ES2267201T3 - Ribonucleopoliptidos que contienen metal. - Google Patents

Abstract

Ribonucleoproteínas que contienen metal que contienen una proteína de la familia de las proteínas S100, un ARN y cobre como ión metálico en forma de un complejo ternario, caracterizadas porque el ARN del complejo ternario presenta las siguientes secuencias: (a1)(ARNA) Clon 3a (ARNA I) o (a2)ARNA VI Clon P-10 (ARNA VI)

Description

Ribonucleopolipéptidos que contienen metal.

La presente invención se refiere a ribonucleopolipéptidos (RNP) que contienen metal, así como a procedimientos para su preparación, a su uso y a fármacos que contienen ribonucleopolipéptidos o sus estructuras equivalentes en biología molecular y/o partes y/o derivados.

La homeostasis de tejidos del cuerpo, sus órganos y tejidos depende de los mecanismos de regulación de la angiogénesis. Estos influyen tanto en la reparación de tejidos y curación de heridas, la nueva formación de tejidos en la embriogénesis y en los ciclos reproductivos, así como en el aumento, la regresión y la destrucción de tumores, transplantes y tejidos abastecidos con vasos y libres de vasos.

El documento WO-A-9704007 da a conocer ribonucleopolipéptidos (RNP) que contienen metal bioactivos específicos en los que se encuentra como metal preferiblemente calcio, cobre o cinc.

Es cometido de la presente invención proveer otros ribonucleopolipéptidos que contienen metal como mediadores no mitogénicos de la homeostasis de tejidos, con los que prioritariamente puede influirse la reparación de tejidos, angiogénesis de curación de heridas y neovascularización. Es además cometido de la invención la provisión de un procedimiento para la preparación de estos mediadores no mitogénicos, así como un fármaco que contiene estos mediadores no mitogénicos.

Se consiguen estos cometidos mediante los objetos de las reivindicaciones 1 a 3.

Se encontró por los inventores que hay mediadores celulares no mitogénicos basados en ácidos nucleicos con secuencia definida que pueden causar específicamente la formación de vasos sanguíneos in vivo e in vitro, y representan mediadores no mitogénicos agentes naturales biológicamente específicos de la angiogénesis o del crecimiento direccional de brotes de vasos sanguíneos.

La nueva clase de morfógenos celulares detectada por los inventores para células endoteliales se presenta en forma de un ribonucleopéptido (RNP)-metal bioactivo. Este se denomina angiotropina.

La estructura de la angiotropina puede asignarse a las ribonucleoproteínas (RNP). Consiste en una parte proteica (ARP= proteína relacionada con angiotropina) y una parte de ARN (ARNA= angiotropina-ARN). Para la formación del complejo de ARP y ARNA es esencial Cu (II). Además del ión cobre, la angiotropina contiene un ión Ca (II). Para las numerosas funciones biológicas y bioquímicas de la angiotropina son útiles además iones Mg (II).

La parte proteica (ARP) consta de una proteína, que puede asignarse a la familia de las proteínas S100
(Dell'Angelica et al., J. of Biological Chemistry, vol. 269, nº 46, pág. 28929-28936 (1994)), y preferiblemente es de 91 aminoácidos de longitud. La estructura primaria de esta ARP preferida es como sigue:

1

Según la invención, los ARNA utilizables son además como se definen a continuación:

100

2

\vskip1.000000\baselineskip

Los RNP según la invención se caracterizan mediante las siguientes propiedades:

-

efecto morfogénico selectivo celular in vitro sobre células endoteliales de capilares sanguíneos aisladas primarias y/o clonadas en cultivo para la inducción no mitogénica del cambio del fenotipo celular a partir del estado confluente, para cambio no mitogénico de la organización supracelular espaciotemporal de las células hasta estructuras similares a capilar organoides tridimensionales en cultivo;

-

efecto quimiotrópico específico sobre vasos sanguíneos in vivo,

-

inducción de un crecimiento direccional de vasos sanguíneos in vivo,

-

inducción de una neovascularización de tejidos mediante el crecimiento dirigido de vasos sanguíneos.

En los RNP según la invención, la parte proteica está unida mediante interacción a la parte de ARN.

Es también cometido de la invención un procedimiento para la preparación y obtención de RNP bioactivos, caracterizado porque se homogeneizan las células, por ejemplo leucocitos o tejidos inflamatorios, o se cultivan leucocitos y se obtienen los RNP generados a partir de los homogeneizados o a partir de los sobrenadantes de la solución de cultivo mediante procedimientos estándar. Por ejemplo, puede aislarse angiotropina a partir de los sobrenadantes de cultivos celulares en masa libres de suero de leucocitos de sangre porcina activados con concanavalina A y leucocitos de células de músculo cardiaco isquémico/infartado, y purificarse para homogeneidad.

El procedimiento para la preparación y obtención de los morfógenos de RNP bioactivos de las células o leucocitos y del tejido inflamatorio se caracteriza porque se cultivan células o leucocitos del sistema reticuloendotelial de los leucocitos y del tejido inflamatorio, y se obtienen los morfógenos de RNP generados a partir de los homogeneizados o a partir de la solución de cultivo sobrenadante.

En principio, es también posible procesar en las células, por ejemplo leucocitos, los mediadores directamente sin cultivo.

El cultivo de células (leucocitos) puede llevarse a cabo en principio en cualquier medio que mantenga las células (leucocitos).

