JPS6191129A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 童ス」の利用」ピ艷 この発明は、抗腫瘍剤に関し、更に詳しくは。

腫瘍壊死因子（以下ｒＴＮＦＪと記す）を含有する抗腫
瘍剤に関する。

貨】欽ｌ支権 ＴＮＦは動物正常細胞には壊死作用を示すことなく腫瘍
細胞のみを壊死又は死滅せしめる作用を有する。従って
、抗腫瘍剤として使用すべく研究されてきた。しかしな
がら従来、ＴＮＦ蛋白はある程度精製はされていたが、
抗腫瘍剤として使用するに耐えられる純度のＴＮＦ蛋白
は得られていなかった。ましてや、ＴＮＦを抗腫瘍剤と
して使用する際には、その物が化学的に特定できていな
ければならないが、その物を化学的に特定できる迄には
精製されていなかった。加えて、従来、腫瘍壊死作用を
有する蛋白の存在は知られていたが、その蛋白は一種類
のみか、あるいは多種の蛋白があるのかさえも知られて
いなかった。更に加えて従来知られていたウサギ由来の
ＴＮＦは、分子量４０〜５０ｋｄ　（Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎ
ｃｅｒ、４０゜５３４〜５３９．１９７９）あるいは６
８〜５２ｋｄ　（Ｊ、Ｉｍｍｎｏｌ、１２５．１６７１
〜１６７７．１９８０）であり、比較的分子量の大きな
ものであった。

方朋Ｊ」騰−しようとするｌ。

従って本発明の目的は、物として特定でき、かつ抗腫瘍
剤として使用できるような高度に精製された７１’ＮＦ
蛋白を得、これによってＴＮＦを抗腫瘍剤として使用で
きるようにすることにある。

問題点を解決するための手段 成上の問題点を解決するため、本発明者らは鋭意研究の
結果、ＴＮＦ蛋白を化学的に特定し、かつ高度に精製す
ることによって、抗腫瘍剤として使用できるＴＮＦ標品
を得ることに成功した。

即ち、この発明は以下の内容を骨子とするものである。

マウス線維芽細胞を標的細胞とした時の細胞壊死比活性
が２Ｘ１０７単位／ｍｇ−ｍ白以上であり、かつ腫ｆｆ
５１ｙ、ＡＪ死囚子蛋白が分子中に下記のアミノ酸配列
を有し、かつ分子量が１８ｋｄである腫瘍壊死蛋白を含
有する抗腫瘍剤。

Ｓｃｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｖａｌ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ−）！１
ｓ−Ｔｒｙ−Ｇｉｎ 但しＸはＣｙ　ｓ　Ｈ又は糖を有するアミノ酸ＴＮＦは
以下のように製造することができる。

即ち、ウサギ、サル、ヒツジ、マウス、ラット、モルモ
ット、ウシ、ヤギ、イヌ等の哺乳動物の血管内、通常は
静脈内にマクロファージ賦活剤を投与する。投与方法は
、使用するマクロファージ賦活剤により異なるが、要は
血清中のＴＮＦ活性が最も高くなるように適宜予め定め
ておけばよい。

マクロファージ賦活剤としては、生体内においてマクロ
ファージに作用してマクロファージの異物諏別作用又は
貧食作用等のマクロファージの作用が賦活されるような
ものをいう。このような賦活作用の有無は、マクロファ
ージ賦活剤を投与した哺乳動物よりマクロファージを分
離して、生体外にてマクロファージの活性を調べること
により知ることができる。

マクロファージ賦活剤の具体例としては、リポポリサッ
カライド、ＢＣＧ、インターフェロンで、レンチナン、
ザイモザン、リピドＡ、ポリ−■。

Ｃ等がある。

このようにして感作された哺乳動物より、ＴＮｌ？は、
その分子量、溶屏度、電荷、特異的吸着能等を利用して
分Ｈ，精製することができる１例えば、透析、ゲルクロ
マトグラフィー、塩析、極性有機溶媒による沈澱及び電
気泳動、アフィニティークロマ！−グラフィー等を適宜
組み合せることによりｆ１７製する。より具体的には次
のような方法がある。

