ES2266886T3 - Derivado de ribonucleosido 2'-o-sililoximetil trisustituido y el metodo para la preparacion del mismo. - Google Patents
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Abstract
Un derivado de ribonucleósido de la fórmula (Ver fórmula) en donde R1 es una base de la familia de purina- o pirimidina-o un derivado de una familia base o un derivado de una base o cualquier otro residuo que sirve como un sustituto de una nucleobase, R2 es un protón o un derivado sustituido de ácido fosfónico, R3 es un protón o un grupo protector para el átomo de oxígeno en la posición 5¿, R4, R5 y R6 son independientemente un grupo alquilo o arilo o una combinación de alquilo y arilo o heteroátomo, R4, R5 o R6 puede también estar conectados cíclicamente entre sí; y en donde al menos uno de los sustituyentes R4, R5 o R6 comprende un átomo de C terciario o un heteroátomo cercano al átomo de Si.
Description
Derivado de ribonucleosido
2'-O-sililoximetil trisustituido y
el método para la preparación del mismo.
La invención está en el campo de la química de
ácido nucleico y los métodos concernientes para la preparación y
empleo de un derivado de ribonucleósidos con grupos protectores
novedosos. Los compuestos inventivos son particularmente adaptados
para la preparación automatizada de los oligoribonucleótidos.
Las aplicaciones para ácidos nucleicos
sintéticos son numerosas y claves para el entendimiento de
procedimientos biológicos. Entre estas aplicaciones, el uso de
oligonucleótidos sintéticos para la reducción de la expresión
específica de proteínas por hibridización específica en la célula
del oligonucleótido sintético a un mARN se conoce como un mecanismo
antisentido y ha sido descrito ampliamente (1). Más recientemente,
la interferencia del ARN, una técnica utilizando dsARN conocido
como siARN, ha sido empleada exitosamente para inhibir la traducción
de mARN de un mamífero a su proteína (2). La gran promesa de la
tecnología de ARN ha creado una necesidad para el desarrollo de la
preparación de oligoribonucleótidos sintéticos eficiente y
rentable.
La síntesis de oligoribonucleótidos es más
rebatible que la síntesis de oligodeoxinucleótidos, principalmente a
causa del grupo 2'-OH que está presente en ácidos
ribonucleicos, pero no en ácidos deoxiribonucleicos. La síntesis
química de oligoribonucleótidos normalmente se basa en un derivado
protegido de ribonucleósido inmovilizado sobre una fase sólida al
cual además los derivados de ribonucleótidos protegidos son
acoplados en etapas consecutivas de un ciclo de síntesis cada uno
hasta que la longitud de la cadena deseada sea conseguida. Asegurar
una síntesis eficiente y evitar la degradación de ARN durante el
proceso de preparación, la estrategia del grupo protector por el
grupo 2'-OH sería perfectamente ortogonal con
aquellos de otros grupos protectores y el grupo protector sería
retirado tan tarde como sea posible en el proceso. Hasta el momento,
principalmente los siguientes tipos de grupos de protección han sido
empleados para proteger el grupo 2'-OH:
La química
2'-O-TBDMS es el grupo protector
comúnmente utilizado para la síntesis de ARN (3). Este es ortogonal
con otros grupos protectores. Sin embargo, la migración fosforil
2'-3' durante la síntesis de oligoribonucleótido ha
sido reportada (4). Además, el impedimento estérico del grupo de
t-butildimetilsilil cerca del reactivo fosforamidita
disminuye significantemente la eficiencia de acoplamiento. La última
limitación puede ser reducida pero al precio de tiempos más largos
de acoplamiento, el uso de excesos molares más altos de reactivos y
activadores de fosforamidita como por ejemplo
5-(Benzilmercapto)-1H-tetrazol
(5).
La química de
2'-O-ACE ha sido descrita por
Caruthers et al. (6) como una alternativa a la química de
TBDMS. Allí, el 2'-OH es protegido por un ácido
ortoéster inestable. En comparación con TBDMS, el impedimento bajo
de este grupo protector permite ratas de acoplamiento más altas. La
inestabilidad del ácido de 2' ortoéster requiere una protección
temporal del 5'-OH con un ácido-no
inestable. Se logró con grupos silil trisustituidos que se retiran
al final de cada ciclo de acoplamiento mediante una que contiene
fluoruro. Por lo tanto, los reactivos para la preparación de
bloques de construcción de 2'-O-ACE
tienen que ser escalados específicamente. Tal desprotección 5'
puede en algunos casos ser problemática: requiere un sintetizador
resistente dedicado a iones fluoruro y no es posible el uso de los
soportes basados en silica empleados comúnmente (similares a Cristal
de Poro Controlado). Química
2'-O-TOM se ha reportado por Pitsch
et al. (6). Como para la estrategia del grupo protector
2'-OTBDMS, el grupo protector
2'-O-TOM se retira sobre el
tratamiento con iones fluoruro. Originalmente, se desarrollo para
permitir la síntesis de ARN sin la migración fosforil
2'-3' observada con
2'-O-TBDMS. En este caso, debido al
acetal natural del enlace entre el nucleósido y el grupo protector,
la no-migración del grupo protector en una posición
diferente en el ribonucleótido derivado, en particular, puede
ocurrir en la posición-O-3'
adyacente. Tal isomerización es un problema conocido en la síntesis
de las unidades de ARN
2'-O-silil-sustituidas
convencionales.
