ES2267287T3 - Tratamiento de la adiccion a la nicotiona y comportamiento relacionado con la adicion. - Google Patents

Abstract

Uso de gamma-vinil-GABA (GVG) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un enantiómero o una mezcla racémica del mismo, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que padece de adicción a la nicotina, administrando una cantidad eficaz del medicamento al mamífero, en que la cantidad eficaz es suficiente para disminuir, inhibir o eliminar un comportamiento asociado con las ansias o el uso de nicotina.

Description

Tratamiento de la adicción a la nicotina y comportamiento relacionado con la adicción.

Esta invención se hizo con apoyo gubernamental bajo contrato con el Departamento de Energía de los EE.UU., Oficina de Investigación Biológica y Medioambiental (USDOE/OBER DE-AC02-98CH10886), por las entidades National Institutes of Mental Health (NIMH MH49165 y NIMH R2955155) y National Institute of Drug Abuse (Y1-DA7047-01). El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere al uso de un inhibidor irreversible de GABA-transaminasa para el tratamiento de la adicción a sustancias y la modificación del comportamiento asociado con la adicción a sustancias. La adicción a sustancias, como el abuso de drogas, y el comportamiento relacionado con la adicción a sustancias resultante, son enormes problemas sociales y económicos que continúan en crecimiento con consecuencias desastrosas.

La adicción a sustancias se puede producir mediante el uso de sustancias legales e ilegales. La nicotina, cocaína, anfetamina, metanfetamina, etanol, heroína, morfina y otras sustancias adictivas están fácilmente disponibles y son rutinariamente usadas por amplios sectores de la población de los Estados Unidos.

Muchas drogas de abuso se producen de forma natural. Por ejemplo, la cocaína es un estimulante de nonanfetamina que se produce de forma natural derivado de las hojas de la planta de la coca, Erythroylon coca. Las hojas de coca contienen solo aproximadamente la mitad de uno por ciento del alcaloide de la cocaína puro. Cuando son masticadas, solo son liberadas cantidades relativamente pequeñas de cocaína, y la absorción gastrointestinal es lenta. Ciertamente, esto explica el motivo por el que masticar hojas de coca no ha sido nunca un problema sanitario en Hispanoamérica. La situación cambia radicalmente con el abuso del alcaloide en sí mismo.

Se ha encontrado que las drogas de adicción como la nicotina, cocaína, anfetamina, metanfetamina, etanol, heroína y morfina aumentan (en algunos casos directamente, en otros casos indirectamente o incluso trans-sinápticamente) la dopamina (DA) en el circuito de satisfacción/refuerzo mesotelencefálico del cerebro anterior, produciendo presumiblemente la satisfacción aumentada al cerebro que constituye la "subida" de droga del usuario. Las alteraciones en la función de estos sistemas de DA han estado implicadas también en el ansia de drogas y en la recaída en el hábito del consumo de drogas en adictos en recuperación. Por ejemplo, la cocaína actúa sobre estos sistemas de DA uniéndose al transportador de dopamina (DAT) y previniendo la reabsorción de DA en el terminal presináptico.

Hay una evidencia considerable de que la nicotina, cocaína, anfetamina, metanfetamina, etanol, heroína, morfina y otras propensiones adictivas al abuso de drogas están asociadas al bloqueo de la reabsorción en las trayectorias de satisfacción/refuerzo del sistema nervioso central (CNS). Por ejemplo, los aumentos inducidos por cocaína de DA extracelular han estado asociados con sus efectos de satisfacción y ansia en roedores. En seres humanos, el perfil de unión farmacocinético de C^{11}-cocaína indica que la absorción de cocaína marcada está directamente correlacionada con la "subida" auto-informada. Además, los adictos humanos a cocaína expuestos a señales ambientales asociadas a la cocaína experimentaron una satisfacción aumentada de cocaína que está antagonizada por el antagonista receptor de DA haloperidol. Basándose en la conexión presumible entre la propensión aditiva de la cocaína y el circuito de satisfacción/refuerzo de DA del cerebro anterior, han sido propuestas muchas estrategias farmacológicas para tratar la adicción a la cocaína.

En el pasado, una estrategia de tratamiento era dirigir a diana directamente el DAT con un análogo de cocaína de afinidad elevada, bloqueando así la unión de la cocaína. Otra estrategia de tratamiento era modular la DA sináptica directamente mediante el uso de agonistas o antagonistas de DA. Todavía, otra estrategia de tratamiento era modular DA sináptica, indirectamente o trans-sinápticamente, dirigiendo a diana específicamente un sistema neurotransmisor funcionalmente asociado pero bioquímicamente diferente.

Un cierto número de drogas ha sido sugerido para ser usado en la retirada de los usuarios de cocaína de su dependencia. Ciertos agentes terapéuticos se vieron favorecidos por la "hipótesis del agotamiento de dopamina". Está bien establecido que la cocaína bloquea la reabsorción de dopamina, aumentando agudamente las concentraciones de dopamina sináptica. Sin embargo, en presencia de cocaína, la dopamina sináptica es metabolizada como una 3-metoxitiramina y es excretada. La pérdida sináptica de dopamina plantea demandas sobre el cuero de una síntesis aumentada de dopamina, como se pone de manifiesto por el aumento de la actividad de tirosina hidroxilasa después de la administración de cocaína. Cuando los suministros de precursor se agotan, se desarrolla una deficiencia de dopamina. Esta hipótesis condujo al ensayo de bromocriptina, un agonista de receptor de dopamina. Otra aproximación era la administración de amantadina, un liberador de dopamina. Todavía, otra aproximación, también basada en la hipótesis del agotamiento de dopamina, era proporcionar un precursor para dopamina, como L-dopa.

Los agonistas no son agentes terapéuticos preferidos. Un agonista dado puede actuar sobre diversos receptores, o receptores similares en células diferentes, no justo sobre el receptor particular o célula que se desea estimular. A medida que se desarrolla la tolerancia a una droga (a través de cambios en el número de receptores y su afinidad por la droga), se puede desarrollar análogamente la tolerancia al agonista. Un problema particular con la bromocriptina agonista, por ejemplo, es que puede crear en sí una dependencia de drogas. Por tanto, las estrategias de tratamiento usadas en el pasado no aliviaron en ansia del paciente por la cocaína. Además de ello, usando ciertos agonistas como bromocriptina, un paciente era propenso a sustituir un ansia por otra.

Otra droga de la que se abusa frecuentemente es la nicotina. El alcaloide (-)-nicotina está presente en los cigarrillos y otros productos de tabaco que son fumados o masticados. Se ha encontrado que la nicotina contribuye a diversas enfermedades, incluido el cáncer, enfermedad cardiaca, enfermedad respiratoria y otros estados, para los que el uso del tabaco es un factor de riesgo, particularmente la enfermedad cardiaca.

Han tenido lugar enérgicas campañas contra el uso del tabaco o la nicotina, y actualmente es de conocimiento común que el cese del uso del tabaco acarrea numerosos síntomas de retirada desagradables, que incluyen irritabilidad, ansiedad, agitación, falta de concentración, aturdimiento, insomnio, temblores, hambre aumentada y ganancia de peso y, naturalmente, un ansia intensa de tabaco.

La propensión adictiva de la nicotina ha estado asociada a acciones de satisfacción/refuerzo y a sus efectos sobre neuronas de DA en las trayectorias de satisfacción del cerebro (Nisell et al., 1995; Pontieri, et al., 1996). Por ejemplo, la administración sistémica agua de nicotina, así como de otras numerosas drogas de abuso, produce un aumento de los niveles de DA extracelulares en el nucleus accumbens (NACC), un componente importante del sistema de satisfacción (Damsma et al., 1989; Di Chiara y Imperato, 1988; Imperato et al., 1986; Nisell et al., 1994a, 1995; Pontieri et al., 1996). Análogamente, la infusión de nicotina en la zona segmental ventral (VTA) del roedor produce un aumento significativo de los niveles de DA en el NACC (Nisell et al., 1994b).

Se ha descrito que unos pocos agentes farmacéuticos son útiles para tratar la dependencia de la nicotina, incluida la terapia de sustitución de la nicotina como goma de nicotina, parches transdérmicos de nicotina, pulverizaciones nasales, inhaladores de nicotina y bupropion, el primer tratamiento no nicotínico para el abandono del tabaco (Henningfield, 1995; Hurt et al., 1997).

Desgraciadamente, la terapia de sustitución de la nicotina incluye la administración de la nicotina que frecuentemente conduce a la retirada de la nicotina y una posterior recaída en el uso de productos del tabaco. Por tanto, hay una necesidad de una terapia que tenga un perfil deseable de efectos secundarios, para aliviar los síntomas de retirada de la nicotina, incluida el ansia a largo plazo por la nicotina.

Otras sustancias adictivas bien conocidas son los analgésicos narcóticos como la morfina, heroína y otros opiáceos tanto naturales como semisintéticos. El abuso de opiáceos induce tolerancia y dependencia. Los síntomas de retirada para el abandono de los opiáceos varían considerablemente dependiendo de numerosos factores que incluyen la dosis de opiáceo usada, el grado en que los efectos del opiáceo sobre el CNS (sistema nervioso central) son ejercidos de forma continua, la duración del uso crónico y la velocidad a la que el opiáceo se retira de los receptores. Estos síntomas de retirada incluyen ansias, ansiedad, disforia, casmodia, transpiración, lagrimeo, taponamiento nasal, agitación y sueño interrumpido, irritabilidad, pupilas dilatadas, dolor de huesos, espalda y músculos, piloerección, carnes calientes y frías, náuseas, vómitos, diarrea, pérdida de peso, fiebre, presión sanguínea, pulso y ritmo respiratorio aumentados, agarrotamiento muscular y movimientos compulsivos de las extremidades inferiores.

Las complicaciones médicas asociadas con la inyección de opiáceos incluyen una diversidad de cambios patológico en el CNS que incluyen cambios degenerativos en globus pallidus, necrosis de la materia gris espinal, mielitis transversal, ambliopía, plexitis, neuropatía periférica, síndromes parkinsonianos, impedimento intelectual, cambios de la personalidad y cambios patológicos en músculos y nervios periféricos. Las infecciones de la piel y órganos sistémicos son también bastante comunes, incluida la neumonitis estafilocócica, tuberculosis, endocarditis, septicemia, hepatitis viral, virus de inmunodeficiencia humano (HIV), malaria, tétanos y osteomielitis. Las expectativas de vida de los adictos a opiáceos son considerablemente reducidas, debido a la sobredosis, infecciones relacionadas con drogas, suicidio y homicidio.

Los agentes farmacéuticos usados para tratar la dependencia de opiáceos incluyen metadona, que es un opiáceo, y antagonistas de opiáceos, principalmente naloxona y naltrexona. La clonidina se ha mostrado que suprime algunos elementos de la retirada de opiáceos, pero adolece de los efectos de hipotensión y sedación, que pueden ser bastante extremos. El tratamiento y el ejercicio psicológico de modificación del comportamiento son frecuentemente una terapia auxiliar usada en asociación con los agentes farmacéuticos. Hay una necesidad de una terapia que tenga un perfil más deseable de efectos secundarios, para aliviar la adicción y los síntomas de retirada de los opiáceos.

El etanol es probablemente el depresor más frecuentemente usado y abusado en la mayoría de las culturas y una causa principal de morbididad y mortalidad. La ingestión repetida de grandes cantidades de etanol puede afectar a casi todos los sistemas de órganos en el cuerpo, particularmente el tracto gastrointestinal, sistema cardiovascular y los sistemas nerviosos central y periférico. Los efectos gastrointestinales incluyen gastritis, úlceras de estómago, úlceras duodenales, cirrosis hepática y pancreatitis. Además, hay una tasa aumentada de cáncer de esófago, estómago y otras partes del tracto gastrointestinal. Los efectos cardiovasculares incluyen hipertensión, cardiomiopatía y otras miopatías, niveles significativamente elevados de triglicéridos y colesterol de lipoproteínas de baja densidad. Estos efectos cardiovasculares contribuyen a un aumento considerable del riesgo de enfermedad cardiaca. La neuropatía periférica puede estar presente, como se pone de manifiesto por la debilidad muscular, paratesias y sensación periférica disminuida. Los efectos sobre el sistema nervioso central incluyen déficits cognitivos, dificultades graves de memoria, cambios degenerativos en el cerebelo y trastorno amnésico persistente inducido por el etanol en el que la capacidad de codificar una nueva memoria está gravemente dificultada. Generalmente, estos efectos están relacionados con deficiencias de vitaminas, particularmente las vitaminas B.

Los individuos con dependencia o adicción al etanol exhiben síntomas y cambios físicos que incluyen dispepsia, náuseas, hinchamiento, varices en el esófago, hemorroides, temblores, inestabilidad al caminar, insomnio, disfunción eréctil, tamaño testicular reducido, efectos feminizantes asociados con niveles reducidos de testosterona, absorción espontánea y síndrome de alcohol fetal. Los síntomas asociados con el cese o retirada del consumo de etanol incluyen náuseas, vómitos, gastritis, hematemesis, sequedad de boca, complexión pustulosa hinchada y edema periférico.

El tratamiento generalmente aceptado para la adicción y la retirada del etanol se realiza administrando un tranquilizante suave como clorodiazepóxido. Normalmente, son administradas también vitaminas, particularmente las vitaminas B. Opcionalmente, son administrados también sulfato de magnesio y/o glucosa. Las náuseas, vómitos y diarrea son tratados sintomáticamente a discreción del facultativo encargado. Puede ser administrado también disulfiram para ayudar a mantener la abstinencia. Si es consumido etanol mientras se toma disulfiram, se acumula acetaldehído, produciendo náuseas e hipotensión. Hay una necesidad de una terapia que tenga un perfil más deseable de efectos secundarios, para aliviar los síntomas de adicción y retirada del etanol.

Recientemente, se ha informado que el abuso de poli-drogas o drogas de combinación ha aumentado a una velocidad alarmante. Por ejemplo, se da a menudo un abuso de cocaína y heroína en una combinación de drogas conocida como "speedballing". Este aumento informado se cree que es una consecuencia de un efecto sinérgico que aumenta la euforia del usuario.

Consecuentemente, hay todavía una necesidad de tratamiento de la adicción a drogas de abuso para proporcionar nuevos métodos que puedan aliviar el ansia de un paciente cambiando las acciones farmacológicas de las drogas de abuso en el sistema nervioso central. Hay también una necesidad de proporcionar nuevos métodos para tratar el abuso de drogas de combinación.

Sumario de la presente invención

La presente invención se refiere al uso de gamma-vinil-GABA (GVG) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un enantiómero o una mezcla racémica del mismo, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que padece de adicción a la nicotina administrando una cantidad eficaz del medicamento al mamífero, en que la cantidad eficaz es suficiente para disminuir, inhibir o eliminar el comportamiento asociado con el ansia o uso de la nicotina.

La presente invención, como se describió anteriormente, que aborda las necesidades de la técnica anterior, describe métodos para tratar la adicción a la nicotina y cambiar el comportamiento relacionado con la adicción de un mamífero, por ejemplo un primate, que padece de adicción a sustancias, administrando al mamífero una cantidad eficaz de una composición farmacéutica o medicamento que incluye gamma-vinil-GABA (GVG). La cantidad de GVG varía desde aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 100 mg/kg a aproxi-
madamente 600 mg/kg y, lo más preferentemente, de aproximadamente 150 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg.

En una realización preferida, la presente invención describe un método para eliminar los efectos de la adicción a la nicotina tratando un mamífero con una cantidad eficaz de una composición o medicamento que incluye GVG. Cuando se están tratando los efectos de la adicción a la nicotina, la cantidad de GVG presente en la composición farmacéutica o medicamento es de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 2 g/kg. Preferentemente, 75 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg y, lo más preferentemente, de aproximadamente 18 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg.

Todavía, en otra realización, la presente invención describe un método para cambiar el comportamiento relacionado con la adicción de un mamífero que padece de adicción a la nicotina, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de GVG o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en que la cantidad eficaz atenúa los efectos de satisfacción/incentivo de la nicotina y, opcionalmente, de una o más drogas de abuso seleccionadas entre el grupo que consiste en psicoestimulantes, analgésicos narcóticos, alcoholes y sus combinaciones en ausencia de efectos que alteren la satisfacción/incentivo de los alimentos en dicho mamífero.

La cantidad de GVG varía de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 2 g/kg, preferentemente de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 600 mg/kg y lo más preferentemente de aproximadamente 150 mg a aproximadamente 600 mg/kg.

Como consecuencia de la presente invención, se describen métodos para reducir la adicción de sustancias y cambiar el comportamiento relacionado con la adicción que están basados en una composición farmacéutica o medicamento que no es adictivo en sí, aunque es altamente eficaz para mejorar la adicción del comportamiento adictivo de pacientes adictos. La composición farmacéutica o medicamento útil para el método de la presente invención inhibe o elimina el ansia experimentada por los adictos a drogas para el uso de la droga de abuso. Además de ello, la eliminación del comportamiento asociado con las drogas de abuso se produce en ausencia de una respuesta adversa o apetitiva para GVG. Además de ello, las características de comportamiento asociadas con la dependencia de drogas de abuso son reducidas o eliminadas en ausencia de una alteración en la función locomotora del primate.

