ES2270439T3 - Hepatocitos crioconservados y procedimiento para hacerlo. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE A CONTINUACION UN SISTEMA DE MANTENIMIENTO ARTIFICIAL DE UN HIGADO, QUE COMPRENDE HEPATOCITOS CRIOCONSERVADOS CON UNA VIABILIDAD INICIAL DE 80-99 %. SE DESCRIBEN ASIMISMO HEPATOCITOS CRIOCONSERVADOS MEDIANTE LA INTRODUCCION DE HEPATOCITOS EN RECIPIENTES DE CONGELACION, CONGELACION DE DICHOS RECIPIENTES DESDE -50 HASTA 90 (GRADOS) C, ALMACENAMIENTO DE LOS RECIPIENTES EN NITROGENO GASEOSO O LIQUIDO, DESCONGALACION DE LOS HEPATOCITOS CRIOCONSERVADOS CUANDO ESTEN LISTOS PARA SU UTILIZACION Y ELIMINACION DEL MEDIO CRIOPROTECTOR RESIDUAL.

Description

Hepatocitos crioconservados y procedimiento para hacerlo.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere en general a la crioconservación de células y más específicamente a la crioconservación a gran escala de hepatocitos porcinos.

El hígado es un órgano esencial para la supervivencia de los seres humanos debido a que sirve a una diversidad de funciones importantes relacionadas con la síntesis macromolecular, la generación y almacenamiento de energía, el catabolismo y la eliminación de sustancias tóxicas y productos residuales del metabolismo intermediario. Las funciones bioquímicas en las cuales el hígado juega un papel fundamental incluyen el metabolismo de aminoácidos, amoníaco, proteínas, carbohidratos y lípidos; la oxidación bioquímica; y el metabolismo y desintoxicación de drogas, vitaminas y hormonas. Dado esto la mencionada, deficiencia hepática aguda o crónica, conlleva un pronóstico malo.

El tratamiento para el fallo hepático crónico o agudo en fase terminal se puede dividir en dos categorías, principalmente el uso de sistemas de soporte hepático artificial (ALS, del Inglés "Artificial Liver Support") y el trasplante hepático ortotópico (OLT, del Inglés "Orthotopic Liver Transplantation"). Los métodos de ALS incluyen hemoperfusión, hemodiálisis, hemofiltración y plasmaféresis. Lamentablemente, estos métodos no aumentan la supervivencia debido a que no proporcionan soporte metabólico.

A diferencia, el trasplante tiene un índice de supervivencia de un año del 50 al 90%. Sin embargo, lamentablemente los donantes de hígado están muy demandados pero escasean. Se ha informado que del 15 al 30% de los pacientes mueren antes de que se encuentre un donante compatible.

Finalmente, se han estudiado los métodos de ALS y de trasplante de hepatocito. Específicamente, se han investigado hepatocitos aislados para usarse en dispositivos de hígado artificial para compensar la pérdida de función metabólica en el hígado dañado. También se ha investigado el transplante de hepatocito en vez del transplante de hígado completo como una modalidad de tratamiento alternativo. Sin embargo, ambas técnicas para ser eficaces requieren crioconservación a gran escala de los hepatocitos viables.

Adams et al., (1995), Cell Transplantation 4, 579-586 describe estudios sobre crioconservación y almacenamiento a largo plazo de hepatocitos humanos primarios. Chesné et al., (1993), Hepatology 18, 406-414 describe estudios sobre la viabilidad y la función en cultivo primario de hepatocitos adultos de diversas especies después de la crioconservación. Skett y Roberts, (1994), In Vitro Toxicology 7, 261-267 informa sobre el efecto del medio de cultivo sobre el mantenimiento del metabolismo esteroide en hepatocitos de rata adulta cultivados. Takaue et al., (1994), Bone Marrow Transplantation 13, 801-804 y Rhoads et al., (1991), Cryo-Letters 12, 329-338 describen estudios sobre crioconservación usando métodos de velocidad controlada.

