ES2277018T3 - Metodo, ensayo y equipo para la cuantificacion de inhibidores de la proteasa del vih. - Google Patents
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Abstract
Un método para cuantificar un inhibidor de la proteasa del VIH en una muestra, que incluya los siguientes pasos: combinar una proteasa del VIH, un conjugado que contenga un análogo de un inhibidor de la proteasa del VIH y una muestra que se sospecha que contiene un inhibidor de la proteasa del VIH, en la que la proteasa del VIH y el conjugado forman un complejo detectable; medir la cantidad de dicho complejo; relacionar la cantidad del mismo con una concentración de inhibidor de la proteasa del VIH de la muestra.
Description
Método, ensayo y equipo para la cuantificación
de inhibidores de la proteasa del VIH.
La atención médica de pacientes que tienen el
síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) ha mejorado
sustancialmente gracias a la introducción de compuestos que
funcionan como inhibidores potentes y específicos de la proteasa del
VIH. Se cree que el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es el
agente causal responsable del SIDA, y que la enzima proteasa del VIH
es responsable de catalizar procesos de escisión específicos en los
polipéptidos gag y gag-pol del VIH.
Un virus que sintetiza una proteasa inactivada por mutación
generalmente no forma viriones infecciosos. La proteasa del VIH es,
por lo tanto, una diana importante para la que se pueden diseñar
fármacos contra el SIDA. Los inhibidores de la VIH proteasa pueden
provocar una reducción o un cese de la actividad de la proteasa del
VIH.
Actualmente, existen seis tipos de inhibidores
de la proteasa del VIH aprobados por la Food and Drug
Administration (FDA) para el tratamiento de pacientes con SIDA -
amprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir y
saquinavir. Los tratamientos combinados que implican inhibidores de
la proteasa del VIH y también inhibidores de la transcriptasa
inversa del VIH son los fundamentos de los tratamientos recomendados
actualmente para la infección por VIH. No todos los pacientes con
SIDA muestran la misma respuesta óptima al régimen de tratamiento
combinado. Puede haber gran variabilidad en la respuesta
farmacológica entre los distintos pacientes. La relación entre la
exposición sistémica a los inhibidores de la proteasa y el efecto
antiviral ha sido respaldada por la acumulación de información
clínica. Cuando se administra un régimen de tratamiento combinado a
un paciente, las interacciones farmacocinéticas potenciales
fármaco-fármaco pueden mejorar o debilitar el
tratamiento. El cumplimiento del paciente, cuando se relaciona
directamente con el mantenimiento de los niveles de fármaco
adecuados, también puede afectar al resultado del tratamiento.
Por lo tanto, es deseable medir las
concentraciones de los inhibidores de la proteasa del VIH en los
pacientes con SIDA para asegurar que la exposición al fármaco es
suficiente para mantener actividad antiviral. Además, la
cuantificación de los inhibidores de la proteasa del VIH en muestras
biológicas de los individuos en estudio es crucial en el proceso de
desarrollo del fármaco. Otras mediciones de interés en el
tratamiento del VIH incluyen la medición de los metabolitos de los
inhibidores de la proteasa del VIH, y la medición de los anticuerpos
anti-proteasa del VIH. La presencia y cantidad de
metabolitos pueden proporcionar información respecto a la
efectividad del tratamiento terapéutico. La presencia de anticuerpos
anti-proteasa del VIH indica infección de un
paciente por VIH, y la detección de los anticuerpos puede ser, por
lo tanto, utilizada para diagnosticar la posible infección.
Normalmente, se cuantifican los inhibidores de
la proteasa del VIH en muestras del paciente mediante métodos de
ensayo que requieren instrumentos sofisticados y costosos, que hacen
que el análisis sea difícil de realizar en un entorno clínico. Por
ejemplo, las muestras de plasma pueden analizarse simultáneamente
para la presencia de numerosos compuestos inhibidores de la proteasa
del VIH utilizando métodos cromatográficos como la cromatografía
líquida de alta resolución (del inglés, HPLC,
high-performance liquid chromatography) unida a la
espectrometría de masas en tándem (HPLC/EM/EM). Véase, por ejemplo,
Poirier, J.M., et al., Ther. Drug Monit.
22:465-473 (2000); Marzonlini, C., et al., J.
Chromatogr. 740:43-58 (2000); y Remmel, R.P.,
et al., Clin. Chem. 46(1):73-81
(2000). Las muestras de plasma normalmente están sujetas a
procedimientos de extracción de fase sólida previos al examen. Por
tanto, el plasma no se analiza directamente sino que debe ser
modificado, añadiendo complejidad y costes al
análisis.
análisis.
Los radioinmunoensayos normalmente implican la
interacción competitiva entre un conjugado radiomarcado que
contiene un análogo de un inhibidor de la proteasa del VIH y
cualquier inhibidor de la proteasa del VIH libre en la muestra. El
receptor es normalmente un anticuerpo para el inhibidor de la
proteasa del VIH en cuestión. En un ejemplo de radioinmunoensayo,
se observa que un análogo de un inhibidor de la proteasa del VIH
marcado con yodo-125 compite con cualquier
compuesto inhibidor del VIH en una muestra de plasma de un paciente
para la unión con un anticuerpo. Se analiza el nivel de
radiactividad de los complejos de anticuerpos precipitados para
determinar la concentración del compuesto inhibidor de la proteasa
del VIH. Véase, por ejemplo, Wiltshire, H.R., et al. Analyt.
Biochem. 281:40 105-114 (2000). En un
ejemplo de un ensayo que utiliza indirectamente un
radioinmunoensayo, la proteasa del VIH se puede añadir a la muestra
juntamente con el sustrato para la proteasa del VIH. La escisión
del sustrato puede medirse mediante radioinmunoensayo utilizando un
anticuerpo que específicamente se una a los productos de escisión.
Una ausencia de productos de escisión indica la presencia de
anticuerpos anti-proteasa del VIH. Véase, por
ejemplo, la patente estadounidense núm. 5 171 662. La patente
europea núm. EP-A2-1 207 394 revela
un inmunoensayo para los inhibidores de la proteasa del VIH en el
que un anticuerpo selectivo para un inhibidor de la proteasa
concreto se utiliza como receptor para el inhibidor de la proteasa
del VIH.
Todos estos métodos para medir inhibidores o sus
metabolitos han obtenido un éxito limitado. Hay, por lo tanto, la
necesidad de hallar un método mejorado para cuantificar los
inhibidores de la proteasa del VIH o sus metabolitos de una muestra
biológica. Es deseable que dicho método pueda llevarse a cabo de
manera fácil y rápida con los instrumentos analíticos actualmente
disponibles en entornos clínicos.
\newpage
En un aspecto de la invención, existe un método
para cuantificar un inhibidor de la proteasa del VIH en una muestra
que consiste en combinar una proteasa del VIH, un conjugado que
conste de un análogo de un inhibidor de la proteasa del VIH y una
muestra que se sospecha que contiene un inhibidor de la proteasa del
VIH. Entonces la proteasa del VIH y el conjugado forman un complejo
detectable, se mide la cantidad del complejo detectable, y se
relaciona la cantidad de dicho complejo detectable con la
concentración de inhibidor de proteasa del VIH en la muestra.
En otro aspecto de la invención, existe un
método para cuantificar un inhibidor de la proteasa del VIH en una
muestra que consiste en combinar una proteasa del VIH, un conjugado
que conste de un transportador y al menos dos análogos de
inhibidores unidos al transportador, y una muestra que se sospecha
que contiene un inhibidor de la proteasa del VIH. Entonces, la
proteasa del VIH, que está inmovilizada en la superficie de una
micropartícula, y el conjugado experimentan un proceso de
aglutinación, se mide la aglutinación y se relaciona el nivel de
aglutinación con una concentración del inhibidor de la proteasa del
VIH en la muestra.
