cabo mediante un método que comprende una etapa de amplificación de la secuencia de ADN genómico o ARN, preferentemente de la secuencia de ADN, o sus fragmentos, susceptible de contener dichos SNP haplotípicos, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En dicho método en el que la etapa a) de determinación de la presencia o ausencia de los haplotipos de riesgo de tres alelos se lleva a cabo mediante un método que comprende una etapa de amplificación mediante PCR, los cebadores usados pueden ser todos los cebadores que se pueden deducir a partir de la secuencia nucleotídica del gen ENPP1 y que pueden hacer posible detectar la presencia de dicho haplotipo que contiene o consiste en los tres SNP K121Q, IVS20 delT-11 y un SNP localizado en la secuencia del dominio 3'UTR (la primera secuencia de tipo natural del dominio 3'UTR de 1170 pb (incluyendo el codón TGA) que tiene la secuencia SEC ID nº 15).
El término "cebador" representa una secuencia oligonucleotídica específica que es complementaria a una secuencia nucleotídica diana y que se usa para hibridarla a la secuencia nucleotídica diana. Un cebador sirve como un punto de iniciación para la polimerización nucleotídica catalizada mediante ADN polimerasa, ARN polimerasa o transcriptasa inversa.
Los cebadores que se pueden usar para el método de la presente invención se pueden diseñar a partir de las secuencias descritas para cualquier método conocido en la técnica. Un conjunto preferido de cebadores se diseña de forma que el extremo 3' del tramo contiguo de identidad con la secuencia diana esté presente en el extremo 3' del cebador. Tal configuración permite que el extremo 3' del cebador se hibride a la secuencia de ácido nucleico seleccionada.
Se pueden diseñar cebadores específicos de alelos de forma que un polimorfismo esté en el extremo 3' del tramo contiguo, y el tramo contiguo esté presente en el extremo 3' del cebador. Tales cebadores específicos de alelos tienden a cebar selectivamente una reacción de amplificación o secuenciación en tanto que se usen con una muestra de ácido nucleico que contiene uno de los dos alelos presentes en un polimorfismo.
En una forma de realización preferida, dicho método para determinar si un sujeto tiene un aumento (elevado) de riesgo de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad según la invención se caracteriza porque la etapa de la PCR se lleva a cabo a partir de ADN genómico, ARNm o ADNc, eventualmente después de la etapa de transcripción inversa, o sus fragmentos, usando los siguientes conjuntos de cebadores:
a)
5'-TCATACTCAGGAAGACAGCAA-3' (cebador directo SEC ID nº 2) y 5'-CAATAGCCATGACTCCTAA-3' (cebador inverso SEC ID nº 3) para el SNP "K121 Q";
b)
5'-AGCATTTTTACACTTTAGTT-3' (cebador directo SEC ID nº 4) y 5'-ATAATGTATGGTAGGATTT-3' (cebador inverso SEC ID nº 5) para el SNP IVS20 delT - 11; y
c)
5'-ATATTCCTATCCTGCTCACT-3' (cebador directo SEC ID nº 6) y 5'-TGCAGCTGGCCCTTAGGCCG-3' (cebador inverso SEC ID nº 7) para el SNP A>G +1044 TGA.
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En una forma de realización particular, dicho método para determinar si un sujeto tiene un aumento (elevado) de riesgo de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad según la invención se caracteriza porque la etapa de la PCR se lleva a cabo a partir de ADN genómico, ARNm o ADNc, eventualmente después de una etapa de transcripción inversa, o sus fragmentos, usando los dos siguientes conjuntos de cebadores:
a)
- 5'-CTTTCCCCAATCACTACAGCATTGTCA-3' (cebador directo, exón 7, SEC ID nº 8), y 5'-TTTCAGACCATCCATCAGCATACCAAC-3' (cebador inverso exón 12, SEC ID nº 9); y para el SNP de 3'UTR
b)
- 5'-GTCCTGTGTTTGACTTTGATTATGA-3' (cebador directo exón 23, SEC ID nº 10), y - 5'-CCCTTAGGCCGTTGAAGAATGGTCA-3' (cebador inverso 3'UTR, SEC ID nº 11).
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En una forma de realización también preferida, dicho método para determinar si un sujeto tiene un aumento (elevado) de riesgo de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad según la invención se caracteriza porque dicha muestra biológica es una muestra de hígado, adipocitos o células beta pancreáticas, cuando la presencia de dicho haplotipo se determina en una secuencia de ARN o sus fragmentos.
La invención también describe métodos para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad a partir de una muestra de plasma o de suero procedente de dicho sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de:
a)
determinar la concentración de la proteína ENPP1 en el suero o en el plasma; y
b)
observar si el sujeto tiene o no un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad mediante la observación de si dicha concentración es significativamente mayor que el nivel normal, indicando la presencia de dicha concentración significativamente mayor que dicho sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad.
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Concentración significativa mayor de proteína ENPP1 en suero o plasma corresponde a por lo menos más de 10%, preferentemente más de 15% de la concentración normal en suero o plasma.
La presente invención describe además métodos para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad a partir de una muestra de plasma o suero procedente de dicho sujeto, según la invención, en los que dicha concentración de proteína ENPP1 en suero o plasma se determina usando anticuerpos capaces de reconocer específicamente la proteína ENPP1 o un fragmento epitópico específico de la
misma.
En estos métodos, dichos anticuerpos se ponen en contacto con el suero o plasma a ensayar, en condiciones que permitan la formación de un complejo inmunológico específico entre la proteína ENPP1 y dicho anticuerpo, y se cuantifican los complejos inmunológicos formados.
Otros aspectos engloban un método para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad a partir de una muestra de plasma o suero procedente de un sujeto y a partir de una muestra biológica que contiene una secuencia de ADN genómico o ARN, o sus fragmentos, susceptible de contener los haplotipos de riesgo de tres alelos del gen ENPP1, comprendiendo dicho método determinar la concentración de proteína ENPP1 en suero o plasma y observar si dicha concentración de proteína ENPP1 en suero o plasma es significativamente mayor que el nivel normal, y si dicha secuencia de ADN o ARN contiene el haplotipo de riesgo de tres alelos.
En una forma de realización preferida para estos métodos para determinar si un sujeto tiene un aumento (elevado) de riesgo de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad, la patología relacionada con obesidad se selecciona del grupo que consiste en diabetes de tipo 2, hipertensión, hipercolesterolemia e hiperlipidemia, particularmente diabetes de tipo 2.
En otro aspecto, la presente invención también describe un kit para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología desarrollada con obesidad, que comprende uno o más cebadores o conjunto de cebadores, o sondas, opcionalmente con una porción o todos los reactivos necesarios e instrucciones para genotipar un sujeto de ensayo determinando la identidad de un nucleótido en los tres siguientes SNP de la región ENPP1:
-
K121Q,
-
IVS20 delT-11, y
-
un SNP localizado en la secuencia del dominio 3'UTR.
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Los cebadores o las sondas de dicho kit se pueden unir opcionalmente a un soporte sólido, o pueden ser parte de un conjunto o conjunto dirigible de polinucleótidos. El kit puede proporcionar la determinación de la identidad del nucleótido en estos tres SNP de la posición de la región de ENPP1 mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, un método de ensayo de secuenciación, un método de ensayo de microsecuenciación, un método de ensayo de hibridación, un método de amplificación específica de alelos, o un ensayo de detección de desemparejamientos basado en reacción de cadena de polimerasas y/o ligasas.
En una forma de realización preferida, dicho kit para determinar si un sujeto tiene un aumento del riesgo de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad, que comprende por lo menos un par de cebadores o un conjunto de un par de cebadores capaces de amplificar un fragmento de ADN genómico o ARN que codifica la proteína ENPP1 y susceptible de contener el haplotipo que comprende los tres siguientes SNP:
-
K121Q,
-
IVS20 delT-11, y
-
un SNP localizado en la secuencia del dominio 3'UTR.
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En una forma de realización más preferida para dicho kit, el SNP localizado en el dominio 3'UTR se selecciona del grupo de los SNP que consiste en A>G +1044 TGA, A>C +1092 TGA, G>T +1101 TGA, T>C +1137 TGA, C>T +1157 TGA, G>T +1236 TGA, T>C +1348 TGA, G>A +1350 TGA, A>G +1539 TGA y T>C +1670 TGA. Todavía más preferido para dicho kit, el SNP localizado en el dominio 3'UTR se selecciona del grupo de los SNP que consiste en A>G +1044 TGA, A>C +1092 TGA y C>T +1157 TGA, prefiriéndose también el grupo de los SNP A>G +1044 TGA y A>C +1092 TGA, y siendo el más preferido A>G +1044 TGA.
