ES2269399T3 - Aislamiento de acido nucleico. - Google Patents
Aislamiento de acido nucleico. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2269399T3 ES2269399T3 ES01934205T ES01934205T ES2269399T3 ES 2269399 T3 ES2269399 T3 ES 2269399T3 ES 01934205 T ES01934205 T ES 01934205T ES 01934205 T ES01934205 T ES 01934205T ES 2269399 T3 ES2269399 T3 ES 2269399T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- solid support
- nucleic acid
- binding
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
- C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
- C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Un método para aislar ácidos nucleicos a partir de una muestra de san- gre, que comprende: (a) aislar de forma selectiva leucocitos a partir de dicha muestra, mediante la unión de dichos leucocitos a un soporte sólido por medio de una molécula de unión específica de leucocitos; (b) lisar dichos leucocitos aislados; y (c) unir el ácido nucleico liberado de dichas células lisadas a dicho soporte sólido.
Description
Aislamiento de ácido nucleico.
La presente invención se refiere al aislamiento
de ácidos nucleicos a partir de células sanguíneas, y especialmente
a un método para aislar ADN o ARN a partir de tales células, que
combina una etapa de aislamiento de células en fase sólida con una
etapa de aislamiento de ADN o ARN en fase sólida.
El aislamiento de ácidos nucleicos es una etapa
importante en muchos procedimientos bioquímicos y diagnósticos. Por
ejemplo, la separación de ácidos nucleicos de las mezclas complejas
en las que a menudo se encuentran es necesaria con frecuencia antes
de que se puedan emprender otros estudios y procedimientos, p.ej.,
detección, clonado, secuenciación, amplificación, hibridación,
síntesis de cADN, estudio de la estructura y composición del ácido
nucleico (p.ej. el patrón de metilación del ADN), etc.; la presencia
de grandes cantidades de material contaminante celular o de otro
tipo, p.ej. proteínas o carbohidratos, en tales mezclas complejas
impide a menudo muchas de las reacciones y métodos utilizados en
biología molecular. Además, el ADN puede contaminar las
preparaciones de ARN, y viceversa. Así, se requieren métodos para el
aislamiento de ácidos nucleicos a partir de mezclas complejas, tales
como células, tejidos, etc., no solamente desde el punto de vista
preparativo, sino también en los numerosos métodos que se usan
actualmente que dependen de la identificación de ADN o ARN, p.ej.,
diagnóstico de infecciones microbianas, criminología, clasificación
de tejidos y sangre, genotipado, detección de variantes genéticas,
etc.
El uso de la identificación de ADN o ARN está
perfectamente aceptado actualmente como medio para distinguir entre
diferentes células o tipos de células, o entre variantes del mismo
tipo de células que contienen mutaciones del ADN. Así, la
clasificación de HLA, que se lleva a cabo más frecuentemente
mediante la identificación de antígenos de superficie
característicos mediante el uso de anticuerpos, se puede efectuar de
forma alternativa mediante la identificación del ADN que codifica
tales antígenos. La infección o contaminación microbiana se puede
identificar mediante análisis de ácidos nucleicos para detectar el
organismo de interés, en lugar de depender de la detección de las
características de las células de los microorganismos, por ejemplo,
mediante la detección de características morfológicas o bioquímicas.
Las variantes genéticas se pueden identificar por medios
similares.
Particularmente en los campos del diagnóstico
del ácido nucleico, estudios de población y genotipado, es
importante obtener preparaciones de ácidos nucleicos de elevada
calidad y pureza para asegurar que las etapas de amplificación y/o
detección posteriores se llevan a cabo de forma fiable y exacta.
El aislamiento de ácidos nucleicos a partir de
células sanguíneas es necesario para varias aplicaciones, que
incluyen, por ejemplo, clasificaciones, o para aplicaciones
diagnósticas o de cribado, por ejemplo para detectar mutaciones o
polimorfismos. Para tales aplicaciones son deseables grandes
cantidades de ácido nucleico puro, especialmente ADN genómico.
Especialmente, es deseable obtener tal ácido nucleico de forma fácil
y rápida, y evitar el uso de materiales que pueden contaminar y/o
degradar el ácido nucleico.
Se conocen una variedad de métodos para el
aislamiento de ácidos nucleicos, pero, en general, éstos dependen de
una serie compleja de etapas de extracción y lavado, y son largos y
laboriosos de realizar. Además, a menudo implican el uso de
materiales tales como alcoholes y otros disolventes orgánicos,
agentes caotrópicos y proteinasas, lo que es desventajoso, ya que
tales materiales tienden a interferir con muchas reacciones
enzimáticas y otras aplicaciones en procedimientos posteriores.
Así, los métodos clásicos para el aislamiento de
ácidos nucleicos a partir de materiales de partida complejos, tales
como sangre o productos sanguíneos o tejidos, implican la lisis del
material biológico mediante un detergente o un agente caotrópico,
posiblemente en presencia de enzimas que degradan proteínas, seguido
de varias extracciones con disolventes orgánicos, p.ej. fenol y/o
cloroformo, precipitación con etanol, centrifugaciones y diálisis de
los ácidos nucleicos. Tales métodos no solamente son incómodos y
largos de realizar, sino que el número relativamente elevado de
etapas necesarias incrementa el riesgo de degradación, pérdida de
muestra o contaminación cruzada de las muestras cuando se procesan
simultáneamente varias muestras. En el caso del aislamiento de ARN,
el riesgo de contaminación con ADN es relativamente elevado.
Se han hecho mejoras en los métodos para aislar
ácidos nucleicos, y, más recientemente, se han propuesto otros
métodos que dependen del uso de una fase sólida. En el documento
US-A-5.234.809, por ejemplo, se
describe un método en el que los ácidos nucleicos se unen a una fase
sólida en forma de partículas de sílice, en presencia de un agente
caotrópico tal como una sal de guanidinio, y así se separan del
resto de la muestra. El documento WO 91/12079 describe un método en
el que el ácido nucleico se retiene sobre la superficie de una fase
sólida mediante precipitación. En general, se usan alcoholes y sales
como precipitantes.
Aunque tales métodos aceleran el proceso de
separación de ácidos nucleicos, todavía existe la necesidad de
métodos que sean rápidos y simples de realizar, que permitan obtener
buenos rendimientos sin pérdidas, y en particular que no requieran
el uso de disolventes, alcoholes y agentes similares. Además,
especialmente cuando se necesita aislar grandes cantidades de ácidos
nucleicos, son deseables métodos que sean eficaces tanto para
volúmenes grandes como para volúmenes pequeños de material de
muestra.
\newpage
Los agentes caotrópicos necesitan ser usados a
una molaridad elevada, lo que da como resultado disoluciones
viscosas con las que puede ser difícil trabajar, especialmente
cuando se trabaja con ARN. Los procedimientos de amplificación,
tales como PCR y otras reacciones basadas en enzimas, son muy
sensibles a los efectos inhibidores o de interferencia de los
alcoholes y otros agentes. Además, también se sabe que el secado del
sedimento de ácido nucleico que es necesario tras la precipitación
con alcohol y los problemas asociados con la disolución de los
ácidos nucleicos conducen a artefactos en los procedimientos basados
en enzimas, tales como la PCR. Ya que tales procedimientos son
actualmente la base de la biología molecular, existe la necesidad de
métodos mejorados de aislamiento de ácidos nucleicos a partir de
muestras de sangre, y particularmente de métodos que sean rápidos y
simples de realizar y que eviten el uso de agentes caotrópicos o de
precipitación con alcohol. Además, ya que a veces es deseable aislar
cantidades relativamente grandes de ácidos nucleicos a partir de
muestras de sangre, existe la necesidad de métodos que permitan
obtener buenos rendimientos de ácido nucleico tanto de muestras de
sangre grandes (p.ej. 1 ml a 100 ml o más) como pequeñas (p.ej.
hasta 1 ml). También existe la necesidad de un método que permita la
diferenciación entre ARN y ADN, y que permita un aislamiento
separado de ambos tipos de ácidos nucleicos a partir de la misma
muestra. La presente invención busca proporcionar tales
métodos.
En particular, se ha descubierto que se puede
aislar ácido nucleico a partir de una muestra de sangre o derivada
de sangre en una forma adecuada para la amplificación u otros
procesos posteriores, mediante un procedimiento simple y fácil de
realizar, que implica específicamente aislar células que contienen
ácido nucleico a partir de la muestra en un soporte sólido, lisar
las células aisladas unidas al soporte y permitir que el ácido
nucleico liberado se una al mismo soporte sólido (o que de forma
alternativa se una a una mezcla del mismo soporte sólido y
diferentes soportes sólidos), tras lo cual el ácido nucleico se
puede separar fácilmente de la muestra, p.ej. mediante extracción
del soporte de la muestra. La unión del ácido nucleico es
independiente de su secuencia. Además, mediante la elección
apropiada de las condiciones de unión del ácido nucleico y/o de la
naturaleza del soporte sólido, se puede seleccionar si se une al
soporte sólido ADN o ARN, por lo que se permite un procedimiento de
aislamiento selectivo de ADN o ARN.
En un aspecto, la presente invención proporciona
así un método de aislamiento de ácidos nucleicos a partir de una
muestra de sangre, y dicho método comprende:
(a) aislar de forma selectiva leucocitos a
partir de dicha muestra mediante la unión de dichos leucocitos a un
soporte sólido por medio de una molécula de unión específica de
leucocitos;
(b) lisar dichos leucocitos aislados; y
(c) unir el ácido nucleico liberado de dichas
células lisadas a dicho soporte sólido.
Más particularmente, en la etapa (a), los
leucocitos de dicha muestra se pueden unir a una molécula de unión
específica de leucocitos, y dicha molécula de unión se une a un
soporte sólido antes o después de unirse a dichos leucocitos, por lo
que une dicho soporte a dichos leucocitos.
El ácido nucleico puede ser ADN, ARN o cualquier
modificación natural suya, y sus combinaciones. Preferiblemente, sin
embargo, el ácido nucleico será ADN, que puede ser monocatenario o
bicatenario o de cualquier otra forma, p.ej. lineal o circular. El
método de la presente invención es particularmente adecuado para
aislar ADN genómico.
El término "leucocito" se usa aquí para
incluir cualquier célula de la sangre que contiene ácidos nucleicos.
Así, el término "leucocito" incluye todos los glóbulos blancos.
Tales células pueden ser células linfoides, p.ej. linfocitos, tales
como células T y células B, o células citotóxicas naturales (NK) o
células mieloides, p.ej. monocitos/macrófagos,
granulocitos/neutrófilos, eosinófilos, basófilos/mastocitos,
megacariocitos y células pluripotenciales eritroides. También se
incluyen las células dendríticas (tanto mieloides como linfoides).
Se incluyen todas las células nucleadas que se pueden encontrar en
la sangre o en el sistema hematopoyético.
La "muestra de sangre" puede ser cualquier
muestra derivada de sangre que conserve células, por ejemplo sangre
completa o capa de leucocitos. La muestra puede ser obtenida
recientemente, o almacenada o tratada de cualquier forma deseada o
conveniente, por ejemplo mediante dilución o adición de tampón, u
otras disoluciones o disolventes, disoluciones que contienen
enzimas, etc., mientras se mantenga la integridad de los leucocitos
en ella (es decir, mientras la superficie de los leucocitos
permanezca intacta). La "muestra de sangre" también puede ser
cualquier muestra "relacionada con sangre", por ejemplo una
muestra obtenida a partir de otros tejidos hematopoyéticos tales
como médula ósea, o a partir de otros tejidos/líquidos que pueden
contener células de origen hematopoyético, p.ej. líquido ascítico,
líquido linfático, o suspensiones celulares (p.ej. suspensiones de
células individuales) obtenidas a partir de cualquier tejido o
líquido. Así, la "muestra de sangre" puede ser cualquier
muestra hematopoyética o cualquier muestra (p.ej. una muestra
clínica) que contiene células de origen hematopoyético. Así,
definida de forma alternativa, se puede considerar que la invención
proporciona un método, como se definió anteriormente, que es un
método para aislar ácidos nucleicos a partir de una muestra de
células (p.ej. una muestra clínica), y en particular a partir de una
muestra tal que contiene células de origen hematopoyético. Así, tal
muestra de células es una muestra que contiene leucocitos.
