ES2268226T3 - Basterias bifidobacterium longun y preparaciones que las contienen. - Google Patents

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Abstract

Un cultivo biológicamente puro de la cepa Bifidobacterium Longum LMG P-21586

Description

Bacterias Bifidobacterium Longum y preparaciones que las contienen.
La presente invención se refiere al uso de microorganismos no patógenos del género Bifidobacterium Longum con objeto de favorecer la salud gastrointestinal y en particular para prevenir y/o tratar las indisposiciones del tracto gastrointestinal, particularmente del intestino.
Se conocen desde hace bastante tiempo muchos tipos de bacterias utilizados como agentes de fermentación para conservación de alimentos o preparación de alimentos lácteos como yogur u otros productos lácteos; estas bacterias se designan bajo el término genérico de "bacterias de ácido láctico" y comprenden muchos géneros como Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium y Pediococcus.
En fecha más reciente, estas bacterias están siendo objeto de mayor atención debido a que, una vez ingeridas, han demostrado propiedades notables en el hombre y los animales; en particular cepas de Lactobacillus o Bifidobacterium, administradas a veces juntas en combinación, han demostrado eficacia en la colonización de la mucosa intestinal y en la ayuda a la salud de las personas, por prevención de la colonización por otros microorganismos nocivos, como se indica en las patentes U.S. 5.494.664 y 6.241.983 y en las Solicitudes de Patentes Internacional WO 0033854 y
WO 0110453.
Estos microorganismos se denominan también "probióticos" y un requisito fundamental para su efecto beneficioso es que los mismos puedan alcanzar la mucosa intestinal en tal número y con tal vitalidad que sean capaces de persistir y colonizar el intestino, por lo cual es necesario que resistan convenientemente al bajo pH del estómago.
La toma de productos probióticos está recomendada en el caso de indisposiciones intestinales, tales como estreñimiento o diarrea y después de períodos de tratamiento con antibióticos, es decir en particular en todas aquellas circunstancias que conducen a un empobrecimiento de la flora bacteriana intestinal y también en todas aquellas circunstancias en las cuales una alimentación pobre en fibras, las condiciones ambientales, o el estrés disminuyen la vitalidad de la flora bacteriana intestinal.
El restablecimiento de niveles adecuados de microorganismos presentes naturalmente en la flora bacteriana intestinal por utilización de cepas bacterianas bien caracterizadas y extraídas de la flora de personas sanas es el objetivo de una dicha administración.
La actividad colonizadora de microorganismos exógenos en el intestino depende de su concentración, de su capacidad para colonizar y de las condiciones ambientales que encuentran los mismos en el intestino, debido a que la administración de una cantidad mayor, una alta capacidad de colonización y condiciones ambientales adecuadas contribuyen a su efecto protector y curativo mediante la colonización de grandes porciones en el interior del intestino sin efectos secundarios dado que los mismos son productos de origen natural. En particular, debe subrayarse que la posible presencia de fibras alimentarias, como por ejemplo inulina o fructo-oligosacáridos, contribuye principalmente a la colonización debido a que estos compuestos son un sustrato para el producto probiótico y por consiguiente aumentan las posibilidades de colonización. Dichos oligosacáridos han sido denominados también "prebióticos" debido a su acción sinérgica con el probiótico.
El documento US 5.494.664 se refiere a un cultivo biológicamente puro de una cepa seleccionada del grupo constituido por Bifidobacterium Breve CNCM I-1226, Bifidobacterium Infantis CNCM I-1227 y Bifidobacterium Longum CNCM I-1228.
La publicación Microbial Ecology in Health and Disease 1999; 11:41-46 da a conocer los efectos de la administración de yogur de Bifidobacterium Longum BB536 sobre el ambiente intestinal de adultos sanos.
El documento US 6.306.638 da a conocer una cepa mutante de Bifidobacterium aislada que crece en condiciones aerobias, es aproximadamente 10 veces más tolerante al ácido clorhídrico que Bifidobacterium a un pH de aproximadamente 1,5-4,5, y es tolerante a la bilis de buey a aproximadamente 0,3% (p/v en un medio de cultivo).