En una forma de realización particular, la invención engloba un kit para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad según la presente invención, en el que dicho por lo menos conjunto de un par de cebadores es:
a)
5'-TCATACTCAGGAAGACAGCAA-3' (cebador directo SEC ID nº 2) y 5'-CAATAGCCATGACTCCTAA-3' (cebador inverso SEC ID nº 3) para el SNP "K121Q";
b)
5'-AGCATTTTTACACTTTAGTT-3' (cebador directo SEC ID nº 4) y 5'-ATAATGTATGGTAGGATTT-3' (cebador inverso SEC ID nº 5) para el SNP IVS20 del T - 11; y
c)
5'-ATATTCCTATCCTGCTCACT-3' (cebador directo SEC ID nº 6) y 5'-TGCAGCTGGCCCTTAGGCCG-3' (cebador inverso SEC ID nº 7) para el SNP A>G +1044 TGA.
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En otra forma de realización particular, la invención engloba un kit para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad según la presente invención, en el que dicho por lo menos conjunto de un par de cebadores es:
a)
- 5'-CTTTCCCCAATCACTACAGCATTGTCA-3' (cebador directo, exón 7, SEC ID nº 8), y - 5'-TTTCAGACCATCCATCAGCATACCAAC-3' (cebador inverso exones 12, SEC ID nº 9); y para el SNP 3'UTR;
b)
- 5'-GTCCTGTGTTTGACTTTGATTATGA-3' (cebador directo exón 23, SEC ID nº 10), y
- 5'-CCCTTAGGCCGTTGAAGAATGGTCA-3' (cebador inverso 3'UTR, SEC ID nº 11).
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En otro aspecto, la presente invención se refiere a una secuencia nucleica variante aislada, o a una molécula de ácido nucleico aislada, o una secuencia complementaria de la misma, de un mamífero, preferentemente humano, secuencia de ADN genómico o de ARN del gen que codifica la proteína ENPP1, caracterizada porque dicha secuencia nucleica variante aislada comprende el haplotipo que comprende los tres SNP como se define anteriormente K121Q, IVS20 delT-11 y un SNP localizado en la secuencia del dominio 3'UTR, tal como uno de los SNP seleccionados del grupo de los SNP que consiste en A>G +1044 TGA, A>C +1092 TGA, G>T +1101 TGA, T>C +1137 TGA, C>T +1157 TGA, G>T +1236 TGA, T>C +1348 TGA, G>A +1350 TGA, A>G +1539 TGA y T>C +1670 TGA, siendo más preferido el SNP A>G +1044 TGA o A>C +1092 TGA de los SNP localizados en la secuencia del dominio 3'UTR, y siendo el más preferido el SNP A>G +1044 TGA.
Una secuencia o molécula de ácido nucleico "aislada" es aquella que se separa de otras secuencias o moléculas de ácidos nucleicos que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferentemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del sujeto a partir del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la secuencia nucleica variante aislada de la invención puede contener menos de alrededor de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias nucleotídicas que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula a partir de la cual deriva el ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención se puede aislar usando técnicas de biología molecular estándar y la información de secuencias proporcionada aquí. Usando toda o una porción de la secuencia de ácido nucleico variante de ENPP1 que comprende el haplotipo que comprende los tres SNP como se definen anteriormente, K121Q, IVS20 delT-11 y un SNP localizado en el dominio 3'UTR, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención se pueden aislar usando técnicas de hibridación y clonación estándar (por ejemplo, como se describe en in Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2ª, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferentemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica la secuencia nucleica variante aislada de ENPP1 de la presente invención.
Como se usa aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere como un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que se pueden ligar en el genoma vírico segmentos de ADN adicionales. Algunos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula hospedante en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación, y vectores de mamíferos episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedante al introducirlos en la célula hospedante, y de ese modo se replican junto con el genoma del hospedante. Además, algunos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están enlazados de forma operativa. Tales vectores se denominan aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se pueden usar de forma intercambiable, ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que tienen funciones equivalentes.
Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden comprender la secuencia nucleica variante aislada del gen que codifica la proteína ENPP1 de la presente invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedante, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células hospedantes a usar para la expresión, que están enlazadas de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "enlazada de forma operativa" quiere decir que la secuencia nucleotídica de interés está enlazada a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro, o en una célula hospedante cuando el vector se introduce en la célula hospedante). La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Los vectores de expresión de la invención, tales como el vector de expresión de levaduras o los vectores de expresión de baculovirus, se pueden introducir en células hospedante, en célula procariota o eucariota, para producir de ese modo proteínas o péptidos. En otra forma de realización, el vector de expresión de la presente invención es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en células de mamíferos o en un tipo de célula particular (por ejemplo, los elementos reguladores específicos de tejidos se usan para expresar el ácido nucleico).
Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedantes en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Las expresiones "célula hospedante" y "célula hospedante recombinante" se usan aquí de forma intercambiable. Se entiende que tal expresión se refiere no sólo a la célula sujeto particular, sino a la progenie o progenie potencial de tal célula. Debido a que se pueden producir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias medioambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica a la célula progenitora, pero todavía se incluye en el alcance de la expresión como se usa aquí.
Una célula hospedante puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, la secuencia nucleica variante de ENPP1 aislada de la presente invención se puede expresar en células bacterianas tales como E. coli, en células de insectos, en levadura o en células de mamíferos (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS o células humanas). Otras células hospedantes adecuadas son conocidas por los expertos en la materia, incluyendo oocitos de Xenopus laevis.
El ADN vectorial se puede introducir en células procariotas o eucariotas vía técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se usan aquí, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedante, incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedantes se pueden encontrar en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) y otros manuales de labo-
ratorio.
Para la transfección estable de células de mamíferos, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección usados, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. A fin de identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células hospedantes, junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos.
Las células hospedantes de la invención también se pueden usar para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una forma de realización, una célula hospedante de la invención es un oocito fertilizado o una célula madre embriónica en la que se ha introducido la secuencia nucleica variante de ENPP1 aislada de la presente invención. Tales células hospedantes se pueden usar entonces para crear animales transgénicos no humanos, en los que la secuencia nucleica variante de ENPP1 exógena de la presente invención se ha introducido en su genoma, o animales recombinantes homólogos, en los que la secuencia nucleica de ENPP1 endógena se ha alterado a fin de insertar la variante haplotípica de la presente invención. Tales animales son útiles para estudiar la función y/o actividad del polipéptido ENPP1 o su fragmento, y para identificar y/o evaluar moduladores de ENPP1. Como se usa aquí, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferentemente un mamífero, más preferentemente un roedor tal como una rata o un ratón, en el que una o más de las células del animal incluye un transgén. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios, etc. Un transgén es ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de ese modo la expresión de un producto génico codificado, en uno o más tipos celulares o tejidos del animal transgénico. Como se usa aquí, un "animal recombinante homólogo" es un animal no humano, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ratón, en el que un gen ENPP1 endógeno se ha alterado mediante recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógeno introducida en una célula del animal, por ejemplo una célula embriónica del animal, antes del desarrollo del
animal.
Un animal transgénico de la invención se puede crear introduciendo el ácido nucleico variante de ENPP1 de la presente invención en los pronúcleos masculinos de un oocito fertilizado, por ejemplo mediante microinyección o infección retrovírica, y permitiendo que el oocito se desarrolle en un animal hembra adoptivo pseudopreñado. Como alternativa, como transgén se puede usar un homólogo no humano de la variante del gen ENPP1 humana de la presente invención, tal como una variante del gen ENPP1 de ratón o de rata. Los métodos para generar animales transgénicos vía manipulación embriónica y microinyección, particularmente animales tales como ratones, se han convertido en convencionales en la técnica, y están bien descritos.
Para crear un animal en el que se ha introducido en el genoma un ácido nucleico deseado, vía recombinación homóloga, se prepara un vector que contiene por lo menos una porción de un gen ENPP1 en el que la por lo menos tres mutaciones del haplotipo de la presente invención se ha introducido para alterar de ese modo el gen ENPP1.
De este modo, la presente invención se refiere a un mamífero transgénico, excepto humano, caracterizado porque comprende una célula transformada según la invención o una célula que contiene un gen ENPP1 funcional recombinante que comprende por lo menos el haplotipo que comprende los tres SNP como se define anteriormente (K121Q, IVS20 delT-11 y un SNP localizado en la secuencia del dominio 3'UTR).
En otro aspecto, la invención comprende el uso de una célula o un animal transgénico según la presente invención para identificar compuestos químicos o bioquímicos para el tratamiento o la prevención de obesidad o patología relacionada con la obesidad.
En una forma de realización preferida, dicho método para seleccionar un compuesto químico o bioquímico para el tratamiento o la prevención de obesidad o patología relacionada con la obesidad se caracteriza porque comprende las etapas de:
a)
poner en contacto una célula transformada o un mamífero transgénico según la invención con dicho compuesto químico o bioquímico a ensayar; y
b)
observar si el producto de expresión del gen ENPP1 disminuye o no en dicha célula o dicho mamífero.
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En una forma de realización más preferida, dicho método para seleccionar un compuesto químico o bioquímico para el tratamiento o la prevención de obesidad o patología relacionada con la obesidad según la presente invención se caracteriza por:
-
en la etapa a), el compuesto químico o bioquímico a ensayar se administra a un mamífero transgénico de la presente invención, o a un mamífero transgénico que expresa la proteína ENPP1; y
-
en la etapa b), se observa si la concentración de proteína ENPP1 en el suero o en el plasma disminuye en comparación con una referencia,
seleccionándose dicho compuesto químico o bioquímico si se observa una disminución de dicha concentración.