Una ventaja importante adicional de este grupo
protector es la barrera más baja del grupo protector debido al
acetal espaciador entre el 2'-oxígeno y el grupo
triisopropilsilil voluminoso.
Ambos 2'-O-TOM y
2'-O-ACE están favoreciendo las
producciones del acoplamiento acercándose a aquellas observadas en
la síntesis de oligodeoxinucleótido. Las producciones de
acoplamiento satisfactorias también son obtenibles con química de
2'-O-TBDMS pero en el precio de
activadores poco usuales o de excesos molares más altos de bloques
de construcción. En todos los casos, los bloques de construcción
mencionados están contribuyendo en gran medida a los costos de
fabricación de oligoribonucleótidos. En segundo lugar, el
procedimiento post-sintético de
oligoribonucleótidos es más evidente como comparado con el
procedimiento de oligodeoxiribonucleótidos. El último aspecto puede
ser de especial importancia cuando la demanda del
alto-rendimiento tiene que ser satisfecha.
Hay una necesidad para mejorar los bloques de
construcción de ARN que son accesibles fácilmente y permiten un
procedimiento post-sintético más sencillo.
Grupos sililoximetil sustituidos han sido
utilizados como grupos protectores de grupos hidroxil en el pasado
(7, 8). El impedimento estérico de sustituyentes sobre un átomo de
Si modula la estabilidad y retiran las condiciones del grupo
protector. Por ejemplo, han sido reportados, carbonos terciarios que
soportan el sililoximetil adyacente al átomo de Si (7), en estos
casos, la producción para la sustracción de los grupos protectores
eran subóptimas con respecto a esas observadas usualmente con la
protección TBDMS, y aparentemente no adecuada para la síntesis de
oligoribonucleótidos en fase sólida.
Ahora, la presente invención suministra grupos
novedosos y mejorados para la protección en la posición
2'-OH de derivados de ribonucleósidos que
particularmente son adecuadas para la síntesis automatizada de
oligoribonucleótidos en fase sólida. Se proporciona un nuevo
procedimiento para la preparación de estos bloques de construcción.
Finalmente, se revela el empleo de estos bloques de construcción en
la síntesis en fase sólida del ARN.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un derivado de ribonucleósidos de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
R_{1} es una base de la familia de purina- o
pirimidina- o un derivado de una familia base o un derivado de una
base o cualquier otro residuo que sirve como un sustituto de una
nucleobase,
R_{2} es un protón o un derivado sustituido de
ácido fosfónico,
R_{3} es un protón o un grupo protector para
el átomo de oxígeno en la posición 5',
R_{4}, R_{5} y R_{6} son
independientemente un grupo alquilo o arilo o una combinación de
alquilo y arilo o heteroátomo, R_{4}, R_{5} o R_{6} puede
también estar cíclicamente conectados entre sí;
y
en donde al menos uno de los sustituyentes
R_{4}, R_{5} o R_{6} comprende un átomo de C terciario o un
heteroátomo cercano al átomo de Si.
En un aspecto preferido, el sustituyente que
comprende el átomo de C terciario cercano al átomo de Si comprende
desde 4 a 24 átomos de C, más preferiblemente desde 5 a 24 átomos de
C y aún más preferiblemente desde 6 a 24 átomos de C. en un aspecto
más preferido, el sustituyente que comprende el átomo de C terciario
cercano al átomo de Si es un alquilo-sustituyente
seleccionado del grupo que consiste de ter-butil,
ter-pentil, ter-hexil,
ter-heptil, ter-octil,
ter-nonil, ter-decil,
ter-undecil, ter-dodecil. En otro
aspecto preferido, el sustituyente que comprende el átomo de C
terciario cercano al átomo de Si es seleccionado del grupo de
1,1-dimetil etil,
1,1-dimetil-propil,
1,1-dimetil-butil,
1,1-dimetil-pentil,
1,1-dimetil-hexil, texil
(1,1,2-trimetil-propil),
1,1,2-trimetil-butil,
1,1,2-trimetil-pentil,
1,1,2-trimetil-hexil,
1,1,2,2-tetrametil-propil,
1,1,2,2-tetrametil-butil. En una
modalidad más preferida, los sustituyentes de los grupos anteriores
comprenden al menos 5 átomos de C, más preferiblemente al menos 6
átomos de C.
En un aspecto relacionado, la presente invención
provee un derivado de ribonucleósidos en donde el sustituyente
cercano al átomo de Si comprende un heteroátomo sustituido. En un
aspecto preferido, el sustituyente cercano al átomo de Si comprende
un heteroátomo bivalente sustituido, en un aspecto más preferido
este sustituyente es oxígeno.