Todavía, en otra realización, la invención describe un método para cambiar el comportamiento relacionado con la adicción de un mamífero que padece de adicción a la nicotina, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de GVG o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un enantiómero o una mezcla racémica del mismo, en que la cantidad eficaz es suficiente para disminuir, inhibir o eliminar el comportamiento asociado con un ansia o uso de nicotina.

En otra realización ilustrativa de la presente invención, el método describe cambiar el comportamiento relacionado con la adicción de un mamífero que padece de adicción a la nicotina, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición o medicamento que aumente los niveles de GABA del sistema nervioso central, en que la cantidad eficaz es suficiente para disminuir, inhibir o eliminar el comportamiento asociado con el ansia o el uso de drogas de abuso.

En otra realización, la presente invención describe un método para prevenir la adicción a la nicotina, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de GVG o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un enantiómero o una mezcla racémica del mismo.

Todavía, en otra realización, la presente invención describe un método para prevenir la adicción a la nicotina que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de GVG o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un enantiómero o mezcla racémica del mismo.

Otras mejoras que proporciona la presente invención sobre la técnica anterior serán identificadas como resultado de la siguiente descripción, que expone las realizaciones preferidas de la presente invención. La descripción no está destinada en modo alguno a limitar el alcance de la invención, sino que en lugar de ello solamente proporciona un ejemplo de trabajo de las realizaciones presentes preferidas. El alcance de la presente invención estará marcado por las reivindicaciones anejas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que ilustra el cambio porcentual del volumen de distribución (DV) para tres grupos de animales tratados con cocaína.

La Figura 2 es una fotografía de imágenes de la relación DV paramétrica transaxial del cerebro de un primate no humano al nivel del cuerpo estriado.

Las Figuras 3A y 3B son gráficos que ilustran los efectos de GVG sobre el comportamiento locomotor con testigos de solución salina.

La Figura 4 es un gráfico que ilustra los efectos de GVG sobre dopamina extracelular inducida por nicotina.

Las Figuras 5A y 5B son gráficos que ilustran los efectos de la nicotina y GVG sobre los niveles de dopamina extracelulares en el nucleus accumbens de ratas con libertad de movimientos.

La Figura 6 es un gráfico que ilustra los efectos de la metanfetamina sobre los niveles de dopamina extracelulares en el nucleus accumbens de ratas con libertad de movimientos.

La Figura 7 es un gráfico que ilustra los efectos de GVG sobre los cambios inducidos por metanfetamina en los niveles de dopamina extracelulares en el nucleus accumbens de ratas con libertad de movimientos.

La Figura 8 es un gráfico que ilustra los efectos de GVG sobre los cambios inducidos por alcohol en los niveles de dopamina extracelulares en el nucleus accumbens de ratas con libertad de movimientos.

La Figura 9 es un gráfico que ilustra los efectos de GVG sobre cocaína, heroína y la combinación de cocaína y heroína sobre los niveles de dopamina extracelulares en el nucleus accumbens de ratas con libertad de movimientos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe un método altamente eficaz para tratar la adicción a sustancias y para mejorar el comportamiento relacionado con la adicción de mamíferos, por ejemplo, primates, que padecen de adicción a sustancias.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el comportamiento relacionado con la adicción que resulta del uso compulsivo de sustancias y se caracteriza por la dependencia total aparente de la sustancia. Es sintomático del comportamiento (i) implicación desbordada con el uso de la droga, (ii) la seguridad de su suministro, y (iii) una probabilidad elevada de recaída después de la retirada.

Por ejemplo, un usuario de cocaína experimenta tres fases de los efectos de las drogas. La primera, la intoxicación aguda ("borrachera") es eufórica, marcada por una ansiedad disminuida, confianza en sí mismo y apetito sexual aumentados, y puede estar alterado por indiscreciones sexuales, gastos irresponsables y accidentes atribuibles a un comportamiento desenfrenado. La segunda fase ("choque"), sustituye la euforia por ansiedad, cansancio, irritabilidad y depresión. Algunos usuarios han cometido suicido durante este período. Finalmente, la tercera fase, "anedonia", es un momento de capacidad limitada para obtener placer de las actividades normales y satisfacción para los efectos eufóricos de la cocaína, que conduce al uso de esta droga. Véase Gawin y Kleber, Medical Management of Cacaine Withdrawal, 6-8 (APT Foundation). En relación con los usuarios de cocaína, el comportamiento relacionado con la adicción incluye un comportamiento asociado con la totalidad de las tres fases de los efectos de la droga.

Drogas de abuso

Las drogas de abuso incluyen, pero sin limitación psicoestimulantes, analgésicos narcóticos, alcoholes y alcaloides adictivos como nicotina o sus combinaciones. Algunos ejemplos de psicoestimulantes incluyen, pero sin limitación, anfetamina, dextroanfetamina, metanfetamina, fenmetrazina, dietilpropion, metilfenidato, cocaína y sus sales farmacéuticamente aceptables.

Ejemplos específicos de analgésicos narcóticos incluyen alfentanilo, alfaprodina, anileridina, bencitramida, codeína, dihidrocodeína, difenoxilato, etilmorfina, fentanilo, heroína, hidrocodona, hidromorfona, isometadona, levometorfano, levorfanol, metazocina, metadona, metopon, morfina, extractos de opio, extractos de fluidos de opio, opio en polvo, opio granulado, opio en bruto, tintura de opio, oxidocona, oximorfona, petidina, fenazocina, piminodina, racemetorfano, racemorfano, tebaina y sus sales farmacéuticamente aceptables.

Las drogas de abuso incluyen también depresores del CNS como barbituratos, clordiazepóxido y alcoholes como etanol, metanol y alcohol isopropílico.

El método de la presente invención puede ser usado para tratar mamíferos adictos a la nicotina en combinación con una o más drogas de abuso.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, una combinación de drogas de abuso incluye combinaciones de psicoestimulantes, analgésicos narcóticos, alcoholes y alcaloides adictivos como se expuso con anterioridad. Por ejemplo, las combinaciones de drogas de abuso incluyen cocaína, nicotina, metanfetamina, etanol, morfina y heroína.

El uso compulsivo de drogas incluye tres componentes independientes: tolerancia, dependencia psicológica y dependencia física. La tolerancia produce una necesidad de aumentar la dosis de la droga después de varias administraciones con el fin de conseguir la misma magnitud de efecto. La dependencia física es un estado adaptativo producido por la administración repetida de drogas y que se manifiesta en sí misma por una intensa perturbación física cuando de interrumpe la administración de las drogas. La dependencia psicológica es un estado caracterizado por un impulso intenso, satisfacción o uso de una droga cuyos efectos siente el usuario que son necesarios para una sensación de bienestar. Véase Feldman, R.S. y Quenzer, L.F. "Fundamentals of Neuropsychopharmacology", 418-422 (Sinaur Associates, Inc.) 1984. Basándose en las anteriores definiciones, como se usa en la presente memoria descriptiva "características de dependencia" incluye todas las características asociadas con un uso compulsivo de drogas, características que pueden estar afectadas por la composición bioquímica del hospedante y las propiedades físicas y psicológicas del hospedante.

Como se explicó anteriormente, el uso compulsivo de drogas o abuso o la combinación de drogas de abuso da lugar a una fase eufórica seguida de una fase de satisfacción para los efectos eufóricos de esa droga que conduce al uso de la droga o combinación de drogas. Como se usa en la presente memoria descriptiva, los efectos de satisfacción/incentivos del abuso se refieren a cualquier estímulo (en este caso, una droga) que produce anedonia o aumenta la probabilidad de una respuesta aprendida. Esto es sinónimo de refuerzo. Con respecto a los animales experimentales, un estímulo se estima que produce una satisfacción usando paradigmas que se cree que miden la satisfacción. Esto se puede realizar midiendo si los estímulos producen una respuesta de aproximación, también conocida como respuesta apetitiva o una respuesta de retirada, como cuando el animal evita los estímulos, también conocidos como una respuesta de aversión. La preferencia de lugar condicionado (CPP) es un paradigma que mide las respuestas de aproximación (apetitivas) o retirada (aversivas). Se puede deducir que los estímulos de satisfacción producen un comportamiento de aproximación. De hecho, una definición de satisfacción es cualquier estímulo que provoque un comportamiento de aproximación. Además de ello, las consecuencias de la satisfacción serían aumentar las propiedades incentivas de los estímulos asociados con la satisfacción.

La satisfacción puede ser medida también determinando si el suministro de una satisfacción está supeditada a una respuesta particular, aumentando así la probabilidad de que la respuesta reaparezca en una situación similar, es decir, un paradigma de refuerzo. Por ejemplo, una rata que apriete una barra un cierto número de veces para una inyección de cocaína es un ejemplo de refuerzo. Todavía, una forma de medir la satisfacción es determinando si un estímulo (por ejemplo, una droga), a través de múltiples emparejamientos con estímulos medioambientales neutros, puede provocar los que estímulos ambientales previamente neutros provoquen efectos de comportamiento que inicialmente solo estaban asociados con la droga; esto es un refuerzo condicionado. La CPP es considerada una forma de refuerzo condicionado.

El valor de motivación incentiva de una droga (u otros estímulos) puede ser valorado usando la preferencia de lugar condicionado (CPP). Con respecto a la cocaína, nicotina, heroína, morfina, metanfetamina, etanol u otras drogas de abuso o sus combinaciones, los animales son ensayados en un estado exento de drogas, para determinar si prefieren un entorno en el que previamente recibían la droga de abuso en comparación con un entorno en el que recibían previamente solución salina. En el paradigma de CPP, a los animales se les proporciona una droga en un entorno distinto y se les proporciona el vehículo apropiado en un entorno alternativo. El paradigma de CPP es ampliamente usado para evaluar los efectos de motivación incentiva en animales de laboratorio (Van Der Kooy, 1995). A continuación del condicionamiento o emparejamiento con la droga, si el animal, en un estado exento de drogas, elige de forma consistente el entorno previamente asociado con la droga de abuso, es obtiene la deducción de que el valor apetitivo de la droga de abuso estaba codificada en el cerebro y es accesible en el estado exento de drogas. La CPP es reflejada en un transcurso de duración aumentada en presencia de los estímulos asociados con las drogas con relación a los animales testigos inyectados con vehículo. Puede ser usada también para valorar la adición a una combinación de drogas de abuso.

Se ha propuesto que como la satisfacción a nivel humano está provocada a menudo por estímulos sensoriales previamente asociados con la ingestión de drogas, pueden ser usados paradigmas de condicionamiento como CPP para modelar la satisfacción en animales de laboratorio.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, la satisfacción de una droga de abuso o una combinación de drogas de abuso es un deseo intenso de auto-administración de la(s) droga(s) previamente usada(s) por el mamífero. El mamífero no necesita la droga de abuso para evitar los síntomas de retirada.

La propensión adictiva de drogas de abuso, como por ejemplo cocaína, nicotina, metanfetamina, morfina, heroína, etanol y otras drogas de abuso ha estado asociada con sus acciones farmacológicas sobre las trayectorias de refuerzo/satisfacción de dopamina mesotelencefálica (DA) en el sistema nervioso central (CNS). La transmisión dopaminérgica en estas trayectorias está modulada por ácido gamma-amino-butírico (GABA).

Por ejemplo, la cocaína, nicotina, metanfetamina, morfina, heroína y etanol inhiben la reabsorción presináptica de monoaminas. Las neuronas dopaminérgicas del sistema de DA mesocorticolímbica, cuyas estructuras celulares se sitúan en la zona segmental ventral (VTA) y se proyectan principalmente hacia el nucleus accumbens (NACC), parece que están involucradas en el refuerzo de la cocaína, nicotina, metanfetamina, morfina, heroína o etanol. La estimulación eléctrica de los centros de satisfacción en la VTA aumenta los niveles de DA extracelulares en el NACC, mientras que las lesiones de 6-hidroxi-dopamina del NACC eliminan la auto-administración de cocaína, nicotina, metanfetamina, morfina, heroína o etanol. Unos estudios de microdiálisis in vivo confirman la capacidad de la cocaína, nicotina, metanfetamina, morfina, heroína y etanol para aumentar la DA extracelular en el NACC.

Las neuronas ácido \gamma-amino-butírico (GABA)-érgicas en el NACC y el pallidum ventral se proyectan en las neuronas de DA en el VTA. Unos estudios farmacológicos y electrofisiológicos indican que estas proyecciones son inhibidoras. La inhibición de neuronas de VTA-DA es probablemente el resultado de la estimulación de receptores GABA_{B}. Además, una microinyección de baclofeno en el VTA, que actúa a través de estos subtipos de receptores, puede disminuir las concentraciones de DA en el NACC. Tomada conjuntamente, es evidente que la manipulación farmacológica de GABA puede efectuar niveles de DA en el NACC a través de la modulación de neuronas de VTA-DA.

Gamma-vinil-GABA

El gamma-vinil-GABA (GVG) es un inhibidor selectivo e irreversible de GABA-transaminasa (GABA-T) conocido por potenciar la inhibición GABAérgica. Es conocido también que el GVG altera los efectos bioquímicos de la cocaína provocando una elevación prolongada y dependiente de la dosis de los niveles de GABA endógenos extracelulares.

El GVG es C_{6}H_{11}NO_{2} o ácido 4-amino-5-hexanoico disponible como Vigabatrin® en la empresa Hoechst Marion Roussel y puede ser obtenido en la empresa Marion Merrell Dow de Cincinnati, Ohio. El GVG no se une a ningún receptor o complejo de reabsorción, sino que aumenta los niveles de GABA intracelulares endógenos inhibiendo selectiva e irreversiblemente GABA-transaminasa (GABA-T), la enzima que normalmente cataboliza GABA.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, GVG incluye el compuesto o mezcla racémico que contiene cantidades iguales de S(+)-gamma-vinil-GABA y R(-)-gamma-vinil-GABA. Este compuesto racémico de GVG está disponible como Vigabatrin® en la empresa Hoechst Marion Roussel y puede ser obtenido de la empresa Marion Merre Dow de Cincinati, Ohio.

El GVG contiene átomos de carbono asimétricos y, por tanto, es capaz de existir como enantiómeros. La presente invención abarca cualquier forma enantiómera de GVG que incluya los racematos o mezclas racémicas de GVG. En algunos casos puede haber ventajas, es decir, mayor eficacia, en usar un enantiómero particular si se compara con otro enantiómero o el racemato o mezcla racémica en los métodos de la presente invención, y estas ventajas pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la técnica.

Por ejemplo, el enantiómero S(+)-gamma-vinil-GABA es más eficaz a niveles de GABA intracelulares endógenos crecientes que el enantiómero R(-)-gamma-vinil-GABA.

Pueden ser sintetizados diferentes enantiómeros a partir de materiales de partida quirales, o los racematos pueden ser resueltos mediante procedimientos convencionales que son bien conocidos en la técnica de la química como cromatografía quiral, cristalización fraccionada de sales diastereómeras y similares.

Administración de gamma-vinil-GABA

En mamíferos vivos (in vivo), el GVG o sus sales farmacéuticamente aceptables pueden ser administrados sistémicamente mediante las vías parenteral y enteral, que incluyen también sistemas de suministro de liberación controlada. Por ejemplo, el GVG puede ser fácilmente administrado por vía intravenosa, o por vía intraperitoneal (i.p.) que es una vía preferida de suministro. La administración intravenosa o intraperitoneal puede ser realizada mezclando GVG en un vehículo o excipiente farmacéutico adecuado, como será comprendido por los expertos en la técnica.

El uso oral o enteral está también contemplado, y formulaciones como comprimidos, cápsulas, píldoras, sellos, elixires, suspensiones, jarabes, pastillas, goma de mascar similares pueden ser empleados para proporcionar GVG o sus sales farmacéuticamente aceptables.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen los ácidos y bases formadores de sales que no aumenten sustancialmente la toxicidad del compuesto. Algunos ejemplos de sales adecuadas incluyen sales de ácidos minerales como ácidos clorhídrico, yodhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, así como sales de ácidos orgánicos como ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico, arilsulfónico, por ejemplo, p-tolueno sulfónico, y similares.

Una cantidad eficaz como se usa en la presente memoria descriptiva es la cantidad eficaz para conseguir el resultado especificado de cambiar el comportamiento relacionado con la adicción del mamífero. Es una cantidad que disminuya o alivie uno o más síntomas o estados resultantes del cese o retirada del psicoestimulante, analgésico narcótico, alcohol, nicotina o sus combinaciones. Sin embargo, debe destacarse que la invención no está limitada a ninguna dosis particular.

Preferentemente, el GVG es administrado en una cantidad que tenga poco o ningún afecto adverso. Por ejemplo, la cantidad administrada puede ser de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 2 g/kg o de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 600 mg/kg.

Por ejemplo, para tratar la adicción a la cocaína, el GVG es administrado en una cantidad de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 2 g/kg, preferentemente de aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg o de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 600 mg/kg y, lo más preferentemente, de aproximadamente 150 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg o de aproximadamente 75 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg.

Para tratar la adicción a la nicotina, por ejemplo, el GVG es administrado en una cantidad de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 2 g/kg o de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 600 mg/kg, preferentemente de aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg o de aproximadamente 150 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg y lo más preferentemente de aproximadamente 18 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg o de aproximadamente 75 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg.