Preferiblemente, las muestras son de 10 \mul a
100 ml de tamaño, preferiblemente de 200 \mul a 10 ml. El método
de la invención se puede usar para muestras pequeñas, p.ej. menos de
1 ml, o para muestras mayores, p.ej. al menos 2 ml, p.ej. más de 5
ml ó 10 ml ó 50 ml.
Los sistemas de separación o aislamiento por
afinidad para las células de interés deseadas se conocen en la
técnica, y dependen de la especificidad de una molécula de unión,
específica o selectiva para la célula de interés, para conseguir el
aislamiento selectivo de la célula. Tal sistema se emplea de acuerdo
con la presente invención para conseguir el aislamiento selectivo de
leucocitos a partir de la muestra. Así, la molécula de unión de la
etapa (a) puede ser cualquier resto que tenga afinidad de unión por
un leucocito, y en particular una afinidad de unión selectiva o
específica, de forma que se une específicamente a los leucocitos
presentes en la muestra, pero no a otras células o componentes de la
muestra.
La molécula de unión puede ser cualquier
molécula o resto capaz de unirse a un leucocito, pero de forma
conveniente será una proteína, polipéptido o péptido. No obstante,
se pueden usar también otros restos o moléculas de naturaleza
química diferente, por ejemplo carbohidratos o moléculas orgánicas
pequeñas. También se pueden usar moléculas de unión de ácido
nucleico, p.ej. aptámeros.
La molécula de unión se puede unir a moléculas o
estructuras de la superficie de los leucocitos, por ejemplo a
antígenos de superficie celular que se expresan (p.ej.
específicamente) en la superficie de los leucocitos. De forma
alternativa, la molécula de unión puede ser un resto que se une a
una proteína expresada en la superficie celular, p.ej. un receptor
de superficie celular.
La molécula de unión puede ser convenientemente,
por ejemplo, un anticuerpo específico para un antígeno de superficie
de leucocitos. También se pueden usar fragmentos y derivados de
anticuerpos, según los métodos conocidos en la técnica.
Los anticuerpos para uso como moléculas de unión
en los métodos de la presente invención pueden ser de cualquier
especie, clase o subtipo. Además, el anticuerpo puede ser natural,
derivado o sintético. Así, los "anticuerpos" representativos
incluyen:
(a) cualquiera de las diversas clases o
subclases de inmunoglobulinas, p.ej. IgG, IgA, IgM, IgD o IgE
derivadas de cualquier animal, p.ej. cualquiera de los animales
usados de forma convencional, p.ej. ovejas, conejos, cabras o
ratones,
(b) anticuerpos monoclonales o policlonales
(c) anticuerpos intactos o fragmentos de
anticuerpos, monoclonales o policlonales, y los fragmentos que son
los que contienen la región de unión del anticuerpo, p.ej. los
fragmentos desprovistos de la porción Fc (p.ej. Fab, Fab',
F(ab')_{2}, Fv), los denominados fragmentos de
"semimolécula" obtenidos mediante escisión reductora de los
enlaces disulfuro que conectan los componentes de la cadena pesada
en el anticuerpo intacto.
(d) anticuerpos producidos o modificados
mediante ADN recombinante u otros métodos sintéticos, que incluyen
anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, "anticuerpos
humanizados", anticuerpos quiméricos, o estructuras similares a
anticuerpo producidas o alteradas de forma sintética. También están
incluidos los derivados funcionales o "equivalentes" de
anticuerpos, p.ej. anticuerpos de cadena simple, anticuerpos con
injerto de CDR, anticuerpos de unidad mínima de reconocimiento,
etc.
Los métodos para preparar tales fragmentos o
derivados se conocen en la técnica y están descritos perfectamente
en la bibliografía.
Además de anticuerpos o moléculas basadas en
anticuerpos, se pueden usar otros tipos de moléculas de unión, por
ejemplo péptidos u otras moléculas, producidos de forma sintética
y/o seleccionados de bibliotecas de expresión o combinatorias, p.ej.
de expresión en fagos. Se puede hacer mención a los aptámeros. Otros
tipos de molécula de unión específica de leucocitos pueden incluir
Affibodies u otras moléculas de afinidad sintéticas, y lectinas.
Los leucocitos pueden expresar o portar una
diversidad de moléculas en su superficie que pueden ser reconocidas
por una molécula de unión específica. Tales moléculas pueden ser
comunes a todos o casi todos (p.ej. sustancialmente todos) los
leucocitos (lo que se denomina "pan-leucocito")
o pueden ser portadas/expresadas por solamente un subconjunto de
leucocitos, por ejemplo tipos celulares particulares, tales como
células T, células B, linfocitos en general, monocitos, etc. De
forma ideal, se usan moléculas de unión específicas para moléculas o
antígenos panleucocitarios. Sin embargo, la invención permite que se
use una o más moléculas de unión diferentes, y por lo tanto se
pueden usar combinaciones o mezclas de moléculas de unión para
llevar a cabo la separación deseada.
Así, se puede seleccionar una molécula de unión,
o una combinación o mezcla de moléculas de unión, para llevar a cabo
una separación o un aislamiento deseado de leucocitos de la muestra.
De forma ventajosa, se pueden separar todos o sustancialmente todos
(es decir, prácticamente todos) los leucocitos presentes en la
muestra. La separación realizable puede depender no solamente de
la(s) molécula(s) de unión seleccionada(s),
sino también de la naturaleza de la muestra, las condiciones de
unión, etc. Además, los sistemas biológicos son por su propia
naturaleza variables, y no siempre se puede llevar a cabo una
separación del 100%, y, de hecho, no es necesaria según la presente
invención; como en cualquier sistema biológico, se debe tener en
cuenta cierta tolerancia. Sin embargo, en las realizaciones
preferidas de la invención, se puede separar al menos el 60%, 65%,
70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% de los leucocitos presentes en la
muestra.
Los leucocitos expresan en su superficie una
variedad de moléculas clasificadas en el sistema "CD" y también
antígenos HLA, que se pueden usar como "objetivos" para las
moléculas de unión específicas de leucocitos. Las moléculas de unión
preferidas según la invención incluyen así aquellas que reconocen o
que son capaces de unirse específicamente a uno o más de:
HLA-I, CD11a, CD18, CD45, CD46, CD50, CD82, CD100 ó
CD162. También se pueden incluir CD5 y/o CD15 en esta lista. Se
puede usar una o más de tales moléculas de unión.
Otros antígenos se expresan de forma más
selectiva, por ejemplo, las células linfoides, que incluyen células
T y células B y células NK, expresan CD5. Los monocitos y los
neutrófilos expresan CD15. HLA-I se expresa en los
linfocitos, pero no en los granulocitos. La Tabla 1, a continuación,
muestra otros antígenos, y la Tabla 2 muestra la distribución típica
de diferentes tipos celulares de leucocitos en una muestra de
sangre. Se pueden seleccionar combinaciones apropiadas de moléculas
de unión que reconocen los diferentes antígenos de la Tabla 1 para
permitir la separación deseada de leucocitos a partir de una
muestra, p.ej. para aislar la mayoría de los leucocitos de una
muestra.
Una combinación de moléculas de unión para CD45
y CD15 representa una realización preferida según la presente
invención.
| Células linfoides | Células mieloides | ||
| Célula T | Célula B y NK | Monocito | Neutrófilo |
| CD2 | |||
| CD3 | |||
| CD3 + CD8 | |||
| CD5 | CD5 | ||
| CD13 | CD13 | ||
| CD15 | CD15 | ||
| CD43 | CD43 | ||
| CD88 | CD88 | ||
| CD97 | CD97 | ||
| CD101 | CD101 | ||
| CD107a | CD107a | ||
| Diferentes moléculas de superficie celular expresadas en todos los leucocitos: | |||
| HLA-I | HLA-I | HLA-I | HLA-I |
| CD11a | CD11a | CD11a | CD11a |
| CD18 | CD18 | CD18 | CD18 |
| CD45 | CD45 | CD45 | CD45* |
| CD46 | CD46 | CD46 | CD46 |
| CD50 | CD50 | CD50 | CD50 |
| CD82 | CD82 | CD82 | CD82 |
| CD100 | CD100 | CD100 | CD100 |
| CD162 | CD162 | CD162 | CD162 |
| *CD45 no tiene una expresión muy elevada en neutrófilos |
| Tipo celular | Intervalo de % |
| Neutrófilo | 45 - 76% |
| Eosinófilo | 2 - 4% |
| Basófilo | 0,5 - 1% |
| Monocitos | 6 - 10% |
| Linfocitos | 20-35% |
| (células T 60-80%) |
Normalmente, una muestra de sangre contiene
6x10^{9} leucocitos/litro (intervalo
2-12x10^{9})
El soporte sólido puede ser cualquiera de los
soportes o de las matrices conocidas que se usan o se proponen de
forma generalizada actualmente para inmovilización, separación, etc.
Pueden tomar la forma de partículas, láminas, geles, filtros,
membranas (p.ej. membranas de nailon), fibras, capilares, agujas o
tiras de microtitulación, tubos, placas o pocillos, etc., peines,
puntas de pipeta, micromatrices, chips, o cualquier material de
superficie sólida.
De forma conveniente, el soporte puede estar
hecho de vidrio, sílice, látex, plástico o cualquier material
polimérico. En general, para el aislamiento de ADN, la naturaleza
del soporte no es crítica, y se puede usar una diversidad de
materiales de superficie. La superficie del soporte sólido puede ser
hidrófoba o hidrófila. Se prefieren los materiales que presentan una
elevada área superficial para la unión de las células, y,
posteriormente, del ácido nucleico. Tales soportes tendrán en
general una superficie irregular, y pueden ser, por ejemplo, porosos
o particulados, p.ej. partículas, fibras, redes, aglomerados o
tamices. Se prefieren en general los materiales particulados, p.ej.
microesferas, debido a su mayor capacidad de unión, particularmente
las microesferas/partículas poliméricas.
Convenientemente, un soporte sólido particulado
usado según la invención comprenderá microesferas de forma esférica.
El tamaño de las microesferas no es crítico, pero pueden ser, por
ejemplo, de un diámetro del orden de al menos 1, y preferiblemente
al menos 2 \mum, y tener un diámetro máximo de, preferiblemente,
no más de 10 y, más preferiblemente, no más de 6 \mum. Por
ejemplo, se ha demostrado que las microesferas de diámetro 2,8
\mum y 4,5 \mum funcionan bien.
Las partículas monodispersas, es decir, aquellas
que son sustancialmente uniformes en tamaño (p.ej. de un tamaño que
tiene una desviación estándar del diámetro de menos del 5%) tienen
la ventaja de que proporcionan una reproducibilidad de reacción muy
uniforme. Las partículas poliméricas monodispersas producidas
mediante el método descrito en el documento
US-A-4336173 son especialmente
adecuadas.
Hay disponibles microesferas poliméricas no
magnéticas adecuadas para el uso en el método de la invención de
Dynal Particles AS (Lillestrøm, Noruega; previamente Dyno Particles
o Dyno Speciality Polymers), así como de Qiagen, Amersham Pharmacia
Biotech, Serotec, Seradyne, Merck, Nippon Paint, Chemagen, Promega,
Prolabo, Polysciences, Agowa, Bangs Laboratories y Dyno Particles o
Dyno Speciality Polymers.
Sin embargo, para facilitar la manipulación y la
separación, se prefieren las microesferas magnéticas. El término
"magnético", como se usa aquí, significa que se puede
transmitir un momento magnético al soporte cuando se le coloca en un
campo magnético, y así es desplazable bajo la acción de ese campo.
En otras palabras, un soporte que comprende partículas magnéticas se
puede extraer fácilmente mediante agregación magnética, que
proporciona una forma rápida, simple y eficaz de separar las
partículas después de las etapas de unión de células y ácidos
nucleicos, y es un método mucho menos riguroso que las técnicas
tradicionales, tales como la centrifugación, que genera fuerzas de
cizallamiento que pueden romper las células o degradar los ácidos
nucleicos.