En otro aspecto, la presente invención provee un
método para la preparación de un derivado de ribonucleósido, que
comprende la reacción de un nucleósido con la fórmula:
donde R_{1} y R_{3} son como se
definieron arriba, con un derivado de sililoximetil de la
fórmula
YH_{2}C --- O
---
\melm{\delm{\para}{R _{6} }}{S}{\uelm{\para}{R _{4} }}i
---
R_{5}
en donde Y es un grupo marginal
apropiado y en donde R_{4}, R_{5} y R_{6} son
independientemente un grupo alquilo o arilo o una combinación de
alquilo y arilo o un heteroátomo, R_{4}, R_{5} o R_{6} también
pueden estar cíclicamente conectados entre sí. En una modalidad
preferida Y es halógeno. En otra modalidad preferida, R_{4},
R_{5} y R_{6} juntos comprenden entre 6 y 30 átomos de carbono.
En una modalidad preferida adicional, R_{4}, R_{5} y R_{6}
comprende al menos un heteroátomo sustituido cercano al átomo de
Si, que es preferiblemente un átomo bivalente, más preferiblemente
oxígeno. El derivado de ribonucleósido además puede ser sustituido
sobre el oxígeno en la posición 3'- con un grupo que consiste de un
derivado de ácido
fosfónico.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona un método para la preparación de un derivado de
ribonucleósido, que comprende la reacción de un derivado de
ribonucleósido con la fórmula
bajo una activación electrofílica
con un compuesto de
fórmula:
HO ---
\melm{\delm{\para}{R _{6} }}{S}{\uelm{\para}{R _{4} }}i
---
R_{5}
en donde R_{1} se define como
arriba y R_{7} es un grupo alquilo- o arilo-, o un grupo
alquilo-arilo-,
en donde R_{2} es un grupo protector,
en donde R_{3} es un grupo protector,
en donde R_{4}, R_{5} y R_{6} son como se
definieron arriba.
En una modalidad preferida, el derivado de
ribonucleósido es adicionalmente sustituido sobre el oxígeno en la
posición 3'- con un grupo que consiste de un derivado de ácido
fosfónico.
- TBDMS
- t-butildimetilsilil
- ACE
- bis[2-(acetiloxi)etoxi]metil
- TOM
- (triisopropilsilil)oximetil
- THEX
- [((1,1,2-trimetil-propil)-dimetilsilil)]-oximetil
- DCA
- Ácido dicloroacético
- dsRNA
- ARN bicatenario
- siRNA
- ARN de pequeña interferencia.
La presente invención se relaciona con derivados
de ribonucleótido 2'-O-sililoximetil
para una aplicación en la síntesis química de ácidos ribonucleicos
que comprende una unidad de D o L-ribosa que tiene
la siguiente fórmula estructural general:
Según la cual
R_{1} es un base de la familia purina- o
pirimidina- o un derivado de una base o cualquier otro residuo que
sirve como un sustituto de una nucleobase, R_{2} es un protón o un
derivado sustituido de ácido fosfónico, R_{3} es un protón o un
grupo protector para el átomo de oxígeno en la posición 5', y
R_{4}, R_{5} y R_{6} son independientemente grupos alquilo- o
arilo- o un grupo alquilo-arilo-. R_{4}, R_{5}
o R_{6} también pueden estar cíclicamente conectados entre sí.
La protección del grupo R_{3} en la posición
-O-5'- es por ejemplo un grupo monometoxitritil- o
dimetoxitritil- o un grupo diferente, apropiado que se retira a
partir del aumento de la secuencia durante la construcción de la
cadena tal como liberar una posición del enlace para el acoplamiento
de la siguiente unidad para ser adicionada a la cadena.
El R_{1} componente base del derivado de
ribonucleósido es preferiblemente una base de la familia de purina
o pirimidina, por ejemplo una de las cinco nucleobases adenina,
citosina, timina, uracil, guanina o un derivado de estos, o
cualquier otro residuo que sirve como un sustituto de una
nucleobase. Este puede ser protegido por un
acil-sustituyente que puede ser retirado después de
la creación de la cadena.
En la posición -O-3'-, R_{2}
es un derivado de ácido fosfónico, tal como un grupo fosforamidita
N, N- y O-sustituido, por lo cual los
N-sustituyentes son grupos alquilo- o arilo- que
adicionalmente pueden ser sustituidos y/o conectados cíclicamente
entre sí. Por la activación del nitrógeno del grupo amino-
disustituido, el centro del fósforo se activa por acoplamiento de la
unidad a una cadena en aumento.