Para tratar la adicción a la metanfetamina, por ejemplo, el GVG es administrado en una cantidad de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 2 g/kg, preferentemente de aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg o de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 600 mg/kg y, lo más preferentemente, de aproximadamente 150 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg o de aproximadamente 75 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg para un mamífero.

Cuando el mamífero es adicto a una combinación de drogas de abuso, el GVG es administrado en una cantidad de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 2 g/kg, preferentemente de aproximadamente 100 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg o de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 600 mg/kg y, lo más preferentemente, de aproximadamente 150 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg o de aproximadamente 75 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg de un mamífero.

Los mamíferos incluyen, por ejemplo, seres humanos, babuinos y otros primates, así como animales domésticos como perros y gatos, animales de laboratorio como ratas y ratones y animales de granja como caballos, ovejas y vacas.

El gamma-vinil-GABA (GVG) es un inhibidor selectivo e irreversible de GABA-transaminasa (GABA-T) que se conoce que potencia la inhibición GABérgica. Es conocido también que el GVG altera los efectos bioquímicos de la cocaína provocando una elevación prolongada y dependiente de la dosis de los niveles de GABA endógenos extracelulares en el cerebro.

Basándose en el conocimiento de que la cocaína, así como otras drogas de abuso, aumentan el DA DEL NACC extracelular y en el hecho de que el GABA inhibe DA en los mismos núcleos, se ha conocido que el GVG puede atenuar los cambios inducidos por cocaína, nicotina, metanfetamina y etanol en DA extracelular. En un ejemplo, se usaron técnicas de microdiálisis in vivo en animales con libertad de movimientos para mostrar los efectos de la administración de GVG agudos (inyección única) y crónicos (11 días) sobre aumentos inducidos por cocaína en la concentración de DA extracelular en el NACC. Véase específicamente la publicación de Morgan, A.E. et al. "Effects of Pharmacologic Increases in Brain ABA Levels on Cocaine-Induced Changes in Extracellular Dopamine", Synapse 28:60-65 (1998).

Se ha encontrado inesperadamente que la ingestión de GVG altera el comportamiento, y especialmente el comportamiento relacionado con la adicción asociado con los cambios bioquímicos que resultan de la ingestión de drogas de abuso. Por ejemplo, el GVG atenuaba significativamente los aumentos inducidos por cocaína en DA sináptica neoestriatal en el cerebro del primate (babuino) según se valoró mediante tomografía de emisión de positrones (PET) y eliminó tanto la expresión como la adquisición de la preferencia de lugar condicionado inducida por cocaína o CPP. Sin embargo, no tuvo ningún efecto sobre el CPP en cuanto a la satisfacción de alimentos ni sobre el suministro de cocaína para la actividad locomotora cerebral. Estos descubrimientos sugieren la posible utilidad terapéutica en la adicción a la cocaína de una estrategia farmacológica dirigida a diana en el sistema neurotransmisor GABAérgico, un sistema distinto pero funcionalmente asociado al sistema de satisfacción/refuerzo mesotelencefálico de DA. Sin embargo, en lugar de dirigir a diana el complejo receptor de GABA con un agonista de GABA directo, esta nueva aproximación con GVG aprovecha los efectos prolongados de un inhibidor enzimático irreversible que eleva los niveles de GABA endógenos sin la propensión adictiva asociada con agonistas de GABA que actúan directamente en el propio
receptor.

Aunque el GVG es usado en los presentes ejemplos, debe entenderse por los expertos en la técnica que pueden ser usadas otras composiciones o medicamentos que se conozca que potencian el sistema GABAérgico o aumenten los niveles de GABA endógeno extracelular en el CNS.

Estas composiciones o medicamentos incluyen drogas que aumentan la producción o liberación de GABA en el CNS. Estas drogas incluyen, pero sin limitación, gabapentina, ácido valproico, progabida, ácido gamma-hidroxibutírico, fengabina, cetil-GABA, topiramato, tiagabina, acamprosato (homo-calcio-acetilurina) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, o un enantiómero o mezcla racémica de los mismos.

La presente invención abarca cualquier forma enantiómera de gabapentina, ácido valproico, progabida, ácido gamma-hidroxibutírico, fengabina, cetil-GABA, topiramato, tiagabine o acamprosato, incluidos los racematos o mezclas racémicas de los mismos.

Como se estableció previamente, en algunos casos puede haber ventajas, es decir, una mayor eficacia, en usar un enantiómero particular si se compara con otro enantiómero o el racemato o la mezcla racémica en los métodos de la presente invención, y estas ventajas pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la técnica.

La presente invención abarca las composiciones o medicamentos que incluyen profármacos de GABA o fármacos que contienen GABA como un resto en su estructura química. Estos profármacos se hacen farmacológicamente activos cuando son biotransformados metabólica, enzimática o no enzimáticamente o son escindidos en GABA en el CNS. Un ejemplo de un profármaco de GABA es progabida que, tras cruzar la barrera sanguínea del cerebro, aumenta los niveles de GABA endógenos en el CNS.

Como se estableció previamente, el gamma-vinil-GABA (GVG) es un inhibidor selectivo e irreversible de GABA-transaminasa (GABA-T) que se conoce que potencia la inhibición GABAérgica. Otras composiciones o medicamentos que inhiben la reabsorción de GABA en el CNS están también incluidos en la presente invención. Un ejemplo de un inhibidor de la reabsorción de GABA es tiagabina.

El método de la presente invención es útil para potenciar el sistema GABAérgico o aumentar los niveles de GABA endógeno extracelular en el CNS. Como se usa en la presente memoria descriptiva, mejorar o aumentar los niveles de GABA endógeno del CNS se define como aumentar o regular en sentido ascendente los niveles de GABA sustancialmente sobre los niveles normales in vivo, en un mamífero. Preferentemente, los niveles de GABA endógeno del CNS son mejorados al menos de aproximadamente 10% a aproximadamente 600% sobre los niveles normales.

Como se estableció previamente, una cantidad eficaz como se usa en la presente memoria descriptiva es la cantidad eficaz para conseguir el resultado especificado de cambiar el comportamiento relacionado con la adicción del mamífero. Es una cantidad que disminuirá o aliviará uno o más síntomas o condiciones que resultan del cese o retirada del psicoestimulante, analgésico narcótico, alcohol, nicotina o sus combinaciones. Sin embargo, debe destacarse que la invención no está limitada a ninguna dosis particular.

Por ejemplo, una cantidad eficaz de gabapentina administrada al mamífero es una cantidad de aproximadamente 500 mg a aproximadamente 2 g/día. La gabapentina está disponible como Neurontin® en la empresa Parke-Davis en los Estados Unidos.

Una cantidad eficaz de ácido valproico administrado al mamífero es, por ejemplo, preferentemente, una cantidad de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg/día. El ácido valproico está disponible domo Depakene® de la empresa Abbott en los Estados Unidos.

Preferentemente, una cantidad eficaz de topiramato administrado al mamífero es, por ejemplo, una cantidad de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 1 g/día. El topiramato está disponible como Topamax® en la empresa McNeil en los Estados Unidos. Una cantidad eficaz de progabida administrada al mamífero es, preferentemente, una cantidad de aproximadamente 250 mg a aproximadamente 2 g/día. Progabida está disponible como Gabrene® en la empresa Synthelabo de Francia. La fórmula química de progabida es C_{17}H_{16}N_{2}O_{2}.

Una cantidad eficaz de fengabina administrada al mamífero es, preferentemente, una cantidad de aproximadamente 250 mg a aproximadamente 4 g/día. Fengabina está disponible como SL 79229 en la empresa Synthelabo de Francia. La fórmula química de fengabina es C_{17}H_{17}C_{12}NO.

Preferentemente, una cantidad eficaz de ácido gamma-hidroxibutírico administrado al mamífero es una cantidad de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg/día. El ácido gamma-hidroxibutírico está disponible en la empresa Sigma Chemical. La fórmula química del ácido gamma-hidroxibutírico es C_{4}H_{7}O_{3}Na.

Se exponen detalles de la invención en la forma de ejemplos, que se describen a continuación. El alcance completo de la invención será indicado en las reivindicaciones anejas.

Ejemplos

Se exponen a continuación ejemplos para los fines de ilustrar y describir el mejor modo de la presente invención. El alcance de la invención no está limitado en modo algunos por los ejemplos expuestos en la presente memoria descriptiva.

Materiales y métodos 1. Estudios en primates por PET

Veinte babuinos hembras adultos (Papio anubis, 13-18 kg) fueron usados para todos los estudios y se sintetizó como se describió previamente racloprida marcado con carbono-11, que se mostró previamente que era sensible a los cambios en DA sináptico (Volkow et al., 1994). Se obtuvieron muestras de sangre arterial a través del estudio y se analizaron muestras de plasma seleccionadas en cuanto a la presencia de carbono-11 radio-marcador inalterado. Los animales no fueron retirados de la jaula entre las inyecciones de isótopos. Las zonas de interés (ROI) fueron extraídas directamente sobre las imágenes de PET. Brevemente, el cuerpo estriado fue indicado, bilateralmente, en cada escisión transaxial después de que apareciera. El ROI cerebelar fue extraído a través de la línea media al nivel del vermis cerebelar. Los ROI del primer estudio fueron seguidamente copiados directamente sobre la correspondiente escisión del segundo. Examinando la ubicación de los ROI en la segunda exploración se pudieron hacer cambios, si fuera necesario, solamente en la posición de ROI. Este método multi-planar de análisis redujo las diferencias que podían surgir debidas al movimiento del animal en la jaula durante el intervalo de exploración.

Un método gráfico para determinar el volumen de distribución (DV) fue previamente desarrollado para el análisis cinético de los datos de [C^{11}]-racloprida. La relación de DV fue la medición más reproducible de la absorción de racloprida. La relación es el DV de una zona con elevado contenido de receptor (cuerpo estriado) para el DV de una zona no receptora (cerebelo). La concentración de receptor libre era directamente proporcional a la relación de DV de 1. La preparación de los animales se realizó como se detalló previamente (Dewey et al., 1992).

El análisis estadístico fue diseñado para ensayar la hipótesis de que (1) el estímulo de la cocaína difería de la variabilidad de ensayo/nuevo ensayo del radio-marcador carbono-11 (realizado en los mismos animales bajo condiciones experimentales idénticas) y (2) las condiciones del estímulo difirieron unas de otras. El hecho de que se obtuvieran resultados significativos para el estriado y la relación de estriado a cerebelo, pero no para el cerebelo, indicaba que los efectos de la intervención estaban limitados al componente de unión específica, pero no el de la no específica. El GVG no alteró la distribución zonal ni la velocidad de metabolismo del radio-marcador.

2. Preferencia de lugar condicionado inducida por cocaína en roedores

En todos los estudios con roedores, se usaron ratas Sprague-Dawley machos (200-225 g, Taconic Farms, Germantown, NY). Se permitió que los animales se aclimataran a la instalación de alojamiento de los animales durante al menos 5 días antes del comienzo de los experimentos. Se usaron cámaras de preferencia de lugar condicionados (CPP) como se describió previamente (Lepore et al., 1995), con la excepción de que en lugar de que una cámara fuera completamente blanca y la otra negra, una cámara era completamente azul claro con un suelo de acero inoxidable y la segunda cámara era azul claro con tiras horizontales negras (2,5 cm de ancho) separadas 3,8 cm con un suelo de plexiglás suave. En todos los estudios de CPP con GVG, el volumen de solución salina era (1 ml/kg) y las dosis de cocaína eran 20 mg/kg. La solución salina, cocaína y GVG fueron inyectados todos por vía intraperitoneal (i.p.). El procedimiento de condicionamiento para la fase de adquisición consistía en 12 sesiones llevadas a cabo consecutivamente durante 12 días.

Los emparejamientos de CPP fueron: 1) solución salina/solución salina 2) solución salina/cocaína 3) GVG/solución salina 4) solución salina/cocaína y GVG. Los animales en cada grupo fueron asignados al azar a un diseño factorial de 2 x 2 en el que un factor era la cámara de emparejamiento y el otro factor era el orden de condicionamiento. Los animales que recibieron solución salina o cocaína fueron inyectados y confinados en el compartimento apropiado durante 30 minutos. Las inyecciones de GVG fueron proporcionadas 3 horas antes de la inyección de solución salina o cocaína y con posterioridad a la colocación de os animales en la cámara apropiada. Esto se hizo porque se había observado que los niveles de GABA alcanzaban valores máximos 3 a 4 horas después de la administración de
GVG.

En el día del ensayo (día 12), no fueron administradas ni las drogas ni la solución salina y se permitió que el animal se moviera libremente entre las dos cámaras durante quince minutos. Se registró la cantidad de tiempo transcurrido en cada cámara usando un haz de infrarrojos automatizado electrónicamente acoplado a un cronómetro. Para la fase de expresión de CPP a cocaína, los animales fueron habituados y condicionados a cocaína como se describió en los estudios de adquisición, pero a ninguno de los animales en los estudios de expresión se les proporcionó GVG en los días de condicionamiento. En el día del ensayo (día 12), los animales que estaban siendo ensayados en la fase de expresión, al contrario que los animales en la fase de adquisición, recibieron solución salina o GVG 2,5 horas antes de que fueran colocados en el aparato y se les permitiera libre acceso a las dos cámaras durante 15 minutos.

3. Preferencia de lugar condicionado inducida por alimentos en roedores

Con el fin de ensayar la CPP inducida por alimentos en roedores, a cuatro grupos de ratas se les permitió acceso a alimentos sin restricción durante las 12 sesiones completas del procedimiento de CPP. El procedimiento de CPP de 12 sesiones era exactamente el mismo que el procedimiento usado en los estudios de CPP inducido por cocaína, con la excepción de que la sustancia apetitiva eran alimentos en lugar de cocaína. Al grupo uno se le proporcionó solución salina, al grupo dos se le suministraron por vía intraperitoneal 150 mg/kg de GVG, al grupo 3 se le proporcionó solución salina y al grupo 4 se le proporcionaron por vía intraperitoneal 300 mg/kg de GVG antes de la exposición de alimentos y emparejamiento de CPP a un lado de la caja de CPP. Los animales en la totalidad de los cuatro grupos fueron habituados a un entorno "Froot Loops", un cereal de desayuno con sabor a frutas que es muy apetitoso para las ratas de laboratorio, en la cámara apropiada en el espacio del ensayo durante cuatro sesiones de habituación. Veinticuatro horas después del último emparejamiento de CPP, los animales fueron colocados en la cámara y no se administró droga ni solución salina (ni alimentos) (ni estaban disponibles) y se permitió que los animales se movieran libremente en el aparato de CPP durante 15 minutos. La cantidad de tiempo transcurrido en las cámaras emparejadas y sin emparejar fue registrada usando un dispositivo automatizado.

4. Actividad locomotora medida en roedores

Los animales fueron previamente manejados durante 5 minutos cada día durante una semana antes del experimento para reducir el estrés del manejo. En el día del estudio, se administró GVG (150 mg/kg o 300 mg/kg) o solución salina (1 ml/kg o 0,5 ml/kg) por vía intraperitoneal 2,5 horas antes del experimento. Después de 2,5 horas de la administración de GVG o solución salina, los animales fueron colocados en las jaulas de comportamiento y la actividad locomotora fue registrada en intervalos de 10 minutos durante 90 minutos en un ordenador PC-AT usando el hardware para el Photobeam Activity System. Las jaulas de locomoción son en sí mismas jaulas acrílicas transparentes de 41,3 x 41,3 x 30,5 cm. El sistema eletrónico (Photobeam Activity System, San Diego Instruments, San Diego, Calif.) usado para verificar la actividad locomotora consiste en 16 haces infrarrojo que se proyectan a través de las jaulas de izquierda a derecha y 16 haces de delante hacia atrás. Todos los haces infrarrojos están a aproximadamente 0,39 cm desde el suelo.

5. Estudios de catalepsia en roedores

El grado de catalepsia a continuación de la administración por vía intraperitoneal de 150 mg/kg de GVG, 300 mg/kg de GVG por vía intraperitoneal o solución salina (1 ml/kg i.p., 0,9% de solución salina) se determinó usando el ensayo de Bar. Brevemente, las ratas Sprague-Dawleymachos fueron manejadas y transportadas hasta el espacio del ensayo tres días antes de los experimentos para permitir su aclimatación. En el día del ensayo, los animales (n=10 por grupo de tratamiento) recibieron solución salina o GVG, y se midió el grado de catalepsia 60, 120 y 240 minutos a continuación de la inyección. El encargado del experimento no tenía ningún conocimiento del tratamiento recibido por cada animal. La barra estaba compuesta por madera y tenía un diámetro de 1,2 cm y la altura desde el suelo hasta la parte superior era de 10 cm. Para cada determinación, las patas delanteras de los animales fueron suavemente colocadas sobre la barra y se midió el tiempo que tardó el animal en mover las dos patas delanteras hasta el suelo.