Así, usando el método de la invención, las
partículas magnéticas con células unidas se pueden extraer en una
superficie adecuada mediante la aplicación de un campo magnético,
p.ej. usando un imán permanente. Normalmente es suficiente aplicar
un imán en el lateral del recipiente que contiene la mezcla de
muestra para agregar las partículas en la pared del recipiente y
para desechar el resto de la muestra.
Se prefieren especialmente las partículas
superparamagnéticas, por ejemplo las descritas por Sintef en el
documento EP-A-106873, ya que se
puede evitar la agregación y aglutinación magnética de las
partículas durante la reacción, y así se asegura la extracción
uniforme de ácidos nucleicos. Las partículas magnéticas conocidas
vendidas por Dynal Biotech ASA (Oslo, Noruega, previamente Dynal AS)
como DYNABEADS son particularmente adecuadas para el uso en la
presente invención.
Se pueden preparar partículas revestidas
funcionalizadas para el uso en la presente invención mediante la
modificación de las microesferas según las patentes de EE.UU. nºs
4.336.173, 4.459.378 y 4.654.267. Así, se pueden preparar
microesferas, u otros soportes, que tienen diferentes tipos de
superficie funcionalizada, por ejemplo cargada de forma positiva o
negativa, hidrófila o hidrófoba.
La(s) molécula(s) de unión se
puede(n) unir al soporte sólido de cualquier manera
conveniente, antes o después de la unión a los leucocitos, según los
métodos conocidos en la técnica y descritos en la bibliografía. Así,
la molécula de unión se puede unir directa o indirectamente al
soporte sólido.
En una realización conveniente, la molécula de
unión se puede unir al soporte antes de ponerla en contacto con la
muestra. Tal unión se puede conseguir fácilmente mediante métodos
(p.ej. química de acoplamiento) conocidos en la técnica, y de forma
conveniente la molécula de unión se une directamente al soporte
sólido, por ejemplo mediante revestimiento. Sin embargo, también se
puede unir por medio de restos espaciadores o ligadores. La molécula
de unión se puede unir de forma covalente o reversible, según se
prefiera.
De forma alternativa, como se mencionó
anteriormente, la molécula de unión se puede poner en contacto
primero con la muestra, para que se una a los leucocitos antes de
unirse al soporte sólido. En este caso, el soporte sólido puede
portar o se le puede proporcionar convenientemente un resto de unión
capaz de unirse a la molécula de unión específica de leucocitos. De
nuevo, tales sistemas de unión se conocen en la técnica. Por
ejemplo, la superficie sólida puede portar un anticuerpo
(secundario) capaz de unirse a la molécula de unión
anti-leucocitos (p.ej. un anticuerpo
anti-especie policlonal).
Cuando se usa más de un tipo diferente de
molécula de unión (p.ej. anticuerpos anti-CD45 y
anti-CD15) se pueden unir al mismo soporte sólido o
a diferentes soportes sólidos. El sistema que usa diferentes
soportes sólidos es aplicable particularmente en el caso de un
soporte particulado, tal como microesferas. Así, las diferentes
moléculas de unión se pueden unir a diferentes microesferas.
En las realizaciones en las que se usa más de un
tipo diferente de molécula de unión, las cantidades o proporciones
apropiadas a las que se pueden usar los diferentes tipos de molécula
de unión serán determinadas fácilmente por una persona experta en la
técnica. Por ejemplo, en las realizaciones preferidas de la presente
invención, en las que se usan anticuerpos anti-CD45
y anti-CD15, éstos se pueden usar en cualquier
proporción, con tal que dicha proporción permita que se aíslen las
células. Las proporciones preferibles son proporciones 1:1 y 2:1 de
CD45 respecto de CD15.
Como se mencionó anteriormente, los métodos de
separación de células basados en unión de afinidad en fase sólida
(p.ej. separación inmunomagnética (SIM)) se conocen en la técnica, y
las condiciones para llevarlos a cabo pueden ser determinadas
fácilmente por el experto en este campo. Así, por ejemplo, se puede
poner en contacto con la muestra un soporte sólido que porta
molécula(s) de unión anti-leucocitos. Por
ejemplo, se puede añadir un soporte sólido particulado a la muestra
contenida (p.ej. suspendida) en un medio apropiado (p.ej. un
tampón). El soporte se puede dejar después en contacto con la
muestra (p.ej. incubar) durante un periodo de tiempo para permitir
que ocurra la unión de las células. Las condiciones durante la etapa
no son críticas, y la mezcla muestra-soporte se
puede incubar, p.ej. a 4 a 20ºC durante 10 minutos a 2 horas, p.ej.
20-45 minutos.
Después de la unión de las células, las células
aisladas o unidas al soporte se lisan para liberar sus ácidos
nucleicos. Los métodos de lisis celular se conocen en la técnica y
están descritos extensamente en la bibliografía, y se puede usar
cualquiera de los métodos conocidos. Se podría usar cualquiera de
los siguientes métodos, por ejemplo: lisis con detergente que usa
p.ej. SDS, LiDS o Sarcosil en tampones apropiados; el uso de agentes
caotrópicos, tales como hidrocloruro de guanidinio (GHCl),
tiocianato de guanidinio (GTC), yoduro sódico (NaI), perclorato,
etc.; ruptura mecánica, tal como mediante una prensa de French,
sonicación, trituración con microesferas de vidrio, alúmina o en
nitrógeno líquido; lisis enzimática, por ejemplo mediante el uso de
lisozima, proteinasas, pronasas o celulasas o cualquiera de las
otras enzimas de lisis disponibles comercialmente; lisis de células
mediante infección con bacteriófagos o virus; liofilización; choque
osmótico; tratamiento con microondas; tratamiento térmico, p.ej.
mediante calentamiento o ebullición, o mediante congelación, p.ej.
en hielo seco o nitrógeno líquido, y descongelación; lisis
alcalina. Como se mencionó anteriormente, todos los métodos son
técnicas de lisis estándar y se conocen en la técnica, y se puede
usar cualquiera de tales métodos o combinación de métodos.
Como se mencionó anteriormente, la presente
invención proporciona la ventaja de que se puede evitar el uso de
agentes tales como disolventes, alcoholes y agentes caotrópicos.
Así, aunque se pueden emplear métodos de lisis tales como los
mencionados anteriormente que usan tales agentes, en las
realizaciones ventajosas de la invención se evita el uso de tales
agentes.
Convenientemente, la lisis se puede llevar a
cabo según la presente invención usando detergentes. Un agente
ejemplar de lisis adecuado incluye así un detergente tal como SDS u
otra sal de alquilsulfato de metal alcalino, p.ej. LiDS, o Sarcosil
o sus combinaciones. Los agentes de lisis se pueden proporcionar en
disolución acuosa simple, o se pueden incluir en una disolución
tampón, para formar un denominado "tampón de lisis". Se puede
usar cualquier tampón adecuado, que incluye, por ejemplo, tampones
Tris, Bicina, Tricina y fosfato. De forma alternativa, los agentes
de lisis se pueden añadir por separado. También se pueden incluir, o
añadir, sales en los tampones de lisis, por ejemplo LiCl y NaCl. En
particular, se prefiere LiCl cuando se usa LiDS y se prefiere NaCl
cuando se usa SDS.
Las concentraciones y cantidades adecuadas de
los agentes de lisis variarán según el sistema concreto, etc., y se
pueden determinar de forma apropiada, pero se pueden usar
concentraciones de, p.ej., agentes caotrópicos 2 M a 7 M tales como
GTC, GHCl, NaI o perclorato, agentes alcalinos 0,1 M a 1 M tales
como NaOH, y 0,1 a 50% (p/v), p.ej. 0,5 a 15% de detergente.
Para llevar a cabo el método de la invención,
las células aisladas unidas al soporte se pueden extraer o separar
convenientemente del resto de la muestra, por lo que se concentran o
se enriquecen las células. Así, la etapa de unión de leucocitos
sirve para enriquecer las células o para concentrarlas en un volumen
más pequeño que la muestra inicial. Para facilitar las etapas
posteriores puede ser deseable, antes de la etapa de lisis, diluir
las células unidas al soporte, p.ej. en un tampón apropiado u otro
medio. Si se desea, las células se pueden tratar adicionalmente,
p.ej. calentando o agitando (p.ej. con vórtice). Puede ser ventajosa
una etapa de dilución para evitar la aglomeración/agregación de un
soporte particulado, tal como microesferas, particularmente en una
matriz de ADN genómico que hace el manejo posterior de las
microesferas difícil y poco fiable para la transferencia del
sobrenadante o del sedimento de microesferas a otro compartimento o
receptáculo, p.ej. pocillo/tubo/bandeja, etc. La lisis se puede
llevar a cabo después convenientemente añadiendo un tampón de lisis
apropiado que contiene los agentes de lisis deseados, o sometiendo a
las células aisladas a las condiciones de lisis deseadas. Por
ejemplo, en el caso de añadir simplemente un tampón de lisis que
contiene agentes de lisis apropiados, las células aisladas se pueden
incubar simplemente en presencia del tampón de lisis durante un
intervalo adecuado para permitir que tenga lugar la lisis. Pueden
ser apropiadas diferentes condiciones de incubación para diferentes
sistemas de lisis, y se conocen en la técnica. Por ejemplo, para un
tampón de lisis que contiene detergente, la incubación puede tener
lugar a temperatura ambiente o a temperaturas superiores, p.ej.
37ºC, 50ºC ó 65ºC. De forma similar, el tiempo de incubación se
puede variar desde unos minutos, p.ej. 5 ó 10 minutos, a horas,
p.ej. 20 a 40 minutos o 1 a 2 horas. Para lisis enzimática, p.ej.
mediante el uso de proteinasa K, etc., pueden ser necesarios tiempos
de tratamiento superiores, p.ej. durante la noche.
En una realización ventajosa de la invención, la
etapa de lisis del método comprende una etapa adicional que implica
la adición de una cantidad adicional o extra de soporte sólido a los
leucocitos aislados. Tal soporte sólido "adicional" (también
denominado aquí como un "segundo" soporte sólido) puede
comprender el mismo soporte sólido o uno diferente del que se usó en
la etapa (a) del método, y se puede añadir a la muestra de células
como un componente separado antes o después de la adición del tampón
de lisis, o incluirse en la disolución o tampón de lisis. El segundo
soporte sólido o soporte sólido adicional puede comprender así
cualquiera de los soportes sólidos discutidos anteriormente para el
uso en la etapa (a). Sin embargo, ya que el aislamiento de los
leucocitos ya se ha llevado a cabo mediante la etapa de lisis, no
hay necesidad absoluta de que la segunda fase sólida tenga una
molécula de unión específica de leucocitos asociada a su superficie.
Se ha descubierto que el uso de un segundo soporte sólido ofrece
ventajas en la recogida de la muestra, por ejemplo mejorando la
formación del sedimento y por lo tanto el aislamiento del primer
soporte sólido. La formación mejorada del sedimento también puede
reducir la unión inespecífica de sustancias o entidades del
sedimento, o, en otras palabras, reduce la contaminación del
sedimento. Aunque no se desea limitarse por la teoría, se cree que
cuando se usa solamente un primer soporte sólido, el ácido nucleico
aislado se une al primer soporte sólido en forma de malla suelta, no
compacta, por lo que da como resultado un sedimento no compacto
relativamente suelto. Sin embargo, cuando se usa un segundo soporte,
y particularmente cuando este segundo soporte sólido comprende
partículas que son más pequeñas o más grandes que el primer soporte
sólido, el segundo soporte sólido rellena los huecos (o viceversa)
de la malla suelta, por lo que hace que el sedimento sea más
apretado y más compacto, por lo que se reduce la tendencia a retener
material contaminante.
Así, el segundo soporte sólido puede ser de
tamaño y densidad comparables al primer soporte sólido.