En otro aspecto más de la invención, existe un
método para cuantificar un inhibidor de la proteasa del VIH en una
muestra que consiste en combinar un transportador multivalente que
consta de, al menos, dos enzimas proteasa del VIH, un conjugado que
consta de una micropartícula y de un análogo de un inhibidor de la
proteasa del VIH, y una muestra que se sospecha que contiene un
inhibidor de la proteasa del VIH. Entonces, la proteasa del VIH y
el conjugado experimentan un proceso de aglutinación, siendo la
muestra suero o plasma humano; se mide la aglutinación; y se
relaciona el nivel de aglutinación con una concentración del
inhibidor de la proteasa del VIH en la muestra.
En otro aspecto más de la invención, existe un
método para cuantificar un inhibidor de la proteasa del VIH en una
muestra que consiste en combinar una proteasa del VIH, un conjugado
que conste de un marcador y un análogo de un inhibidor de la
proteasa del VIH unido al marcador, y una muestra que se sospecha
que contiene un inhibidor de la proteasa del VIH. Entonces, la
proteasa del VIH y el conjugado forman un complejo detectable, se
mide la cantidad de complejo detectable mediante la monitorización
de los cambios en la polarización de la fluorescencia, y se
relaciona la cantidad del complejo detectable con una concentración
del inhibidor de la proteasa del VIH en la muestra.
La Figura 1 es un gráfico de absorbancia en
forma de función de la concentración de un conjugado de
amprenavir/aminodextrano que contiene un promedio de 3,75 porciones
de análogo de amprenavir por aminodextrano.
La Figura 2 es un gráfico de absorbancia en
forma de función de la concentración de un conjugado de
amprenavir/aminodextrano que contiene un promedio de 2,15 porciones
de análogo de amprenavir por aminodextrano.
La Figura 3 es un gráfico de absorbancia en
forma de función de la concentración de amprenavir a distintas
concentraciones en suero humano normal, que utiliza un ensayo
competitivo que incluye el conjugado de la Figura 1.
La presente invención se refiere a métodos para
la cuantificación de un inhibidor de la proteasa del VIH en una
muestra que incluyen un sistema de ensayo para determinar la
concentración de inhibidores de la proteasa del VIH
(VIH-IP) en la muestra. El sistema incluye enzima
proteasa del VIH (VIH-PR), un conjugado y una
muestra que se sospecha que contiene VIH-IP. De
acuerdo con la invención, el conjugado y los VIH-IP
presentes en la muestra compiten por la unión a la
VIH-PR. Al entrar en contacto la
VIH-PR con el conjugado en el caso de ser una
muestra que contiene VIH-IP, se observa un cambio en
los niveles de VIH-PR unida al conjugado, y esto se
puede medir y correlacionar con la concentración de
VIH-IP en la muestra.
El término "proteasa del VIH"
(VIH-PR) se refiere a una enzima responsable del
procesamiento postraduccional de los polipéptidos gag y
gag-pol del VIH. VIH-1 y
VIH-2 son dos tipos de VIH que codifican para
VIH-PR. VIH-1 es un virus altamente
variable que muta muy fácilmente, dando como resultado muchos tipos
de VIH-1. Estas variedades se pueden clasificar en
distintos grupos (por ejemplo, M y O) y en distintos los subtipos.
Así, como ejemplos de la proteasa del VIH se incluyen la
VIH-1 PR y la VIH-2 PR, así como
VIH-PR sintéticas.
El término "inhibidor de la proteasa del
VIH" (VIH-IP) incluye compuestos inhibidores de
la proteasa del VIH, metabolitos activos de compuestos inhibidores
de la proteasa del VIH y anticuerpos anti-proteasa
del VIH. Como ejemplos de compuestos inhibidores de la proteasa
del VIH y metabolitos de los mismos se incluyen péptidos,
compuestos orgánicos, compuestos organometálicos y complejos
metálicos, que pueden reducir o eliminar la actividad de la
proteasa del VIH. Ejemplos específicos de compuestos inhibidores de
la proteasa del VIH incluyen los compuestos actualmente aprobados
por la FDA para el tratamiento de pacientes con SIDA; a saber,
amprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, ritonavir y
saquinavir. Un anticuerpo anti-proteasa del VIH es
un anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica por la
enzima de la proteasa del VIH excluyendo otras sustancias. El
término "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales,
anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos.
El término "analito" se refiere a una
sustancia o grupo de sustancias de las que se determina su presencia
o cantidad en una muestra, incluyendo cualquier fármaco o derivado,
hormona, antígeno proteico u oligonucleótido. En el presente
sistema de ensayo, el analito es un inhibidor de la proteasa del
VIH, incluyendo un compuesto inhibidor de la proteasa del VIH, un
metabolito de un compuesto inhibidor de la proteasa del VIH o un
anticuerpo anti-proteasa del VIH.
El término "receptor" se refiere a una
pareja de unión específica de un analito, y se propone incluir
cualquier sustancia, o grupo de sustancias, que tengan una afinidad
de unión específica por el analito excluyendo otras sustancias.
Ejemplos de receptores incluyen enzimas y anticuerpos. En el
presente sistema de ensayo, la proteasa del VIH actúa como receptor
para un VIH-IP o para un conjugado que contenga un
análogo de un VIH-IP.
El término "análogo de un
VIH-IP" se refiere a una sustancia, o grupo de
sustancias, que se comportan esencialmente de la misma manera que
un inhibidor de la proteasa del VIH con respecto a la afinidad de
unión por la proteasa del VIH. Un análogo de un
VIH-IP normalmente es un VIH-IP que
se ha modificado o del que se ha obtenido un derivado de manera que
imita la interacción del VIH-IP con
VIH-PR. Un análogo de un VIH-IP por
lo tanto incluye cualquier modificación de un
VIH-IP. Por ejemplo, un análogo de un
VIH-IP puede ser idéntico al VIH-IP
excepto por la presencia de una unión entre el
VIH-IP y otra sustancia, como un átomo, un grupo de
unión, un marcador o una sustancia transportadora. Ejemplos de
análogos de VIH-IP incluyen análogos de compuestos
inhibidores de la proteasa del VIH, análogos de metabolitos de
compuestos inhibidores de la proteasa del VIH y análogos de
anticuerpos anti-proteasa del VIH.
El término "conjugado" se refiere a una
composición formada por un análogo de un VIH-IP
unido a otra sustancia, por ejemplo un transportador, un marcador o
una fase sólida, y es capaz de unirse específicamente a un receptor.
Por ejemplo, un conjugado que contenga un análogo de
VIH-IP puede unirse específicamente a
VIH-PR a través del análogo. Se puede preparar un
conjugado que contenga un análogo de un VIH-IP como
se describe, por ejemplo, en la solicitud
co-dependiente con número de serie 10/192 052
presentada el 7 de julio de 2002.
El término "marcador" se refiere a una
sustancia identificativa que, cuando se une a un análogo de un
VIH-IP como parte de un conjugado, se puede
utilizar para detectar la unión del conjugado con el receptor
apropiado. Un marcador puede estar unido al análogo de un
VIH-IP directamente o indirectamente a través de una
región de unión o puente. Ejemplos de marcadores utilizados
habitualmente incluyen marcadores fluorescentes, como las
fluoresceínas y rodaminas; compuestos luminiscentes, como los
dioxetanos y la luciferina; isótopos radiactivos, como el
^{125}I; marcadores quimioluminiscentes, como los ésteres de
acridina; marcadores electroquimioluminiscentes, como el rutenio
bipiridilo; enzimas, como las peroxidasas y las
beta-galactosidasas; y marcadores de sustrato
enzimático.