Para el cultivo de células, como leucocitos, se añade a los medios de cultivo a una duración planeada del cultivo de 1 hora principalmente suero, por ejemplo suero bovino o suero equino, ya que los componentes del suero son beneficiosos para el mantenimiento de las funciones vitales de las células. Sin embargo, cuando deben procesarse en la solución de cultivo que contiene suero las proteínas (mediadores) que se producen mediante el cultivo, la obtención de las proteínas producto contenidas por lo general sólo a bajas concentraciones se enfrenta a grandes dificultades a causa de la pluralidad de proteínas extrañas procedentes del suero. Además, no puede verificarse a este respecto con seguridad si un mediador determinado es de origen humoral o celular y de cuál especie procede, es decir, si es un mediador de la especie cuyas células se han cultivado o de la especie de la que procede el suero usado (por lo general heterólogo).

El medio de cultivo celular totalmente sintético usado preferiblemente según la invención contiene los grupos de sustancias habituales como sales, azúcares, aminoácidos nucleósidos y bases nucleosídicas, vitaminas, vitaminoides, coenzimas y esteroides en solución acuosa. Se caracteriza porque contiene adicionalmente una o una mezcla de varias sustancias que se demuestran especialmente valiosas para la supervivencia y el crecimiento de leucocitos y su capacidad para la producción de mediador. Pertenecen a estas sustancias ácidos grasos insaturados, flavonoides, ubiquinona, vitamina C y mevalolactona.

\newpage

El medio de cultivo celular se usa preferiblemente para cultivo de células o leucocitos de larga duración sin adición de suero. En lugar de ello, contiene al menos una proteína definida, que en una forma de realización especialmente preferida es seroalbúmina homogénea molecular de alta pureza.

En otras formas de realización preferidas, el medio de cultivo celular libre de suero totalmente sintético usado según la invención puede contener aún otros compuestos beneficiosos para el cultivo de leucocitos de las clases de sustancias de compuestos polihidroxílicos y azúcares, aminoácidos, nucleósidos, compuestos aniónicos y/o vitaminas, cuyo uso en los medios de cultivo conocidos no es habitual. Los componentes del medio usado según la invención se adaptan en sus relaciones cuantitativas entre sí de modo que la concentración de los componentes en el medio se ajuste en gran medida a los intervalos de concentración naturales del plasma, véase Ciba-Geigy AG (editor) (1969) en "Documenta Geigy, Wissenschaftliche Tabellen" 7ª edición, Geigy S.A., Basilea.

Preferiblemente, el medio de cultivo celular está libre de tensioactivos, sales de metales pesados y colorantes que dañan las células y pueden perturbar la obtención de los productos celulares deseados a partir de la solución de cultivo.

Se prefiere especialmente para el cultivo de leucocitos en el procedimiento de la invención el medio de cultivo celular con la composición dada en la Tabla 1 siguiente.

Para la preparación del medio se usa agua de calidad ASTM-1, véase ASTM D-1193-70 "Standard Specification for Reagent Water", 1970; Annual Book of ASTM-Standards, Easton, Maryland, ASTM 1970. Se libera además de posibles contaminaciones con endotoxina mediante ultrafiltración con membranas libres de tensioactivos con un límite de exclusión 10.000 Da. El medio preparado se esteriliza por filtración en membranas libres de tensioactivos con
\leq0,2 \mum de tamaño de poro.

TABLA 1

Nº	Componente	mol/l
1	KCl	5,0 m
2	KH_{2}PO_{4}	0,2 m
3	NaCl	120,0 m
4	Na_{2}HPO_{4}	0,8 m
5	Na_{2}SO_{4}	0,8 m
6	Ácido L-ascórbico	0,2 m
7	Cloruro de colina	50,0 \mu
8	2-Desoxi-D-ribosa	5,0 \mu
9	D-galactosa	0,5 m
10	D-glucosa	5,0 m
11	D-glucurono-\gamma-lactona	0,1 m
12	Glicerina	50,0 \mu
13	Mioinosita	0,5 m
14	Acetato de sodio	0,2 m
15	Citrato de sodio	50,0 \mu
16	Piruvato de sodio	0,1 m
17	D-ribosa	20,0 \mu
18	Ácido succínico	0,1 m
19	Xilita	10,0 \mu

TABLA 1 (continuación)

Nº	Componente	mol/l
20	D-xilosa	20,0 \mu
21	CaCl_{2}	2,0 m
22	MgCl_{2}	1,0 m
23	NaHCO_{3}	10,0 m
24	Seroalbúmina humana	7,7 \mu
25	Penicilina	1,0 \mu
26	Estreptomicina	2,0 \mu
27	L-glutamina	1,0 m
28	L-alanina	0,2 m
29	L-asparagina	0,1 m
30	Ácido L-aspártico	0,1 m
31	Ácido L-glutámico	0,1 m
32	Glicina	0,2 m
33	L-prolina	0,1 m
34	2L-serina	0,1 m
35	L-arginina	0,1 m
36	Ácido 4-aminobenzoico	2,0 \mu
37	L-cisteína	0,2 m
38	L-histidina	0,1 m
39	L-hidroxiprolina	10,0 \mu
40	L-isoleucina	0,2 m
41	L-leucina	0,2 m
42	HCl de L-lisina	0,2 m
43	L-metionina	0,1 m
44	L-ornitina	50,0 \mu
45	L-fenilalanina	0,1 m
46	Sarcosina	50,0 \mu
47	Taurina	0,1 m
48	L-treonina	0,2 m
49	L-triptófano	50,0 \mu
50	L-tirosina	0,1 m

TABLA 1 (continuación)