Descripción de la invención
Cultivos biológicamente puros de una cepa de Bifidobacterium Longum denominada W11, depositada en las Colecciones Belgas Coordinadas de Microorganismos - BCCM LMG-Collection que ha registrado la misma bajo el número de acceso LMG P-21586, su uso como probióticos con preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario y las preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario que contienen la misma útiles para favorecer la salud gastrointestinal y prevenir y tratar las patologías intestinales son el objeto de la presente invención.
La cepa de Bifidobacterium Longum W11 ha sido aislada de la flora bacteriana intestinal de un hombre sano y se ha seleccionado entre muchas otras cepas de Bifidobacterium Longum aisladas al mismo tiempo debido a que ha demostrado una capacidad colonizadora en la flora bacteriana intestinal y una capacidad de adherencia a las células intestinales, características ambas que, juntas, hacen de la misma un agente probiótico muy satisfactorio capaz de favorecer la
buena salud del tracto gastrointestinal y restablecer su funcionalidad alterada por gastroenteritis de orígenes diversos.
El cultivo bacteriano objeto de la presente invención se ha producido primeramente en laboratorio y posteriormente en preparaciones industriales y está compuesto de cepas puras que se han desarrollado durante 20 horas a 37ºC en un medio de cultivo adecuado denominado TPY que contiene como ingredientes principales caseína-peptona tríptica, peptona de soja, extracto de levadura y glucosa además de sales de potasio, calcio, magnesio y cinc.
A partir de este cultivo primario se han preparado sub-cultivos subsiguientes con la finalidad de aumentar el número de células de cepas puras hasta obtener los cultivos madre que se han utilizado como inoculación para la producción industrial de los cultivos bacterianos del material probiótico Bifidobacterium Longum W11.
El proceso de producción industrial de dicho cultivo bacteriano prevé los pasos siguientes:
1.
fermentación a un pH controlado entre 5,5 y 7,5;
2.
separación de la biomasa bacteriana del caldo de cultivo por centrifugación;
3.
liofilización de la biomasa bacteriana, después de adición de crioprotectores adecuados seleccionados de proteidos, carbohidratos y sales minerales para salvaguardar la vitalidad de las células a lo largo del paso de congelación y liofilización, posiblemente también con adición de un precipitado proteico con la finalidad de aumentar la resistencia de la cepa a la degradación enzimática y a condiciones de pH ácido;
4.
molienda y granulación del cultivo liofilizado.
El producto así preparado contiene un promedio de aproximadamente 1 x 10^{10} a aproximadamente 1 x 10^{12} células vivas de Bifidobacterium Longum W11 por cada gramo de producto final, analizado de acuerdo con métodos microbiológicos de recuento bacteriano conocidos por las personas expertas en la técnica, como por ejemplo los consignados en Ison A.P. y Matthew G.B., Applied Microbial Physiology a Practical Approach, compiladores Rhodes P.M. y Stanbury P.F. - IRL Press Oxford, 103-130, 1997.
El cultivo bacteriano se ha comprobado en ensayos de colonización del intestino de ratones con resultados positivos dado que el recuento de la cantidad de carga bacteriana del Bifidobacterium Longum LMG P-21586 ha exhibido un valor mayor que 1 x 10^{6} células vivas por cada gramo de heces de ratón.
Objeto adicional de la presente invención, partiendo estrictamente del objeto principal, es el uso del cultivo biológicamente puro obtenido de las cepas de Bifidobacterium Longum W11 como material probiótico en preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario útiles para favorecer la salud gastrointestinal y en la prevención y el tratamiento de las patologías intestinales tales como diarreas, gastroenteritis de diverso origen, estreñimiento, colon irritable, enfermedad diverticular y enfermedades inflamatorias crónicas del intestino. La eficacia de los cultivos bacterianos que contienen el Bifidobacterium Longum W11 para favorecer la salud gastrointestinal puede incrementarse añadiendo a las preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario que las contienen fibras alimentarias en la forma de oligosacáridos indigeribles, por ejemplo fructo-oligosacáridos o inulina, que no son absorbidos ni hidrolizados en el primer tracto del intestino y refuerzan la actividad y estimulan el metabolismo de las cepas de Bifidobacterium Longum LMG P-21586 con desventaja de las bacterias patógenas. Los oligosacáridos preferidos en la realización de la presente invención son mezclas de fructo-oligosacáridos constituidas por una unidad básica consistente en una molécula de glucosa (G), unida a una cadena de moléculas de fructosa (F) de fórmula general GFn, con n \leq 4, teniendo un grado de polimerización, es decir un número de unidades de monosacárido, comprendido entre 2 y 20. Los fructo-oligosacáridos utilizados como materiales prebióticos asociados con los dos tipos de materiales prebióticos objeto de la presente invención tienen un grado de polimerización entre 2 y 10, preferiblemente entre 3 y 6.