El término "transportador" se refiere a una
sustancia, normalmente una proteína, que puede unirse con uno o más
análogos de un VIH-IP y así permitir la detección de
cualquier unión del análogo del VIH-IP con un
receptor. Ejemplos de transportadores incluyen proteínas como la
albúmina sérica bovina (del inglés, BSA), polisacaridasas naturales
o sintéticas, y polímeros como el aminodextrano (AMD).
El término "complejo detectable" se refiere
a un complejo formado por un receptor y un conjugado, cuya cantidad
puede medirse mediante la monitorización de los cambios en la señal
del complejo o de sus alrededores. El cambio en la señal puede ser,
por ejemplo, la formación de un precipitado medible; un cambio en
una característica de una absorbancia, emisión, luminiscencia o
fluorescencia espectroscópicas; o un cambio en las propiedades
eléctricas.
El término "péptido" se refiere a cualquier
compuesto formado por la unión de dos o más aminoácidos mediante
enlaces amida (peptídico), normalmente un polímero de
\alpha-aminoácidos en los que el grupo
\alpha-amino de cada residuo de aminoácido
(excepto el NH_{2} terminal) está unido al grupo
\alpha-carboxilo del siguiente residuo en cadena
lineal. Los términos péptido, polipéptido y poli(aminoácido)
se utilizan como sinónimos en este documento para referirse a este
tipo de compuestos sin restricción de tamaño. A los mayores miembros
de esta clase se les denomina proteínas.
El término "enlace covalente" se refiere a
un enlace químico entre dos especies, y puede incluir enlaces
simples o múltiples. Por otra parte, el término "enlace no
covalente" se refiere a interacciones químicas o físicas que no
forman enlaces químicos. Por lo tanto, los enlaces no covalentes
incluyen interacciones hidrófobas/hidrófilas, enlaces de hidrógeno,
interacciones de van der Waals y, también, interacciones metálicas o
iónicas. Por ejemplo, la adsorción de una sustancia a una
superficie es no covalente, mientras que la unión de una sustancia a
una superficie, p. ej. a través de uniones carbodiimida o
N-hidroxi succinimida (NHS), es covalente.
El término "muestra biológica" se refiere a
un líquido corporal obtenido de un organismo vivo. Una muestra
biológica es preferiblemente una mezcla acuosa, por ejemplo orina,
sangre total, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputo, líquido
cefalorraquídeo, lágrimas, mucosidad o similares, pero
preferiblemente plasma o suero, y más preferiblemente plasma humano
o suero humano. Cualquier muestra que se sospecha que contiene un
VIH-IP puede analizarse por el método de la
presente invención. Si se desea, se puede pretratar la muestra,
incluyendo pretratamientos por disolución, filtración o
centrifugación. La muestra se puede preparar en cualquier medio
conveniente que no interfiera con el ensayo, y se prefiere que sea
un medio acuoso.
El término "material de calibrado" se
refiere a cualquier material estándar o de referencia que contiene
una cantidad conocida del analito a medir. La muestra que se
sospecha que contiene el analito y el material de calibrado se
deben ensayar bajo unas condiciones lo más parecidas posibles. La
concentración de analito se calculará por comparación de los
resultados obtenidos con la muestra desconocida con los resultados
obtenidos con el estándar.
El término "fase sólida" se refiere a una
sustancia no fluida, que incluye partículas (incluyendo
micropartículas y microesferas) hechas de materiales como polímero,
metal (partículas ferromagnéticas, paramagnéticas), vidrio o
cerámica; geles como el gel de sílice, de alúmina o geles
poliméricos; capilares, que pueden estar formados por polímero,
metal, vidrio o cerámica; zeolitas y otras sustancias porosas;
electrodos; placas de microtitulación; tiras sólidas; y cubetas,
tubos o bien otros recipientes para muestras de espectrometría. Un
componente de fase sólida de un ensayo se distingue de las
superficies sólidas inertes con las que el ensayo puede estar en
contacto en que una "fase sólida" contiene al menos una región
en su superficie que está destinada a interaccionar con uno o más
de los componentes de la mezcla de ensayo.
Un sistema de ensayo para determinar la
concentración de inhibidores de la proteasa del VIH
(VIH-IP) en una muestra puede incluir
VIH-PR y un conjugado que contenga un análogo de un
VIH-IP. El conjugado se puede unir a la
VIH-PR para formar un complejo detectable; sin
embargo, cualquier VIH-IP presente también podrá
unirse a la VIH-PR, compitiendo por tanto con el
conjugado. Cuando entra en contacto la VIH-PR con el
conjugado y una muestra que contiene VIH-IP, los
niveles de VIH-PR unidos al conjugado cambian, y
este cambio se puede medir y correlacionar con la concentración de
los VIH-IP en la muestra.
En este formato de ensayo, la enzima proteasa
del VIH actúa como receptor para el conjugado y para los inhibidores
de la proteasa del VIH de la muestra. Normalmente, un inmunoensayo
convencional utiliza un anticuerpo que se una específicamente al
analito y a la porción análoga del analito de un conjugado. Véase,
por ejemplo, la solicitud de publicación de patente europea EP 1
207 394 A2. Este método puede requerir la preparación de
anticuerpos únicos para cada variedad de VIH-IP a
analizar. Mediante la utilización de VIH-PR como
receptor, cualquier tipo de VIH-IP puede
cuantificarse utilizando un único sistema de ensayo, ya que la
VIH-PR será inhibida por cualquier
VIH-PI de una muestra. Este formato puede aportar
características de ensayo diagnóstico ventajosas. Por ejemplo, una
muestra que contenga una variedad de VIH-IP
distintos puede analizarse en un solo ensayo, permitiendo la
cuantificación oportuna de los niveles globales de
VIH-IP de la muestra. Además, se puede utilizar un
único tipo de conjugado para analizar una variedad de
VIH-IP, lo que contribuye a la simplicidad del
ensayo.
La VIH-PR puede estar presente
en una mezcla de ensayo en forma de enzima libre, o puede estar
unida a otras sustancias, como una superficie de una fase sólida o
a un transportador. La utilización de VIH-PR como
receptor puede aplicarse tanto en ensayos homogéneos como en
heterogéneos. En un ensayo heterogéneo, un componente de fase
sólida del ensayo se separa del resto de la mezcla líquida del
ensayo antes de realizar la medición de interés. Por el contrario,
un ensayo homogéneo permite que se obtengan mediciones de la mezcla
de ensayo completa, incluyendo la muestra.
La utilización de una fase sólida en un ensayo
diagnóstico puede aportar una manera conveniente para localizar o
separar componentes concretos de la mezcla de ensayo de manera que
se obtengan las mediciones de interés. Se conoce una gran variedad
de configuraciones de ensayo que incluyen la utilización de un
componente de fase sólida, y éstos se pueden clasificar
aproximadamente en heterogéneos u homogéneos. Los componentes de
fase sólida, tanto en formato homogéneo u heterogéneo, pueden
contener VIH-PR como fracción activa en la
superficie de la fase sólida. Por lo tanto, la
VIH-PR puede actuar como receptor capaz de unirse
tanto a los VIH-IP como a los conjugados
detectables.