Nº	Componente	mol/l
51	L-valina	0,2 m
52	Glutation reducido	3,0 \mu
53	Carnosina	5,0 \mu
54	Mevalolactona	5,0 \mu
55	Adenina	50,0 \mu
56	Adenosina	50,0 \mu
57	Citidina	50,0 \mu
58	Guanina	5,0 \mu
59	Guanosina	20,5 \mu
60	Hipoxantina	5,0 \mu
61	5-Metilcitosina	5,0 \mu
62	Timidina	20,0 \mu
63	Timina	5,0 \mu
64	Uracilo	5,0 \mu
65	Uridina	20,0 \mu
66	Xantina	5,0 \mu
67	Biotina	1,0 \mu
68	Pantotenato de Ca	5,0
69	Ergocalciferol	0,5 \mu
70	D,L-Carnitina	50,0 \mu
71	Ácido fólico	5,0 \mu
72	Ácido D,L-\alpha-lipónico	2,0 \mu
73	Menadiona	0,2 \mu
74	Amida del ácido nicotínico	20,0 \mu
75	HCl de piridoxal	5,0 \mu
76	HCl de piridoxina	2,0 \mu
77	Riboflavina	1,0 \mu
78	Rutina	5,0 \mu
79	HCl de tiamina	5,0 \mu
80	Acetato de D,L-\alpha-tocoferilo	1,0 \mu
81	Acetato de vitamina A	1,0 \mu

TABLA 1 (continuación)

Nº	Componente	mol/l
82	Vitamina K	0,2 \mu
83	Vitamina B1	0,5 \mu
84	Vitamina U12	1,0 \mu
85	Colesterol	1,0 \mu
86	Coenzima Q10	0,1 \mu
87	Ácido linólico	1,0 \mu
88	Ácido linolénico	5,0 \mu
89	Ácido oleico	5,0 \mu
90	Etanol	1,0 m
91	Ph 7,10	-
92	Concanavalina A	50,0 n

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Según el tipo de productos deseados, se cultivan poblaciones de células mixtas o leucocitos o tipos de células o leucocitos individuales. La preparación y cultivo de las células o leucocitos debe realizarse en condiciones estériles. El cultivo se lleva a cabo durante un tiempo suficientemente largo para mantener un rendimiento satisfactorio de mediador. Para ello, se ha demostrado adecuada una duración de aproximadamente 10 a 50 horas. A tiempos más cortos, el rendimiento de mediador es demasiado bajo, de modo que el procedimiento es antieconómico. Por otra parte, a una duración de cultivo superior a aproximadamente 50 horas, el medio se agota y las células empiezan a morir, de modo que ya no ha de esperarse un aumento del rendimiento.

El cultivo de las células o leucocitos se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 30 a 42ºC, preferiblemente de aproximadamente 37ºC. A temperaturas menores, el proceso de cultivo es insatisfactorio, mientras que a temperaturas mayores de 42ºC se dañan los leucocitos.

El cultivo se lleva a cabo con una concentración de aproximadamente 10^{6} a 5 x 10^{8} células/ml, preferiblemente hasta 10^{7} a 10^{8} células/ml. A concentraciones celulares menores, el rendimiento por unidad de volumen de la solución de cultivo es demasiado bajo. El procedimiento se vuelve antieconómico debido a los grandes volúmenes de cultivo. A una concentración celular superior a 5 x 10^{8} células/ml, aparece un empobrecimiento muy rápido del medio en sustancias nutritivas.

El cultivo puede llevarse a cabo en la atmósfera. Preferiblemente, se mantiene durante el cultivo una presión parcial elevada de dióxido de carbono, pudiendo bastar con hasta aproximadamente 10% en vol, especialmente hasta aproximadamente 2% en vol. Es de gran importancia el abastecimiento de oxígeno al cultivo. Puede asegurarse, por ejemplo, mediante la conducción de aire. Para evitar una contaminación del cultivo, se esteriliza preferiblemente el aire alimentado y se descontamina térmicamente, es decir, se libera de endotoxinas y otros componentes orgánicos. La solución puede agitarse o removerse durante el cultivo. Como estimulante celular se utiliza preferiblemente Con A.

Para la terminación del cultivo, se separan por centrifugación las células o leucocitos de la solución de cultivo, en la que a continuación se procesan las angiotropinas generadas. Para evitar el daño a las células y por tanto una impurificación de la solución de cultivo por componentes celulares, se centrifuga el cultivo con aceleración comparativamente baja, es decir, aproximadamente 300 a 400 x g. Después de la separación de la mayoría de las células del sobrenadante, se centrifuga éste de nuevo recomendablemente a mayor aceleración para separar las partículas en suspensión restantes. Los leucocitos separados pueden cultivarse de nuevo, crioconservarse o alimentarse a otro uso.

Además de mediante cultivo de leucocitos, los morfógenos de RNP bioactivos de la invención pueden obtenerse también a partir de tejidos inflamatorios. Allí se generan mediante la aglomeración de los leucocitos a causa de los procesos de inflamación desencadenados por el daño a tejidos. Los tejidos inflamatorios pueden obtenerse de modo habitual y se usan para la extracción de los RNP. Para ello, se homogeneizan los tejidos inflamatorios en solución tampón y se separan los componentes solubles (exudado) de los componentes estructurales insolubles del tejido.

Preferiblemente, se usan tejidos de músculo cardiaco infartado inflamado que se forman mediante el ligamiento de la rama anterior izquierda de la arteria coronaria izquierda mediante una técnica de catéter transfemoral durante 24 horas. La parte de músculo cardiaco inflamada que contiene leucocitos se separa a 0 a 4ºC de los tejidos sanos no infartados.