Esta invención ahora provee nuevos y ventajosos
grupos protectores
2'-O-sililoximetil en donde R_{4},
R_{5} o R_{6} es independientemente un alquilo- o
arilo-sustituyente, o un
alquilo-arilo- o arilo-alquilo o un
heteroátomo sustituido sustituyente, y en donde al menos uno de los
R_{4}, R_{5} o R_{6} sustituyentes comprende un heteroátomo o
un átomo de C terciario como puede ser representado por la
fórmula
Si ---
\melm{\delm{\para}{R'''}}{C}{\uelm{\para}{R'}} ---
R''
2
en donde R', R'' y R''' son
alquilo- o arilo, o un
alquilo-arilo-sustituyente- o
arilo-alquilo o un heteroátomo sustituido, y en
donde R', R'' y R''' no son H. R', R'' y R''' pueden ser iguales o
diferentes, sustituyentes preferidos son los que comprenden de 1 a
12 átomos de C, preferiblemente 1 a 6 átomos de C y más
preferiblemente son 1 a 4 átomos de C. R', R'' y R''' también
pueden estar cíclicamente conectados entre sí, por ejemplo R' puede
estar cíclicamente conectado a R'' o R''', o R'' puede estar
cíclicamente conectado a R'''. En una modalidad preferida, dos de
los sustituyentes son idénticos y comprenden desde 1 a 6 átomos de
C, preferiblemente desde 1 a 4 átomos de C. El tercer sustituyente
comprende preferiblemente al menos 3 átomos de C, preferidos son
desde 3 a 12 átomos de C, más preferidos son desde 3 a 6 átomos de
C.
De esta manera, en una modalidad al menos uno de
los sustituyentes R_{4}, R_{5} y/o R_{6} es (C_{4} a
C_{24})-terciario-alquilo y/o
arilo, preferiblemente (C_{5} a
C_{18})-terciario-alquilo y/o
arilo, más preferiblemente (C_{6} a
C_{12})-terciario-alquilo y/o
arilo, en donde el átomo de C terciario es adyacente al átomo de
Si. Sin tener la intención de ser limitante de estos grupos,
ejemplos de tales sustituyentes pueden comprender por ejemplo,
ter-butil, ter-pentil,
ter-hexil, ter-heptil,
ter-octil, ter-nonil,
ter-decil, ter-undecil, terdodecil,
texil (1,1,2-trimetil-propil),
1,1,2-trimetil-butil,
1,1,2-trimetil-pentil,
1,1,2-trimetil-hexil, 1,1,2,2
tetrametil-propil,
1,1,2,2-tetrametil-butil. En una
modalidad preferida, el sustituyente es ter-pentil
o más alto, en una modalidad más preferida el sustituyente es
ter-hexil o más alto. Ejemplos más preferidos
comprenden por ejemplo 1,1 dimetil-etil,
1,1-dimetil-propil,
1,1-dimetil-butil,
1,1-dimetil-pentil,
1,1-dimetil-hexil,
1,1,2-trimetil-propil,
1,1,2-trimetilbutil,
1,1,2-trimetil-pentil,
1,1,2-trimetil-hexil,
1,1,2,2-tetrametil-propil,
1,1,2,2-tetrametil-butil. En otra
modalidad R_{4}, R_{5} y/o R_{6} comprenden un
heteroátomo.
El sustituyente(s) que no comprende un
átomo de C terciario puede tener idénticos o diferentes
sustituyentes. Estos sustituyentes son preferiblemente
sustituyentes alquilo- o arilo-, o sustituyentes
alquilo-arilo-. Preferidos son los sustituyentes
que comprenden desde 1 a 12 átomos de C, preferiblemente desde 1 a 8
átomos de C, más preferiblemente desde 1 a 4 átomos de C. Sin tener
la intención de ser limitante a estos grupos, ejemplos se tales
sustituyentes pueden comprender por ejemplo metil, etil, propil,
butil, pentil, hexil, i-propil,
sec-butil, isobutil, sec-pentil.
En otra modalidad, R_{4}, R_{5} y/o R_{6}
comprenden un heteroátomo sustituido similar por ejemplo silicio,
germanio, estaño, plomo, nitrógeno, oxígeno, azufre tal como por
ejemplo puede estar representado por un heteroátomo
"cuatro-valente" por la fórmula:
en donde X es Si o Ge, Sn o Pb y en
donde R', R'' y R''' se definen en cuanto a la fórmula 2, y R_{4}
y R_{6} se definen como arriba. Cualquiera de los sustituyentes
R_{4}, R_{5} o R_{6} puede comprender el heteroátomo cercano
al átomo de Si, se prefiere solo uno como se ilustra en la fórmula
3. Para heteroátomos "bivalentes" como el oxígeno, o para
heteroátomos trivalentes como el nitrógeno la fórmula 3 puede
adaptarse consecuentemente como una persona de habilidad en el
oficio lo reconocería fácilmente. En una modalidad preferida de la
presente invención, X es
oxígeno.