La superficie de un componente de fase sólida se
puede modificar para incluir VIH-PR por distintos
métodos. Por ejemplo, la VIH-PR puede adsorberse a
una superficie poniendo en contacto dicha superficie con una mezcla
líquida que contenga la enzima VIH-PR. En otro
ejemplo, un anticuerpo que se una a VIH-PR sin
ocultar lugares de unión cruciales de la enzima, se puede adsorber
o unir a la superficie, y la VIH-PR posteriormente
inmovilizarse en la superficie a través de su interacción con el
anticuerpo. En otro ejemplo más se puede utilizar biotina, avidina
o estreptavidina para inmovilizar una VIH-PR
modificada que contenga la pareja de unión apropiada. En este
ejemplo, puede ser conveniente modificar la VIH-PR
con la fracción de biotina más pequeña y modificar la superficie
sólida con avidina o estreptavidina. En otro ejemplo más, la
VIH-PR se puede inmovilizar mediante uniones
covalentes, como enlaces carbodiimida; enlaces tipo éster
N-hidroxi succinimida (NHS); o bien por otras
técnicas de uniones químicas. Véase, por ejemplo, Markgren, P.-O.
et al., Analytical Biochemistry 265, 340-350
(1998).
Los componentes de fase sólida para ensayos
heterogéneos pueden ser componentes estacionarios, como un tubo,
tira, cubeta o placa de microtitulación, o puede ser un componente
no estacionario, como microesferas y micropartículas. Las
micropartículas también se pueden utilizar como fase sólida para
formatos de ensayo homogéneos. Se puede utilizar una variedad de
micropartículas que permitan la unión covalente o no covalente de
proteínas o de otras sustancias. Dichas partículas incluyen
partículas de polímero como poliestireno y polimetilmetacrilato,
partículas de oro como nanopartículas de oro y coloides de oro, y
partículas de cerámica como partículas de sílice, vidrio y óxidos de
metal. Véase, por ejemplo, C.R. Martin et al. Analytical
Chemistry - News & Features, May 1, 1998,
322A-327A.
Por ejemplo, los reactivos de micropartículas
útiles se pueden formar por adsorción de la VIH-PR a
la superficie de las micropartículas. Las micropartículas preferidas
incluyen micropartículas de látex de poliestireno con un diámetro
entre 0,1 y 1,0 micrómetros (\mum). La superficie de las
micropartículas puede incluir grupos carboxilato (-COO^{-} y
-COOH). Los grupos carboxilato se pueden introducir en superficies
mediante, por ejemplo, reacciones de hidrólisis, tratamientos con un
reactivo carboxilante, o mediante formación de monocapas
autoensambladas (del inglés, self-assembled
monolayers, SAMs) que contienen grupos carboxilato. Véase, por
ejemplo, J.G. Chapman et al. J. Am. Chem. Soc., 122,
8303-8304 (2000). Por ejemplo, las micropartículas
pueden contener grupos carboxilato en concentraciones que
proporcionen un área de estacionamiento en la superficie de
carboxilatos de 5 a 200 \ring{A}^{2}, o preferiblemente de 10 a
120 \ring{A}^{2}, que se define como el área de superficie de la
micropartícula dividida entre el número total de grupos carboxilato
de la superficie.
En un ejemplo de inmovilización de la
VIH-PR, la enzima se adsorbe a las micropartículas
de látex modificadas en los grupos carboxilato. Las micropartículas
que contienen VIH-PR unida se separan de la mezcla
de adsorción y se someten a ciclos continuos de lavado y
centrifugación. Estas partículas modificadas se pueden almacenar a
temperaturas reducidas, por ejemplo a 4ºC durante un máximo de dos
semanas. Las mezclas acuosas utilizadas para la adsorción, lavado,
o preparación de mezclas madre están tamponadas, preferiblemente a
un pH entre 3,5 y 6,5. Si se utiliza una VIH-PR
sintética más robusta, las condiciones de manejo y almacenamiento
podrán ser más flexibles.
Un material de fase sólida, ya sea estacionario
o no estacionario, que posea VIH-PR unida a su
superficie, se puede utilizar en un ensayo competitivo para
cuantificar los VIH-IP de una muestra. En un formato
de ensayo competitivo, los VIH-IP de la muestra
compiten con un conjugado por la unión con la VIH-PR
inmovilizada, que funciona como receptor. La unión de la
VIH-PR al conjugado da como resultado la formación
de un complejo detectable. La medición de la cantidad de enzima
unida, si solamente está el conjugado, en comparación con la
cantidad unida en presencia de algún VIH-IP, se
puede correlacionar con la cantidad de VIH-IP de la
muestra que compite con el conjugado.
Un ejemplo de ensayo homogéneo que utiliza la
enzima VIH-PR libre como receptor es la polarización
de fluorescencia. En los ensayos de polarización de fluorescencia,
el conjugado incluye un indicador fluorescente unido al análogo del
VIH-IP. Este conjugado fluorescente compite con el
VIH-IP de una muestra por la unión a la
VIH-PR. Un conjugado que está unido a la
VIH-PR muestra una polarización de fluorescencia
diferente de la mostrada por un conjugado no unido. Por lo tanto,
el complejo detectable se cuantifica o se mide mediante la
monitorización del cambio en la polarización de fluorescencia de la
mezcla de ensayo. El cambio en la señal de polarización de
fluorescencia debido a la presencia de los VIH-IP se
puede correlacionar con la cantidad de VIH-IP en la
muestra. Véase, por ejemplo, Biochem. Biophys. Res. Comm.
5:299, 1961.
En general, las técnicas de polarización de
fluorescencia se basan en el principio de que cuando un compuesto
marcado con fluoresceína se excita mediante luz polarizada
linealmente, emitirá fluorescencia en un grado de polarización
inversamente relacionado con su tasa de rotación. Se conocen varios
derivados de la fluoresceína a partir de los que se pueden preparar
indicadores marcados con fluoresceína y están comercializados. La
mayoría de derivados de fluoresceína derivan de la posición 5 o 6 de
la fluoresceína (también se conocen como isómero I para la posición
5 e isómero II para la posición 6) e incluyen 5- o
6-N-hidroxisuccinimidilcarboxifluoresceína,
5-aminometilfluo-resceína y 5- o
6-dicloro-1,3,5-triazin-2-il-aminofluoresceína
(DTAF). La señal de los inmunoensayos de polarización de
fluorescencia se puede cuantificar en términos de unidades de
milipolarización (mP), a partir de las que se puede determinar una
curva de calibrado. La polarización de fluorescencia disminuye de
manera regular cuando la concentración del analito aumenta, y la
concentración del analito en la muestra se puede determinar por
comparación con la curva de calibrado estándar. Los ensayos de
polarización de fluorescencia, incluyendo procedimientos,
instrumental y reactivos, se describen en las patentes
estadounidenses de núm. 5 986 094, 5 070 025 y 4 868 132, y en la
solicitud de patente europea núm. EP 0 745 602 A1.
En los ensayos de polarización de fluorescencia
de los VIH-IP, la polarización de fluorescencia es
una función de la concentración del analito, y, por lo tanto, es
adecuada para cuantificar los compuestos inhibidores de la proteasa
del VIH, metabolitos de los compuestos inhibidores de la proteasa
del VIH y anticuerpos anti-proteasa del VIH. Cuando
el conjugado y la VIH-PR se mezclan en ausencia de
VIH-IP libres, la mayoría del conjugado se une a la
VIH-PR. Como resultado, cuando el indicador unido se
excita con luz polarizada en una longitud de onda de absorción
determinada, la luz emitida a la longitud de onda de emisión
permanece altamente polarizada. Sin embargo, si los
VIH-IP están presentes en la muestra, estos
competirán con el conjugado por unirse a la VIH-PR
unida a las partículas. Por tanto, habrá más cantidad de indicador
libre y la luz emitida será menos polarizada. En un ejemplo de
ensayo de polarización de fluorescencia para VIH-IP,
el conjugado incluye un análogo de VIH-IP unido a
fluoresceína. La detección del complejo de VIH-PR y
el conjugado incluye irradiar la muestra con luz a 489 nm y medir la
polarización de la luz emitida a 520 nm.