Shinichi Kasai y Michio Mito en "Large-Scale Cryopreservation of Isolated Dog Hepatocytes", Cryobiology 30, 1-11, 1993, describe un método de aislamiento en el que la viabilidad de los hepatocitos conservados es de 75\pm3% y el índice de recuperación estimado es de aproximadamente el 50%. Además, los hepatocitos conservados mostraban del 20 al 50% de la actividad metabólica de las células frescas tal como había valorado mediante los ensayos de carga de amoniaco y fructosa, el contenido de ATP, el consumo de leucina C-14. Aunque esta técnica es un comienzo, se puede mejorar mucho tanto en el rendimiento como en la viabilidad de los hepatocitos.

Por tanto, es un objetivo principal de la presente invención proporcionar un método de tratamiento para el fallo hepático agudo y crónico que asegure un alto rendimiento de hepatocitos sometidos a crioconservación viables. Un objetivo adicional es asegurar un alto rendimiento de hepatocitos sometidos a crioconservación viables para dejar un margen para el control de calidad y el ensayo de carga biológica ("bioburden") antes de usar.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a un método de crioconservación de hepatocito que comprende las etapas de:

a.

repartir los hepatocitos en los recipientes de congelación;

b.

congelar dichos recipientes entre menos 50 a menos 90 grados Celsius en un congelador de velocidad controlada programado tal como sigue:

i.

comenzar cuando la temperatura de la muestra alcance los menos 4 grados.

ii.

velocidad de enfriamiento entre 1 y 10 grados Celsius por minuto antes de la liberación del calor latente (menos 12 grados Celsius).

iii.

durante la liberación del calor latente, dejar caer la temperatura de la cámara a una velocidad de 25 grados Celsius por minuto hasta que la temperatura caiga entre menos 60 y menos 70 grados Celsius, a continuación, aumentar inmediatamente la temperatura de la cámara hasta entre menos 12 y menos 20 grados Celsius a una velocidad de 15 grados Celsius por minuto.

iv.

a continuación, continuar la congelación a velocidades de congelación entre 1 y 10 grados Celsius por minuto hasta que se alcance una temperatura final de congelación entre menos 50 y menos 90 grados Celsius;

c.

almacenar dichos recipientes en nitrógeno líquido o en vapor;

d.

descongelar dichos hepatocitos sometidos a crioconservación cuando se quieran usar; y

e.

eliminar los medios de crioconservación residuales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención contempla el uso de hepatocitos sometidos a crioconservación a gran escala para usar en dispositivos de ALS. Una vez que el donante y el producto han pasado todos los ensayos de Control de Calidad, la instalación del tratamiento puede usar los hepatocitos congelados. Poco antes de usar las células se descongelan y se cargan en un dispositivo de ALS. A modo de ilustración y no de limitación la presente invención contempla dispositivos de ALS que comprenden fibras huecas, micro porteadores, membranas de lámina lisas, etc. Específicamente, la presente invención contempla cartuchos. Este cartucho de ALS cargado de hepatocito en esencia actúa como un hígado biológico artificial que actúa como puente de la función hepática hasta que un hígado donante llega a estar disponible para el transplante o hasta que el hígado del paciente se autoregenere.

Puesto que los hepatocitos aislados solamente sobreviven en cultivo durante varios días o semanas y su uso en dispositivos de ALS híbridos requiere una supervivencia mayor, son esenciales las técnicas de crioconservación a largo plazo. Además, la crioconservación a largo plazo ofrece las siguientes ventajas: deja tiempo para el ensayo de carga biológica ("bioburden"), endotoxina, micoplasma, bacterias y virus, deja un margen para un riguroso examen histológico del animal donante, mejora la administración del inventario y reserva del producto a los pacientes, permite el mantenimiento de las muestras celulares o los archivos para el ensayo celular después del tratamiento, mejora la investigación de la función celular antes de usar las células a tratar, etc.