6. Estudios de [C^{11}]-cocaína en roedores y primates

Los animales (n=10) fueron colocados en dos grupos. En el grupo 1, se administró solución salina (1 ml/kg) mediante inyección por vía intraperitoneal (i.p.) 3 horas antes de la administración i.p. de [C^{11}]-cocaína. En el grupo 2, se administró GVG (300 mg/kg) por medio de inyección i.p. 3 horas antes de la administración i.p. de [C^{11}]-cocaína. Los animales fueron sacrificados 10 minutos a continuación de la inyección de [C^{11}]-cocaína. Los cerebros fueron extirpados y recontados en cuanto a radioactividad. En dos estudios adicionales de PET con primates, se administró GVG (300 mg/kg) inmediatamente a continuación de una exploración de referencia con cocaína marcada. Aproximadamente 3 horas después, fue nuevamente administrada cocaína marcada y los animales fueron explorados durante 60 minutos.

7. Estudios de microdiálisis en roedores

Todos los animales fueron usados bajo un protocolo aprobado por la IACUC y con un seguimiento estricto de las normas del NIH. Ratas Sprague-Dawley machos adultas (200-300 g, Taconic Farms), albergadas en la instalación para cuidado de animales bajo condiciones de luz/oscuridad 12:12, fueron colocadas en 6 grupos (n=5-9), anestesiadas fueron implantadas cánulas de guía siliconizadas esteroatácticamente en el NACC derecho (2,0 mm anteriores y 1,0 mm lateral a bregms y 7,0 mm ventrales a la superficie cortical) al menos 4 días antes del estudio. Se colocaron sondas de microdiálisis (2, 0 mm, Bioanalytical Systems, BAS, West Lafayette, IN) en las cánulas de guía y se administró fluido cerebroespinal artificial (ACSF, Na 155,0 mM, Ca^{2+} 1,1 mM, K 2,9 mM, Cl^{-} 132,76 mM y Mg^{2+} 0,83 mM) a través de la sonda usando una bomba de microinfusión CMA/100 (BAS) a un caudal de 2,0 µl/minuto. Los animales fueron colocados en cuencos y se insertaron sondas y se inundaron con ACSF durante una noche. En el día del estudio, fue inyectado un mínimo de tres muestras para determinar la estabilidad de referencia. Las muestras fueron recogidas durante 20 minutos y fueron inyectadas en línea (CMA/160, BAS). La concentración media de dopamina de estas tres muestras estables fue definida como testigo (100%), y todos los valores posteriores de tratamiento fueron transformados en porcentaje de ese testigo. Tras establecer un valor de referencia estable, la nicotina fue administrada mediante inyección intraperitoneal (i.p.) El sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) consiste en una columna de fase inversa (3,0 \mu C-18), un trasductor electroquímico BAS LC-4C con electrodo de carbono dual/vítreo ajustado a 650 mV, un ordenador que analiza datos en línea usando un paquete de software comercial (Chromograph Bioanalytical Systems) y un registrador gráfico de bolígrafo dual. La fase móvil (caudal 1,0 ml/minuto) consistía en 7,0% de metanol, fosfato de sodio monobásico 50 mM, octil-sulfato de sodio 1,0 mM y EDNA 0,1 mM, pH 4,0. DA eluida a 7,5 minutos. Tras completar el estudio, los animales fueron decapitados y se obtuvieron secciones congeladas para verificación por colocación de sonda.

En paralelo a las estimaciones cuantitativas de la concentración de dopamina, se cuantificó simultáneamente la respuesta de estos animales a la administración simultánea usando un detector de movimientos infrarrojos. Este detector de proximidad óptica infrarrojos verificó el movimiento del brazo de suspensión, un componente integral del sistema de movimientos libres. El aporte digital del detector se puso en interfase con un ordenador personal IBM y se programó para contar las desviaciones del brazo tanto positivas como negativas. Los datos fueron recogidos y englobados usando el mismo protocolo de toma de muestras temporal usado para las muestras de diálisis. La actividad locomotora se expresó seguidamente como el número de desviaciones por intervalo de muestras.

No todos los ejemplos están abarcados por el alcance de las reivindicaciones.

Ejemplo 1 Estudios en primates no humanos (babuino)

En este ejemplo veinte primates no humanos recibieron dos inyecciones de [C^{11}]-racloprida de acuerdo con el procedimiento descrito en la Sección 1 de Materiales y métodos. La primera sirvió como valor de referencia y la segunda consistió en cocaína o placebo. Los primates del ensayo/nuevo ensayo (n=7) mostrados en el Grupo 1 de la Tabla 1 siguiente recibieron placebo (0,9% de solución salina, 1 ml/kg) antes de la segunda inyecciones de radio-marcador con el fin de determinar la variabilidad del ensayo/nuevo ensayo en este método de formación de imágenes.

TABLA 1 Grupos y condiciones experimentales

Grupo	Condición farmacológica
1	testigo (ensayo/nuevo ensayo)
2	Tratado con cocaína
3	Tratado con GVG/cocaína

Todos los primates restantes (n=13) recibieron una inyección sistémica de hidrocloruro de cocaína (0,5, 1,0 ó 2,0 mg/kg) cada 5 ó 30 minutos antes de la segunda inyección de [C^{11}]-racloprida. De estos 13 animales, cinco recibieron GVG (300 mg/kg, i.v.) 3 horas antes de la administración de cocaína.

Valores diferentes de dosis de cocaína e intervalos de tiempo de pretratamiento con cocaína no produjeron cambios significativos en los efectos de la cocaína sobre el volumen de distribución (DV), en congruencia con lo esperado, por lo tanto, el cambio porcentual % en la relación de DV para los animales tratados con cocaína sola (n=8) frente a GVG/cocaína (n=5) se representa como Grupos 2 y 3 de la Figura 1, respectivamente.

Como un antagonista competitivo, la unión de [C^{11}]-racloprida es dependiente de la concentración de DA en la fisura sináptica. Es decir, a medida que disminuyen las concentraciones de DA sináptica, aumenta la unión de [C^{11}]-racloprida. Inversamente, a medida que aumentan las concentraciones de DA sináptica, disminuye la unión de [C^{11}]-racloprida. Como se observa en la Figura 1, la variabilidad del ensayo/nuevo ensayo de este método de formación de imágenes fue menor que 7% para el grupo 1. La variabilidad de estas mediciones de PET es congruente con los valores previos obtenidos con [C^{11}]-racloprida en primates. En el grupo 2, la cocaína produjo una reducción mayor que 30% en la relación de DV media (p<0,0002, ensayo T de Student de dos colas, Figura 1). Estos datos son congruentes los estudios de PET y microdiálisis simultáneos en los que una estimulación con anfetamina aumento la DA extracelular y disminuyó la unión de [C^{11}]-racloprida en el cerebro del primate. Además, estos descubrimientos son similares a un informe reciente que examinó los efectos de una estimulación con cocaína sobre la unión de racloprida marcado en el ser humano. Finalmente, estos datos son congruentes con los estudios de microdiálisis del solicitante (Morgan y Dewey, 1998) así como los estudios del PET en primates y seres humanos del solicitante con anfetamina, GBR 12909, tetrabenazina, metilfenidato y [C^{11}]-racloprida (Dewey et al., 1993; Volkow et al., 1994). Sin embargo, el pretratamiento con GVG bloqueó significativamente la disminución inducida por cocaína como se muestra en el grupo 2 de la Figura 1 en la relación de DV (grupo 2, p<0,002, ensayo T de Student de dos colas). Estas diferencias son fácilmente evidentes en las imágenes de relaciones DV paramétricas mostradas en la Figura 2. Los valores para los grupos 1 y 3 no eran estadísticamente diferentes (p>1, ensayo T de Student de dos colas).

Ejemplo 2 Estudios de preferencia de lugar condicionado inducida por cocaína en roedores

En este ejemplo se siguió el procedimiento indicado en la Sección 2 de Materiales y métodos. La cocaína produjo una respuesta CPP dependiente de la dosis, en la que la respuesta más fiable y robusta se producía a 20 mg/kg como se muestra en la Tabla 2 siguiente.

TABLA II Preferencia de lugar condicionado a cocaína

	Tiempo transcurrido en cámaras (min.)
Cocaína (mg/kg)	Emparejado	Sin emparejar^{1}
0	7,4\pm0,3	7,6\pm0,3
5,0	8,2\pm0,4	6,8\pm0,5
10,0	9,6\pm0,5^{2}	5,4\pm0,3
20,0	11,8\pm0,4^{3}	3,2\pm0,4^{4}
^{1} A los animales verificados se les inyectó solamente solución salina.
^{2} \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente mayor que las dosis de 0 y 5 mg/kg de cocaína, p<0,05, análisis de la varianza (ANOVA) y ensayo de Student-Newman-Keuls.\end{minipage}
^{3} \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente mayor que las dosis de 0,5 y 10 mg/kg de cocaína, p<0,05, ANOVA y ensayo de Student-Newman-Keuls.\end{minipage}
^{4} \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente menor que las dosis de 0,5 y 10 mg/kg de cocaína, p<0,01, ANOVA y ensayo de Student-Newman-Keuls.\end{minipage}

Por lo tanto, se escogió una dosis de 20 mg/kg de cocaína con la que examinar el efecto de la administración de GVG sobre las fases de adquisición y expresión de CPP inducida por cocaína. Los resultados indicaron claramente que 112, 150 y 300 mg/kg, pero no 75 mg/kg de GVG bloquearon la adquisición y expresión de CPP inducida por cocaína. Véanse específicamente las Tablas 3-10 siguientes.

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TABLA III Efecto de GVG y solución salina sobre la adquisición de la preferencia de lugar condicionada inducida por cocaína

	Tiempo transcurrido en cámaras (min.)
Emparejamientos de tratamiento	Emparejado	Sin emparejar^{2}
Solución salina/solución salina	7,3\pm0,5	7,7\pm0,6
Solución salina/cocaína	11,1\pm0,3^{4}	3,9\pm0,4
75 mg/kg GVG^{3}/solución salina	7,3\pm0,5	7,7\pm0,6
75 mg/kg GVG^{3}/cocaína	9,1\pm1,1	5,9\pm1,2
^{1} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara \pm S.E.M. (n=8-10).
^{2} Los animales verificados fueron inyectados solamente con solución salina.
^{3} Los animales recibieron GVG o solución salina 2,5 horas antes de recibir solución salina o cocaína (20 mg/kg).
^{4} Significativamente mayor que todos los grupos de tratamiento, p<0,05, ensayo ANOVA y Newman-Keuls.
^{5} Significativamente menor que todos los grupos de tratamiento, p<0,01, ensayo ANOVA y Newman-Keuls.

TABLA IV

	Tiempo transcurrido en cámaras (min.)
Emparejamientos de tratamiento	Emparejado	Sin emparejar^{2}
Solución salina/solución salina	7,2\pm0,5	7,8\pm0,4
Solución salina/cocaína	11,8\pm0,5^{4}	3,2\pm0,5
112 mg/kg GVG^{3}/solución salina	7,6\pm0,6	7,4\pm0,6
112 mg/kg GVG^{3}/cocaína	8,2\pm0,5	6,8\pm0,5
^{1} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara \pm S.E.M. (n=8-10).
^{2} Los animales verificados fueron inyectados solamente con solución salina.
^{3} Los animales recibieron GVG o solución salina 2,5 horas antes de recibir solución salina o cocaína (20 mg/kg).
^{4} Significativamente mayor que todos los grupos de tratamiento, p<0,05, ensayo ANOVA y Newman-Keuls.
^{5} Significativamente menor que todos los grupos de tratamiento, p<0,01, ensayo ANOVA y Newman-Keuls.

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TABLA V

	Tiempo transcurrido en cámaras (min.)
Emparejamientos de tratamiento	Emparejado	Sin emparejar^{2}
Solución salina/solución salina	7,4\pm0,3	7,6\pm0,4
Solución salina/cocaína	11,6\pm0,5^{4}	3,4\pm0,4^{5}
150 mg/kg GVG^{3}/solución salina	7,8\pm0,6	7,2\pm0,6
150 mg/kg GVG^{3}/cocaína	7,9\pm0,8	7,1\pm0,8
^{1} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara \pm S.E.M. (n=8-10).
^{2} Los animales verificados fueron inyectados solamente con solución salina.
^{3} Los animales recibieron GVG o solución salina 2,5 horas antes de recibir solución salina o cocaína (20 mg/kg).
^{4}Significativamente mayor que todos los grupos de tratamiento, p<0,05, ensayo ANOVA y Newman-Keuls.
^{5} Significativamente menor que todos los grupos de tratamiento, p<0,01, ensayo ANOVA y Newman-Keuls.

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TABLA VI

	Tiempo transcurrido en cámaras (min.)
Emparejamientos de tratamiento	Emparejado	Sin emparejar^{2}
Solución salina/solución salina	7,7\pm0,3	7,3\pm0,3
Solución salina/cocaína	11,2\pm0,6^{4}	0,8\pm0,5^{5}
300 mg/kg GVG^{3}/solución salina	7,2\pm0,4	7,8\pm0,4
300 mg/kg GVG^{3}/cocaína	7,6\pm0,7	7,2\pm0,7
^{1} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara \pm S.E.M. (n=8-10).
^{2} Los animales verificados fueron inyectados solamente con solución salina.
^{3} Los animales recibieron GVG o solución salina 2,5 horas antes de recibir solución salina o cocaína (20 mg/kg).
^{4} Significativamente mayor que todos los grupos de tratamiento, p<0,05, ensayo ANOVA y Newman-Keuls.
^{5} Significativamente menor que todos los grupos de tratamiento, p<0,01, ensayo ANOVA y Newman-Keuls.

TABLA VII Efecto de GVG y solución salina sobre la expresión de la preferencia de lugar condicionado inducida por cocaína

		Tiempo transcurrido en cámaras (min.)
Emparejamientos de	Droga proporcionada en	Emparejado	Sin emparejar^{2}
tratamiento	el día del ensayo
Sol. salina/Sol. salina	Sol. salina	7,5\pm0,4^{1}	7,5\pm0,4
Sol. salina/Sol. salina	GVG, 75 mg/kg	7,5\pm0,3	7,5\pm0,3
Sol. salina/Cocaína	Sol. salina	11,8\pm0,5^{3}	3,2\pm0,5
Sol. salina/Cocaína	GVG, 75 mg/kg	10,6\pm0,6^{3}	4,4\pm0,9
Sol. salina/Sol. salina	Sol. salina	7,8\pm0,5^{1}	7,2\pm0,6
^{1} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara \pm S.E.M. (n=10).
^{2} Los animales verificados fueron inyectados solo con solución salina.
^{3} \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente mayor que todas las demás pinturas de tratamiento, p<0,01, ensayo de ANOVA y Student Newman-Keuls.\end{minipage}

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TABLA VIII

		Tiempo transcurrido en cámaras (min.)
Emparejamientos de	Droga proporcionada en	Emparejado	Sin emparejar^{2}
tratamiento	el día del ensayo
Sol. salina/Sol. salina	Sol. salina	7,1\pm0,5	7,9\pm0,5
Sol. salina/Sol. salina	GVG, 112 mg/kg	7,2\pm0,3	7,8\pm0,3
Sol. salina/Cocaína	Sol. salina	12,2\pm0,6^{3}	2,8\pm0,5
Sol. salina/Cocaína	GVG, 112 mg/kg	8,1\pm0,7	6,9\pm0,6
^{1} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara \pm S.E.M. (n=10).
^{2} Los animales verificados fueron inyectados solo con solución salina.
^{3} \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente mayor que todas las demás pinturas de tratamiento, p<0,01, ensayo de ANOVA y Student Newman-Keuls.\end{minipage}

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TABLA IX

		Tiempo transcurrido en cámaras (min.)
Emparejamientos de	Droga proporcionada en	Emparejado	Sin emparejar^{2}
tratamiento	el día del ensayo
Sol. salina/Sol. salina	Sol. salina	7,2\pm0,2^{1}	7,8\pm0,2
Sol. salina/Sol. salina	GVG, 150 mg/kg	7,7\pm0,2	7,3\pm1,1
Sol. salina/Cocaína	Sol. salina	11,1\pm0,5^{3}	3,9\pm0,4^{4}
Sol. salina/Cocaína	GVG, 150 mg/kg	7,9\pm0,3	7,1\pm0,3
^{1} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara \pm S.E.M. (n=10).
^{2} Los animales verificados fueron inyectados solo con solución salina.
^{3} \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente mayor que todas las demás pinturas de tratamiento, p<0,01, ensayo de ANOVA y Student Newman-Keuls.\end{minipage}
^{4} \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente menor que todos los demás emparejamientos de tratamiento, p<0,01, ensayo de ANOVA y Student Newman-Keuls.\end{minipage}

TABLA X

		Tiempo transcurrido en cámaras (min.)
Emparejamientos de	Droga proporcionada en	Emparejado	Sin emparejar^{2}
tratamiento	el día del ensayo
Sol. salina/Sol. salina	Sol. salina	7,8\pm0,5^{1}	7,2\pm0,6
Sol. salina/Sol. salina	GVG, 300 mg/kg	7,3\pm0,4	7,7\pm0,3
Sol. salina/Cocaína	Sol. salina	12,5\pm0,8^{3}	2,5\pm0,6^{4}
Sol. salina/Cocaína	GVG, 300 mg/kg	7,9\pm0,5	7,1\pm0,6
^{1} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara \pm S.E.M. (n=10).
^{2} Los animales verificados fueron inyectados solo con solución salina.
^{3} \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente mayor que todas las demás pinturas de tratamiento, p<0,05, ensayo de ANOVA y Student Newman-Keuls.\end{minipage}
^{4} \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente menor que todos los demás emparejamientos de tratamiento, p<0,05, ensayo de ANOVA y Student Newman-Keuls.\end{minipage}

Por sí mismo, el GVG no produjo una CPP ni una respuesta aversiva condicionada. Véanse nuevamente las Tablas 3-10.