El compuesto se puede preparar por métodos
conocidos en el oficio tal como por medio de la ruta de
organometálicos. Esta ruta se describe por ejemplo en WO99/09044
(6). La reacción 4 \rightarrow 5a/5b \rightarrow 6 muestra un
ejemplo de la preparación de un compuesto de la presente invención
por medio de la ruta de organometálicos. Brevemente, un
ribonucleósido protegido en el 5'-O se hace
reaccionar con por ejemplo
clorometil[dimetil-(1,1,2-trimetilpropil)silil]
éter (o THEX-Cl) en la presencia de una sal
organometálica apropiada, tal como por ejemplo dibutiltindocloruro
o dibutiltinoxido. El THEX-Cl por si mismo se
prepara de una manera similar al TOM-Cl de acuerdo
con un procedimiento publicado (7). Sin embargo,
TOM-Cl diferente, la preparación del
THEX-Cl no requiere una etapa de destilación final
del reactivo previo a la reacción con el ribonucleósido que
representa una simplificación significante. En la reacción del
THEX-Cl con un ribonucleósido
5'-O-protegido se obtiene una mezcla
de ribonucleósidos 2'- y 3'-protegidos, de donde el
ribonucleósido 2'-sustituido se purifica mediante
por ejemplo métodos cromatográficos. En una etapa subsiguiente el
grupo 3'-OH del compuesto purificado 5a se
convierte en la fosforamidita 6 de acuerdo con los métodos conocidos
en el oficio (Sinha, N.D. et al., Tetrahedron Lett. 1983, 24,
5843; Sinha, N.D. et al., Ácido nucleico Res. 1984, 12,
4539). Este método requiere el uso de sililoximetil éteres
sustituidos en donde los sustituyentes contienen grupos alquilo,
arilo, o ariloalquilo y que pueden estar cíclicamente conectados. En
una modalidad adicional, este método es aplicable a los
sililoximetiléteres en donde al menos uno de los sustituyentes
contiene al menos un heteroátomo sustituido como por ejemplo
silicio, germanio, estaño, plomo, nitrógeno, oxígeno, azufre
La reacción puede realizarse en solución o sobre
fase sólida o mediante el uso de reactivos soporte de polímero. El
solvente puede ser un solvente hidrocarburo, solvente etéreo,
solvente nitrilo, solvente clorinado, solvente heterocíclico,
solventes sulfoxido, etc... Ejemplos específicos de solventes
apropiados incluyen piridina, N, N-dimetilformamida
(DMF), tetrahidrofurano (THF), dimetilsulfoxido (DMSO),
acetonitrilo, dicloroetano y cloruro de metileno. Preferiblemente,
se utiliza dicloroetano.
A pesar de que la reacción puede llevarse a cabo
a temperatura ambiente, también puede realizarse a un rango de
temperatura de 0 a 150ºC preferiblemente a 10 a 100ºC.
En un aspecto adicional de la presente
invención, los compuestos de la invención se prepararon por un
método nuevo y superior como se ilustra por la reacción 7
\rightarrow 8 \rightarrow 9 \rightarrow 10 \rightarrow
6.
Este método permite la introducción selectiva de
los grupos protectores 2'-OH a través de, primero la
introducción un grupo
2'-O-alquilotiometil, arilotiometil,
alquiloarilotiometil o ariloalquilotiometil. Esto evita la etapa no
selectiva descrita en la ruta de organometálicos. Este nuevo método
es generalmente aplicable para la introducción de derivados
oximetil selectivamente sobre el grupo 2'-OH de
ribonucleósidos y no es restringido a la introducción de los grupos
protectores como se describe arriba. Los métodos para la preparación
de ribonucleótidos protegidos corrientemente conocidos en el
oficio, tal como la ruta de organometálicos, no son
2'-3' selectivos para la introducción del grupo
protector. Este método permite la introducción selectiva del grupo
metiltiometil en la posición 2' y por esa razón evita una última
etapa no selectiva en el esquema de síntesis.
\newpage
En esta nueva ruta un
2'-O-alquiltiometil-ribonucleósido
como puede ser representado por la fórmula
en donde R_{7} es alquilo o arilo
o una combinación de alquilo y arilo, se hace reaccionar con un
silanol de la fórmula general HOSiR_{4}R_{5}R_{6}. En una
modalidad preferida R_{7} es un (C_{1} a C_{20})-, más
preferido es (C_{1} a C_{10})- alquilo y/o arilo. En otra
modalidad preferida R_{7} es por ejemplo metil, etil, propil,
butil, pentil, hexil, iso-propil,
sec-butil, iso-butil,
sec-pentil. Los sustituyentes R_{4}, R_{5} y
R_{6} del silanol son idénticos o diferentes sustituyentes alquilo
o arilo o un combinación de alquilo y arilo, o heteroátomos
sustituidos y que también pueden estar cíclicamente conectados entre
sí. En una modalidad preferida los tres sustituyentes juntos
comprenden entre 3 y 30 átomos de carbono cada
uno.
uno.
En otra modalidad preferida, el compuesto 11 se
hace reaccionar con un silanol de la fórmula general
HOSiR_{4}R_{5}R_{6} con los sustituyentes R_{4}, R_{5},
R_{6} como se definieron arriba, bajo condiciones apropiadas
conocidas en el oficio. Estos comprenden un reactivo de activación
electrofílica o un reactivo de combinación tal como, pero no limita
a, por ejemplo N-halosuccinimidas y una cantidad
catalítica de un ácido. La reacción puede ser llevada a cabo en
solución o sobre fase sólida o por el uso de reactivos soporte de
los polímeros. El solvente puede ser un solvente hidrocarburo,
solvente etéreo, solvente nitrilo, solvente clorinado, solvente
heterocíclico, solventes sulfoxido, etc... Ejemplos específicos de
solventes apropiados incluyen piridina, N,
N-dimetilformamida (DMF), tetrahidrofurano (THF),
dimetilsulfoxido (DMSO), acetonitrilo, dicloroetano y cloruro de
metileno. Preferiblemente, se utiliza el diclorometano. A pesar de
que la reacción puede ser llevada a cabo a temperatura ambiente,
esta también se puede realizar a una temperatura de -78ºC a 100ºC
preferiblemente de 0 a 50ºC.