La preparación objeto de la presente invención puede contener, junto con diversos excipientes tales como edulcorantes, por ejemplo aspartamo, manitol o sorbitol, sustancias saborizantes y colorantes, vitaminas, preferiblemente vitaminas de los grupos E, B1, B2, B6 y B12, que tienen la finalidad de favorecer adicionalmente la salud por restablecimiento del componente vitamínico que sufre una disminución acusada durante las patologías del tracto intestinal.
Objeto de la presente invención son tanto preparaciones farmacéuticas como productos alimentarios que contienen cultivos bacterianos de Bifidobacterium Longum denominado W11 y registrados con el número de acceso LMG P-21586, opcionalmente en asociación con materiales prebióticos, preferiblemente fructo-oligosacáridos o inulina, y/o vitaminas, preferiblemente vitaminas de los grupos E, B1, B2, B6 y B12.
Las preparaciones farmacéuticas están hechas preferiblemente de composiciones administrables por vía oral en forma de cápsulas, tabletas, sobres, trociscos, suspensiones líquidas, suplementos orales secos, suplementos orales líquidos, viales y algunos otros que contienen una carga bacteriana de células vivas de Bifidobacterium Longum W11 entre 1 x 10^{7} y 1 x 10^{11} al final del periodo de estabilidad.
Dichas preparaciones farmacéuticas pueden contener también agentes prebióticos como los fructo-oligosacáridos o la inulina, preferiblemente de 0,5 a 5 g de fructo-oligosacárido por cada dosis, más preferiblemente de 1 a 3 g, y/o vitaminas, preferiblemente vitaminas de los grupos E, B1, B2, B6 y B12. Cantidades de material probiótico de 1 x 10^{7} a 1 x 10^{11} de células vivas de Bifidobacterium Longum pueden incorporarse también en la fabricación de muchas clases de productos alimentarios tales como leche, yogur, quesos frescos tales como ricotta, stracchino y mozzarella (clases de queso italiano), helados, productos constituidos por leche fermentada, productos constituidos por cereales fermentados, polvos lácteos, productos para niños y productos para animales domésticos. Los ensayos para la comprobación del recuento bacteriano han demostrado que la cepa de Bifidobacterium Longum objeto de la presente invención es tan resistente que no sufre una mortalidad sensible durante los procesos tecnológicos de producción de las preparaciones farmacéuticas o alimentarias, o a todo lo largo del período normal de almacenamiento de la misma. De hecho, estas preparaciones bacterianas se han sometido a ensayos de estabilidad que han demostrado una resistencia extremadamente satisfactoria de las dos cepas bacterianas a la temperatura ambiente por lo que su venta puede continuarse durante no menos de dos años después de su fabricación.
Los ejemplos consignados más adelante en esta memoria son útiles para una ilustración adicional de la invención y no deben considerarse como limitación de la misma.
Ejemplo 1 Método de fabricación del cultivo bacteriano de la cepa Bifidobacterium Longum W11
El "cultivo primario" de la cepa de Bifidobacterium Longum W11 utilizado como inoculación de las fermentaciones industriales es exactamente el mismo que el depositado en las Colecciones Belgas Coordinadas de Microorganismos - BCCM LMG-Collection - Laboratorium voor Microbiologie, Universidad de Gante, que al aceptar la cepa expedida ha ratificado la pureza y la vitalidad de la cepa, y ha registrado la misma con el número de acceso LMG P-21586.
