ES2268076T3 - Metodo para la fabricacion de microparticulas cargadas de proteinas. - Google Patents

Abstract

Método para la fabricación de partículas de poliestireno revestidas, que se caracteriza por que el revestimiento de adsorción de las partículas de poliestireno se realiza con un elemento de un par de enlace de igual bioafinidad a un valor del pH en el intervalo del pH 10, 0 hasta pH 12, 5.

Description

Método para la fabricación de micropartículas cargadas de proteínas.

La presente invención se refiere a un método para la fabricación de micropartículas, que se caracteriza por que la carga de las micropartículas en suspensión se realiza en unas condiciones fuertemente alcalinas. Además la invención se refiere a las micropartículas fabricadas con este método y a su uso en un ensayo de enlace, por ejemplo, en un inmunoanálisis.

Las micropartículas cargadas de proteínas son conocidas y se emplean muchas veces en métodos de detección medicinales, inmunológicos y diagnósticos como fase sólida. Las partículas de partida no cargadas (conocidas también por "Beads") se componen preferiblemente de látex, por ejemplo de látex de poliestireno y a menudo son magnetizables debido a un porcentaje o a un núcleo de magnetita. El acoplamiento de la proteína a la partícula de látex se realiza de forma conocida generalmente a través de un enlace químico (enlace covalente) o bien por adsorción (enlace no covalente).

Los métodos de acoplamiento covalentes descritos en la tecnología actual constan de micropartículas (partículas funcionarizadas), que presentan distintos grupos funcionales (-COOH, tosilo-, -epoxi, etc.). Utilizan estos grupos funcionales para la formación de enlaces covalentes con las proteínas, por ejemplo, a través de grupos amino y carboxi de las proteínas a revestir.

Los métodos de acoplamiento covalentes se diferencian del método de acoplamiento de adsorción en que poseen superficies claramente más hidrófilas en las partículas que funcionan empleadas en primer lugar que en las partículas que no funcionan. Por ello el porcentaje de proteína enlazado por adsorción se reduce. Las proteínas enlazadas por adsorción pueden provocar una "hemorragia" según la intensidad del enlace. "Hemorragia" significa que la proteína enlazada débilmente o bien no enlazada se vuelve a desprender. Únicamente se mantiene enlazada la proteína que ha reaccionado con los grupos funcionales en la superficie de la partícula.

En general, las partículas iniciales presentan para un método de revestimiento covalente una varianza de carga elevada respecto a la densidad en grupos funcionales y una estabilidad de almacenamiento mínima de los grupos funcionales sobre la superficie, que conduce tras la carga a unas densidades de carga bajas y/o unos resultados muy oscilantes. Otro inconveniente del método de revestimiento covalente es la mala accesibilidad espacial de los grupos funcionales. Por este motivo no se alcanzan las densidades de carga necesarias con las partículas revestidas de este modo para una aplicación, por ejemplo, en un inmunoanálisis sensible. El acoplamiento químico covalente puede conducir también a una inactivación de la proteína que va a ser revestida.

Giese publica en US 4.478.914 y US 4.656.252 un método de acoplamiento, a través del cual se consigue una carga de varias capas (multicapa) de las superficies con una proteína funcional. Para ello la biotina formaba un enlace covalente en la superficie y seguidamente repetía la avidina y un expansor acoplado a la biotina enlazado al material cargado, por lo que la sustancia no enlazada se eliminaba mediante el lavado. En dicho método de varias capas se puede llegar a una hemorragia retardada por una deserción retrasada.

Para el método de revestimiento de adsorción se emplean en general partículas con una superficie hidrófoba. Los métodos conocidos para dichas partículas son las partículas de poliestireno, que se encuentran libres de los grupos funcionales anteriormente mencionados o bien las partículas de poliestireno, que son derivatizadas con poliuretano.

La experiencia demuestra que las partículas que se han fabricado mediante un revestimiento de adsorción, tienden mas fuertemente a la hemorragia, que las partículas revestidas de forma covalente. En esta hemorragia se produce de forma casual el hecho de que el revestimiento de adsorción se lleva a cabo por unas interacciones de van der Waals iónicas relativamente débiles.