Un ejemplo de ensayo homogéneo en el que el
receptor de la VIH-PR está unido a una superficie de
una fase sólida es la aglutinación de micropartículas. En los
ensayos de aglutinación de micropartículas, el conjugado incluye
una pluralidad de análogos del VIH-IP unidos a la
sustancia transportadora. Este conjugado multivalente compite con
cualquier VIH-IP de la muestra por unirse a una
cantidad limitada de VIH-PR unida a micropartículas.
Tan solo se pueden utilizar dos análogos de VIH-IP,
de igual o distinto origen, unidos a un transportador, pero también
puede unirse al transportador una mayor cantidad de análogos de
VIH-IP. Los análogos de VIH-IP que
se originan a partir de distintos VIH-IP deben ser
competidores de los VIH-IP de la muestra. La
naturaleza multivalente del conjugado da como resultado reacciones
cruzadas y, por lo tanto, aglutinación de las micropartículas
cuando el conjugado se une a la VIH-PR inmovilizada.
El nivel de aglutinación de micropartículas que tiene lugar en
ausencia de los VIH-IP se ve por tanto reducido por
la presencia de cualquier VIH-IP en la muestra. El
complejo detectable puede medirse o cuantificarse mediante gran
variedad de técnicas de medición de la aglutinación que incluyen,
por ejemplo, la medición de la turbidez por nefelometría,
anisotropía angular y la dispersión cuasielástica de la luz. Las
mediciones de turbidez, que pueden realizarse en un
espectrofotómetro simple, detectan, por ejemplo, cambios en la
absorbancia debido al tamaño de micropartícula relacionado con el
grado de aglutinación. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense
núm. 4 480 042 y la solicitud de patente europea publicada.
Los ensayos de aglutinación de micropartículas
también se pueden llevar a cabo utilizando un análogo de
VIH-IP unido a la superficie de micropartículas, en
combinación con un transportador unido a diversas enzimas
VIH-PR. El conjugado en este ensayo contiene el
análogo del VIH-IP unido a la micropartícula, y este
conjugado compite con cualquier VIH-IP de la
muestra para unirse a la enzima VIH-PR en el
transportador multivalente. El complejo detectable se puede medir
mediante técnicas de aglutinación, como se ha descrito
anteriormente. Los análogos de VIH-IP se pueden
unir a superficies de fase sólida, por ejemplo, a través de uniones
covalentes o mediante la adsorción de un análogo de
VIH-IP que está unido a un transportador como sería
la albúmina sérica bovina. Los transportadores unidos a
VIH-IP y la adsorción de dichos transportadores a
superficies de fase sólida para formar conjugados se describen, por
ejemplo, en la solicitud co-dependiente de número de
serie 09/712 525 presentada el 14 de noviembre de 2000.
Para un ensayo homogéneo de
VIH-IP que utiliza la aglutinación de
micropartículas, puede ser beneficioso emplear un tampón acuoso que
tenga un pH entre 3,5 y 6,5, o preferiblemente entre 4,5 y 5,5. Los
tampones útiles pueden incluir cloruro sódico en una concentración
entre 0,1 y 1 molar (M), o entre 0,2 y 0,8 M, y también pueden
incluir un acelerador de la aglutinación. Los aceleradores de la
aglutinación incluyen, por ejemplo, ácido poliacrílico (PAA),
polivinilpirrolidona (PVP) y dextrán sulfato sódico, y pueden estar
presentes en la muestra a una concentración de entre el 0,5 y el 3%
o, preferiblemente, entre el 0,8 y el 2,5%.
Los ensayos heterogéneos se pueden utilizar para
cuantificar VIH-IP. Los formatos heterogéneos
preferidos incluyen ensayos de receptores en fase sólida unidos a
enzimas, en los que el conjugado incluye un análogo de
VIH-IP unido a una enzima. Los ensayos de receptores
en fase sólida unidos a enzimas se pueden realizar de forma
competitiva o no competitiva. En un formato competitivo, el análogo
del inhibidor unido a la enzima compite con cualquier analito de
una muestra por la unión a una cantidad limitada de receptor que
está inmovilizado en una fase sólida. Se pueden utilizar distintas
técnicas para la detección de un marcador enzimático. Normalmente,
las enzimas son responsables de la conversión de un sustrato en un
producto que se pueda detectar fácilmente, ya sea por su color o a
través de otra propiedad espectroscópica como la fluorescencia o
luminiscencia. En un ejemplo, la fosfatasa alcalina se puede
utilizar como marcador enzimático, y la nicotinamida adenina
dinucleótido fosfato (NADPH) se puede utilizar como sustrato
detectable.
En un ejemplo de ensayo de receptores en fase
sólida unidos a enzimas para VIH-IP, la fase sólida
puede ser micropartículas. Una muestra que se sospecha que contiene
VIH-IP se incuba con un conjugado y micropartículas
que contienen VIH-PR inmovilizada. La cantidad de
unión entre el conjugado y la VIH-PR unida que tiene
lugar en ausencia de VIH-IP se reduce como
resultado de la presencia de cualquier VIH-IP que
compita en la muestra. Los componentes no unidos de la muestra y el
conjugado se eliminan, por ejemplo, por centrifugación y
decantación. Las micropartículas pueden también ser capturadas por
un filtro que contiene una matriz de fibra de vidrio o una membrana
selectiva. Además, las partículas ferromagnéticas se pueden separar
mediante la aplicación de un campo magnético, llevando a las
partículas a los laterales o a la base del tubo. La solución
sobrenadante se puede eliminar por aspiración o decantación. Las
micropartículas aisladas de la mezcla de ensayo se pueden tratar
con un sustrato para el marcador enzimático unido, y la cantidad de
enzima unida a las partículas se puede medir y relacionar con la
concentración de VIH-IP en la muestra original.
En otro ejemplo de ensayo de receptor en fase
sólida unido a enzimas para VIH-IP, la fase sólida
puede ser una fase estacionaria, como una placa de microtitulación.
Los materiales de la fase sólida pueden ser vidrios, metales,
polímeros, plásticos, papeles o membranas. Los materiales preferidos
son plásticos como el poliestireno. En este ejemplo, una muestra
que se sospecha que contiene VIH-IP se incuba con un
conjugado en presencia de VIH-PR inmovilizada en
una placa de microtitulación. La cantidad de unión de
VIH-PR que ocurra en ausencia de
VIH-IP es reducida como resultado de la competencia
de los VIH-IP de la muestra. La porción libre de la
muestra, incluyendo cualquier conjugado no unido, se elimina por
aspiración, seguida de varios lavados y las posteriores
aspiraciones. La placa de microtitulación se puede tratar con un
sustrato para el marcador enzimático unido, y la cantidad de enzima
unida a la placa se puede medir y relacionar con la concentración de
VIH-IP en la muestra original.
En otro ejemplo más de ensayo heterogéneo para
cuantificar los VIH-IP, la VIH-PR
puede funcionar como receptor sin estar inmovilizada en una
superficie de fase sólida. Por ejemplo, un conjugado que sea capaz
de inmovilizarse, ya sea directamente (mediante enlaces covalentes
o uniones adhesivas) o indirectamente (por ejemplo por formación de
complejos con avidina/biotina), puede competir con cualquier
VIH-IP de una muestra para unirse a la
VIH-PR libre en la mezcla de ensayo. Entonces, esta
mezcla de ensayo se combina con una superficie sólida en la que se
inmoviliza el conjugado directa o indirectamente. Por lo tanto,
cualquier VIH-PR unida al conjugado será
inmovilizada en la superficie sólida y se podrá separar del resto de
la mezcla del ensayo.