Preferiblemente, sin embargo, el segundo soporte sólido es de tamaño
menor que el primer soporte sólido. Por ejemplo, cuando los soportes
son particulados, el segundo soporte sólido comprende partículas de
un diámetro más pequeño (p.ej. aproximadamente la mitad del
diámetro) que las que comprende el primer soporte sólido. En
realizaciones especialmente preferidas, el primer soporte sólido
comprende partículas de 4,5 \mum de diámetro (p.ej. las
microesferas M450 descritas aquí) mientras el segundo soporte sólido
comprende partículas de 2,8 \mum de diámetro (p.ej. las
microesferas M280 y M270 descritas aquí). De forma alternativa, el
primer soporte puede ser más pequeño que el segundo soporte, y las
dimensiones descritas anteriormente se pueden invertir.
De forma especialmente preferible, el segundo
soporte sólido puede tener un papel más activo en el aislamiento del
ácido nucleico, y en tal caso la segunda fase sólida es capaz de
unirse al ácido nucleico, es decir, tiene propiedades de unión de
ácido nucleico. Preferiblemente, por lo tanto, el segundo soporte
sólido puede estar hecho de vidrio, sílice, látex, plástico o
cualquier material polimérico (es decir, una superficie sin
revestir) capaz de unir ácidos nucleicos, y tal soporte sólido se
puede funcionalizar opcionalmente, por ejemplo para ayudar o mejorar
la unión de ácidos nucleicos. A este respecto, son particularmente
preferidos los soportes sólidos funcionalizados que tienen una carga
superficial, preferiblemente una carga superficial negativa. Los más
preferidos son soportes sólidos revestidos con grupos funcionales de
ácido carboxílico. Tales soportes sólidos están disponibles
comercialmente, por ejemplo las microesferas de ácido carboxílico
M-270 o las microesferas de hidroxilo
M-280 fabricadas por Dynal Biotech ASA.
Preferiblemente, los segundos soportes sólidos son particulados,
p.ej. microesferas, y de forma especialmente preferible son
magnéticos.
La provisión de una cantidad adicional o extra
de soporte sólido después de la etapa de aislamiento de células da
como resultado un rendimiento mejorado de ácido nucleico, y también
hace más fácil la elución del ácido nucleico desde el soporte
sólido, particularmente cuando se usan soportes sólidos con
superficies cargadas negativamente. Aunque no se desea limitarse por
la teoría, como se describió anteriormente, se cree que la adición
de una cantidad extra de un "segundo" soporte sólido mejora el
grado de compactación del sedimento de microesferas y ácidos
nucleicos, y particularmente cuando el ADN es capaz de unirse al
segundo soporte sólido, se consigue una unión más eficaz y completa
de las moléculas de ácido nucleico, en vez de que las moléculas de
ácido nucleico se unan a las microesferas solamente por un extremo o
que se unan a las microesferas de forma suelta.
Así, una realización adicional de la invención
proporciona un método para aislar ácidos nucleicos a partir de una
muestra de sangre, y dicho método comprende:
(a) aislar de forma selectiva leucocitos a
partir de dicha muestra mediante la unión de dichos leucocitos a un
primer soporte sólido por medio de una molécula de unión específica
para leucocitos;
(b) lisar dichos leucocitos aislados;
(c) unir el ácido nucleico liberado de dichas
células lisadas a dicho primer soporte sólido; y
(d) poner en contacto dichos leucocitos aislados
de la etapa (b) o el ácido nucleico de la etapa (c) con una cantidad
adicional de un segundo soporte sólido, y preferiblemente unir dicho
ácido nucleico a dicho segundo soporte sólido, que es capaz de unir
ácidos nucleicos.
Preferiblemente, los linfocitos aislados se
lisan en presencia de dicho segundo soporte sólido.
Este método que usa un segundo soporte sólido se
puede usar igualmente para aislar selectivamente ácidos nucleicos a
partir de células de cualquier muestra. En tales métodos, las
células a partir de las cuales se desea aislar ácidos nucleicos se
aíslan de forma selectiva a partir de la muestra uniendo dichas
células a un soporte sólido por medio de una o más moléculas de
unión apropiadas, tras lo cual se llevan a cabo las etapas (b), (c)
y (d) del método descrito anteriormente sobre las células aisladas
particulares en cuestión.
Los primeros y segundos soportes sólidos
apropiados para el uso en tales métodos se discuten aquí (y pueden
ser iguales o diferentes), ya que son métodos apropiados para el
aislamiento selectivo de células y métodos de lisis.
Preferiblemente, la etapa de lisis (b) del método también implica el
uso de proteinasas, y en particular proteinasa K, a una
concentración apropiada. Como se discutió anteriormente, el uso de
proteinasas en las técnicas convencionales de aislamiento de ácidos
nucleicos es a menudo desventajoso, ya que tales materiales tienden
a interferir con muchas reacciones enzimáticas y otras aplicaciones
en procedimientos posteriores. Sin embargo, en los métodos
preferidos de la presente invención, estos efectos desventajosos de
las proteinasas se minimizan mediante el uso de la técnica de
separación magnética, en la que la cantidad de enzimas contaminantes
será insignificante, ya que las microesferas se pasan de recipiente
a recipiente durante el aislamiento de ácidos nucleicos y las etapas
de lavado posteriores.
La expresión cantidad "adicional" o
"extra", cuando se usa aquí con respecto a la adición de una
segunda fase sólida, se usa para indicar la adición de cualquier
cantidad (en peso) de una segunda fase sólida de forma que se mejora
el aislamiento de ácidos nucleicos, por ejemplo se mejora el
rendimiento de ácido nucleico aislado. Por ejemplo, la cantidad de
la segunda fase sólida añadida podría ser la misma cantidad de la
primera fase sólida usada, o puede ser de hasta aproximadamente 3 a
5 veces la cantidad de la primera fase sólida usada. De forma
alternativa, la cantidad de la segunda fase sólida añadida puede ser
inferior que la cantidad de la primera fase sólida, con tal que se
mejore el aislamiento de ácidos nucleicos. Preferiblemente, la
cantidad usada de la segunda fase sólida es 0,5 a 3 veces la
cantidad de la primera fase sólida.
La "cantidad" de fase sólida se refiere al
peso de la fase sólida, en las realizaciones preferidas de la
invención en las que la primera y segunda fases sólidas son
particuladas y las partículas que componen la segunda fase sólida
son más pequeñas (o más grandes) que las partículas que componen la
primera fase sólida, el número de partículas usado para la primera
y la segunda fase sólida será generalmente diferente.
Tras la lisis, el ácido nucleico liberado se une
al mismo soporte al que están unidas las células lisadas, o en otras
realizaciones de la invención el ácido nucleico liberado se une al
mismo soporte sólido al que están unidas las células lisadas y al
segundo soporte sólido adicional. Esta unión de ácidos nucleicos se
puede conseguir de cualquier manera conocida en la técnica para la
unión de ácidos nucleicos a un soporte sólido. De forma
conveniente, el ácido nucleico se une inespecíficamente al soporte,
es decir, independientemente de la secuencia. Así, por ejemplo, el
ácido nucleico liberado se puede precipitar en el soporte usando
cualquiera de los precipitantes conocidos de ácidos nucleicos, p.ej.
alcoholes, combinaciones alcohol/sal, polietilenglicoles (PEGs),
etc. La precipitación de ácidos nucleicos sobre microesferas de esta
manera se describe, por ejemplo, en el documento WO 91/12079. Así,
se puede añadir una sal al soporte y al ácido nucleico liberado en
disolución, seguido de la adición de alcohol que provocará que el
ácido nucleico precipite. De forma alternativa, la sal y el alcohol
se pueden añadir juntos, o se puede omitir la sal. Como se describió
anteriormente con respecto a la etapa de unión de células, se puede
usar cualquier alcohol o sal adecuados, y se pueden determinar
fácilmente las cantidades o concentraciones apropiadas. Sin embargo,
como se mencionó anteriormente, se prefiere evitar el uso de
disolventes, alcoholes y agentes similares. Así, se prefieren
métodos alternativos que evitan el uso de tales agentes.
Un método de unión de ácidos nucleicos
alternativo y preferido incluye el uso de detergentes como se
describe en el documento WO 96/18731 de Dynal AS (el procedimiento
denominado "DNA Direct"). Se describen diversos sistemas
basados en detergentes para unir ácidos nucleicos a un soporte
sólido en esta publicación, y se pueden usar según la presente
invención.
De forma conveniente, la etapa de unión de
ácidos nucleicos puede tener lugar de forma simultánea o
concomitante con la etapa de lisis celular. Esto se puede llevar a
cabo de forma conveniente usando los métodos basados en detergentes
del documento WO 96/18731. Así, por ejemplo, un agente o agentes de
lisis y unión de ácidos nucleicos pueden estar contenidos de forma
conveniente en un medio apropiado (p.ej. un tampón u otra disolución
acuosa) y se añaden a las células unidas al soporte. Después, las
células se pueden mantener en contacto con el medio, p.ej. se
incuban (p.ej. como se describió anteriormente), para permitir que
tenga lugar la lisis y la unión de ácidos nucleicos. Tal medio se
puede denominar como un medio de "lisis/unión". Un detergente
puede funcionar tanto como agente de lisis como para ayudar en la
unión del ácido nucleico al soporte.
El detergente puede ser cualquier detergente, y
se conocen y están descritos en la bibliografía una extensa variedad
de ellos. Así, el detergente puede ser iónico, que incluye aniónico
y catiónico, no iónico o dipolar. La expresión "detergente
iónico", como se usa aquí, incluye cualquier detergente que está
parcial o completamente en forma iónica cuando se disuelve en agua.
Se ha demostrado que los detergentes aniónicos funcionan
particularmente bien, y se prefieren. Los detergentes aniónicos
adecuados incluyen, por ejemplo, dodecilsulfato sódico (SDS) u otras
sales de alquilsulfato de metales alcalinos o detergentes similares,
Sarcosil, o sus combinaciones.
Convenientemente, el detergente se puede usar en
una concentración de 0,2 a 30% (p/v), p.ej. 0,5 a 30%,
preferiblemente 0,5 a 15%, más preferiblemente 1 a 10%. Para
detergentes aniónicos, se ha demostrado que las concentraciones de
1,0 a 5%, p.ej. 0,5 a 5%, funcionan bien.
El detergente se puede suministrar en disolución
acuosa simple, que puede ser alcalina o ácida, o más preferiblemente
en un tampón. Se puede usar cualquier tampón adecuado, que incluye
por ejemplo tampones Tris, Bicina, Tricina y fosfato. De forma
conveniente, se puede incluir una fuente de cationes monovalentes,
p.ej. una sal, para aumentar la captura de ácido nucleico, aunque
no es necesario. Las sales adecuadas incluyen sales de cloruro,
p.ej. cloruro sódico, cloruro de litio, etc., a concentraciones de
0,1 a 1 M, p.ej. 250 a 500 mM. Como se mencionó anteriormente,
también se pueden incluir otros componentes, tales como enzimas.
Otros componentes opcionales en la composición
de detergente incluyen agentes quelantes, p.ej. EDTA, EGTA y otros
ácidos poliaminocarboxílicos de forma conveniente a concentraciones
de 1 a 50 mM, etc., agentes reductores tales como ditiotreitol (DTT)
o \beta-mercaptoetanol, a concentraciones de, por
ejemplo, 1 a 10 mM.
Las composiciones de detergente preferidas
pueden comprender, por ejemplo:
- Tris-HCl 100 mM, pH 7,5
- EDTA 10 mM
- 2% de SDS
\vskip1.000000\baselineskip
- o:
- Tris-HCl 100 mM, pH 7,5
- EDTA 10 mM
- 5% de SDS
- NaCl 10 mM
\vskip1.000000\baselineskip
- o:
- Tris-HCl 100 mM, pH 7,5
- LiCl 500 mM
- EDTA 10 mM
- 1% de LiDS
Se hace referencia al documento WO 96/18731 para
más detalles, condiciones de reacción ejemplares, etc.