Para el aislamiento y obtención de los RNP bioactivos de la invención, es necesario el procesamiento de un volumen de solución cultivo muy grande. Para iniciar el procedimiento de purificación, es necesario por tanto por razones prácticas llevar a cabo una reducción lo más eficaz posible del volumen a tratar. La solución de cultivo contiene, además de cantidades pequeñas de las sustancias producidas, entre ellas principalmente proteínas, la mezcla de componentes del medio. Ventajosamente, se lleva a cabo por tanto en la primera etapa de la purificación una separación de las proteínas generadas de los componentes del medio y simultáneamente del gran volumen de solución acuosa. Esto puede efectuarse mediante una precipitación salina selectiva de las proteínas de la solución de cultivo que se consigue, por ejemplo, mediante la adición de un sulfato o fosfato. A continuación, se describe la precipitación de las proteínas, por ejemplo, por precipitación salina mediante adición de sulfato de amonio a la solución de cultivo.

Mediante la saturación de la solución de cultivo con sulfato de amonio, precipitan la mayoría de las proteínas generadas junto con la seroalbúmina eventualmente contenida. Después de la separación del precipitado de sustancia, por ejemplo mediante centrifugación, puede separarse éste del modo descrito a continuación en sus componentes individuales, y obtenerse los RNP bioactivos contenidos. El residuo obtenido contiene, además de los componentes solubles del medio, también la parte soluble de las sustancias en solución saturada de sulfato de amonio, entre las que se encuentra también una parte de los RNP bioactivos. Se concentra el sobrenadante y se obtienen las sustancias contenidas del modo siguiente. Cuando se mezcla la solución de cultivo que contiene proteína con sulfato de amonio hasta saturación, precipitan la mayor parte de las proteínas acompañantes. De este modo, se obtiene una mezcla proteica que está compuesta por una serie de distintas proteínas y cuya separación en los componentes individuales es en consecuencia laboriosa. En una forma de realización preferida del procedimiento de la invención, se separa por tanto la mezcla proteica contenida en la solución de cultivo ya en la etapa de precipitación en varias fracciones. Esta separación en varias fracciones proteicas es posible ya que las proteínas individuales precipitan a distintas concentraciones de sulfato de amonio. Preferiblemente, se mezcla por tanto por etapas la solución de cultivo en el procedimiento de la invención con sulfato de amonio hasta el grado de saturación determinado, con lo que en cada fracción precipita la parte de las proteínas cuyo producto de solubilidad se encuentra por debajo del respectivo grado de saturación. Mediante una elección adecuada de los límites de saturación de las fracciones individuales, puede conseguirse en el procedimiento de la invención ya en la precipitación una gran separación en grupos de proteínas.

Por ejemplo, se mezcla la solución de cultivo en primer lugar hasta una saturación de 35% con sulfato de amonio. Se separa el precipitado proteico obtenido. Después, se aumenta el grado de saturación de la solución sobrenadante a 45%. Se forma de nuevo un precipitado proteico, que se separa. A continuación, se ajusta la solución sobrenadante a un grado de saturación de 90%. El precipitado proteico así obtenido se separa igualmente. Se concentra la solución sobrenadante de este precipitado, por ejemplo, mediante diálisis de deshidratación o ultrafiltración.

La precipitación salina de las proteínas se lleva a cabo igualmente que la purificación siguiente, preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 0 a 10ºC, especialmente aproximadamente 0 a 4ºC. Las soluciones usadas para purificación poseen un valor de pH de entre 5 y 9, especialmente entre 6 y 8. Para alcanzar una constancia de pH de la solución, se añade antes de la precipitación salina preferiblemente un tampón fuerte, por ejemplo, tampón fosfato 0,1 mol/l. Para mantener el potencial rédox de las proteínas, se añaden a las soluciones preferiblemente cisteína a una cantidad de 0,001 mol/l. No son necesarias condiciones estériles para la purificación de proteína.

Las proteínas obtenidas en la precipitación salina pueden alimentarse directamente, después de disolución en un medio no nocivo para proteínas, a la purificación y separación descritas a continuación. El sobrenadante de la última etapa de precipitación se concentra, por ejemplo mediante diálisis de deshidratación o ultrafiltración. A este respecto, se obtienen cuantitativamente en forma de retenido todos los compuestos con un peso molecular mayor de aproximadamente 300 a 500 Da, es decir, también las proteínas y péptidos de esta fracción.

Las fracciones proteicas obtenidas en las etapas descritas anteriormente contienen los RNP bioactivos de la invención mezclados con numerosas proteínas extrañas (otras proteínas secretadas, eventualmente seroalbúmina y eventualmente CON). Las proteínas extrañas se presentan en las mezclas en cantidad ampliamente predominante. Mediante una serie de etapas de purificación, deben enriquecerse los RNP bioactivos y liberarse de proteínas extrañas, para que éstas no perjudiquen ya su especificidad biológica molecular. Los RNP bioactivos mismos son igualmente una clase de sustancias que se separa en sus individuos de acción específica individuales.