Ejemplo 3 Estudios de preferencia de lugar condicionado inducida por alimentos en roedores

En este ejemplo se siguió el procedimiento indicado en la Sección 3 de Materiales y métodos. Los expuestos en la Tabla 11 siguiente indican que los alimentos provocaron un incentivo o efecto de satisfacción. Por ejemplo, todos los valores emparejados muestran que los roedores pasan más tiempo en la cámara cuando estaban presentes alimentos.

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TABLA XI Efecto de GVG (150, 300 mg/kg, ip) sobre la preferencia de lugar condicionado a alimentos

	Tiempo transcurrido en cámaras (min.)
Emparejamientos de tratamiento	Emparejado	Sin emparejar^{2}
Sol. salina/sol. salina	7,3\pm0,6	7,7\pm0,6
GVG/cocaína	7,5\pm0,7	7,5\pm0,7
Sol. salina/alimentos	9,3\pm0,7	5,7\pm0,7
GVG (150 mg/kg)/alimentos	9,4\pm0,4	5,6\pm0,5
GVG (300 mg/kg)/alimentos	9,0\pm0,5	6,0\pm0,5
^{1} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara \pm S.E.M.
^{2} Los animales verificados fueron inyectados solamente con solución salina.

La administración de 150 ó 300 mg/kg de GVG no alteró la respuesta de CPP, como se muestra en la Tabla 11, a pesar de atenuar los efectos de motivación incentiva de cocaína en los experimentos de CPP anteriormente indicados, como se muestra en las Tablas 3-10 anteriores.

Discusión de los resultados experimentales obtenidos en los Ejemplos 1, 2 y 3

En los estudios de PET previos, se mostró que el GVG solo reduce las concentraciones de DA extracelular, dio lugar a un aumento de la unión de [C^{11}]-racloprida en el cerebro de primates (Dewey et al., 1992). En los estudios de PET de la presente invención, las disminuciones inducidas por GVG en los niveles de DA extracelular antes de la administración de cocaína claramente sirven de base a la atenuación de los efectos de la cocaína observados en el grupo 3 de la Tabla 1. Sin embargo, los valores aparentemente iguales encontrados para los grupos 1 y 3, combinados con los descubrimientos previos de los inventores usando GVG solo (Dewey et al., 1992) indican que la cocaína aumentó los niveles de DA extracelular en la presente invención a pesar de la administración de GVG, pero solamente para valores de referencia.

Sin embargo, basado en los datos de CPP presentados en la presente memoria descriptiva, este retorno al valor de referencia inducido por cocaína era aparentemente insuficiente para producir efectos de motivación incentiva. Los resultados de los inventores indican que la cocaína producía una respuesta de CPP. Por el contrario, los emparejamientos con vehículo no produjeron una respuesta de CPP, indicando que los animales no exhibieron una preferencia de cámara, es decir, el aparato es insesgado. Además, la respuesta de CPP a la cocaína era dependiente de la dosis, y la respuesta más fiable y consistente se producía a la dosis de cocaína de 20 mg/kg.

La administración de 112, 150, 300 mg/kg pero no 75 mg/kg de GVG bloqueó la adquisición y expresión de la respuesta de CPP provocada por cocaína. Por el contrario el GVG, cuando se emparejó con solución salina, no produjo una CPP o respuesta aversiva. Esto indica que el bloqueo de la CPP a cocaína por GVG no estaba relacionado con el hecho de que el GVG provocara una repuesta aversiva o de apetencia por sí mismo. Los resultados de la invención presentados en el Ejemplo 2 indicaban que el alimento provoca un efecto incentivo o de satisfacción. La administración de 150 ó 300 mg/kg de GVG no alteró la respuesta de CPP a los alimentos, a pesar de atenuar los efectos incentivos de la cocaína. Este descubrimiento sugiere que el GVG atenúa específicamente los efectos de satisfacción/incentivos de la cocaína.

Ejemplo 4 Actividad Locomotora y estudios de catalepsia en roedores de laboratorio

En este ejemplo se siguieron los procedimientos indicados en la Sección 4 y 5 de Materiales y métodos. Aunque está ampliamente aceptado que el paradigma CPP diferencia efectos de motivación incentiva respecto a efecto motores, no obstante se valoraron los efectos de GVG sobre locomoción y catalepsia en ratas. Se encontró que un pretratamiento con GVG a dosis de 150 mg/kg o 300 mg/kg no alteró la actividad locomotora en comparación con testigos previamente tratados de solución salina, como se muestra en las Figuras 3a y 3b. Además, el pretratamiento con GVG a dosis de 150 mg/kg o 300 mg/kg no indujo catalepsia en ratas. La duración de la capatepsia después de 300 mg/kg de GVG fue de 1,1 + 0,4 segundos (n=10), que no era significativamente diferente de 0,7 + 0,3 segundos (n=10) en ratas tratadas con solución salina. El valor n indica el número de roedores que fueron ensayados.

Ejemplo 5 Niveles de C^{11}-cocaína en roedores y primates

En este ejemplo se siguió el procedimiento indicado en la Sección 6 de Materiales y métodos. Con el fin de valorar la posibilidad de que GVG pudiera atenuar las acciones de cocaína alteryo su penetración en el cerebro, se examinó el efecto de solución salina y GVG sobre los niveles de [C^{11}]-cocaína en el cerebro completo de la rata y el primate. En roedores, los niveles de [C^{11}]-cocaína en el cerebro a continuación de la administración intraperitoneal de solución salina y 300 mg/kg de GVG fueron 0,110\pm0,03 y 0,091\pm0,02, respectivamente, que no diferían estadísticamente. En primates, el perfil farmacocinético de la unión a cocaína marcada en el neostriato no era significativamente diferente de la exploración del valor de referencia en términos tanto de absorción absoluta como de desaparición.

Ejemplo 6

En este ejemplo, se midieron los efectos de GVG sobre los cambios inducidos por nicotina en concentraciones de dopamina extracelular en ratas con libertad de movimientos. Se siguió el procedimiento indicado en la sección 7 de Materiales y métodos.

Se examinó un total de 8 ratas para cada emparejamiento de tratamiento. Los animales recibieron 4 emparejamientos durante un período de 8 días, un emparejamiento por día. Los animales recibieron 75 mg/kg de GVG 2,5 horas antes de recibir 0,4 mg/kg de nicotina. A los animales se les proporcionó GVG, seguidamente nicotina y se colocaron en la cámara apropiada en el día 1. En el día 2, a los animales se les proporcionó GVG, seguidamente solución salina y seguidamente se coloraron en la cámara apropiada. El protocolo de los días 1 y 2 se repitió 3 veces adicionales. Veinticuatro horas después de administrar el último emparejamiento, se permitió el libre acceso de los animales a aparato de estudio del comportamiento completo durante 15 minutos y se registró la cantidad de tiempo transcurrido en las cámaras con emparejamiento y sin emparejamiento usando un dispositivo automatizado. Los efectos de 75 mg/kg de GVG aplicados por vía intraperitoneal sobre la adquisición de CPP para nicotina por las ratas examinadas en este ejemplo se exponen en la Tabla XII siguiente.

TABLA XII Efecto de 75 mg/kg de GVG i.p. sobre la adquisión de preferencia de lugar condicionado para (-)-nicotina

	Tiempo transcurrido en cámaras (min.)^{1}
Emparejamientos de tratamiento	Emparejado	Sin emparejar^{2}
Nicotina 0,4 mg/kg, s.c./kg, s.c./vehículo^{3}	9,4\pm0,5	5,6\pm05,
75 g/kg GVG/nicotina, 0,4 mg/kg s.c.	6,4\pm0,3^{4}	8,6\pm0,3^{5}
^{1} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara \pm S.E.M.
^{2} Los animales verificados fueron inyectados solamente con solución salina.
^{3} El vehículo era 1 ml/kg de NaCl al 0,9% o solución salina.
^{4} \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente menor que el emparejamiento de nicotina/vehículo, p<0,01, ensayo ANOVA y Student-Newman-Keuls.\end{minipage}
^{5} \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente mayor que el emparejamiento de nicotina/vehículo, p<0,01, ensayo ANOVA y Student-Newman-Keuls.\end{minipage}

Los resultados de un experimento similar al resumido en la Tabla XII se muestran en la Figura 4. La figura 4 muestra que el GVG (150 mg/kg) bloquea los aumentos inducidos por nicotina de las concentraciones de dopamina en ratas con libertad de movimientos. Los círculos abiertos son animales testigos. Los círculos cerrados son de animales tratados con GVG 2,5 horas antes de la nicotina.

Ejemplo comparativo

Efectos de baclofeno sobre el uso de cocaína

Los resultados de los inventores obtenidos en los ejemplos 1, 2 y 3 eran congruentes con estudios previos que sugerían que el aumento de la función GABAérgica puede atenuar las acciones de satisfacción/refuerzo de la cocaína y otras drogas de abuso. Por ejemplo, se ha mostrado que usando el paradigma de la relación progresiva, el agonista GABA_{B} selectivo baclofeno producía una disminución dependiente de la dosis en los puntos de rotura para la administración intravenosa (i.v.) de cocaína en ratas Wistar machos, aunque no afecto a la velocidad de ingestión de droga. Estos resultados sugerían que el baclofeno atenuaba los efectos de refuerzo de la cocaína, ya que una disminución en el punto de rotura representa una disminución de la motivación para la auto-administración de cocaína.

Se ha propuesto también que el aumento de transporte de la función de receptora de GABA_{A} atenúa la auto-administración de cocaína, como clordiazepóxido y alprazolam, modeladores alostéricos positivos del complejo receptor de GABA_{A}, disminuía el ritmo de auto-administración de cocaína. Sin embargo, este efecto está probablemente relacionado con un aumento en el valor de refuerzo de cada dosis unitaria de cocaína, ya que el clordiazepóxido aumentará el punto de rotura para la auto-administración de cocaína sobre un esquema de relación progresiva.

Los descubrimientos con baclofeno fueron reforzados por un reciente estudio del mismo laboratorio que indica que el pretratamiento agudo de ratas con baclofeno (1,25-5 mg/kg i.p.) suprimirá la auto-administración de cocaína en un paradigma de ensayos discretos durante al menos cuatro horas, sin alterar significativamente la respuesta para un refuerzo de los alimentos. La microinyección de baclofeno en la zona segmental ventral ipsilateral respecto a un electrodo estimulante en el hipotálamo lateral de ratas produjo un desplazamiento hacia la derecha de la curva ritmo-intensidad de la corriente, indicando que el baclofeno atenuaba el valor de satisfacción de la estimulación eléctrica. Sin embargo, el baclofeno no afectó a la velocidad máxima de respuesta para la satisfacción por estimulación cerebral eléctrica ni los niveles de rendimiento no reforzados, sugiriendo que la acción del baclofeno no estaba relacionada con alteraciones en el rendimiento/destreza motores.

Un reciente estudio demostró que el GVG producía un aumento dependiente de la dosis en los umbrales de satisfacción de la estimulación cerebral en ratas F344 (Kushner et al., 1997b) sin efectos significativos sobre el rendimiento motor. La disminución en los umbrales de satisfacción de la estimulación cerebral producidos por 2,5 y 5 mg/kg de cocaína administrada por vía intraperitoneal fue significativamente antagonizada por una dosis de 400 mg/kg de GVG.

Finalmente, la respuesta CPP provocada por morfina (8 mg/kg) fue significativamente atenuada por una microinyección de baclofeno (0,1-1 mmol) en la zona segmental ventral, y este efecto fue antagonizada por el antagonista de GABA_{B} hidroxisaclofeno. Por tanto, a pesar de usar paradigmas diferentes para valorar la satisfacción/refuerzo, estos estudios indican que la activación de receptores de GABA_{B} atenuó el valor apetitivo de la cocaína, la morfina y la satisfacción de la estimulación cerebral eléctrica.

Previamente, se informó que el pretratamiento con el compuesto emulador de GABA progabida (que aumenta los niveles de GABA en el cerebro a través de su metabolismo para GABA), que solo no produce preferencia o aversión de lugar condicionada, no alteró la respuesta de CPP a 1,5 mg/kg i.p. de anfetamina. Sin embargo, es difícil comparar este descubrimiento con la presente invención, ya que había diferencias entre las cepas de ratas, compuestos GABAérgicos y drogas usadas para provocar la CPP. Debe apreciarse también que el progabida estuvo presente solamente durante 35 minutos. Como se ha mostrado que el aumento máximo de los niveles de GABA en el cerebro a continuación del progabida sistémico se produce cuatro-seis horas después de la inyección, los niveles de GABA no estaban en su valor máximo durante la determinación de CPP inducida por anfetamina.

Dada la evidencia que sugiere que el aumento de la función dopaminérgica en el sistema mesolímbico desempeña una función en la mediación de los efectos de satisfacción/refuerzo de la cocaína, la supresión de la respuesta de CPP a la cocaína por GVG puede estar relacionada con una alteración de la actividad/función dopaminérgica. Esta hipótesis está apoyada por un estudio de microdiálisis in vivo del solicitante que indica que la administración aguda (300 y 500 mg/kg i.p.) o repetida (100, 300 y 500 mg/kg i.p.) de GVG produjo una significativa disminución dependiente de la dosis en la elevación de los niveles de DA extracelulares en el NACC y el estriado producida por 20 mg/kg i.p. de cocaína (Dewey et al., 1998). Al mismo tiempo, es improbable que una alteración en la sensibilidad de los receptores de DA a continuación de la administración de GVG sea responsable de su atenuación de la acción de la cocaína, ya que es conocido que la administración repetida de GVG no altera la sensibilidad de los receptores D_{1} o D_{2} en el estriado de ratas. Sin embargo, no hay ninguna evidencia en lo que respecta a los efectos de GVG sobre otros receptores de DA (D_{3}, D_{4} y D_{5}). Alternativamente, es posible que la cocaína pueda alterar la función receptora de GABA_{B}, alterando así potencialmente la liberación de neurotransmisores como DA, y esto podría ser antagonizado por le GVG a través de la elevación de los niveles de GABA y la posterior estimulación de receptores de GABA_{B}.

Se ha mostrado también que la administración repetida de cocaína disminuye la eficacia de los auto- y hetero-receptores de GABA_{B} presinápticos en las neuronal del núcleo septal lateral en escisiones de cerebro de rata. Esto puede conducir a una acción desinhibidora y una liberación aumentada de neutrotransmisores. Es posible también que el baclofeno pueda atenuar la acción de DA y esto atenuaría las acciones de la cocaína. Esto está indirectamente apoyado por los descubrimientos de Lacey et al. (1988), mostrando que en los registros intracelulares de neuronas compactas de la zona de sustancia negra de ratas, las corrientes hacia fuera provocadas por DA eran ocluidas por corrientes máximas producidas por el baclofeno.

Son posibles diversas interpretaciones de los presentes resultados. En primer lugar, es posible que el GVG pueda aumentar el metabolismo de la cocaína, disminuyendo así la cantidad que alcanza el cerebro y disminuyendo posteriormente sus efectos neuroquímicos y finalmente sus acciones de comportamiento. Sin embargo, esto es improbable ya que los niveles en el cerebro de C^{11}-cocaína no estaban significativamente alterados en ratas o primates previamente tratados con GVG (300 mg/kg). Además de ello, la cocaína es principalmente metabolilzada por colinesterasas de plasma, mientras que el GVG es excretado principalmente sin cambiar en la orina, haciendo improbable una interacción farmacocinética.

Se ha descrito que las drogas que aumentan la función GABAérgica pueden producir sedación y ataxia. Consecuentemente, es razonable plantear que el GVG, produciendo estos efectos adversos de comportamiento, pueden antagonizar de forma no específica la acción de la cocaína. Sin embargo, los resultados en el presente estudio indican que el GVG no produce catalepsia ni altera significativamente la actividad locomotora, haciendo insostenible esta hipótesis. Además de ello, los ejemplos expuestos anteriormente muestran que el GVG no produce una aversión de lugar condicionada, indicando que su antagonismo de la acción de la cocaína no es el resultado de una acción aversiva desequilibrante. Además, el GVG no provoca CPP solo, indicando que no está alterando la preferencia de los animales desde el entorno emparejado con cocaína al emparejado con GVG.

Se ha mostrado que la administración de GVG puede alterar el consumo de alimentos en ratas. Basándose en esto, es posible que el GVG pueda disminuir o atenuar el valor hedonista de las satisfacciones naturales, así como los provocados por la cocaína. Sin embargo, el presente estudio muestra que ni 150 ni 300 mg/kg de GVG alteran el CPP para los alimentos.