Para obtener este "cultivo primario" dicha cepa se ha dejado crecer en un medio de cultivo denominado TPY que tiene la composición siguiente cuando se refiere a un litro:
- Peptona tríptica de caseína 10 g
- Peptona de soja 5 g
- Extracto de levadura 5 g
- Glucosa 10 g
- K_{2}HPO_{4} anhidro 2 g
- MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 0,5 g
- ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,25 g
- CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 0,15 g
- Tween 80 1 ml
- Hidrocloruro de cisteína 0,5 g
- Agua bidestilada cs hasta 1000 ml.
El crecimiento se ha llevado a cabo a 37ºC durante 20 horas y después de ello el cultivo se ha distribuido, con la adición de crioprotectores adecuados seleccionados de proteidos, carbohidratos y sales minerales, en viales que se han congelado y guardado en nitrógeno líquido a -196ºC.
Partiendo del "cultivo primario", con un porcentaje de inoculación de 3%, se han preparado 3 sub-cultivos con la finalidad de aumentar el número de células de la cepa bacteriana.
El último sub-cultivo de aproximadamente 10 litros, denominado "cultivo madre", se ha utilizado para inocular el reactor del "cultivo intermedio" que tiene una capacidad de aproximadamente 300 litros.
El proceso subsiguiente de la fabricación industrial del cultivo biológicamente puro de Bifidobacterium Longum W11 comprende los pasos siguientes:
1.
fermentación a un pH controlado entre 6,5 y 7,0;
2.
separación de la biomasa bacteriana del caldo de cultivo;
3.
protección de la biomasa bacteriana por medio de una solución de crioprotectores seleccionados de proteidos, carbohidratos y sales minerales con la finalidad salvaguardar la vitalidad de las células durante los pasos subsiguientes de congelación y liofilización, y posiblemente también por inclusión en un precipitado proteico con la finalidad de proporcionar también a la cepa resistencia a la degradación enzimática y a condiciones de pH ácido;
4.
liofilización;
5.
molienda y granulación del cultivo liofilizado;
6.
mezcla del cultivo liofilizado;
7.
envasado.
El producto obtenido contiene aproximadamente 8 \div 10 x 10^{10} células vitales por cada gramo.
Ejemplo 2 Ensayos de colonización in vivo
Los ensayos se han llevado a cabo en 4 grupos de 2 ratones, habiendo recibido cada ratón dos dosis, la segunda 16 horas después de la primera, de una solución de glucosa que contenía Bifidobacterium Longum LMG P-21586 a una concentración igual a 1,6 x 10^{9} CFU (unidades formadoras de colonias)/60 \mul.
La capacidad de la cepa en cuanto a la colonización del intestino de estos ratones se ha comprobado por cálculo de la cantidad de Bifidobacterium Longum presente en las heces: la primera toma de muestras se ha realizado antes de iniciar las alimentaciones, mientras que las tomas de muestras subsiguientes se han realizado respectivamente 2, 4, 8, 24, y 48 horas después de la segunda administración. La cantidad de la cepa de Bifidobacterium Longum encontrada en las heces ha estado situada en la región de 10^{6} CFU/g, demostrando así que se ha producido colonización. En particular, se ha encontrado que el Bifidobacterium Longum resulta ser el componente principal de la flora bacteriana con respecto a todas las cepas de bifidobacterias encontradas en las heces.
Ejemplo 3 Formulación en bolsas en asociación con fructo-oligosacáridos y vitaminas
Se consigna como ejemplo la preparación de bolsas, cada una de las cuales pesa 3 g para disolución en agua o leche y que contienen 250 mg de cultivo bacteriano biológicamente puro correspondiente a aproximadamente 2 x 10^{10} células vivas de Bifidobacterium Longum W11, 2500 mg de fructo-oligosacáridos y vitaminas de los grupos B1, B2, B6 y B12.
En particular, se ha utilizado como fructo-oligosacárido el producto disponible comercialmente denominado
Actilight® 950P compuesto de una mezcla de fructo-oligosacáridos formados por una cadena de moléculas de fructosa unidas a una molécula de glucosa de fórmula general GFn con n \leq 4 y con un grado de polimerización entre 2 y 10.