De la tecnología actual se conocen una serie de artificios para mejorar el enlace de adsorción de las proteínas a la superficie y reducir la tendencia de la hemorragia. La 19924643 describe el revestimiento de partículas a elevada temperatura y la posterior irradiación por medio de luz UV. Con estas medidas se reduce la tendencia a la hemorragia.

Conradie, J.D y cols., J. Immunol Methods 59 (1983) 289-99 informan sobre un revestimiento más eficaz de las placas de microvaloración si se emplea una temperatura elevada, unas concentraciones salinas elevadas y unas condiciones de pH ácido.

Ishikawa E., y cols., J. Immunoassay 1 (1980)385-98 describen asimismo la aplicación preferible de unas condiciones de pH fuertemente ácidas. Se recomienda para ello el tratamiento previo de los anticuerpos a pH 2,5 para el revestimiento de las bolitas de poliestireno.

Un inconveniente adicional al método conocido en la tecnología actual se puede observar en la fuerte tendencia a la agregación de las partículas hidrófobas empleadas. La estructura básica hidrófoba de las partículas lleva a que estas partículas tiendan por un lado a la formación de agregados, lo que es un inconveniente en la exactitud de la medición en el método de determinación secundario que emplea estas partículas. Por otro lado, estas partículas debido a su naturaleza hidrófoba tienden asimismo, cuando se emplean en una prueba inmunológica, a una fuerte inclinación hacia un enlace no específico de los componentes de las muestras. Los enlaces no específicos en dichos sistemas de análisis actúan de forma conocida, negativamente sobre las características del ensayo, como por ejemplo, en el cociente señal/ruido, o bien pueden conducir a resultados falsos-positivos o también falsos negativos.

En las etapas convencionales del lavado, las partículas cargadas se granulan tanto mediante el centrifugado o por separación magnética y seguidamente vuelven a formar una suspensión. La centrifugación o granulación hace que las partículas cargadas se acerquen entre ellas y en un caso desfavorable formen agregados.

El cometido de la presente invención consistía en llegar a disponer de un método con el cual se lograra la fabricación técnica a gran escala de micropartículas cargadas por adsorción. Además la invención se propone conseguir micropartículas cargadas de proteínas que se obtengan mediante carga en unas condiciones fuertemente alcalinas y que presenten una fuerte capacidad de enlace con una hemorragia mínima simultánea y una buena estabilidad de almacenamiento. La invención se extiende asimismo al uso preferible en unas condiciones alcalinas de micropartículas revestidas en sistemas de detección inmunológicos.

De acuerdo con la configuración de la invención este cometido se resuelve mediante un método para fabricar micropartículas cargadas de proteínas, que se caracteriza porque la carga se realiza en unas condiciones de pH fuertemente alcalinas. Preferiblemente el revestimiento se lleva a cabo a un pH que se elige entre 10,0 y 12,5.

Las micropartículas que se van a cargar (o beads) que se pueden emplear para el método de la presente invención están microdispersas y se emplean preferiblemente en suspensiones con concentraciones inferiores al 20%, preferiblemente por debajo de un 10% en peso por volumen, por lo que se prefiere un campo del 0,1 hasta el 10% en peso/vol., en particular del 0,2 hasta el 2% en peso/volumen.

Contrariamente a la tecnología actual, se pueden emplear tanto partículas hidrófobas, como partículas funcionalizadas con grupos epoxi preferiblemente en un método para el revestimiento por adsorción.

Las partículas pueden constar de látex y materiales similares, preferiblemente de poliestireno-látex y si se diera el caso de material magnetizable como algo de magnetita. El tamaño de las partículas de las partículas no cargadas se sitúa preferiblemente en el campo de 50 nm hasta 25 \mum. En el caso de partículas magnéticas las dimensiones preferidas se encuentran entre 0,5 y 25 \mum, puesto que en este intervalo la separación magnética funciona de forma favorable. Por ejemplo, son adecuadas las Dynabeads de la empresa Dynal con un tamaño de aproximadamente 2,8 \mum, que constan de un 88% de poliestireno y de un 12% de magnetita, como por ejemplo las Beads M-280 hidrófobas o las Epoxi-beads M-270.