ｎ１ｌｉ乳動物から得られた血清を１００％飽和度の硫
安溶液を最終的に６０％となるように血清中に添加して
Ｔ　Ｎ　Ｆを沈澱させる。この沈澱をリン酸ｉυ！’７
　ｔｅｉで７容解し、Ｄ　ＩミＡＥセファデックスの陰
イオン交換プロマトグラフィーにかけ、低塩；負度がら
、：゛６塩濃度のり衝液でＴＮＦを溶７１−させる。こ
れ１？Ｉの１１１出液のうちＴ　Ｎ　ｒ−”の活性のあ
る部分をセフアリルＳ−２００のゲル濾過にかける。こ
のゲル濾過操作を２回（り返し、もう一度、陰イオン交
換クロマ１−グラフィーにかける。このようにして得ら
扛だサンプルからブルーセファロース−６３の特異的ク
ロマトグラフィーによりアルブミンをとり除き精製”１
’　Ｎ　Ｆとする。

得られたＴＮＦ蛋白の化学的及び生物学的性質は以下の
とおりである。

（，１）得られたＴＮＦ蛋白標品は、５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法（ｐＨ８，３）により１８ｋ
ｄであるが、「セファクリル３−２００Ｊによるゲル濾
過法では３４ｋｄである。

（ｂ）Ｎ−末端部分のアミノ酸配列は以下のとおりであ
る。

（Ｉｌｉｓ）−３ｅｒ”Ｈｉｓ−Ｖａｌ　　Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｘ−Ｖａ　ｌ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｑｌｙ
−Ａｒｇｌ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｒ但しＸはＣｙ　ｇ　
Ｈ又は糖を有するアミノ酸である。又Ｎ−末端のＨｉｓ
は確認していない。

（ｃ）ｉ”ＮＦはｒ−−９２９２４１１胞を特異的に壊
死せしめる。またＭ　Ｈ１３４腫疫細胞を腹部皮内に移
植されたＣ　３　Ｈ／　Ｈｅマウスに対し、延命効果を
示す。

（ｆ）熱安定イ′ｌ　：　５６°Ｃ，３０分安定、７０
℃、２０′ｌｒ、５０％失活、１００°Ｃ，２分、１０
０％失Ｉ舌、 （ｅ、）ノ・ｒラミニダーゼ、ヒアルダーゼ及びトリプ
シンに対して安定。

１’　Ｎ　Ｆけ以下のように定性及び定歌分析できる。

即ち、標的細胞であるＬ−９２９ＫＭ胞（Ｐｒｏｃ。

Ｎ；＋　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７
２゜３６６６−３６７０）をイーグルミニマムエソセン
ンヤルｈ′ｒ地（以下Ｍ　ＴＥ　Ｍと記す）に５％仔牛
脂児血清を加え育成し、８ＸＩＯａ！胞が１００−１の
同上培地に含まれる様にし、９６六の平底プレートに育
種する。育種条件は３７℃、２時間５％Ｃ０２１００％
ト■２０で通常細胞培養に用いられる方法でよい。その
後アクチノマイシンＤを培地中に終濃度１．−ｇ／ｍｌ
となる様に加え、培養液の液量を１５０、−１とする。

即座にｈ−ＴＮ　Ｆを含むと考えられる検体を適当にＭ
ＥＭ培地で稀釈したものを５０Ｐｌ加える。この際稀釈
率を適宜７Ｂ製し、ＥＤ５０を求める事ができる。更に
最終液量２００　、、　ｌとなったＬ９２９剛胞を上記
条件で１８ｈｒ培養を継続する。細胞壊死活性は、まず
全培地を除去し、ここに０．２％クリスタルバイオレッ
トを含む２％メチルアルコール溶液を加え固定染色する
。クリスタルバイオレットは全有核細胞を染色するので
、ｈ　−ＴＮ　Ｆにより特異的に細胞壊死を生じた結果
フラスコ底面より遊歴した細胞は染色されないのでｈ−
ＴＮ　Ｆ活性を直接に測定できる。この染色度を○Ｄ５
９０ｎｍの吸収でｉｌｌ！ｌ定し、対照群に対する染色
度と比１１２する事でｈ　−Ｔ　Ｎ　Ｆを測定する。活
性の定義は次の様に行う。Ｌ９２９細胞が５０％生存で
きる検体原液の稀釈率をＸとした時、その稀釈率の逆数
に１０−３を乗じた値を原液の１ｍｌあたりの活性とす
る。即ち原液の１０００分の１稀釈でＥＤ５０を与える
検体の活性は１単位／　ｍ　ｌである。