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La presente invención también describe un método para determinar la eficacia de un fármaco para reducir el riesgo de obesidad o patología relacionada con la obesidad en un paciente, que comprende las etapas de
(a)
recoger una muestra de suero o plasma procedente de dicho paciente antes y después de administrar dicho fármaco a dicho paciente;
(b)
determinar la concentración de proteína ENPP1 en el suero o plasma en dicha muestra recogida, en el que una disminución en la concentración de proteína ENPP1 en suero o plasma, subsiguiente a dicho tratamiento, es indicativa de un tratamiento que reduce el riesgo de obesidad o patología relacionada con la obesidad.
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Ejemplos
En los siguientes ejemplos se describen varios de los métodos de la presente invención, ejemplos los cuales se ofrecen a título de ilustración y no a título de limitación. Se pueden realizar muchas otras modificaciones y variaciones de la invención como se expone aquí sin separarse del espíritu ni alcance de la misma.
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Leyendas de las figuras
Figura 1. LD por parejas entre cincuenta y tres SNP en una región de 580 kb que incluye el gen ENPP1 en 421 niños obesos y 298 individuos de control. Las regiones de LD (delta) alto y bajo se presentan mediante un sombreado rojo y azul, respectivamente. La gráfica está a la escala del mapa físico.
Figura 2. Asociación alélica de cincuenta y tres SNP en la región de 580 kb que incluye los genes ARG1, CRSP3, ENPP3, ENPP1 y CTGF. Los círculos azules corresponden al -log_{10} (valor de p) para la comparación de la distribución alélica entre 421 niños obesos y 298 individuos de control. Los círculos rojos corresponden al -log_{10} (valor de p) para la comparación de la distribución alélica entre 62 niños obesos de familias con "signos de 6q" y 298 individuos de control. La figura no está a escala según la localización del mapa físico; de hecho, los SNP están equidistantes para permitir la fácil visualización de los resultados del ensayo de asociación.
Figura 3. Correlación del nivel sérico de la proteína ENPP1 con la puntuación Z de BMI en 279 niños.
Figura 4. Nivel sérico de ENPP1 en 89 niños delgados según la presencia del haplotipo de riesgo.
Figuras 5A y 5B. Expresión de ARNm de PC-1/ENPP1 en tejidos humanos. Se llevó a cabo una PCR para detectar \beta-actina y ENPP1. Línea 1, corazón; 2 cerebro; 3, placenta; 4, pulmón; 5, hígado; 6, músculo esquelético; 7, riñón; 8, páncreas (panel de MTC); 9, células beta humanas; 10, adipocito subcutáneo y 11, adipocito epiploico. Teniendo en cuenta que cinco isoformas de ENPP1 se describieron en las bases de datos (http://www.ncbi.nih.gov/IEB/Research/
Acembly/av.cgi?db=human&1=ENPP1), se diseñaron en primer lugar cebadores que amplifican una región codificante entre el exón 7 y 12 que es común a por lo menos 3 transcritos, y se encontró expresión ubicua (figura 5A). Después se diseñaron cebadores específicos de la isoforma de ARNm larga, caracterizada por una 3'UTR más grande (1.170 bases en dirección 3' del TGA, incluyendo el SNP asociado con la obesidad A/G +1044 TGA), y se encontró una expresión específica para el páncreas y células beta, adipocito subcutáneo y epiploico, de hígado (figura 5B).
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Ejemplo 1 Métodos a) Sujetos
En la tabla 1 se resumen las características fenotípicas y el tipo de estudio llevado a cabo sobre cada muestra.
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TABLA 1 Descripción de las muestras francesa y austríaca usadas en el estudio. Relación de sexos: hembra/varón
2
Se estudiaron quinientos veintinueve niños obesos no relacionados. Se recogieron 336 árboles genealógicos con por lo menos un niño obeso en la Unidad de CNRS-Institut Pasteur y en el Hospital Jeanne de Flandres en Lille. Se reclutaron ciento seis niños obesos adicionales en el Hospital de los Niños, Toulouse, y 87 en el Hospital Trousseau, París. Los niños con un BMI mayor que el 97º percentil de BMI para la edad y sexo dado en las tablas de Rolland-Cachera et al^{12} (población general francesa) se diagnosticaron como obesos según la recomendación del European Childhood Obesity Group (ECOG)^{42}. Se usó un conjunto de 696 pacientes adultos mórbidamente obesos no relacionados (BMI \geq 40 kg/m^{2}) y 717 pacientes adultos moderadamente obesos no relacionados (BMI entre 30 y 40 kg/m^{2}). También se usaron, para TDT, 87 árboles genealógicos con obesidad de adulto (un probando con un BMI mayor que 40 kg/m^{2}, por lo menos un hermano adicional con un BMI mayor que 27 kg/m^{2}, y por lo menos un progenitor). Estos individuos se reclutaron en el Departamento de Nutrición del Hospital Hötel Dieu en París o en la Unidad de CNRS-Institut Pasteur en Lille. Los 752 sujetos con T2D se reclutaron en el Hospital Sud Francilien en Corbeil-Essonnes, o en la Unidad de CNRS-Institut Pasteur en Lille. El estado de intolerancia a la glucosa y de diabetes de tipo 2 se definió según los criterios de la OMS de 1999. El primer conjunto de 556 sujetos de control se obtuvo de la población de SUVIMAX^{43}. El segundo conjunto de 649 individuos de control se reclutaron en la Unidad de CNRS-Institut Pasteur en Lille, y a través del estudio^{44} "Fleurbaix-Laventie Ville Santé". El conjunto de 1.261 sujetos austriacos no relacionados es un subconjunto al azar de una población descrita previamente^{45}. A fin de justificar el uso de controles sin concordancia de edad, y para confirmar que no hubo ningún efecto de cohortes de edad sobre SNP y frecuencias haplotípicas, se genotiparon los polimorfismos K121Q, IVS20 delT -11 y A>G +1044 TGA en 198 niños de control procedentes del estudio^{44} "Fleurbaix-Laventie Ville Santé", y se encontraron frecuencias muy concordantes para el alelo Q (13,8%) y el haplotipo de riesgo (7,8%) en comparación con los adultos de control. Los 458 tríos de control (2 progenitores y un niño delgado) procedieron de la cohorte de "Fleurbaix-Laventie Ville Santé". Antes de la participación, se obtuvo una autorización por escrito de todos los sujetos. El estudio genético fue aprobado por el Comité Ético de Hotel Dieu en París y CHRU en Lille. La puntuación Z de BMI se obtuvo según el método de Cole^{46}. Durante el ensayo de tolerancia a la glucosa oral (OGTT), los sujetos recibieron después de un ayuno nocturno de 12 h: 1) 1 g de glucosa/kg si el peso del sujeto era menor que 50 kg; 2) 75 g de glucosa si el peso del sujeto fue mayor que 50 kg. Se tomaron muestras de sangre a 0, 30, 60, 90 y 120 minutos para la medida de las concentraciones de glucosa e insulina en plasma. Las medidas cuantitativas de insulina plasmática se llevaron a cabo usando radioinmunoensayos de doble anticuerpo. Las concentraciones de glucosa sérica se midieron usando un procedimiento de glucosa oxidasa. El índice insulinogénico se calculó según Seltzer et al^{47}.
b) Análisis de ligamiento
En sesenta y ocho familias nucleares, que comprenden 306 individuos, se usaron para el genotipado cinco marcadores polimórficos (D6S1720, D6S434, D6S287, D6S1656, D6S292) que cubren el intervalo de ligamiento del estudio a nivel genómico inicial^{1}. Se llevaron a cabo análisis de dos puntos y de múltiples puntos usando cada ensayo de MLS^{48} implementado en el software de GeneHunter^{49}.
c) Detección de la mutación
Los veinticinco exones y UTR (5'UTR en dirección 5', y 3'UTR en dirección 3') se examinaron usando DHPLC (Transgenomic, San José, Calif., USA) en 48 niños obesos no relacionados seleccionados al azar entre familias que contribuyen a la conexión en el locus del cromosoma 6q16-q24, y en 24 sujetos de control normoglucémicos no obesos no relacionados seleccionados de árboles genealógicos franceses. Los perfiles variantes se secuenciaron usando un secuenciador automatizado de ADN ABI Prism 3700 en combinación con el kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA).