En una configuración preferida el método de revestimiento conforme a la invención se caracteriza porque las partículas de poliestireno empleadas presentan una superficie hidrófoba o funcionalizada con grupos epóxido.

Se prefiere especialmente el uso de partículas de poliestireno que presentan un núcleo magnetizable.

El material proteínico polimerizado preferiblemente que se enlaza a las partículas tiene unas dimensiones de al menos 10 nm hasta un máximo de 300 nm, se determina por espectroscopia de correlación de fotones (PCS)(Lagaly, G., y cols. Photonenkorrelationsspektroskopie en "Dispersiones y Emulsiones"(1997) 289-294, Darmstadt, Steinkopf), donde es preferible un intervalo de 20 hasta 250 nm. En principio es posible emplear proteínas con un peso molecular de más de 10 kD para la carga de las micropartículas. Preferiblemente se trata de un compañero de un par de enlace que presenta bioafinidad en la proteína que va a ser revestida. Los pares de enlace que presentan bioafinidad son, por ejemplo, antígeno/anticuerpo, hapteno/anticuerpo y ligando/receptor.

Se emplea un compañero de dicho par de enlace, preferiblemente un anticuerpo o un receptor para el revestimiento. Se prefiere especialmente un receptor para la biotina, como la avidina y en particular la estreptavidina. Para la presente invención los materiales especialmente adecuados son las proteínas de elevado peso molecular o las proteínas polimerizadas, como algo de estreptavidina polimerizada (SA-Poly). Se ha descubierto que las proteínas polimerizadas se enlazan a las superficies fuertemente por adsorción. El motivo es probablemente porque las proteínas polimerizadas presentan un mayor número de puntos de contacto. Por tanto se garantirizaría para estos polímeros siempre un enlace suficiente a la superficie, incluso se desprendieran algunos puntos de contacto. En los monómeros con menos hasta un único lugar de contacto todo el monómero se desprende tan pronto como el punto de contacto desaparece.

La polimerización en la estreptavidina se puede conseguir mediante tratamiento químico. Preferiblemente se emplea avidina polimerizada en un método de revestimiento conforme a la invención o bien estreptavidina, en particular estreptavidina especialmente polimerizada. Asimismo son adecuados los anticuerpos polimerizados.

Tal como se ha mencionado al principio, la hemorragia representa un gran problema sobre todo durante el almacenamiento a largo plazo y durante el transporte de partículas. La hemorragia viene definida por la separación de las partículas de la suspensión almacenada y se mide el contenido de la parte enlazada sangrada que queda en el residuo.

Para las partículas que se han revestido de estreptavidina se indica la hemorragia en nanogramos de estreptavidina por miligramo de micropartícula (ng/mg). Es decir, la capacidad de enlace de la estreptavidina sangrada se determina por medio de una curva de calibración, que se averiguaba sobre la estreptavidina monomérica. Preferiblemente la hemorragia de las perlas SA fabricadas conforme a la invención se produce a <150 ng/mg y en particular a <80 ng/mg.

Tal como se ha mencionado, existe un elemento central de la presente invención que lleva a cabo el revestimiento en unas condiciones de pH fuertemente alcalinas. Se ha demostrado que el margen del pH entre 10,0 y 12,5 es especialmente adecuado. Según la duración del método de revestimiento se pueden considerar óptimos distintos subsectores de este espectro del pH. A gran escala el revestimiento se realiza durante un periodo de tiempo de 1-10 días. Se prefiere especialmente que el revestimiento dure de 4 a 7 días. Utilizando estos intervalos de tiempo relativamente largos se prefieren márgenes de pH entre 10,5 y 12,5 y en particular entre 11,0 y 12,0. Al emplear tiempos de revestimiento más cortos se darán valores de pH óptimos elevados.

Asimismo se ha demostrado que resulta preferible que la concentración salina del tampón alcalino para el revestimiento se encuentre en una solución salina fisiológica. El revestimiento se lleva a cabo preferiblemente con un tampón con un contenido en sal de 0,1 hasta 2 M, en particular 0,3 hasta 1,5 M y especialmente 0,8 hasta 1,2 M.