En términos muy generales la presente invención describe un proceso de crioconservación que comprende preparar un medio crioconservador, colocar en suspensión las células hepáticas en dicho medio, repartir dichos hepatocitos en recipientes seguros de congelador, congelar dichos recipientes durante un periodo concreto de tiempo bajo condiciones concretas, nitrógeno, o bien líquido o en vapor, almacenar dichos contenedores y descongelar dichas células cuando se quieran usar. En términos generales, un crioconservador es un compuesto que se usa para minimizar los efectos perjudiciales de la crioconservación tales como la formación de hielo intracelular durante la congelación. A modo de ilustración y no de limitación se puede mencionar DMSO, polietilenglicol, aminoácidos, propanodiol, etc. Lo siguiente ofrece detalles para el proceso general mencionado.

En la bibliografía se han descrito bien los medios de cultivo de hepatocito y así no comprende ninguna parte de esta invención. Además, la presente invención no se limita a ningún medio concreto. Por tanto, a modo de ilustración y no de limitación se pueden mencionar los siguientes medios de cultivo Medios Esenciales de Chee, Medios Eagle Modificados, Medio Eagle Modificado de Dulbecco, Leibowitz, Waymouth, y medios de Kreb, etc. tal como se describen en el Gibco, "BRL Life technologies catalogue", 1993-1994.

Un medio de cultivo de hepatocito preferido es el que permite a las células resistir el cambio extremo de temperatura encontrado con el almacenamiento en nitrógeno líquido con mínima degradación celular. A modo de ilustración y no de limitación se puede mencionar el Medio Esencial modificado de Chee complementado con timidina, arginina, insulina, dexametasona, glutamina y suero de mamífero. El suero de mamífero puede comprender suero bovino fetal, suero de ternera fetal y suero porcino en concentraciones que oscilan entre 10 y 90%. Este medio preferido además puede estar complementado con DMSO que oscila entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15%, albúmina que oscila entre aproximadamente 3,5 y aproximadamente 15% y glicerol que oscila entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20%.

El medio más preferido comprende Medios Esenciales de Chee más Suero Bovino Fetal, más adelante FBS (del Inglés "Fetal Bovine Serum"), más Dimetilsulfóxido, más adelante DMSO. Más específicamente el medio crioconservador comprende FBS al desde aproximadamente 5 a aproximadamente 20% y DMSO al desde aproximadamente 5 a aproximadamente 15%. Lo más preferido es un medio crioconservador que comprende FBS al 10% y DMSO
al 10%.

La presente invención tampoco es dependiente de ninguna de las técnicas de aislamiento bien conocidas. Sin embargo, solamente con propósitos ilustrativos, se pueden mencionar las siguiente técnicas resumidas en el ASAIO Journal 1995; 41:155-161 y en Seglen, P.O. Preparation of isolated rat liver cells. Prescott, D.M. ed. Methods in cell biology. Vol. 13. Nueva York: Academic Press; 1976:29-83; ambos incorporados en la presente memoria como referencia.

A continuación, se preparan los hepatocitos aislados para congelación. Se reparten en recipientes resistentes de congelador a densidades concretas. A modo de ilustración y no de limitación se pueden mencionar los siguientes recipientes de congelación: viales, bolsas, cañas, etc. Los preferidos son las bolsas de plásticos y las más preferidas son las bolsas de plástico de la marca registrada Cryocyte de Baxter que tienen una capacidad que oscila entre aproximadamente 250 y aproximadamente 500 ml.

Siendo lo más preferido la repartición ayudada por jeringuilla en las bolsas de congelador. En este proceso las células se canalizan a través de la jeringuilla por gravedad o se reparten por presión moderada dentro de las bolsas. Una vez que las células se han introducido en la bolsa, también se puede usar de manera ventajosa la jeringuilla para extraer el exceso de aire el cual más tarde promueve el proceso de descongelación. A continuación, se sellan las bolsas. Los métodos de sellado pueden comprender sellos de aluminio mecánicos, selladores por calor de impulso térmico, tapones de cierre de tipo "luer-lock", etc. Siendo el más preferido el sellado por calor. Los recipientes sellados así se mantienen preferiblemente a 0 a 4 grados Celsius hasta que se rellenen y se sellen todos los recipientes para someterse a crioconservación de manera que se puedan someter a crioconservación de manera simultánea.