d) Genotipado
El genotipado de marcadores microsatélites se llevó a cabo usando una técnica semiautomatizada basada en la fluorescencia en máquinas de secuenciación automatizada de ADN (ABI 377, PE ABI). Los cebadores se sintetizaron por MWG Biotech. Los SNP se genotiparon con LightCycler^{TM}, LightTyper^{TM} (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza), con el TaqMan^{TM} (Applied Biosystems, Foster City, Calif. USA) o mediante secuenciación directa. Las sondas para LightCycler^{TM} y LightTyper^{TM} se sintetizaron mediante TIB Molbiol^{TM} Syntheselabor Alemania. Para la cobertura de la región de 580 kb, se seleccionaron los SNP con una frecuencia alélica > 10% en caucásicos usando el software Applied Biosystem SNP Viewer II. A fin de evitar errores de genotipado de SNP, el 10% de las muestras de ADN se volvió a genotipar sistemáticamente para una verificación adicional. Se encontraron tasas de concordancia de 100% para todos los SNP.
e) Análisis estadísticos
La comparación de frecuencias alélicas entre los casos y los controles se logró usando la prueba de la \chi^{2}, y el valor de p se calculó empíricamente con el programa CLUMP^{50}. Se determinaron las frecuencias haplotípicas, y se compararon entre grupos con el software UNPHASED http://www.mrc-bsu.cam.ac.uk/opersonalfrank/^{51}. El efecto de los haplotipos sobre la variación de los rasgos cualitativa o cuantitativa se evaluó usando los subprogramas cocaphase y qt-phase del software UNPHASED^{51}. La independencia de la asociación se ensayó con el programa THESIAS^{32}. THESIAS también implementa un algoritmo EM y permite el ensayo de probabilidad de modelos de efecto haplotípico en un marco lineal. Se usó este programa para ensayar si el efecto de cada SNP, sobre el estado de obesidad, fue independiente del efecto de K121Q solo. Se prefirió el análisis de haplotipos con respecto a la regresión logística múltiple, ya que estos SNP estaban en LD parcial. Los análisis de TDT sobre SNP y haplotipos se llevaron a cabo mediante el método de TDT implementado en el software UNPHASED^{51}. Debido al bajo LD entre los tres SNP del haplotipo de riesgo, sólo se usaron los haplotipos no ambiguos para obtener un TDT verdadero robusto para la estratificación de la población. A fin de evaluar el efecto del haplotipo de riesgo sobre la conexión, se usó el procedimiento^{23} del ensayo de compartición de IBD de genotipos (GIST), que estudia la correlación entre la puntuación de NPL familiar y un índice de la frecuencia del haplotipo de riesgo en la familia.
f) Análisis de desequilibrio de ligamiento
Se investigó el LD (desequilibrio de ligamiento) entre veinticuatro SNP de ENPP1 identificados, y entre cincuenta y tres SNP en la región de ENPP1 de 580 kb. Se estimó delta por parejas (coeficiente de correlación entre los SNP) a partir de los genotipos, y los resultados se visualizaron mediante el programa GOLD (http://www.sph.umich.edu/csg/ abecasis/GOLD/).
g) Expresión de ARNm de ENPP1
Para el análisis de la expresión de ARNm se usaron ADNc humanos procedentes del Panel de MTC (BD Biosciences Contech), adipocitos subcutáneos y epiploicos (proporcionados por G Fruhbeck, Universidad de Navarra, Pamplona, España) y células beta pancreáticas purificadas mediante FACS (proporcionadas por Human Pancreatic Cell Core Facility, University Hospital, Lille, Francia^{52}). La pureza de las células beta se confirmó mediante inmunoquímica (98% de células positivas a insulina) y PCR (ausencia de amplificación con cebadores de quimiotripsina, específicos para células exocrinas). La PCR se llevó a cabo en una mezcla de 25 \mul que contiene 10 mM de Tris-HCl, 1.5 mM de MgCl2, 50 de KCI, 10 mM de cada uno de los dNTP, 2,5 U de Taq polimerasa (Promega), 30 mM tanto de cebador directo como de cebador inverso, y 3 \mul de ADNc monocatenario. El cebador directo para ENPP1 fue (SEC ID nº 8) 5'-CTTTCCCCAATCACTACAGCATTGTCA-3' (exón 7); y el cebador inverso fue (SEC ID nº 9) 5'-TTTCAGACCATCCATCAGCATACCAAC-3' (exón 12); y para beta-actina, se usó un cebador directo (SEC ID nº 12: 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3') y un cebador inverso (SEC ID nº 13: 5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3'). La isoforma de ENPP1, caracterizada por una 3'UTR más grande (1.170 bases en dirección 3' del codón de parada TGA) se amplificó usando SEC ID nº 10 5'-GTCCTGTGTTTGACTTTGATTATGA-3'(exón 23) y (SEC ID nº 11 5'-CCCTTAGGCCGTTGAAGAATGGTCA-3' (3'UTR)). Las mezclas se calentaron a 95ºC durante 2 minutos, y se sometieron a una amplificación de 45 ciclos a 95ºC durante 30 s, 68ºC durante 2 min., y 72ºC durante 2 min, y después 10 min a 72ºC. Los productos de la PCR se separaron en un gel de agarosa al 2% (p/v), y se visualizaron usando bromuro de etidio y transiluminación con UV.
h) Ensayos séricos de proteína ENPP1
El nivel sérico de ENPP1 se midió usando el ELISA descrito por Rutsch et al.^{2}
Ejemplo 2 Búsqueda de genes candidatos posicionales en el cromosoma 6q163-q24.2
Las características fenotípicas de 62 familias con "evidencia de 6q" (definidas mediante una puntuación Z de Gene Hunter de genealogía individual > 1,0 en el intervalo de caída 2-LOD flanqueado por los marcadores microsatélites D6S434 y D6S1704) se compararon primeramente con las 35 familias restantes, todas procedentes de nuestro barrido genómico publicado previamente para la obesidad de la niñez.
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TABLA 2 Características fenotípicas de familias con "signos de 6q"
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Como se muestra en la Tabla 2, los niños obesos con "signos de 6q" tienen una puntuación Z de BMI significativamente mayor (desviación del índice de masa corporal en comparación con una población de referencia francesa^{12}). Después del ajuste de parámetros para sexo, edad y BMI, sus niveles de glucemia tras la administración de glucosa son mayores, y su índice insulinogénico, que estima la secreción de insulina de primera fase, es significativamente más bajo que en niños de otras familias. Además, el 3,1% de los niños obesos con "signos de 6q" no toleran la glucosa o son diabéticos; por el contrario, ninguno de los niños obesos en otras familias es intolerante a la glucosa. También se investigó la generación previa, y se encontró que 13,8% de los padres ligados mediante 6q tienen diabetes mellitus de tipo 2 (T2D), en comparación con 3,2% de padres en otras familias (p=0,02). Estos datos condujeron a la conclusión de que el gen o genes de susceptibilidad a la obesidad, en el cromosoma 6q también puede (pueden) estar implicado (implicados) en la homeostasis de la glucosa.
Basándonos en un barrido genómico en busca de la obesidad de la niñez^{1}, el intervalo de caída 2-LOD para el pico de ligamiento de 6q16.3-q24.2 cubre 41,4 Mb e incluye 166 genes referenciados. A fin de centrar la búsqueda de genes de susceptibilidad a la obesidad en un área cromosómica más restringida, se analizaron los picos de 7 informes publicados de ligamiento en el cromosoma 6q16.1-q27 con obesidad^{2}, secreción de insulina^{3,4} o T2D^{5-8}, todos llevados a cabo en adultos. Se identificó un intervalo de 2,4 Mb común a todos los barridos genómicos, comprendiendo la región entre los marcadores D6S1656 y D6S270. Entre los veintidós genes cartografiados en este intervalo, el mejor candidato fisiológico fue ectonucleótido pirofosfatasa/fosfodiesterasa ENPP1 (también conocida como la glicoproteína 1 de las células plasmáticas PC-1) (referencia 173335 de OMIM). Se cree que ENPP1 inhibe directamente los cambios conformacionales del receptor de insulina inducidos por insulina, afectando de ese modo a su activación y a la señalización aguas abajo^{9,13}. A este respecto, una mutación de sentido erróneo funcional (K121Q), que se propuso que inhibía más eficazmente la señalización de insulina^{11}, se asoció con resistencia a insulina o T2D en diversos grupos étnicos^{14-18}.
El marcador microsatélite D6S1656 en el intrón 1 del gen ENPP1, ligado a la obesidad de la niñez en nuestro barrido genómico, se analizó en un segundo conjunto de replicación de 68 familias que tienen por lo menos dos hermanos con BMI > 95º percentil (corregido para el género y edad), y se observó una leve prueba de ligamiento (MLS.83, p=0,04). Por el contrario, no se encontró ligación con la obesidad con otros 4 marcadores microsatélites de esta región en el conjunto de replicación (datos no mostrados). El alelo 10 de D6S1656 también se subtransmitió significativamente para afectar a niños tanto en el conjunto inicial como en el de la replicación (44 transmitidos frente a 69 no transmitidos, p=0.02, datos no mostrados). Estos resultados sugieren que se pueden localizar cerca polimorfismos funcionales en desequilibrio de ligamiento (LD) parcial.