En general, el procedimiento de purificación para productos proteicos (proteínas) y otras sustancias naturales consiste en una secuencia de procedimientos de separación combinados que aprovechan para la separación las diferencias de tamaño molecular, carga, forma, estabilidad estructural y carácter de la superficie molecular entre el principio activo buscado y las sustancias extrañas acompañantes. En consecuencia, pueden concebirse numerosas combinaciones de los más distintos procedimientos de separación para la purificación de una proteína. Para las propiedades de manejo, practicabilidad técnica, posibilidad de automatización y economía de un procedimiento de purificación, así como para la calidad del producto natural buscado, es por tanto no sólo importante el tipo de etapas de separación usadas, sino especialmente su configuración optimizada y su combinación juiciosa en una secuencia de purificación dentro del marco de la estabilidad estructural y los demás parámetros estructurales del principio activo buscado. Es decir, que incluso también el uso de principios de separación iguales o similares (por ejemplo, filtración de tamices moleculares, diálisis, adsorción de intercambio iónico, etc,), pero en distinta combinación, puede ser decisivo para la manejabilidad y economía del procedimiento de purificación. En determinados casos, el uso u omisión de una técnica individual (por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatito, cromatografía de precipitación por zonas, etc.) en un sitio determinado de la secuencia de purificación, o dentro de una secuencia parcial limitada, es de importancia crucial para la calidad del principio activo buscado, así como para la manejabilidad y la economía de su procedimiento de purificación. Se muestran claramente estas relaciones generales y principios básicos de la purificación de sustancias naturales, por ejemplo, por el hecho generalmente conocido de que en un procedimiento de purificación de sustancias naturales económico, racional y técnicamente manejable no es juiciosa una etapa de purificación de cromatografía en columna o una etapa de liofilización antes de haber reducido el volumen de partida global o la concentración de partida de los componentes extraños acompañantes del extracto de principio activo al menos 1/500 a 1/1000 mediante otra etapa de procedimiento.

Para la purificación de las fracciones proteicas individuales, convienen una pluralidad de etapas de purificación conocidas en la bioquímica individualmente por sí mismas. Son ejemplos de dichas etapas de purificación: filtración por tamiz molecular preparativa y analítica, cromatografía de intercambio aniónico y catiónico o procedimiento de adsorción en un recipiente, cromatografía en hidroxiapatito, cromatografía de precipitación por zonas y filtración por tamiz molecular en circulación o en cascada.

Ya mediante la realización una vez de uno de los procedimientos de purificación citados, puede separarse una cantidad considerable de proteínas acompañantes de RNP bioactivos. Sin embargo, a pesar de su peso molecular distinto, frecuentemente las sustancias obtenidas en las fracciones se mantienen juntas muy fuertemente. Por ejemplo, en la filtración por tamiz molecular, a menudo se separan de forma incompleta correspondientemente a su peso molecular por la existencia de equilibrios no ideales de polielectrolitos proteicos. Se recomienda por tanto llevar a cabo al menos dos de los procedimientos de separación citados. Preferiblemente, se someten consecutivamente las fracciones de proteína que contienen actividad de RNP bioactivos al menos a tres de las etapas de purificación citadas.

Todas las combinaciones de las etapas de separación mencionadas son cometido del procedimiento según la invención. A este respecto, pertenece al estado de conocimientos del experto que determinadas series de etapas de separación son menos juiciosas que otras combinaciones. Por ejemplo, el experto es consciente de que al llevar a cabo una filtración por tamiz molecular preparativa después de una filtración por tamiz molecular analítica, además de un modo de procedimiento inmanejable, se obtiene también un resultado global peor con relación al efecto separador que con el orden inverso.

La filtración por tamiz molecular efectúa una separación de las proteínas correspondientemente a su peso molecular. Ya que una parte predominante de las proteínas extrañas acompañantes presenta un peso molecular distinto a los RNP bioactivos, su separación puede conseguirse de este modo. Para la separación de sustancias según su peso molecular, se usa un tamiz molecular hidrófilo hinchable en agua. Los ejemplos de tamices moleculares adecuados son dextranos reticulados con epiclorhidrina (Sephadex), agarosas reticuladas con acrilamida (Ultrogele) y acrilamidas reticuladas espacialmente (Biogele), cuyos límites de exclusión son mayores que los límites de separación usados para la separación.

La filtración por tamiz molecular, en caso de usar varias etapas de separación, se lleva a cabo preferiblemente como una de las primeras. Según la relación de longitud-diámetro de la columna usada y el diámetro de partícula de la matriz de gel, que influyen sobre el número de platos teóricos de la columna, se designa la filtración por tamiz molecular como "preparativa" o "analítica". Se designa como "preparativa" cuando la cromatografía se lleva a cabo en columnas con una relación de dimensiones de longitud:diámetro de 10:1 y una carga de hasta 1/3 del contenido de la columna o aprovechamiento completo del volumen de separación típico de matriz global. "Analítica" significa una relación longitud-diámetro superior a 10:1, preferiblemente aproximadamente 50:1, y una carga de hasta 3% como máximo del contenido de columna, también en versiones de HPLC.

En la cromatografía por tamiz molecular preparativa, se usan matrices de gel con el tamaño de partícula mayor posible para conseguir velocidades de caudal rápidas de las soluciones proteicas a menudo algo viscosas a las presiones más bajas posibles. En la filtración por tamiz molecular analítica, se elige el tamaño de partícula de la matriz de gel lo más pequeño posible, para conseguir un número de platos teórico máximo de la columna a presión utilizable técnicamente y con seguridad, y a una velocidad de flujo de la fase móvil de 2 a 4 cm/h. Estos parámetros dependen de la estructura de matriz del gel y son distintos de gel a gel.

En caso de llevar a cabo varias filtraciones por tamiz molecular preparativas, puede elegirse un límite de separación escalonado. Para ello, se puede llevar a cabo a continuación una filtración por matriz molecular analítica con límites de separación escalonados correspondientemente. El límite de exclusión del gel usado debe ser mayor en cualquier caso de aproximadamente 10.000 Da, para posibilitar una distribución de volumen de las angiotropinas entre la fase de matriz de gel estacionaria y la fase acuosa tamponada móvil.