La puesta en contacto de la suspensión de micropartículas con el material proteínico de elevado peso molecular en un método conforme a la presente invención se realiza preferiblemente a 15-30ºC, en particular a temperatura ambiente, es decir a aproximadamente 18-25ºC, es decir el material proteínico no se coloca a una temperatura previa. Tras la carga en unas condiciones tampón fuertemente alcalinas ya se realizan una única o varias etapas de separación, que servirán para eliminar la proteína no adsorbida o ligeramente adsorbida.

La separación puede realizarse mediante un método convencional, como por ejemplo una separación magnética en el caso de micropartículas que contienen magnetita. Para el método de la presente invención es preferible una separación en una unidad de microfiltración a través de un tamiz, filtro o membranas. Estas pueden ser tanto hidrófilas como hidrófobas, sin embargo en último caso es preferible transformarlas en un estado hidrófilo antes de su empleo, lo que puede efectuarse de modo convencional. Presentan preferiblemente un tamaño de poro que se encuentra entre el tamaño de la micropartícula y el tamaño del material proteínico de alto peso molecular. Los tamaños de poro especialmente adecuados se encuentran en un intervalo de aproximadamente un 50% más del tamaño de la proteína a separar, es decir, aproximadamente 50 nm hasta 2,5 \mum. Las membranas con tamaños de poro de 0,4 \mum, preferiblemente 0,45 \mum hasta 2,5 \mum, preferiblemente hasta 2 \mum son especialmente adecuadas.

La separación puede realizarse una o varias veces, donde se puede emplear un tampón o un sistema tampón que conste de distintos tampones. Los tampones contienen preferiblemente sales y sustancias activas en el lavado para el desplazamiento/solubilización de proteínas no enlazadas o débilmente enlazadas, así como los llamados "agentes de bloqueo" (por ejemplo, albúmina sérica) para el relleno de zonas todavía libres de la superficie de partículas. Se prefiere que la etapa de separación se realice varias veces, preferiblemente tres veces, con distintos tampones, que se diferenciarán uno de otro por su contenido en detergente y sal. La separación se realiza con un intercambio de volumen de 5 hasta 15 veces el volumen de la preparación. Es importante para la efectividad de la separación tanto el tiempo de separación (intervalos de tiempo, en los que las partículas están suspendidas en una determinada solución tampón) así como el flujo y la presión y su combinación en el sistema de separación. El flujo y la presión dependen de la instalación respectivamente empleada y pueden ser averiguados por el técnico. El tampón separado se puede averiguar midiendo la altura del nivel de relleno y puede ser reemplazado por tampón nuevo.

Durante todo el proceso se intenta preferiblemente evitar que se produzca una sedimentación de micropartículas. En particular debe evitarse una sedimentación durante la separación. Con esta finalidad la suspensión se deberá desplazar de forma adecuada, por ejemplo, agitando, mediante bombeo, introduciendo energía dispersante o cualquier combinación de dichas medidas o bien mediante otros métodos físicos adecuados.

El llenado de las partículas cargadas se realiza asimismo de forma estéril en un módulo de llenado previsto para ello.

Otro objetivo de la invención son las micropartículas revestidas, que se obtienen mediante el método anteriormente descrito.

El objetivo de la invención es también un método para la detección de un analito en una muestras combinando la muestra con uno o varios elementos de enlace específicos del analito, de manera que el método se caracterice porque se emplea una micropartícula conforme a la invención revestida de un elemento de un par de enlace de bioafinidad similar. El método se realiza preferiblemente como análisis inmunológico. Es decir, que al menos uno de los elementos del enlace específicos del analito es un elemento de enlace inmunológico. En este método, la muestra en la cual se encuentra probablemente el analito, se incuba con un elemento de enlace específico inmunológico. Este elemento de enlace específico desde el punto de vista inmunológico es, en el caso de detección de un antígeno como, por ejemplo, en los marcadores tumorales como el PSA, un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se enlaza específicamente al analito, es decir, se enlaza al antígeno tumoral PSA. En un método para la detección de anticuerpos frente a un determinado antígeno (por ejemplo, anti-HCV-anticuerpo), se puede emplear por ejemplo el antígeno correspondiente como elemento de enlace específico desde el punto de vista inmunológico.