El alquilotiometil-sustituyente
en el grupo 2'-OH comprende preferiblemente un grupo
(C_{1} a C_{12})-alquilo y/o arilo,
preferiblemente un grupo (C_{1} a C_{6})-alquilo
y/o arilo. Ejemplos de sustituyentes preferidos comprenden
metiltiometil, etiltiometil, propiltiometil, isopropiltiometil o
butiltiometil.
Los siguientes Ejemplos ilustran la presente
invención, sin de alguna manera limitar el alcance de la misma.
El esquema 1 representa el esquema sintético
para la introducción del grupo protector THEX sobre Uridina 5'-
O-DMTr y la subsiguiente fosfitilación.
Una suspensión de 11.1 ml (0.15 mol) etanotiol y
4.5 g (0.15 mol) para-formaldehido se trato con dos
gotas de NaOMe/MeOH (30%) y se agitó 1 h a 40ºC. Después se enfrió,
se adicionaron 150 ml de CH_{2}Cl_{2} y 22.66 g (0.333 mol) de
imidazol. Después de 10 minutos, se adicionaron 32.66 g (0.167 mol)
de cloruro
(1,1,2-trimetil-propil)-dimetilsilil
gota a gota. La suspensión resultante se agitó a temperatura
ambiente por 24 horas y se diluyó con 300 ml de
n-hexano. Después se adicionan 200 ml de una
solución 2 M de NaH_{2}PO_{4}, se agitó (15 minutos) y se
separaron las fases, la fase orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}
y se evaporó. El residuo se disolvió en 100 ml de CH_{2}Cl_{2},
se trató gota a gota con 12.3 ml (20.4 g, 0.152 mol) cloruro de
sulfuril en 50 ml de CH_{2}Cl_{2}. Después de 1 hora, la mezcla
se evaporó. El producto se obtuvo como cera (31.5 g).
^{1}H-NMR (400 MHz, CDCl_{3}): 0.5 (s, 6H,
SiMe_{2}); 0.65 (12H, CH_{3}); 1.40 (sept, 1H, CH); 5.43 (s, 2H,
CH_{2}).
Una solución de 9.5 g (17.4 mmol)
5'-O-dimetoxitritilado uridina (1)
en 200 ml 1,2-dicloroetano se trató con 11.23 g (87
mmol) base de Huenig y luego con 5.81 g (19.2 mmol) de
dibutiltindocloruro. Después de 30 minutos, la mezcla se calentó a
80ºC, se trató con 4.2 g (22.6 mmol) cloruro de
(1,1,2-trimetil-propil)-dimetilsililoximetil
(THEX-Cl) en 50 ml de dicloroetano y se agitó dos
horas a 80ºC. Después se enfrió, la mezcla se diluyó con 400 ml de
CH_{2}Cl_{2} y se adicionaron 350 ml de solución acuosa de
NaHCO_{3} saturado. Después de agitar por 30 minutos, las capas
se separaron y la capa orgánica se evaporó. El residuo se sometió a
cromatografía sobre silica gel, utilizando acetato de etilo/hexano
(3:1) que contiene 0.1% de N-metilmorfolina. El
producto fue obtenido como espuma sólida (4.52 g).
^{1}H-NMR (400 MHz,
CDCl_{3}): 0.1 (s, 6H, CH_{3}); 0.6-0.8 (s y d,
12H, CH_{3}); 1.45 (m, 1H, CH); 3.15 (d, 2H, CH_{2}); 3.64 (s,
6H, OCH_{3}); 3.85 (q, 2H, CH_{2}); 4.05 (m, 1H, CH); 4.15 (m,
1H, CH); 4.80 (q, 2H, CH_{2}); 5.12 (d, 1H, OH); 5.30 (q, 1H, CH);
5.78 (d, 1H, CH); 6.8-5.3 (m, 13H); 7.6 (d, 1H).
Una solución de 4.0 g (5.56 mmol) uridina
protegida (2), 1.14 g (6.68 mmol) diisopropilaminotetrazolida y 2.01
g (6.68 mmol) bis(N,
N-diisopropilamino)-2-cianoetoxi
fosfina en 150 ml de CH_{2}Cl_{2} se agitó 24 horas a
temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con 100 ml de
CH_{2}Cl_{2} y se lavó dos veces con 50 ml de solución acuosa de
NaHCO_{3} saturado. La fase orgánica secada (Na_{2}SO_{4}) se
evaporó y el residuo se sometió a cromatografía de columna (acetato
de etilo/ hexano 3:2 con adicional 0.1%
N-metilmorfolina). El producto fue obtenido como una
espuma sólida
(4.12 g).