El "límite de exclusión" designa el parámetro hidrodinámico de una partícula disuelta que corresponde al tamaño de poro de la matriz de gel. Las partículas con parámetros hidrodinámicos mayores no pueden penetrar ya en la matriz de gel (coeficiente de distribución de volumen K_{D}= 0). El "límite de separación" designa un parámetro hidrodinámico establecido recomendablemente para la separación de partículas disueltas que se encuentra entre un coeficiente de distribución de volumen K_{D}= 0 y K_{D}= 1.

Para la filtración por tamiz molecular, se aplican las sustancias disueltas en un líquido no nocivo al tamiz molecular. Es un ejemplo especial de un disolvente adecuado solución de fosfato de sodio y potasio 0,003 mol/l con un contenido de 0,3 mol/l de NaCl y 0,001 mol/l de cisteína y un valor de pH de 7,4. Después de la filtración, se concentran las fracciones que contienen RNP del modo descrito a continuación y eventualmente se someten a una etapa de purificación adicional.

Los intercambiadores aniónicos para la purificación de las sustancias son adecuados, por ejemplo, con matrices de dextrano (Sephadex) o celulosa reticuladas con epiclorhidrina, a las que se acoplan grupos funcionales con capacidad de intercambio aniónico. Pueden usarse repetidamente después del uso mediante regeneración. Preferiblemente, se usa un intercambiador aniónico débil prehinchado y equilibrado en una solución tampón en forma de Cl^{-}, como DEAE-Sephadex-A 50, y el tratamiento se lleva a cabo a un valor de pH de 8 a 10. Es un ejemplo especial para dicha solución tampón Tris-HCl 0,01 mol/l que contiene NaCl 0,04 mol/l y cisteína 0,001 mol/l y tiene un valor de pH de 8,0.

En el uso de intercambiadores aniónicos, se añade la fracción de sustancia a una cantidad de intercambiador aniónico tal que baste para la adsorción completa de las angiotropinas y las proteínas acompañantes adsorbentes positivas. Habitualmente, bastan para ello dos partes en volumen de intercambiador aniónico hinchado por volumen de fracción proteica concentrada. La reacción puede configurarse como procedimiento de cromatografía o como procedimiento de adsorción en un recipiente más fácilmente manejable. En el procedimiento de un recipiente, se separa el líquido sobrenadante con las proteínas adsorbentes negativas del intercambiador aniónico cargado con RNP y otras sustancias adsorbentes positivas, por ejemplo mediante filtración (en la columna de cromatografía), decantación o centrifugación (en el procedimiento de un recipiente). El intercambiador iónico cargado se libera mediante lavado con agua o con una solución salina que tiene una fuerza iónica máxima equivalente a NaCl 0,04 mol/l, preferiblemente como máximo a aproximadamente 15ºC, de compuestos adsorbentes negativos adherentes. Es un ejemplo especial de una solución salina adecuada para lavado la solución tampón citada de Tris-HCl de valor de pH 8,0.

El intercambiador aniónico liberado de compuestos adsorbentes negativos cargado con RNP y otras sustancias se eluye entonces con una solución salina acuosa no nociva para proteínas que tiene una fuerza iónica equivalente mayor de NaCl 0,04 mol/l y un valor de pH entre 4,0 y 10,0. Preferiblemente, se usa una solución salina de alta fuerza iónica con un valor de pH de 5,0 a 7,0. Es un ejemplo especial de una de dichas soluciones salinas una solución de NaCl 2,0 mol/l, que está tamponada con HCl de piperazina 0,01 mol/l a un valor de pH de 6,5 y que contiene 0,001 mol/l de cisteína.

En caso de configurar la reacción de intercambiador aniónico como procedimiento de cromatografía, la elución de RNP y otras sustancias puede realizarse también mediante un gradiente lineal de concentración de NaCl.

Como intercambiador catiónico son adecuados para la purificación de la fracción proteica, por ejemplo, matrices de dextrano (Sephadex) o celulosa reticuladas con epiclorhidrina a las que se acoplan grupos funcionales con capacidad de intercambio catiónico. Pueden utilizarse repetidamente después del uso mediante regeneración. Preferiblemente, se usa un intercambiador catiónico ácido débil en forma de Na^{+}, como CM-Sephadex C-50, y se lleva a cabo el tratamiento a un valor de pH de 4 a 6. Las fracciones de sustancia pueden diluirse para facilitar el ajuste de los equilibrios de carga antes del tratamiento con el intercambiador catiónico con una solución salina no nociva para proteínas que tiene una fuerza iónica máxima equivalente de 0,04 mol de NaCl/l. Simultáneamente, puede servir para ajustar el valor de pH. Es un ejemplo especial de una de dichas soluciones salinas una solución de tampón fosfato-acetato de potasio con un contenido de 0,04 mol/l de NaCl y un valor de pH de 4 a 6. Esta reacción de intercambio catiónico puede proporcionarse tanto como procedimiento de cromatografía como procedimiento de un recipiente técnicamente más fácilmente manejable.

El intercambiador catiónico se añade a la fracción de sustancia en una cantidad que baste para adsorber la fracción proteica. Habitualmente, bastan para ello aproximadamente 2 partes en volumen de intercambiador iónico hinchado por parte en volumen de fracción proteica. Después de ello, se separa el líquido sobrenadante del intercambiador catiónico cargado con las sustancias, por ejemplo mediante decantación o centrifugación. Se libera el intercambiador catiónico cargado de compuestos adsorbentes adherentes mediante lavado con agua o una solución salina que tiene una fuerza iónica máxima equivalente de NaCl 0,04 mol/l, preferiblemente a un valor de pH de aproximadamente 4 a 6 y una temperatura de preferiblemente como máximo aproximadamente 15ºC. Es un ejemplo especial para una solución salina adecuada para lavado la citada solución tampón de fosfato-acetato de potasio de valor de
pH 5,0.