Preferiblemente, un elemento de enlace inmunológico se encuentra conjugado con el segundo elemento o componente de la proteína de misma bioafinidad empleada para el revestimiento. En el caso de que se empleara estreptavidina para el revestimiento, el elemento de enlace inmunológico constará de un grupo biotinilo. Tras la realización de las habituales etapas de incubación, las partículas se pueden separar de la muestra y se puede determinar de forma conocida la cantidad de analito hallado.

Otro objetivo de la invención es entonces la utilización de micropartículas revestidas conforme a la invención en un análisis inmunológico.

En el diagnóstico rutinario los esfuerzos para simplificar la ejecución del ensayo (a ser posible pocas etapas de incubación con las mínimas posibilidades de error posibles) y abastecimiento completo (todos los componentes de prueba esenciales por un lado, a ser posible en un envase) han avanzado mucho. Normalmente el cliente recibe una caja de reactivos (un estuche), que contiene todos los componentes importantes para el ensayo. Otro objetivo de la invención es por tanto un estuche de pruebas que contenga una suspensión de micropartículas, que se revistan conforme a la invención.

Los ejemplos siguientes, publicaciones y figuras aclaran la invención y su campo de aplicación viene dado por las reivindicaciones de las patentes. Los métodos descritos se han de entender como ejemplos, que se describen conforme a las modificaciones del objeto de la invención.

Descripción de las figuras

Figura 1

Dependencia del pH del revestimiento

Se representa la dependencia del pH del revestimiento para perlas Dynal M-270. Utilizando las perlas cargadas bajo las distintas condiciones del pH en unas condiciones de análisis asimismo similares en un ensayo TSH se observa un fuerte incremento de la señal de medición en un intervalo del pH de 9,0 hasta 12,5.

Figura 2

Distribución de las partículas en el revestimiento de perlas M-280 conforme a un método estándar

Las perlas Dynal M-280 se revestían tal como se ha descrito en DE 19924643. Con el contador de partículas (Coulter Multisizer II) se investigaba la distribución de las partículas. El pico o máximo principal a aproximadamente 2,8 \mum corresponde a partículas monodispersas, mientras que los picos secundarios equivalen a agregados dímeros y agregados de tres y más partículas.

Figura 3

Distribución de partículas en un revestimiento de perlas M-280 en un método conforme a la invención

Las perlas Dynal M-280 se revestían tal como se describe en el ejemplo 1. Con el contador de partículas (Coulter Multidizer II) se investigaba la distribución de las partículas. El análisis demuestra una cantidad muy pequeña de agregados dímeros. Agregados más grandes no son evidentes.

Figura 4

Distribución de partículas en un revestimiento de perlas M-270-epoxi en un método conforme a la invención

Las perlas Dynal M-280 se revestían tal como se describe en el ejemplo 1. Con el contador de partículas (Coulter Multisizer II) se investigaba la distribución de las partículas. El análisis demuestra una cantidad muy pequeña de agregados dímeros. Agregados más grandes no son evidentes.

Ejemplo 1

Revestimiento de perlas 1.1 Perlas de referencia

Las perlas Dynal M-280 se revestían tal como se describe en DE 19 92 4643.