Ejemplo 3 Variación de secuencia con el gen ENPP1 y asociación con obesidad debido a los SNP de ENPP1
La ENPP1 tiene 25 exones y abarca alrededor de 83,2 Kb. A fin de caracterizar la variación de secuencia en el gen, se llevó a cabo una secuenciación de todas las regiones codificantes 1,3 Kb en dirección 5' del codón de partida ATG y en dirección 3' del codón de parada TGA en 48 niños obesos de las familias de "signos de 6q" y en 24 adultos no obesos. Se identificaron en la secuencia en dirección 5' ocho polimorfismos de nucleótido sencillo (SNP), seis en uniones intrón/exón, cuatro tuvieron sentido erróneo, tres fueron mutaciones sinónimas, y veinte se identificaron en la secuencia en dirección 3' (véase la tabla 3)
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TABLA 3 Polimorfismos en las regiones próximas 5' y 3', exones y fronteras del gen ENPP1
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Entre estos cuarenta y un polimorfismos, veinticuatro estaban presentes en las bases de datos públicas, y veintidós de las variantes tuvieron una frecuencia alélica minoritaria (MAF) mayor que 5%. Para los diecinueve polimorfismos infrecuentes, se inspeccionó su transmisión en las genealogías. Cuando el alelo raro estaba presente en hermanos sin afectar, la variante ya no se investigó más (n=14). Los cinco restantes SNP raros no mostraron ninguna asociación significativa con obesidad en análisis de caso-control (datos no mostrados). Se usó LD por parejas entre los veintidós SNP más comunes, más otros dos: SNP23 (3,5%), previamente descritos por influir sobre la estabilidad de ARNm^{19}, y una inserción de 13 pb (SNP31, Ins 13pb +828 TGA, prevalencia 4,2%) para seleccionar un conjunto de diez SNP "marcadores de haplotipos" para ser tipados en el conjunto completo de muestras.
Para potenciar adicionalmente las ocasiones para identificar SNP funcionales, se identificaron veinticinco fragmentos que tuvieron más de 100 pb de longitud, que muestran un grado elevado de homología (>70%) a lo largo de los genomas de Fugu rubripes, rata y humano, y en los 198 Kb de las regiones intrónica e intergénica de 5' y 3' del gen ENPP1. Estos fragmentos se secuenciaron, y se identificaron once SNP adicionales de MAF >5%. Estos SNP se usaron inicialmente para genotipar un conjunto de ensayo de 421 niños obesos y 298 individuos de control. Al conjunto de los SNP analizados en todo el conjunto de muestras, se añadió un SNP en la región 3' de ENPP1 (T>G +5954 TGA) que mostró una tendencia a la asociación con la obesidad en la niñez (p<0,1).
En conjunto, se genotiparon once SNP en 2.430 individuos, formado por 529 niños obesos no relacionados, 696 adultos obesos mórbidamente no relacionados, y 1.205 adultos normoglucémicos delgados. Los adultos delgados se usaron como controles para ambos conjuntos de casos, debido a que demostraron una resistencia a largo plazo frente a la obesidad. Como se muestra en la Tabla 4, se observaron asociaciones entre formas graves de obesidad y seis de los SNP: IVS2 deIG +8, K121Q, IVS8 T>G +27, Ins20 delT -11, A>G +1044 TGA y T>G +5954 TGA (véase la Tabla 4, 0,00008<p<0,03; 1,21 >0R>1,37). El valor de p global, evaluado mediante 10^{5} permutaciones del estado de obesidad entre individuos, fue 0,001. El análisis de los datos reunidos identificó la asociación más fuerte con formas graves de obesidad del SNP K121Q (OR=1,37, intervalo de confianza de 95% [1,17-1,61], p=6,00008). La relación impar en un modelo recesivo se incrementó a 3,29 [1,83 - 5,93] (p=0,00003), con una separación significativa del modelo aditivo (p=0,02).
Para ensayar esta asociación adicionalmente, se genotiparon para este SNP 184 familias múltiples. Este conjunto consistió en 97 familias de barrido genómico de obesidad de la niñez más 87 familias nucleares con obesidad grave de adultos, que mostró ligación de los niveles de leptina sérica con el cromosoma 6q24^{20}. Usando el Ensayo de Desequilibrio de Transmisión (TDT), el alelo 121 Q se sobretransmitió significativamente a la descendencia obesa (transmitido: 76, no transmitido: 48, p=0,01), apoyando el resultado del caso-control.
Para confirmar la especificidad de ENPP1 para estas asociaciones, se tiparon en el conjunto inicial de 421 niños obesos y 298 individuos de control usados anteriormente (densidad media:1 SNP/10,9 kb) un total de cincuenta y tres SNP en la región cromosómica 6q, que abarca 580 kb y que incluye los genes ARG1, CRSP3, ENPP3, ENPP1 y CTGF. Usando el software gold, se observaron tres regiones distintas de desequilibrio de ligamiento (LD); la primera contenía ARG1, CRSP3 y ENPP3, la segunda un ENPP1 solo, y la tercera el gen CTGF y 176 de una región no codificante (figura 1). La comparación de la distribución alélica de los cincuenta y tres SNP entre niños obesos y los controles, y también entre sesenta y dos niños obesos con "signos de 6q" y los controles, reveló que ocho SNP estaban asociados tanto con obesidad en la niñez con obesidad en la niñez con "signos de 6q" (p<0,05). Siete de los ocho SNP (K121Q, Celera dbSNP hcV1207989, C>T +164 TGA, Celera dbSNP hcV1207974, A>G +1044 TGA, G>T +1101 TGA, C>T +1157TGA) se cartografiaron en ENPP1 (figura 2). El octavo SNP asociado se localizó en una región intergénica, 69 kb 3' de CTGF, y no se localizó en un fragmento que muestra un grado elevado de homología a lo largo de los genomas Fugu rubripes, roedores y humanos, y sin ningún sitio de unión al factor de transcripción conocido. Estos
datos apoyan la hipótesis de que la asociación observada con la obesidad de la niñez es debida a los SNP de ENPP1.
TABLA 4 Asociación positiva (p<0,05) de genotipos y alelos de los SNP del gen ENPP1 con la obesidad. Conjunto de casos 1 = 529 niños caucásicos franceses con un BMI mayor que el umbral de obesidad del 97º percentil. Conjunto de control 1 = 556 adultos caucásicos franceses no obesos y normoglucémicos. Conjunto de casos 2 = 696 adultos caucásicos franceses con BMI \geq 40. Conjunto de control 2 = 649 adultos caucásicos franceses no obesos y normoglucémicos
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Ejemplo 4 Caracterización de un haplotipo de riesgo de tres alelos asociado fuertemente con formas graves de obesidad
Se evaluó un análisis de dos SNP entre el polimorfismo K 121 Q y los otros 6 SNP asociados con la obesidad para evaluar si estos SNP tuvieron un efecto independiente sobre el riesgo de obesidad. Un ensayo de relación de probabilidad mostró que sólo los SNP IVS20delT-1 y G+1044TGA modularon significativamente el efecto de K121Q (pb.03 y p = 0,04, respectivamente). Merece la pena señalar que, para estos dos SNP, el modelo con el mejor ajuste fue también uno recesivo. Esto puede dar cuenta de la pequeña desviación observada del equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) para estos SNP, ya que se han descartado mediante resecuenciación errores de genotipado (datos no mostrados). Tal desviación se puede esperar en individuos "extremos" afectados cuando el modelo genético no es estrictamente aditivo^{21}.
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A fin de estimar el efecto acumulativo potencial de combinaciones de los tres SNP sobre el riesgo de obesidad, se llevó a cabo un análisis de haplotipos usando los datos de SNP de K121Q, IVS20 delT-11 y A>G +1044 TGA procedentes de todo el conjunto de 2.430 sujetos caucásicos franceses. Se predijeron ocho haplotipos, teniendo cinco de ellos una MAF > 5%. Como se muestra en la Tabla 5, el haplotipo de tipo natural de tres alelos (K121Q/IVS20 delT-11/A>G +1044 TGA, KTA) fue menos frecuente en sujetos obesos que en controles (60,3% frente a 64,0%, p = 0,002). Por el contrario, el haplotipo de riesgo de tres alelos (K121Q/IVS20 delT-11/A>G +1044 TGA, QdelTG) estuvo asociado fuertemente con formas graves de obesidad (11,2% frente a 7,5%, OR = 1,58, p = 0,00001, valor de p empírico <0,0001 para 10^{5} simulaciones). De forma interesante, el efecto del haplotipo de riesgo fue de magnitud similar tanto en adultos mórbidamente obesos como en obesidad de niños (10,8% frente a 7,9%, OR = 1,50, p = 0,006, y 11,7% frente a 7,1%, OR = 1,69, p = 0,0006, respectivamente). La asociación también está apoyada por el análisis de TDT en las 184 familias (Chi2 = 5,68, p = 0,01, Tabla 5).