En un ejemplo de este tipo de ensayo
heterogéneo, un análogo de VIH-IP unido a biotina
puede competir con cualquier VIH-IP libre en una
muestra para unirse a la VIH-PR libre en la mezcla
de ensayo. Las micropartículas que contienen avidina o
estreptavidina en la superficie se pueden combinar con esta mezcla
de ensayo, permitiendo la complejación de la biotina con la avidina
o estreptavidina unida. De este modo, cualquier
VIH-PR unida al análogo se inmovilizará en las
micropartículas. De manera similar, una fase sólida estacionaria que
contenga avidina o estreptavidina unida a la superficie puede
combinarse con la mezcla del ensayo, permitiendo la inmovilización
de la VIH-PR a través de la complejación de la
biotina con la avidina o estreptavidina. Los componentes de la
muestra que no están unidos a la fase sólida, incluyendo cualquier
VIH-PR que esté inhibida de manera competitiva por
un VIH-IP libre, serán eliminados utilizando
técnicas estándar de ensayo heterogéneo. Si el análogo de
VIH-IP se une a un marcador, la fase sólida aislada
se puede analizar utilizando técnicas espectroscópicas. Si el
análogo de VIH-IP no está unido a un marcador, la
fase sólida aislada se puede poner en contacto con un anticuerpo
anti-proteasa del VIH marcado para facilitar el
análisis espectroscópico. La VIH-PR libre también
se puede modificar antes del ensayo, por ejemplo para incluir un
marcador espectroscópico o un marcador electroquimioluminiscente.
Por ejemplo, la VIH-PR unida a la fracción de
rutenio bipiridilo se puede unir a la superficie de un electrodo
que contenga estreptavidina a través de su interacción con un
conjugado que contiene biotina y un análogo de
VIH-IP. A continuación, el electrodo se puede
separar, tratar con tripropilamina y utilizar para el análisis
electroquimioluminiscente.
Preferiblemente, los ensayos homogéneos y
heterogéneos para los VIH-IP se pueden realizar en
analizadores espectroscópicos automatizados comerciales para
proporcionar un análisis clínico exhaustivo. Son ejemplos de los
analizadores espectroscópicos automatizados disponibles el
COBAS/HITACHI y el COBAS INTEGRA (ROCHE DIAGNOSTICS SYSTEMS,
Indianápolis). Una vez se ha calibrado el analizador espectroscópico
para uno o más VIH-IP de interés, se puede analizar
una muestra de concentración desconocida de uno o más
VIH-IP, y la señal espectroscópica resultante se
correlaciona con la concentración de los VIH-IP de
la muestra. Ejemplos de analizadores espectroscópicos incluyen los
espectrofotómetros UV-Visible, fluorómetros,
luminómetros e instrumentos de RMN. Preferiblemente, la
concentración medida de VIH-IP en la muestra debe
tener un valor situado entre las concentraciones mínima y máxima
utilizadas para el calibrado.
El método de la presente invención se puede
utilizar para cuantificar los VIH-IP de muestras
biológicas. Las muestras biológicas incluyen muestras de líquidos
de un organismo, por ejemplo: orina, sangre total, plasma, suero,
saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas,
mucosidad y similares. Dichos líquidos incluyen normalmente una
variedad de componentes además del agua y el VIH-IP
de interés, que incluyen varios péptidos, lípidos, sales y otros
compuestos o anticuerpos. Estos componentes no esenciales para el
ensayo pueden interferir en la interacción entre la
VIH-PR y tanto el conjugado como los
VIH-IP, o con ambos. Por ejemplo, el conjugado o el
VIH-IP pueden adsorberse a uno o más de los
componentes no esenciales o reaccionar con ellos. La
VIH-PR también puede ser inhibida no específicamente
por otros péptidos presentes en el líquido. Es inesperado y
sorprendente que, dada la posibilidad de interferencia en los
ensayos realizados con líquidos corporales, los
VIH-IP se puedan cuantificar en muestras biológicas
mediante el uso de la VIH-PR como receptor.
El método de la presente invención puede
utilizarse, por tanto, para monitorizar los niveles de los
compuestos inhibidores de la proteasa del VIH en pacientes a los
que se les han administrado dosis terapéuticas. La valoración de
los niveles de compuestos inhibidores de la proteasa del VIH y la
correlación con síntomas positivos o negativos pueden utilizarse
para modificar el tratamiento de pacientes con SIDA. Las mediciones
de compuestos inhibidores de la proteasa del VIH también se pueden
utilizar para evaluar la efectividad de tales compuestos o de las
combinaciones de dichos compuestos. El método de la presente
invención también se puede utilizar para monitorizar en pacientes
los niveles de anticuerpos anti-proteasa del VIH.
Las determinaciones de la presencia de anticuerpos pueden ser de
ayuda en el diagnóstico de la infección por VIH, y las
determinaciones de los niveles de anticuerpos pueden ser útiles en
la valoración de la respuesta del paciente frente al virus o los
tratamientos antivirales.
Los siguientes ejemplos se aportan a modo de
ilustración.
La enzima proteasa del VIH-1
(0,65 miligramos por mililitro (mg/ml), 16 Unidades Internacionales
por miligramo (UI/mg)) se obtuvo de BACHEM AMERICAS (King of
Prussia, Pensilvania).
Se preparó un conjugado de
VIH-IP que contiene un análogo de amprenavir tal y
como se describe en una solicitud de patente
co-dependiente con número de serie 10/192 052
presentada el 10 de julio de 2002.
Se agitaron durante la noche amprenavir (0,1517
g) y cloruro de
succinimido-oxicarbonil-butirilo
(0,0817 g) en dimetilformamida anhidra (DMF) (3 ml) a 50ºC. La
mezcla se secó por evaporación bajo presión reducida y se purificó
directamente mediante cromatografía en gel de sílice (15% de
tetrahidrofurano (THF) en una elución de acetato de etilo) para dar
N-(succinimido-oxicarbonil-butiril)-amprenavir
en forma de sólido blanco (0,1395 g; rendimiento del 61%).
Espectrometría de masas: M+Na 739,2. Los datos espectrales
(^{1}H-NMR) fueron compatibles con la
funcionalización del nitrógeno de la anilina.
(a) Se agitaron
N-(succinimido-oxicarbonil-butiril)-amprenavir
(131,5 mg) y ácido
glicil-glicil-4-aminobutírico
(43,4 mg, Bachem California Inc., CA) durante 7 horas en borato
acuoso al 25% (pH 10) en THF (5 ml). La mezcla se secó por
evaporación bajo presión reducida y se purificó directamente
mediante HPLC preparativa de fase inversa (45% de
acetonitrilo-agua, conteniendo un 0,1% de ácido
trifluoroacético) para dar
N-(3-carboxipropilamino-^{co}glicil-glicil-glutaril)-amprenavir
en forma de sólido blanco (98,2 mg; rendimiento del 65%).
Espectrometría de masas: M+H 817,4.
(b) Se agitan dar
N-(3-carboxipropilamino-^{co}glicil-glicil-glutaril)-amprenavir
(40,9 mg), N-hidroxisuccinimida (11,5 mg) y etil
dimetilaminopropil carbodiimida (19,2 mg) durante 5 horas en DMF
anhidra al 20% en cloruro de metileno (2,5 ml). La mezcla se secó
por evaporación bajo presión reducida y se purificó directamente
mediante cromatografía en gel de sílice (12% de metanol en una
dilución de cloroformo) para dar
N-(succinimidil-oxicarbonil-propil-amino-^{co}glicil-glicil-glutaril)-amprenavir
en forma de espuma blanca (37,9 mg; rendimiento del 83%).
Espectrometría de masas: M+H 938,4.