1.2 Revestimiento alcalino (optimización del pH)

50 mg de perlas magnéticas (Dynal M-270 o Dynal M-280) se lavaban una tras otra inicialmente con isopropanol, después varias veces con 5 ml de tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 9,0). Las perlas se volvían a suspender seguidamente en 4 ml de tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 9,0). A continuación se añadían 10 mg de estreptavidina polimerizado (poli-SA), disueltos en 1 ml de tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,3. El valor del pH se ajustaba con NaOH al valor deseado entre pH 10,0 y pH 12,5. La preparación se incubaba durante 72 horas en el mezclador de rodillos. Seguidamente se lavaban las perlas con tampón de fosfato sódico 40 mM (pH 7,4) y una solución de Tween20® al 1% (en el mismo tampón base). Las perlas se incubaban luego varias veces con una solución que constaba de tampón de fosfato sódico (fosfato sódico 10 mM Nall 0,15 M, pH 7,4) y RSA (0,5% p/v)) y se lavaban. Para finalizar las perlas se lavaban con tampón de HEPES 50 mM (pH 7,4) y se ajustaban a una concentración final de 0,7 mg/ml en este tampón HEPES (pH 7,4). En una prueba de TSH (hormona estimulante tiroidea = TSH) se determina la idoneidad de las partículas revestidas para su empleo en un análisis inmunológico y se representa gráficamente en la figura 1 para las partículas M-270. Resulta evidente que las condiciones alcalinas elegidas conducen a una mejoría clara del Recuento y con ello a la idoneidad de las partículas en el ensayo.

1.3 Revestimiento alcalino (método rutinario)

50 mg de perlas magnéticas (Dynal M-270 o Dynal M-280) se lavaban una tras otra inicialmente con isopropanol, después varias veces con 5 ml de tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 9,0). Las perlas se volvían a suspender seguidamente en 4 ml de tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 9,0). A continuación se añadían 10 mg de estreptavidina polimerizada (poli-SA), disueltos en 1 ml de tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,3. El valor del pH se ajustaba con NaOH al valor deseado entre pH 10,0 y pH 12,5. La preparación se incubaba de a 4 a 7 días en el mezclador de rodillos. Seguidamente se lavaban las perlas con tampón de fosfato sódico 40 mM (pH 7,4) y una solución de Tween20® al 1%. Las perlas se incubaban luego varias veces con una solución que constaba de tampón de fosfato sódico (fosfato sódico 10 mM Nall 0,15 M, pH 7,4) y RSA (0,5% p/v)) y se lavaban. Para finalizar las perlas se lavaban con tampón de HEPES 50 mM (pH 7,4) y se ajustaban a una concentración final de 0,7 mg/ml en este tampón HEPES (pH 7,4).

Ejemplo 2

Distribución de partículas

Con un contador de partículas (Coulter Multisizer II) se comparaban las partículas de las perlas Dynal M-280 y M-270 revestidas con el método anteriormente descrito con las perlas M-280 revestidas con el método convencional (figuras 2-4). En un revestimiento alcalino se observa una distribución claramente más homogénea de las perlas revestidas con menores porcentajes de agregados dímeros, trímeros y superiores. Esto se deduce de la comparación de las figuras 3 y 4 respecto a la figura 2.

Ejemplo 3

Comportamiento de la hemorragia

El sangrado de las proteínas revestidas se realiza en condiciones de almacenamiento normales (4-8ºC) durante muchos meses muy lentamente. Para simular la hemorragia en las condiciones de almacenamiento se emplea un modelo a tiempo corto. Las partículas revestidas se almacenan aquí a 35ºC durante 21 días en el mezclador de rollos. La capacidad de enlace de la biotina del residuo, que está condicionada por la estreptavidina, se determina por ejemplo utilizando biotina marcada radiactivamente.

La tendencia a la hemorragia se indica en ng de SA/mg de partículas. Para averiguar la hemorragia se prepara una curva estándar por medio de la estreptavidina monomérica y se deduce la capacidad de enlace de la biotina de las suspensiones de micropartículas cargadas del residuo. Para las micropartículas revestidas según el ejemplo 1 se han constatado sorprendentemente unas tendencias a la hemorragia mínimas, que regularmente se sitúan por debajo de 150 ng/mg, en la mayoría de casos incluso inferiores a 100 ng/mg tras la carga.

Ejemplo 4

Resultados en el ensayo de la función del VIH

Se realizaba un ensayo puente de doble antígeno para la detección de anticuerpos específicos frente al VIH. Para ello se incubaba el líquido de prueba con un antígeno con un grupo biotinilo en presencia de una fase sólida revestida de estreptavidina (perlas de SA magnéticas según el método estándar o conforme al método aquí reivindicado). Tras una etapa de lavado se añadía de nuevo el mismo antígeno, sin embargo esta vez marcado con rutenio. La existencia de anticuerpos antiretrovíricos en el líquido de muestra se determinaba mediante el marcado con rutenio en la fase sólida con ayuda de la electroluminiscencia en un sistema Elecsys®.