Hay una evidencia que indica que el comportamiento en el paradigma de preferencia de lugar condicionado (CPP) depende de las propiedades tanto afectivas como mejoradoras de la memoria de los reforzadores bajo ensayo. Por lo tanto, se puede alegar que el bloque de GVG de la expresión y adquisición de la CPP inducida por cocaína es el resultado de que el GVG interfiere con la asociación del valor incentivo positivo inducido por cocaína con los estímulos apropiados, interfiriendo con la memoria. De hecho, es conocido que ciertas drogas que aumentan la función GABAérgica pueden dificultar la memoria. Sin embargo, el GVG no afecta al condicionamiento de lugar para alimentos, sugiriendo que esta hipótesis no puede explicar el antagonismo del GVG de la acción de la cocaína en el paradigma de CPP.

Se ha encontrado que las dosis de 112, 150 y 300 mg/kg de GVG antagonizan la adquisición y expresión de CPP inducida por cocaína. Por el contrario, el GVG no provocó una CPP ni condicionó una respuesta de aversión al lugar, indicando que el GVG no antagoniza la acción de la cocaína produciendo una respuesta de CPP sola o atenuando la CPP mediante la producción de un efecto aversivo. Hay una evidencia de que los estímulos o indicios relacionados con la cocaína restablecerán el comportamiento de búsqueda de drogas y la apetencia en adictos a cocaína desintoxicados, conduciendo así a la recaída. La expresión de la CPP respecto a la cocaína, determinada en ausencia de cocaína, está antagonizada por GVG. Estos resultados indican que la apetencia experimentada por los adictos a cocaína puede ser atenuada por GVG.

La transmisión dopaminérgica en el NACC ha estado específicamente implicada en las propiedades reforzantes de la cocaína. En los estudios de PET anteriormente expuestos, se hicieron mediciones en el cuerpo estriado en lugar de el NACC. Aunque la neurotransmisión de DA en el cuerpo estriado no ha estado implicada en la satisfacción y el refuerzo de la cocaína, los efectos de la cocaína sobre los niveles de DA extracelular son cualitativamente similares en ambos sectores. Además, los estudios de microdiálisis in vivo de los inventores demostraron que la capacidad de GVG para atenuar los aumentos inducidos por cocaína en los niveles de DA extracelular hasta un alcance similar en ambos sectores (Dewey et al., 1997; Morgan y Dewey, 1998).

En la presente invención, se usaron dos especies diferentes de roedores para realizar experimentos de formación de imágenes y de comportamiento. Sin embargo, el sistema de DA mesocorticolímbico es neuroanatómicamente y neurofisiológicamente homólogo en las dos especies. Además, los efectos bioquímicos de la cocaína sobre la DA extracelular, medidos mediante técnicas de microdiálisis in vivo, son análogos en las dos especies, y los dos roedores y primates se auto-administran fácilmente cocaína (Morgan et al., 1998).

Basándose en los resultados experimentales de la presente invención, se supone que el bloqueo de los comportamientos en el paradigma de CPP era debido a una atenuación de los efectos de la cocaína sobre la DA cerebral secundaria a los aumentos inducidos por GVG en la inhibición GABAérgica del sistema de DA mesocortocolímbico.

El GVG ofrece la ventaja conceptual de bloquear los efectos incentivos de motivación y bioquímicos sobre la DA cerebral inhibiendo irreversiblemente GABA-T, haciendo que la nueva síntesis relativamente lenta de esta enzima sea la etapa determinante de la velocidad en la inversión de la inhibición de los efectos de la cocaína. Un informe de un caso reciente de un consumidor abusivo de cocaína sugiere que la gabapentina, un anticonvulsivo que potencia también la transmisión GABAérgica a través de mecanismos desconocidos, atenuaba la retirada y la apetencia de cocaína. Tomados conjuntamente, estos datos indican que las drogas selectivamente dirigidas a diana en el sistema GABAérgico pueden ser ventajosas para el tratamiento de la adicción a la cocaína. Más específicamente, la inhibición de GABA-T inducida por GVG, que produce un aumento en los niveles de GABA cerebral extracelular, representa un fármaco efectivo y una estrategia nueva par el tratamiento de la adicción a la cocaína.

Ejemplo 7

El fenómeno de la sensibilización es observado virtualmente con todas las drogas de adicción. La sensibilización se cree que desempeña una función en la etiología de la adicción. En este ejemplo, el efecto de la solución salina y 150 mg/kg i.p. de GVG sobre la expresión del comportamiento estereotípico inducido por cocaína a continuación de un régimen de sensibilización de cocaína fue medido en diez ratas con libertad de movimientos.

Los animales recibieron 15 mg/kg i.p. de cocaína y la estereotipia se determinó en jaulas de locomoción estándar. Durante 6 días consecutivos, los animales recibieron 15 mg/kg i.p. de cocaína una vez al día en sus jaulas de alojamiento. Ocho días después, los animales fueron nuevamente estimulados con 15 mg/kg i.p. de cocaína y se determinó la estereotipia. Se usó una escala de valoración de cinco puntos para valorar la estereotipia y la persona encargada de la valoración no tenía ningún conocimiento del tratamiento recibido por cada animal. Se apreció que el GVG suprimía la expresión de la sensibilización inducida por cocaína a una dosis de 150 mg/kg i.p., cuando era administrado 2,5 horas antes de la estimulación con cocaína. Los resultados se muestran en la Tabla XIII siguiente.

TABLA XIII Efecto de solución salina y 150 mg/kg i.p. de GVG sobre la expresión de estereotipos inducidos por cocaína a continuación de un régimen de sensibilización de cocaína

Puntuación de estereotipia	Tratamiento 2 h antes de medir	Estereotipias en el día 15
en el día 1	la puntuación de estereotipia
2,5\pm0,4	1 ml/kg i.p. de NaCl al 0,9%	4,1\pm0,5
2,9\pm0,4	150 mg/kg i.p. de GVG	2,3\pm0,6
* Significativamente mayor que en el día 1, p<0,05, ensayo de Student

Los siguientes experimentos estaban diseñados para determinar los efectos de GVG sobre los aumentos inducidos por nicotina en DA del NACC así como sobre los comportamientos asociados con este efecto bioquímico. Específicamente, este se realizó a través de: 1) usar microdiálisis in vivo en animales desprovistos de sistema inmune y crónicamente tratados con nicotina para medir los efectos de GVG y nicotina sobre la DA del NACC extracelular; 2) usar tomografía de emisión de positrones (PET) para medir el efecto de GVG sobre las disminuciones inducidas por nicotina en la unión de C^{11}-racloprida en el estriado de babuinos hembras anestesiados y 3) examinar el efecto de GVG sobre la CPP inducida por nicotina.

Ejemplo 8 Efectos de GVG sobre aumentos inducidos por nicotina en DA del NACC 1. Estudios de microdiálisis en roedores

En este ejemplo, se usó nicotina como la droga adictiva. En los animales del (Grupo 1), la nicotina (0,4 mg/kg, s.c.) fue administrada 2,5 horas después del GVG (75, 90, 100 ó 150 mg/kg, i.p.). En una serie separada de experimentos (Grupo 2), los animales fueron tratados durante 21 días con nicotina (0,4 mg/kg, s.c., dos veces al día). En el día del estudio, se administró GVG (100 mg/kg) 2,5, 12 ó 24 horas antes de la estimulación con nicotina (0,4 mg/kg, s.c.). En todos los estudios, los animales fueron colocados en los cuencos de microdiálisis la noche anterior al experimento y fue perfusionado fluido cerebroespinal artificial (ACSF) a través de las sondas de microdiálisis a un caudal de 2,0 µl/min. Al final de cada estudio, los animales fueron sacrificados y sus cerebros fueron extirpados y seccionados para una verificación de colocación de sondas.

En los animales del Grupo 1, la nicotina aumentó las concentraciones de DA extracelular en el NACC en aproximadamente 100%, 80 minutos después de la administración (Figura 5A). Es decir, los niveles de DA se elevaron hasta aproximadamente 200% de los niveles basales. El GVG en el modo dependiente de la dosis inhibieron este aumento, como se muestra en la Figura 5A. A 75 mg/kg, el GVG no tuvo ningún efecto sobre los aumentos inducidos por nicotina en DA, mientras que a 90 mg/kg, el GVG inhibió los aumentos de DA en aproximadamente 50% y a 100 mg/kg, suprimió completamente cualquier aumento de DA. La dosis más elevada de 150 mg/kg suprimió completamente los efectos también (datos no mostrados). De apreciación particular es el descubrimiento de que a las tres dosis superiores (90, 100 o 150 mg/kg, el GVG rebajó los niveles de DA basales antes de la administración de nicotina. La dosis más baja (75 mg/kg) no tuvo ningún efecto sobre los niveles de DA basales y posteriormente ningún efecto sobre la capacidad de la nicotina para elevar el DA del NACC extracelular.

En los animales del Grupo 2, la nicotina aumentó los niveles de DA del NACC extracelular dentro del mismo período de tiempo y hasta el mismo alcance medido en los animales del Grupo 1 (aproximadamente 100% por encima del valor de referencia, Figura 5B). Análogamente a los descubrimientos en el Grupo 1, cuando se administró 2,5 horas antes de la administración de nicotina, el GVG (100 mg/kg) suprimió completamente los aumentos inducidos por nicotina en DA extracelular. Sin embargo, cuando se administra 12 horas antes de la estimulación, la nicotina aumentó los niveles de DA extracelular aproximadamente 25% por encima de los valores de referencia (Figura 5B). En los animales del Grupo 2 que recibieron GVG 24 horas antes de la estimulación con nicotina, los niveles de DA extracelular aumentaron hasta valores similares a los medidos en animales testigos (Figura 5B). De forma congruente con los descubrimientos previos de los inventores (Dewey et al., 1997), el GVG no alteró la actividad locomotora gruesa durante el intervalo de pretratamiento de 2,5 horas. Sin embargo, la nicotina aumentó la actividad locomotora gruesa en todos los animales independientemente de la dosis de GVG que recibieran.

Ejemplo 9 2. CPP inducida por nicotina en roedores Descripción del aparato de CPP

El aparato de CPP estaba hecho completamente de plexiglás, excepto para el suelo en una de las cámaras de emparejamiento, que estaba hecho de una placa de acero inoxidable con orificios (0,5 mm de diámetro) separado 0,5 mm de un borde a otro. Las dos cámaras de emparejamiento diferían en los indicios visuales y táctiles. Una cámara era completamente azul claro con el suelo de acero inoxidable la segunda cámara era azul claro con tiras negras horizontales (2,5 cm de ancho) separadas en 3,8 cm con un suelo de plexiglás suave. Las dos cámaras de emparejamiento estaban separadas por un tercer túnel de conexión (10 x 14 x 36 cm) con paredes de plexiglás claras y un suelo de plexiglás. Los indicios visuales y táctiles eran equilibrados, de forma que no se exhibiera ninguna preferencia lateral significativa por los animales antes del condicionamiento.

El efecto de GVG sobre la expresión de CPP en roedores

El procedimiento de condicionamiento consistió en 20 sesiones llevadas a cabo consecutivamente durante 20 días. Loas tres primeras sesiones fueron sesiones de habituación, durante las cuales los animales fueron manejados durante 5 minutos por día y expuestos a las vistas y sonidos del entorno del ensayo. Esto estuvo seguido de 16 sesiones de 8 emparejamientos con 1) vehículo/vehículo (1 ml/kg i.p. de solución salina al 0,9%, n=10 animales) o 7 grupos de solución salina-nicotina (0,4 mg/kg s.c.) con 10 animales en cada grupo. La mitad de los animales en cualquier grupo de ensayo recibió nicotina antes de la exposición a la cámara azul y la otra mitad recibió solución salina antes de la exposición a la cámara azul y con tiras negras. Los animales que recibieron vehículo o nicotina fueron inyectados y confinados en el compartimento apropiado durante 30 minutos a través de puertas de plexiglás de tipo guillotina para bloquear el acceso al resto de la cámara. La sesión final (día 20) fue una sesión de ensayos, en la que los animales recibieron uno de los siguientes tratamientos 30 minutos antes del experimento: 1) solución salina o 2) GVG (18,75, 37,5, 75 ó 150 mg/kg i.p.). Las entradas a las dos cámaras de emparejamiento estaban abiertas, y se permitió que los animales se movieran libremente entre las 3 cámaras durante 15 minutos. La cantidad de tiempo transcurrido en cada cámara se registró usando un haz infrarrojo electrónicamente acoplado a un cronómetro.

El efecto de GVG sobre la adquisición de CPP

Los animales fueron habituados como se describió anteriormente. A los animales se les proporcionó solución salina o GVG (37,5 y 75 mg/kg i.p.) 2,5 horas antes de que los animales recibieran nicotina. Posteriormente, los animales fueron colocados entonces en la cámara apropiada durante 30 minutos. Esto se repitió para 8 emparejamientos durante un período de 16 días. En el día del ensayo, los animales fueron colocados en el aparato de CPP y se les permitió libre acceso a todas las cámaras de CPP y se registró la cantidad de tiempo transcurrido en cada cámara.

La administración de solución salina no produjo una preferencia de cámara. Sin embargo, la nicotina (0,4 mg/kg s.c.) produjo una respuesta de CPP estadísticamente significativa y fiable cuando los animales pasaron 9,6 + 0,6 minutos en el lado emparejado (nicotina) en comparación con 5,4 + 0,6 minutos en el lado sin emparejar (solución salina) (Tablas XIV y XV). Un análisis estadístico de los datos de expresión indicaron un efecto del tratamiento (F(5,50=21,6, p<0,001). Un análisis realizado con posterioridad puso de manifiesto que el GVG a dosis de 18,75, 37,5, 75,0 o 150 mg/kg pero sin solución salina, suprimió la fase de expresión de CPP inducida por nicotina
(Tabla XIV).

Un análisis de los datos de adquisición indicó un efecto del tratamiento (F(3,32)=11,1, p<0,05). Un análisis realizado con posterioridad indicó que el GVG (37,5 mg(kg) no bloqueó significativamente la adquisición de CPP inducida por nicotina (Tabla XV). Por el contrario, a una dosis de 75 mg/kg, el GVG bloqueó significativamente la fase de adquisición de CPP inducida por nicotina (Tabla XV).

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TABLA XIV Efecto de solución salina y GVG sobre la expresión de la respuesta de preferencia de lugar condicionado a 0,4 mg/kg s.c. de (-)-nicotina

Emparejamientos de tratamiento	Droga proporcionada en	Tiempo transcurrido en las
	el día del ensayo	cámaras (min.) emparejadas
Sol. salina/sol. salina	Sol. salina^{2}	7,4\pm0,3^{1}	7,6\pm0,3
Sol. salina/nicotina	Sol. salina	9,6\pm0,6	5,4\pm0,6
Sol. salina/nicotina	GVG, 18,75 mg/kg^{3}	7,5\pm0,7*	7,5\pm0,7
Sol. salina/nicotina	GVG, 37,5 mg/kg	6,8\pm1,0**	8,2\pm1,0
Sol. salina/nicotina	GVG 75 mg/kg	6,4\pm0,3**	8,6\pm0,3
Sol. salina/nicotina	GVG 150 mg/kg	5,0\pm0,9**	10,0\pm0,9
^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara\pm S.E.M. Se examinó un total de 8-10 ratas para cada emparejamiento de tratamiento. Todos los animales recibieron 8 emparejamientos con nicotina y solución salina antes del día del ensayo. En el día del ensayo, los animales recibieron solución salina o GVG 2,5 horas antes de ser colocados en el aparato de CPP.\end{minipage}
^{2} La solución salina era 1 ml/kg s.c. de solución salina al 0,9%.
* \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente menor que el emparejamiento de solución salina/nicotina con solución salina en el día del ensayo, p<0,05, ensayo ANOVA y Student-Newman-Keuls.\end{minipage}
** \begin{minipage}[t]{152mm} Significativamente menor que el emparejamiento de solución salina/nicotina con solución salina en el día del ensayo, p<0,01, ensayo ANOVA y Student-Newman-Keuls.\end{minipage}

TABLA XV Efecto de solución salina y GVG sobre la adquisición de la respuesta de preferencia de lugar condicionado para 0,4 mg/kg s.c. de (-)-nicotina

Emparejamientos de tratamiento	Tiempo transcurrido en cámaras (min.)
	Emparejado	Sin emparejar
Sol. salina/sol. salina^{2}	7,3\pm0,3^{1}	7,7\pm0,3
Sol. salina/nicotina	9,6\pm0,6^{1}	5,4\pm0,6
Nicotina/GVG, 37,5 mg/kg i.p.	8,8\pm0,5	6,2\pm0,5
Nicotina/GVG, 75 mg/kg i.p.	6,9\pm0,9*	8,1\pm0,9
^{1} \begin{minipage}[t]{154mm} Cada valor representa el número medio de minutos transcurridos en cada cámara\pm S.E.M. Se examinó un total de 8-10 ratas para cada emparejamiento de tratamiento. Los animales fueron previamente tratados con solución salina, 37,5 o 75 mg/kg i.p. de GVG y 2,5 horas más tarde, cada animal recibió 0,4 mg/kg s.c. de nicotina, excepto para un grupo que recibió solución salina seguida de tratamiento con solución salina (emparejamiento de solución salina/solución salina). Se realizaron ocho emparejamientos con cada animal.\end{minipage}
^{2} La solución salina era 1 ml/kg s.c. de solución salina al 0,9%.
* \begin{minipage}[t]{153mm} Significativamente menor que el emparejamiento de solución salina/nicotina con solución salina en el día del ensayo, p<0,05, ensayo ANOVA y Student-Newman-Keuls.\end{minipage}

Estudios de PET en primates

Se usaron babuinos hembras adultos (n=16) (Paiio anubis, 13-18 kg) para todos los estudios de formación de imágenes y racloprida marcado con carbono-11 (C^{11}-racloprida). Los animales fueron colocados en 5 grupos como se destalla en la Tabla XVI. Los animales testigos (Grupo 1) recibieron dos inyecciones de C^{11}-racloprida sin ninguna intervención de drogas con el fin de determinar la variabilidad de ensayo/nuevo ensayo de la medición. Estos datos han sido descritos previamente (Dewey et al., 1998). Los animales del Grupo 2 recibieron GVG solo (300 mg/kg) 2,5 horas antes de la segunda inyección de C^{11}-racloprida. En los estudios combinados de GVG/nicotina, el GVG fue administrado por vía intravenosa (i.v.) a dosis de 100 (Grupo 4) o 300 mg/kg (Grupo 5) 2,5 horas antes de la administración de nicotina. La nicotina (0,3 mg total, i.v.) fue administrada 30 minutos antes de la segunda inyección de C^{11}-racloprida. Se obtuvieron muestras de sangre arterial durante todo el estudio y las muestra de plasma seleccionadas fueron analizadas en cuanto a la presencia de C^{11}-racloprida sin cambiar. Los animales no fueron retirados de la jaula entre las inyecciones de isótopos. Se realizó un análisis de datos usando el método de Logan, como se detalló previamente (Logan et al., 1990).