Se pueden someter eficazmente a crioconservación un amplio rango de densidades celulares usando el método mencionado, principalmente desde aproximadamente 5 a aproximadamente 40 x 10^{6} células/ml. Los volúmenes que oscilan entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 ml se pueden conservar en recipientes de congelación de 250 ml, mientras que entre aproximadamente 50 y aproximadamente 150 ml se pueden someter a crioconservación en recipientes de congelación de 500 ml.

La siembra es una técnica usada para inducir la cristalización controlada o la formación de hielo en disoluciones que ya se han enfriado bajo cero. La siembra puede minimizar el daño relacionado con el daño relacionado con la formación de hielo y, por lo tanto, es beneficioso para la viabilidad celular.

La presente invención contempla cualquiera de los métodos de siembra bien conocidos entre ellos se pueden mencionar la inserción de una barra de metal fría en los recipientes de congelación, la introducción de un chorro de nitrógeno líquido en los recipientes de congelación, etc.

Para asegurar la congelación uniforme, la presente invención contempla opcionalmente el uso de placas de congelación. Se intercalan los recipientes de congelación entre dichas placas de congelación. Dichas placas pueden estar fabricadas de cualquier material conductor del calor tal como acero, aluminio, etc. Siendo el aluminio el más preferido. Preferiblemente dichas placas se separan de nuevo mediante medios espaciadores. Por medios espaciadores la presente invención contempla cuñas, muelles, rollos, almohadillas, etc. Dichos medios espaciadores son preferiblemente de hasta 6,35 mm de grosor. Dichos espaciadores pueden estar fabricados del mismo material que las placas, principalmente de cualquier material conductor del calor tal como acero, aluminio, etc. Siendo el aluminio el más preferido. El aluminio es el más preferido debido a que es un conductor del calor eficaz y el aluminio ayuda en la eliminación del calor latente producido durante el ciclo de congelación. La eliminación del calor latente es importante debido a que el daño celular puede resultar de un incremento en la temperatura durante la congelación. Además, el aluminio actúa como un sitio de nucleación para la siembra del hielo externo. Esto controla de manera ventajosa la cristalización y previene el superenfriamiento. En resumen, el uso de las placas de congelador y los espaciadores causa liberación uniforme del calor por un lote completo de células. Además estas placas aseguran que todos los recipientes de congelación se congelen en un lote concreto hasta un grosor uniforme y tengan tiempos de descongelación uniformes y reproducibles. Por tanto, aunque es posible congelar sin usar placas de congelador y espaciadores, se prefieren.

Una vez que se reparten los hepatocitos en recipientes de congelación, están preparados para ser colocados en congeladores. Aunque se contempla cualquier congelador capaz de congelar desde aproximadamente 4 grados Celsius a aproximadamente menos 90 grados Celsius, se prefiere un congelador de velocidad controlada.

Cuando se usa un congelador de velocidad controlada, se programan los perfiles de congelación en dichos congeladores para asegurar la congelación uniforme. Todos los perfiles contemplados por la presente invención comienzan una vez que la temperatura de la muestra alcance los menos 4 grados Celsius. La velocidad de enfriamiento debería estar entre 1 y 10 grados Celsius por minuto antes de la liberación del calor latente (menos 12 grados Celsius). Durante la liberación del calor latente, se deja caer la temperatura de la cámara a una velocidad de 25 grados Celsius por minuto hasta que la temperatura caiga entre menos 60 y menos 70 grados Celsius. Una vez que la temperatura de la cámara cae entre menos 60 y menos 70 grados Celsius, se incrementa inmediatamente la temperatura de la cámara hasta entre menos 12 y menos 20 grados Celsius a una velocidad de 15 grados Celsius por minuto. A continuación, se utilizan las velocidades de congelación entre 1 y 10 grados Celsius por minuto, para alcanzar temperaturas de congelación finales entre menos 50 y menos 90 grados Celsius.