El intercambiador catiónico cargado con las sustancias liberado de compuestos adsorbentes negativos se eluye entonces con una solución salina acuosa no nociva para proteínas y ácidos nucleicos. Preferiblemente, se usa para ello una solución salina de alta fuerza iónica con un valor de pH de aproximadamente 4 a 10. Son ejemplos especiales de dichas soluciones salinas una solución acuosa de fosfato de potasio 0,5 mol/l de valor de pH 6,5 a 7,5 o una solución de cloruro de sodio 2 a 5 mol/l de igual valor de pH.

Para la cromatografía en hidroxiapatito, se separan posiblemente antes de la aplicación al hidroxiapatito las sales presentes en las etapas precedentes, por ejemplo sulfato de amonio y ante todo fosfatos, preferiblemente mediante diálisis o ultrafiltración con una membrana con un límite de exclusión de 500 Da. Aparte del aumento de viscosidad por las adiciones extrañas, es sin embargo únicamente crítico para el éxito de la cromatografía en hidroxiapatito la concentración de fosfato de la solución proteica. La elución de las sustancias se realiza mediante un gradiente de concentración de fosfato de potasio que preferiblemente es lineal. Las fracciones que contienen RNP se reúnen y se concentran del modo citado a continuación.

El uso de hidroxiapatito es de importancia fundamental para la obtención pura respetuosa con la estructura de los RNP. Sin embargo, por razones técnicas y económicas está ligado a dificultades considerables purificar mediante cromatografía grandes volúmenes de sustancia en columnas de hidroxiapatito. Por un lado, porque el hidroxiapatito tiende a grandes volúmenes de sustancia a una oclusión muy fuerte, y se vuelve entonces inutilizable. Por otro lado es hidroxiapatito es caro, lo que se opone a su uso a gran escala. Por estas razones, se prefiere en el procedimiento según la invención separar ya antes de la cromatografía en hidroxiapatito una gran parte de las proteínas extrañas acompañantes de las fracciones de sustancia que contienen los RNP bioactivos como trazas mediante etapas de procedimiento adecuadas, y reducir así decisivamente el volumen de proteína que debe aplicarse sobre la columna de hidroxiapatito.

En la cromatografía de precipitación por zonas (véase J. Porath, Nature, vol. 196 (1962), pág. 47-48), se separan impurezas proteicas de RNP bioactivos mediante fraccionamiento por precipitación salina de las proteínas mediante un gradiente de concentración salina.

El principio básico de la separación de proteínas mediante la cromatografía de precipitación por zonas son las distintas propiedades de solubilidad reversible dadas por la estructura de las proteínas. Pertenecen a los parámetros de separación molecular más sensibles y se han usado frecuentemente como criterio para la detección de la uniformidad molecular de una proteína. A este respecto, pueden variar en un intervalo comparativamente amplio temperaturas y valor de pH, dimensión de la columna, tipo de sal, forma del gradiente y carga de la columna.

La temperatura en la cromatografía de precipitación por zonas puede ascender a entre aproximadamente 0 a 40ºC. Preferiblemente, está en un intervalo de temperatura de aproximadamente 0 a 10ºC, especialmente aproximadamente 4 a 6ºC. El valor de pH puede encontrarse a entre aproximadamente 4 y 10, preferiblemente es un valor de pH en el intervalo de 6 a 8, especialmente aproximadamente 7. La relación de longitud:diámetro de la columna usada debe ser mayor de aproximadamente 10:1, preferiblemente es una relación de 30 a 100:1, especialmente de aproximadamente 50:1. Como sales se tienen en cuenta todas las sales con efectos no nocivos para proteínas y ácidos nucleicos. Son ejemplos
de dichas sales fosfato de sodio y potasio, sulfato de amonio y sulfato de sodio. Se prefiere usar sulfato de amonio.

El gradiente de concentración salina puede tener cualquier forma, a condición de que los puntos de precipitación salina de las proteínas estén separados según su recorrido. Se prefieren gradientes lineales de concentración, especialmente un gradiente lineal de concentración creciente de 25 a 100% de saturación de sulfato de amonio. La carga de la columna asciende como máximo aproximadamente a 5%, preferiblemente a aproximadamente 1%.

La filtración por tamiz molecular en circulación o en cascada puede llevarse a cabo en condiciones que se han descrito anteriormente para la filtración por tamiz molecular analítica. Pueden usarse los mismos tamices moleculares y las mismas condiciones de columna. Se prefiere Sephadex G 50 a una relación de longitud:diámetro de la columna de al menos aproximadamente 50:1 y una carga de cómo máximo aproximadamente 3% del contenido de la columna. Como disolvente y para elución se utilizan preferiblemente los disolventes usados en la filtración por tamiz molecular analítica.

En la filtración por tamiz molecular en circulación, se conduce el eluído en los límites de separación establecidos por circulación de nuevo a la misma columna. De este modo, se alarga diferencialmente el recorrido de las proteínas. En otra forma de realización, la filtración por tamiz molecular en cascada, se conduce el eluído en los límites de separación establecidos a una nueva columna con los mismos parámetros definidos o similares.