Como antígeno se empleaba un péptido de VIH de la zona gp36 del VIH 2 (posterior descripción se ha de extraer de WO 96/03652), que está marcado en un término N. La concentración en antígeno era en el ensayo:

6 ng/ml de Ag con un grupo de biotina, 200 ng/ml de Ag con rutenio.

El valor blanco del sistema se determinaba en presencia de antígeno con rutenio.

En las tablas siguientes se representa el resultado de los experimentos con perlas SA revestidas conforme a la invención en base a las partículas de partida Dynal M-280 en comparación con las partículas que se han revestido conforme a la tecnología actual.

TABLA 1 Valores de prueba/medición VIH

Recuentos	Perlas de estreptavidina conforme	Perlas de estreptavidina según
	al ejemplo 1	la tecnología actual
Valor blanco del sistema	316	481
Muestra negativa	560	2.150
Muestra positiva 1	2.442.861	2.506.269
Muestra positiva 2	1.073.515	1.338.9787
Muestra positiva 3	7.315	11.802

La dinámica de la señal se calcula según la fórmula siguiente: (señal-valor blanco del sistema)/(muestra negativa - valor blanco del sistema)

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TABLA 2 Dinámica de la señal/ensayo VIH

Dinámica de la señal sueros	Perlas de estreptavidina conforme	Perlas de estreptavidina según
pos/neg.	al ejemplo 1	la tecnología actual
Muestra negativa	1,0	1,0
Muestra positiva 1	10.010,4	1.501,4
Muestra positiva 2	4.398,4	802,0
Muestra positiva 3	28,7	6,8

Resulta evidente que mediante el uso de perlas SA conforme a la invención se obtienen valores blanco claramente inferiores y por tanto se obtiene una mejor diferenciación de la señal positiva respecto a la negativa.

La tabla siguiente muestra un enlace no específico del conjugado de anticuerpo con la fase sólida de la estreptavidina. En esta realización del ensayo en lugar de antígenos con algún grupo biotina se emplea únicamente tampón. La concentración del conjugado de rutenio es de 600 ng/ml.

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TABLA 3 Enlace no específico del conjugado de Ru de la prueba VIH

Recuentos	Perlas de estreptavidina conforme	Perlas de estreptavidina según
	al ejemplo 1	la tecnología actual
Valor blanco del sistema	316	481
Tampón	446	2.061
Suero humano	373	692

Las perlas conforme a la invención muestran aquí también los mejores valores blanco (enlace no específico mínimo) y una dependencia claramente reducida de la matriz (diferencias de señal inferiores respecto al valor blanco del sistema en muestras libres de analito), lo que permite un ensayo más preciso.

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Ejemplo 5

Resultados en el ensayo CA 15-3

En el ensayo CA 15-3 utilizado se trata de un ensayo sándwich en un formato de ensayo de 2 etapas. En una primera etapa se incuban perlas, muestras y anticuerpos con un grupo de biotina, seguidamente se separan las perlas fijándose a imanes y el residuo es aspirado. Tras varias etapas de lavado (adición de tampón de lavado, nuevo aspirado, nueva suspensión mediante vórtices en el tampón de lavado, nueva separación, aspirado) las perlas se vuelven a suspender en el reactivo 2, que contiene anticuerpos con rútenlo. Tras una incubación adicional se lava de nuevo, las perlas suspendidas en el tampón de lavado se transfieren a la célula de medición de un aparato Elecsys® E1010 y se determina la cantidad de marcaje de rutenio enlazada al analito.

En el ensayo CA 15-3 la agregación de perlas equivale a un problema especial; el analito es un antígeno con múltiples elementos repetitivos, que facilitan el enlace de varios complejos de anticuerpo-perla. Durante las etapas de lavado, las perlas se depositan en superficies relativamente pequeñas y pueden por tanto estar en un contacto íntimo. Esto puede dar lugar a la formación de complejos tridimensionales. Estas acumulaciones de perlas dan lugar a agregados mayores que pueden verse en la célula de medición y conducen a empeorar la precisión (elevado coeficiente de variación) y un rendimiento inferior de la señal.