El derivado de APV utilizado en la preparación
de conjugados fue
N-(succinimidil-oxicarbonil-propilamino-^{co}gli-cil-glicil-glutaril)-amprenavir,
que tiene la siguiente estructura:
Se preparó una solución madre de un
transportador de aminodextrano (AMD; 40 kDa de pm; 5,7 aminas por
molécula) mediante disolución de 80 mg de AMD en 4 ml de dimetil
sulfóxido (DMSO), para una concentración final de 20 mg/ml. Se
preparó una solución madre con 20 mg/ml de derivado de APV,
disolviendo 22 mg de derivado de APV en 1,1 ml de DMSO. El producto
liofilizado se preparó añadiendo gota a gota 0,183 ml de solución
madre de derivado de APV (relación molar de 4:1 de derivado de APV
respecto a AMD) o 0,366 ml de solución madre de derivado de APV
(relación molar de 8:1 de derivado de APV respecto a AMD) mientras
se agitaban 2 ml de solución madre de AMD a temperatura ambiente.
Se dejó la mezcla de reacción en agitación durante 24 horas a
temperatura ambiente. La solución de la reacción se dializó
posteriormente frente a DMSO al 80, 60, 40 y 20% y agua desionizada.
La solución dializada se liofilizó y se mantuvo a -20ºC.
Una solución madre con 0,5 mg/ml de conjugado se
preparó disolviendo 2 mg del producto liofilizado en 4 ml de Tampón
fosfato salino (PBS) 20 mM, pH 7,2. Se realizaron diluciones en
serie, con un factor diferencial de dos, en el mismo tampón para un
volumen final de 2 ml, dando como resultado las soluciones de
conjugado con concentraciones de 0,25 mg/ml y 0,125 mg/ml. Se
realizaron las mismas concentraciones de solución madre y las
mismas diluciones en serie para AMD. Se obtuvieron las mediciones de
absorbancia a 264 nm para las distintas concentraciones de
conjugado utilizando las soluciones de AMD a las concentraciones
correspondientes como blancos de calibrado. Los datos y resultados
de los cálculos de la carga y carga promedio se muestran en la Tabla
1.
| Relación de carga | APV-AMD \mug/ml | Absorbancia promedio | APV, mM | Carga | Carga promedio |
| 125 | 0,1643 | 6,5720E-03 | 2,10 | ||
| 4:1 | 250 | 0,3327 | 1,3308E-02 | 2,13 | 2,15 |
| 500 | 0,6909 | 2,7636E-02 | 2,21 | ||
| 8:1 | 125 | 0,2809 | 1,1236E-02 | 3,60 | |
| 250 | 0,5849 | 2,3394E-02 | 3,74 | 3,75 | |
| 500 | 1,2188 | 4,8753E-02 | 3,90 |
Se diluyeron 5 ml de suspensión al 10% de
micropartículas de látex sólidas modificadas en los grupos
carboxilato (0,198 \mum, áreas de estacionamiento de 41
\ring{A}^{2}, fabricada por SERADYN, INC., Indianápolis, IN)
hasta el 1% de sólido con agua desionizada. Se centrifugó la
suspensión a 32.600 x g durante una hora a 4ºC. El sedimento se
recogió y se resuspendió mediante sonicación en agua desionizada. La
suspensión se centrifugó a 32.600 x g durante 1 hora a 4ºC. Se
recogió el sedimento y se resuspendió mediante sonicación en ácido
2-(N-morfolino)-etanosulfónico
(MES) 50 mM, pH 5,5. Las micropartículas de látex se almacenaron a
4ºC.
Se añadieron 0,33 ml de MES 50 mM (pH 5,5) y
0,33 ml de suspensión de látex sólido al 1,18% bajo agitación a un
tubo de microcentrífuga de 1,7 ml seguido de la adición de 0,33 ml
de 0,3 mg/ml de VIH-1 PR (proporcionada en tampón
de acetato sódico 0,1 M; pH 5,5; glicerol al 10% (v/v); y de
etilenglicol al 5% (v/v)). La solución de reacción se mezcló
convenientemente y se incubó durante la noche a 4ºC. Al día
siguiente, la mezcla se centrifugó a 32.600 x g durante 1 hora a
4ºC. Se recogió el sedimento y se resuspendió mediante sonicación
en 0,5 ml de MES 50 mM (pH 5,5) y se añadieron 0,5 ml de albúmina
sérica bovina (BSA) al 2% (disuelta recientemente en MES 50 mM; pH
5,5; NaN_{3} al 0,09%) a la solución resuspendida. La solución se
mezcló convenientemente y se incubó durante la noche a 4ºC. Al día
siguiente, la mezcla se centrifugó a 32.600 x g durante 1 hora a
4ºC. El sedimento se recogió y se resuspendió mediante sonicación en
1 ml de tampón de ensayo de VIH-PR (acetato de
sodio (NaOAc) 50 mM, pH 4,9, cloruro sódico (NaCl) 200 mM, 5 ml de
ditiotreitol (DTT) y glicerol al 10%(v/v)). Después, la mezcla se
centrifugó a 32.600 x g durante 1 hora a 4ºC. Se recogió el
sedimento y se lavó con tampón de ensayo de VIH-PR
como se ha descrito anteriormente. Después del lavado final, el
sedimento se resuspendió en 1 ml de tampón de ensayo de
VIH-PR. Finalmente, la concentración final de
micropartículas de látex se determinó por comparación de las
micropartículas de látex con las curvas estándar a cinco longitudes
de onda distintas (340, 405, 500, 550 y 600 nm) en un ROCHE COBAS
MIRA (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianápolis, IN).
Los reactivos de micropartículas de látex
preparados como se ha descrito anteriormente se diluyeron con tampón
de ensayo de VIH-PR hasta conseguir una suspensión
de látex sólido al 0,08%. Cada uno de los conjugados de
APV-AMD 2,15:1 y 3,75:1 a nueve concentraciones
diferentes (0; 0,4; 0,8; 1; 2; 3; 4; 5 y 6 \mug/ml) se mezcló con
tampón de ensayo de VIH-PR y ácido poliacrílico
(PAA) al 2,5%. Se utilizó ROCHE ZERO CALIBRATOR (suero humano
normal) (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianápolis, IN) como muestra de suero.
Las figuras 1 y 2 son gráficos de los resultados obtenidos para los
conjugados 3,75:1 y 2,15:1, respectivamente. Estas pruebas de
aglutinación se realizaron en ROCHE COBAS MIRA. Los parámetros de
ensayo utilizados en el ROCHE COBAS MIRA se muestran en la Tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
| Longitud de onda | 600 nm |
| Temperatura | 37ºC |
| Volumen de la muestra | 2 ml |
| Reactivo de conjugado | 100 \mul |
| Reactivo de micropartículas | 95 \mul |
| Empuje del agua | 0 |
| Preincubación Muestra/Conjugado | 2,08 min. |
| Tiempo de lectura | 6,25 min. |
Se preparó una solución madre de 1 mg/ml de APV
mediante la disolución de 1 mg de APV en 1 ml de DMSO. A la
solución madre de APV se añadió ROCHE DIAGNOSTICS CALIBRATOR para
obtener series de las muestras de suero a concentraciones de 0,5;
1,5; 2,5; 3,5 y 5 \mug/ml. El reactivo de micropartículas se
preparó como se describe en el ejemplo 1. El reactivo del conjugado
contenía 5 \mug/ml de conjugado APV:AMD (3,75:1) en el tampón de
ensayo de VIH-PR y PAA al 2,5%. Las pruebas de
inhibición/sustitución de la aglutinación se llevaron a cabo en
ROCHE COBAS MIRA utilizando varias concentraciones de APV preparadas
en suero humano normal. Los parámetros de ensayo utilizados con
ROCHE COBAS MIRA son los mismos que en el ejemplo 2. Los resultados
del ensayo de inhibición competitiva medidos mediante la
aglutinación de micropartículas a varias concentraciones de APV se
muestran en la Figura 3.