La composición cuali-cuantitativa detallada de las bolsas es como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Componente mg
Bifidobacterium Longum W11 250
Actilight® 950P 2500
Vitamina B1 1,4
Vitamina B2 1,6
Vitamina B6 2
Vitamina B12 0,001
Aroma de mandarina 20
Aspartamo 20
Gel de sílice 10
Sorbitol 195
Método de preparación
Se lleva a cabo un primer paso de mezcladura de las vitaminas con una parte alícuota de Actilight® 950P, seguido por tamizado sobre un tamiz que tiene 0,5 mm de apertura de malla. Esta primera mezcla se añade a una segunda parte alícuota de Actilight® 950P y se lleva a cabo un segundo paso de mezcladura. Por último, el cultivo bacteriano de Bifidobacterium Longum W11, la parte alícuota restante de Actilight® 950P y los otros componentes de la formulación se añaden con mezcladura adicional seguida por un tamizado final sobre un tamiz de 0,8 mm.
El producto se distribuye luego en bolsas de aluminio que pesan 3 g. El proceso tecnológico de preparación de las bolsas no causa deterioro alguno a la vitalidad de la cepa.
Ensayos de estabilidad
Los ensayos de estabilidad se han llevado a cabo sobre las bolsas midiendo la carga bacteriana en el tiempo 0 y respectivamente después de 1, 2 y 3 meses de almacenamiento a 22ºC para fijar así el tiempo de semi-vida. El análisis de los datos después de 1, 2 y 3 meses ha demostrado que la mortalidad es muy baja en estos periodos de tiempo, de tal modo que al cabo de 2 años el número de células vivas para cada dosis no es inferior a 5 x 10^{9} células en la formulación anterior de dichas bolsas. Dicho resultado demuestra que esta preparación es perfectamente adecuada para los objetivos que la presente invención pretende alcanzar.
Ejemplo 4 Formulaciones de cápsulas blandas de gel en asociación con vitaminas
Se han preparado cápsulas blandas de gel con la composición cuali-cuantitativa siguiente:
Componente mg
Bifidobacterium Longum W11 125
Mono- y diglicéridos de los ácidos grasos 14
Aceite de soja 261,372
Lecitina de soja 5
Tocoferoles naturales (E) 16,418
Mononitrato de tiamina (B1) 2,072
Hidrocloruro de piridoxina (B6) 2,918
Riboflavina (B2) 1,920
Cianocobalamina 0,1% (B12) 1,300
Gelatina alimentaria 116
Glicerol 71
Dióxido de titanio 4,140
Óxido de hierro amarillo 0,200
Produciendo una suspensión homogénea del cultivo bacteriano de Bifidobacterium Longum W11, las vitaminas, la lecitina de soja y los mono- y diglicéridos de los ácidos grasos en lecitina de soja, distribuyendo dicha suspensión en cápsulas ovaladas de tamaño 7,5 hechas de gelatina alimentaria, glicerol, dióxido de titanio y óxido de hierro amarillo y secando luego con una corriente de aire a una temperatura de aproximadamente 21ºC con aproximadamente 20% de humedad.

Claims (8)

1. Un cultivo biológicamente puro de la cepa Bifidobacterium Longum LMG P-21586.
2. Uso del cultivo biológicamente puro de acuerdo con la reivindicación 1 como material probiótico para la fabricación de preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario a fin de favorecer la salud gastrointestinal y prevenir y tratar patologías intestinales.
3. Preparaciones de tipo farmacéutico o alimentario que contienen una carga bacteriana entre 1 x 10^{7} y 1 x 10^{11} células vivas procedentes de un cultivo biológicamente puro constituido por la cepa de Bifidobacterium Longum LMG P-21586.
4. Preparaciones de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizadas porque contienen un material prebiótico en forma de oligosacáridos.
5. Preparaciones de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizadas porque los oligosacáridos son fructo-oligosacáridos con un grado de polimerización entre 2 y 10 o inulina.
6. Preparaciones de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizadas porque contienen vitaminas.
7. Preparaciones de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizadas porque las vitaminas son las vitaminas E, B1, B2, B6 y B12.
8. Preparaciones de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, caracterizadas porque se seleccionan de cápsulas, tabletas, sobres, trociscos, suspensiones líquidas, suplementos orales secos, suplementos orales líquidos, viales, leche, yogur, queso fresco, helados, productos hechos de cereales fermentados, polvos lácteos, productos para niños y productos para animales domésticos.
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