Preferiblemente el perfil del congelador de velocidad controlada incluye un chorro de nitrógeno que se programa para compensar la liberación del calor latente. La compensación de la liberación del calor latente disminuye la probabilidad del daño celular durante la crioconservación de las células. Este chorro frío programado también ayuda en la sincronización de la siembra de hielo externo sobre todos los recipientes de congelación en un ciclo de congelación. Esto es particularmente ventajoso puesto que el punto crítico de la crioconservación celular se da durante la fase de formación de hielo. La formación de hielo comienza en un sitio de nucleación el cual puede ser un glomérulo de moléculas que se da al azar en la fase líquida. Los cristales de hielo nucleados forman dentro un frente de hielo que se expande a través del líquido hasta que se completa la solidificación.

Por tanto, se prefiere un congelador de velocidad controlada debido a que asegura los ciclos de congelación reproducibles y, por tanto, la crioconservación uniforme. Para aumentar más la reproducibilidad, además se puede equipar el congelador de velocidad controlada con un Validador el cual es capaz de hacer un seguimiento y documentar el proceso completo de crioconservación de ese modo asegurar más la uniformidad y la reproducibilidad. El Validador es un sistema de seguimiento de temperatura programado por ordenador con pares térmicos calibrados y fáciles de encontrar. Los pares térmicos permiten hacer un seguimiento adicional para documentar la temperatura de la muestra y la cámara a través del ciclo de congelación así como desencadenar ciertas partes del programa de congelación. A modo de ilustración y no de limitación se pueden mencionar los siguientes pares térmicos: Par Térmico submini de Omega y alambre revestido de teflón, etc. Los hepatocitos sometidos a crioconservación por los perfiles mencionados son altamente deseables para la conformidad regulatoria y la comercialización
uniforme.

Una vez que se congelan las células por las técnicas de congelación mencionadas, se pueden colocar en cajas de almacenamiento criogénico para almacenamiento a largo plazo en congeladores de almacenamiento con nitrógeno. Por almacenamiento a largo plazo se quiere decir meses o años. Los recipientes de congelación se pueden almacenar o bien en nitrógeno en fase de vapor o líquida. La presente invención contempla el almacenamiento a temperaturas por debajo de la temperatura de transición de cristal de agua o a -120 grados Celsius, en la que generalmente se cree que el tiempo y la actividad biológica se paran y, así, las células se pueden almacenar durante
años.

Antes de usar, las células se deben descongelar y se debe eliminar el DMSO. La descongelación se lleva a cabo por un baño de 37 a 42 grados Celsius. Se extraen las células del recipiente cuando aparece un hielo viscoso. A continuación, se introducen las células en un tubo de centrífuga que contiene medios de cultivo fríos. Se diluye el volumen celular inicial en el tubo de centrífuga añadiendo de 5 a 10 veces el volumen celular inicial en medios de cultivo fríos frescos. A continuación, se centrifuga la suspensión a 7 a 15 g durante 2 a 5 minutos. Se aspira el sobrenadante para eliminar los medios que contienen el DMSO residual. A continuación, se añade desde aproximadamente 2 a aproximadamente 4 veces medios frescos al gránulo celular.

Los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no de limitación, definen más la presente invención.

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Ejemplo 1 Medios de congelación

Medio Esencial de Chee (MEC) complementado con:

10 ml de FBS por 90 ml de MEC

10 ml de DMSO por 90 ml de MEC

0,584 g de Glutamina por litro de MEC

10 mU de Insulina por ml de MEC

Dexametasona 10^{-6} M

50 \mug de Gentamicina por ml de MEC

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Ejemplo 2 Método de relleno

Antes de rellenar una bolsa o un tubo, se mantuvo la suspensión celular en una botella estéril enfriada previamente. Se dio vueltas continuamente a la suspensión para mantener la densidad celular constante.