(4.12 g).
^{31}P-NMR (400 MHz,
CDCl_{3}): 151.183 (s) y 151.537 (s).
Una solución de 4.53 g (14.8 mmol) de
2'-O-metiltiometil uridina 7 (8) en
50 ml piridina se trató con 3.04 g (29.7 mmol) de Ac_{2}O. Después
de 24 de agitación, la solución se evaporó. El residuo se disolvió
en 40 ml EtOAc, se lavo con agua y se secó con Na_{2}SO_{4}.
Después de la evaporación, fue obtenido el compuesto de título puro
(5.05 g).
Se adicionaron 0.33 g (1.47 mmol) de
N-iodosuccinimida en 3 ml de THF a una solución de
0.5 g (1.287 mmol) 8, 0.978 g (6.l mmol)
(1,1,2-trimetil-propil)-dimetil
silanol, 10 ml CH_{2}Cl_{2} y 1 gota de MeOSO_{3}H. Después
de agitar por 2, se adicionaron 2 ml NaHSO_{3} (37%), Luego 100 ml
de CH_{2}Cl_{2}. La capa orgánica se separó y se secó con
Na_{2}SO_{4}. Después de la filtración, la solución se evaporó:
552 mg de compuesto de título puro.
Una solución de 187 mg (0.37 mmol) 9, 20 ml MeOH
y 0.135 ml (0.74 mmol) NaOMe/MeOH (30%) se agitó 30min. a 0ºC.
Después de la evaporación, el residuo se filtro a través de una
pequeña columna de silica gel (EtOAc/MeOH 4:1): 140 mg 10 como
polvo.
La síntesis de oligonucleótidos se desarrollo
típicamente sobre un sintetizador de ADN automatizado ABI394
(Applied Biosystems). ADN Fosforamiditas, fosforamidita Uridina
protegida THEX (6) o fosforamidita Uridina protegida TOM (Xeragon,
Inc.) se disolvieron en acetonitrilo seco a una concentración del 5%
w/v; el acoplamiento se hizo mediante la activación de
fosforamiditas utilizando una solución de benzimidazolo triflato 0.2
M (9) en acetonitrilo. Los tiempos de acoplamiento fueron entre
1-5 minutos. Una primera cubierta se hizo utilizando
reactivos de cubierta estándar. La oxidación se hizo utilizando una
solución de yoduro 0.1 M en THF/agua/piridina (1:1:1). Una segunda
cubierta se desarrollo después de la oxidación. La detritilación
antes del próximo acoplamiento se efectuó con ácido dicloroacético
al 2% en dicloroetano.
Sobre la terminación de la elongación de la
cadena de oligonucleótido, el soporte sólido se transfirió a un tubo
Eppendorf.
Cuando se preparó con fosforamidita Uridina
protegida THEX (6), los oligonucleótidos se dividieron del soporte y
se desprotegió como sigue:
- 1.
- 32% aq. Amoníaco/EtOH 3:1 (250 \mul para una escala de 0.2 \mumole), temperatura ambiente, 2 h liofilización a sequedad.
- 2.
- 1 M de fluoruro de tetrabutilamonio en THF (250 \mul para una escala de 0.2 \mumole), 30 min. a temperatura ambiente.
- 3.
- 1 M Tris.HCl, pH=7.4 (250 \mul para una escala de 0.2 \mumole).
Cuando se preparó con fosforamidita Uridina
protegida TOM, los oligonucleótidos se dividieron del soporte y se
desprotegió como sigue:
- 1.
- 32% aq. Amoníaco/EtOH 3:1 (250 \mul para una escala de 0.2 \mumole), temperatura ambiente, 2 h liofilización a sequedad.
- 2.
- 1 M fluoruro de tetrabutilamonio en THF (250 \mul para una escala de 0.2 \mumole), 6 h min a temperatura ambiente.
- 3.
- 1 M Tris.HCl, pH=7.4 (250 \mul para una escala de 0.2 \mumole).
Soluciones crudas resultantes se analizaron por
Electroforesis Capilar en Gel.
Los resultados se resumieron en la tabla 1
| # | Secuencia | TOM (% pureza) | THEX (% pureza) |
| 11 | TTT TTU TTT TTT TTT | 85 | 79 |
| 12 | TTT TTU UUU TTT TTT | 67 | 72 |
Como se muestra en la tabla 1, y la figuras
1-4, la calidad del material crudo obtenido con
fosforamidita Uridina protegida THEX 6 y fosforamidita Uridina
protegida TOM son muy similares.
El uso de la estrategia del grupo protector
2'-O-THEX permitió la reducción de
la desprotección de 2' desde 6 h a 35ºC (como se reporta en la ref.
6) en 30 min a temperatura ambiente.
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controlled-pore glass support: synthesis of a
43-nucleotide sequence similar to the
3'-half molecule of an Escherichia coli
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7996-7997.