Cada primate (n=16) recibió dos inyecciones de C^{11}-racloprida. La primera sirvió como un valor de referencia para la segunda que siguió a GVG, nicotina, o ambas. Los primates del ensayo/nuevo ensayo (n=7, Grupo 1, Tabla XVI) recibieron placebo (solución salina al 0,9%, 1 ml/kg) 30 minutos antes de la segunda inyección de radiomarcador para determinar la variabilidad del ensayo/nuevo ensayo del método. Todos los primates restantes (n=9) recibieron una inyección sistémica de GVG, nicotina o ambos antes de la segunda inyección de [C^{11}]-racloprida.

Como se describió previamente (Dewey et al., 1998), la variabilidad de la relación del volumen de distribución (DV) medio de ensayo/nuevo ensayo de racloprida marcado en el estriado del primate era ligeramente mayor que 7% (Tabla XVII). La administración de GVG (300 mg/kg, Grupo 2) aumentó significativamente la relación de DV media en 18% (Tabla XVII). Estos datos son congruentes con los estudios de microdiálisis que demuestran que la DA extracelular disminuye de forma dependiente de la dosis de GVG en animales con libertad de movimientos. Sin embargo, la administración de nicotina (Grupo 3) produjo el efecto opuesto del GVG y redujo significativamente la relación de DV media en 12% (Tabla XVII). Esto es nuevamente congruente con los datos de microdiálisis de los solicitantes que demuestran que la nicotina aumenta la DA extracelular en animales con libertad de movimientos. Cuando se administra de forma secuencia, el GVG (100 mg/kg, Grupo 4) suprimió la disminución en la relación de DV media producida por nicotina sola (Grupo 3). A esta dosis de GVG, la relación de DV media era similar a la del valor de ensayo/nuevo ensayo obtenido en los animales del Grupo 1 (9%, Tabla XVII). Sin embargo, cuando se administró a una dosis de 300 mg/kg (Grupo 5), la relación de DV media para racloprida marcado fue significativamente mayor (15%) que los valores de ensayo/nuevo ensayo y fue de hecho similar a los valores obtenidos en los animales del Grupo 2 que recibieron GVB solo (Tabla XVII).

Se apreció que el GVG, la nicotina o ambos no alteraron la velocidad de metabolismo sistémico de racloprida marcado ni la distribución regional del radiomarcador. La recuperación de cada estudio fue poco considerable.

TABLA XVI Grupos para estudios de PET en primates

Grupo	Condición
1	Ensayo/nuevo ensayo (sin estimulación)
2	GVG (300 mg/kg)
3	Nicotina (0,3 mg)
4	GVG (100 mg/kg), nicotina (0,3 mg)
5	GVG (300 mg/kg), nicotina (0,3 mg)

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TABLA XVII Efectos de estimulación con droga sobre la relación de DV media

Grupo	% de cambio en relación de DV media
1	7,16\pm1,2
2	18,8\pm3,2
3	-12,3\pm2,6
4	9,45\pm2,1
5	15,1\pm2,8

Discusión de los resultados experimentales obtenidos en el Ejemplo 9

En este ejemplo, se demostró que la nicotina (0,4 mg/kg, s.c.) aumentaba la DA del NACC en aproximadamente 100% (o 200% por encima del valor de referencia) en animales con libertad de movimientos aproximadamente 80 minutos a continuación de la administración. Estudios previos de microdiálisis han informado que la administración de nicotina a dosis de 0,6 o 0,8 mg/kg (s.c.) produjo un aumento de 220% y 179% en los niveles de DA extracelular en el NACC, respectivamente (Di Chiara y Imperato, 1988; Imperato et al., 1986; Brazell et al., 1990). Aunque no son directamente comparables, los resultados de los inventores están claramente en línea con estos descubrimientos anteriores. Además de ello, en los animales de la invención expuestos crónicamente a nicotina, una estimulación con nicotina produjo un aumento de 90% en los niveles de DA del NACC extracelular. Este descubrimiento es congruente con datos previos que indican que la administración crónica de nicotina no produce tolerancia ni sensibilización para una estimulación aguda con nicotina (Damsma et al., 1989).

Con respecto a los descubrimientos de los inventores usando GVG, se demostró que inhibía de forma dependiente de la dosis los aumentos inducidos por nicotina de DA del NACC en animales tanto desprovistos del sistema inmune como tratados crónicamente con nicotina. Este es el primer estudio que informa de esta acción del GVG. A una dosis de 75 mg/kg, el GVG no tuvo ningún efecto ya que la nicotina aumentó en la DA extracelular en casi 200%, mientras que una dosis de 90 mg/kg produjo una inhibición de casi 50%. En las dos dosis más elevadas examinadas 8100 y 150 mg/kg), el GVG suprimió completamente los aumentos inducidos por nicotina en los niveles de DA del NACC extracelular. Previamente, se demostró que una inyección aguda de GVG (300 mg/kg i.p.) produjo una disminución de 25% en los aumentos inducidos por cocaína en DA del NACC (Dewey et al., 1998). Sin embargo, un tratamiento crónico con GVG, a una dosis similar, produjo una inhibición mayor (Morgan y Dewey, 1998). Conjuntamente, esto datos muestran que la dosis de GVG necesaria para atenuar significativamente los aumentos inducidos por drogas en niveles de DA del NACC depende no solamente de la droga de estimulación usada (por ejemplo, cocaína o nicotina) sino también de la dosis a la que es administrada la droga de estimulación.

Los presentes datos demuestran adicionalmente que la eficacia de GVG está relacionada con su capacidad dependiente de la dosis para rebajar las concentraciones de DA basal antes de la estimulación con drogas. Por ejemplo, la dosis de 75 mg/kg no tuvo ningún efecto sobre la DA basal ni cobre los aumentos inducidos por nicotina en DA. Sin embargo, a una dosis de 90 ó 100 mg/kg, el GVG rebajó los niveles de DA basales y redujo en 50% o suprimió los efectos dela nicotina, respectivamente. Por lo tanto, parece que la atenuación dependiente de la dosis de aumentos inducidos por nicotina o cocaína en DA del NACC es debida a la disminución previa de las concentraciones basales de DA, posteriores a un aumento de GABA endógeno producido por GVG. Esto es congruente con datos que indican que un aumento de la función GABAérgica reduce la DA en el NACC.

En una extensión de un trabajo previo de los inventores con GVG y cocaína, se examinó el transcurso temporal de los efectos de GVG sobre los aumentos inducidos por nicotina en DA del NACC en animales crónicamente tratados con nicotina durante 21 días. Cuando se administró antes de la nicotina a una dosis de 100 mg/kg, el GVG suprimió completamente los aumentos inducidos por drogas en DA del NACC. Sin embargo, cuando se administró a la misma dosis 12 horas antes de la estimulación, la nicotina aumentó la DA extracelular en aproximadamente 25%.

El GVG no tuvo ningún efecto sobre los aumentos inducidos por nicotina en DA del NACC, cuando fue administrado 24 horas antes de la estimulación con nicotina a la misma dosis. Claramente, los datos de microdiálisis y comportamiento de los inventores muestran que incluso cambios pequeños en la inhibición de GABA-T producidos por dosis crecientes de GVG tenían un efecto profundo sobre la inhibición de elevaciones inducidas por nicotina en DA del NACC y CPP, respectivamente.

Estos datos son particularmente interesantes considerando la velocidad de síntesis de GABA-T, la semi-vida de GVG en el cerebro de los roedores, la duración del efecto sobre GABA y la marcada curva de respuesta a la dosis detallada en la presente memoria descriptiva. Los descubrimientos previos demuestran que la semi-vida biológica de GABA-T en el cerebro de los roedores es de 3,4 días, mientras que la semi-vida de GVG en el cerebro es de aproximadamente 16 horas. Además, los niveles totales de GABA en el cerebro no comienzan a disminuir hasta 24 horas a continuación de la administración aguada de GVG (Jung et al., 1977). La disparidad entre los niveles sostenidos de GABA en el cerebro medidos 24 horas a continuación de una dosis única de GVG y la respuesta normal a la estimulación con nicotina observados para el mismo valor del tiempo sugieren que la inhibición GABAérgica de la trayectoria de satisfacción mesotelencefálica puede no ser una simple reflexión de los niveles totales de GABA en el cerebro. Es decir, aunque los niveles totales de GABA en el cerebro son todavía significativamente elevados 24 horas después de una dosis aguda de GVG, pequeñas diferencias funcionales en las trayectorias específicas pueden ser enmascaradas por estas mediciones globales. Finalmente, se puede suponer que los receptores de GAB hayan resultado insensibles a GABA durante el período de 24 horas, sin embargo, no se tuvo constancia de ninguna evidencia en el sistema de GABA que pudiera apoyar esta hipótesis.

En el presente estudio, se demostró que 8 emparejamientos de solución salina-nicotina produjeron una respuesta de CPP fiable. Los resultados de los inventores están de acuerdo con estudios previos que indicaban que la nicotina (0,1-1,2 mg/kg s.c.) produce una dependencia de la dosis en la respuesta de CPP de animales Sprague-Dawley machos (Fudala et al., 1985; Fudalda y Iwamoto, 1986). Se mostró también que los animales Lewis, pero no los F344, muestran una respuesta de CPP a la nicotina después de 10 emparejamientos (Horan et al., 1997). Sin embargo, un informe previo ha mostrado que 4 emparejamientos de nicotina-vehículo no provocaron una respuesta de CPP en animales encapuchados machos (Clarke y Fibiger, 1987). Por tanto, parece que la CPP inducida por nicotina puede ser dependiente de las especies, aunque esto puede ser confuso por el hecho de que los estudios mencionados utilizaron un número diferente de emparejamientos. La respuesta de CPP inducida por nicotina descrita en el presente estudio es congruente con la noción de que la nicotina produce un efecto positivo sobre el comportamiento de motivación incentiva.

Estos datos, por primera vez, demuestran que el GVG puede bloquear los efectos bioquímicos y de comportamiento de la nicotina usando el paradigma de CPP. Los datos de CPP indican claramente que a una dosis tan baja como 18,75 mg/kg, el GVG suprime la expresión de la respuesta de CPP producida por la nicotina. Los datos de los inventores indicaron que una dosis de 75 mg/kg, pero no de 37,5 mg/kg, bloqueaba la adquisición de la respuesta de CPP a la nicotina. Basándose en estos descubrimientos, la dosis de GVG necesaria para el tratamiento del cese del consumo de tabaco puede ser de un total de 250-500 mg por día (en comparación con 2-4 gramos/día para la epilepsia), un intervalo considerablemente menor que el proporcionado a los epilépticos.

Los efectos de GVG sobre la CPP inducida por nicotina es improbable que estén relacionados con su capacidad de producir un efecto de satisfacción o aversivo, ya que previamente se mostró que el GVG solo 875-300 mg/kg i.p.) no produce CPP ni aversión (Dewey et al., 1998). Además de ello, es improbable que el GVG suprima las acciones de comportamiento de la nicotina interfiriendo con la actividad de memoria y locomotora, ya que el GVG no bloquea la satisfacción por alimentos ni la actividad locomotora a dosis tan elevadas como 300 mg/kg (Dewey et al., 1998).

Finalmente, se ha mostrado que el GVG no es auto-administrado por monos rhesus y los animales que son retirados de un tratamiento crónico con GVG no exhiben manifestaciones o síntomas de retirada (Takada y Yanagita, 1997). Por tanto, el GVG, al contrario que otras drogas usadas en la farmacoterapia de ciertas adicciones (por ejemplo, metadona o antabuse) no es en sí mismo adictivo y no produce efectos aversivos significativos.

La atenuación de la adquisición de la respuesta de CPP a la nicotina por GVG puede ser interpretada como una disminución en el valor incentivo positivo de la nicotina. Estos datos muestran que el GVG disminuye la probabilidad de que un animal adquiera la asociación de un efecto incentivo positivo a continuación de la administración de nicotina. De forma interesante, los resultados de los inventores indican que la dosis de GVG requerida para bloquear la fase de expresión de la respuesta de CPP producida por la nicotina era ¼ de la cantidad necesaria para bloquear la adquisición de la respuesta de CPP. Este descubrimiento es congruente con los datos previos de los inventores que indican que era necesaria una dosis superior de GVG para bloquear la adquisición, en oposición a la expresión de CPP para la cocaína (Dewey et al., 1998). La explicación para esta diferencia es desconocida. Como el GVG atenúa la expresión de la respuesta de CPP a la nicotina, esto demuestra que el GVG es decreciente en el comportamiento de búsqueda de droga del animal, ya que el animal ya ha adquirido el valor incentivo positivo de la droga.

Por tanto, los datos de los inventores muestran que el GVG puede ser más eficaz para bloquear las ansias de nicotina que en el bloqueo del valor incentivo positivo o acción de satisfacción de la nicotina. Finalmente, a la dosis más elevada ensayada, 150 mg/kg, el GVG produjo una respuesta aversiva significativa en el día del ensayo (Tabla XV) cuando los animales pasaron 5,0+0,9 en el lado emparejado (nicotina) y 10,0 + 0,9 minutos en el lado sin emparejar (solución salina). Estos datos sugieren que puede haber un efecto límite para el cual el GVG en dosis elevadas se hace aversivo para los animales tratados con nicotina y ensayados en un estado exento de drogas. Estos datos pueden tener implicaciones en el desarrollo de los límites de dosis que van a ser ensayados en ensayos clínicos en seres humanos.

Basándose en los conocimientos de los inventores del paradigma de CPP, los datos de los inventores apoyan los siguientes resultados. En el paradigma de CPP, los animales son ensayados, en un estado exento de drogas, para determinar si prefieren un entorno en el que previamente recibían nicotina en comparación con un entorno en el que previamente recibían solución salina. Si el animal, en un estado exento de drogas, escoge consistentemente el entorno previamente asociado con la nicotina, se extrae la conclusión de que el valor apetitivo de la nicotina era codificado en el cerebro y es accesible en el estado exento de drogas (Gardner, 1997). De hecho, en el día del ensayo, la aproximación y asociación de los animales con el lado emparejado con droga pueden ser considerados un comportamiento de búsqueda de droga. En esencia, los estímulos ambientales y otros indicios que eran previamente neutros o no eran sobresalientes, se han convertido en sobresalientes a través de emparejamientos repetidos con nicotina. Posteriormente, cuando los animales son nuevamente expuestos a estos indicios, se produce una respuesta de CPP, es decir, los indicios pueden provocar el efecto de la droga. Por tanto, los indicios relacionados con la droga proporcionan una respuesta condicionada Pauloviana.

Esto es crítico ya que es conocido que los factores no farmacológicos, además de los farmacológicos, desempeñan una función en mediar el valor incentivo de las drogas de adicción (Jarvik y Henningfield, 1988). De hecho, se ha demostrado clínicamente que en adictos desintoxicados, la exposición a estímulos que estaban previamente asociados con el uso de drogas puede provocar la recaída (Childress et al., 1986a,b; Childress et al., 1988; Ehrman et al., 1992; O'Brien et al., 1992, Wikler, 1965). Por tanto, estos datos muestran que como el GVG bloquea la expresión de la respuesta de CPP inducida por nicotina, entonces el GVG bloquea las ansias o búsqueda de nicotina. Por lo tanto, el GVG es eficaz en el tratamiento de individuos que tienen un deseo de dejar de fumar cigarrillos. Estos datos muestran adicionalmente que el GVG es eficaz para suprimir la expresión de la respuesta de CPP a la nicotina y puede atenuar las ansias en la manifestación de indicios ambientales previamente asociados con el consumo de tabaco.