TABLA 5 Análisis de haplotipos de 1225 niños mórbidamente obesos/obesos y 1205 sujetos de control. Se muestran los haplotipos que comprenden tres polimorfismos (K121Q, IVS20 delT-11, A>G +1044 TGA). Se llevó a cabo un TDT para cada haplotipo en 97 genealogías con obesidad de niños, y en 87 genealogías con obesidad de adultos
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El análisis de TDT en 458 tríos de control caucásicos franceses (2 padres y un niño delgado) no mostró un exceso de transmisión del haplotipo de riesgo (Chi2 = 0,53, p = 0,46, datos no mostrados) y excluyó una distorsión de la relación de transmisión del haplotipo de riesgo en niños no afectados^{22}. Finalmente, se evaluó el efecto de los haplotipos en un conjunto adicional de 717 sujetos adultos con una forma menos grave de obesidad (BMI entre 30 y 40 kg/m^{2}), en comparación con los 649 sujetos de control no obesos normoglucémicos usados previamente. Nuevamente, el haplotipo de riesgo se asoció con obesidad (10,3% frente a 7,9%, OR = 1,37, p = 0,02).
Se usaron varios enfoques para ensayar el impacto del haplotipo de riesgo de ENPP1 sobre el ligamiento con la obesidad en niños observado en el barrido genómico. En primer lugar se detectó una mayor frecuencia del haplotipo de riesgo en individuos procedentes de la familia con "signos de 6q" (16,2% frente a 7,1%, OR = 2,37, p = 0,004) en comparación con otras familias (12,2% frente a 7,1%, OR = 1,65, p = 0,16). Las parejas de hermanos afectadas que comparten el haplotipo de riesgo asociado con la obesidad (15 de un total de 135), cuando se analizaron separadamente, dieron una puntuación de MLS LOD de múltiples puntos máxima de 3,49 en la posición del ligamiento máximo inicial (marcador D6S287). Contrariamente, tras eliminar estas 15 parejas de hermanos afectadas, la puntuación de MLS LOD de múltiples puntos cayó desde 4,06 a 1,6 en el marcador D6S287, y una nueva puntuación de MLS LOD máxima de 2,63 apareció centromérica de 16 Mb al pico original de ligamiento, en el marcador D6S301. Para evaluar la significancia de estas variaciones, se usó el ensayo de compartición de IBD de genotipo (GIST)^{23}. Este ensayo sugiere una tendencia de un posible efecto del haplotipo en un modelo aditivo (p = 0,07) que se hizo significativo para un modelo recesivo (p = 0,03), pero esto se basó solamente en las tres parejas de hermanos afectadas que comparten dos copias del haplotipo. Todos juntos, estos datos sugieren alguna contribución del haplotipo de riesgo de obesidad ENPP1 al ligamiento observado con la obesidad en la niñez en el cromosoma 6q, aunque el resultado de GIST demuestra que es relativamente modesta.
Según estos datos, por lo menos tres SNP de ENPP1 están implicados en la asociación con obesidad. Se cree que la variante Q121 inhibe la señalización^{11} de insulina más eficaz que la versión de tipo natural, pero se desconocen los efectos funcionales del haplotipo de riesgo.
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Ejemplo 5 Incremento muy significativo de los niveles de ENPP1 asociado con los alelos K121Q, IVS20delT-11 y G+1044TGA
La proteína ENPP1 tiene un sitio de escisión proteolítica, se escinde en la superficie de las células, y se sabe que está presente en la circulación^{24}. De este modo, el nivel sérico de proteína representa una buena estimación de su expresión tisular^{24}. Los niveles séricos de proteína ENPP1, medidos en 279 niños que engloban un amplio intervalo de pesos, mostraron una correlación positiva con la puntuación Z de BMI (coeficiente de correlación de Pearson = 0,1, p = 05, Figura 3). Entonces se seleccionaron ochenta y nueve niños delgados (BMI medio, 18,4 \pm 2,5 kg/m^{2}; edad media, 13,3 \pm 2,6 a; n = 50/39 niñas/niños) para ajustarse al BMI de confusión, y se analizaron para determinar el efecto de los tres SNP sobre los niveles de ENPP1. La presencia de por lo menos una copia de los alelos Q121, IVS20delT-11 y G+1044TGA se asoció con un incremento muy significativo de los niveles de ENPP1 (28,6 ng/ml frente a 24,1 ng/ml, p = 0,008) (Figura 4), sugiriendo que el haplotipo asociado con la obesidad no sólo altera la unión de la insulina sino también potencia los niveles de expresión de ENPP1.
Entonces se evaluó la construcción del haplotipo de riesgo sobre la variación de los fenotipos relacionados con la obesidad en 474 niños obesos cuando los datos estuvieron disponibles. Los niños obesos con el haplotipo de riesgo asociado con la obesidad mostraron un incremento de 0,17 mmoles/l en la glucemia en ayunas (p = 0,002), con una mayor prevalencia de intolerancia a la glucosa/T2D (OR = 3,43, p = 0,02). Los padres que poseen el haplotipo de riesgo tuvieron un aumento de 2,35 veces de riesgo de desarrollar T2D (p = 0,005). Además, el riesgo fue mayor en el conjunto de padres obesos (OR = 3,26, p = 0,0005), mientras que no se observó incremento en el riesgo de T2D en los padres no obesos que poseen el haplotipo de riesgo (OR = 0,86, p = 0,9). Para confirmar la asociación de los SNP de ENPP1 con T2D, se comparó una cohorte adicional no solapante de 752 sujetos caucásicos franceses con T2D no relacionados con antecedentes familiares de la enfermedad con los 556 sujetos de mediana edad normoglucémicos no obesos usados previamente (edad media: 55 \pm 6 años). Se identificó un exceso significativo del haplotipo de riesgo en el grupo de T2D (10,7% frente a 7,1%, OR = 1,44, p = 0,005), apoyando adicionalmente un efecto potencial de los SNP de ENPP1 sobre la homeostasis de la glucosa en caucásicos franceses. Este hallazgo se replicó entonces usando 1261 sujetos austríacos no relacionados, que consiste en 503 sujetos con T2D y 759 sujetos normoglucémicos no obesos (9,8% frente a 6,3%, OR = 1,68, p = 0,001). Debido a las diferencias potenciales en la frecuencia alélica y en el tamaño del efecto entre las cohortes francesa y austríaca, se usó la relación de impares ajustada de Mantel Haenszel, bajo un modelo de efectos fijos, para evaluar el riesgo de T2D en las cohortes reunidas. Los datos reunidos, con 2569 individuos de origen europeo, fortalecieron la asociación del haplotipo de riesgo con T2D (10,4% frente a 6,6%, OR combinada = 1,56, p = 0,00002). En resumen, estos hallazgos indican que tanto la obesidad como T2D, especialmente en sujetos obesos, están asociadas con variabilidad genética de ENPP1, y específicamente un único haplotipo de riesgo de tres alelos. Esto proporciona pruebas genéticas para la relación recientemente descrita entre la obesidad en la niñez y el riesgo elevado de T2D en los adolescentes o en la madurez temprana^{25}, proporcionando el primer mecanismo molecular común para esta asociación perniciosa.
Se examinó a continuación la distribución tisular de los transcritos de ENPP1. Se llevó a cabo una RT-PCR sobre los ADNc procedentes de un amplio intervalo de tejidos humanos que incluyen cerebro, músculo, hígado, adipocito (subcutáneo y epiploico), y células beta de los islotes pancreáticos purificadas. Teniendo en cuenta que se conocen cinco isoformas de ENPP1 (http://www.ncbi.nih.gov/IEB/Research/Acembly/av.cgi?db=human&1=ENPP1), se diseñaron cebadores para amplificar la región en los exones 7 y 12, que es común para por lo menos 3 transcritos, y se encontró una expresión ubicua (véase la figura 5). Después, se diseñaron cebadores que fueron específicos para la isoforma de ARNm larga, caracterizada por una 3'UTR más grande con 1170 bases en dirección 3' del codón de parada TGA y que incluye el SNP A>G +1044 TGA asociado con la obesidad. Se encontró que la forma larga sólo se expresaba en células \beta pancreáticas, adipocitos e hígado, tres tejidos claves para la homeostasis de la glucosa (véase la figura 1 suplementaria).
Este estudio proporciona la primera prueba de un papel principal de las variantes de variantes del gen ENPP1 en el desarrollo de morbidez tanto en la niñez como en los adultos, y formas menos graves de obesidad, y una fuerte prueba de una asociación con T2D que se podría incrementar por la presencia concurrente de obesidad. Este amplio análisis de todo el locus de ENPP1 en el contexto de enfermedades metabólicas reveló que este efecto es principalmente el resultado de un haplotipo de riesgo de tres alelos recientemente descrito que fue un predictor más potente de los SNP individuales en todas las poblaciones estudiadas.