鼓盤 （］）ＴＮＦの単離、精製 日本白色家兎（体重２．５ないし３．０ｋｇ）１０羽に
１８ｍｇ／羽のＢＣＧ　（日本ＢＣＧ（株）、凍結乾燥
品〕を静脈投与し、２週間後８０オ、　ｇ　７羽のＥ、
ｃｏｌｉ０１２７のりポボリサツカライド（Ｄｉｆｃｏ
　　Ｌａｂ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｂ８）を静脈投与し、２
時間後、全血を採取した。得ら第１た４００ｍ１の全血
清に６００ｍ１の硫安飽和溶液を添加し、ｐＨ７，０，
４℃にて一夜ゆっくり撹拌した。生じた沈澱を１２０　
ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌを含む５０ｍＭリン酸ｆｔ　ＦＷ
液（ｐ　Ｈ７、０）　　２０　ｍｌにけん濁し、４℃に
て一夜１２０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１を含む５０ｍＭリ
ン酸緩衝液に対し透析を行った。

透析内液を予め１２０ｍＭＮａＣ１を含む５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて平衡にしたｒＤＥΔ１号セ
ファデックス」に負荷して、蛋白画分を吸着せしめ、１
２０〜４００ｍＭＮａＣ１にて濃度勾配溶出を行い、２
５０〜３５０ｍＭのＮａ　ＣＩにて溶出された両分を採
取した。溶出液を限外濾過膜〔東洋化学（株）、セルロ
ースフィルター、ＭＷ１万以下通過〕を用いてｌｏｍ１
程度に迄濃縮し、濃縮液を１２０ｍＭ　　ＮａＣ１を含
む５０ｍＭリン酸緩衝液にて平衡にした［セファクリル
Ｓ−２００Ｊ　　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＮＪ）カラム
に負荷し、分子量３０〜４０．ｋｄの両分を採取した。

溶出液を限外濾過〔濾過膜、東洋化学（株）、セルロー
スフィルター、ＭＷ１万以下通過〕にて濃縮し、濃縮液
を「セファクリルＳ−２００」を用いて、ゲル濾過を行
った。溶出液を更にＤＥＡＥ−セファデックスカラムを
用い、２００〜３５０ｍＭＮａＣ１にて濃度勾配溶出を
行った。溶出液（２５０〜３５０ｍＭ）よりアルブミン
を除くため、゛予め１００ｍＭ　　ＫＣＩを含む５”　
　ＯｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，０）に
て平衡化した「セファロース−６ＢＪカラムによるプロ
マトグラフィーを行い、溶出液を乾燥して、比活性２Ｘ
ＩＯ７単位／ｍｇのＴＮＦ蛋白４５０．。

ｇを得た。

精製の間のＴＮＦ蛋白の比活性及び回収率を第１表に示
す。

第　　１　　表 ＊：１０３単位／　ｍ　ｇ−蛋白 （２）ＴＮＦ＄ｉ’Ｊ製蛋白の性質 得られたＴＮＦ蛋白は「セファクリルＳ−２００」によ
るゲル濾過により３４ｋｄであり、また５ＤＳ−ポリア
クリルゲル電気泳動による分子量は１８ｋｄであった。

”Ｉ’　Ｎ　Ｆ蛋白のアミノ酸配列を決定するために６
・−ｇのＴＮＦをプロティン・セクエンサー（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　　Ｃｏ、。

Ｃａ１ｆ、Ｍｏｄｅｌ　　４７０Ａ）に導入した。

アミノ酸配列の決定方法は　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、
　、　１９３．２６５　２７５　（１９５１）に記載さ
れ、ている方法により行なった。

実施例２ （１）ＴＮＦの単独使用による生理作用Ｃ３Ｈ／　ｌ−
１ｅマウス腹部皮肉にＭＨ１３４１１１瘍細胞を２Ｘ１
０’細胞数移植し、移植後４日で腫瘍が一定の大きさに
生着したものを無差別に部分けし、４，７．１０日の日
程で、実施例１において得られた精製きれたＴＮＦを１
１０単位ずつ腫瘍内に投与した。２〜３日おきに腫瘍の
大きさを測定した。腫瘍の大きさは、腫瘍の最大長ｍと
最小長ｎの対数平均で表わした。又、対照群には、ＴＮ
Ｆと同様な日程で生理食塩液を投与した。