Cuando se rellenaron las Bolsas Cryocyte, se cerraron las grapas de rodillo de la conexión "y". Se enfriaron previamente las bolsas hasta 2 a 8 grados Celsius durante aproximadamente 30 minutos antes de usar. Se extrajo de manera aséptica el émbolo de una jeringuilla de 60 cc, se aseguró el cuerpo de la jeringuilla en la fijación de cierre tipo "luer-lock" de la tubería de la conexión "y", y se introdujo de manera aséptica 50 ml de la criosuspensión de hepatocito en el cuerpo de la jeringuilla. A continuación, se abrió la grapa de la tubería de entrada y se dejó que la suspensión celular fluyera dentro de la bolsa por gravedad. A continuación, se comprimió moderadamente la bolsa hasta que se observó una corriente de células fluyendo hacia la tubería de entrada para eliminar todo el exceso de aire de la bolsa. A continuación, se eliminó la comprensión hasta que las células se reintrodujeron en la bolsa y se cerró por grapa la conexión "y" tan pronto como se observó que el aire se reintroducía en la bolsa. Finalmente, se selló la tubería de la conexión "y" usando un sellador por calor y se eliminó la tubería en exceso.

Ejemplo 3 Método de congelador de velocidad no controlada

Se colocaron las bolsas Cryocyte o los tubos rellenados de acuerdo con el Ejemplo 2 en una caja de Styrofoam de 12,7 mm de grosor. A continuación, se colocó cada recipiente de crioconservación en un congelador de temperatura ultrabaja fijada a menos 70 grados Celsius y se mantuvo allí durante aproximadamente de 2 a 2 horas y 1/2. A continuación, se extrajeron los recipientes de crioconservación del congelador e inmediatamente se enfriaron en nitrógeno líquido y se colocaron en almacenamiento a largo plazo. Se hace un seguimiento del ciclo de crioconservación y se documenta por un Validador Portátil de Kaye durante el almacenamiento a largo plazo.

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Ejemplo 4 Método de congelador de velocidad controlada

Se intercalaron bolsas Cryocyte rellenas con células entre placas de congelación de aluminio común. A continuación, se colocaron en una cámara de un congelador de velocidad controlada programado con el siguiente perfil de congelación. Se enfriaron las células lentamente hasta 4 grados Celsius a una velocidad de 1 grado Celsius/minuto. A continuación, se cambió la velocidad de enfriamiento a 2,5 grados Celsius/minuto hasta que se alcanzara una temperatura de menos 12 grados Celsius, el punto de liberación del calor latente. El calor latente liberado se compensó dejando caer la temperatura de la cámara 25 grados/minuto hasta que la temperatura cayera hasta menos 70 grados Celsius. En ese punto, se incrementó inmediatamente la temperatura de la cámara hasta menos 20 grados Celsius, a una velocidad de 15 grados Celsius/minuto. A continuación, se utilizó unas velocidades de congelación de 1,5 grados Celsius/minuto para alcanzar la temperatura de congelación final de menos 70 grados Celsius. Una vez que se obtuvo esta temperatura, se extrajeron las células sometidas a crioconservación del congelador de velocidad controlada y se colocaron en nitrógeno en fase de vapor durante de 10 a 24 horas. A continuación, se colocaron directamente en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

La cámara del ciclo de congelación y la temperatura de la muestra se documentan con pares térmicos del NIST ("National Institute of Science and Technology").

Los hepatocitos sometidos a crioconservación por las directrices específicas y generales mencionadas generalmente mostraron del 80 al 99% de la viabilidad inicial y del 50 al 80% de la actividad metabólica de las células frescas. Estos resultados están ilustrados por los datos en las siguientes tablas.