Claims (17)
1. Un derivado de ribonucleósido de la
fórmula
en
donde
R_{1} es una base de la familia de purina- o
pirimidina-o un derivado de una familia base o un
derivado de una base o cualquier otro residuo que sirve como un
sustituto de una nucleobase,
R_{2} es un protón o un derivado sustituido de
ácido fosfónico,
R_{3} es un protón o un grupo protector para
el átomo de oxígeno en la posición 5',
R_{4}, R_{5} y R_{6} son
independientemente un grupo alquilo o arilo o una combinación de
alquilo y arilo o heteroátomo, R_{4}, R_{5} o R_{6} puede
también estar conectados cíclicamente entre sí;
y
en donde al menos uno de los sustituyentes
R_{4}, R_{5} o R_{6} comprende un átomo de C terciario o un
heteroátomo cercano al átomo de Si.
2. Un derivado de ribonucleósido de acuerdo con
la reivindicación 1 en donde el sustituyente que comprende el átomo
de C terciario cercano al átomo de Si contiene desde 4 a 24 átomos
de C.
3. Un derivado de ribonucleósido de acuerdo con
la reivindicación 1 o 2 en donde el sustituyente que comprende el
átomo de C terciario cercano al átomo de Si es un
alquilo-sustituyente seleccionado del grupo que
consiste de ter-butil, ter-pentil,
ter-hexil, terheptil, ter-octil,
ter-nonil, ter-decil,
ter-undecil, ter-dodecil.
4. Un derivado de ribonucleósido de acuerdo con
la reivindicación 1, 2 o 3 en donde el sustituyente que comprende el
átomo de C terciario cercano al átomo de Si es seleccionado del
grupo de 1,1-dimetiletil,
1,1-dimetil-propil,
1,1-dimetil-butil,
1,1-dimetilpentil,
1,1-dimetil-hexil,
1,1,2-trimetil-propil,
1,1,2-trimetil-butil,
1,1,2-trimetil-pentil,
1,1,2-trimetil-hexil,
1,1,2,2-tetrametil-propil,
1,1,2,2-tetrametil-butil.
5. Un derivado de ribonucleósido de acuerdo con
la reivindicación 1 en donde el sustituyente cercano al átomo de Si
contiene un heteroátomo sustituido.
6. Un derivado de ribonucleósido de acuerdo con
la reivindicación 5 en donde el sustituyente cercano al átomo de Si
contiene un heteroátomo bivalente sustituido.
7. Un derivado de ribonucleósido de acuerdo con
la reivindicación 6 en donde el heteroátomo es oxígeno.
8. Un método para la preparación de un derivado
de ribonucleósido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende
la reacción de un nucleósido con la fórmula:
donde R_{1} y R_{3} son como se
definieron en la reivindicación 1, con un derivado de sililoximetil
de la
fórmula
YH_{2}C --- O
---
\melm{\delm{\para}{R _{6} }}{S}{\uelm{\para}{R _{4} }}i
---
R_{5}en donde Y es un grupo marginal
apropiado
y en donde R_{4}, R_{5} y R_{6} son
independientemente un grupo alquilo o arilo o una combinación de
alquilo y arilo o un heteroátomo, R_{4}, R_{5} o R_{6} también
pueden estar conectados cíclicamente entre sí.
9. El método de la reivindicación 8 en donde Y
es un halógeno.
10. El método de la reivindicación 8 o 9 en
donde R_{4}, R_{5} y R_{6} juntos contienen entre 3 y 30
átomos de carbono.
11. El método de las reivindicaciones 8 o 9 en
donde R_{4}, R_{5} o R_{6} contienen al menos un heteroátomo
sustituido cercano al átomo de Si.
12. El método de la reivindicación 11 en donde
el heteroátomo es un átomo bivalente.
13. El método de la reivindicación 12 en donde
el heteroátomo es un oxígeno.
14. El método de la reivindicación 11, 12 o 13
en donde el derivado de ribonucleósido es adicionalmente sustituido
sobre el oxígeno en la posición 3'- con un grupo que comprende de un
derivado de ácido fosfónico.
15. Un método para la preparación de un derivado
de ribonucleósido, que comprende la reacción de un derivado de
ribonucleósido con la fórmula
Bajo una activación electrofílica con un
compuesto de fórmula:
HO ---
\melm{\delm{\para}{R _{6} }}{S}{\uelm{\para}{R _{4} }}i
---
R_{5}en donde R_{1} se define como en
la reivindicación 1 y R_{7} es un grupo alquilo- o arilo-, o un
grupo
alquilo-arilo-,
en donde R_{2} es un grupo protector,
en donde R_{3} es un grupo protector,
en donde R_{4}, R_{5} y R_{6} son grupos
alquilo o arilo idénticos o diferentes o una combinación de
sustituyentes alquilo y arilo, que adicionalmente pueden estar
sustituidos con heteroátomos y que también pueden estar conectados
cíclicamente entre sí.
16. El método de la reivindicación 15 en donde
R_{4}, R_{5} y R_{6} son definidos según las reivindicaciones
1 a 7.
17. El método de la reivindicación 15 o 16 en
donde el derivado de ribonucleósido es adicionalmente sustituido
sobre el oxígeno en la posición 3'- con un grupo que comprende un
derivado de ácido fosfónico.
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