Las soluciones madre que contienen un conjugado
y la VIH-PR unida a micropartículas se preparan como
en el ejemplo 1. Una solución madre que contiene inhibidores de la
proteasa (sulfato de indinavir, mesilato de nelfinavir, ritonavir y
saquinavir) se prepara en metanol como se describe en Remmel et
al. Se preparan diferentes soluciones de calibrado mediante
dilución de la solución madre, de manera que la concentración final
oscila entre 0,05 y 19,4 \mug/ml para indinavir, 0,02 y 8,6
\mug/ml para nelfinavir, 0,05 y 20,0 \mug/ml para ritonavir y
0,02 y 8,8 \mug/ml para saquinavir (Remmel et al). Se
prepara a parte una solución madre en metanol para el control de
calidad. Las muestras de suero o plasma se obtienen de los
voluntarios humanos sanos y se suplementan con una porción de la
solución madre de los inhibidores de la proteasa del VIH. Estas
muestras suplementadas con VIH-IP se incuban con la
solución de micropartículas con VIH-PR y el
conjugado. La concentración de los inhibidores de la proteasa se
establece mediante monitorización de la aglutinación de
micropartículas de VIH-IP en las muestras de suero
o plasma. La absorbancia aumentada, debida al aumento de tamaño de
las micropartículas por la aglutinación, se mide mediante un
espectrofotómetro.
Ya que la concentración de inhibidores de
proteasa del VIH es inversamente proporcional al descenso de la
absorbancia medida, se calcula la concentración de inhibidores de
proteasa en el suero o plasma.
Las soluciones madre que contienen un conjugado
y VIH-PR unida a micropartículas se preparan como en
el ejemplo 1. Las muestras de suero o plasma se obtienen de
pacientes con SIDA 8 horas después de su tratamiento con una dosis
por vía oral de inhibidores de la proteasa (VIH-IP).
Entonces, las muestras de suero o plasma de los pacientes con SIDA
se incuban con la solución de micropartículas de
VIH-PR y el conjugado, y la concentración de
VIH-IP se establece por la medición de la
aglutinación de las micropartículas de VIH-IP en las
muestras de suero o plasma. La absorbancia incrementada, debido al
aumento de tamaño de las micropartículas por la aglutinación, se
mide mediante un espectrofotómetro.
Ya que la concentración de inhibidores de
proteasa del VIH es inversamente proporcional al descenso de la
absorbancia medida, se calcula la concentración de inhibidores de
proteasa en el suero o plasma.
Las soluciones madre que contienen un conjugado
y VIH-PR unida a micropartículas se preparan como en
el ejemplo 1. Las muestras de suero o plasma se obtienen de
pacientes con SIDA dentro del primer año desde el momento del
diagnóstico de SIDA, y entonces se incuban con la solución de
micropartículas con VIH-PR y el conjugado, y la
concentración de VIH-IP se establece por la medición
de la aglutinación de las micropartículas de VIH-IP
en las muestras de suero o plasma. La absorbancia incrementada,
debido al aumento de tamaño de las micropartículas por la
aglutinación, se mide mediante un espectrofotómetro.
Ya que la concentración de anticuerpos
anti-proteasa del VIH es inversamente proporcional
al descenso de la absorbancia medida, se calcula la concentración
de anticuerpos anti-proteasa del VIH en el suero o
plasma.
Claims (15)
1. Un método para cuantificar un inhibidor de la
proteasa del VIH en una muestra, que incluya los siguientes
pasos:
combinar una proteasa del VIH, un conjugado que
contenga un análogo de un inhibidor de la proteasa del VIH y una
muestra que se sospecha que contiene un inhibidor de la proteasa del
VIH, en la que la proteasa del VIH y el conjugado forman un
complejo detectable; medir la cantidad de dicho complejo; relacionar
la cantidad del mismo con una concentración de inhibidor de la
proteasa del VIH de la muestra.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la proteasa del VIH se inmoviliza en la superficie de una fase
sólida.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
el inhibidor de la proteasa del VIH incluye un miembro seleccionado
del grupo formado por un compuesto inhibidor de la proteasa del VIH,
un anticuerpo anti-proteasa del VIH y un metabolito
de un compuesto inhibidor de la proteasa del VIH.
4. El método de la reivindicación 1, en el que
el inhibidor de la proteasa del VIH incluye un miembro seleccionado
del grupo formado por amprenavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir,
ritonavir y saquinavir.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
el conjugado incluye un marcador.
6. El método de la reivindicación 5, en el que
el marcador incluye un miembro seleccionado del grupo formado por
un marcador fluorescente, un compuesto luminiscente, un isótopo
radiactivo, un marcador quimioluminiscente, una enzima y un
sustrato enzimático.
7. El método de la reivindicación 2, en el que
el conjugado incluye un transportador y al menos dos análogos de
inhibidores de la proteasa del VIH unidos al transportador, y en el
que la medición de la cantidad de complejo detectable incluye la
medición de la aglutinación.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
el conjugado incluye un marcador fluorescente, y la medición del
complejo detectable incluye la medición de la polarización de la
fluorescencia.
9. El método de la reivindicación 2, en el que
la fase sólida incluye un miembro seleccionado del grupo formado
por una partícula, una placa de microtitulación, una cubeta, un tubo
y una tira.
10. El método de la reivindicación 2, en el que
la cantidad de complejo detectable incluye la medición de una
propiedad espectroscópica de la fase sólida.
11. El método de la reivindicación 1, en el que
el conjugado incluye biotina; método que también incluye la
inmovilización del complejo detectable en la superficie de una fase
sólida, que contiene avidina o estreptavidina.
12. El método de la reivindicación 11, en el que
la proteasa del VIH está unida a un marcador.
13. Un método para cuantificar un inhibidor de
la proteasa del VIH en una muestra, de acuerdo con la reivindicación
1, que se caracteriza por combinar una proteasa del VIH, un
conjugado que incluye un transportador y al menos dos análogos de
inhibidores de la proteasa del VIH unidos al transportador y una
muestra que se sospecha que contiene un inhibidor de la proteasa
del VIH. La proteasa del VIH está inmovilizada en una superficie de
una micropartícula, la proteasa del VIH y el conjugado experimentan
un proceso de aglutinación, y la muestra es suero humano o plasma
humano. Posteriormente se mide la aglutinación y se relaciona el
nivel de aglutinación con una concentración de inhibidor de la
proteasa del VIH en la muestra.
14. Un método para cuantificar un inhibidor de
la proteasa del VIH en una muestra, de acuerdo con la reivindicación
1, que se caracteriza por combinar un transportador
multivalente que incluye al menos dos enzimas proteasa del VIH, un
conjugado que incluye una micropartícula y un análogo de inhibidor
de la proteasa del VIH y una muestra que se sospecha que contiene
un inhibidor de la proteasa del VIH. La proteasa del VIH y el
conjugado experimentan un proceso de aglutinación, y la muestra es
suero humano o plasma humano. Posteriormente se mide la
aglutinación y se relaciona el nivel de aglutinación con una
concentración de inhibidor de la proteasa del VIH en la
muestra.
15. Un método para cuantificar un inhibidor de
la proteasa del VIH en una muestra, de acuerdo con la reivindicación
1, que se caracteriza por combinar una proteasa del VIH, un
conjugado que incluye un marcador y un análogo de un inhibidor de
la proteasa del VIH unido al marcador, y una muestra que se sospecha
que contiene un inhibidor de la proteasa del VIH. La proteasa del
VIH y el conjugado forman un complejo detectable, y la muestra es
suero humano o plasma humano. Posteriormente se mide la cantidad de
complejo detectable mediante monitorización de un cambio en la
polarización de fluorescencia y se relaciona la cantidad de complejo
detectable con una concentración de inhibidor de la proteasa del
VIH en la muestra.
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