En las realizaciones de la invención en las que
se añade un segundo soporte sólido, este segundo soporte sólido se
puede incluir en la composición de detergente. Las composiciones de
detergente preferidas comprenden así las anteriores composiciones
que además comprenden una cantidad apropiada de un segundo soporte
sólido, p.ej. microesferas de ácido carboxílico M270 o microesferas
de hidroxilo M-280, por ejemplo a una concentración
de aproximadamente 1,5 mg/ml, y opcionalmente una cantidad apropiada
de proteinasas, p.ej. proteinasa K, por ejemplo a 20 mg/ml.
Seleccionando las condiciones de "unión de
ácidos nucleicos" apropiadas (p.ej. composiciones de tampón o
medio de lisis/unión apropiadas), se puede seleccionar si se une el
ADN liberado de las células o el ARN liberado de las células al
soporte sólido. Así, las composiciones de "medio de unión" se
pueden seleccionar para favorecer la unión de ADN (o más
particularmente la unión de ADN genómico) al soporte sólido. Tales
composiciones del medio de unión incluyen las mencionadas
anteriormente, las descritas en los ejemplos más adelante, y las
composiciones del documento WO 96/18731. Por ejemplo, un medio de
unión de ADN representativo puede incluir GuHCl y opcionalmente
EDTA.
Para unir ARN, se conocen en la técnica
composiciones de medios o condiciones apropiadas, o se pueden
determinar fácilmente a partir de los procedimientos de aislamiento
de ARN conocidos en la técnica, y pueden incluir, por ejemplo, los
tampones y procedimientos descritos en el documento
EP-A-0389063 y en el documento
US-A-5.234.809 de Akzo Nobel
NV.
Las composiciones de unión de ARN
representativas pueden incluir así tiocianato de guanidina (GTC) con
EDTA.
Para la unión de ARN, la naturaleza del soporte
sólido puede ser de importancia, y se debería usar una superficie
sólida de "sílice" (es decir, que comprende sílice propiamente
dicho o que se basa en sílice o en un derivado de sílice) (véase más
adelante).
De forma ventajosa, cuando el método de la
invención se usa para aislar ADN, se puede combinar con una etapa
adicional de forma separada para aislar el ARN de la muestra. Así,
tras el procedimiento discutido anteriormente, y seleccionando las
condiciones de unión de ADN en la etapa de unión de ácidos nucleicos
(p.ej. un medio de lisis/unión o unión que favorece la unión de
ADN), el ADN liberado de las células unidas al soporte se puede unir
al soporte, y se puede extraer de la muestra. El ARN, más
particularmente ARNm, liberado de los leucocitos, permanece en la
muestra (más exactamente en el sobrenadante). Este ARN se puede
aislar fácilmente de la muestra usando procedimientos estándar, por
ejemplo mediante unión a una sonda de captura inmovilizada de forma
conveniente (p.ej. mediante unión a un soporte sólido), que consiste
en oligo dT.
También se pueden usar los métodos de unión de
ácidos nucleicos alternativos para llevar a cabo la etapa de unión
del ácido nucleico liberado al soporte sólido. Por ejemplo, un
método puede aprovechar la ventaja del principio conocido de unión
de ácidos nucleicos a una superficie de sílice.
Así, en tal realización, el soporte sólido puede
comprender o consistir en un material de sílice, o basado o derivado
de sílice. Se conocen y están descritos en la técnica muchos de
estos materiales, y la bibliografía está repleta de referencias que
describen el aislamiento de ácidos nucleicos mediante unión a
superficies de sílice (véase, p.ej., el documento
EP-A-0389063 de AKZO N.V., el
documento US-A-5.342.931, el
documento US-A-5.503.816 y el
documento US-A-5.625.054 de Becton
Dickinson, el documento
US-A-5.155.018 de Hahnemann
University, el documento
US-A-6.027.945 de Promega Corp. y el
documento US-A-5.945.525 de Toyo
Boseki KK).
La unión iónica del ácido nucleico al soporte se
puede llevar a cabo usando un soporte sólido que tiene una carga
superficial, por ejemplo un soporte revestido con poliaminas.
El soporte que se usa en el método de la
invención puede portar también grupos funcionales que ayudan en la
unión específica o inespecífica de los ácidos nucleicos, por ejemplo
proteínas de unión de ADN, p.ej. cremallera de leucinas o histonas o
tintes intercalantes (p.ej. bromuro de etidio o Hoechst 42945) que
se pueden revestir en el soporte.
De forma similar, se puede proporcionar al
soporte moléculas de unión para ayudar en la captura selectiva de
ácidos nucleicos. Por ejemplo, se pueden usar secuencias de ADN o
ARN complementarias, o proteínas de unión a ADN. La unión de tales
proteínas al soporte sólido se puede llevar a cabo usando métodos
conocidos en la técnica. De forma conveniente, tales moléculas de
unión de ácidos nucleicos se pueden entremezclar en el soporte
sólido con las moléculas de unión
anti-leucocito.
Aunque no es necesario, puede ser conveniente
introducir una o más etapas de lavado en el método de aislamiento de
la invención, por ejemplo tras la etapa de aislamiento de células
y/o unión de ácidos nucleicos. Se puede usar cualquier tampón de
lavado convencional u otros medios. En general, se prefieren
tampones de fuerza iónica baja a moderada que contienen sales, p.ej.
Tris-HCl 10 mM a pH 8,0/NaCl 10 mM ó 40 mM. También
se pueden usar otros medios de lavado estándar, p.ej. que contienen
alcoholes, si se desea, por ejemplo lavar con etanol del 70%.
El uso de partículas magnéticas permite etapas
de lavado fáciles simplemente mediante la agregación de las
partículas, la extracción del medio de unión de ácido nucleico, la
adición del medio de lavado y la reagregación de las partículas
tantas veces como sea necesario.
Tras el proceso de aislamiento de ácido nucleico
y las etapas de lavado opcionales que se puedan desear, el soporte
que lleva el ácido nucleico unido se puede transferir, p.ej. se
resuspende o se sumerge en cualquier medio adecuado, p.ej. agua o
tampón de fuerza iónica baja. Así, el ácido nucleico aislado se
puede extraer o separar de la muestra. Dependiendo del soporte y de
la naturaleza de cualquier procedimiento posterior deseado, puede o
no ser deseable liberar el ácido nucleico del soporte.
En el caso de un soporte sólido particulado, tal
como microesferas magnéticas o no magnéticas, éste se puede usar en
muchos casos directamente, por ejemplo en PCR u otras
amplificaciones, sin eluir el ácido nucleico del soporte. Además,
para muchos métodos de detección o identificación de ADN no es
necesaria la elución, ya que aunque el ADN puede estar en contacto
de forma aleatoria con la superficie de la microesfera y unido en
varios puntos mediante enlaces de hidrógeno o fuerzas iónicas o de
otro tipo, en general habrá suficiente longitud de ADN disponible
para la hibridación con oligonucleótidos y para la
amplificación.
Sin embargo, si se desea, la elución del ácido
nucleico se puede llevar a cabo fácilmente usando medios conocidos,
por ejemplo calentando, p.ej. a 65ºC durante 5 a 10 minutos, tras lo
cual el soporte se puede extraer del medio y dejar el ácido nucleico
en disolución. Tal calentamiento se obtiene de forma automática en
la PCR en la etapa de desnaturalización del ADN que precede al
programa de termociclado. También se puede usar de forma conveniente
un tampón de elución que no contiene sal.
Si se desea eliminar el ARN del ADN, se puede
llevar a cabo destruyendo el ARN antes de la etapa de separación de
ADN, por ejemplo mediante la adición de ARNasa o de un álcali, tal
como NaOH.
Una ventaja de la presente invención es que es
rápida y simple de realizar, y con una combinación apropiada de
etapas de unión de células, lisis y unión de ácidos nucleicos,
proporciona un método que produce de forma fiable y simple ácido
nucleico aislado en un periodo de tiempo corto, en muchos casos
menos de una hora, o incluso menos de 45 minutos. La simplicidad del
método permite un elevado rendimiento de muestras. De forma
concomitante, la etapa de unión de células da como resultado un
enriquecimiento o concentración de las células, y la eliminación de
otros componentes de la muestra, por lo que mejora el proceso de
aislamiento de ácidos nucleicos. Además, de forma ventajosa, se
evita el uso de disolventes tales como cloroformo/fenol. De forma
ventajosa, el método de la invención permite que se aísle ácido
nucleico a partir de muestras relativamente pequeñas de sangre, por
ejemplo de hasta 10 ml de sangre, por ejemplo 10 \mul a 2 ml de
sangre, p.ej. 200 a 500 \mul de sangre o 50 a 200 \mul, (p.ej.
100 \mul) de capa de leucocitos. Los rendimientos y la calidad del
ácido nucleico aislado usando los métodos de la invención son
buenos. Por ejemplo, 0,2 ml de sangre proporcionan de forma
rutinaria 5-12 \mug de ADN con una proporción
DO_{260/280} de 1,75-1,9. Además, como se mencionó
anteriormente, los métodos de la invención se pueden usar para
aislar ácidos nucleicos a partir de grandes muestras de sangre,
p.ej. a partir de muestras mayores de 10 ml.
Se han obtenido resultados particularmente
favorables usando el método de la invención para aislar ADN genómico
a partir de muestras de sangre. En particular, se ha demostrado que
se puede obtener ADN de elevada calidad con poca fragmentación.
La invención es ventajosamente susceptible de
automatización, particularmente si se usan partículas, y
especialmente partículas magnéticas, como soporte. En una
realización particularmente preferida de la invención, el método de
aislamiento de ácidos nucleicos se realiza usando un sistema
automatizado para el manejo del soporte sólido durante la lisis
celular, la unión de ácido nucleico, y opcionalmente, las etapas de
lavado. Así, las células aisladas unidas al soporte se pueden
transferir a un aparato, lavarlas si se desea, y lisarlas; el ácido
nucleico se puede unir al soporte, y el ácido nucleico unido se
puede lavar fácilmente usando tal aparato. Además, también se puede
usar el aparato para manejar el soporte durante la etapa de
aislamiento de células. Se puede hacer mención particular a este
respecto del Bead Retriever^{TM}, disponible de Dynal ASA,
Noruega. El aparato tiene un sistema para la transferencia fácil y
eficaz del soporte (que porta las células o el ácido nucleico) desde
un pocillo a otro. Tal aparato es particularmente eficaz para
manejar el ADN viscoso de elevada calidad que resulta del método de
la invención.
Como se mencionó anteriormente, el método de la
invención tiene utilidad particular como una primera etapa
preliminar para preparar ácidos nucleicos para el uso en
procedimientos de detección basados en ácidos nucleicos, por ejemplo
en el genotipado.
Como se mencionó anteriormente, de forma
ventajosa el ácido nucleico unido no necesita ser eluido o extraído
del soporte antes de llevar a cabo la etapa de detección, aunque
esto se puede realizar si se desea. Si se eluye o no el ácido
nucleico puede depender también del método particular que se usó en
la etapa de unión de ácido nucleico. Así, ciertos procedimientos de
unión de ácido nucleico unirán el ácido nucleico de forma más
apretada que otros. En el caso de unión de ADN que usa detergentes
(p.ej. mediante DNA Direct), por ejemplo, el ácido nucleico eluirá
del soporte sólido cuando se introduzca un tampón de elución u otro
medio apropiado. El ácido nucleico unido por medio de un
precipitante, tal como alcohol o un agente caotrópico, permanecerá
unido de forma más apretada, y puede no eluir cuando se coloque en
un medio tampón, y puede necesitar calentamiento para eluir.
Así, el ácido nucleico unido al soporte se puede
usar directamente en un procedimiento de detección basado en ácido
nucleico, especialmente si el soporte es particulado, simplemente
resuspendiendo el soporte en, o añadiendo al soporte, un medio
apropiado para la etapa de detección. El ácido nucleico puede eluir
al medio, o, como se mencionó anteriormente, no es necesario que
eluya.