Entre las etapas de purificación ilustradas anteriormente pueden purificarse y concentrarse las soluciones de sustancia que contienen RNP bioactivos obtenidas para separaciones posteriores de las proteínas de sales indeseadas. Esta concentración (separación de la mayor parte de la solución acuosa salina de las proteínas) puede realizarse de distintos modos. Por ejemplo, los RNP bioactivos y las sustancias acompañantes pueden concentrarse mediante ultrafiltración o diálisis de deshidratación con una membrana de límite de exclusión de 500 Da o mediante liofilización. Para ello, puede usarse también una filtración por tamiz molecular modificada de modo habitual mediante la elección de la correspondiente fase móvil. En la filtración por tamiz molecular, se añade preferiblemente a la solución de sustancia sulfato de amonio aproximadamente 0,4 mol/l. En contraposición con concentraciones mayores, el sulfato de amonio tiene a esta concentración un fuerte efecto de disolución salina frente a las proteínas. Mediante estas medidas, se mantienen por consiguiente las proteínas en solución durante la filtración por tamiz molecular. Además, el sulfato de amonio reduce el crecimiento bacteriano e inhibe enzimas conocidas. Por ello, contribuye a la estabilización de los RNP bioactivos, ante todo cuando la cromatografía se lleva a cabo a altas temperaturas (por encima de aproximadamente 20ºC) y en condiciones no estériles.

Las condiciones de temperatura y pH no son especialmente críticas en la realización de las etapas de purificación. Cuando se pretende mantener la conformación nativa de las sustancias, se recomienda la observación de una temperatura en el intervalo de aproximadamente 0 a 8ºC, preferiblemente aproximadamente 0 a 4ºC. Además, las etapas de separación y purificación deben llevarse a cabo en condiciones de pH y sal esencialmente fisiológicas. Una ventaja esencial del procedimiento según la invención consiste en que la observación de estas condiciones es por primera vez fácil. Para la reducción de la oxidación, se mezcla la solución de sustancia preferiblemente además con cisteína aproximadamente 0,001 mol/l.

Los RNP bioactivos obtenidos pueden mantenerse en una solución salina fisiológica tamponada, por ejemplo en solución de fosfato de sodio y potasio 0,0015 mol/l que contiene NaCl 0,15 mol/l (0,9%) y cisteína 0,001 mol/l y presenta un valor de pH de 7,4, después de esterilización por filtración habitual (0,2 \mum de amplitud de poro) nativos y biológicamente activos también a temperatura ambiente (durante al menos 200 horas) o congelados a –25ºC (durante al menos 5 años). Esta estabilidad de los RNP bioactivos puede considerarse entre otras cosas uno de los criterios para su estado de alta pureza.

Los RNP según la invención pueden prepararse también usando secuencias parciales sintetizadas química o biológicamente o partes y secuencias homólogas de las mismas. Se prefiere utilizar las secuencias oligonucleotídicas o nucleotídicas sin sentido sintetizadas química o biológicamente in vivo o in vitro que codifican las secuencias dadas según la reivindicación 1 con al menos 6 bases en la reacción PCR, o utilizar la técnica de bioprocesamiento sin sentido.

Los ejemplos ilustran la invención. En los ejemplos se describe la obtención de los morfógenos RNP a partir de leucocitos de sangre porcina. Sin embargo, la invención no está limitada a esta forma de realización. Pueden usarse también células del sistema reticuloendotelial o tejidos inflamatorios, lesionados o líquidos (exudados) de otros mamíferos.

La presente invención se refiere además al uso de los RNP descritos anteriormente para la provisión de fármacos. Estos fármacos contienen eventualmente además un vehículo farmacéuticamente compatible. Los vehículos adecuados y la formulación de dichos fármacos son conocidos por el experto. Se cuentan entre los vehículos adecuados, por ejemplo, soluciones de sal común tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, por ejemplo emulsiones de aceite/agua, reticulantes, soluciones estériles, etc. La administración del fármaco puede realizarse por vía oral o parenteral. Pertenecen a los procedimientos para administración parenteral la administración tópica, intraarterial (por ejemplo directa al tumor), intramuscular, subcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal o intranasal. La dosificación adecuada se determina por el médico a cargo y depende de distintos factores, por ejemplo, la edad, el sexo, el peso del paciente, el tipo de administración, etc. En una forma de realización preferida, los RNP según la invención pueden administrarse individualmente o en forma de mezclas por vía local a mamíferos, por ejemplo personas, a una cantidad de > 1 fmol. La dosis umbral de efecto in vivo asciende a > 50 fmol, preferiblemente 2,5 fmol. Estos fármacos son adecuados para una influencia específica de la angiomorfogénesis y del estado vascular de un tejido de un cuerpo de un mamífero. Estos fármacos pueden contener para satisfacer los mismos cometidos también al menos una inmunoglobulina anti-RNP y/o estructuras equivalentes de biología molecular. Preferiblemente, se usa el fármaco generado para una influencia funcional de la angiogénesis.

Claims (3)

1. Ribonucleoproteínas que contienen metal que contienen una proteína de la familia de las proteínas S100, un ARN y cobre como ión metálico en forma de un complejo ternario, caracterizadas porque el ARN del complejo ternario presenta las siguientes secuencias:

3

2. Procedimiento para la preparación de una ribonucleoproteína que contiene metal según la reivindicación 1, caracterizado porque se homogeneizan leucocitos o tejidos inflamatorios o se cultivan leucocitos y se obtienen los RNP generados a partir de los homogeneizados o a partir de los sobrenadantes de la solución de cultivo mediante procedimientos estándar.

3. Uso de las ribonucleoproteínas según la reivindicación 1 para la preparación de un fármaco para la influencia específica de la angiogénesis.