La probable contribución del haplotipo de riesgo de ENPP1 asociado a la obesidad al ligamiento observado con la obesidad en la niñez en 6q se evaluó mediante varios métodos que incluyen el procedimiento de Ensayo Compartido de IBD de Genotipo (GIST)^{23} recientemente descrito. Se observó una frecuencia significativamente mayor del haplotipo de riesgo en individuos afectados procedentes de familias con "signos de 6q", junto con una correlación significativa entre el índice específico del haplotipo y la puntuación NPL en el ensayo GIS. A este respecto, Jenkinson et al. presentó recientemente datos preliminares que apoyan una contribución de los SNP de ENPP1^{26} al ligamiento para niveles en ayunas de insulina observados en mejicano-americanos^{3}. Puesto que también se encontraron signos de asociación entre los SNP de ENPP1 y T2D, este gen también podría contribuir a los picos de ligamiento con T2D y rasgos relacionados encontrados en otras poblaciones^{3-8}. Sin embargo, a pesar de la fuerte asociación del haplotipo de tres alelos con formas graves de obesidad en la población caucásica francesa (OR = 1,58, p = 0,00001) y los signos de su contribución a la señal de ligamiento de 6q, sólo se encontró un exceso moderado de transmisión de este haplotipo a descendencia afectada, según se mide mediante el TDT (p = 0,01). Esto sugiere que el haplotipo de riesgo es necesario para el ligamiento, mostrando así una mayor frecuencia en individuos "ligados", pero no es suficiente para explicarlo. Esto implica otras secuencias contribuyentes en la región ligada de 6q.
Es plausible que SNP adicionales en las regiones no codificantes del locus de ENPP1 den cuenta de una parte del ligamiento observado. Por ejemplo, el SNP T>G +5954 TGA, incluido en una región altamente conservada en los genomas de Fugus rubripes, de rata y de ser humano, mostró asociación con formas graves de obesidad. Usando Genomatix (http://www.genomatix.de/) se encontró que el polimorfismo fue parte de una secuencia (aaaaaattcTT(>G)ATgacaccta) reconocida por el Factor Promotor de la Insulina IPF1^{27}. La sustitución de T por G predice la pérdida de unión de IPF1, sugiriendo que este SNP podría ser funcional. Como alternativa, más de un gen puede explicar el ligamiento con la obesidad y T2D en 6q. Tal situación ya se ha descrito en el cromosoma 16 para la enfermedad de Crohn^{28,29}. A este respecto, el desplazamiento del pico de ligamiento centromérico de 16 Mb cuando se descartan portadores del haplotipo de riesgo de ENPP1 asociado con la obesidad coincide con la localización del gen Single-minded 1 (SIM1), otro gen candidato de la obesidad^{30,31}.
La funcionalidad putativa de los tres SNP asociados a la obesidad se evaluó principalmente por medios estadísticos, incluyendo un ensayo de relación de probabilidad de efectos haplotípicos, usando el software THESIAS^{32}. Entre estos SNP, se ha asociado previamente la mutación de sentido erróneo del exón 4 de K121Q de ENPP1 con resistencia a insulina en muestras de tamaño más bien pequeño procedentes de Sicilia, Escandinavia e India^{14-17}, y con T2D en dominicanos^{18}, pero nunca se ha confirmado en estudios a gran escala. El presente estudio implica un total de 6.147 sujetos, todos de origen europeo, y confirma los hallazgos de T2D y los amplían para incluir la obesidad. Los otros dos SNP fuertemente asociados a la obesidad están localizados en la frontera del exón 21 (IVS2Odel T-11) y en la 3'UTR (A>G +1044 TGA). De forma interesante, esta última pertenece a una isoforma que se expresa específicamente en tres tejidos humanos altamente sensibles a insulina (célula \beta de los islotes pancreáticos, adipocito e hígado) que se piensa que desempeñan un papel importante en la patofisiología de T2D. Destacando la importancia de la acción de ENPP1 en el hígado, los ratones a los que se les administra un constructo de expresión de adenovirus que sobreexpresa este gen en hepatocitos muestran resistencia a insulina e intolerancia a la glucosa^{10}. Aunque la sustitución del aminoácido 121 Q exónico se propuso para inhibir directamente el receptor de insulina mediante un mecanismo no enzimático^{11}, los otros SNP no codificantes pueden tener su efecto modificando la expresión génica, la producción proteínica o el corte y empalme, incrementando ambos el efecto perjudicial putativo de la proteína sobre la señalización de insulina. Esta hipótesis está favorecida por los niveles incrementados de proteína en el suero en niños que poseen el haplotipo de riesgo de obesidad de ENPP1, y también por la elevación de los niveles de ENPP1 con la adiposidad. Es necesario averiguar en cohortes de familias más grandes si este efecto es específico del haplotipo, o no está relacionado con la fase genética.
Este estudio aquí ha demostrado que ARNm de ENPP1 está presente en tipos celulares sensibles a insulina, y que una mayor expresión proteínica puede imitar hasta cierto grado los efectos de la inactivación del receptor de insulina en el cerebro, en el que la insulina tiene potentes acciones anorécticas^{33}, o en el músculo esquelético, conduciendo ambos a un aumento de la masa de grasa^{34,35}. Además, los ratones carentes del gen del receptor de insulina en el hígado^{36} o en las células \beta^{37} son intolerantes a la glucosa. Por el contrario, Um et al. han demostrado recientemente en ratones con deficiencia de S6K1 que la protección frente a la obesidad inducida por la edad y la dieta estaba asociada con una sensibilidad potenciada a la insulina^{38}. En el actual estudio, los niños obesos que poseen el haplotipo de riesgo de ENPP1 tienen un fuerte antecedente familiar de T2D, y más a menudo son intolerantes a la carga de glucosa. Esto sugiere que la resistencia exagerada a insulina conferida mediante la expresión incrementada de ENPP1 heredada, en el hígado, músculo y tejido adiposo (y posiblemente en el cerebro y en la célula \beta pancreática) en el contexto de un entorno obesogénico occidentalizado muy fuerte, puede modificar el reparto nutricional y contribuir a una acumulación excesiva de grasas. A este respecto, Barroso et al. mostró recientemente que el alelo de Q121 de ENPP1 estaba asociado con un aumento de BMI en la población general del Reino Unido^{39}. Los datos presentados aquí apoyan la vista de un efecto causal de resistencia primaria a insulina en obesidad de niños que se puede ver como un estado "prediabético"^{25}. Según esta hipótesis, se mostró que la hiperinsulinemia en ayunas inducida por la resistencia a insulina es un predictor potente para el desarrollo subsiguiente de obesidad en niños de diversos grupos étnicos ^{40,41}.
En conclusión, este estudio apoya fuertemente un ligamiento genético entre las variantes del gen ENPP1 y la obesidad poligénica en niños ligada al cromosoma 6q, y también con obesidad de adultos y T2D. Los datos proporcionan una perspectiva en la base molecular para la asociación fisiológica entre resistencia a insulina y obesidad, y por lo tanto presentan una nueva perspectiva para la prevención y tratamiento de estas afecciones.
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<110> Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
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Université de Droit et de la Santé de Lille 2 
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FROGUEL Philippe 
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MEYRE David 
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DINA Christian 
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BOUTIN Philippe 
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<120> Haplotipo del gen ENPP1 (PC-1) asociado con el riesgo de obesidad y diabetes de tipo 2, y sus aplicaciones
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<130> D23085
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<150> EP 05291298.7
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<151> 17-06-2005
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<160> 15
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<170> Patentln version 3.1
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<210> 1
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<211> 832
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<212> ADN
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<213> homosapiens 
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<220>
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<223> Fragmento del ADN genómico del gen ENPP1 que incluye el SNP "IVS20 delT-11" en la posición -11 antes del exón 21
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<223> Cebador derivado del ADN genómico que codifica la proteína ENPP1 humana
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<223> Cebador derivado del ADN genómico que codifica la proteína ENPP1 humana
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<400> 10
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gtcctgtgtt tgactttgat tatga 
\hfill
25 
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<210> 11
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador derivado del ADN genómico que codifica la proteína ENPP1 humana
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<400> 11
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cccttaggcc gttgaagaat ggtca 
\hfill
25 
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<210> 12
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador derivado del ADN genómico que codifica la proteína beta-actina humana
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgtcatactc ctgcttgctg atccacatct gc 
\hfill
32 
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<210> 13
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador derivado del ADN genómico que codifica la proteína beta-actina humana
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskip
atctggcacc acaccttcta caatgagctg cg 
\hfill
32 
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<210> 14
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<211> 873
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<223> Proteína ENPP1 humana (número de acceso de Genbank NP_006199)
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<400> 14
11
12
13 
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<210> 15
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<211> 1173
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<223> dominio 3'UTR del gen ENPP1 humano
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<400> 15
14

Claims (25)

1. Método para determinar si un sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad a partir de una muestra procedente de dicho sujeto que contiene ADN genómico o ARN, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
a)
determinar en por lo menos un alelo génico o secuencia de ARN que codifica la proteína ENPP1, si dicha secuencia, o fragmentos de la misma contiene el haplotipo que comprende los tres SNP siguientes:
-
K121Q,
-
IVS20 delT-11, y
-
un SNP localizado en la secuencia del dominio 3'UTR, y en el que la primera secuencia de tipo natural del dominio 3'UTR de 1170 pb (incluyendo el codón TGA) tiene la secuencia SEC ID nº 15; y
b)
observar si el sujeto tiene o no un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad mediante la observación de si dicha secuencia, o sus fragmentos, contiene dicho haplotipo, indicando la presencia de dicho haplotipo que dicho sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la patología relacionada con obesidad se selecciona de entre el grupo que consiste en diabetes de tipo 2, hipertensión, hipercolesterolemia e hiperlipidemia.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la patología relacionada con la obesidad es diabetes de tipo 2.