Las formaciones de grumos son claramente visibles en configuraciones coloreadas, mientras que por el contrario las configuraciones o imágenes en blanco/negro en diferentes grados de grises apenas tienen validez, por lo que se deberían evitar en una figura correspondiente. Las perlas revestidas propiamente tienen una gran influencia en las dimensiones de las formaciones de grumos en el electrodo de medición. Contrariamente a las perlas SA estándar, las perlas revestidas conforme a la invención presentan una distribución claramente mejorada en parte en la célula de medición debido a una agregación básicamente inferior. Por lo que es irrelevante si para el revestimiento se han empleado perlas M270 de epoxi o bien perlas M280 hidrófobas. En ambos casos se obtiene una distribución claramente más homogénea en el electrodo en comparación con la referencia.

Una distribución mejor de las perlas conduce también a una recuperación de la señal muy mejorada. En la tabla 4 se resumen los resultados correspondientes de un ensayo CA 15-3 representativo.

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TABLA 4 Alturas de señal al utilizar diferentes perlas en un ensayo CA 15-3 (valor medio de la determinación doceava)

Perlas/Muestra	Referencia	Perlas WJ069A	Perlas WJ069E
		(perlas de epoxi M-270	(perlas de epoxi M-280
		revestidas en medio alcalino)	revestidas en medio alcalino)
Calibrador 1	35 492	47 739	54 746
29,9 \mu/ml
Calibrador 2	237 460	304 448	354 975
139 \mu/ml

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De esta tabla resulta evidente que utilizando materiales de partida idénticos el empleo de diferentes lotes de perlas en CA 15-3 conduce a distintas alturas de señal. La altura de señal mejora claramente para las partículas revestidas en un medio alcalino.

La determinación de los coeficientes de variación se realizaba con la prueba CA 15-3 de la empresa Roche Diagnostics GMBH (Nr. De pedido 1776169) conforme a los datos del fabricante. En lugar de las perlas revestidas del estuche de ensayo se empleaban las preparaciones de perlas que se indican en la tabla 5.

El coeficiente de variación se averigua según el método estadístico habitual de la determinación 21 múltiple de las muestras que se indican.

TABLA 5 Coeficientes de variación de lotes de perlas distintos en el ensayo CA 15-3

Lote/muestra	Revestimiento estándar	Revestimiento alcalino
	A188	A191	1:1 de A188/191	R82	WJ0075D
Suero	4,8	7,4	6,0	6,1	4,0
CA 15-3 estándar	5,5	6,3	6,2	4,5	3,2

La tabla 5 demuestra a título de ejemplo que las partículas, que se han cargado en condiciones de revestimiento alcalino conforme a la invención, presentan en el ensayo CA 15-3 un coeficiente de variación claramente inferior (VK - expresado en % del recuento medido). Cuanto menor es VK, más precisa es la determinación.

Claims (8)

1. Método para la fabricación de partículas de poliestireno revestidas, que se caracteriza porque el revestimiento de adsorción de las partículas de poliestireno se realiza con un elemento de un par de enlace de igual bioafinidad a un valor del pH en el intervalo del pH 10,0 hasta pH 12,5.

2. Método conforme a la reivindicación 1, que se caracteriza porque el mencionado elemento de un par de enlace de igual bioafinidad se presenta en forma polimerizada.

3. Método conforme a la reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza porque el mencionado par de enlace es la estreptavidina polimerizada.

4. Método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 3, que se caracteriza porque las partículas de poliestireno empleadas presentan una superficie hidrófoba o funcionalizada con grupos epóxido.

5. Método conforme a una de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque las partículas de poliestireno empleadas presentan un núcleo magnetizable.

6. Partícula de poliestireno revestida que se obtiene según un método conforme a una de las reivindicaciones 1 hasta 5.

7. Uso de partículas de poliestireno revestidas conforme a la reivindicación 6 en un análisis inmunológico.

8. Estuche de pruebas que contiene una suspensión de partículas de poliestireno revestidas conforme a la reivindicación 6.