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TABLA 1 Actividad Metabólica de Diazepam y Viabilidad de Hepatocitos Sometidos a Crioconservación y Frescos

Células Frescas

Muestra	% de Viabilidad	Actividad Metabólica de Diazepam
		(\mug/10^{6} células/hora)
1	80	7,5
2	92	7,8
3	88	5,8

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Células Sometidas a Crioconservación

Muestra	% de Viabilidad	Actividad Metabólica de Diazepam
		(\mug/10^{6} células/hora)
1	70	5,9
2	81	4,5
3	85	4,1

TABLA 1 (continuación)

% de Células Frescas

Muestra	% de Viabilidad	Actividad Metabólica de Diazepam
		(\mug/10^{6} células/hora)
1	88	79
2	88	58
3	97	71

en la que:

Célula Fresca = hepatocitos porcinos recién aislados/cultivados.

Células Sometidas a Crioconservación = hepatocitos porcinos que se han sometido a crioconservación, almacena-
{}\hskip0.4cm dos en nitrógeno líquido y descongelados.

Viabilidad = valorada por el ensayo de exclusión de azul de trypan.

Actividad Metabólica de Diazepam = producción metabólica.

A modo de recapitulación la presente invención describe un nuevo dispositivo de soporte hepático artificial que comprende nuevos hepatocitos sometidos a crioconservación producidos por el nuevo proceso de crioconservación que comprende aislar los hepatocitos, preparar un medio crioconservador, colocar en suspensión las células hepáticas en dicho medio, repartir dichos hepatocitos en recipientes seguros de congelación, congelar dichos recipientes durante un periodo concreto de tiempo bajo condiciones concretas, almacenar en nitrógeno dichos recipientes si se desea almacenamiento a largo plazo y descongelar dichas células cuando se quieran usar. Las células sometidas así a crioconservación demuestran del 80 al 99% de viabilidad y una actividad metabólica del 50 al 80% de células frescas que las hacen muy deseables para usar en dispositivos de ALS híbridos o como la base para el transplante de hepatocito. Ya que los hígados biológicos artificiales pueden actuar como puente de la función hepática hasta que un hígado donante llegue a estar disponible para el transplante o hasta que el hígado del paciente se autoregenere.

Puesto que se pueden realizar ciertos cambios sin salirse del alcance de la invención tal como se ha descrito en la presente patente, se intenta que todo asunto descrito en la precedente memoria, incluyendo los ejemplos, sea interpretado como ilustrativo y no en un sentido limitante.

Claims (2)

1. Un método de crioconservación de hepatocito que comprende las etapas de:

a.

repartir los hepatocitos en los recipientes de congelación;

b.

congelar dichos recipientes entre menos 50 y menos 90 grados Celsius en un congelador de velocidad controlada programado tal como sigue:

i.

comenzar cuando la temperatura de la muestra alcance los menos 4 grados.

ii.

velocidad de enfriamiento entre 1 y 10 grados Celsius por minuto antes de la liberación del calor latente (menos 12 grados Celsius).

iii.

durante la liberación del calor latente, dejar caer la temperatura de la cámara a una velocidad de 25 grados Celsius por minuto hasta que la temperatura caiga hasta entre menos 60 y menos 70 grados Celsius, a continuación, incrementar la temperatura de la cámara inmediatamente hasta entre menos 12 y menos 20 grados Celsius a una velocidad de 15 grados Celsius por minuto.

iv.

a continuación, continuar la congelación a velocidades de congelación entre 1 y 10 grados Celsius por minuto hasta que se alcance una temperatura de congelación final entre menos 50 y menos 90 grados Celsius;

c.

almacenar dichos recipientes en nitrógeno líquido o en vapor;

d.

descongelar dichos hepatocitos sometidos a crioconservación cuando se quieran usar; y

e.

eliminar los medios crioconservadores residuales.

2. El método de crioconservación de hepatocito de la reivindicación 1, en el que la densidad de hepatocito sometido a crioconservación dentro de dichos recipientes de congelación es desde aproximadamente 5 a aproximadamente 40 x 10^{6} células/ml.