4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, el que dicho SNP localizado en el dominio 3'UTR se selecciona de entre el grupo de los SNP que consiste en A>G +1044 TGA, A>C +1092 TGA y C>T +1157 TGA.
5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho SNP localizado en el dominio 3'UTR se selecciona de entre el grupo de los SNP que consiste en A>G +1044 TGA y A>C +1092 TGA.
6. Método según la reivindicación 5, en el que dicho SNP localizado en el dominio 3'UTR es de A>G +1044 TGA.
7. Método para determinar si un sujeto está en un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad, caracterizado porque dicho método comprende la etapa a) y b) del método según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que:
-
en la etapa a), se determina si el sujeto es o no homocigótico para dicho haplotipo que comprende dichos tres SNP; y
-
en la etapa b), se observa si el sujeto tiene un riesgo aumentado o no de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad mediante la observación de si el sujeto es homocigótico para dicho haplotipo, indicando la homocigosidad si dicho sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad.
8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 7 en el que la etapa a) de determinación de la presencia o ausencia de dicho haplotipo de riesgo de tres alelos se lleva a cabo mediante un método que comprende una etapa de amplificación de la secuencia de ADN genómico o ARN, o sus fragmentos, susceptible de contener dichos SNP aplotípicos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
9. Método según la reivindicación 7, en el que la etapa de PCR se lleva a cabo a partir de ADN genómico, ARNm o ADNc, eventualmente después de una etapa de transcripción inversa, o sus fragmentos, usando los siguientes conjuntos de cebadores:
a)
5'-TCATACTCAGGAAGACAGCAA-3' (cebador directo SEC ID nº 2) y 5'-CAATAGCCATGACTCCTAA-3' (cebador inverso SEC ID nº 3) para el SNP "K121Q";
b)
5'-AGCATTTTTACACTTTAGTT-3' (cebador directo SEC ID nº 4) y 5'-ATAATGTATGGTAGGATTT-3' (cebador inverso SEC ID nº 5) para el SNP IVS20 delT - 11; y
c)
5'-ATATTCCTATCCTGCTCACT-3' (cebador directo SEC ID nº 6) y 5'-TGCAGCTGGCCCTTAGGCCG-3' (cebador inverso SEC ID nº 7) para el SNP A>G +1044 TGA.
10. Método según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha muestra biológica es una muestra de hígado, adipocitos o células beta pancreáticas cuando la presencia de dicho haplotipo se determina en la secuencia de ARN o sus fragmentos.
11. Método para determinar si un sujeto está en riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad a partir de una muestra de plasma o suero procedente de dicho sujeto, comprendiendo dicho método las etapas siguientes:
a)
determinar la concentración de la proteína ENPP1 en el suero o en el plasma y adicionalmente la presencia del haplotipo que comprende los tres SNP como se define en las reivindicaciones 1 y 4 a 6; y
b)
observar si el sujeto tiene o no un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad mediante la observación de si dicha concentración es significativamente mayor que el nivel normal, indicando la presencia de dicha concentración significativamente mayor que dicho sujeto tiene un riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con obesidad.
12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha concentración significativa mayor de proteína ENPP1 sérica o plasmática corresponde a por lo menos más de 10%, preferentemente más de 15% de la concentración sérica o plasmática normal.
13. Método según la reivindicación 11 ó 12, en el que dicha concentración de proteína ENPP1 sérica o plasmática se determina usando anticuerpos capaces de reconocer específicamente la proteína ENPP1.
14. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque dichos anticuerpos se ponen en contacto con el suero o plasma a ensayar, en condiciones que permiten la formación de un complejo inmunológico específico entre la proteína ENPP1 y dicho anticuerpo, y porque se cuantifican los complejos inmunológicos formados.
15. Método según una de las reivindicaciones 11 a 14, en el que la patología relacionada con la obesidad se selecciona del grupo que consiste en diabetes de tipo 2, hipertensión, hipercolesterolemia e hiperlipidemia.
16. Método según una de las reivindicaciones 11 a 15, en el que la patología relacionada con obesidad es diabetes de tipo 2.
17. Kit para determinar si un sujeto está en riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad, que comprende por lo menos un par de cebadores o un conjunto de un par de cebadores capaces de amplificar un fragmento de ADN genómico o ARN que codifica la proteína ENPP1 y susceptible de contener el haplotipo que comprende los tres siguientes SNP:
-
K121Q,
-
IVS20 delT-11, y
-
un SNP localizado en la secuencia del dominio 3'UTR, y en el que la primera secuencia de tipo natural del dominio 3'UTR de 1170 pb (incluyendo el codón TGA) tiene la secuencia SEC ID nº 15; y
y en el que dicho por lo menos conjunto de un par de cebadores es:
a)
5'-TCATACTCAGGAAGACAGCAA-3' (cebador directo SEC ID nº 2) y 5'-CAATAGCCATGACTCCTAA-3' (cebador inverso SEC ID nº 3) para el SNP "K121Q";
b)
5'-AGCATTTTTACACTTTAGTT-3' (cebador directo SEC ID nº 4) y 5'-ATAATGTATGGTAGGATTT-3' (cebador inverso SEC ID nº 5) para el SNP IVS20 delT - 11; y
c)
5'-ATATTCCTATCCTGCTCACT-3' (cebador directo SEC ID nº 6) y 5'-TGCAGCTGGCCCTTAGGCCG-3' (cebador inverso SEC ID nº 7) para el SNP A>G +1044 TGA.
18. Kit para determinar si un sujeto está en riesgo aumentado de desarrollar obesidad o patología relacionada con la obesidad, que comprende por lo menos un par de cebadores o un conjunto de un par de cebadores capaces de amplificar un fragmento de ADN genómico o ARN que codifica la proteína ENPP1 y susceptible de contener el haplotipo que comprende los tres siguientes SNP:
-
K121Q,
-
IVS20 delT-11, y
-
un SNP localizado en la secuencia del dominio 3'UTR, y en el que la primera secuencia de tipo natural del dominio 3'UTR de 1170 pb (incluyendo el codón TGA) tiene la secuencia SEC ID nº 15; y
y en el que dicho por lo menos conjunto de un par de cebadores es:
a)
- 5'-CTTTCCCCAATCACTACAGCATTGTCA-3' (cebador directo, exón 7, SEC ID nº 8), y 5'-TTTCAGACCATCCATCAGCATACCAAC-3' (cebador inverso exón 12, SEC ID nº 9); y para el SNP de 3'UTR;
b)
- 5'-GTCCTGTGTTTGACTTTGATTATGA-3' (cebador directo exón 23, SEC ID nº 10), y - 5'-CCCTTAGGCCGTTGAAGAATGGTCA-3' (cebador inverso 3'UTR, SEC ID nº 11).
19. Secuencia nucleica variante aislada, o secuencia complementaria de la misma, de un mamífero, preferentemente ser humano, secuencia genómica o de ARN del gen que codifica la proteína ENPP1, caracterizada porque dicha secuencia nucleica variante aislada comprende por lo menos la presencia del haplotipo que comprende los tres siguientes SNP como se define en las reivindicaciones 1 y 4 a 6.
20. Vector de clonación y/o de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 19.
21. Célula hospedante transformada mediante un vector según la reivindicación 20.
22. Mamífero transgénico, excepto ser humano, caracterizado porque comprende una célula transformada según la reivindicación 21, o una célula que contiene un gen ENPP1 funcional recombinante que comprende por lo menos el haplotipo que comprende los tres siguientes SNP como se define en las reivindicaciones 1 y 4 a 6.
23. Uso de célula según la reivindicación 21 o un animal transgénico según la reivindicación 22, para seleccionar compuestos químicos o bioquímicos para el tratamiento o la prevención de obesidad o patología relacionada con la obesidad.
24. Método para seleccionar un compuesto químico o bioquímico para el tratamiento la prevención de obesidad o patología relacionada con la obesidad, caracterizado porque comprende la etapa de:
a)
poner en contacto una célula transformada según la reivindicación 21 o un mamífero transgénico según la reivindicación 26 con dicho compuesto químico o bioquímico a ensayar; y
b)
observar si el producto de expresión del gen ENPP1 disminuye o no en dicha célula o dicho mamífero.
25. Método para seleccionar un compuesto químico o bioquímico para el tratamiento o prevención de obesidad o patología relacionada con la obesidad según la reivindicación 24, caracterizado porque:
-
en la etapa a), el compuesto químico o bioquímico a ensayar se administra a un mamífero transgénico según la reivindicación 22, o a un mamífero transgénico que expresa la proteína ENPP1; y
-
en la etapa b), se observa si la concentración de proteína ENPP1 en el suero o en el plasma disminuye en comparación con una referencia,
seleccionándose dicho compuesto químico o bioquímico si se observa una disminución de dicha concentración.
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