Ｍｌ１１３４腫ｆＭ細胞：Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス由来１］
Ｆ癌で腹水増殖可能にした腫瘍で、６〜８日の間隔で継
代したものを用いた。

Ｃ３Ｈ／ｌｌｃマウス：通交系マウスで８週令のものを
用いた。

ＴＮＦ：部分精製して比活性が３００〜２０００倍上昇
したサンプルを用いた。

その結果、対照群においては、腫瘍移植日から２２日に
至るまで腫瘍が増殖をつづけ、２２日目における腫瘍の
大きさは１８ｍｍに達し、最終的には全て死亡した。一
方、ＴＮＦ投与群においては腫瘍移植後７日から１０日
にかけて著明な腫瘍の退縮が見られ、最終的には完全治
癒マウスも出た。このことより、大量の１１０単位のＴ
ＮＦは単独でも強い抗腫瘍効果を持つことが示された。

ちなみにｒ、ｐｓ（リポポリサッカライド）の単独での
最大効果は、この実験系において１８日目で腫瘍径にし
て１０ｍｍ前後であった。

（２）ＴＮＦの併用効果 シイタケ由来の多糖、レンチナン（Ｌｅｎｔｉｎａｎ）
と併用制癌効果を持つが、検討を行なった。

Ｍ　Ｈ１３４ｆｌｉｆＩＩｉｌｌ胞を２Ｘ１０５細胞数
、Ｃ３１−１／　Ｈｅマウス腹部皮肉に移植後、（１）
と同様に４．７．１０日目にＴＮＦを２．５単位ずつ腫
瘍内に投与した。レンチナンは６．２５ｍｇ／ｋｇを腹
腔内に１２日、１４日目に投与した。抗腫瘍効果の判定
は（１）と同様に２２日における腫瘍径と延命日数によ
った。

又、Ｍｌ（１３４と異なる腫瘍であるルイス肺癌（３Ｌ
　Ｌ）に対する効果も調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウス腹
部皮内に３’ＬＬを３Ｘ１０５細胞数移植して、ＴＮＦ
を５単位ずつ４，７，１０．１２゜１４１」に投与した
。レンチナンは６．２５ｍｇ／ｋｇを腹腔内に６．８，
１０，１２．１４日目に投与した。抗ＩＩＩ！瘍効果は
ＭＨ１３４と同様な方法で判定した。

ＭＨＩ３４１１１！瘍細胞＝　（１）と同様。

ルイス肺癌（３ＬＬ）：マウス肺癌で２週問おきに継代
して用いた。

Ｃ３Ｈ／　Ｈｅマウス：　（１）と同様。

Ｃ３Ｈ／　Ｈｅマウス：通交系マウスで８週令のものを
用いた。

レンチナン：シイタケ由来のβｌ−３結合を主鎖とする
グルカンである。味の素株式 会社より供与された。

結果は第２表に示すように、レンチナン単独投与群やＴ
ＮＦ単独投与群においては、２２日において対照群との
間に差は認められなかった。一方、ＴＮＦとレンチナン
の併用群においては、腫瘍移植後２２日１において、対
照群のみならず、ＴＮＦ甲、独群やレンチナン単独群と
の間でも、腫瘍の大きさにおいて有意な差が認められ、
ＴＮＦとレンチナンの併用が、有効な制癌効果を持つこ
とが示された。

第２表において、腫瘍大きさは腫瘍移植後２２日におけ
るものであり、延命日数増加率は対照群の生存日数を１
００としたときの治療群の延命日数を％で示したもので
ある。

第　　２　　表

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）マウス線維芽細胞を標的細胞とした時の細胞壊死
   比活性が２×１０＾７単位／ｍｇ−蛋白以上であり、か
   つ腫瘍壊死因子蛋白が分子中に下記のアミノ酸配列を有
   し、かつ分子量が１８ｋｄである腫瘍壊死蛋白を含有す
   る抗腫瘍剤。 【アミノ酸配列があります】 但しＸはＣｙｓＨ又は糖を有するアミノ酸