\newpage
Se conocen varios métodos diferentes para
detectar ácidos nucleicos y se describen en la bibliografía, y se
puede usar cualquiera de éstos según la presente invención. De forma
conveniente, se puede detectar ácido nucleico mediante métodos
ópticos, por ejemplo midiendo o determinando la densidad óptica
(DO). De forma alternativa, el ácido nucleico se puede detectar
mediante hibridación con una sonda, y se han descrito
muchosprotocolos de hibridación (véase, p.ej., Sambrook et
al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Muy frecuentemente, la
detección implicará una etapa de hibridación in situ, y/o una
etapa de amplificación in vitro que usa cualquiera de los
métodos descritos en la bibliografía para esto. Así, como se
mencionó, se pueden usar métodos tales como LAR, 3SR y el sistema de
replicasa Q-beta. Sin embargo, la PCR y sus diversas
modificaciones, p.ej. el uso de cebadores anidados, será
generalmente el método de elección (véase, p.ej., Abramson y Myers,
1993, Current Opinion in Biotechnology, 4: 41-47
para un resumen de las técnicas de amplificación de ácidos
nucleicos).
Otros métodos de detección se pueden basar en
una aproximación de secuenciación, por ejemplo, la aproximación de
minisecuenciación descrita por Syvänen y Söderlund, 1990, Genomics,
8: 684-692.
En las técnicas de amplificación tales como PCR,
el calentamiento necesario en la primera etapa para desnaturalizar
la molécula bicatenaria de ADN puede liberar el ADN unido del
soporte. Así, en el caso de una etapa de detección posterior, tal
como PCR, el ácido nucleico unido al soporte se puede añadir
directamente a la mezcla de reacción, y el ácido nucleico eluirá en
la primera etapa del proceso de detección. Se puede usar en la etapa
de detección la muestra completa de ácido nucleico unida al soporte
aislada obtenida según la invención, o una alícuota.
Los resultados de la PCR o de otra etapa de
detección se pueden detectar o visualizar por muchos medios, que se
describen en la técnica. Por ejemplo, los productos de PCR o de otra
amplificación se pueden separar en un gel de electroforesis, p.ej.
un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, usando métodos
conocidos. De forma alternativa, se puede usar el sistema DIANA, que
es una modificación del método de cebadores anidados. En el sistema
DIANA (Detection of Immobilised Amplified Nucleic Acids) (véase
Wahlberg et al., Mol. Cell Probes 4: 285 (1990)), el
segundo par de cebadores internos portan, respectivamente, medios de
inmovilización para permitir la captura de ADN amplificado, y un
indicador o medios para la unión de un indicador para permitir el
reconocimiento. Esto proporciona la doble ventaja de una señal de
fondo reducida, y un medio rápido y fácil para la detección del ADN
amplificado.
El ácido nucleico amplificado también se puede
detectar, o se puede confirmar el resultado, mediante secuenciación,
usando cualquiera de las muchas técnicas de secuenciación diferentes
que están disponibles actualmente, p.ej. secuenciación estándar,
secuenciación en fase sólida, secuenciación cíclica, secuenciación
automática y minisecuenciación.
De forma ventajosa, se ha descubierto que las
células aisladas se pueden mantener en un tampón "de unión de
células" según la invención, p.ej. un tampón sal/alcohol durante
al menos una semana a temperatura ambiente, sin pérdida detectable
de sensibilidad en una etapa de detección de ácidos nucleicos
posterior. Tal estabilidad es una ventaja en situaciones de
campo.
Así, los métodos de la invención se pueden usar
para aislar ácidos nucleicos para cualquier uso apropiado posterior.
Los ejemplos de tales usos se describieron de forma breve
anteriormente. De forma ventajosa, los métodos de la invención se
podrían usar para preparar y aislar ácidos nucleicos a partir de las
muestras en el punto de recogida, p.ej. en el lecho del paciente o
cerca de él, o en una consulta, en donde el ácido nucleico aislado u
obtenido se podría usar después opcionalmente en análisis
posteriores también en el punto de recogida, p.ej. se podría usar en
análisis genéticos de presencia/ausencia en un análisis de
hibridación en mancha, por ejemplo.
Los diversos reactivos y componentes necesarios
para realizar los métodos de la invención se pueden suministrar
convenientemente en forma de un equipo. Tales equipos representan un
aspecto adicional de la invención.
En su forma más simple, este aspecto de la
invención proporciona un equipo para aislar ácidos nucleicos a
partir de una muestra, que comprende:
(a) un soporte sólido;
(b) medios para la unión de leucocitos a dicho
soporte sólido;
(c) medios para lisar dichas células; y
(d) medios para la unión del ácido nucleico
liberado de dichas células lisadas a dicho soporte sólido.
Los componentes opcionales adicionales del
equipo incluyen (e) un segundo soporte sólido, que puede ser el
mismo componente del soporte sólido de (a) u otro diferente, y (f)
una proteinasa, tal como proteinasa K. En los equipos de la
invención en los que se incluye un segundo soporte sólido, se
debería notar que tales equipos se pueden usar igualmente para
aislar ácidos nucleicos a partir de cualquier muestra de células, y
no se limitan a aislar ácidos nucleicos a partir de una muestra que
contiene leucocitos, p.ej. una muestra de sangre. En tales equipos,
el componente (b) se sustituye por un medio apropiado para la unión
de las células particulares, a partir de las cuales se desea aislar
ácidos nucleicos, a un soporte sólido.
Los diversos medios (b), (c), (d), (e) y (f)
pueden ser como los descritos y discutidos anteriormente, con
respecto a los métodos de la invención.
Un componente opcional adicional es (g), medios
para detectar el ácido nucleico. Como se discutió anteriormente,
tales medios pueden incluir una sonda apropiada o secuencias
cebadoras de oligonucleótidos para el uso en métodos de detección
basados en hibridación y/o amplificación.
Opcionalmente, se puede incluir además en tal
equipo tampones, sales, polímeros, enzimas, etc.
La invención se describirá a continuación con
más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes con referencia
a los dibujos, en los que:
La Figura 1 es un gráfico que muestra del
rendimiento de ADN (\mug) aislado a partir de 100 \mul de
muestra de capa de leucocitos como se describe en el Ejemplo 2,
aislamientos I, II y III;
La Figura 2 es un gráfico que muestra el
rendimiento de ADN (\mug) aislado a partir de una muestra de 100
\mul de capa de leucocitos como se describe en el Ejemplo 3,
aislamientos I, II y III;
La Figura 3 es un gráfico que muestra el % de
ADN aislado a partir de 1 ml de muestra de sangre como se describe
en el Ejemplo 4, mediante el uso de diferentes preparaciones
anticuerpo-microesfera (microesferas CD45/CD15: KB
458-18; KB 458-16; y KB
458-10; y microesferas separadas CD45 y CD15).
La Figura 4 es un gráfico que muestra el
rendimiento de ADN (\mug) aislado a partir de 200 \mul de sangre
como se describe en el Ejemplo 6. También se muestra el valor de una
proporción que da una indicación de la pureza de ADN tal como se
describe en el Ejemplo 6 (\blacklozenge).
Se ha desarrollado un método para el aislamiento
y la purificación de ADN a partir de células aisladas de forma
específica, concretamente leucocitos, de la sangre. El método se
basa en el uso de anticuerpos u otras moléculas de afinidad
revestidas sobre un soporte sólido, tal como microesferas
magnéticas, para el aislamiento específico de células. La lisis
posterior de estas células en un medio apropiado, p.ej. en un tampón
con una sal o agente caotrópico que contiene un detergente, libera
el ADN, y el ADN se adsorbe en las microesferas. El ARN y otros
contaminantes permanecen en el sobrenadante, y mediante la
separación del soporte, p.ej. de forma magnética, el complejo
ADN/soporte se lava para eliminar estos contaminantes residuales. El
ADN se resuspende después en un tampón apropiado, y está preparado
para ser usado en aplicaciones posteriores.
375 \mug de cada una de Dynabeads^{TM} M450
CD45 y M450 CD15 magnéticas (disponibles de Dynal ASA) provistas con
anticuerpo anti-CD45 o anti-CD15
(resuspendidas en PBS, pH 7,4, con 0,1% de BSA y 0,02% de
NaN_{3}), en una proporción 1:1 se lavan y se resuspenden en DPBS
(PBS de Dulbecco (solución salina tamponada con fosfato) usado sin
Ca^{+2} y Mg^{+2}), pH 7,4, con 0,1% de BSA y 0,6% de citrato
sódico. Las células se añaden después a sangre o capa de leucocitos,
y se incuban durante 20-45 minutos a
4-20ºC. Las células se aíslan de forma magnética y
se lavan en DPBS, pH 7,4, con 0,1% de BSA y 0,6% de citrato sódico,
o se añaden directamente a tampón de lisis/unión (véase Lisis
celular) sin lavar.
Las microesferas con las células aisladas unidas
se añaden a tampón de lisis/unión (Tris-HCl 100 mM,
pH 7,5, LiCl 100 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0, 1% de LiDS y DTT 5 mM
(ditiotreitol)) y se incuban durante cinco minutos a temperatura
ambiente.
El complejo ADN/microesferas se aísla de forma
magnética y se lava en NaCl 40 mM. El ADN se eluye con
Tris-HCl 10 mM de pH 7,4 mediante pipeteo enérgico e
incubación posterior a 65ºC durante 5 minutos. Las microesferas se
extraen de forma magnética del ADN eluido.
En este procedimiento, las etapas de aislamiento
de células y de aislamiento de ADN están automatizadas.
\newpage
Se realizó aislamiento de ADN a partir de 100
\mul de capa de leucocitos, diluida hasta 1 ml con DPBS, pH 7,4,
con 0,1% de BSA y 0,6% de citrato sódico, usando 375 \mug de M450
CD45 y 375 \mug de M450 CD15. El aislamiento de células y de ADN
se realizó usando el aparato Bead Retriever^{TM} de Dynal. Las
células aisladas se transfirieron a tampón de lisis/unión, y el
complejo ADN/microesferas se lavó dos veces en NaCl 40 mM antes de
la elución parcial en Tris-HCl 10 mM de pH 7,4. Para
eluir el ADN completamente se realizó manualmente pipeteo enérgico y
elución a 65ºC. El rendimiento de ADN se determinó midiendo la
DO_{260} y DO_{280} y usando la fórmula de
Warburg-Christian ([ácido nucleico, \mug/ml] =
62,9 DO_{260} - 36,0 DO_{280}). La pureza del ADN aislado se
determinó mediante la proporción DO_{260}/DO_{280}, en la que
una proporción entre 1,7 y 2,0 se considera como una preparación de
ADN puro. Los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación, y
también en la Figura 1.
| Aislamiento | DO_{260} | DO_{280} | Proporción 260/280 | Volumen \mul | \mu/ml de ADN | \mug ADN |
| I | 0,758 | 0,457 | 1,66 | 170 | 31,23 | 5,31 |
| II | 0,778 | 0,456 | 1,71 | 189 | 32,56 | 6,15 |
| III | 0,792 | 0,459 | 1,73 | 180 | 33,29 | 5,99 |
En este procedimiento, las células se aíslan
manualmente y el aislamiento de ADN está automatizado.
Se realizó aislamiento de ADN a partir de 100
\mul de capa de leucocitos, diluida hasta 300 \mul con DPBS, pH
7,4, con 0,1% de BSA y 0,6% de citrato sódico, usando 375 \mug de
M450 CD45 y 375 \mug de M450 CD15. El aislamiento de células se
realizó manualmente y el aislamiento de ADN se realizó usando el
aparato Bead Retriever^{TM} de Dynal. Las células aisladas
manualmente se lavaron tres veces antes de la adición de tampón de
lisis/unión. El complejo ADN/microesferas se lavó tres veces en NaCl
40 mM antes de la elución parcial en Tris-HCl 10 mM
de pH 7,4. Para eluir el ADN completamente, se realizó de forma
manual pipeteo enérgico y elución a 65ºC. El rendimiento de ADN se
determinó midiendo la DO_{260} y DO_{280} y usando la fórmula de
Warburg-Christian ([ácido nucleico, \mug/ml] =
62,9 DO_{260} - 36,0 DO_{280}). La pureza del ADN aislado se
determinó mediante la proporción DO_{260}/DO_{280}, en la que
una proporción entre 1,7 y 2,0 se considera como una preparación de
ADN puro. Los resultados se muestran en la Tabla 4 a continuación, y
también en la Figura 2.
| Aislamiento | DO_{260} | DO_{280} | Proporción 260/280 | Volumen \mul | \mug/ml de ADN | \mug ADN |
| I | 0,942 | 0,522 | 1,80 | 186 | 40,46 | 7,53 |
| II | 0,834 | 0,463 | 1,80 | 205 | 35,79 | 7,34 |
| III | 1,104 | 0,624 | 1,77 | 180 | 46,98 | 8,46 |
Se aislaron células a partir de 1 ml de muestras
de sangre completa (que contenían aproximadamente 2\cdot10^{7}
leucocitos) usando el procedimiento general descrito en el Ejemplo
1. Las microesferas que portaban tanto anti-CD45
como anti-CD15 (KB 458-18; KB
458-16 y KB 458-10; estas
denominaciones representan preparaciones de microesferas diferentes)
se compararon con un procedimiento que usaba una combinación de
microesferas CD45 y CD15 separadas (como en los ejemplos previos).