Los datos de PET en primates de los inventores son congruentes con descubrimientos previos que usaban múltiples estimulaciones farmacológicas que demuestran que la unión de C^{11}-racloprida es sensible tanto a aumentos como a disminuciones de DA sináptica (Dewey et al., 1993; Seeman et al., 1989). Como se pone de manifiesto en los animales del Grupo 3 (Tabla XVII), la relación de DV media estaba consistentemente disminuida con relación a los valores de referencia a continuación de la administración de nicotina. Esta disminución sobrepasó la variabilidad de ensayo/nuevo ensayo de racloprida marcado y es menor que la disminución medida con GBR-12909 (Dewey et al., 1993) o escopolamina (Dewey et al., 1993). El pretratamiento con GVG a una dosis de 100 mg/kg 2,5 horas antes de la nicotina produjo una relación de DCV media similar a los animales del Grupo 1 (Tabla XVII). Sin embargo, cuando la dosis de GVG se aumentó hasta 300 mg/kg, la relación de DV media se elevó hasta valores congruentes con los animales del Grupo 2. Estos datos muestran que la dosis inferior de GVG produjo una disminución en DA sináptica aproximadamente equivalente al aumento producido por la nicotina, mientras que la dosis superior de GVG produjo una disminución que excedió ampliamente la capacidad de la nicotina para aumentar la DA. Los estudios de microdiálisis de los inventores apoyan estos datos de que las dosis superiores de GVG producen una mayor disminución de DA extracelular en animales con libertad de movimientos.

Los descubrimientos de microdiálisis y PET combinados con los datos de CPP muestran que los aumentos de DA en el NACC solo son la base de la propensión adictiva a las drogas de abuso. En primer lugar, estos datos, combinados con los datos anteriores para la cocaína, muestran que los estudios de microdiálisis in vivo o las mediciones de PET de DA endógena sola no son necesariamente predictivos de la eficacia de las drogas usadas para tratar enfermedades que se creía que eran de naturaleza específica de neurotransmisores. En segundo lugar, tanto los datos de microdiálisis como los datos de PET demuestran claramente que a una dosis de 100 mg/kg, el GVG bloqueaba completamente los aumentos inducidos por nicotina en los niveles de DA en NACC, mientras que una dosis de 75 mg/kg no tuvo ningún efecto. Por el contrario, el GVG, a una dosis tan baja como 18,75 mg/kg, suprimió completamente la fase de expresión de CPP inducida por nicotina, mientras que fue necesaria una dosis de 75 mg/kg para suprimir la fase de
adquisición.

Basándose en la curva de respuesta a la dosis obtenida a partir de los datos de microdiálisis, el GVG a una dosis de 18,75 mg/kg no sería de esperar que tuviera ningún efecto sobre los aumentos inducidos por nicotina en la DA del NACC. Además de ello, se apreció un efecto similar usando cocaína en que una dosis de 300 mg/kg de GVG redujo los aumentos inducidos por cocaína en los niveles de DA del NACC en 25%, mientras que una dosis de 150 mg/kg suprimió completamente la fase de expresión y adquisición de CPP inducida por cocaína (Dewey et al., 1997; 1998).

Conjuntamente, estos datos sugieren al menos dos explicaciones plausibles y quizás combinadas. En primer lugar, los cambios diferenciales de DA a continuación de una estimulación farmacológica en zonas distintas del NACC solo pueden ser responsables de la propensión adictiva de una droga particular. De hecho, se ha informado que diversas drogas adictivas pueden alterar los niveles de DA en zonas del cerebro distintas del NACC incluidas las amígdalas, cuerpo estriado y corteza frontal (Hurd et al., 1997; Dewey et al., 1997; Di Chiara y Imperato, 1988; Marshall et al., 1997). En segundo lugar, los neurotransmisores distintos de la DA pueden desempeñar una función vital en la propensión adictiva de las drogas de abuso. Por ejemplo, una respuesta de CPP a la cocaína e todavía mantenida en ratones que carecen de los transportadores DA y 5-HT (Sora et al., 1998; Rocha et al., 1998). Además de ello, es conocido que neurotransmisores como 5-MT, acetilcolina, encefalinas y glutamatos, desempeñan una función en mediar los efectos de las drogas adictivas, incluida la nicotina (Bardo, 1998; Gardner, 1997). Tomados conjuntamente, estos datos muestran que el GVG inhibe los efectos de la cocaína y la nicotina a través de cambios de DA en zonas distintas del NACC. De forma concomitante, el GVG puede inhibir otros neurotransmisores que modula DA directamente o están ellos mismos involucrados en mediar los efectos de las drogas de adicción. Se siguen estudios adicionales diseñados a valorar los múltiples efectos de GVG sobre otros neurotransmisores.

Previamente, se demostró que la capacidad de GVG para atenuar los aumentos inducidos por cocaína en DA del NACC es completamente suprimida tratando previamente animales con el antagonista de receptores selectivos de GABAB SCH 50911 (Bolser et al., 1995), una droga que no altera significativamente los niveles de DA cuando se administra sola. Por lo tanto, se puede mostrar que el GVG suprime la acción dela nicotina a través de su aumento en los niveles de GABA, que posteriormente estimula los receptores de GABAB. Esto es congruente con datos que indican que la administración de baclofeno, un agonista selectivo de GABAB (Bowery y Partt, 1992; Kerr et al., 1990) en el VTA atenúa significativamente la respuesta de CPP en animales producidos mediante morfina sistémica (Tsuji et al., 1995). Además de ello, la administración sistémica de baclofeno atenúa la auto-administración de cocaína en una relación progresiva y un esquema de ensayos discretos (Roberts et al., 1996, 1997).

Se puede alegar que el GVG atenúa las acciones farmacológicas y de comportamiento dela nicotina simplemente alteryo la cantidad que entra efectivamente en el cerebro cambiyo la permeabilidad de la barrera sanguínea del cerebro o bien aumentando la velocidad sistémica del metabolismo de la nicotina. Esta posibilidad es improbable por un cierto número de razones. En primer lugar, el GVG no tuvo ningún efecto sobre el transporte en la barrera sanguínea del cerebro de C^{11}-cocaína, un alcaloide que se mostró previamente que aumentaba la DA del NACC, en el cerebro tanto de roedores como de primates. En segundo lugar, el GVG es excretado principalmente en la forma sin cambiar por los riñones (Grant y Hell, 1991; Porter y Meldrum, 1998), mientras que la nicotina es metabolizada por enzimas en el hígado. Finalmente, el GVG no interacciona con las enzimas microsomales hepáticas (Grant y Heel, 1991; Porter y Meldrum, 1998) y por tanto no induciría ni inhibiría estas enzimas.

El tamaño del NACC está bastante por debajo de la resolución a la que el tomógrafo de los inventores hace su análisis específico fuera de las capacidades de esta técnica. Por lo tanto, los análisis de los inventores incluían el cuerpo estriado, bilateralmente y el cerebelo. Marshall et al. (1995) han demostrado que la nicotina aumentaba la DA igualmente tanto en el NACC como en el cuerpo estriado, mientras que los datos de microdiálisis de los inventores demuestran que el GVG disminuye las concentraciones de DA igualmente en ambas zonas igualmente (Dewey et al., 1997). Estos datos de primates apoyan adicionalmente el uso de esta técnica de formación de imágenes para evaluar las consecuencias funcionales de los estímulos farmacológicos en el cerebro vivo intacto.

Además de ello, esta técnica de formación de imágenes médicas proporciona una ventana única en las interacciones que se ha mostrado que existen entre neurotransmisores funcionalmente asociados en el cerebro tanto de primates como de seres humanos.

En combinación con una bibliografía exhaustiva que apoya el principio fundamental de que los neurotransmisores interaccionan en los focos tanto funcionalmente específicos como regionalmente específicos, está resultyo cada vez más claro que pueden ponerse en práctica nuevas estrategias de tratamiento para los trastornos cerebrales (incluidas las adicciones a la cocaína, nicotina, heroína, metanfetamina y alcohol) con una conciencia más global de este principio global y bien documentado. Aunque los cambios en las concentraciones de neurotransmisores individuales pueden de hecho estar en la base de la etiología de un trastorno específico, es probable que el progreso de la enfermedad y el desarrollo de los síntomas estén unidos a cambios compensatorios o inducidos por la enfermedad en tros neurotransmisores funcionalmente unidos a la diana original. Con estos conocimientos, se han desarrollado nuevas estrategias de tratamiento específicamente diseñadas para alterar uno o más neurotransmisores dirigiendo otro a diana. Los descubrimientos de los inventores con nicotina, cocaína, metanfetamina, alcohol y GVG representan una gran utilidad para el tratamiento de mamíferos adictos a drogas de abuso.

Ejemplo 10 Efectos de GVG sobre los aumentos inducidos por metanfetamina en DA del NACC

En este ejemplo, se estudiaron los efectos de GVG sobre los cambios inducidos por metanfetamina sobre las concentraciones de dopamina en el NACC en 6-8 ratas con libertad de movimientos. Se administró metanfetamina a una dosis de 1,25 mg/kg i.p. y 2,5 mg/kg i.p. a los animales. Se apreció que la metanfetamina elevada las concentraciones de DA extracelular en el NACC en aproximadamente 2500% sobre los niveles basales, 100 minutos después de la administración de 2,5 mg/kg y aproximadamente 1500% sobre los niveles basales a continuación de la administración de 1,25 mg/kg (Figura 6). La DA volvió a los niveles basales aproximadamente 200 minutos después de la administración.

Cuando el GVG se administró antes de la administración de metanfetamina, el GVG inhibió de forma dependiente de la dosis el aumento de DA, como se muestra en la Figura 7. A 300 mg/kg, el GVG inhibió los aumentos de DA en aproximadamente 38% y a 600 mg/kg inhibió los aumentos de DA en aproximadamente 58%. Estos datos demuestran que el GVG inhibe los aumentos de metanfetamina en las concentraciones de dopamina extracelular en el NACC.

Por tanto, se aprecia a partir de los datos anteriores que el orden de preferencia de la nicotina, cocaína y metanfetamina para aumentar los niveles de DA del NACC es metanfetamina (2500%) > cocaína (450%) > nicotina (90%) que es paralelo al orden de preferencia del tamaño de una dosis aguda de GVG necesaria para disminuir significativamente los aumentos inducidos por drogas en DA del NACC.

Ejemplo 11 Efectos de GVG sobre aumentos inducidos por etanol en DA del NACC

En este ejemplo, se estudiaron los efectos de GVG sobre los cambios inducidos por etanol sobre las concentraciones de dopamina del NACC en 6-8 ratas con libertad de movimientos. Se administró a los animales etanol a una dosis de 1,0 g/kg i.p. El etanol aumentó las concentraciones de DA extracelular en el NACC en aproximadamente 200% sobre los niveles basales a aproximadamente 125 minutos a continuación de la administración de etanol.

Cuando se administró GVG a una dosis de 300 mg/kg, inhibió los aumentos de DA en aproximadamente 50% (Figura 8). También, a una dosis de 100 mg/kg, el GVG inhibe significativamente, en aproximadamente un 40%, la capacidad del alcohol para aumentar la dopamina del nucleus accumbens en ratas con libertad de movimientos (datos no mostrados). Estos datos demuestran que el GVG inhibe los aumentos de etanol en las concentraciones de dopamina extracelular en el NACC.

Ejemplo 12 Efectos de GVG sobre los aumentos inducidos por cocaína/heroína en DA del NACC

En este ejemplo, se investigaron los efectos del GVG sobre las elevaciones sinérgicas en DA del NAc a continuación de una estimulación con cocaína/heroína ("speedball"). Se realizaron estudios de microdiálisis in vivo usando ratas Sprague-Dawley macho adultas (Taconic Farms) como se detalló previamente (Morgan y Dewey, 1998). Se administró (i.p.) cocaína, un inhibidor de la reabsorción de dopamina (n=6-8) a una dosis de 20 mg/kg mientras se administraba (i.p.) heroína, un liberador de dopamina indirecto (n=6-8) a una dosis de 0,5 mg/kg. En estudios diseñados para investigar los efectos sinérgicos de una combinación de cocaína/heroína (n=6-8), las dos drogas fueron administradas a la dosis igual usada en los estudios de drogas únicas. La cocaína sola produjo una elevación considerable de DA extracelular de aproximadamente 380% por encima de los valores de referencia, 60 minutos después de la administración. La DA volvió a los valores de referencia en 120 minutos. Por el contrario, la heroína aumentó la DA de NAc en solamente 70%, 60 minutos después de la administración, volviendo a los valores de referencia en 140 minutos. Sin embargo, cuando fueron combinados, las dos drogas produjeron un aumento en DA del NAc de aproximadamente 100%, 180 minutos después de la administración que no había vuelto a los valores de referencia en 200 minutos después de alcanzar los valores picos (Figura 9). Este aumento era significativamente diferente (p>0,001) de la cocaína o la heroína solas.

Esta sinergia neuroquímica, en comparación con un efecto aditivo, era evidente no solamente en la magnitud del aumento de DA del NAc, sino también en el tiempo que tardó en alcanzar la elevación pico y volver a valores de referencia. Individualmente, cada droga produjo un aumento máximo en los 60 minutos a continuación de la estimulación. Sin embargo, cuando se combinaron, este aumento máximo tardó casi tres veces más en conseguirse que cualquier droga sola. Además de ello, tardó considerablemente más en volver a los valores de referencia en comparación con cada droga separadamente. Estos descubrimientos muestran que la duración de la euforia es mucho más larga cuando las dos drogas son usadas en combinación, al contrario que separadamente.

Con respecto a la magnitud absoluta de la respuesta, el GVG suprimió completamente los efectos sinérgicos que siguen a la estimulación de drogas combinadas. En animales que recibieron GVG (300 mg/kg, i.p.) 2,5 horas antes de la estimulación, la DA del NAc aumentó en aproximadamente 500% 180 minutos a continuación de la estimulación (Figura 9). Este aumento fue significativamente diferente tanto de la cocaína como de la heroína solas (p>0,05 y 0,001, respectivamente) y cocaína/heroína combinadas (p>0,001). Los datos obtenidos a continuación de un pretratamiento con GVG son similares a un efecto aditivo tanto de cocaína (380%) como de heroína (70%) en comparación con un efecto sinérgico.

Aunque suprime el efecto sinérgico de las dos drogas en la magnitud absoluta del aumento, el GVG no efectuó los aspectos temporales de la respuesta. A continuación de la administración de GVG y con posterioridad a la estimulación con cocaína/heroína, la DA del NAc alcanzó una concentración máxima en 180 minutos que era igual a la respuesta medida en animales que no recibieron GVG antes de la estimulación.

Los resultados de este ejemplo muestran que el GVG atenúa eficazmente las elevaciones sinérgicas en DA del NAc producida por una estimulación con cocaína/heroína. Combinado con los estudios previos de los inventores, este descubrimiento muestra la eficacia de GVG para el tratamiento del abuso de múltiples drogas.

Los ejemplos anteriores demuestran que las drogas que dirigen selectivamente a diana el sistema GABAérgico pueden ser ventajosas para el tratamiento de drogas de abuso, como psicoestimulantes, analgésicos narcóticos, alcoholes y nicotina o sus combinaciones. Más específicamente, la inhibición de GABA-T inducida por GVG, que produce un aumento en los niveles de GABA cerebral extracelular, representa una droga eficaz y una nueva estrategia para el tratamiento de la adicción a la cocaína, nicotina, heroína, metanfetamina y etanol.

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Claims (10)

1. Uso de gamma-vinil-GABA (GVG) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un enantiómero o una mezcla racémica del mismo, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un mamífero que padece de adicción a la nicotina, administrando una cantidad eficaz del medicamento al mamífero, en que la cantidad eficaz es suficiente para disminuir, inhibir o eliminar un comportamiento asociado con las ansias o el uso de nicotina.

2. Uso según la reivindicación 1, en que dicho mamífero padece de adicción a la nicotina en combinación con una o más drogas de abuso seleccionadas entre el grupo que consiste en psicoestimulantes, analgésicos narcóticos o alcoholes y sus combinaciones.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en que dicha eliminación del comportamiento asociado con las ansias de nicotina, o nicotina en combinación con una o más drogas de abuso se produce en ausencia de una respuesta aversiva o una respuesta apetitiva al medicamento.

4. Uso según la reivindicación 2 ó 3, en que dichas una o más drogas de abuso se seleccionan entre el grupo que consiste en metanfetamina, etanol, morfina, heroína y sus combinaciones.

5. Uso según la reivindicación 1, en que dicho comportamiento relacionado con la adicción es una preferencia de lugar condicionado.

6. Uso según la reivindicación 1, en que el GVG es administrado en una cantidad de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 600 mg/kg.

7. Uso según la reivindicación 1, en que dicha eliminación de comportamiento asociado con ansias de nicotina, o nicotina en combinación con una o más drogas de abuso, es atenuada en ausencia de una alteración en la función locomotora de dicho mamífero.

8. Uso según la reivindicación 1, en que la cantidad de GVG en el medicamento es de 15 mg/kg a 2 g/kg.

9. Uso según la reivindicación 8, en que la cantidad de GVG en el medicamento es de 75 mg/kg a 150 mg/kg.

10. Uso según la reivindicación 8, en que la cantidad de GVG en el medicamento es de 18 mg/kg a 20 mg/kg.