Se usaron 375 \mug de microesferas en cada caso.
El número de leucocitos en 1 ml de sangre se
determinó mediante citometría de flujo para ser 2.600.000. Las
muestras de sangre se diluyeron de 9,6 ml a 12,5 ml, concretamente
una dilución de 1,3, por lo que dio como resultado 2.000.000 de
leucocitos. Se supone que 5 pg de ADN por célula dan aproximadamente
12 \mug de ADN en 1 ml de sangre.
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla
5 y en la Figura 3.
\newpage
Sangre
M450 CD45 y M450 CD15 ó M450 CD45/15
DPBS/BSA (0,1% de BSA y 0,6% de citrato
sódico)
- (50 ml de DPBS + 250 \mul de BSA del 20% + 30 mg de citrato sódico)
Tampón de lisis/unión
- (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, EDTA 10 mM, pH 8, DTT 0,5 mM, 1% de SDS)
Tampón de lavado (NaCl 40 mM)
Tris-HCl 10 mM de pH 7,4
\vskip1.000000\baselineskip
DPBS = PBS de Dulbecco usado sin Ca^{+2} ni
Mg^{+2}
DTT = Ditiotreitol
1. Usar 1\cdot10^{7} microesferas por 1 ml
de sangre. Las microesferas son, o bien M450 CD45 y CD15 1:1, o bien
M450
{}\hskip0,8cm CD45/15.
{}\hskip0,8cm CD45/15.
2. Eliminar el sobrenadante y lavar las
microesferas con tampón DPBS/BSA.
3. Añadir las microesferas a tubos de 2 ml con
tapón de rosca.
4. Añadir 1 ml de sangre. Mezclar bien
pipeteando de forma cuidadosa.
5. Incubar 20 min a 2-8ºC en un
agitador rotativo.
6. Añadir a la gradilla de tubos para el Bead
Retriever:
- Tubo 1: vacío (para añadir 1 ml de sangre con células aisladas)
- Tubo 2, 3, 4 y 5: 1 ml de DPBS/BSA
7. Tras el aislamiento de células, añadir la
sangre con las células aisladas en el primer tubo de la gradilla de
tubos
{}\hskip0,8cm del Bead Retriever.
{}\hskip0,8cm del Bead Retriever.
8. Colocar los tubos y las puntas en el Bead
Retriever e iniciar el programa:
- Tubo 1: recoger las células aisladas
- Tubo 2, 3 y 4: lavar 1 min
- Tubo 5: lavar 1 min, recoger las células en las puntas y colocar en posición 0
9. Añadir a una gradilla nueva de tubos para
Bead Retriever:
- Tubo 1: 500 \mul de tampón de lisis/unión
- Tubo 2, 3 y 4: 1 ml de tampón de lavado
- Tubo 5: 200 \mul de Tris-HCl 10 mM de pH 7,4
10. Dejar las puntas en el aparato, pero
sustituir los tubos del lavado de células con los tubos nuevos para
unión de
{}\hskip1cm ADN y lavado.
{}\hskip1cm ADN y lavado.
11. Iniciar el programa:
- Tubo 1: 5 min de lisis
- Tubo 2, 3 y 4: 1 min de lavado
- Tubo 5: agitación enérgica para liberar el complejo de las microesferas
12. El ADN no se liberará durante la agitación
en el Bead Retriever, y necesita ser manejado manualmente.
Trans-
{}\hskip1cmferir todo el contenido del tubo 5 a un tubo Eppendorf y pipetear varias veces hasta que las microesferas estén
{}\hskip1cmen disolución.
{}\hskip1cmferir todo el contenido del tubo 5 a un tubo Eppendorf y pipetear varias veces hasta que las microesferas estén
{}\hskip1cmen disolución.
13. Eluir el ADN a 65ºC durante 5 minutos.
Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
14. Determinar la DO_{260}, DO_{280} y
DO_{320}. Calcular la proporción:
\hskip0,5cm(DO_{280} y
DO_{320})/(DO_{280} y DO_{320})
15. Calcular la cantidad de ADN aislado:
\hskip0,5cm\mug de ADN = [62,9*(DO_{260} y
DO_{320}) - 36,0*(DO_{280} y DO_{320})]*ml de volumen de
elución
16. Analizar una muestra de 5 \mul en un gel
de agarosa para visualizar el tamaño y cantidad de ADN.
- Sangre
- M450 CD45 (4x10^{8} microesferas/ml y 30
mg/ml)
- M450 CD15 (4x10^{8} microesferas/ml y 30
mg/ml)
- DPBS con un 0,1% de BSA
- Tampón de lisis/unión
(Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, LiCl 500 mM, EDTA 10 mM,
pH 8,0, DTT 0,5 mM, 1% de
{}\hskip0,7cm LiDS) con 1,5 mg/ml de M270-COOH
{}\hskip0,7cm LiDS) con 1,5 mg/ml de M270-COOH
- 20 mg/ml de proteinasa K
- Tampón de lavado (Tris 10 mM de pH 8,0, LiCl
150 mM)
- Tampón de resuspensión
(Tris-HCl de pH 8,0, 0,01% de
Tween-20)
1. Usar 6x10^{6} microesferas (450 \mug) por
200 \mul de sangre en una proporción 2:1 de M450 CD45 y CD15.
Eliminar
{}\hskip0,8cm el sobrenadante y lavar las microesferas con tampón DPBS/BSA.
{}\hskip0,8cm el sobrenadante y lavar las microesferas con tampón DPBS/BSA.
2. Añadir las microesferas lavadas a 200 \mul
de sangre diluidos en 200 \mul de tampón DPBS/BSA. Mezclar
bien
{}\hskip0,8cm pipeteando de forma cuidadosa.
{}\hskip0,8cm pipeteando de forma cuidadosa.
3. Incubar con movimiento constante durante 20
minutos a temperatura ambiente.
4. Lavar las células aisladas tres veces en
tampón DPBS/BSA. Cambiar el tubo en el primer lavado. Eliminar
el
{}\hskip0,8cm sobrenadante.
{}\hskip0,8cm sobrenadante.
5. Añadir 0,5 ml de tampón de lisis/unión que
contiene 1,5 mg/ml de microesferas extra y 20 \mul de 20 mg/ml
de
{}\hskip0,8cm proteinasa K a las células aisladas y a las microesferas. No mezclar mediante pipeteo.
{}\hskip0,8cm proteinasa K a las células aisladas y a las microesferas. No mezclar mediante pipeteo.
6. Incubar durante 5 minutos a temperatura
ambiente con movimiento constante.
7. Lavar tres veces añadiendo tampón de lavado
sin pipeteo adicional.
8. Añadir 200 \mul de tampón de resuspensión e
incubar durante 5 minutos a 80ºC.
9. Centrifugar brevemente, pipetear unas cuantas
veces y/o golpear suavemente el tubo. Transferir el
sobrenadante
{}\hskip0,8cm a un tubo nuevo.
{}\hskip0,8cm a un tubo nuevo.
10. Determinar las DO_{260}, DO_{280},
DO_{320}. Calcular la proporción:
(DO_{260}-DO_{320})/(DO_{280}-DO_{320})
11. Calcular la cantidad de ADN aislado:
\hskip0,5cm\mug de ADN = [50 x
(DO_{260}-DO_{320})] x ml de volumen de
elución.
Los resultados de cinco muestras de sangre
diferentes que se han sometido a este protocolo se muestran en la
Figura 4.
Claims (29)
1. Un método para aislar ácidos nucleicos a
partir de una muestra de sangre, que comprende:
(a) aislar de forma selectiva leucocitos a
partir de dicha muestra, mediante la unión de dichos leucocitos a un
soporte sólido por medio de una molécula de unión específica de
leucocitos;
(b) lisar dichos leucocitos aislados; y
(c) unir el ácido nucleico liberado de dichas
células lisadas a dicho soporte sólido.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
en la etapa (a) los leucocitos de dicha muestra se unen a una
molécula de unión específica de leucocitos, y dicha molécula de
unión se une a un soporte sólido antes o después de unirse a dichos
leucocitos, por lo que se une dicho soporte a dichos leucocitos.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el
que el ácido nucleico es ADN, ARN o cualquier modificación natural
suya, o sus combinaciones.
4. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la molécula de unión de la etapa
(a) se une específicamente a leucocitos presentes en la muestra,
pero no a otras células o componentes de la muestra.
5. El método de la reivindicación 4, en el que
dicha molécula de unión es un anticuerpo o un fragmento o derivado
de un anticuerpo.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que se usan una o más moléculas de
unión diferentes para aislar los leucocitos.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que se separan todos o sustancialmente
todos los leucocitos presentes en la muestra.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la molécula de unión reconoce o es
capaz de unirse de forma específica a una o más de las moléculas
seleccionadas del grupo que comprende HLA-I, CD11a,
CD18, CD45, CD46, CD50, CD82, CD100, CD162, CD5 y CD15.
9. El método de la reivindicación 8, en el que
se usa una o más de dichas moléculas de unión.
10. El método de la reivindicación 8 ó 9, en el
que se usa una combinación de moléculas de unión específicas para
CD45 y CD15.
11. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el soporte sólido de la etapa (a)
comprende partículas, preferiblemente partículas poliméricas.
12. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho soporte sólido es
magnético, preferiblemente superparamagnético.
13. El método de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la molécula de unión se une
directa o indirectamente al soporte sólido de la etapa (a).
14. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 13, en el que se usa más de un tipo diferente
de molécula de unión, y dichas moléculas de unión se unen al mismo o
a diferentes soportes sólidos.
15. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que la unión de ácido nucleico de la
etapa (c) se lleva a cabo mediante el uso de un sistema basado en
detergente.
16. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dichas células aisladas de la
etapa (b) o el ácido nucleico de la etapa (c) se ponen en contacto
adicionalmente con una cantidad adicional de un segundo soporte
sólido, y preferiblemente unir dicho ácido nucleico a dicho segundo
soporte sólido, que es capaz de unir ácidos nucleicos.
17. Un método para aislar ácidos nucleicos a
partir de una muestra de células, que comprende:
(a) aislar de forma selectiva células a partir
de dicha muestra mediante la unión de dichas células a un soporte
sólido por medio de una o más moléculas de unión apropiadas
específicas de dichas células;
(b) lisar dichas células aisladas;
(c) unir el ácido nucleico liberado de dichas
células lisadas a dicho primer soporte sólido, y
(d) poner en contacto dichas células aisladas de
la etapa (b) o el ácido nucleico de la etapa (c) con una cantidad
adicional de un segundo soporte sólido, y preferiblemente unir dicho
ácido nucleico a dicho segundo soporte sólido, que es capaz de unir
ácidos nucleicos.
18. El método de la reivindicación 17, en el que
las células son leucocitos.
19. El método de la reivindicación 17 ó 18, en
el que la muestra de células es una muestra de sangre.
20. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, en el que los componentes usados, o las
características presentes en las etapas (a), (b) y (c) son como se
definió en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
21. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, en el que las células aisladas se lisan en
presencia de dicho segundo soporte sólido.
22. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 21, en el que el primer soporte sólido es como
se definió en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, y el
segundo soporte sólido, que es diferente de dicho primer soporte
sólido, está cargado negativamente.
23. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 22, en el que el ácido nucleico aislado es ADN,
y el método comprende una etapa adicional para aislar ARN a partir
de la muestra.
24. Un equipo para aislar ácidos nucleicos a
partir de una muestra, que comprende:
- (a)
- un soporte sólido;
- (b)
- medios para unir leucocitos a dicho soporte sólido;
- (c)
- medios para lisar dichas células; y
- (d)
- medios para unir el ácido nucleico liberado de dichas células lisadas al mismo soporte sólido.
25. El equipo de la reivindicación 24, que
comprende además uno o más de:
- (e)
- un segundo soporte sólido;
- (f)
- una proteinasa; y
- (g)
- medios para detectar ácidos nucleicos.
26. Un equipo para aislar ácidos nucleicos a
partir de una muestra de células, que comprende:
- (a)
- un soporte sólido;
- (b)
- medios para unir las células particulares a partir de las que se desea aislar ácido nucleico a dicho soporte sólido;
- (c)
- medios para lisar dichas células; y
- (d)
- medios para unir el ácido nucleico liberado de dichas células lisadas al mismo soporte sólido; y
- (e)
- un segundo soporte sólido.
27. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 23, en el que dicho método se realiza usando un
sistema automatizado para manejar el soporte sólido durante la lisis
celular, la unión de ácidos nucleicos y opcionalmente las etapas de
lavado.
28. El método de la reivindicación 27, en el que
el sistema automatizado maneja adicionalmente el soporte durante la
etapa de aislamiento de células.
29. El método de la reivindicación 27 ó 28, en
el que se usa el aparato Bead Retriever^{TM}.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0013658 | 2000-06-05 | ||
| GBGB0013658.0A GB0013658D0 (en) | 2000-06-05 | 2000-06-05 | Nucleic acid isolation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2269399T3 true ES2269399T3 (es) | 2007-04-01 |
Family
ID=9893009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01934205T Expired - Lifetime ES2269399T3 (es) | 2000-06-05 | 2001-06-05 | Aislamiento de acido nucleico. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030180754A1 (es) |
| EP (1) | EP1290155B1 (es) |
| AT (1) | ATE335815T1 (es) |
| AU (2) | AU2001260507B2 (es) |
| CA (1) | CA2410888C (es) |
| DE (1) | DE60122138T2 (es) |
| DK (1) | DK1290155T3 (es) |
| ES (1) | ES2269399T3 (es) |
| GB (1) | GB0013658D0 (es) |
| WO (1) | WO2001094572A1 (es) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9425138D0 (en) | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
| JP2005538929A (ja) | 2002-01-16 | 2005-12-22 | ダイナル バイオテック エイエスエイ | 単一サンプルからの核酸及びタンパク質の単離方法 |
| CA2500392C (en) * | 2002-09-27 | 2012-11-27 | The General Hospital Corporation | Microfluidic device for cell separation and uses thereof |
| EP1608952B1 (en) | 2002-12-20 | 2016-08-10 | Life Technologies Corporation | Assay apparatus and method using microfluidic arrays |
| US7031802B2 (en) * | 2003-08-13 | 2006-04-18 | Hewlett-Packard Development Company, L.P. | Semi-autonomous operation of a robotic device |
| JP2006083114A (ja) * | 2004-09-17 | 2006-03-30 | Hitachi High-Technologies Corp | 核酸抽出方法、及び核酸遊離方法 |
| JP5390772B2 (ja) * | 2004-11-05 | 2014-01-15 | キアゲン ノース アメリカン ホールディングス， インコーポレイテッド | 核酸を安定化試薬から精製するための組成物および方法 |
| US8883487B2 (en) | 2004-12-23 | 2014-11-11 | Abbott Point Of Care Inc. | Molecular diagnostics system and methods |
| US8921102B2 (en) | 2005-07-29 | 2014-12-30 | Gpb Scientific, Llc | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
| US20070092403A1 (en) * | 2005-10-21 | 2007-04-26 | Alan Wirbisky | Compact apparatus, compositions and methods for purifying nucleic acids |
| GB0525231D0 (en) * | 2005-12-12 | 2006-01-18 | Genpoint As | Method |
| WO2007079250A2 (en) * | 2005-12-29 | 2007-07-12 | Cellpoint Diagnostics, Inc. | Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles |
| CA2533052C (en) * | 2006-01-16 | 2016-02-09 | Yousef Haj-Ahmad | Isolating both free and protein associated dna |
| US7919278B2 (en) * | 2006-08-21 | 2011-04-05 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of amplifying nucleic acid from a cell using a nonplanar solid substrate |
| US8183359B2 (en) * | 2007-03-01 | 2012-05-22 | Gen-Probe Incorporated | Kits for amplifying DNA |
| DE102009037331A1 (de) * | 2009-08-14 | 2011-03-03 | Pluriselect Gmbh | Verfahren zur Separierung von Partikeln und/oder Zellen mit 2 und mehr Oberflächenspezifitäten |
| JP6431522B2 (ja) | 2013-03-15 | 2018-11-28 | アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド | 核酸の精製のための１工程法 |
| WO2014152027A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Manufacturing methods for production of rna transcripts |
| WO2014152031A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ribonucleic acid purification |
| WO2014144767A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Moderna Therapeutics, Inc. | Ion exchange purification of mrna |
| WO2014152030A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Moderna Therapeutics, Inc. | Removal of dna fragments in mrna production process |
| US9644232B2 (en) | 2013-07-26 | 2017-05-09 | General Electric Company | Method and device for collection and amplification of circulating nucleic acids |
| WO2015051169A2 (en) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotide molecules and uses thereof |
| WO2015196128A2 (en) | 2014-06-19 | 2015-12-23 | Moderna Therapeutics, Inc. | Alternative nucleic acid molecules and uses thereof |
| US10407683B2 (en) | 2014-07-16 | 2019-09-10 | Modernatx, Inc. | Circular polynucleotides |
| PL3350333T3 (pl) | 2015-09-17 | 2022-03-07 | Modernatx, Inc. | Polinukleotydy zawierające region stabilizujący ogon |
| WO2017223176A1 (en) | 2016-06-24 | 2017-12-28 | Modernatx, Inc. | Methods and apparatus for filtration |
| EP3502274A1 (de) * | 2017-12-22 | 2019-06-26 | Attomol GmbH | Probenträger und verfahren zu dessen herstellung |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU530410B2 (en) * | 1978-02-21 | 1983-07-14 | Sintef | Preparing aqueous emulsions |
| NO155316C (no) | 1982-04-23 | 1987-03-11 | Sintef | Fremgangsmaate for fremstilling av magnetiske polymerpartikler. |
| CA1335181C (en) * | 1988-10-11 | 1995-04-11 | R. Alan Hardwick | System for selective cell separation from cell concentrate |
| NL8900725A (nl) | 1989-03-23 | 1990-10-16 | Az Univ Amsterdam | Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur. |
| US5234809A (en) * | 1989-03-23 | 1993-08-10 | Akzo N.V. | Process for isolating nucleic acid |
| US5641628A (en) * | 1989-11-13 | 1997-06-24 | Children's Medical Center Corporation | Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA |
| ATE147792T1 (de) * | 1989-11-30 | 1997-02-15 | Pharmacia Biotech Ab | Neues verfahren zum nachweis einer spezifischen nukleinsäuresequenz in einer zellprobe |
| GB9003253D0 (en) | 1990-02-13 | 1990-04-11 | Amersham Int Plc | Precipitating polymers |
| US5155018A (en) * | 1991-07-10 | 1992-10-13 | Hahnemann University | Process and kit for isolating and purifying RNA from biological sources |
| DE69324716T2 (de) * | 1992-02-13 | 1999-09-09 | Becton Dickinson And Co. | Celithydrat und Reinigung von DNS |
| GB9220773D0 (en) * | 1992-10-02 | 1992-11-18 | Mini Agriculture & Fisheries | Detection of antigens and nucleic acids |
| US5438129A (en) * | 1993-09-27 | 1995-08-01 | Becton Dickinson And Company | DNA purification by solid phase extraction using partially fluorinated aluminum hydroxide adsorbant |
| US5503816A (en) * | 1993-09-27 | 1996-04-02 | Becton Dickinson And Company | Silicate compounds for DNA purification |
| GB9425138D0 (en) * | 1994-12-12 | 1995-02-08 | Dynal As | Isolation of nucleic acid |
| JP2965131B2 (ja) * | 1995-07-07 | 1999-10-18 | 東洋紡績株式会社 | 核酸結合用磁性担体およびそれを用いる核酸単離方法 |
| US6027945A (en) * | 1997-01-21 | 2000-02-22 | Promega Corporation | Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles |
| GB9709728D0 (en) * | 1997-05-13 | 1997-07-02 | Dynal As | Single step method |
-
2000
- 2000-06-05 GB GBGB0013658.0A patent/GB0013658D0/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-06-05 ES ES01934205T patent/ES2269399T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-05 AU AU2001260507A patent/AU2001260507B2/en not_active Ceased
- 2001-06-05 US US10/297,301 patent/US20030180754A1/en not_active Abandoned
- 2001-06-05 AT AT01934205T patent/ATE335815T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-06-05 WO PCT/GB2001/002472 patent/WO2001094572A1/en not_active Ceased
- 2001-06-05 DK DK01934205T patent/DK1290155T3/da active
- 2001-06-05 AU AU6050701A patent/AU6050701A/xx active Pending
- 2001-06-05 DE DE60122138T patent/DE60122138T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-05 CA CA002410888A patent/CA2410888C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-06-05 EP EP01934205A patent/EP1290155B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-04-04 US US12/098,411 patent/US8263324B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20080293035A1 (en) | 2008-11-27 |
| CA2410888A1 (en) | 2001-12-13 |
| DE60122138D1 (de) | 2006-09-21 |
| DE60122138T2 (de) | 2007-06-28 |
| US8263324B2 (en) | 2012-09-11 |
| WO2001094572A1 (en) | 2001-12-13 |
| AU6050701A (en) | 2001-12-17 |
| ATE335815T1 (de) | 2006-09-15 |
| EP1290155B1 (en) | 2006-08-09 |
| GB0013658D0 (en) | 2000-07-26 |
| US20030180754A1 (en) | 2003-09-25 |
| EP1290155A1 (en) | 2003-03-12 |
| AU2001260507B2 (en) | 2006-08-31 |
| AU2001260507C1 (en) | 2001-12-17 |
| DK1290155T3 (da) | 2006-12-04 |
| CA2410888C (en) | 2008-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2269399T3 (es) | Aislamiento de acido nucleico. | |
| US7527929B2 (en) | Methods of isolating nucleic acids using multifunctional group-coated solid phase carriers | |
| ES2163865T5 (es) | Aislamiento en fase solida de acidos nucleicos. | |
| Tan et al. | DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present | |
| US9739768B2 (en) | Methods and reagents for improved selection of biological materials | |
| ES2741749T3 (es) | Método y materiales para el aislamiento de materiales de ácido nucleico | |
| US8202693B2 (en) | Method of isolation of nucleic acids | |
| AU2001260507A1 (en) | Nucleic acid isolation | |
| ES2294287T3 (es) | Empleo de un material de silice en una reaccion de amplificacion. | |
| EP3405788A1 (en) | Multifunctional beads and methods of use for capturing target cells | |
| JP2005538929A (ja) | 単一サンプルからの核酸及びタンパク質の単離方法 | |
| JP2006517225A (ja) | 核酸抽出のための生物学的試料の化学処理および該処理用のキット | |
| ES2205545T3 (es) | Procedimiento rapido de aislamiento de arn. | |
| CN101268189A (zh) | 分离核酸的方法 | |
| Thatcher | Nucleic acid isolation | |
| EP2385979B1 (en) | Sequence-specific large volume sample preparation method and assay | |
| CN101374960A (zh) | 用于检测样品中靶细胞存在与否的方法 | |
| JP5706072B2 (ja) | 分析処理および検出装置 |